KR20230042023A - 조작된 b형 간염 바이러스 중화 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 부분적으로, B형 간염 표면 항원(HBsAg)의 항원성 루프 영역에 결합할 수 있고 선택적으로 B형 간염 바이러스(HBV), 추가로 선택적으로 델타 간염 바이러스(HDV) 감염을 중화시킬 수 있는 항체 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 참조 항체 또는 항원-결합 단편과 비교하여 형질전환된 숙주 세포에서 감소된 응집체 형성 및/또는 개선된 생산 역가와 같은 유리한 생산 특성을 갖는다. 본 개시내용은 또한 항원-결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 이러한 항체, 항원-결합 단편 및 융합 단백질을 생성하는 세포 및 이를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 B형 간염 및 D형 간염의 진단, 예방 및 치료에서의 본 개시내용의 항체, 항원-결합 단편, 융합 단백질 및 관련 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 및 조성물의 용도에 관한 것이다. 또한 (i) 항체 또는 항원-결합 단편 및 (ii) HBV 유전자 발현의 억제제 및/또는 HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제를 포함하는 병용 요법이 제공된다.

Description

조작된 B형 간염 바이러스 중화 항체 및 이의 용도

서열목록에 관한 사항

본 출원과 관련된 서열목록은 서면 사본 대신 텍스트 형식으로 제공되며, 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열목록을 포함하는 텍스트 파일의 이름은 930485.414WO_SEQUENCE_LISTING.txt.　이다. 상기 텍스트 파일은 101 KB 이며, 2021년 6월 22일에 생성되었으며 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되어 있다.

B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus)는 잠재적으로 생명을 위협하는 급성 및 만성 간 감염을 일으킨다. 급성 B형 간염은 전격성(fulminant) 간염 발생의 위험이 있는 증상이 있거나 없는 바이러스혈증(viremia)을 특징으로 한다 (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. B형 간염의 현재와 미래 치료법: 발견에서 치료까지. Hepatology. 2015년8월3일. doi: 10.1002/hep.28025. [인쇄 전 출판]). B형 간염에 대한 효과적인 백신이 1982년부터 이용 가능했음에도 불구하고 WHO는 2억 4천만 명이 B형 간염에 만성적으로 감염되어 있으며 매년 78만 명 이상이 B형 간염 합병증으로 사망한다고 보고한다. 만성 B형 간염(CHB) 환자의 약 1/3이 간경화(cirrhosis), 간부전(liver failure) 및 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)으로 발전하여 연간 600,000명이 사망한다 (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. B형 간염의 현재와 미래 치료법: 발견에서 치료까지. Hepatology. 2015년 8월 3일. doi: 10.1002/hep. 28025. [인쇄 전 출판]).

HBV에 감염된 환자의 경우 HDV와의 동시 감염 또는 중복 감염의 결과로 심각한 합병증이 발생할 수 있다. WHO에 따르면 D형 간염은 전 세계적으로 약 1,500만 명을 감염시킨다. HDV는 HBV가 있을 때만 전파될 수 있기 때문에 서브바이러스 위성으로 여겨진다. HDV는 알려진 가장 작은 동물 바이러스(40nm) 중 하나이며, 게놈은 1.6kb에 불과하고 S 및 L HDAg를 인코딩한다. RNA 중합효소를 포함하여 HDV의 게놈 복제에 필요한 다른 모든 단백질은 숙주 세포에서 제공되며 HDV 외피는 HBV에서 제공된다. 허용 세포(permissive cells)에 도입되면 HDV RNA 게놈이 복제되고 HDV로 인코딩된 단백질의 여러 복사본과 연결되어 리보핵단백질(RNP) 복합체를 조립한다. RNP는 HBV 외피 단백질에 의해 세포에서 내보내지며, 이는 분비되기 전에 전골지(pre-Golgi) 구획의 루멘으로 버드(bud)하는 지단백질 소포를 조립할 수 있다. 또한 HBV 외피 단백질은 감염되지 않은 세포에 대한 HDV의 표적화 메커니즘을 제공하여 HDV의 확산을 보장한다.

HDV로 인한 합병증에는 급성 감염에서 간부전을 경험할 가능성이 높고 간경변으로 빠르게 진행되며 만성 감염에서 간암이 발생할 가능성이 높아진다. B형 간염 바이러스와 함께 D형 간염은 모든 간염 감염 중 치명률이 20%로 가장 높다(Fattovich G, Giustina G, Christensen E, Pantalena M, Zagni I, Realdi G, Schalm SW. 델타형 간염 바이러스 감염이 B형 대상성 간경변증의 이환율 및 사망률에 미치는 영향. Gut. 2000 Mar; 46(3):420-6). 만성 HDV 감염에 대해 승인된 유일한 치료법은 인터페론-알파이다. 그러나 인터페론-알파로 HDV를 치료하는 것은 상대적으로 비효율적이며 내약성이 좋지 않다. 인터페론-알파로 치료하면 환자의 1/4에서 치료 6개월 후 지속적인 바이러스 반응이 나타난다. 또한 뉴클레오시(티)드 유사체(nucleos(t)ide analogs)(NAs)는 델타 간염에서 광범위하게 테스트되었지만 효과가 없는 것으로 나타났다. NAs 를 인터페론과 함께 사용하는 병용 치료도 실망스러운 것으로 입증되었다(Zaigham Abbas, Minaam Abbas 델타 간염 관리: 새로운 치료 옵션의 필요성. World J Gastroenterol 2015 August 28; 21(32): 9461-9465).

따라서 B형 및/또는 D형 간염 감염에 대한 중화 활성을 갖는 새로운 요법과 같은 새로운 치료 옵션이 필요하다.

본 명세서에 제공된 도면은 본 개시내용에 포함된 주제를 보다 상세하게 설명하기 위한 것이다. 수치는 어떤 식으로든 개시를 제한하려는 의도가 아니다.
도 1은 서열번호 38에 따른 VH 및 서열번호 57에 따른 VL을 포함하는 항-HBV 항체 "HBC34-v35-GAALIE-MLNS"(rIgG1m17, 1)에 의한 HBsAg에 대한 결합(왼쪽) 및 HBV 감염의 중화(오른쪽) 및 Fc에서 돌연변이 G236A, A330L, I332E, M428L 및 N434S 를 나타낸다. 10개((A)-(J)) 유전자형의 HBsAg에 대한 다양한 농도의 항체의 결합이 왼쪽에 표시되어 있다. 중화는 표시된 바와 같이 HBsAg 농도(IU/ml) 및 HBeAg 지수에 의해 측정되었다. HBC34-v35-GAALIE-MLNS는 피코몰 친화력으로 HBsAg의 보존된 구조적 에피토프에 결합하고 10개의 HBV 유전자형을 강력하게 중화한다.
도 2는 1주 RT 인큐베이션 후 정제된 HBC34-v35-GAALIE-MLNS 및 HBC34-v35-MLNS (G236A, A330L 및 I332E Fc 돌연변이를 포함하지 않는다는 점에서 HBC34-v35-GAALIE-MLNS와 다름) IgG에 존재하는 고분자량 종을 보여주는 크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography (SEC)) 데이터를 나타낸다 (약 75 mg/mL). 최대 피크는 그래프의 오른쪽 상단 모서리에 삽입된 이미지에 표시된다.
도 3은 시간 경과에 따라 정제된 HBC34-v35 Fab의 고분자량 종을 보여주는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 데이터를 나타낸다. 최대 피크는 그래프의 오른쪽 상단 모서리에 삽입된 이미지에 표시된다.
도 4는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정된 바와 같이, HBsAg에 대한 HBC34-v35 IgG(패널의 상부 열) 및 Fab(패널의 하부 열) 모노머(중앙 패널) 및 풍부한 다이머(오른쪽 패널)의 결합을 보여준다. 왼쪽에는 HBsAg에 대한 IgG 및 Fab의 결합을 보여주는 개략도를 나타낸다. 사용된 HBsAg 농도는 도면표시에 표시된 대로였다.
도 5A 및 5B는 (A) 단리된 HBC34-v35 재조합 Fab 이량체(왼쪽 피크)의 제조용 SEC 데이터 및 (B) Fab 이량체의 결정화를 나타낸다.
도 6A 및 6B는 (A) 단리된 HBC34-v35 재조합 Fab 단량체의 제조용 SEC 데이터 및 (B) Fab 단량체의 결정화를 나타낸다.
도 7은 (왼쪽) 항체 CDR을 포함하는 이량체 형성의 개략도 및 (오른쪽) HBC34-v35 Fab 이량체를 보여주는 리본 모델을 나타낸다.
도 8은 (오른쪽) VL-VL 상호작용이 HBC34-v35에서 이량체 형성에 관여하는 것을 예시하고, (왼쪽) L-CDR2 내의 상호작용을 요약한다.
도 9는 L-CDR2 및 경쇄 프레임워크 영역에서 HBC34-v35 Fab-Fab 상호작용의 또 다른 예시를 나타낸다.
도 10은 (왼쪽) HBC34-v35 Fab의 이량체 및 (오른쪽) Fab 단량체의 구조 그림을 나타낸다.
도 11A-11C는 HBC34-v35로부터 조작된 변이체 Fab(변이체는 도 11A에서 "L-CDR2 GL Fab"로 표시되고 본 명세서에서 HBC34-v36으로도 지칭됨)에 의한 감소된 이량체화를 나타내며, 여기서 3개의 L-CDR2 잔기는 HBC34-v35 Fab와 비교하여 생식계열 서열(germline sequence)로 역돌연변이 되었다. (A) 0일 및 5-7일에 절대 크기 배제 크로마토그래피(aSEC)에 의해 정제된 Fab의 퍼센트 이합체. (B) 스트레스를 받은 L-CDR2 GL Fab 샘플의 0일째 SEC 분석. (C) 스트레스를 받은 L-CDR2 GL Fab 샘플의 5일째 SEC 분석.
도 12는 ELISA에 의해 결정된 HBsAg에 대한 HBC34-v35 및 HBC34-v36 결합을 나타낸다. 항체는 야생형 Fc(알로타입 G1m17, 1)와 함께 IgG1로 발현되었다.
도 13은 HBC34-v35 및 HBC34-v36에 의한 HBV 유전자형 D 감염의 시험관내 중화를 나타낸다. 항체는 야생형 Fc(알로타입 G1m17,1)와 함께 IgG1로 발현되었다. 중화는 HBsAg(왼쪽) 또는 HBeAg(오른쪽)를 발현하는 표적 세포의 백분율로 측정되었다. N=1 실험.
도 14A-14E는 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 HBsAg에 대한 추가 항체 HBC34-v37-HBC34-v50(CHO 세포로부터의 정제되지 않은 상청액)의 결합을 나타낸다. 정제된 HBC34-v35가 대조군으로 포함되었다. 항체는 야생형 Fc(알로타입 G1m17,1)와 함께 IgG1로 발현되었다. 계산된 EC50 값은 각 그래프 하단에 표시된다.
도 15는 바이러스 판독값으로서 HBeAg를 사용하여 HBC34-v35 및 본 발명의 특정 항체에 의한 HBV 유전자형 D의 중화를 나타낸다. 각 mAb의 계산된 EC50 값이 오른쪽에 표시된다. HBC34-v35(정제된 IgG 및 상청액) 및 HBC34-v36(정제된 IgG)가 대조군으로 사용되었다.
도 16A-16D는 32일 과정에 걸쳐 HBC34-v35에 존재하는 고분자량 종(HMWS) 및 본 발명에 개시된 9개의 정제된 변이체 항체를 보여주는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 데이터를 나타낸다. HBC34-v35 및 변이체 항체를 약 25mg/mL로 농축하고 다양한 온도에서 배양했다. HMWS는 -1일, 0일, 5일, 15일 및 32일에 SEC에 의해 평가되었다. -1일 샘플은 농축 전에 평가되었다. 항체 조성물을 실험 과정에 걸쳐 4℃(도 16A), 25℃(도 16B) 또는 40℃(도 16C)에서 배양하였다. 40ºC에서 32일 배양 후 HMWS의 빈도는 그림 16D에 요약하였다.
도 17A-17J는 FACS에 의해 결정된 바와 같이 HBC34-v35, HBC34-v40, HBC34-v44, HBC34-v45 및 HBC34-v50에 의한 10가지((A)-(J)) 유전자형의 HBsAg에 대한 결합을 나타낸다. 데이터는 항체 농도(ng/ml)에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다. 모의 염색(Mock-staining)은 음성 대조군을 포함한다.
도 18A-18K는 FACS에 의해 결정된 바와 같이, HBC34-v35, HBC34-v40, HBC34-v44, HBC34-v45, 및 HBC34-v50에 의한 HBsAg-유전자형 D 및 10개의 HBsAg-유전자형 D 돌연변이체에 대한 결합을 나타낸다. 데이터는 항체 농도(ng/ml)에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다. 모의 염색(Mock-staining)은 음성 대조군을 포함한다.
도 19는 HBC34-v35, HBC34-v40, HBC34-v44, HBC34-v45 및 HBC34-v50에 대한 형질감염을 통해 생성된 항체 역가를 나타낸다. 5ml 및 100ml 규모의 형질감염 시스템을 모두 평가했으며, 100ml 시스템은 이중 또는 삼중으로 테스트하였다. 5ml 및 100ml 규모 테스트의 개별적인 항체 역가뿐아니라 100ml 규모 테스트의 평균 역가도 나타낸다(mg/L).
도 20은 HBC34-v35(도면표시 "HBC35"), HBC34-v40("HBC40"), HBC34-v44("HBC44"), HBC34-v45("HBC45") 및 HBC34-v50("HBC50")의 열안정성을 반영하는 SEC 데이터를 나타낸다. 항체를 25mg/ml로 농축하고 HMWS를 정량화하기 전에 4일 동안 40ºC에서 배양하였다.
도 21A-21C, 22A-22C 및 23A-23C는 HBC34-v35에서 보이는 응집을 감소시키기 위한 조작에 선택된 경쇄 아미노산 잔기를 나타낸다. 도 21A, 22A 및 23A는 조작을 위해 선택된 HBC34-v35의 경쇄 CDR2 잔기를 나타낸다. 도 21B, 22B 및 23B는 조작을 위해 선택된 프레임워크 잔기를 나타낸다. 도 21C, 22C 및 23C는 변이체 항체의 부분적 VL 서열의 서열 정렬을 나타낸다.

본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 및 델타 간염 바이러스(HDV)에 대한 면역요법 분야에 관한 것이다. 개시된 결합 단백질, 예를 들어 항체, 항원-결합 단편 및 융합 단백질은 HBV 외피 단백질(HBsAg)의 S 도메인의 항원 루프 영역에 위치한 에피토프에 결합할 수 있고, HBV 감염 및 일부 실시예에서 HDV 감염을 중화시킬 수 있다.

본원에 개시된 결합 단백질은 PCT 공개 번호 WO 2020/132091에 개시된 CDR 및 선택적으로 “HBC34-v35”의 VH 및 VL을 포함하는 항-HBV 항체와 비교하여 유리한 생산 특성(예를 들어, 항체 이량체의 감소된 형성 및/또는 숙주 세포에서 증가된 생산)을 갖는다. 간략하게, HBC34-v35 항체는 유리한 결합 및 중화 특성을 갖지만, 본원에 개시된 바와 같이 항체 생산/정제 동안 경쇄간 상호작용을 통해 항체 이량체를 형성할 수 있다. HBC34-v35 이량체는 HBC34-v35 항체 단량체와 비교하여 HBsAg에 결합하는 능력이 감소되었다. 이량체 형성의 감소는 예를 들어 항체(또는 항원 결합 단편) 생성 효율 및 항체(또는 항원 결합 단편) 용량의 효능을 개선할 수 있다.

특정 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 임의의 또는 모든 공지된 HBsAg 유전자형 뿐아니라 HBsAg 변이체에 결합할 수 있고, HBV 감염 뿐아니라 HDV 감염을 중화시킬 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 HBC34-v35와 비교하여 유사하거나 심지어 증가된 효능으로 HBV 및/또는 HDV에 결합할 수 있고/있거나 중화할 수 있다.

본원은 이러한 결합 단백질을 인코딩하는 핵산 및 발현하는 숙주 세포도 제공한다. 또한, 본원은 질병의 진단, 예방 및 치료뿐만 아니라 스크리닝 방법에서 본원에 개시된 결합 단백질을 사용하는 방법을 제공한다.

예를 들어, 본 설명에 따른 항체, 항원-결합 단편 및 융합 단백질의 실시예는 HBV 및 HDV를 예방, 치료 또는 약독화 또는 진단하는 방법에 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 개시된 항체, 항원-결합 단편 및 융합 단백질은 B형 간염 바이러스 표면 항원의 2개 이상의 상이한 유전자형 및 B형 간염 바이러스 표면 항원의 2개 이상의 상이한 감염성 돌연변이체에 결합한다. 특정 실시예에서, 본원에 개시된 항체, 항원-결합 단편 및 융합 단백질은 B형 간염 바이러스 표면 항원의 모든 공지된 유전자형 및 B형 간염 바이러스 표면 항원의 모든 공지된 감염성 돌연변이체에 결합한다.

본원은 또한 HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제와 함께 항-HBV 항체 또는 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 만성 HBV 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 또한 HBV 유전자 발현의 억제제와 함께 항-HBV 항체 또는 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 만성 HBV 감염을 치료하는 방법을 제공한다.

일부 방법, 사용을 위한 조성물, 또는 본원에 개시된 용도에서, HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제 또는 HBV 유전자 발현 억제제는 RNAi 작용제(예를 들어, HBV001 또는 HBV002 또는 HBV003과 같은 siRNA)이다.

본원에 개시된 내용을 보다 상세하게 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용되는 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 이를 이해하는 데 도움이 될 수 있다. 추가적인 정의는 본 명세서 전반에 걸쳐 개시된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 해당 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함하다" 및 "포함하다(comprise)" 및 "포함하는(comprises 및 comprising)"과 같은 변형은 예를 들어 "갖는(having)", "갖는(has)", "포함하는(including)", "포함하는(includes)" 등과 동의어로 사용되고, 명시된 구성원, 비율, 정수(적절한 경우 이의 분수 포함, 예를 들어 정수의 10분의 1 및 100분의 1), 농도 또는 단계의 포함을 의미하지만 다른 명시되지 않은 구성원, 비율, 정수, 농도 또는 단계의 요소를 배제하는 것은 아니다. 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 언급되지 않는 한 인용된 범위 내의 임의의 정수 값 및 적절할 경우 그 분수(예: 정수의 10분의 1 및 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 중합체 서브유닛, 크기 또는 두께와 같은 임의의 물리적 특징과 관련하여 본원에 인용된 임의의 숫자 범위는 달리 나타내지 않는 한 인용된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

"본질적으로 구성된"이라는 용어는 "포함하는"과 동일하지 않으며 청구 범위의 특정 재료 또는 단계 또는 청구 대상의 기본 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 도메인, 영역, 모듈(예: 결합 도메인) 또는 단백질의 아미노산 서열이 확장, 결실, 돌연변이 또는 이들의 조합(예를 들어, 아미노- 또는 카복시-말단 또는 도메인 사이의 아미노산)을 포함할 때, 단백질 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질이 특정 아미노산 서열로 "본질적으로 구성"된다. 여기서 조합은, 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질 길이의 최대 20%(예: 최대 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)에 기여하고 도메인(들), 영역(들), 모듈(들) 또는 단백질의 활성(예를 들어, 결합 단백질의 표적 결합 친화도)에 실질적으로 영향(즉, 활성을 50% 이상 감소시키지 않음, 예를들어40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 보다 많지 않음)을 미치지 않는다.

또한, 본원에 개시된 구조 및 치환기의 다양한 조합으로부터 유도된 개별 화합물 또는 화합물 그룹은 각각의 화합물 또는 화합물 그룹이 개별적으로 설정된 것과 동일한 정도로 본 출원에 의해 개시되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 특정 구조 또는 특정 치환기의 선택은 본 발명에 개시된 범위 내에 있다.

"a" 및 "an" 및 "the" 및 본 개시내용을 설명에서 사용되는 유사한 표현(청구범위 포함)는 본원에서 달리 언급하거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 단수 및 복수 모두를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 대안의 사용(예: "또는")은 대안 중 하나, 둘 다 또는 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위에 대한 언급은 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로 사용하기 위한 것이다. 본 명세서에서 달리 나타내지 않는 한, 각 개별 값은 본 명세서에서 개별적으로 개시된 대로 본 명세서에 포함된다. 명세서의 어떤 표현도 청구되지 않은 요소를 본원에 개시된 대상의 실시에 필수적임을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.

"실질적으로"라는 단어는 "완전히"를 배제하지 않는다; 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 특정 실시예에서, "실질적으로"는 참조된 조성물, 방법 또는 용도의 것과 비교하여 본 개시내용의 조성물, 방법 또는 용도의 주어진 양, 효과 또는 활성을 지칭하고, 참조 조성물, 방법 또는 용도의 양, 효과 또는 활성의 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 이하와 같이 50% 이하의 양, 효과 또는 활성으로 감소하는 것을 설명한다.

본원에서 사용되는 "약"이라는 용어는 달리 나타내지 않는 한 표시된 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 특정 실시예에서, "약"은 ±15%, ±10%, 또는 ±5%를 포함한다.

"선택적" 또는 "선택적으로"는 이후에 설명된 요소, 구성 요소, 이벤트 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있음을 의미하며, 설명에는 해당 요소, 구성 요소, 이벤트 또는 상황이 발생하는 사례와 발생하지 않는 사례가 포함됨을 의미한다.

본원에서 사용되는 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유도체(analogs) 및 아미노산 유사체(mimetics)를 의미한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩된 아미노산뿐만 아니라 그 후 변형된 아미노산, 예를들어 하이드록시프롤린(hydroxyproline), γ-카복시글루타메이트(γ-carboxyglutamate) 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)이다. 아미노산 유도체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조(즉 수소, 카복실기, 아미노기 및 R기(예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄)에 결합된 α-탄소)를 갖는 화합물을 지칭한다. 이러한 유도체는 변형된 R 그룹(예: 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 유사체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 구조가 다르지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화합물을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질" 및 이들 용어의 변형은 (정상 또는 변형된) 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 분자를 지칭한다. 따라서, 단백질 또는 폴리펩티드는 아미노산 잔기의 중합체를 포함한다. 예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 유전자 코드 또는 아미노산 유도체 또는 유사체에 의해 정의된 20개의 아미노산으로부터 선택된 다수의 아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있으며, 각각은 펩티드 결합에 의해 적어도 다른 하나와 연결된다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 L-아미노산 및/또는 D-아미노산(또는 이의 유도체 또는 유사체)을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 용어 "펩티드", "폴리펩티드", "단백질"은 또한 펩티드가 천연 모(parent) 펩티드의 생물학적 작용(들)을 모방하거나 길항할 수 있는 비펩티드 구조 요소를 포함하는 펩티드 유도체로 정의되는 "펩티도미메틱(peptidomimetics)"을 포함한다. 특정 실시예에서, 펩티도미메틱은 효소적으로 절단 가능한 펩티드 결합과 같은 특성이 결여되어 있다.

펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 이들 아미노산에 더하여 유전자 코드에 의해 정의된 20개 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있거나, 유전자 코드에 의해 정의된 20개 아미노산 이외의 아미노산으로 구성될 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명의 맥락에서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 번역 후 성숙 과정과 같은 자연 과정에 의해 또는 당업계에 공지 및 본원에 개시된 것을 포함하는 화학적 과정(예를 들어, 합성 과정)에 의해 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 폴리펩티드의 어느 곳에서나 나타날 수 있다; 예를 들어, 펩티드 골격; 아미노산 사슬; 또는 카복시 말단 또는 아미노 말단 끝. 펩티드 또는 폴리펩티드는 유비퀴틴화 후와 같이 분지형일 수 있거나, 분지가 있거나 없는 환형일 수 있다. 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 또한 변형된 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 고정, 지질 또는 지질 유도체의 공유 고정, 포스파티딜이노시톨의 공유 고정, 공유 또는 비공유 가교, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 페길화를 포함한 글리코실화, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 세네로일화, 황산화, 아르기닐화와 같은 아미노산 첨가 또는 유비퀴틴화를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 문헌에 기술되어 있다(단백질 구조 및 분자 특성 (1993) 2nd Ed., T. E. Creighton, New York; 단백질의 번역 후 공유 결합 변형 (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York; Seifter et al.(1990) 단백질 변형 및 비단백질 보조인자 분석, Meth. Enzymol. 182: 626-646 및 Rattan et al., (1992) 단백질 합성: 번역 후 변형 및 노화, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62). 따라서, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", "단백질"은 예를 들어 리포펩티드, 지단백질, 당펩티드, 당단백질 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드의 변이체가 또한 고려된다. 특정 실시예에서, 변이체 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 개시된바와 같이 정의된 아미노산 서열 또는 참조된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 구성된다.

본원에서 사용되는 "(폴리)펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합에 의해 연결된 복수의 아미노산 단량체와 같은 아미노산 잔기의 중합체와 관련하여 상호교환적으로 사용될 수 있다.

"핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 천연 서브유닛(예: 퓨린 또는 피리미딘 염기) 또는 비-천연 서브유닛(예: 모르폴린 고리)으로 구성될 수 있는 공유 결합된 뉴클레오티드를 포함하는 고분자 화합물을 의미한다. 퓨린 염기에는 아데닌, 구아닌, 하이포크산틴 및 크산틴이 포함되며 피리미딘 염기에는 우라실, 티민 및 시토신이 포함된다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 결합의 유도체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 결합의 유도체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트 등을 포함한다.

핵산 분자는 폴리리보핵산(RNA), cDNA를 포함하는 폴리데옥시리보핵산(DNA), 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하며, 이들 중 임의의 것은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥인 경우 핵산 분자는 코딩 가닥 또는 비코딩(안티센스 가닥)일 수 있다. 마이크로RNA, siRNA, 바이러스 게놈 RNA 및 합성 RNA도 고려된다. 폴리뉴클레오티드(올리고뉴클레오티드 포함) 및 이의 단편은 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 시험관 내 번역에 의해 생성되거나 결찰, 절단, 엔도뉴클레아제 작용 또는 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 생성될 수 있다.

아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자는 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열의 일부 버전은 인트론(들)이 동시 또는 전사후 메커니즘을 통해 제거될 수 있는 정도로 인트론(들)을 포함할 수도 있다. 상이한 뉴클레오티드 서열은 유전자 코드의 중복(redundancy) 또는 축퇴(degeneracy)의 결과, 또는 스플라이싱(splicing) 또는 둘 다의 결과로 동일한 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다.

본 개시내용의 핵산 분자의 변이체가 또한 고려된다. 변이체 핵산 분자는 본원에 개시된바와 같이, 정의된 핵산 분자 또는 참조된 핵산 분자와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일하거나, 또는 약 65-68℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 구연산나트륨 또는 약 42℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 구연산나트륨 및 50% 포름아미드의 엄격한 혼성화 조건 하에 폴리뉴클레오티드에 혼성화된다. 핵산 분자 변이체는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 것과 같이 본원에 개시된 기능성을 갖는 융합 단백질 또는 이의 결합 도메인을 인코딩하는 능력을 보유한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 변이체"는 참조 서열과 비교하여 하나 이상의 변경을 갖는 임의의 서열을 말하며, 여기서 참조 서열은 임의의 공개된 서열 및/또는 "서열 및 서열 번호의 표" (서열 목록)에 열거된 서열이다. 따라서, "서열 변이체"라는 용어는 뉴클레오티드 서열 변이체 및 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 특정 실시예에서, 뉴클레오티드 서열과 관련하여 서열 변이체는 참조 서열은 뉴클레오티드 서열이기도 한 반면, 아미노산 서열과 관련하여 서열 변이체에 대한 특정 실시예에서 참조 서열은 아미노산 서열이기도 하다. 본원에 사용된 "서열 변이체"는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 참조 서열과 동일하다.

"서열 동일성 백분율"은 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같은 2개 이상의 서열 사이의 관계를 의미한다. 서열 동일성을 결정하는 방법은 비교되는 서열 사이에 최상의 매치를 제공하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬될 수 있다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있다). 또한, 비-상동 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다. 본원에서 언급된 서열 동일성 백분율은 달리 나타내지 않는 한 참조 서열의 길이에 대해 계산된다. 서열 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공지된 사용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 찾을 수 있다. 서열 정렬 및 동일성 백분율 계산은 BLAST 프로그램(예: BLAST 2.0, BLASTP, BLASTN 또는 BLASTX)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 프로그램에 사용된 수학적 알고리즘은 Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997에서 찾을 수 있다. 본 개시 내용 내에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용되는 경우, 분석 결과는 참조된 프로그램의 "디폴트 값"을 기반으로 하는 것으로 이해될 것이다. "기본값"은 처음 초기화할 때 소프트웨어와 함께 원래 로드되는 모든 값 또는 매개변수 집합을 의미한다.

핵산(뉴클레오티드) 서열과 관련하여 "서열 변이체"는 참조 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실 또는 치환되거나 하나 이상의 뉴클레오티드가 참조된 뉴클레오티드 서열에 삽입된, 변경된 서열을 가진다. 뉴클레오티드는 표준 한 글자 지정(A, C, G 또는 T)으로 본원에서 언급된다. 유전자 코드의 축퇴로 인해, 뉴클레오티드 서열의 "서열 변이체"는 각각의 참조 아미노산 서열, 즉 아미노산 "서열 변이체"의 변화를 초래할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 특정 실시예에서, 뉴클레오티드 서열 변이는 아미노산 서열 변이(예를 들어, 침묵 돌연변이)를 초래하지 않는다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 "비침묵" 돌연변이를 초래하는 뉴클레오티드 서열 변이체가 고려된다. 일부 실시예에서, 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열 변이체는 참조 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 본원에 개시된 바와 같은 뉴클레오티드 및 아미노 서열은 또한 참조 또는 야생형 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 코돈-최적화 버전을 지칭한다. 본원에 개시된 임의의 실시예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 대해 코돈-최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 알려진 기술 및 도구, 예를 들어 GenScript® OptimumGeneTM 도구 또는 GeneArt 유전자 합성 도구(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행할 수 있다. 코돈-최적화된 서열은 부분적으로 코돈-최적화된(즉, 적어도 하나의 코돈이 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화됨) 서열 및 완전히 코돈-최적화된 서열을 포함한다.

아미노산 서열과 관련하여 "서열 변이체"는 참조 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 삽입된 변경된 서열을 갖는다. 변경의 결과, 이러한 서열 변이체는 참조 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, 참조 서열의 100개 아미노산당 10개 이하의 변경, 즉 결실, 삽입 또는 치환의 임의의 조합을 갖는 변이체 서열은 참조 서열과 "적어도 90% 동일"하다.

"보존적 치환"은 특정 단백질의 결합 특성에 상당한 영향 또는 변경시키지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 일반적으로, 보존적 치환은 치환된 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 보존적 치환은 다음 그룹 중 하나의 치환을 포함한다: 그룹 1: 알라닌(Ala 또는 A), 글리신(Gly 또는 G), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T); 그룹 2: 아스파르트산(Asp 또는 D), 글루탐산(Glu 또는 Z); 그룹 3: 아스파라긴(Asn 또는 N), 글루타민(Gln 또는 Q); 그룹 4: 아르기닌(Arg 또는 R), 라이신(Lys 또는 K), 히스티딘(His 또는 H); 그룹 5: 이소류신(Ile 또는 I), 류신(Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 발린(Val 또는 V); 및 그룹 6: 페닐알라닌(Phe 또는 F), 티로신(Tyr 또는 Y), 트립토판(Trp 또는 W). 추가로 또는 선택적으로, 아미노산은 유사한 기능, 화학 구조 또는 조성(예: 산성, 염기성, 지방족, 방향족 또는 황 함유)에 의해 보존적 치환 그룹으로 그룹화될 수 있다. 예를 들어, 지방족 그룹화는 치환을 위해 Gly, Ala, Val, Leu 및 Ile을 포함할 수 있다. 다른 보존적 치환 그룹은: 황 함유: Met 및 시스테인(Cys 또는 C); 산성: Asp, Glu, Asn 및 Gln; 작은 지방족, 비극성 또는 약한 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; 극성, 음전하 잔기 및 이들의 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; 극성, 양전하 잔기: His, Arg 및 Lys; 큰 지방족 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp을 포함한다. 추가 정보는 Creighton (1984) 단백질, W.H. 프리먼 앤 컴퍼니에서 찾을 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 1개 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함할 수 있다. 말단 삽입의 예는 리포터 분자 또는 효소에 대한 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.

일반적으로, 서열 변이의 변경은 각각의 참조 서열의 원하는 기능을 없애거나 상당히 감소시키지 않는다. 예를 들어, 본원에 개시된 변이체 서열은 HBV 및 HDV의 감염을 충분히 중화시키기 위해 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 서열의 기능성을 유의하게 감소시키거나 없애지 않고 및/또는 항체 이량체의 형성을 유발하거나 증가시키지 않고 및/또는 참조 서열을 갖는(또는 이에 의해 인코딩되는) 항체 또는 항원 결합 단편과 비교하여 숙주 세포에서 더 낮은 역가로 생성되지 않는 것이 바람직하다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 특정 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 "유도된" 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 기원을 지칭한다. 특정 서열로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 그것이 유래된 그 서열 또는 이의 일부와 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 여기서 "본질적으로 동일한"은 상기 정의된 바와 같은 서열 변이체를 포함한다. 특정 펩티드 또는 단백질로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 특정 펩티드 또는 단백질의 상응하는 도메인으로부터 유래될 수 있다. 이 문맥에서 "해당"은 관심 있는 동일한 기능 또는 특성을 갖는 것을 의미한다. 예를 들어, "세포외 도메인"은 또 다른 "세포외 도메인"(다른 단백질의)에 해당하거나, "막관통 도메인"은 또 다른 "막관통 도메인"(다른 단백질의)에 해당한다. 따라서 펩티드, 단백질 및 핵산의 "상응하는" 부분은 당업자에게 쉽게 식별될 수 있다. 마찬가지로, 다른(예를 들어, "소스") 서열에서 "유도된" 서열은 소스 서열에서 그 기원을 갖는 것으로 당업자에 의해 식별될 수 있다.

다른 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유도된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 (유도된) 출발 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 동일할 수 있다. 그러나, 다른 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유도된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 (그것이 유도된) 출발 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 특히 다른 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유도된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 (이로부터 유도된)출발 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 상기 기재된 바와 같은 기능적 서열 변이체일 수 있다. 예를 들어, 펩티드/단백질에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있거나, 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 결실될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "돌연변이"라는 용어는 참조 서열(예를 들어, 해당 게놈, 야생형 또는 참조 서열)과 비교하여 핵산 서열 및/또는 아미노산 서열의 변경과 관련된다. 돌연변이는 예를 들어 (자연 발생) 체세포 돌연변이, 자발적 돌연변이, 유도된 돌연변이(예를 들어 효소, 화학 물질 또는 방사선에 의해 유도됨), 또는 부위 지정 돌연변이 유발(핵산 서열 및/또는 아미노산 서열에 특이적이고 의도적인 변화를 만들기 위한 분자 생물학 방법)에 의해 얻은 돌연변이일 수 있다. 따라서 "돌연변이" 또는 "돌연변이시키는"이라는 용어는 예를 들어 핵산 서열 또는 아미노산 서열에서 물리적으로 돌연변이를 만들거나 유도하는 것도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이에는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입뿐만 아니라 여러 연속적인 뉴클레오티드 또는 아미노산의 역위가 포함된다. 아미노산 서열에서 돌연변이를 달성하기 위해, (재조합) 돌연변이 폴리펩티드를 발현하기 위해 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이가 도입될 수 있다. 돌연변이는 예를 들어 하나의 아미노산을 인코딩하는 핵산 분자의 코돈(예: 부위 지정 돌연변이 유발)을 변경하여(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드 염기를 교대함으로써) 다른 아미노산을 인코딩하거나 동일한 아미노산을 인코딩하는 코돈을 제공하거나 서열 변이체를 합성함으로써 달성될 수 있다.

"기능적 변이체"는 본 개시내용의 모체 또는 참조 화합물과 구조적으로 유사하거나 실질적으로 구조적으로 유사하지만 조성이 약간 다른(예를 들어, 하나의 염기, 원자 또는 작용기가 상이하거나, 추가되거나, 제거됨) 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 따라서 폴리펩티드 또는 코딩된 폴리펩티드는 적어도 50% 효율, 바람직하게는 적어도 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100% 수준의 모 폴리펩티드 활성 효율로 모 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능을 수행할 수 있다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드 또는 인코딩된 폴리펩티드의 기능적 변이체는 기능적 변이체가 결합 친화도를 측정하기 위한 분석(예를 들어, 결합(Ka) 또는 해리(KD) 상수를 측정하는 Biacore® 또는 사량체 염색)과 같은 모체 또는 참조 폴리펩티드와 비교하여 선택된 분석에서 성능의 50% 이하 감소를 나타내는 경우, "유사한 결합", "유사한 친화성" 또는 "유사한 활성"을 갖는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "기능적 부분" 또는 "기능적 단편"은 모체 또는 참조 화합물의 도메인, 부분 또는 단편만을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 말하며, 폴리펩티드 또는 인코딩된 폴리펩티드는 모 또는 참조 화합물의 도메인, 부분 또는 단편과 관련하여 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 %, 99.9%, 또는 100% 수준의 모 폴리펩티드 활성을 유지하거나, 또는 생물학적 이점(예: 이펙터 기능)을 제공한다. 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 인코딩된 폴리펩티드의 "기능적 부분" 또는 "기능적 단편"은 기능적 부분 또는 단편이 기능적 부분 또는 단편이 모체 또는 참조 폴리펩티드와 비교하여 선택된 분석에서 성능이 50% 이하(바람직하게는 20% 또는 10% 이하, 또는 친화도와 관련하여 모체 또는 참조와 비교하여 로그 차이 이하)로 감소하는 경우, "유사한 결합" 또는 "유사한 활성"을 갖는다.

"단리된(isolated)"이라는 용어는 재료가 원래 환경(예: 자연적으로 발생하는 경우 자연 환경)에서 제거되었음을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 핵산 또는 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 자연계에 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 핵산 또는 폴리펩티드는 단리된다. 그러한 핵산은 벡터의 일부일 수 있고 및/또는 그러한 핵산 또는 폴리펩티드는 조성물(예를 들어, 세포 용해물)의 일부일 수 있고, 그러한 벡터 또는 조성물이 핵산 또는 폴리펩티드를 위한 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리될 수 있다. "단리된"은 일부 실시예에서, 인체 외부에 있는 항체, 항원 결합 단편, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 구성물을 설명할 수 있다.

"유전자"라는 용어는 폴리펩티드 사슬을 생산하는 데 관여하는 DNA 또는 RNA의 분절을 의미한다; 특정 문맥에서, 이는 코딩 영역(예를 들어, 5' 비번역 영역(UTR) 및 3' UTR)의 전후 영역뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함한다.

핵산 분자를 세포에 삽입하는 맥락에서 "도입된"이라는 용어는 "형질감염", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하고 핵산 분자를 진핵 또는 원핵 세포로 도입하는 것을 의미하며, 여기서 핵산 분자는 세포의 게놈(예: 염색체, 플라스미드, 색소체 또는 미토콘드리아 DNA)에 통합되거나, 자율 레플리콘으로 변환되거나, 일시적으로 발현(예: 형질감염된 mRNA)될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "재조합"(예를 들어, 재조합 항체, 재조합 단백질, 재조합 핵산 등)은 제조되고, 발현되고, 재조합 수단에 의해 생성 또는 단리되고 자연적으로 발생하지 않는 임의의 분자(항체, 단백질, 핵산 등)를 지칭한다. "재조합"은 "조작된" 또는 "비-천연"과 동의어로 사용될 수 있으며 유기체, 미생물, 세포, 핵산 분자 또는 적어도 하나의 유전적 변경을 포함하거나 외인성 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 벡터를 지칭할 수 있다. 여기서 이러한 변경 또는 변형은 유전 공학(즉, 인간 개입)에 의해 도입된다. 유전적 변경에는 예를 들어 단백질, 융합 단백질 또는 효소를 인코딩하는 발현 가능한 핵산 분자를 도입하는 변형, 또는 세포 유전 물질의 기타 핵산 분자 추가, 삭제, 대체 또는 기타 기능적 파괴가 포함된다. 추가 변형은 예를 들어 변형이 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 오페론의 발현을 변경하는 비인코딩 조절 영역을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "이종" 또는 "비-내인성" 또는 "외인성"은 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자, 또는 숙주 세포 또는 대상체에 고유하지 않은 활성, 또는 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자, 숙주 세포 고유의 활성 또는 변경된 개체를 지칭한다. 이종(Heterologous), 비내인성(non-endogenous) 또는 외인성(exogenous)은 구조, 활성 또는 두 가지 모두가 천연 및 변경된 유전자, 단백질, 화합물 또는 핵산 분자 사이에서 상이하도록 돌연변이되거나 달리 변경된 유전자, 단백질, 화합물 또는 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시예에서, 이종, 비내인성 또는 외인성 유전자, 단백질 또는 핵산 분자는 숙주 세포 또는 대상에 대해 내인성이 아닐 수 있지만, 대신 이러한 유전자, 단백질 또는 핵산 분자를 인코딩하는 핵산은 컨쥬게이션, 형질전환, 형질감염, 전기천공 등에 의해 숙주 세포에 첨가되었을 수 있으며, 여기에서 첨가된 핵산 분자는 숙주 세포 게놈으로 통합될 수 있거나 염색체외 유전 물질로서(예를 들어, 플라스미드 또는 다른 자가 복제 벡터로서) 존재할 수 있다. 용어 "상동" 또는 "상동"은 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자, 또는 숙주 세포, 종 또는 계통에서 발견되거나 유래된 활성을 의미한다. 예를 들어, 이종 또는 외인성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자는 천연 폴리뉴클레오티드 또는 유전자에 대해 상동일 수 있고 상동 폴리펩티드 또는 활성을 인코딩할 수 있지만, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 변경된 구조, 서열, 발현 수준 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 비-내인성 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 뿐만 아니라 인코딩된 폴리펩티드 또는 활성은 동일한 종, 상이한 종 또는 이들의 조합으로부터 유래될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "내인성" 또는 "천연"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드, 유전자, 단백질, 화합물, 분자, 또는 일반적으로 숙주 세포 또는 대상체에 존재하는 활성을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "발현"은 유전자와 같은 핵산 분자의 인코딩 서열에 기초하여 폴리펩티드가 생산되는 과정을 의미한다. 상기 과정은 전사, 전사 후 제어, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 제어, 번역 후 변형 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 발현된 핵산 분자는 전형적으로 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결된다.

"작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편에 2개 이상의 핵산 분자가 결합(association)된 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 제어하에 있음) 코딩 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. "연결되지 않음"은 연관된 유전 요소가 서로 밀접하게 연관되지 않고 하나의 기능이 다른 것에 영향을 미치지 않음을 의미한다.

본원에 기술된 바와 같이, 하나 초과의 이종 핵산 분자는 별도의 핵산 분자로서, 개별적으로 제어되는 복수의 유전자로서, 폴리시스트론 핵산 분자로서, 단백질을 인코딩하는 단일 핵산 분자로서 또는 임의의 핵산 분자로서(예를 들어, 항체의 중쇄), 또는 이들의 조합으로서 숙주 세포에 도입될 수 있다. 2개 이상의 이종 핵산 분자가 숙주 세포 내로 도입될 때, 2개 이상의 이종 핵산 분자는 단일 부위 또는 다중 부위, 또는 이들의 임의의 조합에서 숙주 염색체에 통합된 별개의 벡터 상에서 단일 핵산 분자로서(예를 들어, 단일 벡터 상에) 도입될 수 있는 것으로 이해된다. 참조된 이종 핵산 분자 또는 단백질 활성의 수는 숙주 세포에 도입된 별도의 핵산 분자의 수가 아니라 인코딩 핵산 분자의 수 또는 단백질 활성의 수를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며 이러한 모든 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 용어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 및 "숙주 세포"는 전달 횟수에 관계없이 일차 대상 세포 및 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한 고의적이거나 부주의한 돌연변이로 인해 모든 자손이 DNA 내용물에서 정확히 동일하지 않을 수 있다는 것으로도 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일하거나 실질적으로 동일한 기능, 표현형 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다. 구별되는 지정이 의도된 경우 그것은 문맥상 명확할 것이다.

용어 "작제물"은 재조합 핵산 분자(또는 문맥에서 명확하게 나타내면 본 개시내용의 융합 단백질)를 함유하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

특정 실시예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 벡터의 특정 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 이들이 결찰된 코딩 서열의 발현 및 처리에 영향을 미치기 위해 필요한 폴리뉴클레오티드 서열은 작동가능하게 연결될 수 있다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열을 포함할 수 있으며; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율성을 향상시키는 서열(즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 아마도 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은 관심 유전자 및 관심 유전자를 제어하기 위해 트랜스로 또는 거리를 두고 작용하는 발현 제어 서열과 인접하는 경우 작동가능하게 연결될 수 있다.

항체 및 항원 결합 단편

본원에 개시된 실시예는 HBsAg의 항원성 루프 영역(HBsAg 및 항원성 루프 영역은 본원에서 더 상세히 설명됨)에 결합할 수 있고 선택적으로 유전자형 D, A, B, C, E, F, G, H, I 또는 J 또는 이들의 조합의 B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염을 중화시킬 수 있는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다; 즉, 임의의 1, 임의의 2, 임의의 3, 임의의 4, 임의의 5, 임의의 6, 임의의 7, 임의의 8, 임의의 9 또는 모든 10개의 이러한 유전자형. 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이, 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 예를 들어 숙주 세포에서의 생성을 선호하는 특징 및 바람직하지 않은 응집체, 예컨대 이량체를 형성하는 경향을 감소시키는 특성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 이점을 갖는다.

본원에 사용된 바와 같이, 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한, "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중(H) 사슬 및 2개의 경(L) 사슬을 포함하는 무손상 항체를 지칭(비록 경쇄가 결여된 중쇄 항체는 여전히 일반적으로 "항체"라는 용어에 포함되는 것으로 이해될 것이지만, 본원에 개시된 바람직한 실시예는 VH 및 VL 모두를 포함하고, 일부 실시예에서는 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 포함)할 뿐만 아니라 온전한 항체에 의해 인식되는 항원 표적 분자에 결합하는 능력을 갖거나 유지하는 온전한 항체의 임의의 항원-결합 부분 또는 단편, 예를 들어 scFv, Fab 또는 F(ab')2 단편을 포함한다. 따라서, 본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 온전한 항체 및 이의 기능적(항원-결합) 항체 단편, 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rIgG) 단편, 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함한 단일 사슬 항체 단편, 및 단일 도메인 항체(예: sdAb, sdFv, 나노바디) 단편을 포함하는 다클론 및 단일클론 항체를 포함한다. 상기 용어는 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체 및 헤테로컨쥬게이트 항체, 다중특이적, 예를 들어 이중특이적, 항체, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디, 탠덤 di-scFv, tandem tri-scFv, 및 당업계에 공지된 기타 항체 형식과 같은 유전적으로 조작된 및/또는 달리 변형된 형태의 면역글로불린을 포함한다. 달리 언급하지 않는 한, 용어 "항체"는 이의 기능적 항체 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "항체"는 또한 IgG 및 이의 서브 클래스(IgG1, IgG2, IgG2, IgG4), IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 부류 또는 이의 서브 클래스의 항체를 포함하는 무손상 또는 전장 항체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 항체와 관련하여 용어 "항원-결합 단편", "단편" 및 "항체 단편"은 항체의 항원-결합 활성을 갖는 본원에 개시된 항체의 임의의 단편을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 항체 단편의 예는 단쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

인간 항체는 공지되어 있다(예를 들어, van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체는 면역화 시 내인성 면역글로불린 생성 없이 인간 항체의 전체 목록 또는 선택을 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물(예: 마우스)에서 생성될 수 있다. 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 배열을 전달하면 항원 공격 시 인간 항체가 생성될 것이다(예를 들어, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A. 등, Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M. 등, Year Immunol. 7 (1993) 3340). 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리에서 생성될 수 있다(Hoogenboom, H. R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222) (1991) 581-597). Cole 등의 기술. 및 Boerner et al. 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다(Cole et al., 단클론항체와 암치료, Alan R. Liss, p. 77 (1985); 및 Boerner, P., et al., J. Immunol. 147( 1991) 86-95). Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. (2004)에 설명된 바와 같이 개선된 EBV-B 세포 불멸화를 이용하여 인간 단클론 항체를 제조할 수 있다: 기억 B 세포로부터 인간 단클론 항체를 만드는 효율적인 방법: SARS 코로나바이러스의 강력한 중화. Nat Med. 10(8):871-5. 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또한 예를 들어 가변 영역 또는 불변 영역에서 변형되어 본원에 개시된 항체 및 항체 단편에 따른 특성을 생성하는 이러한 항체를 포함한다.

본원의 개시에 따른 항체는 임의의 이소형(예를 들어, IgA, IgG, IgM, IgE, IgD; 즉, α, γ, μ, ε, 또는 δ 중쇄를 포함함)일 수 있다. 예를 들어, IgG 이소타입 내에서 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스일 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 개시된 항체는 IgG1 항체이다. 본원에서 제공되는 항체 또는 항원 결합 단편은 κ 또는 λ 경쇄를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 λ 경쇄를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 기재된 HBsAg 특이적 항체는 IgG 이소형(예를 들어, IgG1M,171 알로타입)이고 감염된 세포로부터 HBV 및 HBsAg의 방출을 차단할 수 있다. 따라서, 특정 실시예에서, 본 설명에 따른 항체는 세포내에서 결합할 수 있고 이로써 HBV 비리온 및 HBsAg의 방출을 차단할 수 있다.

용어 "VL" 또는 "VL" 및 "VH" 또는 "VH"는 각각 항체 경쇄 및 항체 중쇄로부터의 가변 영역(가변 도메인이라고도 함)을 의미하고; 전형적으로, 이들 영역은 항원에 대한 항체 또는 항원-결합 단편의 결합에 직접 관여한다. VL(뿐만 아니라 CL 또는 경쇄)은 카파(κ) 클래스(또한 본 명세서에서 "VK") 또는 람다(λ) 클래스일 수 있다. 가변 결합 영역은 "상보성 결정 영역"(CDR) 및 "프레임워크 영역"(FR)으로 알려진 개별 하위 영역을 포함한다. 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 "초가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어이며 일반적으로 항체의 항원 특이성 및/또는 결합 친화성을 함께 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산 서열을 지칭하며, 여기서 연속적인 CDR(즉, CDR1 및 CDR2, CDR2 및 CDR3)은 프레임워크 영역에 의한 1차 아미노산 서열에서 서로 분리되어 있다. 각 가변 영역에는 3개의 CDR이 있다(HCDR1, HCDR2, HCDR3; LCDR1, LCDR2, LCDR3; 각각 CDRH 및 CDRL이라고도 함). 특정 실시예에서, 항체 VH는 다음과 같은 4개의 FR 및 3개의 CDR을 포함한다: FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4; 그리고 항체 VL은 다음과 같은 4개의 FR 및 3개의 CDR을 포함한다: FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4. 일반적으로, VH 및 VL은 함께 그들의 각각의 CDR을 통해 항원-결합 부위를 형성하지만, 일부 경우에 결합 부위는 CDR(들)이 VH, VL 또는 둘 다에 배치될 수 있는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 CDR에 의해 형성될 수 있거나 이를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다.

특정 실시예에서, 항체 CDR 및 가변 영역의 아미노산 넘버링은 Chemical Computing Group("CCG")에 의해 개발된 시스템에 따른다; 예를 들어 분자 작동 환경(MOE) 소프트웨어(www.chemcomp.com)를 사용한다.

특정 실시예에서, 가변 영역의 항체 CDR 및 아미노산 넘버링은 IMGT 넘버링 체계에 따른다(예를 들어, Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003 참조).

등가 잔기 위치에 주석을 달 수 있고 항원 수용체 번호 매기기 및 수용체 분류(ANARCI) 소프트웨어 도구를 사용하여 서로 다른 분자를 비교할 수 있다(2016, Bioinformatics 15:298-300).

본원에 사용된 바와 같이, CDR의 "변이체"는 1-3개 이하의 아미노산 치환, 결실 또는 이들의 조합을 갖는 CDR 서열의 기능적 변이체(본원에 제공된 바와 같음)를 지칭한다.

특정 실시예에서, 본 개시내용은 (i) 서열번호 34의 아미노산 서열, 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열, 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 (ii) 서열번호 41, 40, 42 및 43 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열번호 49, 44-48 및 50-53 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열 및 서열번호 55 또는 56에 따른 아미노 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.

여기서 선택적으로, VL은 서열번호 58에 비해 R60N 치환 돌연변이, R60A 치환 돌연변이, R60K 치환 돌연변이, S64A 치환 돌연변이, I74A 치환 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 치환 돌연변이(들)의 아미노산 번호는 서열번호 58에 따르며, 더 나아가 선택적으로, 여기서 VL은 서열번호 58에 비해 임의의 추가 돌연변이(들)를 포함하지 않는다.

그리고 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합할 수 있고, 선택적으로 유전자형 D, A, B, C, E, F, G, H, I 또는 J 또는 이들의 조합의 B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염을 중화시킬 수 있다.

일부 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:

(i) VH에서 각각 서열번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에서 각각 서열번호 41, 45 및 55에 따른 아미노산 서열; (ii) VH에서 각각 서열번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에서 각각 서열번호 41, 46 및 55에 따른 아미노산 서열; (iii) VH에서 각각 서열번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에서 각각 서열번호 41, 47 및 55에 따른 아미노산 서열; (iv) VH에서 각각 서열번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에서 각각 서열번호 41, 48 및 55에 따른 아미노산 서열; (v) VH에서 각각 서열번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에서 각각 서열번호 41, 49 및 55에 따른 아미노산 서열; (vi) VH에서 각각 서열번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에서 각각 서열번호 41, 50 및 55에 따른 아미노산 서열; (vii) VH에서 각각 서열번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에서 각각 서열번호 41, 51 및 55에 따른 아미노산 서열; (viii) VH에서 각각 서열번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에서 각각 서열번호 41, 52 및 55에 따른 아미노산 서열; 또는 (ix) VH에서 각각 서열번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에서 각각 서열번호 41, 53 및 55에 따른 아미노산 서열.

특정 실시예에서, 본 개시내용은 (i) 서열번호 34에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 35 또는 36에 따른 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 37에 따른 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 (ii) 서열번호 40-43 중 어느 하나에 제시된 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 45-53 중 어느 하나에 따른 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 55 또는 56에 따른 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 CDR은 CCG에 따른 것이며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HBsAg의 항원 루프 영역에 결합할 수 있고 유전자형 D, A, B, C, E, F, G, H, I 또는 J 또는 이들의 조합의 B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염을 중화시킬 수 있다.

특정 실시예에서, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열은 서열 번호: (i) 각각 34, 35, 37, 41, 45 및 55; (ii) 각각 34, 35, 37, 41, 46 및 55; (iii) 각각 34, 35, 37, 41, 47 및 55; (iv) 각각 34, 35, 37, 41, 48 및 55; (v) 각각 34, 35, 37, 41, 49 및 55; (vi) 각각 34, 35, 37, 41, 50 및 55; (vii) 각각 34, 35, 37, 41, 51 및 55; (viii) 각각 34, 35, 37, 41, 52 및 55; 또는 (ix) 각각 34, 35, 37, 41, 53 및 55에 따르며, 여기서 CDR은 CCG에 따른다.

표 1은 특정 항체의 CDR 아미노산 서열번호를 제공하며, 여기서 CDR은 CCG에 따라 정의된다.

특정 항체의 CDR(CCG 넘버링) 아미노산 서열번호

항체	CDRH1	CDRH2	CDRH3	CDRL1	CDRL2	CDRL3
HBC34-v35	34	35	37	41	44	55
HBC34-v36	34	35	37	41	45	55
HBC34-v37	34	35	37	41	46	55
HBC34-v38	34	35	37	41	47	55
HBC34-v39	34	35	37	41	48	55
HBC34-v40	34	35	37	41	49	55
HBC34-v41	34	35	37	41	50	55
HBC34-v42	34	35	37	41	51	55
HBC34-v43	34	35	37	41	52	55
HBC34-v44	34	35	37	41	53	55
HBC34-v45	34	35	37	41	44	55
HBC34-v46	34	35	37	41	44	55
HBC34-v47	34	35	37	41	51	55
HBC34-v48	34	35	37	41	44	55
HBC34-v49	34	35	37	41	51	55
HBC34-v50	34	35	37	41	44	55

특정 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 하기의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함한다:HBC34-v36; HBC34-v37; HBC34-v38; HBC34-v39; HBC34-v40; HBC34-v41; HBC34-v42; HBC34-v43; HBC34-v44; HBC34-v45; HBC34-v46; HBC34-v47; HBC34-v48; HBC34-v49; 또는 HBC34-v50, 여기서 CDR은 CCG에 따르고, 선택적으로 VL은 서열번호 58에 비해 R60N 치환 돌연변이, R60A 치환 돌연변이, R60K 치환 돌연변이, S64A 치환 돌연변이, I74A 치환 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하며, 여기서 치환 돌연변이(들)의 아미노산 번호는 서열번호 58에 따르며, 추가로 선택적으로 여기서 VL은 서열번호 58에 비해 임의의 다른 돌연변이(들)를 포함하지 않는다.

표 2는 특정 항체의 CDR 아미노산 서열번호를 제공하며, 여기서 CDR은 IMGT에 따라 정의된다(CDRH2 및 CDRL2의 짧은 버전 및 긴 버전이 개시됨).

특정 항체의 CDR(IMGT 넘버링) 아미노산 서열번호

항체	CDRH1	CDRH2 (짧은/긴)	CDRH3	CDRL1	CDRL2 (짧은/긴)	CDRL3
HBC34-v35	150	151/152	153	154	155/163	173
HBC34-v36	150	151/152	153	154	156/164	173
HBC34-v37	150	151/152	153	154	157/165	173
HBC34-v38	150	151/152	153	154	158/166	173
HBC34-v39	150	151/152	153	154	159/167	173
HBC34-v40	150	151/152	153	154	156/168	173
HBC34-v41	150	151/152	153	154	158/169	173
HBC34-v42	150	151/152	153	154	160/170	173
HBC34-v43	150	151/152	153	154	161/171	173
HBC34-v44	150	151/152	153	154	162/172	173
HBC34-v45	150	151/152	153	154	155/163	173
HBC34-v46	150	151/152	153	154	155/163	173
HBC34-v47	150	151/152	153	154	160/170	173
HBC34-v48	150	151/152	153	154	155/163	173
HBC34-v49	150	151/152	153	154	160/170	173
HBC34-v50	150	151/152	153	154	155/163	173

특정 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 하기의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함한다:HBC34-v36; HBC34-v37; HBC34-v38; HBC34-v39; HBC34-v40; HBC34-v41; HBC34-v42; HBC34-v43; HBC34-v44; HBC34-v45; HBC34-v46; HBC34-v47; HBC34-v48; HBC34-v49; 또는 HBC34-v50, 여기서 CDR은 IMGT에 따르고, 선택적으로 여기서 VL은 서열번호 58에 비해 R60N 치환 돌연변이, R60A 치환 돌연변이, R60K 치환 돌연변이, S64A 치환 돌연변이, I74A 치환 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하며, 여기서 치환 돌연변이(들)의 아미노산 번호는 서열번호 58에 따르며, 추가로 선택적으로 여기서 VL은 서열번호 58에 비해 임의의 다른 돌연변이(들)를 포함하지 않는다.

표 3은 특정 항체의 VH 및 VL 아미노산 서열번호를 제공한다.

특정 항체의 VH 및 VL 아미노산 서열번호

항체	VH	VL
HBC34-v35	38	57
HBC34-v36	38	58
HBC34-v37	38	59
HBC34-v38	38	60
HBC34-v39	38	61
HBC34-v40	38	62
HBC34-v41	38	63
HBC34-v42	38	64
HBC34-v43	38	65
HBC34-v44	38	66
HBC34-v45	38	67
HBC34-v46	38	68
HBC34-v47	38	69
HBC34-v48	38	70
HBC34-v49	38	71
HBC34-v50	38	72

특정 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 다음의 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함한다: HBC34-v36; HBC34-v37; HBC34-v38; HBC34-v39; HBC34-v40; HBC34-v41; HBC34-v42; HBC34-v43; HBC34-v44; HBC34-v45; HBC34-v46; HBC34-v47; HBC34-v48; HBC34-v49; 또는 HBC34-v50.특정 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 여기서: (i) VH는 서열번호 38 또는 39에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% (즉, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 또는 이들 사이의 임의의 비정수 값) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고; 및/또는 (ii) VL은 서열번호 58-66, 69, 71 또는 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% (즉, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 또는 이들 사이의 임의의 비정수 값) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 실시예에서, VH 및 VL은 서열 번호: (i) 각각 38 및 58; (ii) 각각 38 및 59; (iii) 각각 38 및 60; (iv) 각각 38 및 61; (v) 각각 38 및 62; (vi) 각각 38 및 63; (vii) 각각 38 및 64; (viii) 각각 38 및 65; (ix) 각각 38 및 66; (x) 각각 38 및 71; 또는 (xi) 각각 38 및 72에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% (즉, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 비정수 값) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 비제한적 예로서, 특정 실시예에서, VH는 서열번호 38과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 VL은 서열번호 62와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시예에서, VH는 서열번호 38 또는 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며; 및/또는 VL은 서열번호 58-66, 69, 71 또는 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 실시예에서, VH 및 VL은 서열번호: (i) 각각 38및 58; (ii) 각각 38 및 59; (iii) 각각 38 및 60; (iv) 각각 38 및 61; (v) 각각 38 및 62; (vi) 각각 38 및 63; (vii) 각각 38 및 64; (viii) 각각 38 및 65; (ix) 각각 38 및 66; (x) 각각 38 및 71; 또는 (xi) 각각 38 및 72에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

특정 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VH 및 서열번호 58-72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VL을 포함한다.

특정 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VH 및 서열번호 59-72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VL을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 VH 및 VL은 서열번호: (i) 각각 38 및 67; 또는 (ii) 각각 38 및 68 에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HBsAg의 항원 루프 영역에 결합할 수 있고 유전자형 D, A, B, C, E, F, G, H, I, 또는 J 또는 이들의 조합의 B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염을 중화시킬 수 있다.

또한, 서열번호 38 또는 39에 따른 VH 및 하기 돌연변이 중 임의의 하나 이상을 포함하는 서열번호 57-72 중 어느 하나의 VL 변이체를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다(프레임워크 영역 3에서, CCG 번호 지정에 의해 결정됨): R60A, R60N, R60K, S64A, I74A. 특정 추가 실시예에서, VL 변이체는 서열번호 57-72 (각각)과 비교하여 임의의 추가 돌연변이를 포함하지 않는다.

또한 서열번호 38에 따른 VH 및 Q78, D81 또는 둘 모두(CCG 넘버링)에서 치환 돌연변이(예를 들어, 보존적 아미노산 치환 또는 생식계열 인코딩 아미노산에 대한 돌연변이)를 포함하는 서열번호 57-72 중 어느 하나의 VL 변이체를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다.

또한 서열번호 39에 따른 VH 및 Q78, D81 또는 둘 모두(CCG 넘버링)에서 치환 돌연변이(예를 들어, 보존적 아미노산 치환 또는 생식계열 인코딩 아미노산에 대한 돌연변이)를 포함하는 서열번호 57-72 중 어느 하나의 VL 변이체를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다.

본원에서 추가로 논의된 바와 같이, 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 응집체(예: 이량체)를 형성하는 경향이 감소되어 있고, 및/또는 숙주 세포에서 향상된 생산성(예: 더 높은 역가)을 갖고, 및/또는 HBsAg에 대한 결합; HBV 중화; 및/또는 본원에 개시된 참조 항체와 비교하여 열안정성이 유사하거나 실질적으로 동일하거나 심지어 개선되어 있다.

"참조" 항체 또는 항원 결합 단편은 확인되거나 열거된 특징(예를 들어, CDR 및/또는 가변 영역 프레임워크 서열(들)의 차이)을 제외하고 각각 대상 항체 또는 항원 결합 단편과 동일한 항체 또는 항원 결합 단편을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 일부 실시예에서, 참조 항체는 각각 서열번호 34, 35, 37, 41, 44 및 55에 제시된 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함한다.

비제한적 예로서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 IgG1 이소형(isotype)일 수 있고 야생형(wild-type) IgG1 Fc 모이어티를 포함할 수 있고, 참조 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 34, 35, 37, 41, 44 및 55에 각각 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, 선택적으로 서열번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하고, IgG1 이소타입이고 야생형 IgG1 Fc 모이어티를 포함한다. 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편을 특정 조건 하에서 참조 항체 또는 항원-결합 단편과 비교하는 경우, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 조건은 본원에 개시된 분자(들)과 참조 분자(들) 사이에서 동일하거나 또는 조건이 허용하는 한 거의 동일(예를 들어, 2개의 항체는 그들의 아미노산 서열이 하나 또는 다수의 아미노산에 의해 상이할 수 있지만, 그 외에는 동일)하고, 비교 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩 (예를 들어, 각각의 항체는 각각의 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있음)될 것임을 추가로 이해할 것이다.

비제한적 예로서, 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 각각 기준 항체 또는 항원-결합 단편과 비교하여 더 적은 응집체(예를 들면, 항체:항체 이량체, 항체:항원 결합 단편 이량체, 또는 항원 결합 단편:항원 결합 단편 이량체의 형태)를 생성하고 및/또는 숙주 세포에서 더 높은 생성 역가를 갖는다.

이러한 맥락에서, 이량체는 2개의 항체 또는 항원-결합 단편 분자(예를 들어, 항체:항체 이량체, Fab:Fab 이량체, 또는 항체:Fab 이량체)를 포함하는 복합체 또는 응집체이다. 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이, 이러한 맥락에서 이합체화는 온전한 사량체 항체, Fv 또는 Fab의 형성에서 발생하는 항체 중쇄 및 경쇄 성분 사이 또는 2개의 항체 중쇄 폴리펩티드 사이의 전형적인 결합(associations)과 구별되며 두 모노머 사이에서 결합을 수반할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 "이량체"는 기능적 Fab를 포함하는 절반-항체(half-antibody)를 제공하기 위해 항체 중쇄와 항체 경쇄의 결합을 지칭하지 않으며, 또한 항체의 2개의 중쇄의 결합(예: 힌지-힌지 및 Fc-Fc) 또는 Fv 또는 Fab에서와 같은 VH-VL 결합(예: 이황화 결합을 통해 발생)을 포함하지 않는다는 것이 이해될 것이다.

특정 실시예에서, 이량체는 2개의 별개의 항체 또는 항원-결합 단편 분자의 VL 사이의 결합에 의해 형성된다. 별개의 항체 분자의 2개의 VL의 회합에 의해 형성된 이량체의 예시가 본 명세서의 도 7에 제시되어 있다. 이러한 이량체화는 예를 들어, 그 안에 포함된 항체 또는 항원-결합 단편 분자 중 하나 또는 둘 모두의 결합 원자가 및/또는 결합 친화도 및/또는 결합력 및/또는 중화 효능을 감소시킬 수 있다. 일반적으로, 복수의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물에서 이러한 이량체의 증가된 존재는 조성물의 전체 결합 및/또는 중화 효능을 감소시킨다.

항체 또는 항원 결합 단편 이량체는 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피와 같은 공지 기술을 사용하여 확인할 수 있다. 이량체는 이의 각각의 개별(단량체) 서브유닛의 분자량보다 더 높은 분자량을 가질 것이고, 전형적으로 이의 각각의 개별 서브유닛의 분자량의 합과 같거나 근사할 것이다. 예를 들어, 호모-다이머(즉, 아미노산 서열이 동일하거나 실질적으로 동일한 2개의 항체 분자를 포함)는 일반적으로 이의 각 모노머 서브유닛 분자량의 약 2배인 분자량을 가질 것이다. 예를 들어, 전형적인 인간 IgG1 면역글로불린 분자는 약 150킬로달톤의 분자량(예를 들어, 2개의 중쇄 각각이 약 50킬로달톤이고, 2개의 경쇄가 각각 약 25킬로달톤임)을 갖고 2개의 이러한 면역글로불린 분자를 포함하는 이량체는 약 300킬로달톤의 분자량을 가질 것이다. 물론, 하나의 항체는 예를 들어 적어도 부분적으로 각각의 아미노산 서열의 차이로 인해 동일한 일반 구조 및 이소타입의 상이한 항체와 약간 또는 다소 상이한 분자량을 가질 수 있음을 이해할 것이다.

다른 비제한적 예로서, 항체 분자는 140킬로달톤 내지 160킬로달톤의 분자량을 가질 수 있고, 2개의 항체 분자를 포함하는 항체 이량체는 280킬로달톤 내지 320킬로달톤의 분자량을 가질 수 있다. 다이머는 "고분자량 종(high-molecular weight species)" 또는 "HMWS"로 지칭될 수 있다.

다수의 항체(및/또는 항원-결합 단편) 분자를 포함하는 조성물 또는 샘플에서 이량체의 존재는 예를 들어 절대 크기 배제 크로마토그래피(aSEC)를 사용하여 평가될 수 있다. 조성물 또는 샘플에서 이량체의 양은 이량체에 포함된 조성물 또는 샘플에서 총 항체 또는 항원-결합 단편 분자의 백분율로 표현될 수 있다. 예를 들어, 12% 이량체를 포함하는 항체 조성물의 경우, 샘플 내 총 항체 분자의 88%가 단량체로 존재한다.

임의의 본원에 개시된 실시예에서, 다수의 항체 또는 항원-결합 단편(즉, 다수의 항체 또는 항원-결합 단편 분자)을 포함하는 샘플에서, 샘플이 약 40℃에서 약 120 ~ 약 168시간 동안 배양되었을 때 다수의 12% 미만, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 또는 2% 이하가 이합체에 포함된다. 여기서, 선택적으로 이량체의 존재는 절대 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정된다.

임의의 본원에 개시된 실시예에서, 다수의 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편 분자의 인큐베이션은 다수의 참조 항체 또는 항원-결합 단편 분자의 인큐베이션과 비교하여 감소된 이량체 형성을 초래하며, 여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 34, 35, 37, 41, 44 및 55에 각각 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 선택적으로, 항체 이량체의 존재는 절대 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정된다. 이러한 참조 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, Fv, Fab)은 일부 실시예에서 집합적으로 샘플(예: 약 40℃에서 약 120~168시간 배양 시) 내 항체 또는 항원 결합 단편 분자의 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 11% 이상 또는 최대 12%를 포함하는 이량체를 형성할 수 있다. 다시 말해서, 일부 실시예에서, 참조 항체 또는 항원 결합 단편 분자의 최대 12% 이상이 이량체에 포함되는 반면, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 분자의 더 적은 백분율, 바람직하게는 2% 이하가 이량체에 포함된다.

일부 실시예에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편은 참조 항체와 비교하여 더 적은 양의 이량체를 형성하고/하거나 감소된 빈도 및/또는 샘플 또는 조성물에서 총 항체 또는 항원 결합 단편 분자의 더 낮은 비율로 이량체를 형성한다: (i) 4℃에서 5일, 15일 및/또는 32일 배양; (ii) 25℃에서 5일, 15일 및/또는 32일 배양; 및/또는 (iii) 40℃에서 5일, 15일 및/또는 32일 인큐베이션, 여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 34, 35, 37, 41, 44 및 55에 각각 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시예에서, 이량체에 포함된 조성물 중 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편 분자의 백분율은 각각 이량체에 존재하는 조성물 중 참조 항체 분자의 백분율의4/5 미만, 3/4 미만, 1/2 미만, 1/3 미만, 1/4 미만, 1/5 미만, 1/6 미만, 1/7 미만, 미만 1/8, 1/9 미만 또는 1/10 미만이다. 비제한적 예로서, 40℃에서 32일(768시간) 인큐베이션 후, 조성물 중 참조 항체 분자의 22% 이상이 이량체에 포함될 수 있는 반면, 조성물 중 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편 분자의 17% 이하, 16% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하가 각각 이합체에 포함된다.

일부 실시예에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 숙주 세포(예를 들어, ExpiCHO 세포와 같은 CHO 세포)는 참조 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 참조 숙주 세포보다 각각 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상 또는 4배 이상의 항체 또는 항원-결합 단편의 양(예를 들어, mg/mL 단위의 농도로 측정됨) 을 제공하며, 여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열번호 34, 35, 37, 41, 44 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시예에서, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 참조 항체 또는 항원 결합 단편이 참조 형질감염 세포에서 생산되는 것과 비교하여 더 높은 역가로 형질감염 세포에서 생산되며, 여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열번호 34, 35, 37, 41, 44 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시예에서, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 참조 항체 또는 항원 결합 단편이 생성되는 역가보다 적어도 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상 또는 4배 이상 더 높은 역가로 형질감염된 세포에서 생성되며, 여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열번호 34, 35, 37, 41, 44 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함한다.

임의의 본원에 개시된 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 3.5 이하, 약 3.2 이하, 3.0 미만, 2.5 미만, 2.0 미만, 1.5 미만 또는 1.0 미만의 EC50(ng/ml)으로 HBsAg(예를 들어, 아형 adw)에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 3.5 미만, 3.4 미만, 3.3 미만, 3.2 미만, 3.1 미만, 3.0 미만, 2.9 미만, 2.8 미만, 2.7 미만, 2.6 미만, 2.5 미만, 2.4 미만, 2.3, 2.1 미만, 2.0 미만, 1.9 미만, 1.8 미만, 1.7 미만, 1.6 미만, 1.5 미만, 1.4 미만, 1.3 미만, 1.2 미만, 1.1 미만 또는 1.0 미만의 EC50(ng/ml)으로 HBsAg(예를 들어, 아형 adw)에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 0.9 내지 2.0, 또는 0.9 내지 1.9, 또는 0.9 내지 1.8, 또는 0.9 내지 1.7, 또는 0.9 내지 1.6, 또는 0.9 내지 1.5, 또는 0.9 내지 1.4, 또는 0.9 내지 1.3, 또는 0.9 내지 1.2, 또는 0.9 내지 1.1, 또는 0.9 내지 1.0, 또는 1.0 내지 2.0의 EC50(ng/ml)으로 HBsAg(예를 들어, 아형 adw)에 결합할 수 있다. 특정 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 2.0 이하의 EC50(ng/ml)으로 HBsAg(예를 들어, 아형 adw)에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 결합 EC50은 ELISA(예를 들어, 직접 항원-결합 ELISA 분석, Graphpad 프리즘을 사용하여 곡선을 피팅함으로써 결정된 결합 곡선과 함께)에 의해 결정된다.

임의의 본원에 개시된 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 20 ng/ml 미만, 바람직하게는 15 ng/ml 이하, 보다 바람직하게는 10 ng/mL 이하의 감염 중화 EC50으로 B형 간염 바이러스 감염을 중화시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 또는 7ng/mL 의 감염 중화 EC50으로 B형 간염 바이러스 감염을 중화시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 34, 35, 37, 41, 44 및 55에 기재된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는 참조 항체 또는 항원 결합 단편의 감염 중화 EC50(동일한 검정 사용)보다 낮은 감염 중화 EC50으로 B형 간염 바이러스 감염을 중화시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 감염 EC50의 중화는 시험할 항체의 존재 또는 부재 하에 고정된 양의 HBV와 함께 배양된 세포, 예를 들어 분화된 HepaRG 세포의 인큐베이션 후에 결정된다. 이러한 실시예에서, 인큐베이션은 예를 들어 37℃에서 16시간 동안 수행될 수 있다. 상기 인큐베이션은 배지(예를 들어, 4% PEG 8000으로 보충됨)에서 수행될 수 있다. 배양 후, 세포를 세척하고 추가로 배양할 수 있다. 바이러스 감염성을 측정하기 위해, 예를 들어 감염 후 7일부터 11일까지, 배양 상청액으로 분비된 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 및/또는 B형 간염 e항원(HBeAg)의 수준을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 측정할 수 있다. 처리된 세포로부터의 HBsAg 및/또는 HBeAg의 수준은 중화의 존재 및 정도를 결정하기 위해 처리되지 않은 세포의 것과 비교될 수 있다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 작은 항체 단편이다. 이 단편은 일반적으로 하나의 중쇄 가변 영역 도메인과 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이합체(dimer)로 단단한 비공유 결합으로 구성된다. 그러나 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만 포함하는 Fv의 절반)조차도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가질 수 있지만, 일반적으로 전체 결합 부위보다 친화도가 낮다.

"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일 사슬 Fv"는 단일 폴리펩티드 사슬로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 일부 실시예에서, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 유지하거나 형성할 수 있게 하는 VH 및 VL 도메인 사이에 배치되고 연결되는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 이러한 펩티드 링커는 당업계에 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 융합 폴리펩티드에 통합될 수 있다. 추가로 또는 선택적으로, Fv는 VH와 VL 사이에 형성되고 안정화되는 이황화 결합을 가질 수 있다. scF에 대한 리뷰는 단클론 항체의 약리학에서의 Pluckthun, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, 이하. 특정 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 VH 도메인, VL 도메인, 및 VH 도메인을 VL 도메인에 연결하는 펩티드 링커를 포함하는 scFv를 포함한다. 특정 실시예에서, scFv는 VH-링커-VL 배향 또는 VL-링커-VH 배향일 수 있는 펩티드 링커에 의해 VL 도메인에 연결된 VH 도메인을 포함한다. 본 발명의 임의의 scFv는 VL 도메인의 C-말단이 짧은 펩티드 서열에 의해 VH 도메인의 N-말단에 연결되거나 그 반대가 되도록 조작될 수 있다(즉, (N)VL(C)-링커-(N)VH(C) 또는 (N)VH(C)-링커-(N)VL(C)). 선택적으로, 일부 실시예에서, 링커는 VH 도메인, VL 도메인, 또는 둘 다의 N-말단 부분 또는 말단에 연결될 수 있다.

펩티드 링커 서열은 예를 들어 다음에 기초하여 선택될 수 있다: (1) 유연하고 확장된 형태를 채택하는 능력; (2) 제1 및 제2 폴리펩티드 및/또는 표적 분자 상의 기능적 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조를 채택하는 능력의 불능 또는 결여; 및/또는 (3) 폴리펩티드 및/또는 표적 분자와 반응할 수 있는 소수성 또는 하전된 잔기의 부족 또는 상대적 부족.

링커 설계(예를 들어, 길이)에 관한 다른 고려사항은 VH 및 VL이 기능적 항원-결합 부위를 형성할 수 있는 형태 또는 형태의 범위를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 펩티드 링커 서열은 예를 들어 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala와 같은 다른 거의 중성에 가까운 아미노산도 링커 서열에 포함될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 다른 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40:39 46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986); 미국 특허 No. 4,935,233, 및 미국 특허 No. 4,751,180.에 개시된 것을 포함한다. 링커의 다른 예시적이고 비제한적인 예는 예를 들어 Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066-1070 (1990), 및 Bird et al., Science 242:423-426 (1988) 에 의해 개시된 것들을 포함할 수 있고, 연속으로 연결된 4개의 글리신 잔기의 펜타머(pentamer), 시리즈의 C-말단 글리신은 단일 반복으로 존재하거나 1 내지 5회 이상 반복되는 경우 단일 세린에 연결된다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있고, 일반적으로 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 15 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 개의 아미노산 길이, 또는 약 200개 미만의 아미노산 길이일 수 있고, 바람직하게는 가요성(flexible) 구조(링커에 의해 연결된 두 영역, 도메인, 모티프, 단편 또는 모듈 사이의 구조적 이동을 위한 유연성과 공간을 제공할 수 있음)를 포함할 것이고, 바람직하게는 생물학적으로 불활성이고/이거나 인간에서 면역원성의 위험이 낮을 것이다.

scFv는 VH 및 VL 서열의 임의의 조합 또는 본원에 개시된 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 서열의 임의의 조합을 사용하여 구축될 수 있다. 일부 실시예에서, 링커 서열은 필요하지 않다; 예를 들어, 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드가 기능적 도메인을 분리하고 입체 간섭을 방지하는 데 사용될 수 있는 비필수 N-말단 아미노산 영역을 가질 때.

일부 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 경쇄 불변 영역(또는 이의 일부 또는 단편), 중쇄 불변 영역(또는 이의 일부 또는 단편), 또는 둘 모두를 포함한다. 용어 "CL"은 "면역글로불린 경쇄 불변 영역" 또는 "경쇄 불변 영역", 즉 항체 경쇄로부터의 불변 영역을 의미한다. 용어 "CH"는 "면역글로불린 중쇄 불변 영역" 또는 "중쇄 불변 영역"을 말하며, 이는 항체 이소형에 따라 CH1, CH2 및 CH3(IgA, IgD, IgG) 또는 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인(IgE, IgM)로 더 나눌 수 있다. 항체 중쇄의 Fc 영역은 본원에서 추가로 설명된다. 임의의 본원에 개시된 실시예에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 CL, CH1, CH2 및 CH3 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 특정 실시예에서, CL은 서열번호 79의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, CH1-CH2-CH3은 서열번호 73의 아미노산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 하기 아미노산 치환(EU 넘버링) 중 하나 이상을 포함하는 이의 변이체를 포함한다: G236A; A330L; I332E; M428L; N434S. Fc 모이어티는 본 명세서의 다른 곳에서 설명된다.

예를 들어, 포유동물 세포주에서의 생산은 항체 중쇄의 하나 이상의 C-말단 리신을 제거할 수 있다는 것이 이해될 것이다(예를 들어, Liu et al. mAbs 6(5):1145-1154 (2014) 참조). 따라서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄, CH1-CH3, CH3, 또는 C-말단 잔기가 존재하거나 부재하는 Fc 폴리펩티드; 즉, 중쇄의 C-말단 잔기, CH1-CH3, 또는 FC 모이어티이 리신이 아닌 실시예 및 라이신이 C-말단 잔기인 실시예가 포함된다. 특정 실시예에서, 조성물은 복수의 본원에 개시된 항체 및/또는 항원-결합 단편을 포함하고, 여기서 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄, CH1-CH3 또는 Fc 모이어티의 C-말단에 리신 잔기를 포함하지 않으며, 여기서 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄의 C-말단 말단에 라이신 잔기, CH1-CH3 또는 Fc 모이어티를 포함한다.

"Fab"(단편 항원 결합)는 항원에 결합하는 항체의 일부이며 사슬간 이황화 결합을 통해 경쇄에 연결된 중쇄의 가변 영역 및 CH1을 포함한다. 각 Fab 단편은 항원 결합과 관련하여 1가(monovalent)이다. 즉, 단일 항원 결합 부위를 가진다. 항체의 펩신 처리는 2가(divalent) 항원-결합 활성을 갖고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 2개의 이황화물 연결된 Fab 단편에 대략적으로 상응하는 단일의 큰 F(ab')2 단편을 산출한다. Fab와 F(ab')2 모두 "항원 결합 단편"의 예이다. Fab' 단편은 CH1 도메인의 카복시 말단에 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 몇 개의 추가 잔기를 가지는 점에서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다.

F(ab')2 항체 단편은 원래 사이에 힌지 시스테인이 있는 Fab' 단편 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 알려져 있다. Fab 단편은 예를 들어 펩티드 링커에 의해 연결되어 본원에서 "scFab"라고도 하는 단일 사슬 Fab를 형성할 수 있다. 이들 실시예에서, 천연 Fab에 존재하는 사슬간 이황화 결합은 존재하지 않을 수 있고, 링커는 전체 또는 부분적으로 단일 폴리펩티드 사슬에서 Fab 단편을 연결 또는 연결하는 역할을 한다. 중쇄 유래 Fab 단편(예를 들어, VH + CH1 또는 "Fd"를 포함하거나, 구성되거나, 본질적으로 구성됨) 및 경쇄 유래 Fab 단편(예를 들어, VL + CL을 포함하거나, 구성되거나, 본질적으로 구성됨)은 임의의 배열로 연결되어 scFab를 형성할 수 있다. 예를 들어, scFab는 (중쇄 Fab 단편 - 링커 - 경쇄 Fab 단편) 또는 (경쇄 Fab 단편 - 링커 - 중쇄 Fab 단편)에 따라 N-말단에서 C-말단 방향으로 배열될 수 있다. scFab에서 사용하기 위한 펩티드 링커 및 예시적인 링커 서열은 본원에서 더 상세히 논의된다.

임의의 본원에 개시된 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 항체, 모노클로날 항체, 정제된 항체, 단일 사슬 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv를 포함한다. 본원에 기술된 항체의 단편은 펩신 또는 파파인(papain)과 같은 효소로의 소화를 포함하는 방법 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 결합의 절단에 의해 항체로부터 수득될 수 있다. 선택적으로, 항체의 단편은 중쇄 또는 경쇄 서열의 일부를 클로닝하고 발현시켜 얻을 수 있다. 본 개시내용은 예를 들어 본 명세서에 따른 항체로부터의 CDR(및 선택적으로 가변 영역)을 포함하는 scFv, 중쇄 또는 경쇄 단량체 및 이량체(즉, VH-VL 이량체, HC-LC 이량체, HC-HC 이량체), 단일 도메인 중쇄 항체, 단일 도메인 경쇄 항체, 뿐만 아니라 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 또는 영역이 펩티드 링커에 의해 연결되는 단일 사슬 항체를 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄로부터 유래된 단일쇄 Fv 단편(scFv)을 포함한다.

특정 실시예에서, 본원의 개시에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 정제된 항체, 모노클로날 항체, 단일 사슬 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv를 포함한다.

본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은 실시예에서 다중특이적(예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 등)일 수 있고, 본원에 개시된 바와 같이 임의의 다중특이적 포맷으로 제공될 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 이중특이적 또는 삼중특이적 항체와 같은 다중특이적 항체이다. 이중특이적 항체에 대한 포맷은 예를 들어 Spiess et al., Mol. Immunol. 67(2):95 (2015), 및 Brinkmann 및 Kontermann, mAbs 9(2):182-212 (2017)에 개시되어 있다. 이중특이적 포맷 및 이를 만드는 방법은 본원에 참조로 포함되며, 예를 들어 BiTEs(이중특이적 T세포 인게이저), DARTs, Knobs-Into-Holes(KIH) 어셈블리, scFv-CH3-KIH 어셈블리, KIH 일반 경쇄 항체, TandAbs, 트리플 바디, TriBi Minibodies, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2-scFv2, 4가(tetravalent) HCab, 인트라바디, CrossMab, 이중 작용 Fab(DAF)(투인원 또는 포인원), DutaMab, DT-IgG, 전하 쌍, Fab -팔 교환, SEED바디, 트리오맙, LUZ-Y 어셈블리, Fcabs, κλ-바디, 직교 Fab, DVD-IgG, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-( L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zybody 및 DVI-IgG(포인원)를 포함한다. 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 본원에 개시된 또 다른 HBV- 및/또는 HDV-특이적 결합 도메인과 조합하여, 또는 HBV 및/또는 HDV(예: 동일하거나 다른 에피토프)에 특이적으로 결합하거나 다른 항원에 특이적으로 결합하는 다른 결합 도메인과 조합하여 본원에 개시된HBV- 및/또는 HDV-특이적 결합 도메인을 포함할 수 있다.

본원에 개시된 항체 단편은 1가 또는 다가 상호작용을 부여할 수 있고 상기 기재된 바와 같은 다양한 구조에 함유될 수 있다. 예를 들어, scFv 분자는 합성되어 3가 "트리아바디" 또는 4가 "테트라바디"를 생성할 수 있다. scFv 분자는 Fc 영역의 도메인을 포함하여 2가 미니바디를 생성할 수 있다. 또한, 본 발명의 서열은 본 발명의 서열이 본 발명의 에피토프를 표적화하고 분자의 다른 영역이 다른 표적에 결합하는 다중특이적 분자의 성분일 수 있다. 예시적인 분자는 이중특이적 Fab2, 삼중특이적 Fab3, 이중특이적 scFv 및 디아바디(diabodies)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(Holliger 및 Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).

scFv를 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원에 기재된 것과 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특정 실시예에서 본원에 기재된 바와 같은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 융합 단백질에 포함될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "융합 단백질"은 단일 사슬에 적어도 2개의 별개의 도메인 또는 모티프를 갖는 단백질을 지칭하며, 도메인 또는 모티프는 단백질에서 자연적으로 함께 또는 주어진 배열로 발견되지 않는다. 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 PCR, 재조합 공학 등을 이용하여 구축하거나 이러한 융합 단백질을 합성할 수 있다.

일부 실시예에서, 융합 단백질은 숙주 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포의 표면에서 발현될 수 있다. 특정 실시예에서, 융합 단백질은 (i) 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)을 포함하는 세포외 성분; (ii) 막횡단 성분(예를 들어, CD4, CD8, CD27, CD28, 또는 기능적 변이체 또는 이의 일부, 또는 이들의 조합으로부터의 막횡단 도메인); 및 (iii) 공동자극 단백질, 또는 이의 기능적 변이체 또는 일부(예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD2, CD5, ICAM-1(CD54), LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), GITR, CD30, CD40, BAFF-R, HVEM, LIGHT, MKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3으로부터의 신호전달 도메인, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 이의 기능적 변이체, 또는 이의 조합) 및/또는 이펙터 도메인(예를 들어, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, Wnt, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2, 또는 이들의 조합)으로부터의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 성분.

특정 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질은 세포 면역요법에 사용하기 위한 T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포와 같은 숙주 세포의 세포 표면에서 발현될 수 있는 키메라 항원 수용체 분자(CAR)를 포함한다. CAR 분자 및 설계 원리는 예를 들어 다음에 개시되어 있다: Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4):388 (2013); Harris 및 Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 37(3):220 (2016); Stone et al., Cancer Immunol. Immunother., 63(11):1163 (2014); Xu et al., 2018 Oncotarget 9:13991; Androulla et al., 2018 Curr. Pharm. Biotechnol. Volume 19 (April 2018); Wu et al., 2016 Expert Opin. Biol. Ther. 16:1469; and Ren et al., 2017 Protein Cell 8:634, CAR 분자, CAR 설계 및 CAR 설계 원리는 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.

본 명세서 전반에 걸쳐, 항체, 이의 항원 결합 단편 및 융합 단백질은 개별적으로 또는 집합적으로(예를 들어, 임의의 조합으로) "결합 단백질"로 지칭될 수 있다.

본 발명에 따른 결합 단백질은 정제된 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체는 다른 폴리펩티드가 실질적으로 없는 조성물에 존재할 수 있는데, 예를 들어 조성물의 90% 미만(중량 기준), 일반적으로 60% 미만, 보다 일반적으로 50% 미만이 다른 폴리펩티드로 구성된다.

본 발명에 따른 결합 단백질은 인간 및/또는 비인간(또는 이종) 숙주에서; 예를 들어 마우스에서 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 항체는 비인간 숙주에서는 면역원성이지만 인간 숙주에서는 그렇지 않은 이디토프(idiotope)를 가질 수 있다. 인간 사용을 위한 본원에 개시된 항체는 일반적으로 마우스, 염소, 토끼, 래트, 비영장류 포유동물 등과 같은 숙주로부터 분리되지 않고, 일부 경우에 인간화에 의해 또는 제노-마우스로부터 수득되지 않는 것을 포함한다. 또한 알려진 또는 잠재적인 면역원성 및/또는 다른 잠재적 책임을 감소시키거나 마우스와 같은 비-인간 동물에서 항체의 원하는 구조 및/또는 기능성을 부여하도록 조작된 개시된 항체의 변이체 형태가 본원에서 고려된다(예를 들어, 마우스에서 하나 이상의 인간 아미노산 잔기, 서열 또는 모티프가 면역원성 또는 기타 책임을 감소 또는 제거하거나 원하는 구조 및/또는 기능을 갖는 잔기, 서열 또는 모티프로 대체되는 "쥐과화(murinized)" 항체; 예를 들어 마우스를 사용하는 모델 연구의 경우).

본원에 사용된 "중화 항체"(또는 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질)는 숙주 (예: 숙주 유기체 또는 숙주 세포)에서 감염을 개시 및/또는 지속시키는 병원체의 능력을 중화, 즉 예방, 억제, 감소, 방해 또는 간섭할 수 있는 항체이다. 용어 "중화 항체" 및 "중화하는 항체" 또는 "중화하는 항체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 항체는 단독으로, 또는 본원에 기술된 바와 같이 활성 백신접종과 함께, 진단 도구로서, 또는 생산 도구로서 적절한 제제화시 예방제 또는 치료제로서 조합(예를들어, HBV B 및/또는 HBV D 감염을 중화할 수 있는 항체를 포함하여 항체 제제일 수도 있고 아닐 수도 있는 또 다른 제제와 조합된 본 발명의 항체 중 2개 이상의 조합 또는 본 발명의 항체)하여 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 HBV, HDV 또는 둘 다에 의한 감염을 중화시킬 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "특이적으로 결합하다" 또는 "에 특이적인"은 10⁵ M^-1(이 결합 반응에 대한 온율[K_on] 대 오프율[Koff]의 비율과 같음) 이상의 친화도 또는 Ka(즉, 1/M 단위로 특정 결합 상호작용의 평형 결합 상수)를 갖는 표적 분자에 대한 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편) 또는 결합 도메인의 회합 또는 결합인 반면, 시료의 다른 분자 또는 구성 요소와 크게 연관되거나 결합되지 않음을 의미한다. 결합 단백질 또는 결합 도메인은 "고친화성" 결합 단백질 또는 결합 도메인 또는 "저친화성" 결합 단백질 또는 결합 도메인으로 분류될 수 있다. "고친화성" 결합 단백질 또는 결합 도메인은 적어도 10⁷ M^-1, 적어도 10⁸ M^-1, 적어도 10⁹ M^-1, 적어도 10¹⁰ M^-1, 적어도 10¹¹ M^-1, 적어도 10¹² M^-1, 또는 적어도 10¹³ M^-1의 Ka를 갖는 결합 단백질 또는 결합 도메인을 지칭한다. "저친화성" 결합 단백질 또는 결합 도메인은 최대 10⁷ M^-1, 최대 10⁶ M^-1, 또는 최대 10⁵ M^-1의 Ka를 갖는 결합 단백질 또는 결합 도메인을 지칭한다. 대안적으로, 친화성은 M 단위(예를 들어, 10^-5 M 내지 10^-13 M)와의 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)로 정의될 수 있다. "결합" 및 "특이적으로 결합하는"이라는 용어 및 유사한 언급은 비특이적 고착(sticking)을 포함하지 않는다.

결합 단백질의 결합은 예를 들어 표면 플라스몬 공명(SPR) 방법, 예를 들어 Biacore™ 시스템; KinExA®와 같은 동역학 배제 분석; 및 BioLayer 간섭계(예: ForteBio® Octet 플랫폼 사용); 등온 적정 열량계(ITC) 등, 예를 들어 450nm에서의 광학 밀도에 의한 영상화 또는 유동 세포계수법 등에 의한 항원-결합 ELISA(예를 들어, 직접 또는 간접)와 같은 적절한 분석법을 사용하여 결정하거나 평가할 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합할 수 있다. B형 간염 바이러스의 외피에는 일반적으로 3개의 "HBV 외피 단백질"("HBsAg", "B형 간염 표면 항원"이라고도 함)이 포함되어 있다: S 단백질("작은"용, S-HBsAg라고도 함), M 단백질("중간"용, M-HBsAg라고도 함) 및 L 단백질("대형"용, L-HBsAg라고도 함). S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg는 S 단백질(S-HBsAg)에 해당하고 바이러스 조립 및 감염에 중요한 동일한 C-터미널 말단 ("S 도메인"이라고도 함, 226개 아미노산)을 공유한다. S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg는 소포체(ER)에서 합성되고 조립되며 골지체를 통해 입자로 분비된다. S 도메인은 4개의 예측된 막관통(TM) 도메인을 포함하며, S 도메인의 N-말단과 C-말단 모두 루멘에 노출된다. 막횡단 도메인 TM1 및 TM2는 둘 다 ER 막으로의 동시번역 단백질 통합에 필요한 것으로 생각되며 막횡단 도메인 TM3 및 TM4는 S 도메인의 C-말단 3분의 1에 위치한다. HBsAg의 "항원 루프 영역"은 HBsAg의 S 도메인의 예측된 TM3 및 TM4 막관통 도메인 사이에 위치하며 항원 루프 영역은 총 226개의 아미노산을 포함하는 S 도메인의 아미노산 101-172를 포함한다(Salisse J. 및 Sureau C., 2009, Journal of Virology 83: 9321-9328). 감염성의 결정 요인은 HBV 외피 단백질의 항원 루프 영역에 있다. 특히, HBsAg의 119~125번 잔기에는 HBV 및 HDV의 감염성에 중요한 것으로 간주되는 CXXC 모티프가 포함되어 있다(Jaoude GA, Sureau C, Journal of Virology, 2005;79:10460-6).

본원에서 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 서열의 위치가 언급될 때, 이러한 위치는 서열번호 3(하기 표시됨)에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 천연 또는 인공 서열 변이체를 참조하여 만들어진다.

MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFFCLWVYI

(서열번호 3; 아미노산 101 - 172는 밑줄로 표시됨)

예를 들어, "S 도메인의 아미노산 101 - 172"라는 표현은 서열번호 3에 따른 폴리펩티드의 위치 101 - 172의 아미노산 잔기를 의미한다. 그러나, 당업자는 돌연변이 또는 변이(예를 들어, 상이한 유전자형의 HBsAg 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 상이한 HBsAg 돌연변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않음)가 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 서열에서 자연적으로 발생하거나 생물학적 특성에 영향을 미치지 않고 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 서열에 인위적으로 도입될 수 있음을 이해한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "HBsAg의 S 도메인"이라는 용어는 예를 들어 서열번호 3에 따른 폴리펩티드 및 이의 천연 또는 인공 돌연변이를 포함하는 이러한 모든 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 본 명세서에서 HBsAg의 S 도메인의 서열 단편(예를 들어, HBsAg의 S 도메인의 아미노산 101-172 또는 아미노산 120-130)을 기술할 때, 이들은 서열번호 3의 상응하는 서열 단편뿐만 아니라 천연 또는 인공 돌연변이체의 상응하는 서열 단편도 포함한다. 예를 들어, "HBsAg의 S 도메인의 위치 101-172로부터의 아미노산 잔기"라는 어구는 서열번호 3의 위치 101-172로부터의 아미노산 잔기 및 이의 돌연변이체(천연 또는 인공 돌연변이체)의 상응하는 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "상응하는 서열 단편" 및 "상응하는 단편"이라는 어구는 서열이 최적화 정렬될 때, 즉 서열이 가장 높은 백분율의 동일성을 얻도록 정렬될 때 서열의 동일한 위치에 위치하는 단편을 지칭한다.

M 단백질(M-HBsAg)은 "pre-S2"라고 불리는 55개 아미노산의 N-말단 도메인에 의해 확장된 S 단백질에 해당한다. L 단백질(L-HBsAg)은 "pre-S1" (유전자형 D)이라고 하는 108개 아미노산의 N-말단 도메인에 의해 확장된 M 단백질에 해당한다. L 단백질의 pre-S1 및 pre-S2 도메인은 바이러스 입자의 내부 면(ER의 세포질 쪽)에 존재할 수 있으며, 표적 세포와의 상호 작용에 이용 가능하고 바이러스 감염성에 중요한 바이러스 어셈블리 또는 외부 표면(ER의 내강 측면)에서 결정적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 더욱이, HBV 표면 단백질(HBsAgs)은 비리온 외피에 통합될 뿐만 아니라 분비에 의해 세포에서 방출되는 빈(empty) "서브바이러스 입자"(SVP)를 형성하기 위해 ER-골지 중간 구획 막으로부터 자발적으로 발아(bud)할 수 있다.

일부 실시예에서, 결합 단백질은 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합하고, S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg 모두에 결합할 수 있다.

일부 실시예에서, 결합 단백질은 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스에 의한 감염을 중화시킨다. 일부 실시예에서, 결합 단백질은 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스의 바이러스 감염성을 감소시킨다.

실험실에서 바이러스 감염성(또는 "중화")을 연구하고 정량화하기 위해 표준 "중화 분석"을 사용할 수 있다. 중화 분석의 경우 동물 바이러스는 일반적으로 세포 및/또는 세포주에서 전파된다. 시험할 항체(또는 항원 결합 단편 또는 융합 단백질)의 존재(또는 부재)에서 배양된 세포를 고정된 양의 HBV 또는 HDV와 함께 배양하는 중화 분석이 사용될 수 있다. 이러한 분석에서, 세포 배양 상청액으로 분비된 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 또는 B형 간염 e항원(HBeAg)의 수준이 사용될 수 있고/있거나 판독을 제공하기 위해 HBcAg 염색이 평가될 수 있다. 예를 들어 HDV의 경우 델타 항원 면역형광 염색을 평가할 수 있다.

HBV 중화 검정의 특정 실시예에서, 배양된 세포, 예를 들어 분화된 HepaRG 세포와 같은 HepaRG 세포는 테스트할 항체의 존재 또는 부재 하에 고정된 양의 HBV와 함께 인큐베이션된다. 이러한 실시예에서, 인큐베이션은 예를 들어 37℃에서 16시간 동안 수행될 수 있다. 상기 인큐베이션은 배지(예를 들어, 4% PEG 8000으로 보충됨)에서 수행될 수 있다. 배양 후, 세포를 세척하고 추가로 배양할 수 있다. 바이러스 감염성을 측정하기 위해 배양 상청액으로 분비되는 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 및/또는 B형 간염 e항원(HBeAg)의 수준, 예를 들어 감염 후 7일에서 11일 사이에 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 측정할 수 있다. 추가적으로, HBcAg 염색은 면역형광 분석에서 평가될 수 있다. HDV 중화 검정의 실시예에서, 본질적으로 HBV와 동일한 검정이 사용될 수 있으며, 차이점은 HDV 운반체로부터의 혈청이 분화된 HepaRg 세포(HBV 대신)에서 HDV 감염 접종물로서 사용될 수 있다는 점이다. 검출을 위해 델타 항원 면역형광 염색을 판독값으로 사용할 수 있다.

본 발명의 결합 단백질의 실시예는 높은 중화 효능을 갖는다. 특정 실시예에서, B형 간염 바이러스(HBV) 및 델타 간염 바이러스(HDV)의 50% 중화에 필요한 본원에 기술된 바와 같은 항체의 농도는 예를 들어 약 10㎍/ml 이하이다. 다른 실시예에서, HBV 및 HDV의 50% 중화에 필요한 결합 단백질의 농도는 약 5㎍/ml이다. 다른 실시예에서, HBV 및 HDV의 50% 중화에 필요한 본원에 기술된 바와 같은 결합 단백질의 농도는 약 1㎍/ml이다. 또 다른 실시예에서, HBV 및 HDV의 50% 중화에 필요한 결합 단백질의 농도는 약 750ng/ml이다. 또 다른 실시예에서, HBV 및 HDV의 50% 중화에 필요한 본원에 기술된 바와 같은 결합 단백질의 농도는 500 ng/ml 이하이다. 이러한 실시예에서, HBV 및 HDV의 50% 중화에 필요한 본원에 기술된 바와 같은 결합 단백질의 농도는 450ng/ml 이하, 400ng/ml 이하, 350ng/ml 이하, 300ng/ml 이하, 250ng/ml 이하, 200ng/ml 이하, 175ng/ml 이하, 150 ng/ml 이하, 125ng/ml 이하, 100ng/ml 이하, 90ng/ml 이하, 80ng/ml 이하, 70ng/ml 이하, 60ng/ml 이하, 50ng /ml 이하, 또는 20 ng/ml 미만, 바람직하게는 15 ng/ml 이하, 보다 바람직하게는 10 ng/ml 이하, 예컨대 7 ng/ml 이하로부터 선택될 수 있다.

HBV 및 HDV 모두를 중화시킬 수 있는 본 발명에 따른 결합 단백질은 B형 간염 및 D형 간염의 예방 및 치료에 유용하다. HDV 감염은 일반적으로 HBV 감염과 동시에 또는 그 후에 발생하며(예를 들어, HDV는 자체 복제를 위해 HBV의 지원을 필요로 하기 때문에 HBV가 없는 HDV 접종은 D형 간염을 유발하지 않음) D형 간염은 일반적으로 만성 HBV 보균자에서 관찰된다.

개시된 결합 단백질의 실시예는 HBsAg 및 HBV의 제거를 촉진한다. 특정 실시예에서, 결합 단백질은 B형 간염 바이러스(SVP)의 HBV 및 서브바이러스 입자 모두의 제거를 촉진한다. HBsAg 또는 서브바이러스 입자의 제거는 예를 들어 혈액 샘플(예: B형 간염 환자의)에서 HBsAg의 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 유사하게, HBV의 클리어런스는 예를 들어 혈액 샘플(예: B형 간염 환자의)에서 HBV의 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다.

HBV에 감염된 환자의 혈청에는 감염성 입자(HBV) 외에도 일반적으로 HBV 외피 단백질(HBsAg)만으로 구성된 빈(empty) 서브바이러스 입자(SVP)가 상대적으로 더 작은 구 및 가변 길이의 필라멘트 형태로 과량(보통 1,000~100,000배) 존재한다. 하위 바이러스 입자는 HBV의 세포 내 바이러스 복제 및 유전자 발현을 강력하게 향상시키는 것으로 나타났다(Bruns M. et al. 1998 J Virol 72(2): 1462-1468). 이것은 또한 HBV를 포함하는 혈청의 감염성과 관련이 있는데, 감염성은 바이러스의 수뿐만 아니라 SVP의 수에도 의존하기 때문이다(Bruns M. et al. 1998 J Virol 72(2): 1462-1468). 또한 과도한 서브바이러스 입자는 중화 항체를 흡수하여 미끼 역할을 할 수 있으므로 감염 제거를 지연시킬 수 있다. B형 간염 표면 항원(HBsAg) 손실의 달성은 어떤 경우에는 치료의 이상적인 종점이며 만성 B형 간염(CHB)을 치료하는 가장 가까운 결과로 간주된다.

본 발명의 결합 단백질의 실시예는 HbsAg의 제거를 촉진할 수 있다. 특정 실시예에서, 결합 단백질은 B형 간염 바이러스의 서브바이러스 입자의 제거를 촉진할 수 있다. 일부 실시예에서, 결합 단백질은 만성 B형 간염을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

임의의 본원에 개시된 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 HBsAg 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 유전자형의 HBsAg에 결합할 수 있다.

특정 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 HBsAg 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개에 결합할 수 있다. 상이한 HBsAg 유전자형의 예는 다음을 포함한다: GenBank 수탁 번호 J02203(HBV-D, ayw3); GenBank 수탁 번호 FJ899792.1(HBV-D, adw2); GenBank 수탁 번호 AM282986(HBV-A); GenBank 수탁 번호 D23678(HBV-B1 일본); GenBank 수탁 번호 AB117758(HBV-C1 캄보디아); GenBank 수탁 번호 AB205192(HBV-E 가나); GenBank 수탁 번호 X69798(HBV-F4 브라질); GenBank 수탁 번호 AF160501(HBV-G 미국); GenBank 수탁 번호 AY090454(HBV-H 니카라과); GenBank 수탁 번호 AF241409(HBV-I 베트남); 및 GenBank 수탁 번호 AB486012(HBV-J 보르네오). 상이한 유전자형의 HBsAg의 S 도메인의 항원성 루프 영역의 예시적인 아미노산 서열이 본원에 기재되어 있다(예를 들어, 서열번호 5-15).

일부 실시예에서, 결합 단백질은 10개의 HBsAg 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J 중 하나 이상, 일부 경우에는 적어도 6개에 결합할 수 있다. 특정 실시예에서, 결합 단백질은 10개의 HBsAg 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J 중 적어도 8개에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 결합 단백질은 10개의 HBsAg 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J 중 10개 모두에 결합할 수 있다. HBV는 게놈 서열에 따라 여러 유전자형으로 구분된다. 현재까지 HBV 게놈의 8가지 잘 알려진 유전자형(A-H)이 정의되었다. 또한 I와 J라는 두 가지 다른 유전자형도 확인되었다(Sunbul M., 2014, World J Gastroenterol 20(18): 5427-5434). 유전자형은 질병의 진행에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 항바이러스제 치료에 대한 유전자형 간의 차이가 확인되었다.

일부 실시예에서, 본원의 개시에 따른 결합 단백질은 항원 루프 영역에 돌연변이를 갖는 HBsAg 돌연변이체 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개에 결합할 수 있다. 이러한 돌연변이체(들)는 HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R and HBsAg N146A 중 하나 이상으로부터 선택된다. 이들 돌연변이체는 HBsAg 유전자형 D의 S 도메인, Genbank 수탁 번호 FJ899792(서열번호 4)에 기초한 자연 발생 돌연변이체이다. 본원에 언급된 각 돌연변이체의 돌연변이된 아미노산 잔기(들)는 이름으로 표시된다.

서열번호 4:

MENVTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSTLSPFLPLLPIFFCLWVYI

(항원 루프 영역, 즉 아미노산 101 - 172는 밑줄로 표시됨).

상이한 돌연변이의 HBsAg S 도메인의 항원 루프 영역의 아미노산 서열은 서열번호 16-33에 제시되어 있다.

특정 실시예에서, 본원에 개시된 바와 같은 결합 단백질은 HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R 및 HBsAg N146A로부터 선택된 하나 이상, 일부 경우에는 적어도 12개의 감염성 HBsAg 돌연변이체에 결합할 수 있다. 일부 이러한 실시예에서, 결합 단백질은 HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R 및 HBsAg N146A로부터 선택된 적어도 15개의 감염성 HBsAg 돌연변이체에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 결합 단백질은 다음의 감염성 HBsAg 돌연변이 각각에 결합할 수 있다: HBsAg Y100C/P120T; HBsAg P120T; HBsAg P120T/S143L; HBsAg C121S; HBsAg R122D; HBsAg R122I; HBsAg T123N; HBsAg Q129H; HBsAg Q129L; HBsAg M133H; HBsAg M133L; HBsAg M133T; HBsAg K141E; HBsAg P142S; HBsAg S143K; HBsAg D144A; HBsAg G145R; 및 HBsAg N146A.

특정 실시예에서, 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)은 HBV 감염이 있는 포유동물에서 HBV DNA의 혈청 농도를 감소시킬 수 있다. 특정 실시예에서, 결합 단백질은 HBV 감염을 갖는 포유동물에서 HBsAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있다. 특정 실시예에서, 결합 단백질은 HBV에 감염된 포유동물에서 HBeAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있다. 특정 실시예에서, 결합 단백질은 HBV 감염을 갖는 포유동물에서 HBcrAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 결합 단백질은 결합 단백질의 단일 투여 후 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 이상 동안 포유동물에서 HBV DNA, HBsAg, HBeAg 및/또는 HBcrAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있다.

용어 "에피토프" 또는 "항원성 에피토프"는 면역글로불린, 키메라 항원 수용체 또는 다른 결합 분자, 도메인 또는 단백질과 같은 동족 결합 분자에 의해 인식되고 특이적으로 결합되는 임의의 분자, 구조, 아미노산 서열 또는 단백질 결정자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹화를 포함하고 특정 전하 특성뿐만 아니라 특정 3차원 구조적 특성을 가질 수 있다.

일부 실시예에서, 결합 단백질은 HbsAg의 항원 루프 영역의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시예에서, 결합 단백질은 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 115-133, HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 133, 또는 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 130으로부터 선택된 적어도 2개의 아미노산에 결합할 수 있다. 특정 실시예에서, 결합 단백질은 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 115-133, HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 133, 또는 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 130으로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 결합 단백질은 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 115-133, HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 133, 또는 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 130으로부터 선택된 적어도 4개의 아미노산에 결합할 수 있다. 본원에서 사용된 아미노산의 위치(예: 115 - 133, 120 - 133, 120 - 130)는 상기 기재된 바와 같이 HBsAg의 S 도메인을 의미하며, 이는 세 가지 HBV 외피 단백질 S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg 모두에 존재하며, 여기서 S-HBsAg는 일반적으로 HBsAg의 S 도메인에 해당한다.

에피토프와 관련하여 본원에서 사용되는 "에 의해 형성되는"이라는 용어는 결합 단백질이 결합하는 에피토프가 선형(연속적) 또는 구조적(불연속적)일 수 있음을 의미한다. 선형(linear) 또는 순차적(sequential) 에피토프는 아미노산의 선형 서열 또는 1차 구조에 따라 항체에 의해 인식되는 에피토프이다. 구조적 에피토프는 3차원적 형태와 단백질 구조에 따라 인지될 수 있다. 따라서, 에피토프가 선형 에피토프이고 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 위치 115-133 또는 아미노산 위치 120-133에서 선택된 위치에 위치한 하나 이상의 아미노산을 포함하는 경우, 에피토프에 포함된 아미노산은 1차 구조의 인접한 위치(예를 들어, 아미노산 서열에서 연속적인 아미노산임)에 위치할 수 있다. 구조적 에피토프(3차원 구조)의 경우, 아미노산 서열은 전형적으로 에피토프로서 3차원 구조를 형성하므로, 에피토프를 형성하는 아미노산은 1차 구조의 인접 위치에 위치할 수도 있고 위치하지 않을 수도 있다(즉, 아미노산 서열에서 연속적인 아미노산일 수도 있고 아닐 수도 있음).

특정 실시예에서, 결합 단백질이 있는 에피토프는 구조적 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 결합 단백질은 HBsAg의 항원 루프 영역의 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 적어도 2개의 아미노산은 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120-133 또는 아미노산 120-130으로부터 선택되고, 여기서 적어도 2개의 아미노산은 (1차 구조의) 인접한 위치에 위치하지 않는다. 특정 실시예에서, 결합 단백질은 HBsAg의 항원성 루프 영역의 적어도 3개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 적어도 3개의 아미노산은 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120-133 또는 아미노산 120-130으로부터 선택되고, 여기서 3개의 아미노산 중 적어도 2개는 (1차 구조의) 인접 위치에 위치하지 않는다. 일부 실시예에서, 결합 단백질은 HBsAg의 항원 루프 영역의 적어도 4개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 적어도 4개의 아미노산은 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120-133 또는 아미노산 120-130으로부터 선택되고, 여기서 4개의 아미노산 중 적어도 2개는 (1차 구조의) 인접 위치에 위치하지 않는다.

1차 구조의 인접 위치에 위치하지 않는, 본원에 개시된 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질이 결합하는 아미노산(즉, 에피토프를 형성하는 아미노산)은 일부 경우에 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질이 결합하지 않는 하나 이상의 아미노산에 의해 이격된다. 일부 실시예에서, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산이 에피토프에 포함된 인접 위치에 위치하지 않는 2개의 아미노산 사이에 위치할 수 있다.

특정 실시예에서, 결합 단백질은 HBsAg의 S 도메인의 적어도 아미노산 P120, C121, R122 및 C124를 포함하는 에피토프에 결합한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열번호 115에 따른 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다:

PCRXC

여기서 X는 임의의 아미노산이거나 아미노산이 아니며; X는 임의의 아미노산이고; X는 T, Y, R, S 또는 F이고; X는 T, Y 또는 R이고; 또는 X는 T 또는 R이다.

다른 실시예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열번호 107에 따른 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다:

TGPCRTC

또는 서열번호 107과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열에 대해.

다른 실시예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열번호 112에 따른 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다:

STTSTGPCRTC

또는 서열번호 112와 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열에 대해.

특정 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 HBsAg의 S 도메인의 적어도 아미노산 145-151을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다:

GNCTCIP

(서열번호 108).

또 다른 실시예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열번호 107에 따른 아미노산 서열 및 서열번호 108에 따른 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다.

다른 실시예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열번호 112에 따른 아미노산 서열 및/또는 서열번호 114에 따른 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 결합 단백질이 결합하는 에피토프는 선형(continuous) 또는 형태적(discontinuous)일 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 구조적 에피토프에 결합하고, 이러한 특정 실시예에서, 구조적 에피토프는 비환원 조건 하에서만 존재한다.

특정 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 선형 에피토프에 결합한다. 이러한 특정 실시예에서, 선형 에피토프는 비환원 조건 및 환원 조건 모두에 존재한다.

특정 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 서열번호 1에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 HBsAg의 항원 루프 내의 에피토프에 결합한다:

X₁ X₂ X₃ TC X₄ X₅ X₆A X₇G

여기서 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ 및 X₇ 은 임의의 아미노산(서열번호 1)일 수 있다.

일부 실시예에서, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ 및 X₇ 은 서열번호 3의 아미노산 120-130과 비교하여 보존적으로 치환된 아미노산이다.

일부 실시예에서, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ 및 X₇ 은 서열번호 5-33 중 임의의 아미노산 20-30과 비교하여 보존적으로 치환된 아미노산이다.

특정 실시예에서, 서열번호 1의 X₁은 작은 아미노산이다. 본원에 사용된 "작은" 아미노산은 알라닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 시스테인, 글리신, 프롤린, 세린, 트레오닌 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산을 의미한다. 이러한 특정 실시예에서, X₁은 프롤린, 세린 또는 트레오닌이다.

특정 실시예에서, 서열번호 1의 X₂는 작은 아미노산이다. 특정 실시예에서, X₂는 시스테인 또는 트레오닌으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시예에서, 서열번호 1의 X₃은 하전된 아미노산 또는 지방족 아미노산이다. 본원에 사용된 "하전된" 아미노산은 아르기닌, 라이신, 아스파르트산, 글루탐산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산을 의미한다. 본원에 사용된 "지방족" 아미노산은 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산을 의미한다. 특정 실시예에서, X₃은 아르기닌, 리신, 아스파르트산 또는 이소류신으로부터 선택된다.

일부 실시예에서, 서열번호 1의 X₄ 는 작은 아미노산 및/또는 소수성 아미노산이다. 본원에 사용된 "소수성" 아미노산은 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 티로신, 메티오닌, 프롤린 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산을 의미한다. 특정 실시예에서, X₄ 는 메티오닌 또는 트레오닌으로부터 선택된다.

일부 실시예에서, 서열번호 1의 X₅는 작은 아미노산 및/또는 소수성 아미노산이다. 특정 실시예에서, X₅는 트레오닌, 알라닌 또는 이소류신으로부터 선택된다.

일부 실시예에서, 서열번호 1의 X₆은 작은 아미노산 및/또는 소수성 아미노산이다. 특정 실시예에서, X₆은 트레오닌, 프롤린 또는 류신으로부터 선택된다.

일부 실시예에서, 서열번호 1의 X₇은 극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이다. 본원에 사용된 "극성" 아미노산은 아스파르트산, 아스파라긴, 아르기닌, 글루탐산, 히스티딘, 리신, 글루타민, 트립토판, 티로신, 세린 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산을 의미한다. 이러한 특정 실시예에서, X₇은 글루타민, 히스티딘 또는 류신이다.

일부 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 서열번호 2에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 HBsAg의 항원 루프 내의 에피토프에 결합한다:

X₁ X₂ X₃ TC X₄ X₅ X₆A X₇G

여기서

X₁은 P, T 또는 S이고,

X₂는 C 또는 S이고,

X₃은 R, K, D 또는 I이고,

X₄는 M 또는 T이고,

X₅는 T, A 또는 I이고,

X₆은 T, P 또는 L이고,

X₇은 Q, H 또는 L임

(서열번호 2).

서열번호 1 또는 2에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 에피토프와 관련하여, 본원에서 사용되는 "에 의해 형성되는"이라는 용어는 개시된 결합 단백질이 반드시 서열번호 1 또는 2의 각각의 모든 아미노산에 결합한다는 것을 의미하는 것으로 의도되지 않음에 유의한다. 특히 결합 단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 중 일부에만 결합할 수 있으며, 이에 따라 다른 아미노산 잔기는 "스페이서(spacers)"로 작용할 수 있다.

특정 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 하기 표 4에 제시된 서열번호 5 내지 33으로부터 선택된 아미노산 서열의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 아미노산에 의해 형성된 HBsAg의 항원 루프 내의 에피토프에 결합한다.

일부 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 하기 표 4에 제시된 서열번호 5 내지 33 중 어느 하나 이상에 따른 아미노산 서열을 갖는 HBsAg의 항원 루프 영역 또는 이의 서열 변이체에 결합한다. 특정 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 하기 표 4에 제시된 임의의 서열번호 5 내지 33에 따른 아미노산 서열을 갖는 HBsAg의 모든 항원 루프 변이체에 결합한다.

표 4: 본원에 사용된 상이한 유전자형 및 돌연변이체의 HBsAg 의 S 도메인의 항원 루프 영역의 아미노산 서열(HBsAg의 S 도메인의 잔기 101-172 - 관련 돌연변이를 포함하기 위해 HBsAg의 S 도메인의 잔기 100-172를 나타내는 서열번호 16은 제외).

이름	서열번호	아미노산 서열
J02203 (D, ayw3)	5	QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
FJ899792 (D, adw2)	6	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
AM282986 (A)	7	QGMLPVCPLIPGTTTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSW
D23678 (B1)	8	QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSW
AB117758 (C1)	9	QGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSW
AB205192 (E)	10	QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCTTLAQGTSMFPSCCCSKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
X69798 (F4)	11	QGMLPVCPLLPGSTTTSTGPCKTCTTLAQGTSMFPSCCCSKPSDGNCTCIPIPSSWALGKYLWEWASARFSW
AF160501 (G)	12	QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGNSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSW
AY090454 (H)	13	QGMLPVCPLLPGSTTTSTGPCKTCTTLAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKYLWEWASARFSW
AF241409 (I)	14	QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGNSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASARFSW
AB486012 (J)	15	QGMLPVCPLLPGSTTTSTGPCRTCTITAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFAKFLWEWASVRFSW
HBsAg Y100C/P120T	16	CQGMLPVCPLIPGSSTTGTGTCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg P120T	17	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGTCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg P120T/S143L	18	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGTCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPLDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg C121S	19	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPSRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg R122D	20	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCDTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg R122I	21	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCITCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg T123N	22	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRNCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg Q129H	23	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAHGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg Q129L	24	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPALGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg M133H	25	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSHYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg M133L	26	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSLYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg M133T	27	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSTYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg K141E	28	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTEPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg P142S	29	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKSSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg S143K	30	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPKDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg D144A	31	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSAGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg G145R	32	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDRNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg N146A	33	QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGACTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW

Fc 모이어티(Moiety)일부 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 Fc 모이어티(Fc 폴리펩티드로도 지칭됨)를 포함한다. 특정 실시예에서, Fc 모이어티는 인간 기원, 예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4, 또는 또 다른 Ig 클래스 또는 이소타입(isotype)으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgG1로부터 유도된 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, Fc 모이어티는 IgG1m17, 1 (IgHG1*01) 알로타입(allotype)을 포함하거나 그로부터 유도된다(예를 들어, 이에 대해 하나 이상의 돌연변이를 포함한다).

본원에서 사용되는 용어 "Fc 모이어티"는 파파인(papain) 절단 부위(예를 들어, 천연 IgG에서 EU 넘버링에 의한 잔기 216, 중쇄 불변 영역의 첫 번째 잔기를 114로 함) 바로 상류(upstream)의 힌지 영역에서 시작하여 면역글로불린 중쇄의 C-말단에서 끝나는 면역글로불린 중쇄의 일부를 포함하거나, 이로 구성되거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 그로부터 유래된 서열을 지칭한다. 따라서, Fc 모이어티는 완전한 Fc 모이어티 또는 이의 일부(예를 들어, 도메인)일 수 있다. 특정 실시예에서, 완전한 Fc 모이어티는 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인(예를 들어, EU 아미노산 위치 216-446)을 포함한다. 본원에서 언급한 바와 같이, 추가적인 라이신 잔기(K)는 때때로 Fc 모이어티의 극단 C-말단에 존재하지만 종종 성숙 항체로부터 절단된다. Fc 모이어티 내의 아미노산 위치는 Kabat의 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되었다(예를 들어, Kabat et al., "면역학적 관심 단백질의 서열", 미국 보건복지부, 1983 및 1987참조). Fc 모이어티의 아미노산 위치는 또한 IMGT 넘버링 시스템(C-도메인 및 엑손 넘버링에 대한 고유 넘버링 포함) 및 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링될 수 있다.

일부 실시예에서, Fc 모이어티는 힌지(예를 들어, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이의 변이체, 부분 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시예에서, Fc 모이어티는 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 포함한다. 추가 실시예에서, Fc 모이어티는 완전한 Fc 모이어티다. 인간 IgG1 이소타입의 예시적인 Fc 모이어티의 아미노산 서열은 서열번호 73에 제공된다. Fc 모이어티는 또한 자연 발생 Fc 모이어티에 비해 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 힌지 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인 중 적어도 하나 또는 이의 일부가 결실될 수 있다. 예를 들어, Fc 모이어티는 다음을 포함하거나 다음으로 구성될 수 있다: (i) CH2 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 힌지 도메인(또는 이의 일부), (ii) CH3 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 힌지 도메인(또는 이의 일부), (iii) CH3 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 CH2 도메인(또는 이의 일부), (iv) 힌지 도메인(또는 이의 일부), (v) CH2 도메인(또는 이의 일부), 또는 (vi ) CH3 도메인 또는 이의 일부.

본원에 개시된 Fc 모이어티는 천연 발생 면역글로불린 분자의 완전한 Fc 모이어티로부터 아미노산 서열이 달라지도록 변형될 수 있지만, 자연 발생 Fc 모이어티에 의해 부여된 적어도 하나의 바람직한 기능을 유지하거나 강화하고/하거나 자연적으로 발생하는 Fc 모이어티의 바람직하지 않은 기능을 감소시킨다. 이러한 기능에는 예를 들어 Fc 수용체(FcR) 결합, 항체 반감기 조절(예: FcRn에 대한 결합에 의한), ADCC 기능, 단백질 A 결합, 단백질 G 결합 및 보체 결합이 포함된다. 이러한 기능과 관련된 자연 발생 Fc 모이어티의 일부는 당업계에 기술되어 있다.

예를 들어, 보체 캐스케이드를 활성화하기 위해 C1q 단백질 복합체는 면역글로불린 분자(들)가 항원 표적에 부착될 때 적어도 두 분자의 IgG1 또는 한 분자의 IgM에 결합할 수 있다(Ward, E. S., 및 Ghetie, V., Ther. Immunol. 2 (1995) 77-94). Burton, D. R.은 (Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206) 아미노산 잔기 318 내지 337을 포함하는 중쇄 영역이 보체 고정에 관여한다고 기재하였다. Duncan, A. R. 및 Winter, G.(Nature 332 (1988) 738-740)는 부위 지정 돌연변이 유발법을 사용하여 Glu318, Lys320 및 Lys322가 C1q에 대한 결합 부위를 형성한다고 보고했다. C1q의 결합에서 Glu318, Lys320 및 Lys 322 잔기의 역할은 보체 매개 용해(lysis)를 억제하는 이러한 잔기를 포함하는 짧은 합성 펩티드의 능력에 의해 확인되었다.

예를 들어, FcR 결합은 (항체의) Fc 모이어티와 Fc 수용체(FcR)의 상호작용에 의해 매개될 수 있으며, 이는 조혈 세포를 포함하는 세포 상의 특화된 세포 표면 수용체이다. Fc 수용체는 면역글로불린 수퍼패밀리(superfamily)에 속하며, 항체 의존성 세포 매개 세포독성을 통해 면역 복합체의 식균 작용에 의한 항체 코팅 병원체의 제거와 상응하는 항체로 코팅된 적혈구 및 다양한 기타 세포 표적(예: 종양 세포)의 용해를 매개하는 것으로 나타났다(ADCC; Van de Winkel, J. G., and Anderson, C. L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). FcR은 면역글로불린 클래스에 대한 특이성에 의해 정의된다; IgG 항체의 Fc 수용체는 FcγR, IgE의 경우 FcεR, IgA의 경우 FcαR 등으로 지칭되며 신생아 Fc 수용체는 FcRn 으로 지칭된다. Fc 수용체 결합은 예를 들어 Ravetch, J. V., 및 Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P. J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; 및 Gessner, J. E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248에 서술되어 있다.

천연 IgG 항체(FcγR)의 Fc 도메인에 의한 수용체의 교차 결합은 식균 작용, 항체 의존성 세포 독성, 염증 매개체 방출, 면역 복합체 제거 및 항체 생산 조절을 포함한 다양한 이펙터 기능을 유발한다. 수용체(예를 들어, FcγR)의 가교결합을 제공하는 Fc 모이어티가 여기에서 고려된다. 인간의 경우 FcγR 의 3가지 부류가 현재까지 특성화되었으며, 이는 다음과 같다: (i) FcγRI (CD64), 높은 친화도로 단량체성 IgG에 결합하고 대식세포, 단핵구, 호중구 및 호산구에서 발현됨; (ii) FcγRII (CD32), 중간에서 낮은 친화력으로 복합형 IgG에 결합하며 특히 백혈구에서 광범위하게 발현되며 항체 매개 면역의 중심 역할을 하는 것으로 여겨지며 FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIC로 나눌 수 있으며 면역 체계에서 다른 기능을 수행하지만 IgG-Fc에 유사한 낮은 친화도로 결합하고 이들 수용체의 엑토도메인은 매우 상동적임; 및 (iii) FcγRIII (CD16), 중간 내지 낮은 친화도로 IgG에 결합하고 두 가지 형태로 발견됨: NK 세포, 대식세포, 호산구, 일부 단핵구 및 T 세포에서 발견되고 ADCC를 매개하는 것으로 여겨지는 FcγRIIIA; 및 호중구에서 고도로 발현되는 FcγRIIIB.

FcγRIIA 는 살해(killing)에 관여하는 많은 세포(예: 대식세포, 단핵구, 호중구)에서 발견되며 살해 과정을 활성화하는 것으로 여겨진다. FcγRIIB 는 억제 과정에서 역할을 하는 것으로 여겨지며 B-세포, 대식세포 및 비만 세포 및 호산구에서 발견된다. 중요하게도 모든 FcγRIIB의 75%가 간에서 발견되는 것으로 나타났다(Ganesan, L. P. et al., 2012: "간 시누소이달(sinusoidal) 내피의 FcγRIIb 는 작은 면역 복합체를 제거한다," Journal of Immunology 189: 4981-4988). FcγRIIB 는 LSEC로 불리는 간 시누소이달(sinusoidal) 내피에서 풍부하게 발현되며 간 및 LSEC의 Kupffer 세포는 작은 면역 복합체 제거의 주요 부위이다(Ganesan, L. P. et al., 2012: 간 시누소이달(sinusoidal) 내피의 FcγRIIb 는 작은 면역 복합체를 제거한다. Journal of Immunology 189: 4981-4988).

일부 실시예에서, 본원에 개시된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 FcγRIIb, 특히 예를 들어 IgG-유형 항체와 같은 Fc 영역에 결합하기 위한 Fc 모이어티를 포함한다. 더욱이, Chu, S. Y. et al., 2008에 기술된 바와 같이 돌연변이 S267E 및 L328F를 도입함으로써 FcγRIIB 결합을 향상시키도록 Fc 모이어티를 조작하는 것이 가능하다: CD19 및 Fc감마RIIb(FcgammaRIIb)와 Fc-조작된 항체의 결합에 의한 1차 인간 B 세포의 B 세포 수용체-매개 활성화의 억제. 분자 면역학 45, 3926-3933. 따라서 면역 복합체의 청소율이 향상될 수 있다(Chu, S., et al., 2014: 침팬지에서 IgE의 가속화된 제거는 억제 수용체 FcγRIIb에 대한 친화력이 강화된 Fc 조작 항체인 Xmab7195에 의해 매개된다. Am J Respir Crit, American Thoracic Society 국제 컨퍼런스 초록). 일부 실시예에서, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 특히 Chu, S. Y. et al., 2008에 기재된 바와 같이 돌연변이 S267E 및 L328F를 갖는 조작된 Fc 모이어티를 포함한다: CD19 및 Fc감마RIIb(FcgammaRIIb)와 Fc-조작된 항체의 결합에 의한 1차 인간 B 세포의 B 세포 수용체-매개 활성화의 억제. 분자 면역학 45, 3926-3933.

B 세포에서 FcγRIIB 는 추가 면역글로불린 생산 및 예를 들어 IgE 클래스로의 이소형 전환을 억제하는 기능을 하는 것으로 보인다. 대식세포에서 FcγRIIB 는 FcγRIIA 를 통해 매개되는 식균 작용을 억제하는 것으로 생각된다. 호산구와 비만 세포에서 B형은 별도의 수용체에 결합하는 IgE를 통해 이들 세포의 활성화를 억제하는 데 도움이 될 수 있다.

FcγRI 결합과 관련하여 E233-G236, P238, D265, N297, A327 및 P329 중 적어도 하나의 천연 IgG의 변형은 FcγRI 에 대한 결합을 감소시킬 수 있다. 상응하는 위치 IgG1 및 IgG4로 치환된 위치 233-236의 IgG2 잔기는 FcγRI에 대한 IgG1 및 IgG4의 결합을 10³배 감소시키고 항체-감작(antibody-sensitized) 적혈구에 대한 인간 단핵구 반응을 제거하였다(Armour, K. L., et al. Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).

FcγRII 결합과 관련하여, 예를 들어 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 및 K414 중 적어도 하나의 IgG 돌연변이에 대해 FcγRIIA 에 대한 감소된 결합이 발견된다.

인간 FcγRIIA의 두 가지 대립형질 형태는 IgG1 Fc에 높은 친화도로 결합하는 "H131" 변이체와 낮은 친화도로 IgG1 Fc에 결합하는 "R131" 변이체이다. 예를 들어, Bruhns et al., Blood 113:3716-3725 (2009) 참조.

FcγRIII 결합과 관련하여, 예를 들어, E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 및 D376중 적어도 하나의 돌연변이에 대해 FcγRIIIA에 대한 감소된 결합이 발견된다. Fc 수용체에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위, 상기 언급된 돌연변이 부위의 맵핑(mapping) 및 FcγRI 및 FcγRIIA에 대한 결합을 측정하는 방법이 Shields, R. L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604에 설명되어 있다.

인간 FcγRIIIA의 2가지 대립유전자 형태는 낮은 친화도로 IgG1 Fc에 결합하는 "F158" 변이체와 높은 친화도로 IgG1 Fc에 결합하는 "V158" 변이체이다. 예를 들어, Bruhns et al., Blood 113:3716-3725 (2009) 참조.

FcγRII에 대한 결합과 관련하여 천연 IgG Fc의 두 영역은 FcγRII와 IgG 사이의 상호 작용에 관여하는 것으로 보인다, 즉 (i) IgG Fc의 하부 힌지 부위, 특히 아미노산 잔기 L, L, G, G(234 - 237, EU 넘버링), 및 (ii) IgG Fc의 CH2 도메인의 인접 영역, 특히 하부 힌지 영역에 인접한 상부 CH2 도메인의 루프 및 가닥, 예를 들어 P331 영역(Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318). 더욱이, FcγRI는 IgG Fc의 동일한 부위에 결합하는 것으로 보이는 반면, FcRn 및 단백질 A는 CH2-CH3 경계면에 있는 것으로 보이는 IgG Fc의 다른 부위에 결합한다(Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318).

또한 (즉, 하나 이상의) Fcγ 수용체에 대한 본 발명의 Fc 모이어티의 결합 친화성을 증가시키는 돌연변이가 고려된다(예를 들어, 돌연변이(들)을 포함하지 않는 참조 Fc 모이어티 또는 이를 포함하는 항체와 비교하여). 예를 들어, Delillo 및 Ravetch, Cell 161(5):1035-1045 (2015) 및 Ahmed et al., J. Struc. Biol. 194(1):78 (2016), Fc 돌연변이 및 기술은 본원에 참조로 포함된다.

본원에 개시된 임의의 실시예에서, 결합 단백질은 (EU 넘버링) G236A; S239D; A330L; 및 I332E; 또는 임의의 2개 이상을 포함하는 조합으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 (예: IgG1 또는 IgG1 유래) Fc 모이어티를 포함할 수 있다; 예를 들어, S239D/I332E; S239D/A330L/I332E; G236A/S239D/I332E; G236A/A330L/I332E (여기서는 "GAALIE"라고도 지칭함); 또는 G236A/S239D/A330L/I332E. 일부 실시예에서, Fc 모이어티는 S239D를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, Fc 모이어티는 위치 239에 천연 세린을 포함한다.

특정 실시예에서, Fc 모이어티는 FcRn 결합에 대한 결합에 관여하는 Fc 모이어티의 적어도 일부를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 특정 실시예에서, Fc 모이어티는 FcRn에 대한 결합 친화도를 향상시키는(예: 바인딩 강화) 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고(예를 들어, 약 pH 6.0에서), 일부 실시예에서 Fc 모이어티를 포함하는 분자의 생체내 반감기를 연장시킨다(예를 들어, 그렇지 않으면 동일하지만 변형(들)을 포함하지 않는 참조 Fc 모이어티 또는 항체와 비교할 때). 특정 실시예에서, Fc 모이어티는 IgG Fc를 포함하거나 그로부터 유도되고 반감기 연장 돌연변이는 다음 중 임의의 하나 이상을 포함한다: M428L; N434S; N434H; N434A; N434S; M252Y; S254T; T256E; T250Q; P257I Q311I; D376V; T307A; E380A (EU 넘버링). 특정 실시예에서, 반감기 연장 돌연변이는 M428L/N434S(본원에서 "MLNS"라고도 함)를 포함한다. 특정 실시예에서, 반감기 연장 돌연변이는 M252Y/S254T/T256E를 포함한다. 특정 실시예에서, 반감기 연장 돌연변이는 T250Q/M428L을 포함한다. 특정 실시예에서, 반감기 연장 돌연변이는 P257I/Q311I를 포함한다. 특정 실시예에서, 반감기 연장 돌연변이는 P257I/N434H를 포함한다. 특정 실시예에서, 반감기 연장 돌연변이는 D376V/N434H를 포함한다. 특정 실시예에서, 반감기 연장 돌연변이는 T307A/E380A/N434A를 포함한다.

일부 실시예에서, 결합 단백질은 치환 변화 M428L/N434S를 포함하는 Fc 모이어티를 포함한다. 일부 실시예에서, 결합 단백질은 치환 변화 G236A/A330L/I332E를 포함하는 Fc 모이어티를 포함한다. 특정 실시예에서, 결합 단백질은 G236A 돌연변이, A330L 돌연변이 및 I332E 돌연변이(GAALIE)를 포함하고 S239D 돌연변이를 포함하지 않는 (예를 들어, IgG) Fc 모이어티를 포함한다 (예를 들어, 위치 239에서 천연 S를 포함함). 특정 실시예에서, 결합 단백질은 치환 돌연변이: M428L/N434S 및 G236A/A330L/I332E를 포함하고 선택적으로 S239D를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함한다(예를 들어, 위치 329에서 천연 S를 포함할 수 있음). 특정 실시예에서, 결합 단백질은 치환 돌연변이: M428L/N434S 및 G236A/S239D/A330L/I332E를 포함하는 Fc 모이어티를 포함한다. 특정 추가 실시예에서, 결합 단백질은 Fc 모이어티에서 치환 돌연변이를 포함하고, 여기서 치환 돌연변이는 M428L/N434S, G236A/S239D/A330L/I332E, 또는 G236A/S239D/A330L/I332E/M428L/N434S로 구성되거나 본절적으로 구성된다.

임의의 본원에 개시된 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 FcγRIIa 및/또는 인간 FcγRIIIa에 대한 향상된 결합을 갖는다(즉, GAALIE 돌연변이를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 결합 단백질일 수 있는 폴리펩티드).

특정 실시예에서, 참조 폴리펩티드는 야생형 Fc 모이어티(예를 들어, 동일한 이소형)이거나 하나 이상의 치환 돌연변이(또는 삽입 또는 삭제)를 포함하는 Fc 모이어티인 Fc 모이어티를 포함하며, 단, 치환 돌연변이는 GAALIE가 아니거나 포함하지 않는다. 특정 실시예에서, 참조 폴리펩티드는 인간 FcγRIIa 및/또는 인간 FcγRIIIa에 대한 결합에 영향을 미치는 것으로 알려지거나 믿어지는 치환 돌연변이를 포함하지 않는다.

Fc 모이어티(또는 이를 포함하는 결합 단백질)와 인간 FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA 또는 인간 Fc FcγRIIB와 같은 인간 Fcγ 수용체 또는 C1q와 같은 보체 단백질 사이의 결합과 같은 폴리펩티드 사이의 결합은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정 또는 검출될 수 있다. 예를 들어, 생체층 간섭계(BLI) 분석은 센서 기질 상에 포획된 관심 있는 제1 폴리펩티드(예를 들어, GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티)와 관심 있는 제2 폴리펩티드 (예를 들어, FcγRIIA(H131), FcγRIIA(R131), FcγRIIIA(F158), FcγRIIIA(V158) 또는 FcγRIIb) 사이의 실시간 연합 및 해리를 결정하기 위해 제조업자의 지시에 따라 Octet® RED96(ForteBio, 프리몬트, 캘리포니아 미국) 기기를 사용하여 수행될 수 있다.

특정 실시예에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, GAALIE 돌연변이를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 FcγRIIA(H131), 인간 FcγRIIA(R131), 인간 FcγRIIIA(F158), 인간 FcγRIIIA(V158) 또는 이들의 임의의 조합에 대한 향상된 결합을 갖는다. 특정 실시예에서, 강화된 결합은 BLI 분석에서 참조 결합 단백질에 비해 신호 이동의 증가(예를 들어, 다음 중 하나 이상: 더 높은 피크 신호, 더 큰 결합 속도, 더 느린 해리 속도, 더 큰 곡선 아래 면적)에 의해 결정된다. 특정 실시예에서, BLI 분석은 Octet(R) RED96(ForteBio, 프리몬트, 캘리포니아 미국) 기기의 사용을 포함한다. 추가 실시예에서, BLI 분석은 안티-펜타-태그 센서(anti-penta-tag sensor) 상에 포획되고 결합 단백질에 노출된 태그 부착된 인간 FcγR을 포함한다. 일부 실시예에서, 결합 단백질은 IgG Fab를 포함하고 BLI 검정은 Fab 단편을 통해 결합 단백질을 가교결합하기 위해 항-IgG Fab 결합 단편의 존재 하에 포획된 인간 FcγR을 결합 단백질에 노출시키는 것을 추가로 포함한다.

특정 실시예에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 FcγRIIA (H131), 인간 FcγRIIA (R131), 인간 FcγRIIIA (F158), 및/또는 인간 FcγRIIIA (V158) 에 대한 강화된 결합을 갖고, 여기서 강화된 결합은 참조 결합 단백질을 사용하여 관찰된 신호 이동보다 1.5, 2, 2.5, 3배 또는 그 이상 더 큰 BLI 분석에서 신호 이동(나노미터)을 포함할 수 있다.

특정 실시예에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 FcγRIIA (H131), 인간 FcγRIIA (R131), 인간 FcγRIIIA (F158), 및 인간 FcγRIIIA (V158)에 대한 강화된 결합을 갖는다.

임의의 본원에 개시된 실시예에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 FcγRIIB에 대한 감소된 결합을 갖는다. 특정 실시예에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, 예를 들어 BLI 검정에서 통계적으로 유의한 신호 이동 대 기준선의 부재에 의해 결정된 바와 같이 인간 FcγRIIB에 결합하지 않는다.

임의의 본원에개시된 실시예에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 C1q(보체 단백질)에 대한 감소된 결합을 갖는다. 특정 실시예에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고 BLI 검정에서 기준선 대비 통계적으로 유의한 신호 이동의 부재에 의해 결정된 바와 같이 인간 C1q에 결합하지 않는다.

임의의 본원에 개시된 실시예에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고 인간 FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA 또는 둘 모두를 참조 폴리펩티드보다 더 큰 정도로 활성화시킨다(즉, GAALIE 돌연변이를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 HBsAg-특이적 결합 단백질일 수 있는 폴리펩티드). 특정 실시예에서, 참조 폴리펩티드는 야생형 Fc 모이어티이거나 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하되, 단 치환 돌연변이는 GAALIE가 아니다.

인간 FcγR의 활성화는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정 또는 검출될 수 있다. 예를 들어, 잘 검증되고 상업적으로 이용 가능한 바이오 리포터 분석은 NFAT 반응 요소의 제어 하에 (i) 관심 있는 FcγR 및 (ii) 반딧불이 루시퍼라제(luciferase) 리포터를 안정적으로 발현하는 Jurkat 이펙터 세포(Promega; 카탈로그 번호: G9798)의 존재 하에 HBsAg 특이적 결합 단백질을 재조합 HBsAg(엔제릭스 B, 글락소스미스클라인)와 함께 배양하는 것을 포함한다. 세포 표면 발현 FcγR에 대한 Fc의 결합은 루시퍼라제 리포터 유전자의 NFAT 매개 발현을 유도한다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 Bio-Glo-TM Luciferase Assay Reagent(Promega)를 사용하여 발광계(예: Bio-Tek)로 발광을 측정한다. 활성화는 다음 공식을 적용하여 배경에 대한 상대 발광 단위(RLU)의 평균으로 표현된다: (결합 단백질(예: mAb)의 농도 [x]에서 RLU - 배경의 RLU).

특정 실시예에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고 이는 참조 폴리펩티드보다 더 큰 정도로 인간 FcγRIIA (H131), 인간 FcγRIIA (R131), 인간 FcγRIIIA (F158), 및/또는 인간 FcγRIIIA (V158) 를 활성화시킨다. 특정 실시예에서, 더 큰 활성화 정도는 본원에 기술된 바와 같은 발광 바이오리포터 검정을 사용하여 결정된 바와 같이 더 높은 피크 발광 및/또는 더 큰 곡선 아래 발광 영역을 의미한다. 특정 실시예에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고 인간 FcγRIIA (H131), 인간 FcγRIIA (R131), 및 인간 FcγRIIIA (F158)를 참조 폴리펩티드보다 더 큰 정도로 활성화시키며, 여기서 더 큰 활성화 정도는 참조 결합 단백질을 사용하여 관찰된 피크 RLU보다 1.5, 2, 2.5, 3배 또는 그 이상 더 큰 피크 RLU를 포함한다.

임의의 본원에 개시된 실시예에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하며, 상기 기재된 바와 같은 발광 바이오리포터 검정에서 통계적으로 유의하고/하거나 측정가능한 RLU의 부재에 의해 결정되는 바와 같이 인간 FcγRIIB 를 활성화하지 않는다.

임의의 본원에 개시된 실시예에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고 HBsAg의 존재 하에 참조 폴리펩티드보다 더 큰 정도로 인간 자연 살해(NK) 세포를 활성화시킨다. 특정 실시예에서, NK 세포의 활성화는 CD107a 발현(예를 들어, 유세포 분석법)에 의해 결정된다. 특정 실시예에서, NK 세포는 V158/V158 동형접합, F158/F158 동형접합 또는 V158/F158 이형접합 FcγRIIIa 유전자형을 포함하는 세포를 포함한다.

본원의 개시에 따른 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하는 임의의 결합 단백질이 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 특징을 수행하거나 보유할 수 있음이 이해될 것이다; 예를 들어, 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 FcγRIIA 및/또는 인간 FcγRIIIA에 대한 강화된 결합; 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 FcγRIIB에 대한 감소된 결합(및/또는 인간 FcγRIIB에 대한 결합 없음); 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 C1q에 대한 감소된 결합(및/또는 인간 C1q에 대한 결합 없음); FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA 또는 둘 모두를 참조 폴리펩티드보다 더 큰 정도로 활성화하고; 인간 FcγRIIB를 활성화하지 않고; 및/또는 참조 폴리펩티드(예를 들어, HBsAg에 특이적이고 GAALIE 돌연변이를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 항체)보다 더 큰 정도로 HBsAg의 존재 하에 인간 자연 살해(NK) 세포를 활성화시킨다.

특정 실시예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 FC 모이어티을 포함하고: (i) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA, 또는 둘 다에 대한 강화된 결합을 갖고, 여기서 인간 FcγRIIA는 임의로 H131 또는 R131이고/이거나 인간 FcγRIIIA는 선택적으로 F158 또는 V158임; (ii) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 FC 모이어티을 포함하는 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 FcγRIIB에 대한 감소된 결합을 가짐; (iii) 인간 FcγRIIB에 결합하지 않음; (iv) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 C1q에 대한 감소된 결합을 가짐; (v) 인간 C1q에 결합하지 않음; (vi) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드보다 더 큰 정도로 FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA 또는 둘 모두를 활성화하고, 여기서 인간 FcγRIIA는 선택적으로 H131 또는 R131이고/이거나 인간 FcγRIIIA는 선택적으로 F158 또는 V158임; (vii) 인간 FcγRIIB를 활성화하지 않음; (viii) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드보다 더 큰 정도로 HBsAg의 존재 하에 인간 자연 살해(NK) 세포를 활성화하고, 여기서 참조 폴리펩티드는 선택적으로 HB Ag, 선택적으로 HBsAg에 결합하는 항체임; (ix) HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, 또는 이들의 조합을 포함하는 HBsAg 변이체에 결합할 수 있음; (x) HBsAg에 결합하고 G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 항체 또는 항원 결합 단편과 비교하여 HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 HBsAg 변이체에 대한 개선된 결합을 가짐.

선택적으로 또는 추가로, 본원에 개시된 결합 단백질의 Fc 모이어티는 단백질 A 결합에 필요한 것으로 당업계에 공지된 적어도 일부를 포함할 수 있고; 및/또는 본원에 개시된 항체의 Fc 모이어티는 적어도 단백질 G 결합에 필요한 것으로 당업계에 공지된 Fc 분자의 일부를 포함한다. 일부 실시예에서, 유지된 기능은 HBsAg 및 HBVg의 제거를 포함한다. 따라서, 특정 실시예에서, Fc 모이어티는 적어도 FcγR 결합에 필요한 것으로 당업계에 공지된 부분을 포함한다. 위에서 약술한 바와 같이, FC 모이어티은 따라서 적어도 다음을 포함할 수 있다: (i) 천연 IgG Fc의 하부 힌지 부위, 특히 아미노산 잔기 L, L, G, G(234 - 237, EU 넘버링), 및 (ii) 천연 IgG Fc의 CH2 도메인의 인접 영역, 특히 하부 힌지 영역에 인접한 상부 CH2 도메인의 루프 및 가닥, 예를 들어 P331의 영역, 예를 들어 P331 주변의 천연 IgG Fc의 상부 CH2 도메인에서 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산 영역, 예를 들어 천연 IgG Fc의 아미노산 320과 340(EU 넘버링) 사이.

일부 실시예에서, 본원의 개시에 따른 결합 단백질은 Fc 영역을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "Fc 영역"은 항체 중쇄의 2개 이상의 Fc 모이어티에 의해 형성된 면역글로불린의 부분을 의미한다. 예를 들어, Fc 영역은 단량체 또는 "단일 사슬" Fc 영역(즉, scFc 영역)일 수 있다. 단일 사슬 Fc 영역은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 연결된 Fc 모이어티로 구성된다(예: 단일 연속 핵산 서열에 인코딩됨).

예시적인 scFc 영역은 WO 2008/143954 A2에 개시되어 있으며, 본원에 참조로 포함된다. Fc 영역은 이합체 Fc 영역이거나 이를 포함할 수 있으며; 이합체 Fc 영역은 위에서 기술되고 한 실시예에서 도 7에 예시된 바와 같은 바람직하지 않은 (예를 들어, 항체:항체, 항체:항원-결합 단편, 또는 항원-결합 단편:항원-결합 단편) 이합체와 동일하지 않다는 것을 이해할 것이다. 특정 바람직한 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 이량체 Fc 영역을 포함하는 반면, 항체- 또는 항원-결합 단편-함유 이량체를 거의 생성하지 않는다.

"이량체 Fc 영역" 또는 "dcFc"는 2개의 분리된 면역글로불린 중쇄의 Fc 모이어티에 의해 형성된 이량체를 의미한다. 이량체 Fc 영역은 2개의 동일한 Fc 모이어티(예를 들어, 자연 발생 면역글로불린의 Fc 영역)의 동종이량체 또는 2개의 동일하지 않은 Fc 모이어티의 이종이량체일 수 있다(예를 들어, 이량체 Fc 영역의 하나의 Fc 단량체는 다른 Fc 단량체에 존재하지 않는 적어도 하나의 아미노산 변형(예: 치환, 삭제, 삽입 또는 화학적 변형)을 포함하거나, 하나의 Fc 단량체는 다른 것에 비해 절단될 수 있다).

본원에 개시된 Fc 모이어티는 동일하거나 상이한 클래스 및/또는 서브클래스의 Fc 서열 또는 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc 모이어티는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스의 면역글로불린(예를 들어, 인간 면역글로불린) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시예에서, Fc 영역의 Fc 모이어티는 동일한 부류 및 서브 클래스이다. 그러나, Fc 영역(또는 Fc 영역의 하나 이상의 Fc 모이어티)은 또한 키메라일 수 있으며, 키메라 Fc 영역은 상이한 면역글로불린 부류 및/또는 서브 클래스로부터 유도된 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이량체 또는 단일 사슬 Fc 영역의 Fc 모이어티 중 적어도 두 개는 서로 다른 면역글로불린 부류 및/또는 서브 클래스에서 유래할 수 있다. 특정 실시예에서, 이합체 Fc 영역은 2개 이상의 상이한 이소타입 또는 서브클래스로부터의 서열을 포함할 수 있으며; 예를 들어, a SEEDbody ("가닥 교환 엔지니어링 도메인"), Davis et al., Protein Eng. Des. Sel. 23(4):195 (2010) 참조.

추가적으로 또는 선택적으로, 키메라 Fc 영역은 하나 이상의 키메라 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 Fc 영역 또는 모이어티는 제1 서브 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG3 서브 클래스)의 면역글로불린으로부터 유래된 하나 이상의 부분을 포함할 수 있는 반면, 나머지 Fc 영역 또는 모이어티는 상이한 서브 클래스이다. 예를 들어, Fc 폴리펩티드의 Fc 영역 또는 모이어티는 제1 서브클래스(예: IgG1, IgG2 또는 IgG4 서브 클래스)의 면역글로불린으로부터 유래된 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 제2 서브클래스(예를 들어, IgG3 서브클래스)의 면역글로불린으로부터의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc 영역 또는 모이어티는 제1 서브 클래스(예를 들어, IgG4 서브 클래스)의 면역글로불린으로부터 유도된 힌지 및/또는 CH2 도메인 및 제2 서브 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, 또는 IgG3 서브클래스)의 면역글로불린으로부터의 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 Fc 영역은 제1 서브 클래스(예를 들어, IgG4 서브 클래스)에 대한 면역글로불린으로부터의 Fc 모이어티(예를 들어, 완전한 Fc 모이어티) 및 제2 서브 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG3 서브클래스). 예를 들어, Fc 영역 또는 모이어티는 IgG4 면역글로불린의 CH2 도메인 및 IgG1 면역글로불린의 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc 영역 또는 모이어티는 IgG4 분자의 CH1 도메인 및 CH2 도메인 및 IgG1 분자의 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc 영역 또는 모이어티는 항체의 특정 서브클래스, 예를 들어 CH2 도메인의 EU 위치 292-340으로부터의 CH2 도메인의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc 영역 또는 모이어티는 IgG4 모이어티로부터 유래된 CH2의 위치 292-340 및 IgG1 모이어티로부터 유래된 CH2의 나머지 부분의 아미노산을 포함할 수 있다(또는 CH2의 292-340개는 IgG1 모이어티에서 파생되고 나머지 CH2는 IgG4 모이어티에서 파생될 수 있다).

본 발명의 임의의 항체, 항원-결합 단편, 또는 Fc 영역 또는 모이어티는 임의의 알로타입(allotype) 및/또는 일배체형(haplotype)일 수 있음이 또한 이해될 것이다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 G 알로타입은 Jefferis 및 LeFranc, mAbs 1(4):1-7 (2009)에 개시된 것을 포함하며, 이 알로타입(G1m (1(a); 2(x); 3(f); 및 17(z)); G2m (23(n)); G3m (21(g1); 28(g5); 11(b0); 5(b2); 13(b3); 14(b4); 10(b5); 15(s); 16(t); 6(c3); 24(c5); 26(u); 및 27(v)); A2m (1 and 2); 및 Km (1; 2; and 3)를 포함) 및 일배체형, 그리고 생성된 아미노산 서열, 및 이들의 조합은 본원에 참조로 포함된다. 특정 실시예에서, 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 또는 Fc 영역 또는 모이어티는 IgG1 알로타입 g1m17, k1을 포함한다.

더욱이, Fc 영역 또는 모이어티는 (추가로 또는 선택적으로) 예를 들어 키메라 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 힌지는 예를 들어 부분적으로는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 분자(예: 상단 및 하단 중간 힌지 시퀀스)에서, 부분적으로는 IgG3 분자 (예: 중간 힌지 시퀀스)에서 유래한다. 다른 예에서, Fc 영역 또는 모이어티는 부분적으로는 IgG1 분자로부터, 부분적으로는 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 키메라 힌지는 IgG4 분자로부터의 상부 및 하부 힌지 도메인 및 IgG1 분자로부터의 중간 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 키메라 힌지는 예를 들어 IgG4 힌지 영역의 중간 힌지 도메인에서 EU 위치 228에 프롤린 치환(Ser228Pro)을 도입하여 만들 수 있다. 다른 실시예에서, 키메라 힌지는 EU 위치 233-236에서 IgG2 항체 및/또는 Ser228Pro 돌연변이로부터의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 힌지의 나머지 아미노산은 IgG4 항체(예를 들어, 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVAGP(서열번호 74)의 키메라 힌지)로부터이다. 본원의 개시에 따른 항체의 Fc 모이어티에 사용될 수 있는 추가의 키메라 힌지는 US 2005/0163783 A1에 기재되어 있다.

본원에 개시된 결합 단백질의 일부 실시예에서, Fc 모이어티 또는 Fc 영역은 인간 면역글로불린 서열(예를 들어, 인간 IgG 분자로부터의 Fc 영역 또는 Fc 모이어티)으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 그러나, 폴리펩티드는 다른 포유동물 종으로부터의 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 영장류 Fc 모이어티 또는 영장류 결합 부위가 대상 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 선택적으로, 하나 이상의 뮤린 아미노산이 Fc 모이어티 또는 Fc 영역에 존재할 수 있다.

일부 실시예에서, 선택적으로 C-말단 리신이 제거된 서열번호 75에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄(HC), 및 경쇄(LC)를 포함하는 항체가 제공되며, 여기서 LC는 (i) 서열번호 58-72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열 및 (ii) 서열번호 79에 제시된 CL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

일부 실시예에서, 선택적으로 C-말단 리신이 제거된 서열번호 76에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄(HC), 및 경쇄(LC)를 포함하는 항체가 제공되며, 여기서 LC는 (i) 서열번호 58-72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열 및 (ii) 서열번호 79에 제시된 CL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

일부 실시예에서, 선택적으로 C-말단 라이신이 제거된 서열번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄(HC), 및 경쇄(LC)를 포함하는 항체가 제공되며, 여기서 LC는 (i) 서열번호 58-72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열 및 (ii) 서열번호 79에 제시된 CL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

일부 실시예에서, 선택적으로 C-말단 라이신이 제거된 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)를 포함하는 항체가 제공되며, 여기서 LC는 (i) 서열번호 58-72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열 및 (ii) 서열번호 79에 제시된 CL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

핵산 분자/폴리뉴클레오티드

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원의 개시에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 제1 핵산 분자는 항체의 중쇄를 인코딩할 수 있고, 제2 핵산 분자는 항체의 경쇄를 인코딩할 수 있으며; 이들 제1 및 제2 핵산 분자는 여전히 항체를 인코딩하는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"로 지칭될 수 있다. 다시 말해, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 항체 또는 항원 결합 단편의 부분(예를 들어, 사슬)이 별도의 핵산 분자 및/또는 핵산 분자의 별도 부분에 의해 인코딩되는 실시예를 포함한다. 예시적인 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 80-99에 제공된다. 일부 실시예에서, 항체 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 81에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 항체 VL 또는 LC를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 85-99 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 항체 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 83에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 항체 VL 또는 LC를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 85-99 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 항체 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 84에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 항체 VL 또는 LC를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 85-99 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

유전자 코드의 중복으로 인해, 본 개시내용은 또한 이들 핵산 서열의 서열 변이체, 특히 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 이러한 서열 변이체를 포함한다.

특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 서열번호 80-99 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열에 적어도 50% (즉, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 공유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포에 의한 발현을 위해 최적화된 코돈이다.

특정 실시예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 서열번호 80-99 중 어느 하나에 따른 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 81에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 50% 동일성을 갖는 V_H-인코딩 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 85-97 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 V_L-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 본원에 개시된 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 84에 따른 VH-CH1-힌지-CH2-CH3-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 98 또는 99에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 50% 동일성을 갖는 CL-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

벡터

본원의 개시에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터, 예를 들어 발현 벡터가 개시내용의 범위 내에 추가로 포함된다.

"벡터"라는 용어는 핵산 분자를 포함하는 작제물을 의미한다. 본 개시 내용의 맥락에서 벡터는 원하는 핵산 서열을 통합(incorporating)하거나 품는(harboring) 데 적합하다. 그러한 벡터는 저장 벡터, 발현 벡터, 클로닝 벡터, 전달 벡터 등일 수 있다. 저장 벡터는 핵산 분자의 편리한 저장을 허용하는 벡터이다. 따라서, 벡터는 예를 들어 본 설명에 따른 원하는 항체 또는 이의 항체 단편에 상응하는 서열을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "발현 벡터"는 적합한 숙주에서 핵산 분자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 적합한 제어 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 함유하는 DNA 작제물을 의미한다. 그러한 제어 서열은 전사를 수행하기 위한 프로모터(예를 들어, 이종 프로모터), 이러한 전사를 제어하기 위한 선택적인 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 인코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종료를 제어하는 서열을 포함한다. 관심 핵산 분자의 전사에 기여하는 발현 벡터의 임의의 요소는 벡터에 대해 이종일 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 바이러스 또는 단순히 잠재적인 게놈 삽입물일 수 있다. 일단 적합한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제 및 기능할 수 있거나, 경우에 따라 게놈 자체에 통합될 수 있다. 본 명세서에서 "플라스미드", "발현 플라스미드", "바이러스" 및 "벡터"는 종종 혼용되어 사용된다.

클로닝 벡터는 일반적으로 핵산 서열을 벡터에 통합하는 데 사용될 수 있는 클로닝 부위를 포함하는 벡터이다. 클로닝 벡터는 예를 들어 플라스미드 벡터 또는 박테리오파지 벡터일 수 있다.

전달 벡터는 핵산 분자를 세포 또는 유기체로 전달하는데 적합한 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 벡터는 예를 들어 RNA 벡터 또는 DNA 벡터일 수 있다. 벡터는 DNA 분자일 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 의미에서 벡터는 클로닝 부위, 항생제 내성 인자와 같은 선택 마커, 및 복제 기점과 같은 벡터의 증식에 적합한 서열을 포함한다.

특정 실시예에서, 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 γ -레트로바이러스 벡터)를 포함한다. 바이러스 벡터에는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스(예: 아데노 관련 바이러스), 코로나바이러스, 오르소-믹소바이러스(예: 인플루엔자 바이러스)와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스, 랍도바이러스(예: 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(예: 홍역 및 센다이), 피코르나바이러스 및 알파바이러스와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스, 및 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 1형 및 2형, 엡스타인-바 바이러스, 사이토메갈로바이러스)를 포함하는 이중 가닥 DNA 바이러스 및 폭스바이러스(예를 들어, 백시니아, 계두 및 카나리폭스)를 포함한다. 다른 바이러스는 예를 들어 노워크바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바바이러스, 헤파드나바이러스 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는 조류 백혈병-육종, 포유류 C형, B형 바이러스, D형 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스를 포함한다(Coffin, J. M., Retroviridae: 바이러스와 그 복제, 기초 바이러스학 제3판, B. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, 필라델피아, 1996).

"레트로바이러스"는 역전사 효소를 사용하여 DNA로 역전사되는 RNA 게놈을 갖는 바이러스이며, 역전사된 DNA는 숙주 세포 게놈에 통합된다. "감마레트로바이러스"는 레트로바이러스과의 속을 의미한다. 감마레트로바이러스의 예는 마우스 줄기 세포 바이러스, 쥐 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스 및 조류 세망내피증 바이러스를 포함한다.

"렌티바이러스 벡터"는 유전자 전달을 위한 HIV 기반 렌티바이러스 벡터를 포함하며, 이는 통합적이거나 비통합적일 수 있고, 상대적으로 큰 패키징 용량을 가지며, 다양한 세포 유형을 형질도입할 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 일반적으로 3개(패키징, 엔벨로프 및 전달) 이상의 플라스미드를 생산자 세포로 일시적으로 형질감염시킨 후에 생성된다. HIV와 마찬가지로 렌티바이러스 벡터는 세포 표면의 수용체와 바이러스 표면 당단백질의 상호작용을 통해 표적 세포로 들어간다. 진입 시 바이러스 RNA는 바이러스 역전사 효소 복합체에 의해 매개되는 역전사를 겪는다. 역전사의 산물은 감염된 세포의 DNA로의 바이러스 통합을 위한 기질인 이중 가닥 선형 바이러스 DNA이다.

특정 실시예에서, 바이러스 벡터는 감마레트로바이러스, 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)-유래 벡터일 수 있다. 다른 실시예에서, 바이러스 벡터는 보다 복잡한 레트로바이러스 유래 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 유래 벡터일 수 있다. HIV-1 유래 벡터가 이 범주에 속한다. 다른 예로는 HIV-2, FIV, 말 전염성 빈혈 바이러스, SIV 및 Maedi-Visna 바이러스(양 렌티바이러스)에서 파생된 렌티바이러스 벡터가 있다. 트랜스유전자를 함유하는 바이러스 입자로 포유동물 숙주 세포를 형질도입하기 위해 레트로바이러스 및 렌티바이러스 바이러스 벡터 및 패키징 세포를 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있다: 예를 들어, 미국 특허8,119,772; Walchli et al., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther. 18:1748, 2010; 및 Verhoeyen et al., Methods Mol. Biol. 506:97, 2009. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 구조 및 발현 시스템도 상업적으로 이용 가능하다. DNA 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 기반 벡터 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 기반 벡터; 앰플리콘 벡터, 복제 결함 HSV 및 약독화된 HSV를 포함하는 단순 포진 바이러스(HSV)에서 파생된 벡터)를 포함하는 다른 바이러스 벡터도 폴리뉴클레오티드 전달에 사용될 수 있다(Krisky et al., Gene Ther. 5:1517, 1998).

본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 다른 벡터는 배큘로바이러스(baculoviruses) 및 α-바이러스 (Jolly, D J. 1999. 새로운 바이러스 벡터. pp 209-40 in Friedmann T. ed. 인간 유전자 치료의 발전. 뉴욕: 콜드 스프링 하버 연구소), 또는 플라스미드 벡터(잠자는 숲속의 미녀 또는 기타 트랜스포존 벡터와 같은)로부터 유래된 것을 포함한다.

바이러스 벡터 게놈이 별개의 전사물로서 숙주 세포에서 발현될 다수의 폴리뉴클레오티드를 포함할 때, 바이러스 벡터는 또한 바이시스트론 또는 멀티시스트론 발현을 가능하게 하는 2개(또는 그 이상)의 전사물 사이에 추가 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터에 사용되는 이러한 서열의 예는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 퓨린 절단 부위, 바이러스 2A 펩티드 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

대상에게 직접 투여하기 위한 DNA 기반 항체 또는 항원 결합 단편 인코딩 플라스미드 벡터를 포함하는 플라스미드 벡터는 본 명세서에서 추가로 설명된다.

세포

추가 측면에서, 본 개시내용은 또한 본원의 개시에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 발현하는 세포("숙주 세포"라고도 함); 또는 본원의 개시에 따른 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

이러한 세포의 예에는 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포; 및 대장균을 포함하는 원핵 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 이러한 특정 실시예에서, 세포는 CHO 세포(예를 들어, DHFR-CHO 세포(Urlaub et al., PNAS 77:4216 (1980), CHO-KSV, ExpiCHO), 인간 배아 신장 세포(예: HEK293T 세포), PER.C6 세포, Y0 세포, Sp2/0 세포, NS0 세포, 인간 간 세포(예를 들어 헤파 RG 세포), 골수종 세포 또는 하이브리도마 세포와 같은 포유동물 세포주이다. 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, TM4 세포); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 원숭이 신장 세포(CV1); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 쥐 간 세포(BRL 3A); 마우스 유방 종양(MMT 060562); TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포. 항체 생산에 적합한 포유동물 숙주 세포주는 또한 예를 들어, Yazaki 및 Wu,　Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003)에 기술된 것들을 포함한다.

특정 실시예에서, 숙주 세포는 대장균과 같은 원핵 세포이다. 대장균과 같은 원핵 세포에서 펩티드의 발현은 잘 확립되어 있다(예를 들어, Pluckthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991) 참조). 예를 들어, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 때 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는 예를 들어 미국 특허 5,648,237; 5,789,199; 및 5,840,523 참조.

본 개시내용의 결합 단백질을 발현하는 유용한 곤충 세포는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Spodoptera frugipera Sf9 세포, Trichoplusia ni BTI-TN5B1-4세포 및 Spodoptera frugipera SfSWT01 "Mimic^TM" 세포를 포함한다. 예를 들어, Palmberger et al., J. Biotechnol. 153(3-4):160-166 (2011) 참조. 특히 Spodoptera frugiperda 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 확인되었다.

사상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 또한 단백질 코딩 벡터를 클로닝하거나 발현하기에 적합한 숙주이며, "인간화된" 글리코실화 경로를 갖는 곰팡이 및 효모 균주를 포함하여, 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생성한다. Gerngross,　Nat. Biotech.　22:1409-1414 (2004); Li et al.,　Nat. Biotech.　24:210-215 (2006) 참조.

식물 세포는 또한 본 발명의 결합 단백질을 발현하기 위한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, PLANTIBODIES?? 기술(예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177; 6,040,498; 6,420,548; 7,125,978; 및 6,417,429에 설명됨)은 트랜스제닉 식물을 사용하여 항체를 생산한다.

일부 실시예에서, 융합 단백질은 면역 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포 또는 이의 임의의 하위유형에 의해 세포 표면에서 발현된다.

본 개시내용과 호환되는 임의의 단백질 발현 시스템을 사용하여 개시된 결합 단백질을 생성할 수 있다. 적합한 발현 시스템은 유전자 발현 시스템, 학술 보도, eds. Fernandez et al., 1999에 기재된 트랜스제닉 동물을 포함한다.

특정 실시예에서, 세포는 발현 벡터와 함께 본 설명에 따른 벡터로 형질감염될 수 있다. 용어 "형질감염"은 DNA 또는 RNA(예: mRNA) 분자와 같은 핵산 분자를 진핵 세포와 같은 세포로 도입하는 것을 의미한다. 본 설명과 관련하여, "형질감염"이라는 용어는 핵산 분자를 세포, 예를 들어 포유동물 세포를 비롯한 진핵 세포에 도입하기 위한 당업자에게 공지된 임의의 방법을 포함한다. 이러한 방법은 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 예를 들어 양이온성 지질 및/또는 리포좀에 기초한 리포펙션(lipofection), 인산칼슘 침전, 나노입자 기반 형질감염, 바이러스 기반 형질감염, 또는 양이온성 중합체, 예컨대 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민 등에 기초한 형질감염을 포함한다. 특정 실시예에서, 도입은 비-바이러스성이다.

더욱이, 본원에 개시된 세포는 세포는 본 설명에 따른 벡터(예를 들어 본 설명에 따라 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하기 위한 것임)로 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염될 수 있다. 이러한 실시예에서, 세포는 결합 단백질을 인코딩하는 본원에 기술된 바와 같은 벡터로 안정적으로 형질감염된다. 선택적으로, 세포는 본 설명에 따른 결합 단백질을 인코딩하는 본 개시내용에 따른 벡터로 일시적으로 형질감염될 수 있다. 임의의 본원에 개시된 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 대해 이종일 수 있다.

관련된 측면에서, 본 개시내용은 항체, 항원-결합 단편 또는 융합 단백질을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 생산하기에 충분한 조건 및 시간 동안 본 개시내용의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.

따라서, 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 이종 발현하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 예를 들어, 세포는 항체가 완전히 또는 부분적으로 수득된 종(예를 들어, 인간 항체 또는 조작된 인간 항체를 발현하는 CHO 세포)과 상이한 종일 수 있다. 일부 실시예에서, 숙주 세포의 세포 유형은 자연에서 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하지 않는다. 더욱이, 숙주 세포는 결합 단백질의 천연 상태(또는 대상 결합 단백질이 조작되거나 유래된 모 결합 단백질의 천연 상태)에 존재하지 않는 번역 후 변형(PTM; 예: 글리소실화 또는 푸코실화)을 결합 단백질에 부여할 수 있다. 이러한 PTM은 기능적 차이(예: 면역원성 감소)를 초래할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 숙주 세포에 의해 생성되는 본 개시내용의 결합 단백질은 이의 천연 상태의 결합 단백질 또는 모 결합 단백질과 구별되는 하나 이상의 번역후 변형을 포함할 수 있다(예를 들어, CHO 세포에 의해 생성된 인간 항체는 인간으로부터 분리될 때 및/또는 천연 인간 B 세포 또는 형질 세포에 의해 생성될 때 항체와 구별되는 번역후 변형을 포함할 수 있다).

항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질의 선택적 추가 기능

본 개시내용의 항체, 항원-결합 단편 및 융합 단백질은 예를 들어 치료 부위로의 전달을 위한 약물에 결합되거나 관심 세포를 포함하는 부위의 영상화를 용이하게 하기 위해 검출가능한 표지에 결합될 수 있다. 항체를 약물 및 검출가능한 표지에 커플링시키는 방법은 검출가능한 표지를 사용하여 영상화하는 방법과 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 표지된 항체는 매우 다양한 표지를 사용하여 다양한 분석에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 항체(또는 항원 결합 단편 또는 융합 단백질)와 HBsAg, 특히 HBsAg의 항원 루프 영역 상의 관심 에피토프 사이의 항체-항원 복합체 형성의 검출은 검출가능한 물질을 항체에 부착함으로써 촉진될 수 있다. 적합한 검출 수단은 방사성 핵종(radionuclides), 효소, 조효소, 형광체(fluorescers), 화학발광체(chemiluminescers), 발색체(chromogens), 효소 기질 또는 보조인자, 효소 억제제, 보결분자단 복합체(prosthetic group complexes), 자유 라디칼, 입자(particles), 염료(dyes) 등과 같은 표지(labels)의 사용을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타-갈락토시다제(b-galactosidase) 또는 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)를 포함하고; 적합한 보결(prosthetic) 분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴(streptavidin/biotin) 및 아비딘/비오틴(avidin/biotin)을 포함하고; 적합한 형광체의 예는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실 클로라이드(dansyl chloride) 또는 피코에리트린(phycoerythrin )을 포함하고; 발광 체의 예는 루미놀(luminol)이고; 생물발광 물질의 예는 루시퍼라제(luciferase), 루시페린(luciferin) 및 에쿠오린(aequorin)을 포함하고; 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S, 또는　3H 를 포함한다. 이러한 표지된 시약은 방사선면역분석, 효소 면역분석, 예를 들어 ELISA, 형광 면역분석 등과 같은 잘 알려진 다양한 분석에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 표지된 항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질은 예를 들어 미국 3,766,162; 미국 3,791,932; 미국 3,817,837; 및 미국4,233,402에 기술된 바와 같은 분석법에 사용된다.

본 개시내용에 따른 항체, 항원-결합 단편 또는 융합 단백질은 세포독소, 치료제 또는 방사성 금속 이온 또는 방사성동위원소와 같은 치료 부분에 접합될 수 있다. 방사성 동위원소의 예는 I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 접합체는 주어진 생물학적 반응을 수정하는 데 사용할 수 있다; 약물 모이어티는 고전적인 화학 치료제로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 그러한 단백질은 예를 들어 아브린(abrin), 리신 A(ricin A), 슈도모나스 외독소(pseudomonas exotoxin) 또는 디프테리아 독소(diphtheria toxin)와 같은 독소를 포함할 수 있다.

이러한 치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 잘 알려져 있다. 예를 들어, Arnon et al. (1985) "암 치료에서 약물의 면역 표적화를 위한 단클론 항체", 단일 클론 항체 및 암 치료, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) " 약물 전달용 항체, "제어 약물 전달, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653; Thorpe (1985) "암 치료에서 세포독성제의 항체 운반체: 리뷰," 단클론항체에서 '84: 생물학적 및 임상적 응용, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, 밀라노, 이탈리아, 1985); "암 치료에서 방사성 표지 항체의 치료적 사용에 대한 분석, 결과 및 향후 전망,"암 검출 및 치료를 위한 단클론 항체, ed. Baldwin et al. (학술 보도, 뉴욕, 1985), pp. 303-316; 및 Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158 참조.

선택적으로, 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질은 예를 들어 미국 4,676,980에 기재된 바와 같이 이종접합체를 형성하기 위해 제2 항체 또는 이의 항체 단편(또는 제2 융합 단백질)에 접합될 수 있다. 또한, 링커는 예를 들어 미국 4,831,175에 기술된 바와 같이 설명의 표지와 항체 사이에 사용될 수 있다. 항체, 항원-결합 단편 및 융합 단백질은 예를 들어 미국 5,595,721에 기술된 바와 같이 당업계에 공지된 방사성 요오드(iodine), 인듐(indium), 이트륨(yttrium) 또는 기타 방사성 입자로 직접 표지될 수 있다. 치료는 예를 들어 WO00/52031; WO00/52473에 기술된 바와 같이 접합 및 비접합 항체, 항원 결합 단편 및/또는 융합 단백질을 동시에 또는 후속적으로 투여하는 치료의 조합으로 구성될 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 항체, 항원-결합 단편 및 융합 단백질은 또한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체, 이의 기능적 항체 단편 또는 융합 단백질은 예를 들어 그들의 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체에 대한 공유 접합에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 중합체의 예 및 이들을 펩티드에 부착시키는 방법은 US 4,766,106; US　4,179,337; US 4,495,285 및 US 4,609,546에 제시되어 있다. 일부 실시예에서, 중합체는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로부터 선택될 수 있다. PEG는 실온에서 물에 용해되며 일반식: R(O-CH₂-CH₂)_nO-R (여기서 R은 수소 또는 알킬 또는 알칸올 그룹과 같은 보호 그룹일 수 있음)을 갖는다. 특정 실시예에서, 보호기는 1 내지 8개의 탄소를 가질 수 있다. 예를 들어, 보호기는 메틸일 수 있다. 기호 n 은 양의 정수이다. 한 실시예에서, n 은 1 내지 1,000이다. 다른 실시예에서 n 은 2 내지 500이다. 일부 실시예에서, PEG는 1,000 내지 40,000, 2,000 내지 20,000, 및 3,000 내지 12,000으로부터 선택된 평균 분자량을 갖는다. 또한, PEG는 적어도 하나의 하이드록시 그룹을 가질 수 있으며, 예를 들어 PEG는 말단 하이드록시 그룹을 가질 수 있다. 예를 들어, 억제제의 자유 아미노 그룹과 반응하도록 활성화되는 것은 말단 하이드록시 그룹이다. 그러나, 반응기의 유형 및 양은 본 설명의 공유 접합된 PEG/항체를 달성하기 위해 다양할 수 있는 것으로 이해될 것이다.

수용성 폴리옥시에틸화 폴리올(polyoxyethylated polyols)은 또한 본원에 기술된 항체 및 항원 결합 단편과 관련하여 사용될 수 있다. 이들은 폴리옥시에틸화 소르비톨(sorbitol), 폴리옥시에틸화 글루코스(glucose), 폴리옥시에틸화 글리세롤(POG) 등을 포함한다. 일 실시예에서, POG가 사용된다. 어떠한 이론에도 구속되지 않고, 폴리옥시에틸화 글리세롤의 글리세롤 골격은 예를 들어 모노-, 디-, 트리글리세리드에서 동물과 인간에서 자연적으로 발생하는 동일한 골격이기 때문에 이러한 분지는 반드시 체내에서 이물질로 간주되지는 않는다. POG는 PEG와 동일한 범위의 분자량을 가질 수 있다. 순환 반감기를 증가시키기 위해 사용될 수 있는 또 다른 약물 전달 시스템은 리포좀이다. 리포좀 전달 시스템을 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 다른 약물 전달 시스템은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Poznansky et al. (1980) 및 Poznansky　(1984)에 참조로 설명되어 있다.

본 발명의 항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질은 정제된 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로, 항체, 항원-결합 단편, 또는 융합 단백질은 예를 들어, 90%(중량 기준) 미만, 일반적으로 60% 미만, 보다 일반적으로 50% 미만의 조성물이 다른 폴리펩티드로 구성되는 다른 폴리펩티드가 실질적으로 없는 조성물에 존재할 것이다.

본 발명의 항체, 융합 단백질 또는 항원 결합 단편은 비인간(또는 이종) 숙주, 예를 들어 마우스에서 면역원성일 수 있다. 특히, 항체, 항원-결합 단편 또는 융합 단백질은 비인간 숙주에서는 면역원성이지만 인간 숙주에서는 그렇지 않은 이디토프(idiotope)를 가질 수 있다. 특히, 인간 사용을 위한 그러한 개시내용의 분자는 마우스, 염소, 토끼, 래트, 영장류가 아닌 포유동물 등과 같은 숙주로부터 쉽게 분리될 수 없고 일반적으로 인간화에 의해 또는 제노-마우스로부터 얻을 수 없는 것들을 포함한다.

항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질 생산

본 개시내용에 따른 항체, 항원-결합 단편 및 융합 단백질은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마 기술(hybridoma technology)을 사용하여 단일클론항체를 만드는 일반적인 방법론은 잘 알려져 있다(Kohler, G. 및 Milstein, C., 1975; Kozbar et al. 1983). 일 실시예에서, WO2004/076677에 기술된 EBV 불멸화(immortalization) 방법이 사용된다.

한 실시예에서, 항체는 WO 2004/076677에 기재된 방법을 사용하여 생성된다. 그러한 방법에서, 항체를 생산하는 B 세포는 EBV 및 폴리클로날 B 세포 활성화제로 형질전환된다. 세포 성장 및 분화의 추가 자극제는 효율을 추가로 향상시키기 위해 형질전환 단계 동안 선택적으로 첨가될 수 있다. 이러한 자극제는 IL-2 및 IL-15와 같은 사이토카인일 수 있다. 한 측면에서, IL-2 는 불멸화(immortalization)의 효율을 추가로 개선하기 위해 불멸화 단계 동안 첨가되지만, 이의 사용이 필수적인 것은 아니다. 이러한 방법을 사용하여 생성된 불멸화 B 세포는 당업계에 공지된 방법 및 그로부터 분리된 항체를 사용하여 배양될 수 있다.

항체를 생산하는 또 다른 방법은 WO 2010/046775에 기술되어 있다. 이러한 방법에서 형질 세포는 제한된 수로 배양되거나 마이크로웰 배양 플레이트에서 단일 형질 세포로 배양된다. 항체는 형질 세포 배양에서 분리될 수 있다. 또한, 형질 세포 배양물로부터 RNA를 추출할 수 있고 당업계에 공지된 방법을 사용하여 PCR을 수행할 수 있다. 항체의 VH 및 VL 영역은 RT-PCR(역전사 효소 PCR)에 의해 증폭되고, 시퀀싱되고 발현 벡터로 클로닝된 후 HEK293T 세포 또는 다른 숙주 세포로 형질감염될 수 있다. 발현 벡터에서 핵산의 클로닝, 숙주 세포의 형질감염, 형질감염된 숙주 세포의 배양 및 생성된 항체의 분리는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

필요한 경우 여과, 원심분리 및 HPLC 또는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)와 같은 다양한 크로마토그래피 방법을 사용하여 항체를 추가로 정제할 수 있다. 항체(예를 들어, 의약품 등급의 항체를 생산하는 기술을 포함하는 단클론 항체)의 정제 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.

분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 본 설명의 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 원하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 위치 지정 돌연변이 유발 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술을 적절하게 사용할 수 있다.

임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템은 본 발명의 항체 또는 융합 단백질 분자 또는 이의 단편을 인코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들어 대장균 및 기타 미생물 시스템은 Fab 및 F(ab')2 단편, 특히 Fv 단편 및 단일 사슬 항체 단편, 예를 들어 단일 사슬 Fvs와 같은 항체 단편의 발현을 위해 부분적으로 사용될 수 있다. 진핵생물, 예를 들어 포유동물 숙주 세포 발현 시스템은 완전한 항체 분자를 포함하는 보다 큰 항체 분자의 생산에 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 본원에 개시된 예시적인 숙주 세포 및 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 본 개시내용의 항체 분자를 인코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 본 개시내용의 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 항체 분자를 분리하는 것을 포함하는, 본 개시 내용에 따른 항체, 항원-결합 단편 또는 융합 단백질 분자의 생산 방법을 제공한다.

항체 분자 또는 항체 단편은 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드만을 포함할 수 있으며, 이 경우 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드 코딩 서열만이 숙주 세포를 형질감염시키는데 사용될 필요가 있다. 중쇄 및 경쇄 모두를 포함하는 생성물의 생산을 위해, 세포주는 2개의 벡터, 즉 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 벡터로 형질감염될 수 있다. 선택적으로, 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 벡터인 단일 벡터가 사용될 수 있다.

선택적으로, 본 개시내용에 따른 항체, 항원-결합 단편 및 융합 단백질은 (i) 숙주 세포에서 본 개시내용에 따른 핵산 서열을 발현시키는 단계(예를 들어 본 설명에 따른 벡터의 사용에 의함); 및 (ii) 표현된 원하는 제품을 분리하는 단계에 의해 생성될 수 있다. 또한, 상기 방법은 (iii) 분리된 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 형질전환된 B 세포 및 배양된 형질 세포는 원하는 특이성 또는 기능의 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 생산하는 세포에 대해 스크리닝될 수 있다.

스크리닝은 임의의 면역검정, 예를 들어 ELISA, 조직 또는 세포(형질감염된 세포 포함)의 염색, 중화 검정 또는 원하는 특이성 또는 기능을 확인하기 위한 당업계에 공지된 다수의 다른 방법 중 하나에 의해 수행될 수 있다. 분석은 하나 이상의 항원에 대한 단순한 인식을 기반으로 선택하거나, 예를 들어, 항원 결합 항체가 아닌 중화 항체를 선택하기 위해, 신호 캐스케이드, 모양, 성장 속도, 다른 세포에 영향을 미치는 능력, 다른 세포나 다른 시약 또는 조건의 변화에 의한 영향에 대한 반응, 분화 상태 등과 같은 표적 세포의 특성을 변화시킬 수 있는 항체를 선택하기 위해 원하는 기능을 추가로 선택할 수 있다.

이어서 양성 형질전환된 B 세포 배양물로부터 개별 형질전환된 B 세포 클론을 생산할 수 있다. 양성 세포의 혼합물로부터 개별 클론을 분리하기 위한 클로닝 단계는 제한 희석, 미세 조작, 세포 분류에 의한 단일 세포 침착 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

배양된 형질 세포로부터의 핵산은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 HEK293T 세포 또는 다른 공지된 숙주 세포에서 분리, 클로닝 및 발현될 수 있다.

본원에 기술된 불멸화 B 세포 클론 또는 형질감염된 숙주 세포는 다양한 방식으로, 예를 들어 모노클로날 항체의 공급원으로서, 관심 모노클로날 항체를 코딩하는 핵산(DNA 또는 mRNA)의 공급원으로서, 연구 등을 위해 사용될 수 있다.

HBV 단백질 발현 및 전달 시스템의 억제제

본 개시내용은 또한 HBV를 치료하기 위한 조합 요법 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 HBV 단백질 발현의 억제제를 제공하며, 여기서 조합 요법은 본원에 제공된 바와 같은 결합 단백질을 포함한다. 특정 실시예에서, HBV 유전자 발현의 억제제는 RNAi 작용제이다. 본원에 사용된 용어 "RNA 간섭 물질" 또는 "RNAi 물질"은 본원에 정의된 바와 같은 RNA를 함유하고 RNA-유도된 사일런싱 복합체(RISC) 경로를 통해 RNA 전사체의 표적 절단을 매개하는 물질을 의미한다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 RNAi 작용제는 HBV 유전자의 발현을 억제한다.

한 측면에서, RNA 간섭 물질은 표적 RNA의 절단을 지시하기 위해 표적 RNA 서열과 상호작용하는 단일 가닥 RNA를 포함한다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 식물 및 무척추 동물 세포에 도입된 긴 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 다이서(Dicer)로 알려진 유형 III 엔도뉴클레아제에 의해 siRNA로 분해된다(Sharp, et al., Genes Dev. 15:485 (2001)). 리보뉴클레아제-III-유사 효소인 Dicer는 dsRNA를 특징적인 2개의 염기 3' 오버행를 갖는 19-23개의 염기쌍 짧은 간섭 RNA(siRNA)로 처리한다(Bernstein, et al., Nature 409:363 (2001)). 그런 다음 siRNA는 하나 이상의 헬리카제가 siRNA 듀플렉스를 풀고 표적 인식을 유도하는 상보적 안티센스 가닥을 가능하게 하는 RNA-유도된 사일런싱 복합체(RISC)에 통합된다(Nykanen, et al., Cell 107:309 (2001)). 적절한 표적 mRNA에 결합하면, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제가 표적을 절단하여 침묵을 유도한다(Elbashir, et al, Genes Dev. 15:188 (2001)). 따라서, 한 측면에서 본원에 기술된 기술은 RISC 복합체의 형성을 촉진하여 표적 유전자의 침묵을 초래하는 단일 가닥 RNA에 관한 것이다.

"침묵", "발현을 억제하다", "발현을 하향 조절하다", "발현을 억제하다" 등의 용어는 HBV 유전자를 지칭하는 한, 본원에서 HBV 유전자가 전사되고 HBV 유전자 발현의 억제제로 처리되었거나 처리된 첫 번째 세포 또는 세포 그룹에서 분리되거나 검출될 수 있는 HBV mRNA 양의 감소에 의해, 제1 세포 또는 세포군과 실질적으로 동일하지만 그렇게 처리되거나 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포군(대조군 세포)과 비교하여, 적어도 HBV 유전자 발현의 부분적인 감소를 의미한다. 억제 정도는 예를 들어 대조군 세포의 mRNA 발현 정도에서 처리된 세포의 mRNA 발현 정도를 뺀 차이로 측정할 수 있다. 선택적으로, 억제 정도는 HBV 유전자 발현에 기능적으로 연결된 매개변수, 예를 들어, HBV 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 양 또는 특정 표현형(예를 들어, HBV 감염, HBV 단백질 발현(예: B형 간염 표면 항원, HBsAg) 또는 HBV 유전자 발현을 반영하는 세포 유전자 발현의 변화 (예: Smc5/6 발현 및 국소화)와 같은 HBV 감염 표현형)을 나타내는 세포의 수의 감소 측면에서 주어질 수 있다. 억제 정도는 또한 HBV RNA 발현을 반영하는 리포터 유전자를 발현하도록 조작된 세포를 사용하여 측정될 수 있다. 원칙적으로, HBV 유전자 침묵은 HBV 유전자를 발현하는 임의의 세포, 예를 들어 HBV-감염된 세포 또는 HBV 유전자를 발현하도록 조작된 세포에서 임의의 적절한 검정에 의해 결정될 수 있다.

세포 또는 세포군에 의해 발현되는 HBV RNA의 수준, 또는 순환하는 HBV RNA의 수준은 mRNA 발현을 평가하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 국제 출원 공개 번호 WO 2016/077321A1 및 미국 특허 출원 번호 US2017/0349900A1 의 실시예 2 에 제공된 rtPCR 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 이들 방법은 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시예에서, 샘플에서 HBV 유전자(예를 들어, 전체 HBV RNA, HBV 전사체, 예를 들어, HBV 3.5kb 전사체)의 발현 수준은 전사된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 일부, 예를 들어 HBV 유전자의 RNA. RNA는 예를 들어 산 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 추출(RNAzol B; Biogenesis), RNeasy RNA 준비 키트(Qiagen®) 또는 PAXgene(PreAnalytix, 스위스)을 사용하는 것을 포함하는 RNA 추출 기술을 사용하여 세포로부터 추출될 수 있다. 리보핵산 혼성화를 이용하는 전형적인 분석 형식은 핵 실행 분석, RT-PCR, RNase 보호 분석(Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), 노던 블롯팅, 제자리 혼성화 및 마이크로어레이 분석을 포함한다. 순환 HBV mRNA는 국제 출원 공개 번호 WO 2012/177906A1 및 미국 특허 출원 번호 US2014/0275211A1에 설명된 방법을 사용하여 검출할 수 있으며, 이 방법은 본원에 참조로 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "표적 서열"은 1차 전사 산물의 RNA 처리 산물인 mRNA를 포함하여 HBV 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 인접 부분을 의미한다. 서열의 표적 부분은 적어도 그 부분에서 또는 그 근처에서 RNAi-지정된 절단을 위한 기질로서 작용하기에 충분히 길 것이다. 예를 들어, 표적 서열은 일반적으로 9-36개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 15-30개의 뉴클레오티드 길이일 것이며, 사이의 모든 하위 범위를 포함한다. 비제한적 예로서, 표적 서열은 15-30 개의 뉴클레오티드, 15-26 개의 뉴클레오티드, 15-23 개의 뉴클레오티드, 15-22 개의 뉴클레오티드, 15-21 개의 뉴클레오티드, 15- 20 개의 뉴클레오티드, 15-19 개의 뉴클레오티드, 15-18 개의 뉴클레오티드, 15-17 개의 뉴클레오티드, 18-30 개의 뉴클레오티드, 18-26 개의 뉴클레오티드, 18-23 개의 뉴클레오티드, 18-22 개의 뉴클레오티드, 18-21 개의 뉴클레오티드, 18-20 개의 뉴클레오티드, 19-30 개의 뉴클레오티드, 19-26 개의 뉴클레오티드, 19-23 개의 뉴클레오티드, 19-22 개의 뉴클레오티드, 19- 21 개의 뉴클레오티드, 19-20 개의 뉴클레오티드, 20-30 개의 뉴클레오티드, 20-26 개의 뉴클레오티드, 20-25 개의 뉴클레오티드, 20- 24 개의 뉴클레오티드, 20-23 개의 뉴클레오티드, 20-22 개의 뉴클레오티드, 20-21 개의 뉴클레오티드, 21-30 개의 뉴클레오티드, 21-26 개의 뉴클레오티드, 21-25 개의 뉴클레오티드, 21-24 개의 뉴클레오티드, 21-23 개의 뉴클레오티드, 또는 21- 22 개의 뉴클레오티드일 수 있다.

본원에서 사용되는 "서열을 포함하는 가닥"이라는 용어는 표준 뉴클레오티드 명명법을 사용하여 언급된 서열에 의해 기술되는 뉴클레오티드 사슬을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, "상보적인"이라는 용어는 두 번째 뉴클레오티드 서열과 관련하여 첫 번째 뉴클레오티드 서열을 설명하는 데 사용될 때, 당업자가 이해하는 바와 같이, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 특정 조건 하에서 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하여 듀플렉스 구조를 형성하는 능력을 의미한다. 이러한 조건은 예를 들어 엄격한 조건일 수 있으며, 엄격한 조건은 다음을 포함할 수 있다: 400mM NaCl, 40mM PIPES pH 6.4, 1mM EDTA, 50°C 또는 70°C에서 12-16시간 후 세척. 유기체 내부에서 만날 수 있는 생리학적으로 관련된 조건과 같은 다른 조건이 적용될 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드의 궁극적인 적용에 따라 두 서열의 상보성 테스트에 가장 적합한 일련의 조건을 결정할 수 있을 것이다.

RNAi 작용제 내, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 siRNA 내 상보적 서열은 하나 또는 둘 다의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 염기쌍 형성을 포함한다. 이러한 서열은 본 명세서에서 서로에 대해 "완전히 상보적인" 것으로 언급될 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 제1서열이 제2서열과 "실질적으로 상보적인" 것으로 언급되는 경우, 2개의 서열은 완전히 상보적일 수 있거나, 30개 염기쌍까지의 듀플렉스에 대한 혼성화 시 하나 이상을 형성할 수 있지만, 예를 들어, RISC 경로를 통한 유전자 발현의 억제와 같이 궁극적인 적용과 가장 관련이 있는 조건 하에서 혼성화할 수 있는 능력을 유지하면서 일반적으로 5, 4, 3 또는 2개 이하의 불일치 염기쌍을 형성할 수 있다.

그러나 2개의 올리고뉴클레오티드가 혼성화 시 하나 이상의 단일 가닥 오버행를 형성하도록 설계된 경우 이러한 오버행는 상보성 결정과 관련하여 불일치로 간주되지 않는다. 예를 들어, 길이가 21 뉴클레오티드인 하나의 올리고뉴클레오티드와 길이가 23 뉴클레오티드인 또 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 siRNA(더 긴 올리고뉴클레오티드는 더 짧은 올리고뉴클레오티드에 완전히 상보적인 21 뉴클레오티드의 서열을 포함함)는 본원에 설명된 목적을 위해 여전히 "완전히 상보적인" 것으로 언급될 수 있다.

본원에서 사용되는 "상보적" 서열은 또한 비-왓슨-크릭 염기쌍 및/또는 비-천연 및 변형된 뉴클레오티드로부터 형성된 염기쌍을 포함하거나 이들로부터 완전히 형성될 수 있으며, 혼성화 능력과 관련하여 위의 요구 사항이 충족된다. 이러한 비-왓슨-크릭 염기쌍에는 G:U Wobble 또는 Hoogstein 염기쌍이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 "보완적", "완전히 보완적" 및 "실질적으로 보완적"이라는 용어는 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, 또는 RNAi 작용제의 안티센스 가닥과 표적 서열 사이의 염기 매칭과 관련하여 사용될 수 있으며, 이는 이들의 사용 맥락에서 이해될 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 메신저 RNA(mRNA)의 적어도 일부에 대해 "실질적으로 상보적인" 폴리뉴클레오티드는 관심 대상 mRNA(예를 들어, HBV 단백질을 인코딩하는 mRNA)의 인접 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, 서열이 HBV mRNA의 중단되지 않은 부분에 실질적으로 상보적인 경우 폴리뉴클레오티드는 HBV mRNA의 적어도 일부에 상보적이다.

a. siRNAs

일부 실시예에서, RNAi 작용제는 siRNA를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "siRNA"는 2개의 역평행하고 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 혼성화된 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자 또는 분자 복합체를 포함하는 RNAi를 의미하며, 이는 표적 RNA에 대해 "센스" 및 "안티센스" 방향(orientations)을 갖는 것으로 지칭될 것이다. 듀플렉스 영역은 RISC 경로를 통해 원하는 표적 RNA의 특정 분해를 허용하는 임의의 길이일 수 있지만, 전형적으로 길이가 9 내지 36 염기쌍, 예를 들어 15 내지 30 염기쌍 길이일 것이다. 9개와 36개 염기쌍 사이의 듀플렉스를 고려하면, 듀플렉스는 이 범위의 임의의 길이, 예를 들어 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36 및 15-30 개 염기쌍, 15-26 개 염기쌍, 15-23 개 염기쌍, 15-22 개 염기쌍, 15-21 개 염기쌍, 15-20 개 염기쌍, 15-19 개 염기쌍, 15-18 개 염기쌍, 15- 17 개 염기쌍, 18-30 개 염기쌍, 18-26 개 염기쌍, 18-23 개 염기쌍, 18-22 개 염기쌍, 18-21 개 염기쌍, 18-20 개 염기쌍, 19-30 개 염기쌍, 19-26 개 염기쌍, 19-23 개 염기쌍, 19-22 개 염기쌍, 19-21 개 염기쌍, 19-20 개 염기쌍, 20-30 개 염기쌍, 20-26 개 염기쌍, 20-25 개 염기쌍, 20-24 개 염기쌍, 20-23 개 염기쌍, 20-22 개 염기쌍, 20-21 개 염기쌍, 21-30 개 염기쌍, 21-26 개 염기쌍, 21-25 개 염기쌍, 21-24 개 염기쌍, 21-23 개 염기쌍, 및 21-22 개 염기쌍을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그 사이의 임의의 하위 범위일 수 있다. Dicer 및 유사한 효소로 처리하여 세포에서 생성된 siRNA는 일반적으로 길이가 19-22 염기쌍 범위이다. 용어 "이중 가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 또한 본원에서 상기 기술된 바와 같은 siRNA를 지칭하는 것과 동의어로 사용된다.

siRNA의 듀플렉스 영역의 한 가닥은 표적 RNA의 영역에 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥은 적어도 하나의 자기-상보적(self-complementary) 영역을 갖는 단일 RNA 분자로부터 유래될 수 있거나, 2개 이상의 별개의 RNA 분자로부터 형성될 수 있다. 듀플렉스 영역이 단일 분자의 두 가닥으로 형성되는 경우, 분자는 듀플렉스 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오티드의 단일 가닥 사슬(이하 "헤어핀 루프"라 함)에 의해 분리된 듀플렉스 영역을 가질 수 있다. 헤어핀 루프는 적어도 하나의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며; 일부 실시예에서 헤어핀 루프는 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 23개 이상 또는 그 이상의 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. siRNA의 2개의 실질적으로 상보적인 가닥이 별도의 RNA 분자로 구성되는 경우, 이러한 분자는 필요하지 않지만 공유적으로 연결될 수 있다. 두 가닥이 헤어핀 루프 이외의 수단에 의해 공유적으로 연결된 경우 연결 구조를 "링커"라고 한다.

용어 "안티센스 가닥" 또는 "가이드 가닥"은 표적 서열에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 RNAi 작용제, 예를 들어 siRNA의 가닥을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "상보성 영역"은 본원에서 정의된 바와 같은 서열, 예를 들어 표적 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이지 않은 경우, 불일치는 분자의 내부 또는 말단 영역에 있을 수 있다.

일반적으로 가장 용인되는 미스매치는 말단 영역, 예를 들어 5' 및/또는 3' 말단의 5, 4, 3 또는 2개 뉴클레오티드 내에 있다.

본원에 사용된 용어 "센스 가닥(sense strand)" 또는 "패신저 가닥(passenger strand)"은 용어가 본원에 정의된 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 RNAi의 가닥을 의미한다.

또 다른 측면에서, 작용제는 단일 가닥 안티센스 RNA 분자이다. 안티센스 RNA 분자는 표적에 상보적인 15-30개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 안티센스 RNA 분자는 본원에 개시된 안티센스 서열 중 하나로부터 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 서열을 가질 수 있다.

당업자는 용어 "RNA 분자" 또는 "리보핵산 분자"가 자연에서 발현되거나 발견되는 RNA 분자뿐만 아니라 본원에 기술되거나 또는 당업계에 공지된 바와 같이 하나 이상의 리보뉴클레오티드/리보뉴클레오시드 유사체 또는 유도체를 포함하는 RNA의 유사체 및 유도체를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 엄밀히 말하면, "리보뉴클레오시드"는 뉴클레오시드 염기와 리보스 당을 포함하고, "리보뉴클레오티드"는 1개, 2개 또는 3개의 인산염 잔기를 갖는 리보뉴클레오시드이다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오시드" 및 "리보뉴클레오티드"는 본원에서 사용된 것과 동등한 것으로 간주될 수 있다. RNA는 핵염기 구조 또는 리보스-포스페이트 골격 구조에서 변형될 수 있으며, 예를 들어, 아래에서 더 자세히 설명된다. 그러나 리보뉴클레오시드 유사체 또는 유도체를 포함하는 siRNA 분자는 듀플렉스를 형성하는 능력을 유지한다. 비제한적 예로서, RNA 분자는 또한 2'-O-메틸 변형 뉴클레오시드, 5' 포스포로티오에이트 기를 포함하는 뉴클레오시드, 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기에 연결된 말단 뉴클레오시드, 잠긴 뉴클레오시드, 무염기성 뉴클레오시드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오시드, 2'-아미노 변형 뉴클레오시드, 2'-알킬-변형 뉴클레오시드, 모르폴리노 뉴클레오시드, 포스포르아미데이트, 또는 뉴클레오시드를 포함하는 비천연 염기, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 변형된 리보뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 선택적으로, RNA 분자는 siRNA 분자의 전체 길이까지 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 또는 그 이상의 변형된 리보뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 변형은 RNA 분자에서 이러한 복수의 변형된 리보뉴클레오시드 각각에 대해 동일할 필요는 없다. 일부 실시예에서, 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용하기 위해 고려되는 변형된 RNA는 필요한 듀플렉스 구조를 형성하는 능력을 갖고 RISC 경로를 통해 표적 RNA의 특정 분해를 허용하거나 매개하는 펩티드 핵산(PNA)이다.

일부 실시예에서, 변형된 리보뉴클레오시드는 데옥시리보뉴클레오시드를 포함한다. 예를 들어, RNAi 작용제는 데옥시뉴클레오시드 오버행(들)을 포함하는 하나 이상의 데옥시뉴클레오시드, 또는 siRNA의 이중 가닥 부분 내의 하나 이상의 데옥시뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "RNAi 작용제"는 완전한 DNA 분자를 포함하지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드 오버행"은 RNAi 작용제, 예를 들어 siRNA의 듀플렉스 구조로부터 돌출하는 적어도 하나의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, siRNA의 한 가닥의 3'-말단이 다른 가닥의 5'-말단을 넘어 확장되거나 그 반대인 경우 뉴클레오티드 오버행가 있다. siRNA는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 오버행를 포함할 수 있으며; 선택적으로 오버행는 적어도 2개의 뉴클레오티드, 적어도 3개의 뉴클레오티드, 적어도 4개의 뉴클레오티드, 적어도 5개의 뉴클레오티드, 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 오버행는 데옥시뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 이들의 조합에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오티드(들)는 siRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5' 말단, 3' 말단 또는 양쪽 말단에 존재할 수 있다.

일부 실시예에서, siRNA의 안티센스 가닥은 3' 말단 및/또는 5' 말단에 1-10개의 뉴클레오티드 오버행를 갖는다. 일부 실시예에서, siRNA의 센스 가닥은 3' 말단 및/또는 5' 말단에 1-10개의 뉴클레오티드 오버행를 갖는다. 일부 다른 실시예에서, 오버행 내의 하나 이상의 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 티오포스페이트(nucleoside thiophosphate)로 대체된다.

일부 실시예에서, siRNA의 적어도 하나의 말단은 1 내지 4개, 일반적으로 1 또는 2개의 뉴클레오티드의 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 적어도 하나의 뉴클레오티드 오버행을 갖는 siRNA는 블런트-말단 대응물(blunt-ended counterparts)에 비해 예상외로 우수한 억제 특성을 가질 수 있다.

siRNA와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "블런트(blunt)" 또는 "블런트 말단"은 siRNA의 주어진 말단 말단에 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 없다는 것, 즉 뉴클레오티드 오버행이 없음을 의미한다. siRNA의 한쪽 또는 양쪽 끝은 블런트일 수 있다. siRNA의 양 말단이 평활한 경우, siRNA는 "블런트 말단"이라고 한다. "블런트 말단" siRNA는 양 말단이 평활한, 즉 분자의 양 말단에 뉴클레오티드 오버행이 없는 siRNA이다. 대부분의 경우 그러한 분자는 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥이 될 것이다.

특정 실시예에서, 본원에 기재된 병용 요법은 HBV 유전자의 발현을 억제하는 하나 이상의 RNAi 작용제를 포함한다. 일부 실시예에서, RNAi 작용제는 포유동물(예를 들어, HBV에 감염된 인간)에서 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 짧은 간섭 리보핵산(siRNA) 분자를 포함하고, 여기서 siRNA는 HBV 유전자의 발현에서 형성된 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 상보성 영역을 갖는 안티센스 가닥을 포함하고, 그리고 여기서 상보성 영역은 길이가 30개 뉴클레오티드 이하(일반적으로 길이가 19-24개 뉴클레오티드)이고, 그리고 여기서 siRNA는 HBV 유전자를 발현하는 세포와 접촉시, 예를 들어 PCR 또는 분지형 DNA(bDNA) 기반 방법, 또는 웨스턴 블롯과 같은 단백질 기반 방법에 의해 검정할 때 HBV 유전자의 발현을 적어도 10% 억제한다. 세포 배양에서 HBV 유전자의 발현 또는 HBV 유전자 발현(예: Smc5/6)에 대한 대용으로서 COS 세포, HeLa 세포, 1차 간세포, HepG2 세포, 1차 배양 세포 또는 피험자의 생물학적 샘플과 같은 세포 유전자의 발현은 bDNA 또는 TaqMan 분석과 같은 HBV mRNA 수준을 측정하거나 예를 들어 Western Blotting 또는 유세포 분석 기술을 사용하여 면역형광 분석과 같은 단백질 수준을 측정하여 분석할 수 있다.

siRNA는 siRNA가 사용될 조건 하에서 듀플렉스 구조를 형성하기 위해 상보적이고 혼성화되는 두 개의 RNA 가닥을 포함한다. siRNA의 한 가닥(안티센스 가닥)은 표적 서열에 실질적으로 상보적이고 일반적으로 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 표적 서열은 HBV 유전자의 발현 동안 형성된 mRNA의 서열로부터 유래될 수 있다. 다른 가닥(센스 가닥)은 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하여 두 가닥이 혼성화되어 적절한 조건에서 결합될 때 듀플렉스 구조를 형성한다. 일반적으로, 듀플렉스 구조는 15개 내지 30개 포함, 보다 일반적으로 18개 내지 25개 포함, 보다 더 일반적으로 19개 내지 24개 포함, 가장 일반적으로 19개 내지 21개 포함하는 염기쌍이다. 유사하게, 표적 서열에 대한 상보성 영역은 15개 내지 30개 포함, 더 일반적으로 18개 내지 25개 포함, 보다 더 일반적으로 19개 내지 24개 포함, 가장 일반적으로 19개 내지 21개 포함 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시예에서, siRNA는 길이가 15 내지 20개 뉴클레오티드이고, 다른 실시예에서, siRNA는 길이가 25 내지 30개 뉴클레오티드이다. 통상의 기술자가 인식하는 바와 같이, 절단을 위한 표적화된 RNA의 표적화된 영역은 종종 더 큰 RNA 분자, 종종 mRNA 분자의 일부일 것이다. 관련된 경우, mRNA 표적의 "일부"는 RNAi-지시 절단(RNAi-directed cleavage) (즉, RISC 경로를 통한 절단)을 위한 기질이 되기에 충분한 길이의 mRNA 표적의 연속 서열이다. 9개 염기쌍 만큼 짧은 듀플렉스를 갖는 siRNA는 일부 상황에서 RNAi-지시 RNA 절단을 매개할 수 있다. 대부분의 표적은 길이가 적어도 15개 뉴클레오티드일 것이다. 특정 실시예에서, 표적은 길이가 15-30개 뉴클레오티드이다.

당업자는 또한 듀플렉스 영역이 siRNA의 주요 기능적 부분, 예를 들어 9 내지 36개, 예를 들어 15-30개 염기쌍의 듀플렉스 영역임을 인지할 것이다. 따라서, 일부 실시예에서, 절단을 위해 원하는 RNA를 표적화하는 예를 들어 15-30개 염기쌍의 기능적 듀플렉스로 처리되는 정도까지, 30개 염기쌍 초과의 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자 또는 RNA 분자의 복합체는 siRNA이다. 따라서, 통상의 기술자는 일부 실시예에서 miRNA가 siRNA라는 것을 인지할 것이다. 일부 다른 실시예에서, siRNA는 천연 발생 miRNA가 아니다. 일부 실시예에서, HBV 유전자의 표적 발현에 유용한 RNAi 작용제는 더 큰 이중 가닥 RNA의 절단에 의해 표적 세포에서 생성되지 않는다.

본원에 기재된 바와 같은 siRNA는 예를 들어 시판되는 자동화 DNA 합성기(예: Biosearch, Applied Biosystems, Inc.)를 사용하여 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 합성할 수 있다.

일부 실시예에서, RNAi 작용제는 HBV mRNA의 발현을 표적화하고 억제하는 siRNA를 포함한다. 일부 실시예에서, RNAi 작용제는 NCBI 참조 서열 NC_003977.2(GenBank 접근 번호 GI:21326584)(서열번호 116)에 따라 HBV 게놈에 의해 인코딩된 mRNA를 표적으로 하고 그 발현을 억제하는 siRNA를 포함한다. HBV 게놈의 전사는 폴리시스트론(polycistronic), 중복 RNA를 생성하고, 따라서 일부 실시예에서 단일 HBV 유전자를 표적으로 하는 병용 요법의 siRNA는 대부분 또는 모든 HBV 전사체의 발현을 상당히 억제할 수 있다. 일부 실시예에서 siRNA의 mRNA 표적은 P 유전자, NC_003977.1의 뉴클레오티드 2309-3182 및 1-1625; S 유전자(L, M 및 S 단백질 인코딩), NC_003977의 뉴클레오티드 2850-3182 및 1-837; X 단백질, NC_003977의 뉴클레오티드 1376-1840; 및/또는C 유전자, NC_003977의 뉴클레오티드 1816-2454에 의해 인코딩되는 mRNA일 수 있다.

일부 실시예에서, siRNA는 HBV의 X 유전자에 의해 인코딩되는 mRNA를 표적화하고 발현을 억제한다. 일부 실시예에서, RNAi 작용제 또는 siRNA는 NC_003977.2(GenBank 접근 번호GI:21326584)(서열번호 116)의 뉴클레오티드 1579-1597에 해당하는 서열 GTGTGCACTTCGCTTCAC (서열번호117)을 포함하는 HBV 게놈의 일부에 의해 인코딩되는 mRNA를 표적으로 한다.

또 다른 실시예에서, siRNA는 5'-GUUGUGCACUUCGCUUCACA-3'(서열번호 118)을 포함하는 센스 가닥 및 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(서열번호 119)를 포함하는 안티센스 가닥을 갖는다.

특정 실시예에서, HBV 유전자 발현의 억제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA를 포함하고, 여기서 센스(sense) 가닥은 서열번호 118, 또는 서열번호 118과 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 포함하고; 그리고 여기서 안티센스(antisense) 가닥은 서열번호 119, 또는 서열번호 119와 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 포함한다.

한 측면에서, siRNA는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열, 즉 센스 및 안티센스 서열을 포함할 것이며, 여기서 센스 서열은 서열번호 118을 포함하고 상응하는 안티센스 서열은 서열번호 119를 포함한다. 이 측면에서, 2개의 서열 중 하나는 2개의 서열 중 다른 하나에 대해 상보적이며, 서열 중 하나는 HBV 유전자의 발현에서 생성된 mRNA의 서열에 실질적으로 상보적이다. 이와 같이, 이 측면에서, siRNA는 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이며, 여기서 하나의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥으로 기술되고, 제2 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥으로 기술된다. 본원의 다른 곳에서 기술되고 당업계에 공지된 바와 같이, siRNA의 상보적 서열은 또한 별도의 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 것과는 대조적으로 단일 핵산 분자의 자기-상보적(self-complementary) 영역으로서 포함될 수 있다.

또 다른 실시예에서, siRNA는 5'-GGUGGACUUCUCUCCAAUUUUA-3'(서열번호 120)을 포함하는 센스 가닥 및 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(서열번호 121)를 포함하는 안티센스 가닥을 갖는다.

특정 실시예에서, HBV 유전자 발현의 억제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA를 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열번호 120, 또는 서열번호 120과 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 포함하고; 그리고 여기서 안티센스 가닥은 서열번호 121, 또는 서열번호 121과 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 포함한다.

한 측면에서, siRNA는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열, 즉 센스 및 안티센스 서열을 포함할 것이며, 여기서 센스 서열은 서열번호 120을 포함하고 상응하는 안티센스 서열은 서열번호 121을 포함한다. 이 측면에서, 2개의 서열 중 하나는 2개의 서열 중 다른 하나에 대해 상보적이며, 서열 중 하나는 HBV 유전자의 발현에서 생성된 mRNA의 서열에 실질적으로 상보적이다. 이와 같이, 이 측면에서, siRNA는 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이며, 여기서 하나의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥으로 기술되고, 제2 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥으로 기술된다. 본원의 다른 곳에서 기술되고 당업계에 공지된 바와 같이, siRNA의 상보적 서열은 또한 별도의 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 것과는 대조적으로 단일 핵산 분자의 자기-상보적(self-complementary) 영역으로서 포함될 수 있다.

당업자는 20개 내지 23개 사이, 특히 21개 염기쌍의 듀플렉스 구조를 갖는 siRNA가 RNA 간섭을 유도하는 데 특히 효과적이라는 것을 잘 알고 있다(Elbashir, et al., EMBO 20:6877-88 (2001)). 그러나 다른 사람들은 더 짧거나 더 긴 RNA 듀플렉스 구조도 효과적일 수 있음을 발견했다. 상기 기재된 실시예에서, 본원에 기재된 siRNA는 최소 21개 뉴클레오티드 길이의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 또는 서열번호 121 의 서열 중 하나에서 한쪽 또는 양쪽 말단에 단지 몇 개의 뉴클레오티드를 뺀 더 짧은 듀플렉스는 상기 기술된 siRNA와 비교하여 유사하게 효과적이다. 따라서, 서열번호 118 및 서열번호 119 중 하나 또는 둘 다로부터 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드의 부분 서열을 갖고, 전체 서열을 포함하는 siRNA로부터 5, 10, 15, 20, 25 또는 30% 이하로 억제함으로써 HBV 유전자의 발현을 억제하는 능력이 다른 siRNA 가 본원에 설명된 기술에 따라 고려된다. 또한, 본원에 개시된 내용은 서열번호 120및 서열번호 121 중 하나 또는 둘 다로부터 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드의 부분 서열을 갖고, 전체 서열을 포함하는 siRNA로부터 5, 10, 15, 20, 25 또는 30% 이하로 억제함으로써 HBV 유전자의 발현을 억제하는 능력이 다른 siRNA 가 본원에 설명된 기술에 따라 고려된다.

또한, 본원에서 제공되는 siRNA는 RISC-매개 절단에 민감한 HBV 유전자 전사체 내의 부위를 식별한다. 이와 같이, 본 명세서에 개시된 기술은 그러한 서열 중 하나 내에서 표적화하는 RNAi 작용제를 추가로 특징으로 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, RNAi 작용제는 RNAi가 특정 부위 내의 어디에서나 전사체의 절단을 촉진하는 경우 RNA 전사체의 특정 부위 내에서 표적화한다고 한다. 일부 실시예에서, RNAi 작용제는 서열번호 118 및 서열번호 119의 서열 중 하나 또는 둘 다로부터의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, HBV 유전자에서 선택된 서열에 인접한 영역으로부터 취해진 추가 뉴클레오티드 서열에 결합된다. 일부 실시예에서, RNAi 작용제는 서열번호 120 및 서열번호 121의 서열 중 하나 또는 둘 모두로부터의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 이는 HBV 유전자에서 선택된 서열에 인접한 영역으로부터 취해진 추가 뉴클레오티드 서열에 결합된다.

표적 서열은 일반적으로 길이가 15-30개 뉴클레오티드이지만, 임의의 주어진 표적 RNA의 절단을 지시하기 위한 이 범위의 특정 서열의 적합성에 있어서 광범위한 변이가 있다. 여기에 제시된 다양한 소프트웨어 패키지 및 가이드라인은 주어진 유전자 표적에 대한 최적의 표적 서열을 식별하기 위한 지침을 제공하지만, 주어진 크기(비제한적인 예로서, 21개 뉴클레오티드)의 "윈도우" 또는 "마스크"가 문자 그대로 또는 비유적으로(예를 들어, in silico 포함) 표적 RNA 서열에 배치되어 표적 서열로 작용할 수 있는 크기 범위에서 서열을 식별하는 경험적 접근법도 취해질 수 있다. 시퀀스 "창"을 점진적으로 초기 표적 서열 위치의 하나의 뉴클레오티드 상류 또는 하류로 이동시킴으로써, 선택된 임의의 주어진 표적 크기에 대해 가능한 서열의 전체 세트가 식별될 때까지 다음 잠재적 표적 서열을 식별할 수 있다. 최적으로 수행하는 서열을 확인하기 위해 확인된 서열의 체계적인 합성 및 시험(본 명세서에 기재된 바와 같은 또는 당업계에 공지된 바와 같은 분석법 사용)과 결합된 이 과정은 RNAi 제제로 표적화될 때 표적 유전자 발현의 최상의 억제를 매개하는 RNA 서열을 확인할 수 있다. 억제 효율의 추가 최적화는 동일하거나 더 나은 억제 특성을 갖는 서열을 확인하기 위해 주어진 서열의 하나의 뉴클레오티드 업스트림 또는 다운스트림을 점진적으로 "윈도우를 걸음(walking the window)"으로써 달성될 수 있음이 고려된다.

또한, 식별된 임의의 서열(예를 들어 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120 또는 서열번호 121)에 대해, 더 길거나 더 짧은 서열을 생성하기 위해 뉴클레오티드를 체계적으로 추가하거나 제거하고 해당 지점에서 표적 RNA를 위 또는 아래로 더 길거나 더 짧은 크기의 창을 걸어(walking a window) 생성된 서열을 테스트함으로써 추가 최적화를 달성할 수 있다. 다시, 당업계에 공지된 바와 같이 또는 본원에 기술된 바와 같은 억제 검정에서 이들 표적 서열에 기초한 RNAi 제제의 유효성에 대한 시험과 새로운 후보 표적을 생성하는 이러한 접근 방식을 결합하면 억제 효율을 추가로 개선할 수 있다. 또한, 이러한 최적화된 서열은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 바와 같은 변형된 뉴클레오티드의 도입, 오버행의 추가 또는 변경, 또는 당업계에 공지되고/되거나 본원에서 논의된 바와 같은 기타 변형에 의해 발현 억제제로서의 분자를 더 최적화(예: 혈청 안정성 또는 순환 반감기 증가, 열 안정성 증가, 막횡단 전달 향상, 특정 위치 또는 세포 유형에 대한 표적화, 침묵 경로 효소와의 상호작용 증가, 엔도솜으로부터의 방출 증가 등)함으로써 조절될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 RNAi 작용제는 표적 서열에 대한 하나 이상의 미스매치를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 RNAi 작용제는 3개 이하의 미스매치를 포함한다. 일부 실시예에서, RNAi 작용제의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 포함하는 경우, 미스매치 영역은 상보성 영역의 중앙에 위치하지 않는다. 특정 실시예에서, RNAi 작용제의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 포함하는 경우, 미스매치는 상보성 영역의 5' 또는 3' 말단으로부터 마지막 5개 뉴클레오티드 이내로 제한된다. 예를 들어, HBV 유전자의 영역에 상보적인 23개 뉴클레오티드 RNAi 제제 RNA 가닥의 경우, RNA 가닥은 중앙 13개 뉴클레오티드 내에 어떠한 불일치도 포함하지 않을 수 있다. 본원에 기술된 방법 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 표적 서열에 대한 미스매치를 함유하는 RNAi 작용제가 HBV 유전자의 발현을 억제하는데 효과적인지 여부를 결정할 수 있다. HBV 유전자의 발현을 억제하는 불일치가 있는 RNAi 제제의 효능을 고려하는 것이 중요하며, 특히 HBV 유전자의 특정 상보성 영역이 다형성(polymorphic) 서열 변이를 갖는 것으로 알려진 경우에 중요하다.

b. 화학적으로 변형된 RNAi 작용제

일부 실시예에서, RNAi 작용제의 RNA, 예를 들어 siRNA는 화학적으로 변형되어 안정성 또는 다른 유익한 특성을 향상시킨다. 본 명세서에 기술된 기술에 특징이 있는 핵산은 "핵산 화학의 현재 프로토콜," Beaucage, S.L., et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA 에 기술된 것과 같이 당업계에 널리 확립된 방법에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있다. 이들 방법은 본원에 참조로 포함된다.

변형은 예를 들어 다음이 포함된다: (a) 말단 변형, 예를 들어, 5' 말단 변형(인산화, 컨쥬게이션, 역 연결 등), 3' 말단 변형(컨쥬게이션, DNA 뉴클레오티드, 역 연결 등), (b) 염기 변형, 예를 들어 안정화 염기, 불안정화 염기 또는 파트너의 확장된 레퍼토리와 염기쌍을 이루는 염기로의 교체, 염기(무염기성 뉴클레오티드) 또는 접합 염기의 제거, (c) 당 변형(예: 2' 위치 또는 4' 위치) 또는 당의 교체, 뿐만 아니라 (d) 포스포디에스테르 결합의 변형 또는 교체를 포함하는 골격 변형. 본원에 기재된 실시예에서 유용한 RNA 화합물의 특정 예는 변형된 골격을 함유하거나 천연 뉴클레오시드간 결합을 함유하지 않는 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 변형된 골격을 갖는 RNA는 무엇보다도 골격에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해, 그리고 당업계에서 때때로 언급되는 바와 같이, 그들의 뉴클레오시드 골격에 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA는 또한 올리고뉴클레오시드로 간주될 수 있다. 특정 실시예에서, 변형된 RNA는 그것의 뉴클레오시드간 골격에 인 원자를 가질 것이다.

주어진 화합물의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며 실제로 앞서 언급한 변형 중 하나 이상이 단일 화합물 또는 심지어 RNAi 작용제 내의 단일 뉴클레오시드에 통합될 수 있다. 본 명세서에 기재된 기술은 또한 키메라 화합물인 RNAi 작용제 화합물을 포함한다. 본 발명의 맥락에서 "키메라" RNAi 작용제 화합물 또는 "키메라"는 siRNA와 같은 RNAi 작용제 화합물이며, 각각은 적어도 하나의 단량체 단위(즉, siRNA 화합물의 경우 뉴클레오티드)로 구성된 2개 이상의 화학적으로 구별되는 영역을 함유한다. 이들 RNAi 제제는 전형적으로 적어도 하나의 영역을 포함하며, 여기서 RNA는 RNAi 제제에 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 저항성, 증가된 세포 흡수 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성을 부여하도록 변형된다. RNAi 작용제의 추가 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 혼성화를 절단할 수 있는 효소의 기질 역할을 할 수 있다. 예를 들어, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다. 따라서 RNase H의 활성화는 RNA 표적의 절단을 초래하여 RNAi 제제의 유전자 발현 억제 효율을 크게 향상시킨다. 결과적으로, 동일한 표적 영역에 혼성화하는 포스포로티오에이트 데옥시(phosphorothioate deoxy) siRNA와 비교하여 키메라 siRNA를 사용할 때 더 짧은 RNAi 제제로 유사한 결과를 종종 얻을 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동 및 필요한 경우 당업계에 공지된 관련 핵산 혼성화 기술에 의해 일상적으로 검출될 수 있다.

변형된 RNA 골격은 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 이들의 극성이 반전된 것을 포함하며, 여기서 인접한 쌍의 뉴클레오시드 단위는 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리산 형태도 포함된다.

상기 인-함유 결합의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6, 239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; 및 미국 특허 RE39464; 이들 각각은 본 명세서에 참조로 포함된다.

내부에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 RNA 골격은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성되는 골격을 갖는다. 여기에는 모르폴리노 연결(뉴클레오시드의 당 부분에서 부분적으로 형성됨)을 갖는 것들이 포함된다; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 술포네이트 및 술폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 N, O, S 및 CH2 성분 부분이 혼합된 기타.

상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; and, 5,677,439; 이들 각각은 그러한 제조 방법과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된다.

다른 실시예에서, 당 및 뉴클레오시드간 결합, 즉, 뉴클레오티드 단위의 골격 둘 모두가 새로운 그룹으로 대체되는 RNAi 제제에 사용하기 위해 적합한 적합한 RNA 모방체가 고려된다. 기본 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 RNA 모방체인 그러한 올리고머 화합물 중 하나는 펩티드 핵산(PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서 RNA의 당 골격은 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격으로 대체된다. 핵염기는 유지되고 골격의 아미드 부분의 아자(aza) 질소 원자에 직간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 다음이 포함되지만 이에 제한되지 않는다: 미국 특허 번호 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262; 각각은 이러한 제조 방법과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된다. PNA 화합물에 대한 추가 교시는 예를 들어 Nielsen, et al. (Science, 254:1497- 1500 (1991))에서 찾을 수 있다.

본 명세서에 기술된 기술에 특징적인 일부 실시예는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 골격을 갖는 RNA 및 헤테로원자 골격을 갖는 올리고뉴클레오시드를 포함하며, 특히 미국 특허 번호 5,489,677의 -CH₂-NH-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 알려짐], -CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-, 및 -N(CH₃)-CH₂-CH₂- [여기서 천연 포스포디에스테르 골격은 -O-P-O-CH₂- 로 표시됨], 및 미국 특허 번호 5,602,240의 아미드 골격. 일부 실시예에서, 본 명세서에서 특징으로 하는 RNA는 미국 특허 번호 5,034,506의 모르폴리노(morpholino) 골격 구조를 갖는다.

변형된 RNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 본원에서 특징으로 하는 RNAi 작용제, 예를 들어 siRNA는 2' 위치에 다음 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-alkyl; O-, S-, 또는 N-alkenyl; O-, S- 또는 N-alkynyl; 또는 O-alkyl-O-alkyl; 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 비치환된 C₁ 내지 C₁₀ 알킬 또는 C₂　내지 C₁₀ 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적합한 변형은 O[(CH₂)_nO]　_mCH₃, O(CH₂)._nOCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)　_nCH₃, O(CH₂)_nONH₂, 및 O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂를 포함하며, 여기서 n과 m은 1에서 약 10 사이다. 다른 실시예에서, siRNA는 2' 위치에서 다음 중 하나를 포함한다: C₁ 내지 C₁₀ 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH₃, OCN, CI, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터 그룹, 인터칼레이터, RNAi 제제의 약동학적 특성을 개선하기 위한 그룹, 또는 RNAi 제제의 약력학적 특성을 개선하기 위한 그룹 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기. 일부 실시예에서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'- O-CH₂CH₂OCH₃, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE라고도 함) (Martin, et al., Helv. Chim. Acta 78:486-504 (1995)), 즉, 알콕시-알콕시기를 포함한다. 다른 예시적인 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 2'-DMAOE로도 알려진 O(CH₂)₂ON(CH₃)₂기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(2*-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2*-DMAEOE로도 당업계에 알려짐), 즉 2^*-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₂)₂ 이다.

다른 예시적인 변형은 2'-메톡시(2'- OCH₃), 2'-아미노프로폭시(2- OCH₂CH₂CH₂NH₂) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. RNAi 제제의 RNA 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치 또는 2'-5' 연결된 siRNA 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서도 유사한 변형이 이루어질 수 있다. RNAi 작용제는 또한 펜토푸라노실(pentofuranosyl) 당 대신에 시클로부틸(cyclobutyl) 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수 있다.

이러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 미국 특허 번호 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 및 5,700,920; 각각은 이러한 제조 방법과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된다.

RNAi 작용제는 또한 핵염기(종종 당업계에서 간단히 "염기"라고 함) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "변형되지 않은" 또는 "천연" 핵염기에는 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G)과 피리미딘 염기인 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)이 포함된다. 변형된 핵염기는 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4 -티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-다아자아데닌, 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가의 핵염기는 미국 특허 번호 3,687,808에 개시된 것들, 생화학, 생명공학 및 의학에서의 변형된 뉴클레오시드(Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, (2008))에 개시된 것들; 고분자 과학 및 공학의 간결한 백과사전(pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons (1990))에 개시된 것들, Englisch et al. (Angewandte Chemie, 국제판, 30, 613 (1991))에 개시된 것들, 및Sanghvi, Y S. (Chapter 15, dsRNA 연구 및 응용, pages 289-302, Crooke, S. T. 및 Lebleu, B., Ed., CRC Press (1993))에 개시된 것들을 포함한다. 이들 핵염기 중 특정은 본원에 기재된 기술에서 특징으로 하는 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 여기에는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하여 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환 퓨린이 포함된다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 나타났으며(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. 및 Lebleu, B., Eds., dsRNA 연구 및 응용, CRC Press, Boca Raton, pp. 276-278 (1993)), 더욱 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 때 예시적인 염기 치환이다.

상기 언급된 특정 변형된 핵염기 뿐만 아니라 다른 변형된 핵염기의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 미국 특허 번호 3,687,808; 미국 특허 번호 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; 및 7,495,088; 각각은 이러한 제조 방법과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된다.

RNAi 작용제의 RNA는 또한 하나 이상의 잠긴(locked) 핵산(LNA)을 포함하도록 변형될 수 있다. 잠긴 핵산은 리보스 부분이 2' 및 4' 탄소를 연결하는 여분의 다리를 포함하는 변형된 리보스 부분을 갖는 뉴클레오티드이다. 이 구조는 3'-엔도 구조 형태에서 리보스를 효과적으로 "고정(locks)"한다. 잠긴 핵산을 siRNA에 추가하면 혈청에서 siRNA 안정성이 증가하고 비표적 효과가 감소하는 것으로 나타났다(Elmen, J., et al., 핵산 연구 33(l):439-47 (2005); Mook, O.R., et al., Mol Cane Ther 6(3):833-43 (2007); Grunweller, A., et al, 핵산 연구 31(12):3185-93 (2003)).

잠긴 핵산 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 다음이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다: 미국 특허 번호 6,268,490;

6,670,461; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,084,125; 및 7,399,845; 각각은 이러한 제조 방법과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된다.

특정 실시예에서, 병용 요법은 하나 이상의 아데노신-글리콜 핵산("GNA")을 포함하도록 변형된 siRNA를 포함한다. 아데노신-GNA에 대한 설명은 예를 들어 Zhang, et al. (JACS　127(12):4174-75 (2005))에서 찾을 수 있다.

일부 실시예에서, 본 개시내용은 RNAi가 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA인 방법 및 관련 조성물을 제공한다. 본원에서 사용된 변형된 핵산 서열의 뉴클레오티드 단량체에 대한 약어는 표 5에 제시되어 있다.

변형된 핵산 서열 표시에 사용되는 뉴클레오티드 단량체의 약어. 달리 나타내지 않는 한, 이들 단량체는 올리고뉴클레오티드에 존재할 때 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 상호 연결되는 것으로 이해될 것이다

약어	뉴클레오티드(들)
A	아데노신-3'-포스페이트
Af	2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트
Afs	2'-플루오로아데노신-3'-포스포로티오에이트
As	아데노신-3'-포스포로티오에이트
C	시티딘-3'-포스페이트
Cf	2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트
Cfs	2'-플루오로시티딘-3'-포스포로티오에이트
Cs	시티딘-3'-포스포로티오에이트
G	구아노신-3'-포스페이트
Gf	2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트
Gfs	2'-플루오로구아노신-3'-포스포로티오에이트
Gs	구아노신-3'-포스포로티오에이트
T	5'-메틸우리딘-3'-포스페이트
Tf	2'-플루오로-5-메틸우리딘-3'-포스페이트
Tfs	2'-플루오로-5-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
Ts	5-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
U	우리딘-3'-포스페이트
Uf	2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트
Ufs	2'-플루오로우리딘 -3'-포스포로티오에이트
Us	우리딘 -3'-포스포로티오에이트
a	2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트
as	2'-O-메틸아데노신-3'- 포스포로티오에이트
c	2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트
cs	2'-O-메틸시티딘-3'- 포스포로티오에이트
g	2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트
gs	2'-O-메틸구아노신-3'- 포스포로티오에이트
t	2'-O-메틸-5-메틸우리딘-3'-포스페이트
ts	2'-O-메틸-5-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
u	2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트
us	2'-O-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
s	포스포로티오에이트 결합
L96	N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤리놀("Hyp-(GalNAc-알킬)3"이라고도 함)
(Agn)	아데노신-글리콜 핵산 (GNA)
dA	2'-데옥시아데노신-3'-포스페이트
dAs	2'-데옥시아데노신-3'-포스포로티오에이트
dC	2'-데옥시시티딘-3'-포스페이트
dCs	2'-데옥시시티딘-3'-포스포로티오에이트
dG	2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트
dGs	2'-데옥시구아노신-3'-포스포로티오에이트
dT	2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트
dTs	2'-데옥시티미딘-3'-포스포로티오에이트
dU	2'-데옥시우리딘
dUs	2'-데옥시우리딘-3'-포스포로티오에이트

일부 실시예에서, HBV 유전자 발현의 억제제는 siRNA를 포함하고, 여기서 siRNA는 5'- gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96 -3' (서열번호 122)를 포함하는 센스 가닥 및 5'- usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu -3' (서열번호 123)를 포함하는 안티센스 가닥을 갖는다. 또 다른 실시예에서, siRNA는 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (서열번호 124)를 포함하는 센스 가닥 및 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열번호 125)를 포함하는 안티센스 가닥을 갖는다.

특정 실시예에서, HBV 유전자 발현의 억제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA를 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열번호 122 또는 서열번호 124, 또는 각각 서열번호 122 또는 서열번호 124와 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 포함한다.

특정 실시예에서, HBV 유전자 발현의 억제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA를 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 서열번호 123 또는 서열번호 125, 또는 각각 서열번호 123 또는 서열번호 125와 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 포함한다.

일부 실시예에서, HBV 유전자 발현의 억제제는 siRNA를 포함하고, 여기서 siRNA는 5'-gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuuaL96-3' (서열번호 126)을 포함하는 센스 가닥 및 5'-usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc-3' (서열번호 127)을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는다.

특정 실시예에서, HBV 유전자 발현의 억제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA를 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열번호 126, 또는 서열번호 126과 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 뉴클레오티드가 다른 서열을 포함한다.

c. 리간드 결합 RNAi 작용제

일부 실시예에서, RNAi 제제는 RNAi 제제의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 리간드, 모이어티 또는 접합체를 RNA에 화학적으로 연결하는 것과 관련된 변형을 포함한다. 이러한 모이어티는 다음과 같은 지질 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 콜레스테롤 모이어티(Letsinger, et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA 86:6553-56 (1989)), 콜산(Manoharan, et al., Biorg. Med. Chem. Let. 4:1053-60) (1994)), 티오에테르, 예를 들어 베릴-S-트리틸티올(Manoharan, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:306-9 (1992); Manoharan, et al., Biorg. Med. Chem. Let. 3:2765-70 (1993)), 티오콜레스테롤(Oberhauser, et al., Nucl. Acids Res. 20:533-38 (1992)), 지방족 사슬, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras, et al., EMBO J 10:1111-18 (1991); Kabanov, et al., FEBS Lett. 259:327-30 (1990); Svinarchuk, et al., Biochimie 75:49-54 (1993)), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트(Manoharan, et al., Tetrahedron Lett. 36:3651-54(Manoharan, et al., Tetrahedron Lett. 36:3651-54) 1995); Shea, et al., Nucl. Acids Res. 18:3777-83 (1990)), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan, et al., Nucleosides & Nucleotides 14:969-73 (1995)), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan, et al., Tetrahedron Lett. 36:36) 51-54 (1995)), 팔미틸 잔기(Mishra, et al., Biochim. Biophys. Acta 1264:229-37 (1995)), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:923-37 (1996)).

일부 실시예에서, 리간드는 그것이 통합되는 RNAi 제제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경한다. 일부 실시예에서, 리간드는 선택된 표적, 예를 들어 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들어 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체의 영역에 대해 예를 들어 그러한 리간드가 없는 종과 비교하여 향상된 친화성을 제공한다. 이러한 실시예에서, 리간드는 듀플렉스 핵산에서 듀플렉스 페어링에 참여하지 않을 것이다.

리간드는 다음과 같은 자연 발생 물질을 포함할 수 있다: 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지단백질(LDL) 또는 글로불린); 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산); 또는 지질. 리간드는 또한 합성 중합체, 예를 들어 합성 폴리아미노산과 같은 재조합 또는 합성 분자일 수 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리아미노산이 폴리라이신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락티드-코-글리콜화) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체 또는 폴리포스파진인 것을 포함한다. 폴리아민의 예는 다음과 같다: 폴리에틸렌이민, 폴리리신(PLL), 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티드 모방 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차 염, 또는 알파 나선 펩티드.

리간드는 또한 표적화 그룹, 예를 들어 간 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 세포 또는 조직 표적화제, 예를 들어 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어 항체를 포함할 수 있다. 표적 그룹은 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-굴루코사민 다가 만노스, 다가 푸코스, 글리코실화 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 엽산, 비타민 B12, 비타민 A, 비오틴, 또는 RGD 펩티드 또는 RGD 펩티드 모방체일 수 있다. 리간드의 다른 예는 염료, 삽입제(예: 아크리딘), 가교제(예: 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다환식 방향족 탄화수소(예: 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예: EDTA), 친유성 분자(예: 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, l,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1, 3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, 03-(올레오일)리토콜산, 03-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진), 펩티드 접합체(예를 들어, 안테나페디아 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG(예: PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지 마커, 효소, 합텐(예: 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예: 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예: 이미다졸, 바이 시미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP 및 AP를 포함한다.

리간드는 단백질, 예를 들어 당단백질, 또는 펩티드, 예를 들어 공-리간드에 대한 특이적 친화도를 갖는 분자, 또는 간 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체, 예를 들어 항체일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이들은 또한 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-굴루코사민 다가 만노스 및 다가 푸코스와 같은 비-펩티드 종을 포함할 수 있다. 리간드는 예를 들어 리포폴리사카라이드, p38 MAP 키나제의 활성화제 또는 NF-KB의 활성화제일 수 있다.

리간드는 예를 들어 세포의 세포골격을 파괴함으로써, 예를 들어 세포의 미세소관, 미세필라멘트 및/또는 중간 필라멘트를 파괴함으로써 RNAi 작용제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 물질, 예를 들어 약물일 수 있다. 약물은 예를 들어 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 사이토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀라이드, 라트룬쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀라이드 A, 인다노신 또는 미오세르빈일 수 있다.

또 다른 측면에서, 리간드는 표적 세포, 예를 들어 간 세포에 의해 흡수되는 모이어티, 예를 들어 비타민이다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E 및 K를 포함한다. 다른 예시적인 비타민은 B 비타민, 예를 들어 엽산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살, 또는 간 세포와 같은 표적 세포에 의해 흡수되는 다른 비타민 또는 영양소를 포함한다. 또한 HSA 및 저밀도 지단백질(LDL)도 포함된다.

일부 실시예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 RNAi 작용제에 부착된 리간드는 약동학(PK) 조절인자로서 작용한다. 본원에서 사용되는 "PK 조절제"는 약동학적 조절제를 의미한다. PK 조절제에는 친유성 물질, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩티드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등이 포함된다.

예시적인 PK 조절제는 콜레스테롤, 지방산, 콜산(cholic acid), 리토콜산(lithocholic acid), 디알킬글리세리드, 디아실글리세리드, 인지질, 스핑고지질(sphingolipids), 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다수의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 또한 혈청 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 골격에 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 짧은 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 약 5개 염기, 10개 염기, 15개 염기 또는 20개 염기의 올리고뉴클레오티드)는 또한 리간드로서(예를 들어, PK 조절 리간드) 본 명세서에 기술된 기술을 따를 수 있다. 또한, 혈청 성분(예를 들어, 혈청 단백질)에 결합하는 압타머(aptamers)는 또한 본원에 기술된 실시예에서 PK 조정 리간드로서 사용하기에 적합하다.

(i) 지질 접합체. 일부 실시예에서, 리간드 또는 접합체는 지질 또는 지질 기반 분자이다. 지질 또는 지질 기반 리간드는 (a) 접합체의 분해에 대한 저항성을 증가시킬 수 있고, (b) 표적 세포 또는 세포막으로의 표적화 또는 수송을 증가시킬 수 있고, 및/또는 (c) 혈청 단백질(예를 들어, HSA.)에 대한 결합을 조정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 지질 또는 지질 기반 분자는 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합할 수 있다. HSA-결합 리간드는 표적 조직, 예를 들어 신체의 비-신장 표적 조직에 대한 접합체의 분포를 허용한다. 예를 들어, 표적 조직은 간의 실질 세포를 포함하는 간일 수 있다. HSA에 결합할 수 있는 다른 분자도 리간드로 사용할 수 있다. 예를 들어, 네프록신 또는 아스피린을 사용할 수 있다.

지질 기반 리간드는 표적 조직에 대한 접합체의 결합을 억제, 예를 들어 제어하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, HSA에 더 강하게 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드는 신장을 표적으로 삼을 가능성이 적고 따라서 신체에서 제거될 가능성이 적다. HSA에 덜 강력하게 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드를 사용하여 컨쥬게이트를 신장에 표적화할 수 있다.

일부 실시예에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 결합한다. 지질 기반 리간드는 컨쥬게이트가 비-신장 조직에 분포되도록 충분한 친화도로 HSA에 결합할 수 있다. 특정 특정 실시예에서, HSA-리간드 결합은 가역적이다.

일부 다른 실시예에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않아 접합체가 신장에 분포될 것이다. 신장 세포를 표적으로 하는 다른 모이어티는 또한 지질 기반 리간드 대신에 또는 추가로 사용될 수 있다.

(ii) 세포 투과 펩티드 및 작용제. 또 다른 측면에서, 리간드는 나선형 세포 투과제와 같은 세포 투과제이다. 일부 실시예에서, 작용제는 양친매성이다. 예시적인 제제는 탯(tat) 또는 안텐노페디아(antennopedia)와 같은 펩티드이다. 제제가 펩티드인 경우, 펩티드 유사체(peptidylmimetic), 반전체(invertomers), 비펩티드 또는 슈도펩티드 연결 및 D-아미노산 사용을 포함하여 변형될 수 있다. 일부 실시예에서, 헬리컬(helical) 작용제는 알파-나선 작용제이다. 특정한 특정 실시예에서, 나선형 제제는 친유성(lipophilic) 및 소유성(lipophobic) 상을 갖는다.

"세포 투과 펩티드"는 세포, 예를 들어 박테리아 또는 진균 세포와 같은 미생물 세포, 또는 인간 세포와 같은 포유동물 세포를 투과할 수 있다. 미생물 세포 투과 펩티드는 예를 들어 알파-나선형 선형 펩티드(예: LL-37 또는 세로핀 PI), 이황화 결합 함유 펩티드(예: α-데펜신, β-데펜신 또는 박테네신), 또는 1개 또는 2개의 지배적인 아미노산(예: PR-39 또는 인돌리시딘)만 포함하는 펩티드일 수 있다.

리간드는 펩티드 또는 펩티드 모방체(peptidomimetic)일 수 있다. 펩티도모방체(본원에서 올리고펩티도모방체라고도 함)는 천연 펩티드와 유사한 정의된 3차원 구조로 접힐 수 있는 분자이다. RNAi 제제에 대한 펩티드 및 펩티도미메틱의 부착은 세포 인식 및 흡수를 향상시키는 것과 같이 RNAi의 약동학적 분포에 영향을 미칠 수 있다. 펩티드 또는 펩티드 모방 모이어티는 약 5-50개 아미노산 길이, 예를 들어 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다.

펩티드 또는 펩티도미메틱은 예를 들어 세포 투과 펩티드, 양이온성 펩티드, 양친매성 펩티드 또는 소수성 펩티드(예를 들어, 주로 Tyr, Trp 또는 Phe로 구성됨)일 수 있다. 펩티드 모이어티는 덴드리머(dendrimer) 펩티드, 구속(constrained) 펩티드 또는 가교결합(crosslinked) 펩티드일 수 있다. 또 다른 대안에서, 펩티드 모이어티는 소수성 막 전좌 서열(MTS: membrane translocation sequence)을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS-함유 펩티드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP(서열번호 128)를 갖는 RFGF이다. 소수성 MTS를 포함하는 RFGF 유사체(예를 들어, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP(서열번호 129)는 또한 표적 부분일 수 있다. 펩티드 부분은 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, HIV Tat 단백질(GRKKRRQRRRPPQ(서열번호 130) 및 Drosophila Antennapedia 단백질(RQIKIWFQNRRMKWK(서열번호 131))의 서열은 전달 펩티드로 기능할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 펩티드 또는 펩티도미메틱은 파지 디스플레이 라이브러리 또는 OBOC(one-bead-one-compound) 조합 라이브러리(Lam, et al., Nature 354:82-84(1991))에서 식별된 펩티드와 같은 DNA의 무작위 시퀀스에 의해 인코딩될 수 있다.

세포 투과 펩티드는 또한 NLS(nuclear localization signal)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 투과 펩티드는 HIV-1 gp41의 융합 펩티드 도메인과 SV40 대형 T 항원의 NLS로부터 유도된 MPG와 같은 이분 양친매성(bipartite amphipathic) 펩티드일 수 있다(Simeoni, et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-24 (2003)).

(iii) 탄수화물 접합체. 일부 실시예에서, 본원에 기재된 RNAi 작용제 올리고뉴클레오티드는 탄수화물 접합체를 추가로 포함한다. 탄수화물 컨쥬게이트는 핵산의 생체내 전달 뿐만 아니라 생체내 치료 용도에 적합한 조성물에 유리할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "탄수화물"은 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 적어도 6개의 탄소 원자(선형, 분기형 또는 순환형일 수 있음)를 갖는 하나 이상의 단당류 단위로 구성된 탄수화물 그 자체인 화합물; 또는 적어도 6개의 탄소 원자(선형, 분지형 또는 환형일 수 있음)를 각각 갖는 하나 이상의 단당류 단위로 구성된 탄수화물 모이어티를 그 일부로서 갖는 화합물로서, 각 탄소 원자에 산소, 질소 또는 황 원자가 결합되어 있다. 대표적인 탄수화물은 당류(약 4-9개의 단당류 단위를 함유하는 단당류, 이당류, 삼당류 및 올리고당류), 및 전분, 글리코겐, 셀룰로오스 및 다당류 검과 같은 다당류를 포함한다. 특정 단당류는 C5 이상(일부 실시예에서는 C5-C8) 당을 포함하고; 이당류 및 삼당류는 2개 또는 3개의 단당류 단위(일부 실시예에서, C5-C8)를 갖는 당을 포함한다.

일부 실시예에서, 탄수화물 컨쥬게이트는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:

화학식 I,

화학식 II,

화학식 III,

화학식 IV,

화학식 V,

화학식 VI,

화학식 VII,

화학식 VIII,

화학식 IX,

화학식 X,

화학식 XI,

화학식 XII,

화학식 XIII,

화학식 XIV,

화학식 XV,

화학식 XVI,

화학식 XVII,

화학식 XVIII,

화학식 XIX,

화학식 XX, 및

화학식 XXI.

본원에 기재된 실시예에서 사용하기 위한 또 다른 대표적인 탄수화물 접합체는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:

(화학식 XXII), 여기서 X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오티드인 경우, 다른 하나는 수소이다.

일부 실시예에서, 탄수화물 접합체는 PK 조절제, 엔도좀 분해 리간드 또는 세포 투과 펩티드와 같으나 이에 제한되지 않는 다른 리간드를 추가로 포함한다.

(iv) 링커. 일부 실시예에서, 본원에 기재된 접합체는 절단 가능하거나 절단 불가능할 수 있는 다양한 링커를 사용하여 RNAi 작용제 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다.

"링커" 또는 "연결기"라는 용어는 화합물의 두 부분을 연결하는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는 전형적으로 직접 결합 또는 산소 또는 황과 같은 원자, NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH 와 같은 단위, 또는 다음과 같은 원자 사슬을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다: 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로시클릴알킬, 알킬헤테로시클릴알케닐, 알킬헤로시클릴알키닐, 알케닐헤테로시클릴알킬, 알케닐헤테로시클릴알케닐, 알케닐헤테로시클릴알키닐, 알키닐헤테로시클릴알킬, 알키닐헤테로사이클릴알케닐, 알키닐헤테로사이클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 및 알키닐헤로아릴, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클에 의해 중단되거나 종결될 수 있으며; 여기서 R8은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다. 특정 실시예에서, 링커는 1-24개 원자, 4-24개 원자, 6-18개 원자, 8-18개 원자 또는 8-16개 원자이다.

절단 가능한 연결기는 세포 외부에서 충분히 안정적이지만 표적 세포에 들어갈 때 절단되어 링커가 함께 유지하고 있는 두 부분을 해제한다. 특정 실시예에서, 절단 가능한 연결기는 대상체의 혈액에서 또는 제2 참조 조건 (예를 들어, 혈액 또는 혈청에서 발견되는 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있음) 하에서보다 표적 세포에서 또는 제1 참조 조건(예를 들어, 세포내 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있음) 하에서 10배 이상 또는 100배 이상 빠르게 절단된다.

절단 가능한 연결기는 절단제, 예를 들어 pH, 산화환원 전위 또는 분해 분자의 존재에 민감하다. 일반적으로 절단제는 혈청이나 혈액보다 세포 내부에서 더 널리 퍼져 있거나 더 높은 수준이나 활동에서 발견된다. 그러한 분해제의 예는 다음을 포함한다: 특정 기질에 대해 선택되거나 기질 특이성을 갖지 않는 산화환원제, 예를 들어 산화 또는 환원 효소 또는 환원제, 예를 들어 메르캅탄을 포함하는, 세포에 존재하며, 산화환원 절단가능한 연결기를 절감(reduction); 에스테라아제(esterases); 산성 환경을 생성할 수 있는 엔도좀(endosomes) 또는 작용제(agents), 예를 들어 pH가 5 이하가 되는 것들; 일반적인 산, 펩티다아제(기질 특이적일 수 있음) 및 포스파타아제로 작용하여 산 절단 가능한 연결기를 가수분해하거나 분해할 수 있는 효소에 의해 분해할 수 있다. 디설파이드 결합과 같은 절단 가능한 연결 그룹은 pH에 민감할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4인 반면 평균 세포내 pH는 약 7.1-7.3 범위로 약간 더 낮다. 엔도좀은 5.5-6.0 범위의 보다 산성인 pH를 가지며, 리소좀은 약 5.0에서 훨씬 더 산성인 pH를 가진다. 일부 링커는 특정 pH에서 절단되는 절단 가능한 연결기를 가지므로 세포 내부의 리간드에서 또는 세포의 원하는 구획으로 양이온성 지질을 방출한다.

링커는 특정 효소에 의해 절단가능한 절단가능한 연결기를 포함할 수 있다. 링커에 포함된 절단 가능한 연결 그룹의 유형은 표적이 되는 세포에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 간 표적화 리간드는 에스테르 그룹을 포함하는 링커를 통해 양이온성 지질에 연결될 수 있다. 간 세포는 에스테라제가 풍부하므로 링커는 에스테라제가 풍부하지 않은 세포 유형보다 간 세포에서 더 효율적으로 절단된다. 에스테라제가 풍부한 다른 세포 유형에는 폐, 신장 피질(renal cortex) 및 고환(testis)의 세포가 포함된다.

펩티드 결합을 포함하는 링커는 간 세포 및 윤활막 세포와 같은 펩티다아제가 풍부한 세포 유형을 표적으로 할 때 사용할 수 있다.

일반적으로 후보 절단 가능한 연결 그룹의 적합성은 후보 연결 그룹을 절단하는 분해제(또는 조건)의 능력을 테스트하여 평가할 수 있다. 혈액에서 또는 다른 비표적 조직과 접촉할 때 절단에 저항하는 능력에 대해 후보 절단 가능한 연결 그룹을 테스트하는 것도 바람직할 수 있다. 따라서, 제1 조건과 제2 조건 사이의 절단에 대한 상대적 민감성을 결정할 수 있는데, 여기서 첫 번째 조건은 표적 세포에서의 절단을 나타내도록 선택되고 두 번째 조건은 다른 조직 또는 생물학적 유체(예를 들어, 혈액 또는 혈청)에서의 절단을 나타내도록 선택된다. 평가는 무세포 시스템, 세포, 세포 배양, 장기 또는 조직 배양 또는 전체 동물에서 수행할 수 있다. 무세포 또는 배양 조건에서 초기 평가를 수행하고 전체 동물에서 추가 평가를 통해 확인하는 것이 유용할 수 있다. 특정 실시예에서, 유용한 후보 화합물은 혈액 또는 혈청과 비교하여(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하에서) 세포에서(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하에서) 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 10배 또는 적어도 100배 빠르게 절단된다.

절단가능한 연결기의 한 부류는 환원 또는 산화시 절단되는 산화환원 절단가능한 연결기이다. 환원적으로 절단 가능한 연결 그룹의 예는 디설파이드 연결 그룹(-S-S-)이다. 후보 절단 가능한 연결기가 적합한 "환원적으로 절단 가능한 연결기"인지, 또는 예를 들어 특정 RNAi 모이어티 및 특정 표적화제와 함께 사용하기에 적합한지를 결정하기 위해 본 명세서에 기술된 방법을 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 후보는 디티오트레이톨(DTT), 또는 세포, 예를 들어 표적 세포에서 관찰되는 절단 속도를 모방하는 당업계에 공지된 시약을 사용하는 다른 환원제와의 배양에 의해 평가될 수 있다. 후보자는 또한 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에서 평가될 수 있다. 일부 실시예에서, 후보 화합물은 혈액에서 최대 10%까지 절단된다. 특정 실시예에서, 유용한 후보 화합물은 혈액(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하에서)과 비교하여 세포에서(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서) 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 10배 또는 적어도 100배 빠르게 분해된다. 후보 화합물의 절단 속도는 세포내 매질을 모방하도록 선택된 조건 하에서 그리고 세포외 매질을 모방하도록 선택된 조건과 비교하여 표준 효소 동역학 검정을 사용하여 결정될 수 있다.

인산염 기반 절단 가능한 연결 그룹은 인산 그룹을 분해하거나 가수분해하는 제제에 의해 절단된다. 세포에서 인산기를 절단하는 작용제의 예는 세포에서 포스파타아제와 같은 효소이다. 포스페이트계(phosphate-based) 연결기의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O- P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-이다. 특정 실시예에서, 포스페이트계 연결기는 다음으로부터 선택된다: -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O- P(0)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-Ρ(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, 및 -O-P(S)(H)-S-. 특정 실시예에서, 포스페이트 연결기는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이러한 후보는 위에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 평가할 수 있다.

산 절단 가능한 연결 그룹은 산성 조건에서 절단되는 연결 그룹이다. 일부 실시예에서, 산 절단 가능한 연결기는 pH가 약 6.5 이하(예를 들어, 약 6.0, 5.5, 5.0 이하)인 산성 환경에서 또는 일반적인 산으로 작용할 수 있는 효소와 같은 제제에 의해 절단된다. 세포에서 엔도좀 및 리소좀과 같은 특정 낮은 pH 소기관은 산 절단 가능한 연결 그룹을 위한 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단 가능한 연결기의 예는 히드라존, 에스테르 및 아미노산의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 산 절단 가능한 그룹은 일반 공식 C=N-, C(O)O, 또는 -OC(O)를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 에스테르의 산소에 부착된 탄소(알콕시기)는 아릴기, 치환된 알킬기, 또는 디메틸 펜틸 또는 t-부틸과 같은 3차 알킬기이다. 이러한 후보는 위에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 평가할 수 있다.

에스테르 기반 절단 가능한 연결기는 세포에서 에스테라제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 절단된다. 에스테르 기반 절단 가능한 연결기의 예는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌기의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에스테르 절단 가능한 연결기는 일반식 -C(O)O- 또는 -OC(O)-를 갖는다. 이러한 후보는 위에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 평가할 수 있다.

펩티드 기반 절단 가능한 연결기는 세포에서 펩티다아제 및 프로테아제와 같은 효소에 의해 절단된다. 펩티드 기반 절단 가능한 연결기는 올리고펩티드(예: 디펩티드, 트리펩티드 등) 및 폴리펩티드를 산출하기 위해 아미노산 사이에 형성된 펩티드 결합이다. 펩티드 기반 절단 가능 그룹은 아미드 그룹(-C(O)NH-)을 포함하지 않는다. 아미드 그룹은 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키넬렌 사이에 형성될 수 있다. 펩티드 결합은 펩티드와 단백질을 생성하기 위해 아미노산 사이에 형성된 특별한 유형의 아미드 결합이다. 펩티드 기반 절단기는 일반적으로 펩티드와 단백질을 생성하는 아미노산 사이에 형성된 펩티드 결합(즉, 아미드 결합)으로 제한되며 전체 아미드 작용기를 포함하지 않는다. 펩티드 기반 절단 가능한 연결 그룹은 일반식 - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)- 를 가지며, 여기서 RA 및 RB는 2개의 인접한 아미노산의 R 그룹이다. 이러한 후보는 위에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 평가할 수 있다.

링커를 갖는 대표적인 탄수화물 컨쥬게이트는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:

(화학식 XXIII),

(화학식 XXIV),

(화학식 XXV),

(화학식 XXVI),

(화학식 XXVII),

(화학식 XXXVIII),

(화학식 XXIX), 및

(화학식 XXX),

여기서 X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오티드인 경우, 다른 하나는 수소이다.

조성물 및 방법의 특정 실시예에서, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 "GalNAc"(N-아세틸갈락토사민) 유도체이다. 예를 들어, 일부 실시예에서 siRNA는 다음 구조에 나타낸 바와 같이 GalNAc 리간드에 접합된다:

여기서 X는 O 또는 S이다.

일부 실시예에서, siRNA의 센스 가닥은 다음 구조에 나타낸 바와 같이 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 부착된 리간드에 접합된다:

여기서 X는 O 또는 S이다.

일부 실시예에서, 병용 요법(combination therapy)은 화학식 (XXXI) - (XXXIV) 중 임의의 것으로 나타낸 구조의 그룹으로부터 선택된 2가 또는 3가 분지형 링커에 접합된 siRNA를 포함한다:

화학식 XXXI,

화학식 XXXII,

화학식XXXIII, 또는

화학식 XXXIV;

여기서:

q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 각 경우에 대해 독립적으로 0 내지 20을 나타내고, 여기서 반복 단위는 동일하거나 상이할 수 있고;

P^2A, P^2B, P^3A, P^3B, P^4A, P^4B, P^5A, P^5B, P^5C, T^2A, T^2B, T^3A, T^3B, T^4A, T^4B, T^4A, T^5B, 및 T^5C 는 각 경우에 독립적으로 존재하지 않거나, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH₂, CH₂NH, 또는 CH₂O 이고;

Q^2A, Q^2B, Q^3A, Q^3B, Q^4A, Q^4B, Q^5A, Q^5B, 및 Q^5C 는 각 경우에 독립적으로 존재하지 않거나, 알킬렌 또는 치환된 알킬렌이며, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO₂, N(R^N), C(R')=C(R''),C≡C 또는 C(O) 중 하나 이상에 의해 중단되거나 종결될 수 있으며;

R^2A, R^2B, R^3A, R^3B, R^4A, R^4B, R^5A, R^5B, 및 R^5C 는 각 경우에 독립적으로 존재하지 않거나, NH, O, S, CH₂, C(O)O, C(O)NH, NHCH(R^a)C(O), -C(O)-CH(R^a)-NH-, CO, CH=N-O,

,

,

,

,

또는 헤테로사이클릴이고;

L^2A, L^2B, L^3A, L^3B, L^4A, L^4B, L^5A, L^5B, 및 L^5C 는 리간드를 나타내고; 즉, 각 경우에 대해 각각 독립적으로 단당류(예: GalNAc), 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류 또는 다당류; 및 R^a 는 H 또는 아미노산 측쇄이다. 3가 컨쥬게이팅 GalNAc 유도체는 표적 유전자, 예를 들어 화학식 (XXXIV)의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제와 함께 사용하기에 특히 유용하다:

화학식 XXXIV,

여기서 L^5A, L^5B 및 L^5C 는 GalNAc 유도체와 같은 단당류를 나타낸다.

GalNAc 유도체를 컨쥬게이션하는 적합한 2가 및 3가 분지형 링커 그룹의 예는 화학식 I, VI, X, IX 및 XII로 위에서 언급된 구조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

RNA 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음과 같다: 미국 특허 번호 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 및 7,037,646; 이들 각각은 이러한 제조 방법과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된다.

특정 경우에, RNAi 작용제의 RNA는 비리간드 그룹에 의해 변형될 수 있다. 많은 비리간드 분자가 RNAi 제제의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키기 위해 RNAi 제제에 접합되었으며, 이러한 접합을 수행하는 절차는 과학 문헌에서 이용 가능하다. 이러한 비리간드 모이어티에는 다음과 같은 지질 모이어티가 포함된다: 콜레스테롤 (Kubo, T., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 365(1):54-61 (2007); Letsinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553 (1989)), 콜산 (Manoharan, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:1053 (1994)), 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올 (Manoharan, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:306 (1992); Manoharan, et al., Bioorg. Med. Chem. Let. 3:2765 (1993)), 티오콜레스테롤 (Oberhauser, et al., Nucl. Acids Res. 20:533 (1992)), 지방족 사슬, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (Saison-Behmoaras, et al., EMBO J. 10:111 (1991); Kabanov, et al., FEBS Lett. 259:327 (1990); Svinarchuk, et al., Biochimie 75:49 (1993)), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 l,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 (Manoharan, et al., Tetrahedron Lett. 36:3651 (1995); Shea, et al., Nucl. Acids Res. 18:3777 (1990)), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (Manoharan, et al., Nucleosides & Nucleotides 14:969 (1995)), 또는 아다만탄 아세트산 (Manoharan, et al., Tetrahedron Lett. 36:3651 (1195)), 팔미틸 모이어티 (Mishra, et al., Biochim. Biophys. Acta 1264:229 (1995)), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티 (Crooke, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:923 (1996)).

전형적인 컨쥬게이션 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커를 갖는 RNA의 합성을 포함한다. 그런 다음 아미노 그룹은 적절한 커플링 또는 활성화 시약을 사용하여 접합되는 분자와 반응한다. 컨쥬게이션 반응은 RNA가 여전히 고체 지지체에 결합되어 있거나 RNA가 절단된 후 용액 상태에서 수행될 수 있다. HPLC에 의한 RNA 컨쥬게이트의 정제는 전형적으로 순수한 컨쥬게이트를 제공한다.

d. RNAi 작용제 전달

RNAi 작용제를 언급할 때 "세포 내로 도입하는 것"은 당업자가 이해하는 바와 같이 세포 내로의 흡수 또는 흡수를 촉진하거나 실시하는 것을 의미한다.

RNAi 제제의 흡수 또는 흡수는 비보조 확산 또는 활성 세포 과정을 통해 또는 보조 제제 또는 장치에 의해 발생할 수 있다. 이 용어의 의미는 시험관 내 세포에 국한되지 않는다; RNAi 작용제는 또한 "세포에 도입"될 수 있으며, 여기서 세포는 살아있는 유기체의 일부이다. 그러한 경우 세포로의 도입은 유기체로의 전달을 포함할 것이다. 예를 들어, 생체내 전달을 위해 RNAi 작용제는 조직 부위에 주사되거나 전신적으로 투여될 수 있다. 생체내 전달은 또한 미국 특허 번호5,032,401 및 5,607,677, 및 미국 공개 번호 2005/0281781 에 기술된 것과 같은 베타-글루칸 전달 시스템에 의한 것일 수 있으며, 이러한 전달 시스템과 관련된 교시를 위해 본 명세서에 참조로 포함된다. 세포로의 시험관내 도입은 전기천공 및 리포펙션과 같은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 추가 접근법은 본 명세서에서 아래에 설명되거나 당업계에 공지되어 있다.

이를 필요로 하는 피험자에게 RNAi 작용제를 전달하는 것은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 생체내 전달은 RNAi 작용제, 예를 들어 siRNA를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 직접적으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 전달은 RNAi 제제의 발현을 인코딩하고 지시하는 하나 이상의 벡터를 투여함으로써 간접적으로 수행될 수 있다. 이러한 대안은 아래에서 자세히 설명한다.

일반적으로, 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법은 RNAi 제제와 함께 사용하기 위해 개조될 수 있다(예를 들어, Akhtar S. and Julian RL., Trends Cell. Biol. 2(5):139-44 (1992) 및 WO94/02595, 이러한 전달 방법과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함됨). 일반적으로, 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법은 RNAi 제제와 함께 사용하기 위해 개조될 수 있다(예를 들어, Akhtar S. and Julian RL., Trends Cell. Biol. 2(5):139-44 (1992) 및 WO94/02595, 이러한 전달 방법과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함됨). 생체 내에서 RNAi 제제를 성공적으로 전달하는 데 특히 중요한 세 가지 요소는 (a) 전달된 분자의 생물학적 안정성, (2) 비특이적 효과 방지 및 (3) 전달된 분자가 표적 조직에 축적되는 것이다. RNAi 작용제의 비특이적 효과는 국소 투여, 예를 들어 직접 주사 또는 조직(비제한적 예로서, 종양)으로의 이식 또는 제제의 국소 투여에 의해 최소화될 수 있다. 치료 부위로의 국소 투여는 작용제의 국소 농도를 최대화하고, 그렇지 않으면 작용제에 의해 손상될 수 있거나 작용제를 분해할 수 있는 전신 조직에 대한 작용제의 노출을 제한하고, 투여될 RNAi 작용제의 더 낮은 총 용량을 허용한다. 여러 연구에서 RNAi 제제가 국소적으로 투여될 때 유전자 산물의 성공적인 녹다운이 나타났다. 예를 들어, cynomolgus 원숭이의 유리체강내 주사(Tolentino, M.J., et al., Retina 24:132-38 (2004)) 및 마우스의 망막하 주사(Reich, S.J., et al., Mol. Vis. 9:210-16 (2003))에 의한 VEGF siRNA의 안구내 전달은 둘 다 노화 관련 황반 변성의 실험 모델에서 신생혈관 형성을 예방하는 것으로 나타났다. 또한 마우스에 siRNA를 직접 종양 내 주사하면 종양 부피가 줄어들고(Pille, J., et al., Mol. Ther. 11:267-74 (2005)) 종양 보유 마우스의 생존 기간이 연장될 수 있다(Kim, W.J., et al., Mol. Ther. 14:343-50 (2006); Li, S., et al., Mol. Ther. 15:515-23 (2007)). RNA 간섭은 직접 주입에 의한 CNS로의 국소 전달에서도 성공을 보였다(Dorn, G., et al., Nucleic Acids 32:e49 (2004); Tan, P.H., et al., Gene Ther. 12:59-66 (2005); Makimura, H., et al., BMC Neurosci. 3:18 (2002); Shishkina, G.T., et al., Neuroscience 129:521-28 (2004); Thakker, E.R., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-75 (2004); Akaneya,Y., et al., J. Neurophysiol. 93:594- 602 (2005)) 그리고 비강내 투여에 의해 폐로 투여된다 (Howard, K.A., et al., Mol. Ther. 14:476-84 (2006); Zhang, X., et al., J. Biol. Chem. 279:10677-84 (2004); Bitko, V., et al., Nat. Med. 11:50-55 (2005)).

질병 치료를 위해 RNAi 작용제를 전신적으로 투여하기 위해, RNA는 변형되거나 대안적으로 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다; 두 방법 모두 생체 내에서 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의한 siRNA의 급속한 분해를 방지하는 역할을 한다. RNA 또는 약학적 담체의 변형은 또한 표적 조직에 대한 RNAi 작용제 조성물의 표적화를 허용하고 바람직하지 않은 표적외 효과를 피할 수 있다. RNAi 작용제는 콜레스테롤과 같은 친유성 그룹에 대한 화학적 컨쥬게이션에 의해 변형되어 세포 흡수를 향상시키고 분해를 방지할 수 있다. 예를 들어, 친유성 콜레스테롤 모이어티에 접합된 ApoB에 대한 RNAi 작용제는 마우스에 전신 주사되었고 간과 공장(jejunum) 모두에서 apoB mRNA의 녹다운을 초래했다(Soutschek, J., et al., Nature 432:173-78 (2004)). 일부 다른 실시예에서, RNAi 제제는 나노입자, 덴드리머, 폴리머, 리포좀 또는 양이온 전달 시스템과 같은 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 양전하 양이온 전달 시스템은 전형적으로 RNAi 작용제(음전하)의 결합을 용이하게 하고 음전하를 띤 세포막에서의 상호작용을 강화하여 세포에 의한 RNAi 작용제의 효율적인 흡수를 가능하게 한다. 양이온성 지질, 덴드리머 또는 폴리머는 RNAi에 결합되거나 RNAi 작용제를 둘러싸는 소포 또는 미셀을 형성하도록 유도될 수 있다(예를 들어, Kim, S,H., et al., Journal of Controlled Release 129(2):107-16 (2008) 참조). 소낭 또는 미셀의 형성은 전신적으로 투여될 때 RNAi 제제의 분해를 추가로 방지한다. 양이온성-RNAi 작용제 복합체를 제조하고 투여하는 방법은 당업자의 능력 범위 내에 있다(예를 들어, Sorensen, D.R., et al., J. Mol. Biol 327:761-66 (2003); Verma, U.N., et al., Clin. Cancer Res. 9:1291-1300 (2003); Arnold, A.S. et al., J. Hypertens. 25:197-205 (2007); 참조. 이들 방법은 본원에 참조로 포함됨). RNAi 제제의 전신 전달에 유용한 약물 전달 시스템의 일부 비제한적 예는 DOTAP를 포함한다 (Sorensen, D.R., et al. (2003), supra; Verma, U.N., et al., (2003), supra), 올리고펙타민, "고체 핵산 지질 입자" (Zimmermann, T.S., et al., Nature 441:111-14 (2006)), 카디오리핀 (Chien, P.Y., et al., Cancer Gene Ther. 12:321-28 (2005); Pal, A., et al., Int J. Oncol. 26: 1087-91 (2005)), 폴리에틸렌이민 (Bonnet, M.E., et al., Pharm. Res. 25(12):2972-82; Aigner, A., J. Biomed. Biotechnol. 2006(4):71659 (2006)), Arg-Gly-Asp (RGD) 펩티드 (Liu, S., Mol. Pharm. 3:472-487 (2006)), 및 폴리아미도아민 (Tomalia, D.A., et al., Biochem. Soc. Trans. 35:61-7 (2007); Yoo, H., et al., Pharm. Res. 16:1799-1804 (1999)).

본원에서 사용되는 용어 "SNALP"는 안정한 핵산-지질 입자를 의미한다. SNALP는 RNAi 제제 또는 RNAi 제제가 전사되는 플라스미드와 같은 핵산을 포함하는 감소된 수성 내부를 코팅하는 지질 소포를 나타낸다. SNALP는 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US2006/0240093 및 US2007/0135372, 및 국제 출원 공개 번호 WO 2009/082817에 기재되어 있다. 이들 출원은 SNALP와 관련된 교시를 위해 참조로 본 명세서에 포함된다.

일부 실시예에서, RNAi는 전신 투여를 위해 시클로덱스트린과 복합체를 형성한다. RNAis 및 시클로덱스트린의 투여 방법 및 약학적 조성물은 미국 특허 번호 7, 427, 605에서 찾을 수 있으며, 이러한 조성물 및 방법과 관련된 교시를 위해 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시예에서, RNAi를 인코딩하는 유전자는 인코딩되고 발현 벡터로부터 발현된다. 벡터의 예 및 RNAi 전달에서의 이의 용도는 미국 특허 출원 번호 US2017/0349900A1에 기술되어 있으며, 이 예는 본원에 참고로 포함된다.

e. RNAi 작용제의 약학적 조성물 및 제형

일부 실시예에서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 작용제 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. RNAi 작용제를 함유하는 약학적 조성물은 대상체에서 HBV 감염을 치료하거나 HBV 바이러스 부하를 감소시키기 위한 병용 요법에 유용하다. 이러한 약학적 조성물은 전달 방식에 기초하여 제형화된다. 예를 들어, 조성물은 예를 들어 정맥내(IV) 전달에 의한 비경구 전달을 통한 전신 투여를 위해, 또는 예를 들어 연속 펌프 주입과 같은 뇌로의 주입에 의해 뇌 실질(brain parenchyma)로의 직접 전달을 위해 제형화될 수 있다.

일부 맥락에서, "약학적으로 허용되는 담체" 또는 "부형제"는 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 약학적으로 허용되는 용매, 현탁화제 또는 임의의 기타 약리학적으로 불활성인(inert) 비히클이다. 부형제는 액체 또는 고체일 수 있고, 핵산 및 주어진 약학적 조성물의 다른 성분과 조합될 때 원하는 벌크(bulk), 일관성(consistency) 등을 제공하도록 염두에 두고 계획된 투여 방식으로 선택된다. 전형적인 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 결합제(예를 들어, 전호화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충전제(예: 락토스 및 기타 당류, 미정질 셀룰로오스, 펙틴, 젤라틴, 황산칼슘, 에틸 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 인산수소칼슘); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 실리카, 콜로이드성 이산화규소, 스테아르산, 금속 스테아레이트, 경화 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨); 붕해제(예: 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트); 및 습윤제(예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

일부 실시예에서, 핵산과 유해하게 반응하지 않는 비경구 외 투여에 적합한 약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 부형제가 또한 본 발명의 조성물을 제형화하는 데 사용될 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

특정 맥락에서, 핵산의 국소 투여용 제제는 멸균 및 비멸균 수용액, 알코올과 같은 일반적인 용매 중 비수성 용액, 또는 액체 또는 고체 오일 베이스 중 핵산 용액을 포함할 수 있다. 용액에는 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제도 포함될 수 있다. 핵산과 유해하게 반응하지 않는 비경구 투여에 적합한 약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 부형제가 사용될 수 있다.

적합한 약학적으로 허용되는 부형제는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

일부 실시예에서, 본원에 기재된 RNAi 작용제를 함유하는 제약 조성물은 HBV 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 투여량으로 투여된다. 일반적으로, RNAi 제제의 적합한 투여량은 1일 수용자의 체중 1kg당 0.001 내지 200.0mg의 범위일 것이며, 보다 전형적으로는 1일 1kg의 체중당 1 내지 50mg의 범위일 것이다. 예를 들어, siRNA는 단일 용량당 0.01 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 50 mg/kg으로 투여될 수 있다. 제약 조성물은 1일 1회 투여될 수 있거나, RNAi 작용제는 하루 종일 적절한 간격으로 또는 심지어 제어 방출 제제를 통한 연속 주입 또는 전달을 사용하여 2회, 3회 또는 그 이상의 하위 용량으로 투여될 수 있다. 이 경우, 총 일일 투여량을 달성하기 위해서는 각각의 하위 투여량에 포함된 RNAi 제제가 상응하게 더 작아야 한다. 투약 단위는 또한 예를 들어, 수일에 걸쳐 RNAi의 지속 방출을 제공하는 통상적인 지속 방출 제제를 사용하여 수일에 걸쳐 전달하기 위해 배합될 수 있다. 지속 방출 제제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에 기술된 기술의 제제와 함께 사용될 수 있는 것과 같이 특정 부위에서 제제의 전달에 특히 유용하다. 이 실시예에서, 투여량 단위는 상응하는 일일 투여량의 배수를 포함한다.

HBV 유전자의 발현 수준에 대한 단일 용량의 효과는 오래 지속되어 후속 용량이 3, 4, 또는 5 일 이하의 간격으로 또는 1, 2, 3, 또는 4 주 이하의 간격으로 투여될 수 있다.

숙련된 기술자는 질병 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 피험자의 일반적인 건강 및/또는 연령, 존재하는 다른 질병을 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 요인이 피험자를 효과적으로 치료하는 데 필요한 투여량과 시간에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 치료적 유효량의 조성물로 대상체를 치료하는 것은 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 기술에 포함된 개별 RNAi 작용제에 대한 유효 투여량 및 생체내 반감기의 추정은 통상적인 방법론을 사용하거나 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이 적절한 동물 모델을 사용한 생체내 시험을 기초로 할 수 있다.

마우스 모델은 HBV 감염 연구에 사용할 수 있으며 이러한 모델은 RNAi의 생체 내 테스트뿐만 아니라 HBV 유전자 발현을 줄이는 데 효과적인 용량을 결정하는 데 사용할 수 있다.

일부 실시예에서, 본원에 기재된 제약 조성물 및 제제의 투여는 국소 (예를 들어, 경피 패치에 의해), 폐 (예를 들어, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의해, 분무기에 의한 것을 포함함); 기관내; 비강 내; 표피 및 경피; 경구; 또는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 및 근육내 주사 또는 주입을 포함하고; 피하 투여(예를 들어, 이식된 장치를 통해); 또는 두개내 투여(예를 들어, 실질내, 척수강내 또는 뇌실내 투여에 의해)를 포함한다.

특정 실시예에서, 본원에 개시된 바와 같은 HBV 치료를 위한 병용 요법에 사용되는 RNAi 작용제는 피하로 전달된다.

일부 실시예에서, RNAi 작용제는 간(예를 들어, 간의 간세포)과 같은 특정 조직을 표적화하는 방식으로 전달될 수 있다.

국소 투여용 제약 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제(drops), 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제(thickeners) 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 장갑 등도 유용할 수 있다. 적합한 국소 제형은 본원에 기술된 기술에서 특징되는 RNA가 지질, 리포솜, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 및 계면활성제와 같은 국소 전달제와 혼합된 것을 포함한다. 적합한 지질 및 리포좀은 중성(예를 들어, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아롤리포스파티딜 콜린), 음성(예를 들어, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예를 들어, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다. RNAi 작용제는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있거나, 특히 양이온성 리포좀에 대한 복합체를 형성할 수 있다.

선택적으로, RNAi 작용제는 지질, 특히 양이온성 지질에 착화될 수 있다. 적합한 지방산 및 에스테르는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 아라키돈산, 올레산, 에이코산산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린 또는 C_1-20알킬 에스테르 (예를 들어, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염. 국소 제형의 예는 미국 특허 번호 6,747,014에 상세히 기술되어 있으며, 이는 국소 제형과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된다.

리포솜과 같은 소포는 본원에 개시된 RNAi 작용제를 전달하기 위한 제형에 사용될 수 있으며; 이러한 제형은 특이성 및 작용 지속시간과 같은 바람직한 특성을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "리포좀"은 구형 이중층 또는 이중층으로 배열된 양친매성 지질로 구성된 소포를 의미한다.

리포솜은 친유성 물질과 수성 내부로 형성된 막을 갖는 단일층 또는 다중층 소포이다. 수성 부분은 전달될 조성물을 함유한다. 양이온성 리포솜은 세포벽에 융합할 수 있다는 이점을 가질 수 있다. 비양이온성 리포솜은 세포벽과 효율적으로 융합할 수 없지만 생체 내에서 대식세포에 의해 흡수될 수 있다. 리포좀 제형의 제조에서 중요한 고려사항은 지질 표면 전하, 소포 크기 및 리포좀의 수성 부피(aqueous volume)이다.

일부 실시예에서, 리포좀 전달은 다음과 같은 유리한 특성을 가질 수 있다: 매우 변형 가능하고 피부의 미세 모공을 통과할 수 있음; 생체적합성 및 생분해성; 광범위한 수용성 및 지용성 약물을 통합하는 능력; 내부 구획에서 캡슐화된 약물을 대사 및 분해로부터 보호하는 능력(Rosoff, 약학적 제형, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245 (1998)); 국소 전달의 경우, 투여된 약물의 높은 전신 흡수와 관련된 부작용 감소, 원하는 표적에서 투여된 약물의 증가된 축적, 및 다양한 친수성 및 소수성 약물을 피부로 투여하는 능력; 및 고분자량 핵산, 진통제, 항체 및 호르몬을 포함하는 약제를 피부에 전달하는 능력.

리포솜은 크게 두 부류로 나뉜다. 양이온성 리포솜은 음전하를 띤 핵산 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 양전하를 띤 리포솜이다. 양전하를 띤 DNA/리포솜 복합체는 음전하를 띤 세포 표면에 결합하고 엔도솜에 내재화된다. 엔도좀 내의 산성 pH로 인해 리포좀이 파열되어 그 내용물을 세포질로 방출한다(Wang, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.147, 980-985 (1987)).

p에 민감하거나 음전하를 띠는 리포솜은 핵산과 복합체를 형성하기보다는 핵산을 포획한다. DNA와 지질 모두 유사하게 전하를 띠기 때문에 복합체 형성보다는 반발이 일어난다. 그럼에도 불구하고 일부 DNA는 이러한 리포좀의 수성 내부에 포획된다(entrapped). pH-민감성 리포좀은 핵산을 배양물에서 세포 단층으로 전달하는데 사용되어 왔다(예를 들어, Zhou, et al., Journal of Controlled Release 19, 269-74 (1992)).

일부 실시예에서, 리포솜 조성물은 예를 들어 대두 PC 및 계란 PC와 같은 포스파티딜콜린(PC)으로부터 형성된다. 일부 실시예에서, 리포솜 조성물은 천연 유래 포스파티딜콜린 이외의 인지질을 포함한다. 예를 들어, 중성 리포좀 조성물은 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포좀 조성물은 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성될 수 있는 반면, 음이온성 융합생성 리포좀은 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 리포솜 조성물은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.

일부 실시예에서, 리포솜 약물 제형은 피부에 국소적으로 전달된다.

일부 실시예에서, 본원에 기술된 병용 요법에 사용되는 RNAi 작용제는 예를 들어 SPLP, pSPLP, SNALP 또는 다른 핵산-지질 입자를 형성하기 위해 지질 제제에 완전히 캡슐화된다. 본원에서 사용되는 용어 "SNALP"는 SPLP를 포함하는 안정한 핵산-지질 입자를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "SPLP"는 지질 소포 내에 캡슐화된 플라스미드 DNA를 포함하는 핵산-지질 입자를 의미한다. SNALP 및 SPLP는 일반적으로 양이온성 지질, 비양이온성 지질 및 입자의 응집을 방지하는 지질(예: PEG-지질 접합체)을 포함한다. SNALP 및 SPLP는 정맥(i.v.) 주사 후 연장된 순환 수명을 나타내고 원위 부위(예: 투여 부위에서 물리적으로 분리된 부위)에 축적되기 때문에 전신 응용에 사용될 수 있다. SPLP는 국제 출원 공개 번호 WO 00/03683에 기재된 바와 같이 캡슐화된 축합제-핵산 복합체를 포함하는 "pSPLP"를 포함한다. 본원에 기재된 기술의 입자는 전형적으로 약 50 nm 내지 약 150 nm, 보다 전형적으로 약 60 nm 내지 약 130 nm, 보다 전형적으로 약 70 nm 내지 약 110 nm, 가장 전형적으로 약 70 nm 내지 약 90 nm의 평균 직경을 가지며, 실질적으로 독성이 없다. 또한, 일부 실시예에서, 핵산-지질 입자에 존재할 때 핵산은 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 수용액에서 저항성이다. 핵산-지질 입자 및 관련 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 번호5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; 및 국제 출원 공개 번호 WO 96/40964에 개시되어 있다.

일부 실시예에서, RNAi 작용제는 리포좀 또는 다른 지질 제형을 통해 전달되며, 여기서 지질 대 약물 비(질량/질량 비) (예: 지질 대 siRNA 비율)는 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1 범위이다.

항체, 항원-결합 단편, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물

본 개시내용은 또한 본 개시내용에 따른 항체, 항원-결합 단편, 또는 융합 단백질, 본 개시내용에 따른 핵산, 본 개시내용에 따른 벡터 및/또는 본 개시내용에 따른 하기 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 특정 실시예에서, 약학적 조성물은 HBV 단백질 발현 억제제 및 전달 시스템(예를 들어, RNAi 작용제)을 추가로 포함한다.

약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 함유할 수 있다. 담체 또는 부형제가 투여를 용이하게 할 수 있지만, 그 자체가 조성물을 수용하는 개인에게 유해한 항체의 생성을 유도해서는 안 된다. 독성이 있어서도 안된다. 적합한 담체는 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체 및 비활성 바이러스 입자와 같은 크고 느리게 대사되는 거대분자일 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용에 따른 약학적 조성물에서 약학적으로 허용되는 담체는 활성 성분 또는 비활성 성분일 수 있다.

약학적으로 허용되는 염, 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염과 같은 무기산 염, 또는 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조산염과 같은 유기산의 염이 사용될 수 있다.

약학적 조성물에서 약학적으로 허용되는 담체는 추가로 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 함유할 수 있다. 추가로, 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약학적 조성물이 대상체에 의한 섭취를 위해 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제형화될 수 있게 한다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로서 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클에 용액 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다(예를 들어, 보존제를 함유하는 멸균수로 재구성하기 위한 Synagis™ 및 Herceptin™과 유사한 동결건조 조성물). 조성물은 예를 들어 연고, 크림 또는 분말로서 국소 투여용으로 제조될 수 있다. 조성물은 경구 투여용으로, 예를 들어 정제 또는 캡슐, 스프레이 또는 시럽(선택적으로 향미제)으로 제조될 수 있다. 조성물은 미세 분말 또는 스프레이를 사용하여 예를 들어 흡입기로서 폐 투여용으로 제조될 수 있다. 조성물은 좌제 또는 페서리(pessary)로서 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어 점적제로서 비강, 귀 또는 안구 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 조합된 조성물이 피험자에게 투여되기 직전에 재구성되도록 설계된 키트 형태일 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 항체는 멸균수 또는 멸균 완충액과 함께 키트 형태로 제공될 수 있다.

특정 실시예에서, 본 개시내용에 따른 조성물 중 활성 성분은 항체 분자, 항체 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체이고, 특히 조성물 중의 활성 성분은 본원에 기재된 바와 같은 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 또는 이의 변이체 및 유도체이다. 따라서 위장관에서 분해되기 쉽다. 따라서, 조성물이 위장관을 사용하는 경로에 의해 투여되는 경우, 조성물은 분해로부터 항체를 보호하지만 일단 항체가 위장관으로부터 흡수되면 항체를 방출하는 작용제를 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체에 대한 철저한 논의는 Gennaro (2000) Remington: 약학의 과학 및 실습, 20판, ISBN: 0683306472. 에서 확인할 수 있다.

본 개시내용의 제약 조성물의 pH는 5.5 내지 8.5일 수 있고, 일부 실시예에서 이는 6 내지 8일 수 있다. 다른 실시예에서, 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물의 pH는 약 7일 수 있다. 완충액을 사용하여 pH를 유지할 수 있다. 조성물은 무균 및/또는 발열원이 없을 수 있다. 조성물은 인간에 대해 등장성일 수 있다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 밀봉된 용기에 공급된다.

본 개시내용의 범위 내에는 여러 형태의 투여로 존재하는 조성물이 있다; 형태는 비경구 투여, 예를 들어 주사 또는 주입, 예를 들어 볼루스(bolus) 주사 또는 연속 주입에 적합한 형태를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 제품이 주사 또는 주입용인 경우 유성 또는 수성 비히클에 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있으며 현탁제, 방부제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제형 제제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 적절한 멸균 액체와 함께 사용하기 전에 재구성하기 위해 건조 형태일 수 있다. 비히클은 전형적으로 약학적 활성 화합물, 특히 본 발명에 따른 항체와 같은 화합물을 저장, 수송 및/또는 투여하기에 적합한 물질인 것으로 이해된다. 예를 들어, 비히클은 약학적 활성 화합물, 특히 본 명세서에 따른 항체를 저장, 수송 및/또는 투여하기에 적합한 생리학적으로 허용되는 액체일 수 있다. 일단 제형화되면, 본 발명의 조성물은 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 한 실시예에서 조성물은 포유동물, 예를 들어 인간 대상체에게 투여하기에 적합하다.

본원에 기재된 약학적 조성물은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다: 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 복강내, 척수강내, 심실내, 경피, 경피, 국소, 피하, 비강내, 경장, 설하, 질내 또는 직장 경로. 하이포스프레이(Hyposprays)는 또한 본 명세서의 약학적 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 약학적 조성물은 국소 투여를 위한 경구 투여용(예를 들어 정제, 캡슐 등)으로 또는 주사 가능한 것(예를 들어 액체 용액 또는 현탁액)으로 제조될 수 있다. 주입 전에 액체 비히클에 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태(예를 들어 약학적 조성물이 동결건조된 형태)도 사용할 수 있다.

주사용(예를 들어 정맥, 피부 또는 피하 주사, 또는 통증 부위에 주사) 활성 성분은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태로 제공될 수 있다. 필요에 따라 방부제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 포함될 수 있다.

조성물은 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 일부 실시예에서, 담체(들)은 미립자이므로 조성물은 예를 들어 정제 또는 분말 형태이다. 담체(들)는 액체일 수 있고, 조성물은 예를 들어 흡입 투여에 유용한 경구용 오일, 주사액 또는 에어로졸일 수 있다. 경구 투여용으로 의도된 경우, 제약 조성물은 바람직하게는 고체 또는 액체 형태이고, 여기서 반고체, 반액체, 현탁액 및 겔 형태는 본원에서 고체 또는 액체로 간주되는 형태 내에 포함된다.

경구 투여를 위한 고형 조성물로서, 약학적 조성물은 산제, 과립제, 압축 정제, 환제, 캡슐제, 츄잉검, 웨이퍼 등으로 제제화될 수 있다. 이러한 고체 조성물은 전형적으로 하나 이상의 불활성 희석제 또는 식용 담체를 함유할 것이다. 또한, 하기 중 하나 이상이 존재할 수 있다: 카복시메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분, 유당 또는 덱스트린과 같은 부형제, 알긴산, 알긴산나트륨, 프리모겔, 옥수수 전분 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 Sterotex와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 유동화제; 자당 또는 사카린과 같은 감미제; 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료와 같은 향료; 및 착색제. 조성물이 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐의 형태인 경우, 상기 유형의 물질 이외에 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다.

조성물은 액체, 예를 들어 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 두 가지 예로서 경구 투여용 또는 주사 전달용일 수 있다. 경구 투여용으로 의도된 경우, 바람직한 조성물은 본 화합물 이외에 하나 이상의 감미제, 방부제, 염료/착색제 및 향미 증강제를 함유한다. 주사 투여용 조성물에는 계면활성제, 방부제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정제 및 등장화제 중 하나 이상이 포함될 수 있다.

액상 약학 조성물은 용액, 현탁액 또는 기타 유사 형태에 관계없이 다음 보조제 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용수, 식염수, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질로 작용할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세리드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매와 같은 멸균 희석제 ; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장성 조절제. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만든 다회 용량 바이알에 동봉할 수 있다. 생리식염수가 바람직한 보조제이다. 주사가능한 약학적 조성물은 바람직하게는 무균이다.

비경구 또는 경구 투여를 위한 액체 조성물은 적절한 투여량이 얻어질 수 있는 양의 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편을 함유해야 한다. 전형적으로, 이 양은 조성물 중 항체 또는 항원 결합 단편의 적어도 0.01%이다. 경구 투여를 의도하는 경우, 이 양은 조성물 중량의 0.1 내지 약 70%로 다양할 수 있다. 특정 경구 약학 조성물은 약 4% 내지 약 75%의 항체 또는 항원 결합 단편을 함유한다. 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 제약 조성물 및 제제는 비경구 투여 단위가 희석 전에 0.01 내지 10 중량%의 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하도록 제조된다.

조성물은 국소 투여용일 수 있으며, 이 경우 담체는 용액, 에멀젼, 연고 또는 겔 베이스를 적합하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 베이스는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀랍, 광유, 물 및 알코올과 같은 희석제, 유화제 및 안정제. 증점제는 국소 투여용 조성물에 존재할 수 있다. 경피 투여를 의도하는 경우, 조성물은 경피 패치 또는 이온영동 장치를 포함할 수 있다. 제약 조성물은 예를 들어 직장에서 녹아 약물을 방출할 좌약의 형태로 직장 투여용으로 의도될 수 있다. 직장 투여용 조성물은 적합한 비자극성 부형제로서 유지성 기제를 함유할 수 있다. 이러한 염기에는 라놀린, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

조성물은 고체 또는 액체 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 활성 성분 주위에 코팅 쉘을 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅 쉘을 형성하는 물질은 일반적으로 불활성이며, 예를 들어 설탕, 셸락 및 기타 장용 코팅제에서 선택될 수 있다. 또는 활성 성분을 젤라틴 캡슐에 넣을 수 있다. 고체 또는 액체 형태의 조성물은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 결합하여 화합물의 전달을 돕는 작용제를 포함할 수 있다. 이러한 능력으로 작용할 수 있는 적합한 제제는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 하나 이상의 단백질 또는 리포좀을 포함한다. 조성물은 본질적으로 에어로졸로서 투여될 수 있는 투여 단위로 구성될 수 있다. 에어로졸이라는 용어는 콜로이드 특성에서 가압 패키지로 구성된 시스템에 이르는 다양한 시스템을 나타내는 데 사용된다. 전달은 액화 또는 압축 가스 또는 활성 성분을 분배하는 적절한 펌프 시스템을 통해 이루어질 수 있다. 에어로졸은 활성 성분(들)을 전달하기 위해 단상, 2상 또는 3상 시스템으로 전달될 수 있다. 에어로졸의 전달에는 함께 키트를 형성할 수 있는 필요한 용기, 활성기, 밸브, 하위 용기 등이 포함된다. 당업자는 과도한 실험 없이 바람직한 에어로졸을 결정할 수 있다.

본 개시내용의 조성물은 또한 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 대한 담체 분자(예를 들어, 지질 나노입자, 나노스케일 전달 플랫폼 등)를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

특정 실시예에서, 조성물은 제1 플라스미드를 포함하는 제1 벡터, 및 제2 플라스미드를 포함하는 제2 벡터를 포함하고, 여기서 제1 플라스미드는 중쇄 VH 또는 VH+CH를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 플라스미드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 동족 경쇄 VL 또는 VL+CL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시예에서, 조성물은 적합한 전달 비히클 또는 담체에 결합된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)를 포함한다. 인간 대상체에게 투여하기 위한 예시적인 비히클 또는 담체는 지질 또는 지질 유래 전달 비히클(리포좀, 고체 지질 나노입자, 유성 현탁액, 서브미크론 지질 에멀젼, 지질 미세기포, 역 지질 미셀, 달팽이관 리포좀, 지질 미세소관, 지질 미세실린더 또는 지질 나노입자(LNP) 또는 나노스케일 플랫폼과 같은)을 포함한다(예를 들어, Li et al. Wilery Interdiscip Rev. 나노메드 나노바이오테크놀러지. 11(2):e1530 (2019)).참조). 적절한 mRNA를 설계하고 mRNA-LNP를 제형화하고 이를 전달하기 위한 원리, 시약 및 기법은 예를 들어, Pardi et al. (J Control Release 217345-351 (2015)); Thess et al. (Mol Ther 23: 1456-1464 (2015)); Thran et al. (EMBO Mol Med 9(10):1434-1448 (2017); Kose et al. (Sci. Immunol. 4 eaaw6647 (2019); 및 Sabnis et al. (Mol. Ther. 26:1509-1519 (2018))에 설명되어 있으며, 캡핑, 코돈 최적화, 뉴클레오시드 변형, mRNA의 정제, 안정한 지질 나노입자(예를 들어, 이온화 가능한 양이온성 지질/포스파티딜콜린/콜레스테롤/PEG-지질; 이온화 가능한 지질:디스테아로일 PC:콜레스테롤:폴리에틸렌 글리콜 지질)로의 mRNA의 혼입 및 이들의 피하, 근육내, 진피내, 정맥내, 복강내 및 기관내 투여를 포함하는 기술은 본원에 참조로 포함된다.

약학적 조성물은 약학 분야에 잘 알려진 방법론에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사 투여용 조성물은 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 합성물 및 임의로 하나 이상의 염, 완충제 및/또는 안정화제를 멸균 증류수와 함께 포함하여 용액을 형성하는 조성물을 조합하여 제조할 수 있다. 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 촉진하기 위해 계면활성제를 첨가할 수 있다. 계면활성제는 수성 전달 시스템에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용해 또는 균질 현탁을 용이하게 하기 위해 펩티드 조성물과 비공유적으로 상호작용하는 화합물이다.

그것이 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산 분자, 세포 또는 개체에게 제공되는 본 발명에 따른 다른 약학적으로 유용한 화합물이든 간에, 투여는 일반적으로 (경우에 따라) "예방적 유효량" 또는 "치료적 유효량" 또는 "유효량"이며, 이는 개인에게 이점 (예: 임상 결과 개선, 질병과 관련된 증상의 경감 또는 완화, 증상 발생 감소, 삶의 질 개선, 무병 상태 연장, 질병 범위 감소, 질병 상태의 안정화, 질병 진행 지연, 차도(remission), 생존 또는 통계적으로 유의한 방식으로 연장된 생존)을 나타내기에 충분하다. 단독으로 투여되는 개별 활성 성분을 언급할 때, 치료 유효량은 해당 성분 또는 해당 성분만을 발현하는 세포의 효과를 의미한다. 조합을 언급할 때, 치료적 유효량은 연속적으로, 순차적으로 또는 동시에 투여되든 상관없이 치료 효과를 나타내는 활성 성분을 발현하는 세포와 활성 성분 또는 조합된 보조 활성 성분의 조합된 양을 의미한다.

조성물은 유효량으로 투여되고(예를 들어, SARS-CoV-2 감염을 치료하기 위해), 이는 사용된 특정 화합물의 활성을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다; 화합물의 대사 안정성 및 작용 시간; 피험자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 방식 및 시간; 배설 속도; 약물 조합; 특정 장애 또는 상태의 중증도; 및 치료를 받고 있는 대상체. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 제제 및 방법에 따른 요법의 투여를 허용하면, 테스트 대상은 위약 치료 또는 다른 적합한 대조군 대상과 비교하여 치료되는 질병 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상에서 약 10% 내지 약 99% 감소를 나타낼 것이다.

일반적으로, 항체 또는 항원 결합 단편의 치료학적으로 유효한 일일 투여량은 (70kg 포유동물의 경우) 약 0.001mg/kg(즉, 0.07mg) 내지 약 100mg/kg(즉, 7.0g)이고; 바람직하게는 치료적 유효 용량은 (70kg 포유동물의 경우) 약 0.01mg/kg(즉, 0.7mg) 내지 약 50mg/kg(즉, 3.5g)이고; 보다 바람직하게는 치료적 유효 용량은 (70kg 포유동물의 경우) 약 1mg/kg(즉, 70mg) 내지 약 25mg/kg(즉, 1.75g)이다. 항체 또는 항원-결합 단편에 대한 다른 용량이 본원에서 제공된다.

본 개시내용의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 및 관련 조성물의 경우, 치료 유효량은 항체 또는 항원 결합 단편의 경우와 상이할 수 있다.

투여되는 실제 양, 투여 속도 및 시간 경과는 치료되는 것의 특성 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 주사를 위해, 본 개시내용에 따른 약학적 조성물은 예를 들어 사전충전형 주사기(pre-filled syringe)에 제공될 수 있다.

본원에 개시된 제약 조성물은 또한 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 경구적으로 허용되는 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우 통상적으로 사용되는 담체는 유당 및 옥수수 전분이다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제도 일반적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해 유용한 희석제는 락토스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 경구 사용을 위해 수성 현탁액이 필요한 경우, 활성 성분, 즉 상기 정의된 본 발명의 수송체 화물 접합체 분자는 유화제 및 현탁제와 조합된다. 원하는 경우 특정 감미료, 착향료 또는 착색제를 첨가할 수도 있다.

본 설명에 따른 약학적 조성물은 또한 특히 치료의 표적이 예를 들어 피부 또는 임의의 다른 접근 가능한 상피 조직의 질병을 포함하여 국소 적용에 의해 쉽게 접근 가능한 영역 또는 기관을 포함할 때 국소적으로 투여될 수 있다. 적합한 국소 제제는 이러한 영역 또는 기관 각각에 대해 쉽게 제조된다. 국소 적용을 위해, 제약 조성물은 하나 이상의 담체에 현탁되거나 용해된 본 발명의 제약 조성물, 특히 상기 정의된 이의 성분을 함유하는 적합한 연고로 제제화될 수 있다. 국소 투여용 담체는 광유, 액상 바셀린, 화이트 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

대안적으로, 약학적 조성물은 적합한 로션 또는 크림으로 제형화될 수 있다. 본 명세서의 맥락에서, 적합한 담체는 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

복용량은 체중과 관련하여 표현될 수 있다. 따라서 "체중(bodyweight)" 또는 "체중(body weight)"이라는 용어가 명시적으로 언급되지 않더라도 [g, mg 또는 기타 단위]/kg(또는 g, mg 등)으로 표시되는 용량은 일반적으로 "kg(또는 g, mg 등) 체중당" [g, mg 또는 기타 단위]을 나타낸다.

특정 실시예에서, 단일 용량(예를 들어 일일, 주간 또는 월간 복용량)에서, 제약 조성물 중 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 양은 1g을 초과하지 않는다. 이러한 특정 실시예에서, 단일 용량은 500 mg, 250 mg, 100 mg 및 50 mg으로부터 선택된 용량을 초과하지 않는다. 투여량의 추가 실시예가 본원에 제공된다.

특정 실시예에서, 방법은 대상체에게 항체, 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물을 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 이상 투여하는 것을 포함한다.

특정 실시예에서, 방법은 항체, 항원 결합 단편 또는 조성물을 대상체에게 복수회 투여하는 것을 포함하며, 여기서 2차 또는 연속 투여는 각각 1차 또는 이전 투여 후 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 24, 약 48, 약 74, 약 96시간, 또는 그 이상에 수행된다.

특정 실시예에서, 방법은 대상체 투여 전에 적어도 1회 항체, 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 항체, 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물을 포함하는 조성물은 또한 하나 이상의 다른 치료제의 투여와 동시에, 투여 전 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 이러한 병용 요법은 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 추가 활성제를 함유하는 단일 약학적 투여 제형의 투여뿐만 아니라, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편 및 각각의 활성제를 자체의 개별 투여 제형으로 포함하는 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 다른 활성제는 정제 또는 캡슐과 같은 단일 경구 투여 조성물로 함께 환자에게 투여될 수 있거나, 각각의 제제는 별도의 경구 투여 제형으로 투여될 수 있다. 유사하게, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편 및 다른 활성제는 식염수 또는 다른 생리학적으로 허용되는 용액과 같은 단일 비경구 투여 조성물로 대상체에게 함께 투여될 수 있거나, 각각의 제제는 별도의 비경구 투여 제형으로 투여될 수 있다. 별도의 투여 제형이 사용되는 경우, 항체 또는 항원-결합 단편 및 하나 이상의 추가 활성제를 포함하는 조성물은 본질적으로 동시에, 즉 동시에, 또는 별도로 엇갈린 시간에, 즉 순차적으로 임의의 순서로 투여될 수 있다; 병용 요법은 이러한 모든 요법을 포함하는 것으로 이해된다.

일부 실시예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물 또는 키트는 추가로 다음을 포함한다: (i) 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 텔비부딘, 테노포비르 또는 이들의 조합을 선택적으로 포함하는 폴리머라제 억제제; (ii) 임의로 IFN베타 및/또는 IFN알파를 포함하는 인터페론; (iii) 체크포인트 억제제, 여기서 체크포인트 억제제는 임의로 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및/또는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편; (iv) 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제; 또는 (v) (i)-(iv)의 조합. 일부 실시예에서, 키트는 본원에 기술된 바와 같은 조성물 또는 조합물을 포함하고, B형 간염 감염 및/또는 D형 간염 감염을 예방, 치료, 약화 및/또는 진단하기 위해 성분을 사용하기 위한 지침서를 추가로 포함한다.

특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성 (예를 들어, 항체, 항원 결합 단편, 숙주 세포, 핵산, 벡터 또는 약학적 조성물)은 PD-1 억제제, 예를 들어 PD-1-특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 피딜리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, MEDI0680 (이전 AMP-514), AMP-224, BMS-936558, 또는 이들의 조합과 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 PD-L1 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 BMS-936559, 더발루맙(MEDI4736), 아테졸리주맙(RG7446), 아벨루맙(MSB0010718C), MPDL3280A, 또는 이들의 조합과 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 LAG525, IMP321, IMP701, 9H12, BMS-986016 또는 이들의 임의의 조합과 같은 LAG3 억제제와 조합하여 사용된다.

특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 CTLA4의 억제제와 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 CTLA4 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 이필리무맙, 트레멜리무맙, CTLA4-Ig 융합 단백질(예를 들어, 아바타셉트, 벨라타셉트), 또는 이들의 임의의 조합과 함께 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 B7-H3 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 에노블리투주맙(MGA271), 376.96 또는 둘 다와 조합하여 사용된다. 항-B7-H3 항체 결합 단편은, 예를 들어, Dangaj et al., Cancer Res. 73:4820, 2013, 뿐만 아니라 미국 특허 번호 9,574,000 및 PCT 특허 공개 번호 WO /201640724A1 및 WO 2013/025779A에 기술된 바와 같이 scFv 또는 이를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.

특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 CD244의 억제제와 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 BLTA, HVEM, CD160의 억제제 또는 이들의 임의의 조합과 조합하여 사용된다. 항 CD-160 항체는 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2010/084158에 기술되어 있다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 TIM3의 억제제와 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 Gal9의 억제제와 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 유인 아데노신 수용체와 같은 아데노신 신호 전달 억제제와 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 A2aR의 억제제와 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 리릴루맙(BMS-986015)과 같은 KIR의 억제제와 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 억제성 사이토카인(전형적으로, TGFβ 이외의 사이토카인) 또는 Treg 발달 또는 활성의 억제제와 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 IDO 억제제, 예컨대 레보-1-메틸 트립토판, 에파카도스타트 (INCB024360; Liu et al., Blood 115:3520-30, 2010), 엡셀렌 (Terentis et al., Biochem. 49:591-600, 2010), 인독시모드, NLG919 (Mautino et al., 미국 암 연구 협회 104차 연례 회의 2013; Apr 6-10, 2013), 1-메틸-트립토판(1-MT)-티라-파자민, 또는 이들의 임의의 조합과 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 아르기나제 억제제, 예컨대 N(오메가)-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME), N-오메가-하이드록시-노르-l-아르기닌 (노르-NOHA), L-NOHA, 2(S)-아미노-6-보로노헥산산 (ABH), S-(2-보로노에틸)-L-시스테인 (BEC), 또는 이들의 임의의 조합과 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 CA-170(Curis, Lexington, MA)과 같은 VISTA의 억제제와 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 TIGIT의 억제제, 예를 들어 COM902(Compugen, Toronto, Ontario Canada), CD155의 억제제, 예를 들어 COM701(Compugen), 또는 둘 다와 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 PVRIG, PVRL2, 또는 둘 다의 억제제와 조합하여 사용된다. 항-PVRIG 항체는 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2016/134333에 기재되어 있다. 항-PVRL2 항체는 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2017/021526에 기재되어 있다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 LAIR1 억제제와 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, 또는 이들의 임의의 조합의 억제제와 조합하여 사용된다.

특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물은 자극성 면역 체크포인트 분자의 활성을 증가시키는(즉, 효능제임) 작용제와 조합하여 사용된다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물은 다음과 조합하여 사용될 수 있다: CD137(4-1BB) 효능제(예를 들어, 우렐루맙), CD134(OX-40) 효능제(예를 들어, MEDI6469, MEDI6383 또는 MEDI0562), 레날리도마이드, 포말리도마이드, CD27 효능제(예를 들어, CDX-1127), CD28 작용제(예를 들어 TGN1412, CD80 또는 CD86), CD40 작용제(예를 들어 CP-870,893, rhuCD40L 또는 SGN-40), CD122 작용제(예를 들어, IL-2), GITR의 작용제(예를 들어, PCT 특허 공개 번호 WO 2016/054638에 기재된 인간화 모노클로날 항체), ICOS(CD278)의 작용제(예를 들어, GSK3359609, mAb 88.2, JTX-2011, Icos 145-1, Icos 314-8, 또는 이들의 조합).

본원에 개시된 실시예 중 임의의 것에서, 방법은 임의의 전술한 것을 포함하는 자극성 면역 체크포인트 분자의 하나 이상의 작용제와 함께 본 개시내용의 조성물을 단독으로 또는 임의의 조합으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 개시내용에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은 추가 활성 성분 또는 항체, 항원 결합 단편과 동일한 약학적 조성물에 존재할 수 있으며, 또는 본 개시내용에 따른 융합 단백질은 제1 약학적 조성물에 포함될 수 있고 추가 활성 성분은 제1 약학적 조성물과 상이한 제2 약학적 조성물에 포함될 수 있다.

용도

추가 측면에서, 본 개시내용은 (i) B형 간염 및/또는 D형 간염의 예방, 치료 또는 약화 또는 (ii) B형 간염 및/또는 D형 간염(예를 들어, 인간 대상에서) 진단에 있어서 본원의 개시에 따른 항체의 사용 방법, 항원 결합 단편, 융합 단백질, 핵산, 벡터, 세포, 약학적 조성물, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편과 본원에 개시된 HBV 단백질 발현 억제제의 조합, 전달 시스템(예: RNAi 작용제) 또는 키트를 제공한다.

진단 방법(예를 들어, 시험관 내, 생체 외)은 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 융합 단백질을 샘플과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 샘플은 피험자로부터 분리될 수 있으며, 예를 들어 비강(nasal passages), 부비강(sinus cavities), 침샘(salivary glands), 폐, 간, 췌장(pancreas), 신장, 귀, 눈, 태반(placenta), 소화관(alimentary tract), 심장, 난소(ovaries), 뇌하수체(pituitary), 부신(adrenals), 갑상선(thyroid), 뇌, 피부 또는 혈액에서 채취한 분리된 조직 샘플이다. 진단 방법은 또한 특히 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질을 샘플과 접촉시킨 후에 항원/항체 또는 항원/융합 단백질 복합체의 검출을 포함할 수 있다. 이러한 검출 단계는 일반적으로 작업대에서, 즉 인체나 동물의 신체에 접촉하지 않고 수행된다. 검출 방법의 예는 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 ELISA(효소 결합 면역흡착 검정)를 포함한다.

본 개시는 또한 다음의 사용도를 제공한다: (i) 본 개시내용에 따른 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 또는 이의 변이체 및 유도체, (ii) 본 개시내용에 따른 숙주 세포(불멸화 B 세포일 수 있음), (iii) 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터, (iv) 본 발명의 약학적 조성물 또는 (v) (a) B형 간염 및/또는 D형 간염의 예방, 치료 또는 약화 또는 (b) B형 간염 및/또는 D형 간염 진단을 위한 약제의 제조에서, 예를 들어, 본원에 개시된 HBV 단백질 발현 억제제 및 전달 시스템(예를 들어, RNAi 작용제)을 갖는 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 조합.

본원에서 사용되는 용어 "질병(disease)"은 일반적으로 인간이나 동물의 신체 또는 정상적인 기능을 손상시키는 부분 중 하나의 비정상적인 상태를 반영하고 일반적으로 뚜렷한 징후와 증상으로 나타나며 영향을 받은 인간이나 동물의 수명이나 삶의 질을 감소시키는 "장애(disorder)" 및 "상태(condition)" (의학적 상태에서와 같은) 라는 용어와 동의어로 의도되고 상호 교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 대상 또는 환자의 "치료"에 대한 언급은 예방, 예방, 약화, 개선 및 요법을 포함하는 것으로 의도되며, 대상의 질병, 장애 또는 상태의 의학적 관리를 의미한다. 치료의 이점에는 향상된 임상 결과가 포함될 수 있다; 질병과 관련된 증상의 경감 또는 완화; 증상 발생 감소; 삶의 질 향상; 더 긴 무병 상태; 질병 정도의 감소; 질병 상태의 안정화; 질병 진행 지연; 경감(remission); 살아남음(survival); 장기간 생존; 또는 이들의 조합. 용어 "대상체" 또는 "환자"는 인간을 포함하는 모든 포유동물을 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 대상의 예로는 인간, 소, 개, 고양이, 말, 염소, 양, 돼지 및 토끼가 있다. 특정 실시예에서, 환자는 인간이다. 대상은 남성 또는 여성일 수 있고 유아, 청소년, 청소년, 성인 및 노인 대상을 포함하는 임의의 적합한 연령일 수 있다.

본 개시내용은 또한 본 개시내용에 따른 항체, 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질, 본 개시내용에 따른 핵산, 본 개시내용에 따른 벡터, 본 개시내용에 따른 세포, 및 /또는 B형 간염 및/또는 D형 간염의 예방 또는 치료를 위한 약제로서 사용하기 위한 본 개시내용의 HBV 단백질 발현 및 전달 시스템(예를 들어, RNAi 작용제)의 현재 개시된 억제제와의 조합(예를 들어, 현재 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 조합)을 제공한다. 또한 대상의 치료 및/또는 대상의 진단을 위한 약제의 제조에 있어서 본 개시내용의 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질의 용도를 제공한다. 또한 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 조합물을 투여하는 것을 포함하는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 대상은 인간일 수 있다. 치료적 치료의 효능을 확인하는 한 가지 방법은 조성물 투여 후 질병 증상을 모니터링하는 것을 포함한다. 치료는 단일 투여 일정 또는 다중 투여 일정일 수 있다.

한 실시예에서, 본 개시내용에 따른 항체, 항원 결합 단편, 융합 단백질, 숙주 세포(예를 들어, 불멸화 B 세포 클론, 또는 융합 단백질을 발현하는 T 세포, NK-T 세포 또는 NK 세포), 제약 조성물 또는 조합물은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 이러한 대상체는 특히 B형 간염 및/또는 D형 간염에 걸릴 위험이 있거나 감염되기 쉬운 사람을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 약학적 조성물 및 이들의 조합은 또한 B형 간염 및/또는 D형 간염의 예방, 치료, 약화(attenuation) 및/또는 진단을 위한 키트에 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 키트는 B형 간염 감염 및/또는 D형 간염 감염을 예방, 치료, 약화 및/또는 진단하기 위해 구성요소를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 개시내용의 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질에 결합할 수 있는 HBsAg의 항원성 루프 영역 내의 에피토프는 보호(protective) 항-HBV 항체의 존재를 검출하거나 역가(titer)를 결정함으로써 적용 절차(application procedures)의 효능을 모니터링하기 위한 키트에 사용될 수 있다.

특정 실시예에서, 본 개시내용의 조성물 또는 키트는 추가로 하기를 포함한다: 중합효소 억제제, 여기서 중합효소 억제제는 선택적으로 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 텔비부딘, 테노포비르, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고; (ii) 임의로 IFN베타 및/또는 IFN알파를 포함하는 인터페론; (iii) 체크포인트 억제제, 여기서 체크포인트 억제제는 임의로 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및/또는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다; (iv) 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제; 또는 (v) (viii)-(xii)의 조합.

일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 약학적 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 HBV 단백질 발현 및 전달 시스템(예를 들어, RNAi 작용제)의 본 발명에 개시된 억제제와의 조합(예를 들어, 본 발명에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 조합)은 만성 B형 간염 감염의 치료 또는 약화에 사용된다.

특정 실시예에서, 본 개시내용에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은 (i) HBV 감염을 중화시키고, (ii) L-HBsAg(감염성 HBV 입자에 존재하는 큰 HBV 외피 단백질)에 결합하고, 따라서 HBV의 확산을 방지하고, (iii) S-HBsAg에 결합하여 서브바이러스 입자(SVP)의 제거를 촉진하고/하거나 (iv) 혈청전환, 즉 바이러스에 대한 활성 면역 반응을 유도할 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포, 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물은 특히 B형 간염 유발 간부전에 대해 간 이식 후 B형 간염 (재)감염의 예방에 사용될 수 있다.

추가 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 약학적 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 HBV 단백질 발현 및 전달 시스템(예를 들어, RNAi 작용제)의 본 발명에 개시된 억제제와의 조합(예를 들어, 본 발명에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 조합)은 면역화되지 않은 피험자에서 B형 간염의 예방(prevention)/예방(prophylaxis)에 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어 HBV(노출 후 예방)에 우발적으로 노출된 경우이다. "면역화되지 않은 피험자"라는 용어는 백신 접종을 받은 적이 없으므로 면역화되지 않은 피험자와 백신 접종 후 면역 반응(예: 측정 가능한 항-B형 간염 항체가 없음)을 나타내지 않은 피험자를 포함한다.

일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 약학적 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 HBV 단백질 발현 및 전달 시스템(예를 들어, RNAi 작용제)의 본 발명에 개시된 억제제와의 조합(예를 들어, 본 발명에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 조합)은 혈액 투석 환자의 B형 간염 예방에 사용된다.

일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 약학적 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 HBV 단백질 발현 및 전달 시스템(예를 들어, RNAi 작용제)의 본 발명에 개시된 억제제와의 조합(예를 들어, 본 발명에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 조합)은 신생아의 B형 간염 예방에 사용된다. 이러한 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 약학적 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 HBV 단백질 발현 및 전달 시스템(예를 들어, RNAi 작용제)의 본 발명에 개시된 억제제와의 조합(예를 들어, 본 발명에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 조합)은 출생 시 또는 출생 후 가능한 한 빨리 투여할 수 있다. 상기 투여는 백신접종 후 혈청전환될 때까지 반복될 수 있다.

또한, 본 발명은 B형 간염 및/또는 D형 간염의 진단(예: 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내)에 있어서 본 발명에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포, 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

또한, 분리된 혈액 샘플이 B형 간염 바이러스 및/또는 델타 간염 바이러스에 감염되었는지 여부를 결정하는 데 있어서 본 발명에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포, 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

전술한 바와 같이, 진단 방법은 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질을 샘플과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 샘플은 피험자로부터 분리될 수 있으며, 예를 들어 비강, 부비강, 침샘, 폐, 간, 췌장, 신장, 귀, 눈, 태반, 소화관, 심장, 난소, 뇌하수체, 부신, 갑상선, 뇌, 피부 또는 혈액에서 채취한 분리된 조직 샘플이다. 진단 방법은 또한 특히 항체 또는 항체 단편을 샘플과 접촉시킨 후에 항원/항체 복합체의 검출을 포함할 수 있다. 이러한 검출 단계는 일반적으로 작업대(bench)에서, 즉 인체나 동물의 신체에 접촉하지 않고 수행된다. 검출 방법의 예는 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 ELISA(효소 결합 면역흡착 검정)를 포함한다.

본 발명은 또한 대상체에서 B형 간염 및/또는 D형 간염을 치료, 예방 및/또는 약화시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 본 발명에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 약학적 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 HBV 단백질 발현 및 전달 시스템(예를 들어, RNAi 작용제)의 본 발명에 개시된 억제제와의 조합(예를 들어, 본 발명에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 조합)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시예에서, 방법은 대상체에게 다음 중 하나 이상을 투여하는 것을 추가로 포함한다: (vii) 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 텔비부딘, 테노포비르 또는 이들의 조합을 선택적으로 포함하는 폴리머라제 억제제; (viii) 임의로 IFN베타 및/또는 IFN알파를 포함하는 인터페론; (ix) 체크포인트 억제제, 여기서 체크포인트 억제제는 임의로 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및/또는 항-CTLA4 항체 또는 이의의 항원 결합 단편을 포함한다; (x) 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제; 또는 (xi) (vii)-(x)의 조합.

일부 실시예에서, B형 간염 감염은 만성 B형 간염 감염이다. 일부 실시예에서, 대상체는 간 이식을 받았다. 일부 실시예에서, 대상체는 B형 간염에 대해 면역화되어 있지 않다. 특정 실시예에서, 대상체는 신생아이다. 일부 실시예에서, 피험자는 혈액투석을 받고 있거나 받았었다.

본 발명은 또한 간 이식을 받은 대상체에게 본 발명에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 약학적 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 HBV 단백질 발현 및 전달 시스템(예를 들어, RNAi 작용제)의 본 발명에 개시된 억제제와의 조합(예를 들어, 본 발명에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 조합)의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 간 이식을 받은 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 항-B형 간염 및/또는 항-D형 간염 백신에서 정확한 형태의 에피토프의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은: (i) 백신을 본 개시내용 중 어느 하나의 항체, 항원-결합 단편 또는 융합 단백질과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 항원과 항체를 포함하거나, 항원과 항원 결합 단편을 포함하거나, 항원과 융합 단백질을 포함하는 복합체가 형성되었는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "백신"은 전형적으로 면역원과 같은 적어도 하나의 항원을 제공하는 예방 또는 치료 물질로 이해된다. 항원 또는 면역원은 백신접종에 적합한 임의의 물질로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 항원 또는 면역원은 박테리아 입자, 바이러스 입자, 종양(고체 또는 액체 종양 포함) 또는 기타 암 조직과 같은 병원체에서 유래할 수 있다. 항원 또는 면역원은 신체의 적응 면역 체계를 자극하여 적응 면역 반응을 제공한다. 특정 실시예에서, "항원" 또는 "면역원"은 면역계에 의해(예를 들어 적응 면역 체계에 의해) 인식될 수 있고, 항원-특이적 면역 반응을 촉발(예를 들어 적응 면역 반응의 일부로서 항체 및/또는 항원 특이적 T 세포의 형성에 의해)할 수 있는 물질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 항원은 MHC 복합체(예를 들어, MHC 클래스 I; MHC 클래스 II)에 의해 T 세포에 제시될 수 있는 펩티드 또는 단백질일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 항원은 HBV 및/또는 HBD 항원; 예를 들어, HBsAg 항원을 포함한다.

본 개시내용의 일부 실시예는 하기를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 만성 HBV 감염 또는 HBV-연관 질환을 치료하는 방법을 제공한다: (i) 대상체에게 HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제를 투여하는 단계; 및 (ii) 대상에게 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 단계. 특정 실시예에서, HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제는 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편 전에 투여된다. 특정 실시예에서, 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편 전에 HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제를 투여하는 것은 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 투여될 때 바이러스 부하가 감소되게 한다. 특정 실시예에서, 병용 요법의 항-HBV 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료 유효량은 HBV 항원 부하를 감소시키는 제제가 피험자에게 투여되지 않은 경우 (예를 들어, 항-HBV 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 단일 요법으로 단독 투여되는 경우) 전달되는 항-HBV 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료 유효량 미만이다. 일부 실시예에서, HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제는 HBV 전사체의 발현을 억제하는 RNAi 작용제(예를 들어, siRNA)이다.

특정 실시예에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 만성 HBV 감염 또는 HBV-관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다: 대상체에게 HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제를 투여하는 단계; 및 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 피험자에게 투여하는 단계; 및 HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제를 투여하기 전후에 대상체로부터의 혈액 샘플에 존재하는 HBsAg의 양을 측정하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 HBsAg의 감소는 적어도 하나의 HBV 유전자의 감소된 발현을 나타낸다.

특정 실시예에서, 본 발명은 대상체에서 만성 HBV 감염 또는 HBV-관련 질환의 치료에 사용하기 위한 HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제를 제공하며, 여기서 대상체는 후속적으로 항-HBV 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여받는다. 특정한 다른 실시예에서, 본 발명은 대상체에서 만성 HBV 감염 또는 HBV-관련 질환의 치료에 사용하기 위한 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 대상은 이전에 HBV 항원 부하를 감소시키는 제제를 투여받았다. 추가 실시예에서, 적어도 하나의 HBV 유전자의 발현은 HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제의 투여 후에 감소되며, 항-HBV 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 HBV 유전자의 발현이 감소될 때 대상체에게 투여된다.

특정 실시예에서, 본 발명은 만성 HBV 감염 또는 HBV-관련 질병 치료용 약제의 제조에 있어서 HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제 및/또는 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.

본 발명의 일부 실시예는 하기를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 만성 HBV 감염 또는 HBV-관련 질병을 치료하는 방법을 제공한다: (i) 대상체에게 HBV 유전자 발현 억제제를 투여하는 단계; 및 (ii) 대상에게 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 단계. 특정 실시예에서, HBV 유전자 발현의 억제제는 항-HBV 항체 전에 투여된다. 특정 실시예에서, 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편 전에 HBV 유전자 발현 억제제를 투여하는 것은 항-HBV 항체가 투여될 때 바이러스 부하가 감소되게 한다. 특정 실시예에서, 병용 요법의 항-HBV 항체의 치료 유효량은 HBV 유전자 발현 억제제가 대상체에게 투여되지 않았을 때(예를 들어, 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 단일요법으로서 단독으로 투여되는 경우) 전달되는 항-HBV 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료 유효량보다 적다.

특정 실시예에서, 적어도 하나의 HBV 유전자의 발현은 HBV 유전자 발현의 억제제를 투여한 후 감소되고, 항-HBV 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 HBV 유전자의 발현이 감소될 때 대상체에게 투여된다. 특정 실시예에서, 적어도 하나의 HBV 유전자는 HBV X 유전자 및/또는 HBsAg이다.

특정 실시예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 만성 HBV 감염 또는 HBV-관련 질병을 치료하는 방법을 제공한다: 대상체에게 HBV 유전자 발현 억제제를 투여하는 단계; 및 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 피험자에게 투여하는 단계; 및 HBV 발현 억제제를 투여하기 전후에 대상체로부터의 혈액 샘플에 존재하는 HBsAg의 양을 측정하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 HBsAg의 감소는 적어도 하나의 HBV 유전자의 감소된 발현을 나타낸다.

특정 실시예에서, 본 발명은 대상체에서 만성 HBV 감염 또는 HBV-관련 질병의 치료에 사용하기 위한 HBV 유전자 발현의 억제제를 제공하고, 여기서 대상체는 후속적으로 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여받는다. 특정한 다른 실시예에서, 본 발명은 대상체에서 만성 HBV 감염 또는 HBV-관련 질환의 치료에 사용하기 위한 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 대상체는 이전에 유전자 발현 억제제를 투여받았다. 추가 실시예에서, HBV 유전자 발현 억제제의 투여 후 적어도 하나의 HBV 유전자의 발현이 감소되며, 항-HBV 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 HBV 유전자의 발현이 감소될 때 대상체에게 투여된다.

특정 실시예에서, 본 발명은 만성 HBV 감염 또는 HBV 관련 질병의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 HBV 유전자 발현 억제제 및/또는 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.

임의의 상기 방법, 사용을 위한 조성물, 또는 제조 용도에서, 방법 및 조성물은 만성 HBV 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

특정 실시예에서, HBV 유전자 발현 억제제는 단일 용량, 2회 용량, 3회 용량, 4회 용량 또는 5회 용량으로 투여된다. 특정한 특정 실시예에서, HBV 유전자 발현 억제제의 적어도 제1 용량은 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하기 전에 투여된다.

특정 실시예에서, HBV 유전자 발현 억제제는 단일 용량, 2회 용량, 3회 용량, 4회 용량, 또는 5회 용량, 6회 용량, 7회 용량 또는 8회 용량으로 투여된다. 용량 또는 용량들은 예를 들어, 1일 2회, 1일 1회, 2일마다, 3일마다, 주당 2회, 주당 1회, 격주로, 4주마다 또는 월 1회 투여될 수 있다.

특정 실시예에서, 항-HBV 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 것은 항-HBV 또는 이의 항원-결합 단편 항체를 주당 2회, 주당 1회, 격주로, 격주로, 또는 월 1회 투여하는 것을 포함한다.

특정 실시예에서, 항-HBV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 것은 항-HBV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량의 적어도 2회 용량을 투여하는 것을 포함한다. 특정 추가 실시예에서, 적어도 2회 용량은 주당 2회, 주당 1회, 격주로, 격주로, 또는 월 1회 투여된다.

특정 실시예에서, 항-HBV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여는 HBV 유전자 발현 억제제를 투여한 후 적어도 1주 후에 시작된다. 특정 실시예에서, 항-HBV 항체 투여는 HBV 유전자 발현 억제제 투여 2주 후에 시작된다. 특정 실시예에서, 항-HBV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여는 HBV 유전자 발현 억제제를 투여한 후 8주에 시작된다.

특정 실시예에서, 항-HBV 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 HBV 유전자 발현 억제제는 각각 피하 투여된다.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, 항-HBV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 HBV 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H, I, 및 J 를 인식할 수 있다.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, 항-HBV 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 HBsAg에 대한 제1 특이성 및 면역 이펙터를 자극하는 제2 특이성(예를 들어, 세포독성 또는 백신 효과를 자극하는 제2 특이성)을 갖는 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 본원에 개시된 상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 다른 실시예에서, 항-HBV 항체는 모노클로날 항체이다.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, 항-HBV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 본원에 개시된 바와 같은 HBC34의 비천연 변이체를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시예에서, 항 HBV 항체 (i) 서열번호 34에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 35 또는 36에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 및 서열번호 37에 따른 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 (ii) 서열번호 40-43 중 어느 하나에 기재된 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 45-53 중 어느 하나에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 서열번호 55 또는 56에 따른 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 여기서 CDR은 CCG 넘버링 시스템에 따라 결정되고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합할 수 있고 유전자형 D, A, B, C, E, F, G, H, I, 또는 J, 또는 이들의 임의의 조합의 B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염을 중화시킬 수 있다.

특정 실시예에서, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열은 다음의 서열 번호에 따른다: (i) 각각 34, 35, 37, 41, 45 및 55; (ii) 각각 34, 35, 37, 41, 46 및 55; (iii) 각각 34, 35, 37, 41, 47 및 55; (iv) 각각 34, 35, 37, 41, 48 및 55; (v) 각각 34, 35, 37, 41, 49 및 55; (vi) 각각 34, 35, 37, 41, 50 및 55; (vii) 각각 34, 35, 37, 41, 51 및 55; (viii) 각각 34, 35, 37, 41, 52 및 55; 또는 (ix) 각각 34, 35, 37, 41, 53 및 55.

특정 추가 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 여기서: (i) VH는 서열번호 38 또는 39에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% (즉, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 또는 그 사이의 정수가 아닌 값) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며; 및/또는 (ii) VL은 서열번호 58-66, 69, 71 또는 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% (즉, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 또는 그 사이의 정수가 아닌 값) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

일부 실시예에서, VH는 서열번호 38 또는 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며; 및/또는 VL은 서열번호 58-66, 69, 71 또는 72 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

특정 실시예에서, VH 및 VL은 다음 서열번호에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다: (i) 각각 38과 58; (ii) 각각 38 및 59; (iii) 각각 38 및 60; (iv) 각각 38 및 61; (v) 각각 38 및 62; (vi) 각각 38 및 63; (vii) 각각 38 및 64; (viii) 각각 38 및 65; (ix) 각각 38 및 66; (x) 각각 38 및 71; 또는 (xi) 각각 38 및 72.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다: 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL), 여기서 VH 및 VL은 서열번호 (i) 각각 38 및 67; 또는 (ii) 각각 38 및 68 에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합할 수 있고 유전자형 D, A, B, C, E, F, G, H, I, 또는 J, 또는 이의 임의의 조합의 B형 간염 바이러스(HBV) 에 의한 감염을 중화시킬 수 있다.

또한 각각 서열번호 57-72에 비해 프레임워크 영역 3에서 다음 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 서열번호 38 또는 39에 따른 VH 및 서열번호 57-72 중 어느 하나의 VL 변이체를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다. CCG 번호 매기기에 의해 결정됨: R60A, R60N, R60K, S64A, I74A. 일부 실시예에서, 각각 서열번호 57-72에 대한 추가 돌연변이는 변이체에 포함되지 않는다.

또한, 서열번호 38 또는 39에 따른 VH 및 Q78, D81 또는 둘 다에서 치환 돌연변이(예를 들어, 보존적 아미노산 치환 또는 생식계열 인코딩 아미노산에 대한 돌연변이)를 포함하는 서열번호 57-72 중 어느 하나의 VL 변이체를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다. 일부 실시예에서, 각각 서열번호 57-72에 대한 추가 돌연변이는 변이체에 포함되지 않는다.

본원에 개시된 임의의 실시예에서, 복수의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 샘플에서, 샘플이 약 40℃에서 약 120 내지 약 168시간 동안 인큐베이션되었을 때 다수의 12% 미만, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 또는 2% 이하가 항체 이량체에 포함되며, 여기서, 선택적으로, 항체 이량체의 존재는 절대 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정된다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체 이량체 또는 다량체는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 중 2개 이상을 포함하는 복합체이다(예를 들어, 항체:항체 이량체, Fab:Fab 이량체 또는 항체:Fab 이량체).

특정 실시예에서, 항-HBV 항체 또는 항원 결합 단편의 치료 유효량은 HBV 유전자 발현 억제제가 피험자에게 투여되지 않은 경우 전달되는 항-HBV 항체 또는 항원 결합 단편의 치료 유효량 미만이다. 예를 들어, 병용 요법은 항-HBV 항체 또는 항원-결합 단편의 단독 투여와 비교하여 항-HBV 항체 또는 항원-결합 단편의 유효 용량을 낮출 수 있다.

특정 실시예에서, 항-HBV 항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 2회 개별 용량으로 투여된다. 특정 실시예에서, 적어도 2회 용량은 주당 2회, 주당 1회, 격주로, 격주로, 또는 월 1회 투여된다.

특정 실시예에서, 대상은 인간이고 항-HBV 항체의 치료적 유효량이 투여된다; 여기서 치료적 유효량은 약 3 mg/kg 내지 약 30 mg/kg이다.

상기 방법, 사용하기 위한 조성물, 또는 제조에 사용하는 특정 실시예에서, 억제제는 HBV 전사체의 발현을 억제하는 RNAi 작용제이다. 일부 실시예에서, HBV 전사체의 발현 억제는 rtPCR에 의해 측정된다. 일부 실시예에서, HBV 전사체 발현의 억제는 ELISA에 의해 측정되는 단백질 수준의 감소에 의해 측정된다.

특정 실시예에서, RNAi 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열번호 116의 뉴클레오티드 1579-1597과 3개 이하의 뉴클레오티드가 다른 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시예에서, RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열번호 116의 뉴클레오티드 1579-1597을 포함한다.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, RNAi 작용제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드 또는 적어도 2개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함할 수 있다.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, RNAi 작용제의 이중 가닥 영역은 길이가 15-30개 뉴클레오티드 쌍일 수 있으며; 17-23개의 뉴클레오티드 쌍 길이; 17-25개의 뉴클레오티드 쌍 길이; 23-27개의 뉴클레오티드 쌍 길이; 19-21개의 뉴클레오티드 쌍 길이; 또는 21-23개의 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, RNAi 작용제의 각 가닥은 15-30개 뉴클레오티드 또는 19-30개 뉴클레오티드일 수 있다.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, RNAi 작용제는 siRNA이다. 특정 실시예에서, siRNA는 HBsAg 단백질, HBcAg 단백질 및 HBx 단백질, 또는 HBV DNA 중합효소 단백질을 인코딩하는 HBV 전사체의 발현을 억제한다. 특정 실시예에서, siRNA는 다음에 의해 인코딩되는 표적의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드에 결합한다: P 유전자, NC_003977.2의 뉴클레오티드 2309-3182 및 1-1625; S 유전자 (L, M 및 S 단백질 인코딩), NC_003977.2의 뉴클레오티드 2850-3182 및 1-837; HBx, NC_003977.2의 뉴클레오티드 1376-1840; 또는 C 유전자, NC_003977.2의 뉴클레오티드 1816-2454.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, RNAi 작용제는 siRNA이고, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(서열번호 119)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드 또는 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(서열번호 119)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 안티센스 가닥은 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'의 뉴클레오티드 서열로 구성된다(서열번호 119).

일부 실시예에서, siRNA의 센스 가닥은 5'-GUUGUGCACUUCGCUUCACA-3'(서열번호 118)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, siRNA의 센스 가닥은 5'-GUUGUGCACUUCGCUUCACA-3'(서열번호 118)의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, RNAi 작용제는 siRNA이고, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(서열번호 121)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드 또는 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(서열번호 121)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 안티센스 가닥은 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(서열번호 121)의 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 일부 실시예에서, siRNA의 센스 가닥은 5'-GGUGGACUUCUCUCCAAUUUUA-3'(서열번호 120)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, siRNA의 센스 가닥은 5'-GGUGGACUUCUCUCCAAUUUUA-3'(서열번호 120)의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, RNAi 작용제는 siRNA이고, 여기서 상기 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 상기 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고, 상기 센스 가닥은 3'-말단에 부착된 리간드에 접합된다. 특정 실시예에서, 리간드는 1가 링커, 2가 분지형 링커 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다. 특정 실시예에서, 링커를 통해 부착된 GalNAc 유도체는 다음이거나 이를 포함한다:

,

특정 실시예에서, siRNA는 하기 개략도에 나타낸 바와 같이 리간드에 접합된다(즉, 링커를 통해 부착된 GalNAc 유도체는 이다):

,

여기서 X는 O 또는 S이다.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, RNAi 제제는 siRNA이고, 여기서 siRNA의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 다음을 포함하는 변형된 뉴클레오티드이다: 데옥시-뉴클레오티드, 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시 변형 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 잠금 해제 뉴클레오티드, 형태적으로 제한된 뉴클레오티드, 구속된 에틸 뉴클레오티드, 염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형 뉴클레오티드, 2'-C-알킬 변형 뉴클레오티드, 2'-하이드록실 변형 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 변형 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 뉴클레오티드를 포함하는 비천연 염기, 테트라하이드로피란 변형 뉴클레오티드, 1,5-언하이드로헥시톨 변형 뉴클레오티드, 시클로헥세닐 변형 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 아데노신-글리콜 핵산, 또는 5'-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드. 특정 실시예에서, siRNA는 포스페이트 골격 변형, 2' 리보스 변형, 5' 트리포스페이트 변형 또는 GalNAc 접합 변형을 포함한다.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, 상기 RNAi 작용제는 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(서열번호 122)를 포함하는 센스 가닥 및 5'-usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(서열번호 123)를 포함하는 안티센스 가닥을 갖는 siRNA이고,

여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-인산, 2'-O-메틸시티딘-3'-인산, 2'-O-메틸구아노신-3'-인산, 2'-O-메틸우리딘-3'-인산이고;

Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;

s는 포스포로티오에이트 결합이고; 그리고

L96은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤리놀이다.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, RNAi 작용제는 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(서열번호 124)를 포함하는 센스 가닥 및 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(서열번호 125)를 포함하는 안티센스 가닥을 갖는 siRNA이다.

여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;

Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;

(Agn)은 아데노신-글리콜 핵산(GNA)이고;

s는 포스포로티오에이트 결합이고; 그리고

L96은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤리놀이다.

상기 방법, 용도를 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, 상기 RNAi 작용제는 5'-gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuuaL96-3'(서열번호 126)을 포함하는 센스 가닥 및 5'-usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc-3'(서열번호 127)를 포함하는 안티센스 가닥을 갖는 siRNA이고,

여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-인산, 2'-O-메틸시티딘-3'-인산, 2'-O-메틸구아노신-3'-인산, 2'-O-메틸우리딘-3'-인산이고;

Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;

s는 포스포로티오에이트 결합이고; 그리고

L96은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤리놀이다.

상기 방법, 사용을 위한 조성물 또는 제조 용도의 특정 실시예에서, 대상은 인간이고 치료 유효량의 RNAi 또는 siRNA가 대상에게 투여되고; 여기서 RNAi 또는 siRNA의 유효량은 약 1mg/kg 내지 약 8mg/kg이다.

본 명세서에 개시된 방법, 용도를 위한 조성물 또는 용도의 일부 실시예에서, siRNA는 1일 2회, 1일 1회, 2일마다, 3일마다, 주 2회, 주 1회, 격주, 4주마다 또는 월 1회 대상체에게 투여된다. 일부 실시예에서, siRNA는 4주마다 대상체에게 투여된다.

특정 실시예에서, 방법은 HBV 유전자 발현의 2가지 억제제를 항-HBV 항체와 함께 투여하는 것을 포함한다. HBV 유전자 발현의 2가지 억제제는 상이한 HBV 유전자를 표적으로 하는 2개의 siRNA와 같은 2개의 siRNA일 수 있다. 2개의 상이한 HBV 유전자는 예를 들어 HBsAg 및 HBV X일 수 있다. 2개의 HBV 유전자 발현 억제제는 동시에 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 각각 HBV 유전자에 대한 2개의 siRNA가 투여되고, 제1 siRNA는 서열번호 119, 서열번호 123 또는 서열번호 125를 포함하는 안티센스 가닥을 갖고; 제2 siRNA는 서열번호 116의 뉴클레오티드 2850-3182의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 센스 가닥을 갖는 siRNA를 포함한다. 특정 실시예에서, 각각 HBV 유전자에 대한 2개의 siRNA가 투여되고, 제1 siRNA는 서열번호 121 또는 서열번호 127을 포함하는 안티센스 가닥을 갖고; 제2 siRNA는 서열번호 116의 뉴클레오티드 2850-3182의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 센스 가닥을 갖는 siRNA를 포함한다. 특정 실시예에서, 각각 HBV 유전자에 대한 2개의 siRNA가 투여되고, 제1 siRNA는 서열번호 119, 서열번호 123 또는 서열번호 125를 포함하는 안티센스 가닥을 갖고; 제2 siRNA는 서열번호 121 또는 서열번호 127을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는다. 특정 실시예에서, 제1 siRNA는 서열번호 118, 서열번호 122, 또는 서열번호 124를 포함하는 센스 가닥을 갖고; 제2 siRNA는 서열번호 120 또는 서열번호 126을 포함하는 센스 가닥을 갖는다.

특정 실시예에서, 항-HBV 항체 및 HBV 유전자 발현 억제제는 상승적 치료 효과를 나타낸다. "시너지"라는 용어는 각각의 개별 활성제의 개별 효과의 합보다 큰 둘 이상의 활성제의 조합 효과를 설명하는 데 사용된다. 따라서, 2개 이상의 작용제의 조합 효과가 활성 또는 과정의 "상승적 억제(synergistic inhibition)"를 초래하는 경우, 활성 또는 과정의 억제가 각각의 각각의 활성 작용제의 억제 효과의 합보다 더 큰 것으로 의도된다. 용어 "상승적 치료 효과"는 2개 이상의 요법의 조합으로 관찰되는 치료 효과를 말하며, 여기서 치료 효과 (여러 매개변수 중 하나로 측정됨)는 각각의 개별 요법으로 관찰되는 개별 치료 효과의 합보다 크다.

일부 실시예에서, HBV mRNA를 표적으로 하는 RNAi 작용제가 HBV 감염 및/또는 HBV 관련 질병을 앓는 피험자에게, 하나 이상의 HBV 유전자, HBV ccc DNA 수준, HBV 항원 수준, HBV 바이러스 부하 수준, ALT 및/또는 AST의 발현이 가능하도록(예를 들어, 세포에서 피험자의 조직, 혈액 또는 체액이 적어도 약 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42 %, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상감소하도록) 투여된다.

일부 실시예에서, HBV mRNA를 표적으로 하는 RNAi 작용제는 HBV 감염 및/또는 HBV 관련 질병을 앓는 대상체에게 투여되고, HBV 유전자 발현을 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37 %, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87 %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 약 100% (즉, 분석의 검출 수준 이하로) 억제한다.

일부 실시예에서, 본 개시내용에 따른 병용 요법은 뉴클레오티드 유사체를 제3 구성요소로서 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "뉴셀롯(들)사이드 유사체(nucelot(s)ide analog)" (또는 "중합 효소 억제제(polymerase inhibitor)" 또는 "역전사 효소 억제제(reverse transcriptase inhibitor)")는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드와 구조적으로 유사하고 HBV cccDNA의 복제를 특이적으로 억제하고 숙주(예를 들어, 인간) DNA의 복제를 유의하게 억제하지 않는 DNA 복제 억제제이다. 이러한 억제제는 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(TDF), 테노포비르 알라페나미드(TAF), 라미부딘, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르(ETV), 텔비부딘, AGX-1009, 엠트리시타빈(FTC), 클레부딘, 리토나비르, 디피복실, 로부카비르, 팜비르, N-아세틸-시스테인(NAC), PC1323, 테라디즘-HBV(theradigm-HBV), 티모신-알파, 간시클로비르, 베시포비르(ANA-380/LB-80380) 및 테노프비르-엑살리아데스(TLX/CMX157)를 포함한다. 특정 실시예에서, 뉴셀롯(들)화물 유사체는 엔테카비르(ETV)이다. 뉴클레오티드(들) 유사체는 다수의 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하며 라벨 표시에 따라(예를 들어, 전형적으로 특정 용량으로 경구 투여됨) 또는 HBV 치료에서 숙련된 의사에 의해 결정된 대로 본원에 제공된 방법에 사용된다.

항-HBV 항체 또는 HBV 유전자 발현 억제제는 제3 활성 성분과 동일한 약학적 조성물에 존재할 수 있거나, 항-HBV 항체, HBV 유전자 발현 억제제 및 제3 활성 성분은 세 가지 상이한 약학적 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 상이한 약학적 조성물은 조합으로/동시에 또는 상이한 시간에 또는 상이한 위치(예를 들어, 신체의 상이한 부분)에 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 다음의 실시양태를 제공한다:

실시양태 1. 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,

(i) 서열 번호 34의 아미노산 서열, 서열 번호 35 또는 서열 번호 36의 아미노산 서열, 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및

(ii) 서열 번호 41, 40, 42, 및 43 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열 번호 49, 44-48, 및 50-53 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 및 서열 번호 55 또는 56에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고,

여기서 선택적으로 VL은 서열 번호 58에 대해 R60N 치환 돌연변이, R60A 치환 돌연변이, R60K 치환 돌연변이, S64A 치환 돌연변이, I74A 치환 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 치환 돌연변이(들)의 아미노산 넘버링은 서열 번호 58에 따르며, 추가로 선택적으로 VL은 서열 번호 58에 대해 임의의 추가 돌연변이(들)를 포함하지 않고,

항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합할 수 있고, 선택적으로 유전자형 D, A, B, C, E, F, G, H, I, 또는 J, 또는 이들의 임의의 조합의 B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염을 중화시킬 수 있는,

항체 또는 이의 항원 결합 단편.

실시양태 2.

실시양태 1에 있어서, 하기를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편:

(i) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 49 및 55에 따른 아미노산 서열;

(ii) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 46 및 55에 따른 아미노산 서열;

(iii) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 47 및 55에 따른 아미노산 서열;

(iv) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 48 및 55에 따른 아미노산 서열;

(v) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 45 및 55에 따른 아미노산 서열;

(vi) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 50 및 55에 따른 아미노산 서열;

(vii) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 51 및 55에 따른 아미노산 서열;

(viii) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 52 및 55에 따른 아미노산 서열; 또는

(ix) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 53 및 55에 따른 아미노산 서열.

실시양태 3.

항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,

(i) 서열 번호 34에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열 번호 35 또는 36에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 및 서열 번호 37에 따른 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및

(ii) 서열 번호 40-43 중 어느 하나에 따른 CDRL1 아미노산 서열, 서열 번호 49, 44-48, 및 50-53 중 어느 하나에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 서열 번호 55 또는 56에 따른 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고,

여기서 CDR은 CCG 넘버링 시스템에 따라 정의되며,

항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합할 수 있고, 선택적으로 유전자형 D, A, B, C, E, F, G, H, I, 또는 J, 또는 이들의 임의의 조합의 B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염을 중화시킬 수 있으되, 단 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 45에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하지 않는,

항체 또는 이의 항원 결합 단편.

실시양태 4.

실시양태 3에 있어서, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열은 서열 번호 (i) 각각 34, 35, 37, 41, 49, 및 55; (ii) 각각 34, 35, 37, 41, 46, 및 55; (iii) 각각 34, 35, 37, 41, 47, 및 55; (iv) 각각 34, 35, 37, 41, 48, 및 55; (v) 각각 34, 35, 37, 41, 45, 및 55; (vi) 각각 34, 35, 37, 41, 50, 및 55; (vii) 각각 34, 35, 37, 41, 51, 및 55; (viii) 각각 34, 35, 37, 41, 52, 및 55; (ix) 각각 34, 35, 37, 41, 53, 및 55; 또는 (x) 각각 34, 35, 37, 41, 44, 및 55에 따른, 항체 또는 항원-결합 단편

실시양태 5.

중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 VH 및 VL은 각각 HBC34-v40; HBC34-v36; HBC34-v37; HBC34-v38; HBC34-v39; HBC34-v41; HBC34-v42; HBC34-v43; HBC34-v44; HBC34-v45; HBC34-v46; HBC34-v47; HBC34-v48; HBC34-v49; 또는 HBC34-v50에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3을 포함하고,

여기서 CDR은 IMGT 넘버링에 따라 정의되며, 선택적으로 VL은 서열 번호 58에 대해 R60N 치환 돌연변이, R60A 치환 돌연변이, R60K 치환 돌연변이, S64A 치환 돌연변이, I74A 치환 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하고, 여기서 치환 돌연변이(들)의 아미노산 넘버링은 서열 번호 58에 따르며, 추가로 선택적으로 VL은 서열 번호 58에 대해 임의의 추가 돌연변이(들)를 포함하지 않는,

항체 또는 이의 항원 결합 단편.

실시양태 6.

중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 VH 및 VL은 각각 HBC34-v40; HBC34-v36; HBC34-v37; HBC34-v38; HBC34-v39; HBC34-v41; HBC34-v42; HBC34-v43; HBC34-v44; HBC34-v45; HBC34-v46; HBC34-v47; HBC34-v48; HBC34-v49; 또는 HBC34-v50에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3을 포함하고,

여기서 CDR은 CCG 넘버링에 따라 정의되며, 선택적으로 VL은 서열 번호 58에 대해 R60N 치환 돌연변이, R60A 치환 돌연변이, R60K 치환 돌연변이, S64A 치환 돌연변이, I74A 치환 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하고, 여기서 치환 돌연변이(들)의 아미노산 넘버링은 서열 번호 58에 따르며, 추가로 선택적으로 VL은 서열 번호 58에 대해 임의의 다른 돌연변이(들)를 포함하지 않는,

항체 또는 이의 항원 결합 단편.

실시양태 7.

실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서,

(i) VH는 서열 번호 38 또는 39에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고/거나;

(ii) VL은 서열 번호 서열 번호 62, 58-61, 63-66, 69, 71, 및 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진,

항체 또는 이의 항원 결합 단편.

실시양태 8.

실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서,

(i) VH는 서열 번호 38 또는 39에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(즉, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 또는 그 사이의 임의의 비정수 값) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고/거나;

(ii) VL은 서열 번호 62, 58-61, 63-66, 69, 71, 및 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(즉, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 또는 그 사이의 임의의 비정수 값) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진,

항체 또는 이의 항원 결합 단편.

실시양태 9.

실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, VH 및 VL은 (i) 각각 38 및 62; (ii) 각각 38 및 59; (iii) 각각 38 및 60; (iv) 각각 38 및 61; (v) 각각 38 및 58; (vi) 각각 38 및 63; (vii) 각각 38 및 64; (viii) 각각 38 및 65; (ix) 각각 38 및 66; (x) 각각 38 및 71; 또는 (xi) 각각 38 및 72에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(즉, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 사이의 임의의 비정수 값) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.

실시양태 10.

서열 번호 38 또는 39의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 62, 57-61, 및 63-72 중 어느 하나의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 변이체는 R60A; R60N; R60K; S64A; 및 I74A 돌연변이 중 어느 하나 이상을 포함하고, 여기서 선택적으로 VL 변이체는 각각 서열 번호 62, 57-61, 및 63-72와 비교하여 임의의 추가 돌연변이를 포함하지 않는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.

실시양태 11.

서열 번호 38 또는 39의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 62, 57-61, 및 63-72 중 어느 하나의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 변이체는 Q78, D81, 또는 둘 모두에서 치환 돌연변이(예를 들어, 보존적 아미노산 치환, 또는 생식계열 인코딩 아미노산으로의 돌연변이)를 포함하고, 선택적으로 VL 변이체는 각각 서열 번호 62, 57-61, 및 63-72와 비교하여 임의의 추가 돌연변이를 포함하지 않는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.

실시양태 12.

실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, VH는 서열 번호 38 또는 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고/거나; VL은 서열 번호 62, 58-61, 63-66, 69, 71, 또는 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.

실시양태 13.

실시양태 1 내지 9 및 제12 중 어느 하나에 있어서, VH 및 VL은 서열 번호 (i) 각각 38 및 62; (ii) 각각 38 및 59; (iii) 각각 38 및 60; (iv) 각각 38 및 61; (v) 각각 38 및 58; (vi) 각각 38 및 63; (vii) 각각 38 및 64; (viii) 각각 38 및 65; (ix) 각각 38 및 66; (x) 각각 38 및 71; 또는 (xi) 각각 38 및 72에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 14.

중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 여기서 VH 및 VL은 서열 번호 (i) 각각 38 및 62; (ii) 각각 38 및 66; (iii) 각각 38 및 67; (iv) 각각 38 및 68; 또는 (v) 각각 38 및 72에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;

여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합할 수 있고 유전자형 D, A, B, C, E, F, G, H, I, 또는 J, 또는 이들의 임의의 조합의 B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염을 중화시킬 수 있는, 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 15.

실시양태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, D형 간염 바이러스(HDV)에 의한 감염을 중화시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 16.

실시양태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 복수의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 샘플이 약 40℃에서 약 120 내지 약 168시간 동안 인큐베이션된 경우 상기 샘플에서 상기 복수의 12% 미만, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하 또는 2% 이하가 이량체에 포함되고, 여기서 선택적으로 이량체의 존재는 절대 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정되는, 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 17.

실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 복수의 항체 또는 항원 결합 단편의 인큐베이션에 따라 복수의 참조 항체 또는 항원 결합 단편의 인큐베이션에 비해 이량체의 형성이 감소되고,

여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열 번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하며,

선택적으로 항체 이량체의 존재는 절대 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정되는,

항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 18.

실시양태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서,

(i) 4℃에서 5일, 15일 및/또는 32일 인큐베이션 시;

(ii) 25℃에서 5일, 15일 및/또는 32일 인큐베이션 시; 및/또는

(iii) 40℃에서 5일, 15일 및/또는 32일 인큐베이션 시,

참조 항체와 비교하여 샘플 또는 조성물에서 더 낮은 양의 이량체를 형성하고/하거나, 이량체를 감소된 빈도로 형성하고/거나, 총 항체 또는 항원 결합 단편 분자를 더 낮은 비율로 형성하며,

여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열 번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는,

항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 19.

실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 이량체에 포함되는 조성물 중 항체 또는 항원 결합 단편 분자의 백분율이 이량체에 존재하는 조성물 중 참조 항체 분자의 백분율의 각각 4/5 미만, 3/4 미만, 1/2 미만, 1/3 미만, 1/4 미만, 1/5 미만, 1/6 미만, 1/7 미만, 1/8 미만, 1/9 미만, 또는 1/10 미만인, 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 20.

실시양태 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 숙주 세포가 참조 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 참조 숙주 세포 보다 항체 또는 항원 결합 단편의 양을 각각 1.5x 이상, 2x 이상, 3x 이상 또는 4x 이상 제공하고, 여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열 번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 21.

실시양태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 참조 형질감염 세포에서 생산된 참조 항체 또는 항원 결합 단편에 비해 더 높은 역가로 형질감염된 세포에서 생산되고, 여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열 번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 22.

실시양태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 참조 항체 또는 항원 결합 단편이 생산되는 역가보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배 또는 적어도 4배 더 높은 역가로 형질감염된 세포에서 생산되고, 여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열 번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 23.

실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 약 3.2 이하, 3.0 미만, 2.5 미만, 2.0 미만, 1.5 미만 또는 1.0 미만의 EC50(ng/ml)으로 HBsAg(adw)에 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 24.

실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 3.5 미만, 3.4 미만, 3.3 미만, 3.2 미만, 3.1 미만, 3.0 미만, 2.9 미만, 2.8 미만, 2.7 미만, 2.6 미만, 2.5 미만, 2.4 미만, 2.3 미만, 2.1 미만, 2.0 미만, 1.9 미만, 1.8 미만, 1.7 미만, 1.6 미만, 1.5 미만, 1.4 미만, 1.3 미만, 1.2 미만, 1.1 미만, 또는 1.0 미만의 EC50(ng/ml)으로 HBsAg(예를 들어, adw 아형의 것)에 결합할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 25.

실시양태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 0.9 내지 2.0, 또는 0.9 내지 1.9, 또는 0.9 내지 1.8, 또는 0.9 내지 1.7, 또는 0.9 내지 1.6, 또는 0.9 내지 1.5, 또는 0.9 내지 1.4, 또는 0.9 내지 1.3, 또는 0.9 내지 1.2, 또는 0.9 내지 1.1, 또는 0.9 내지 1.0, 또는 1.0 내지 2.0의 EC50(ng/ml)으로 HBsAg(예를 들어, adw 아형의 것)에 결합할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 26.

실시양태 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 2.0 이하의 EC50(ng/ml)으로 HBsAg(adw)에 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 27.

실시양태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, B형 간염 바이러스 감염 중화 EC50이 20 ng/ml 미만, 바람직하게는 15 ng/ml 이하, 보다 바람직하게는 10 ng/mL 이하인, 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 28.

실시양태 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 또는 7 ng/mL의 감염 중화 EC50으로 B형 간염 바이러스 감염을 중화시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 29.

실시양태 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고 선택적으로 서열 번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는 참조 항체 또는 항원-결합 단편의 감염 중화 EC50보다 낮은 감염 중화 EC50으로 B형 간염 바이러스 감염을 중화시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 30.

실시양태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 인간 항체, 모노클로날 항체, 정제된 항체, 단일쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 31.

실시양태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 다중-특이성 항체 또는 항원 결합 단편인 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 32.

실시양태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 이중특이성 항체 또는 항원 결합 단편인 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 33.

실시양태 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, Fc 모이어티를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.

실시양태 34.

실시양태 33에 있어서, Fc 모이어티는 돌연변이를 포함하지 않는 참조 Fc 모이어티과 비교하여 FcRn에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 35.

실시양태 33 또는 34에 있어서, Fc 모이어티는 돌연변이를 포함하지 않는 참조 Fc 모이어티과 비교하여 FcγR, 바람직하게는 FcγRIIA 및/또는 FcγRIIIA에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 36.

실시양태 33 내지 35 중 어느 하나에 있어서, Fc 모이어티는 IgG1과 같은 IgG 이소형이거나, 또는 IgG1과 같은 IgG 이소형으로부터 유래되는, 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 37.

실시양태 33 내지 36 중 어느 하나에 있어서, Ig G1m17, 1(IgHG1^*01)을 포함하거나 그로부터 유래되는 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 38.

실시양태 34 내지 37 중 어느 하나에 있어서, FcRn에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이는

(i) M428L/N434S;

(ii) M252Y/S254T/T256E;

(iii)T250Q/M428L;

(iv) P257I/Q311I;

(v) P257I/N434H;

(vi) D376V/N434H;

(vii) T307A/E380A/N434A; 또는

(viii) (i)-(vii)의 임의의 조합을 포함하고,

여기서 Fc 모이어티의 아미노산 넘버링은 EU 넘버링 시스템에 따르는, 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 39.

실시양태 38에 있어서, FcRn에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이는 M428L/N434S를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 40.

실시양태 35 내지 39 중 어느 하나에 있어서, FcγR에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이는 S239D; I332E; A330L; G236A; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 Fc 모이어티의 아미노산 넘버링은 EU 넘버링 시스템에 따르는, 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 41.

실시양태 40에 있어서, FcγR에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이는 다음의 것을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편:

(i) S239D/I332E;

(ii) S239D/A330L/I332E;

(iii) G236A/S239D/I332E; 또는

(iv) G236A/A330L/I332E.

실시양태 42.

실시양태 40 또는 41에 있어서, FcγR에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이는 G236A/A330L/I332E를 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로 항체 또는 항원 결합 단편은 S239D를 포함하지 않으며, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 선택적으로 위치 239에서 천연 S를 추가로 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 43.

실시양태 33 내지 42 중 어느 하나에 있어서, Fc 모이어티는 아미노산 치환 돌연변이 M428L; N434S; G236A; A330L; 및 I332E를 포함하고, 선택적으로 S239D를 포함하지 않는, 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 44.

실시양태 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 79의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 45.

실시양태 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 73의 아미노산 서열에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CH1-CH2-CH3 또는 아미노산 치환 G236A; A330L; I332E; M428L; N434S(EU 넘버링) 중 하나 이상을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 46.

실시양태 45에 있어서, CH1-CH2-CH3은 C-말단 리신이 제거된, 항체 또는 항원-결합 단편.

실시양태 47.

선택적으로 C-말단 리신이 제거된 서열 번호 75에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄(HC); 및 경쇄(LC)를 포함하는 항체로서, 여기서 LC는 (i) 서열 번호 62, 58-61 및 63-72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열 및 (ii) 서열 번호 79에 제시된 CL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체.

실시양태 48.

실시양태 47에 있어서, LC는 서열 번호 62, 66, 67 및 72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체.

실시양태 49.

선택적으로 C-말단 리신이 제거된 서열 번호 76에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄(HC); 및 경쇄(LC)를 포함하는 항체로서, 여기서 LC는 (i) 서열 번호 62, 58-61 및 63-72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열 및 (ii) 서열 번호 79에 제시된 CL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체.

실시양태 50.

실시양태 49에 있어서, LC는 서열 번호 62, 66, 67 및 72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는,인 항체.

실시양태 51.

선택적으로 C-말단 리신이 제거된 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄(HC); 및 경쇄(LC)를 포함하는 항체로서, 여기서 LC는 (i) 서열 번호 62, 58-61 및 63-72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열 및 (ii) 서열 번호 79에 제시된 CL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체.

실시양태 52.

실시양태 51에 있어서, LC는 서열 번호 62, 66, 67 및 72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체.

실시양태 53.

선택적으로 C-말단 리신이 제거된 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄(HC); 및 경쇄(LC)를 포함하는 항체로서, 여기서 LC는 (i) 서열 번호 62, 58-61 및 63-72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열 및 (ii) 서열 번호 79에 제시된 CL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체.

실시양태 54.

실시양태 53에 있어서, LC는 서열 번호 62, 66, 67 및 72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체.

실시양태 55.

실시양태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, HBsAg 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H, I, 및 J, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 유전자형의 HBsAg에 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 56.

실시양태 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, HBV 감염을 갖는 포유동물에서 HBV DNA의 혈청 농도를 감소시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 57.

실시양태 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, HBV 감염을 갖는 포유동물에서 HBsAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 58.

실시양태 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, HBV 감염을 갖는 포유동물에서 HBeAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 59.

실시양태 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, HBV 감염을 갖는 포유동물에서 HBcrAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 60.

실시양태 1 내지 59 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.

실시양태 61.

실시양태 1 내지 59 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역(VL) 및 선택적으로 경쇄 불변 영역(CL)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.

실시양태 62.

실시양태 61에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 폴리뉴클레오티드.

실시양태 63.

실시양태 62에 있어서, 서열 번호 89, 85-88, 및 90-99 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 50% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.

실시양태 64.

실시양태 60 내지 63 중 어느 하나에 있어서, (i) 서열 번호 81 또는 서열 번호 82에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 서열 번호 89, 85-88, 및 90-99 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.

실시양태 65.

실시양태 60 내지 63 중 어느 하나에 있어서, (i) 서열 번호 83에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 서열 번호 89, 85-88, 및 90-99 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.

실시양태 66.

실시양태 60 내지 63 중 어느 하나에 있어서, (i) 서열 번호 84에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 서열 번호 89, 85-88, 및 90-99 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.

실시양태 67.

실시양태 60 내지 66 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.

실시양태 68.

실시양태 67에 있어서, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 포함하는 벡터.

실시양태 69.

실시양태 60 내지 66 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 및/또는 실시양태 67 또는 68의 벡터를 포함하는 숙주 세포.

실시양태 70.

(i) 실시양태 1 내지 59 중 어느 하나의 항체 또는 항원 결합 단편;

(ii) 실시양태 60 내지 66 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드;

(iii) 실시양태 67 또는 68에 따른 벡터;

(iv) 실시양태 69의 숙주 세포; 또는

(v) (i)-(iv)의 임의의 조합,

및 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.

실시양태 71.

(a) 다음으로부터 선택되는 구성요소:

(i) 실시양태 1 내지 59 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편;

(ii) 실시양태 60 내지 66 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드;

(iii) 실시양태 67 또는 68에 따른 벡터;

(iv) 실시양태 69의 숙주 세포;

(v) 실시양태 70의 약학적 조성물; 또는

(vi) (i)-(vi)의 임의의 조합; 및

(b) (1) B형 간염 감염 및/또는 D형 간염 감염을 예방, 치료, 약화 및/또는 진단하기 위해 구성요소를 사용하기 위한 설명서 및/또는 (2) 주사기와 같은, 대상체에게 구성요소를 투여하기 위한 수단을 포함하는 키트.

실시양태 72.

실시양태 70 또는 71에 있어서, (i) 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 텔비부딘, 테노포비르 또는 이들의 임의의 조합을 선택적으로 포함하는 중합효소 억제제; (ii) 선택적으로 IFN베타 및/또는 IFN알파를 포함하는 인터페론; (iii) 체크포인트 억제제 - 여기서 체크포인트 억제제는 선택적으로 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및/또는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함함 -; (iv) 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제; 또는 (v) (i)-(iv)의 임의의 조합을 추가로 포함하는, 조성물 또는 키트.

실시양태 73.

실시양태 72에 있어서, 중합효소 억제제는 라미부딘을 포함하는, 조성물 또는 키트.

실시양태 74.

실시양태 69의 숙주 세포를 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하기에 충분한 조건 및 시간에서 배양하는 것을 포함하는, 실시양태 1 내지 59 중 어느 하나의 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 방법.

실시양태 75.

대상체에서 B형 간염 감염 및/또는 D형 간염 감염을 예방, 치료, 약화 및/또는 진단하기 위한 약제의 제조에서의 i) 실시양태 1 내지 59 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편; (ii) 실시양태 60 내지 66 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드; (iii) 실시양태 67 또는 68의 벡터; (iv) 실시양태 69의 숙주 세포; 및/또는 (v) 실시양태 70, 실시양태 72 또는 73의 약학적 조성물의 용도.

실시양태 76.

(i) 실시양태 1 내지 59 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편; (ii) 실시양태 60 내지 66 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드; (iii) 실시양태 67 또는 68의 벡터; (iv) 실시양태 69의 숙주 세포; 및/또는 (v) 실시양태 70, 실시양태 72 또는 73의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 B형 간염 및/또는 D형 간염 감염을 치료, 예방 및/또는 약화시키는 방법.

실시양태 77.

실시양태 76에 있어서, (vi) 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 텔비부딘, 테노포비르 또는 이들의 임의의 조합을 선택적으로 포함하는 중합효소 억제제; (vii) 선택적으로 IFN베타 및/또는 IFN알파를 포함하는 인터페론; (viii) 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및/또는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 선택적으로 포함하는 체크포인트 억제제; (ix) 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제; 또는 (x) (vi)-(ix)의 임의의 조합의 하나 이상을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.

실시양태 78.

실시양태 76 또는 77에 있어서, B형 간염 감염은 만성 B형 간염 감염인, 방법.

실시양태 79.

실시양태 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 간 이식을 받은 적이 있는, 방법.

실시양태 80.

실시양태 76 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 B형 간염에 대해 면역화되지 않은, 방법.

실시양태 81.

실시양태 76 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 신생아인, 방법.

실시양태 82.

실시양태 76 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 혈액 투석을 받고 있거나 받은 적이 있는, 방법.

실시양태 83.

실시양태 76 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물의 단일 용량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.

실시양태 84.

실시양태 83에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 2 내지 18 mg/kg(대상체 체중)의 범위로 포함하는, 방법.

실시양태 85.

실시양태 83 또는 84에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 최대 6 mg, 최대 10 mg, 최대 15 mg, 최대 18 mg, 최대 25 mg, 최대 30 mg, 최대 35 mg, 최대 40 mg, 최대 45 mg, 최대 50 mg, 최대 55 mg, 최대 60 mg, 최대 75 mg, 최대 90 mg, 최대 300 mg, 최대 900 mg, 또는 최대 3000 mg으로 포함하거나, 또는

약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 25 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 30 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 50 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 60 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 90 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 100 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 150 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 200 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 300 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 500 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 750 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 900 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 1500 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 2000 mg 내지 3000 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는

약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 25 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 30 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 50 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 60 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 90 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 100 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 150 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 200 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 300 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 500 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 750 mg 내지 900 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는

약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 25 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 30 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 50 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 60 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 90 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 100 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 150 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 200 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 300 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 400 mg 내지 500 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는

약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 25 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 30 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 50 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 60 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 90 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 100 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 150 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 200 mg 내지 300 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는

약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 25 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 30 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 50 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 60 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 90 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 100 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 150 mg 내지 200 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는

약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 25 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 30 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 50 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 60 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 90 mg 내지 100 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는

약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 25 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 25 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 25 mg의 범위, 또는 15 mg 내지 25 mg의 범위, 또는 20 mg 내지 25 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는

약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 50 mg의 범위, 또는 1 mg 내지 25 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 50 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 25 mg의 범위, 또는 10 내지 50 mg의 범위, 또는 10 내지 25 mg의 범위, 또는 1 내지 15 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 15 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 15 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는

약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, 또는 1000 mg, 또는 그 이상의 양으로 포함하거나, 또는

약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 3000 mg 미만, 2500 mg 미만, 2000 mg 미만, 1500 mg 미만, 1000 mg 미만, 900 mg 미만, 500 mg 미만, 300 mg 미만, 200 mg 미만, 100 mg 미만, 90 mg 미만, 75 mg 미만, 50 mg 미만, 25 mg, 또는 10 mg 미만, 1 mg 초과, 2 mg 초과, 3 mg 초과, 4 mg 초과, 또는 5 mg 초과의 양으로 포함하는,

방법.

실시양태 86.

실시양태 83 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 100 mg/mL 내지 200 mg/mL 범위, 예컨대 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 또는 200 mg/mL, 바람직하게는 150 mg/mL의 농도로 포함하는, 방법.

실시양태 87.

실시양태 83 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 약 75 mg의 항체를 포함하는, 방법.

실시양태 88.

실시양태 83 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 약 90 mg의 항체를 포함하는, 방법.

실시양태 89.

실시양태 83 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 300 mg 이하의 항체를 포함하는, 방법.

실시양태 90.

실시양태 83 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 900 mg 이하의 항체를 포함하는, 방법.

실시양태 91.

실시양태 83 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 3,000 mg 이하의 항체를 포함하는, 방법.

실시양태 92.

실시양태 83 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 피하 주사에 의해 단일 용량을 투여하는 것을 포함하고, 선택적으로 단일 용량은 6 mg의 항체 또는 18 mg의 항체를 포함하거나 이로 이루어진, 방법.

실시양태 93.

실시양태 83 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 정맥내 주사에 의해 단일 용량을 투여하는 것을 포함하는 방법.

실시양태 94.

실시양태 83 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물은 물, 선택적으로 USP 물을 추가로 포함하는, 방법.

실시양태 95.

실시양태 83 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물은 히스티딘을 약학적 조성물 중에 선택적으로 10 mM 내지 40 mM의 범위, 예컨대 20 mM의 농도로 추가로 포함하는, 방법.

실시양태 96.

실시양태 83 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물은 디사카라이드, 예컨대 수크로스를 선택적으로 5%, 6%, 7%, 8% 또는 9%, 바람직하게는 약 7%(w/v)로 추가로 포함하는, 방법.

실시양태 97.

실시양태 83 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물은 계면활성제 또는 삼블록 공중합체, 선택적으로 폴리소르베이트 또는 폴록사머-188, 바람직하게는 폴리소르베이트 80(PS80)을 추가로 포함하고, 여기서 선택적으로 폴리소르베이트 또는 폴록사머-188은 0.01% 내지 0.05%(w/v)의 범위, 바람직하게는 0.02%(w/v)로 존재하는, 방법.

실시양태 98.

실시양태 83 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물은 5.8 내지 6.2 범위, 5.9 내지 6.1 범위, 또는 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 또는 6.2의 pH를 갖는, 방법.

실시양태 99.

실시양태 98에 있어서, 약학적 조성물은

(i) 150 mg/mL의 항체;

(ii) USP 물;

(iii) 20 mM 히스티딘;

(iv) 7% 수크로스; 및

(v) 0.02% PS80을 포함하고,

여기서 약학적 조성물은 6의 pH를 포함하는,

방법.

실시양태 100.

실시양태 83 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 성인인, 방법.

실시양태 101.

실시양태 100에 있어서, 대상체는 18세 내지 65세 범위인, 방법.

실시양태 102.

실시양태 83 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 체중이 40 kg 내지 125 kg이고/이거나 대상체는 체질량 지수(BMI)가 18 내지 35 kg/m²인, 방법.

실시양태 103.

실시양태 83 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 예를 들어, 2회 양성 혈청 HBsAg, HBV DNA 및/또는 HBeAg로 정의되는 만성 HBV 감염을 갖고; 여기서 2회는 적어도 6개월 간격인, 방법.

실시양태 104.

실시양태 83 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 간경변증이 없는, 방법.

실시양태 105.

실시양태 104에 있어서, 간경변증의 부재는

섬유스캔 평가(예를 들어, 약학적 조성물의 단일 용량을 투여하기 전 6개월 이내); 또는

간 생검(예를 들어, 약학적 조성물의 단일 용량을 투여하기 전 12개월 이내)에 의해 결정되고,

여기서, 바람직하게는 간경변의 부재는 Metavir F3 섬유증의 부재 또는 F4 간경변의 부재에 의해 결정되는, 방법.

실시양태 106.

실시양태 83 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 단일 용량이 투여되기 전에, 선택적으로 120일 이내에, 추가로 선택적으로 60일 이내에 뉴클레오시(티)드 역전사효소 억제제(NRTI)를 투여받는, 방법.

실시양태 107.

실시양태 106에 있어서, NRTI는 테노포비르; 테노포비르 디소프록실(예를 들어, 테노포비르 디프록실 푸마레이트); 테노포비르 알라페나미드; 엔테카비르; 라미부딘; 아데포비르; 및 아데포비르 디피복실 중 하나 이상을 포함하는, 방법.

실시양태 108.

실시양태 83 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 단일 용량이 투여되기 28일 전까지 혈청 HBV DNA 농도가 100 IU/mL 미만인, 방법.

실시양태 109.

실시양태 83 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 단일 용량 투여 전에 혈청 HBsAg 농도가 3,000 IU/mL 미만이고, 선택적으로 단일 용량 투여 전 혈청 HBsAg 농도가 1,000 IU/mL 미만인, 방법.

실시양태 110.

실시양태 83 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 단일 용량이 투여되기 28일 전까지 혈청 HBsAg 농도가 3,000 IU/mL 이상이고, 선택적으로 단일 용량이 투여되기 28일 전까지 혈청 HBsAg 농도가 1,000 IU/mL 이하인, 방법.

실시양태 111.

실시양태 83 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 단일 용량이 투여되기 28일 전까지 HBe-항원(HBeAg)-음성인, 방법.

실시양태 112.

실시양태 83 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 단일 용량이 투여되기 28일 전까지 항-HB 항체에 대해 음성인, 방법.

실시양태 113.

실시양태 83 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 단일 용량의 투여 전에:

(i) 섬유증이 없고/없거나, 간경변이 없고/거나;

(ii) 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) < 2 x 정상 상한(ULN)을 갖는,

방법.

실시양태 114.

실시양태 83 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 단일 용량 투여 후 56일에 대상체는 단일 용량 투여 전 0일 내지 28일에서 대상체의 혈청 HBsAg와 비교하여 혈청 HBsAg의 >2배 감소(예를 들어, 혈청 내 HBsAg의 농도, 예를 들어 Abbott ARCHITECT 검정을 사용하여 결정됨)를 갖는, 방법.

실시양태 115.

실시양태 83 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 단일 용량의 투여 후(예를 들어, 단일 용량의 투여 후 56일에) 대상체는

(i) 참조 대상체와 비교하여 HBV의 간내 확산이 감소되거나 덜 심각하고/거나;

(ii) HBV에 대한 적응 면역 반응을 포함하는,

방법.

실시양태 116.

실시양태 83 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 남성인, 방법.

실시양태 117.

실시양태 83 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 여성인, 방법.

실시양태 118.

100 mg/mL 내지 200 mg/mL 범위, 예컨대 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 또는 200 mg/mL, 바람직하게는 150 mg/mL 농도의 실시양태 1 내지 59 중 어느 하나의 항체 또는 항원 결합 단편; 및

약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.

실시양태 119.

실시양태 118에 있어서, 최대 6 mg, 최대 18 mg, 최대 75 mg, 최대 90 mg, 최대 300 mg, 최대 900 mg, 또는 최대 3000 mg의 항체를 포함하는 약학적 조성물.

실시양태 120.

실시양태 118 또는 119에 있어서, 약 75 mg의 항체를 포함하는 약학적 조성물.

실시양태 121.

실시양태 118 또는 119에 있어서, 약 90 mg의 항체를 포함하는 약학적 조성물.

실시양태 122.

실시양태 118 또는 119에 있어서, 약 300 mg의 항체를 포함하는 약학적 조성물.

실시양태 123.

실시양태 118 또는 119에 있어서, 약 900 mg의 항체를 포함하는 약학적 조성물.

실시양태 124.

실시양태 118 또는 119에 있어서, 약 3,000 mg의 항체를 포함하는 약학적 조성물.

실시양태 125.

실시양태 118 내지 124 중 어느 하나에 있어서, 물, 선택적으로 USP 물을 포함하는 약학적 조성물.

실시양태 126.

실시양태 118 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 히스티딘을 약학적 조성물 중에 선택적으로 10 mM 내지 40 mM, 예컨대 20 mM의 농도로 포함하는 약학적 조성물.

실시양태 127.

실시양태 118 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 디사카라이드, 예컨대 수크로스를 선택적으로 5%, 6%, 7%, 8%, 또는 9%, 바람직하게는 약 7% (w/v)로 포함하는 약학적 조성물.

실시양태 128.

실시양태 118 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 계면활성제, 선택적으로 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 80(PS80)을 포함하고, 선택적으로 폴리소르베이트는 0.01% 내지 0.05%(w/v)의 범위, 바람직하게는 0.02%(w/v)로 존재하는 약학적 조성물.

실시양태 129.

실시양태 118 내지 128 중 어느 하나에 있어서, pH는 5.8 내지 6.2의 범위, 5.9 내지 6.1의 범위, 또는 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 또는 6.2인, 약학적 조성물.

실시양태 130.

실시양태 118 내지 129 중 어느 하나에 있어서,

(i) 150 mg/mL의 항체;

(ii) USP 물;

(iii) 20 mM 히스티딘;

(iv) 7% 수크로스; 및

(v) 0.02% PS80을 포함하고,

pH 6인,

약학적 조성물.

실시양태 131.

실시양태 83 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 단일 용량 투여 후, 대상체의 혈청 HBsAg는 기준선과 비교하여 1.0 log¹⁰ IU/mL, 1.5 log¹⁰ IU/mL 이상만큼 감소되고, 여기서 선택적으로 감소는 단일 용량 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8일 이상 동안 지속되는, 방법.

실시양태 132.

실시양태 83 내지 117 및 실시양태 131 중 어느 하나에 있어서, 단일 용량의 투여 후, 대상체의 혈청 HBsAg는 기준선과 비교하여 적어도 8일, 적어도 15일, 적어도 22일 또는 적어도 29일 동안 감소되는, 방법.

실시양태 133.

B형 간염 및/또는 D형 간염 감염의 시험관내 진단 방법으로서,

(i) 대상체로부터의 샘플을 실시양태 1 내지 59 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및

(ii) 항원과 항체를 포함하거나 항원과 항원 결합 단편을 포함하는 복합체를 검출하는 단계를 포함하는,

방법.

실시양태 134.

실시양태 133에 있어서, 샘플은 대상체로부터 단리된 혈액을 포함하는, 방법.

실시양태 135.

항-B형 간염 및/또는 항-D형 간염 백신에서 올바른 형태의 에피토프의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서,

(i) 백신을 실시양태 1 내지 59 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및

(ii) 항원과 항체를 포함하거나 항원과 항원 결합 단편을 포함하는 복합체가 형성되었는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는,

방법.

실시양태 136.

실시양태 1 내지 59 중 어느 하나에 있어서,

(i) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA, 또는 둘 다에 대한 강화된 결합을 갖고, 여기서 인간 FcγRIIA는 선택적으로 H131 또는 R131이고/거나, 인간 FcγRIIIA는 선택적으로 F158 또는 V158이고;

(ii) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 FcγRIIB에 대한 감소된 결합을 갖고;

(iii) 인간 FcγRIIB에 결합하지 않고;

(iv) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 C1q에 대한 감소된 결합을 갖고;

(v) 인간 C1q에 결합하지 않고;

(vi) FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA, 또는 둘 다를, G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드보다 더 큰 정도로 활성화하고, 여기서 인간 FcγRIIA는 선택적으로 H131 또는 R131이고/거나, 인간 FcγRIIIA는 선택적으로 F158 또는 V158이고;

(vii) 인간 FcγRIIB를 활성화하지 않고;

(viii) HBsAg의 존재 하에 G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드보다 더 큰 정도로 인간 자연 살해(NK) 세포를 활성화하고, 여기서 참조 폴리펩티드는 선택적으로 HB Ag, 선택적으로 HBsAg에 결합하고;

(ix) HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 HBsAg 변이체에 결합할 수 있고/거나;

(x) HBsAg에 결합하고 G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 항체 또는 항원 결합 단편과 비교하여 HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 HBsAg 변이체에 대한 개선된 결합을 갖는,

항체 또는 항원 결합 단편.

실시양태 137.

만성 HBV 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 만성 HBV 감염을 치료하는 방법으로서,

대상체에게 HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제를 투여하는 단계; 및

실시양태 1 내지 59 중 어느 하나의 항-HBV 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는,

방법.

실시양태 138.

만성 HBV 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 만성 HBV 감염을 치료하는 방법으로서,

대상체에게 HBV 유전자 발현 억제제를 투여하는 단계; 및

실시양태 1 내지 59 중 어느 하나의 항-HBV 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는,

방법.

실시양태 139.

실시양태 137 또는 138에 있어서, RNAi 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열 번호 116의 뉴클레오티드 1579-1597와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.

실시양태 140.

실시양태 137 내지 139 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열 번호 116의 뉴클레오티드 1579-1597을 포함하는, 방법.

실시양태 141.

실시양태 137 내지 140 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는, 방법.

실시양태 142.

실시양태 137 내지 140 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는, 방법.

실시양태 143.

실시양태 137 내지 142 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 이중 가닥 영역은 길이가 15-30개 뉴클레오티드 쌍인, 방법.

실시양태 144.

실시양태 137 내지 142 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 이중 가닥 영역은 길이가 17-23개 뉴클레오티드 쌍인, 방법.

실시양태 145.

실시양태 137 내지 142 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 이중 가닥 영역은 길이가 17-25개 뉴클레오티드 쌍인, 방법.

실시양태 146.

실시양태 137 내지 142 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 이중 가닥 영역은 길이가 23-27개 뉴클레오티드 쌍인, 방법.

실시양태 147.

실시양태 137 내지 142 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 이중 가닥 영역은 길이가 19-21개 뉴클레오티드 쌍인, 방법.

실시양태 148.

실시양태 137 내지 142 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 이중 가닥 영역은 길이가 21-23개 뉴클레오티드 쌍인, 방법.

실시양태 149.

실시양태 137 내지 142 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 각 가닥은 15-30개의 뉴클레오티드를 갖는, 방법.

실시양태 150.

실시양태 137 내지 142 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 각 가닥은 19-30개의 뉴클레오티드를 갖는, 방법.

실시양태 151.

실시양태 137 내지 150 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제는 siRNA인, 방법.

실시양태 152.

실시양태 151에 있어서, siRNA는 HBsAg 단백질, HBcAg 단백질 및 HBx 단백질 또는 HBV DNA 중합효소 단백질을 인코딩하는 HBV 전사체의 발현을 억제하는, 방법.

실시양태 153.

실시양태 151 또는 152에 있어서, siRNA는 P 유전자, NC_003977.2의 뉴클레오티드 2309-3182 및 1-1625; S 유전자(L, M 및 S 단백질 인코딩), NC_003977.2의 뉴클레오티드 2850-3182 및 1-837; HBx, NC_003977.2의 뉴클레오티드 1376-1840; 또는 C 유전자, NC_003977.2의 뉴클레오티드 1816-2454에 의해 인코딩된 표적의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드에 결합된, 방법.

실시양태 154.

실시양태 151 또는 152에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(서열 번호 119)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.

실시양태 155.

실시양태 151 또는 152에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(서열 번호 119)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.

실시양태 156.

실시양태 151 또는 152에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(서열 번호 119)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.

실시양태 157.

실시양태 151 또는 152에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(서열 번호 119)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진, 방법.

실시양태 158.

실시양태 154 내지 157 중 어느 하나에 있어서, siRNA의 센스 가닥은 5'- GUGUGCACUUCGCUUCACA-3'(서열 번호 118)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.

실시양태 159.

실시양태 154 내지 157 중 어느 하나에 있어서, siRNA의 센스 가닥은 5'- GUGUGCACUUCGCUUCACA-3'(서열 번호 118)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진, 방법.

실시양태 160.

실시양태 151 또는 152에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(서열 번호 121)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.

실시양태 161.

실시양태 151 또는 152에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(서열 번호 121)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.

실시양태 162.

실시양태 151 또는 152에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(서열 번호 121)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.

실시양태 163.

실시양태 151 또는 152에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(서열 번호 121)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진, 방법.

실시양태 164.

실시양태 154 내지 157 중 어느 하나에 있어서, siRNA의 센스 가닥은 5'- GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA-3'(서열 번호 120)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.

실시양태 165.

실시양태 154 내지 157 중 어느 하나에 있어서, siRNA의 센스 가닥은 5'- GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA-3'(서열 번호 120)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진, 방법, 사용을 위한 조성물 또는 용도.

실시양태 166.

실시양태 151 내지 165 중 어느 하나에 있어서, 상기 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 상기 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고, 여기서 상기 센스 가닥은 3'-말단에 부착된 리간드에 접합된, 방법.

실시양태 167.

실시양태 166에 있어서, 리간드는 1가 링커, 2가 분지형 링커 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체인, 방법.

실시양태 168.

실시양태 166 또는 167에 있어서, 리간드는

인,

방법.

실시양태 169.

실시양태 168에 있어서, siRNA는 하기 구조로 나타낸 바와 같이 리간드에 접합된, 방법:

상기에서, X는 O 또는 S이다.

실시양태 170.

실시양태 151 내지 169 중 어느 하나에 있어서, siRNA의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 데옥시-뉴클레오티드, 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시 변형 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 잠금 해제 뉴클레오티드, 구조적으로 제한된 뉴클레오티드, 구속된 에틸 뉴클레오티드, 염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형 뉴클레오티드, 2'-C-알킬 변형 뉴클레오티드, 2'-하이드록실 변형 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 변형 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기를 포함하는 뉴클레오티드, 테트라하이드로피란 변형 뉴클레오티드, 1,5-언하이드로헥시톨 변형 뉴클레오티드, 사이클로헥세닐 변형 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 아데노신-글리콜 핵산, 또는 5'-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는 변형된 뉴클레오티드인, 방법.

실시양태 171.

실시양태 151 내지 169 중 어느 하나에 있어서, siRNA는 포스페이트 백본 변형, 2' 리보스 변형, 5' 트리포스페이트 변형 또는 GalNAc 접합 변형을 포함하는, 방법.

실시양태 172.

실시양태 171에 있어서, 포스페이트 백본 변형은 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 방법.

실시양태 173.

실시양태 171 또는 172에 있어서, 2' 리보스 변형은 플루오로 또는 -O-메틸 치환을 포함하는, 방법.

실시양태 174.

실시양태 151 내지 159 및 실시양태 166 내지 173 중 어느 하나에 있어서, siRNA는 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(서열 번호 122)를 포함하는 센스 가닥 및 5'-UsGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusU-3'(서열 번호 123)를 포함하는 안티센스 가닥을 갖고,

여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;

Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;

s는 포스포로티오에이트 결합이고;

L96은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤리놀인,

방법.

실시양태 175.

실시양태 151 내지 159 및 실시양태 166 내지 173 중 어느 하나에 있어서, siRNA는 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(서열 번호 124)를 포함하는 센스 가닥 및 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(서열 번호 125)를 포함하는 안티센스 가닥을 갖고,

여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;

Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;

(Agn)은 아데노신-글리콜 핵산(GNA)이고;

s는 포스포로티오에이트 결합이고;

L96은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤리놀이다.

실시양태 176.

실시양태 151 내지 153 및 160 내지 173 중 어느 하나에 있어서, siRNA는 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(서열 번호 124)를 포함하는 센스 가닥 및 5'-UsGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusU-3'(서열 번호 125)를 포함하는 안티센스 가닥을 갖고,

여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;

Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고,;

s는 포스포로티오에이트 결합이고;

L96은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤리놀인,

방법, 사용을 위한 조성물, 또는 용도.

실시양태 177.

실시양태 137 내지 176 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 인간이고 치료 유효량의 RNAi 작용제 또는 siRNA가 대상체에게 투여되고; 여기서 RNAi 작용제 또는 siRNA의 유효량은 약 1 mg/kg 내지 약 8 mg/kg인, 방법.

실시양태 178.

실시양태 137 내지 177 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제 또는 siRNA는 대상체에게 1일 2회, 1일 1회, 2일마다, 3일마다, 주 2회, 주 1회, 격주로, 4주마다 또는 한 달에 한 번 투여되는, 방법.

실시양태 179.

실시양태 137 내지 177 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제 또는 siRNA는 4주마다 대상체에게 투여되는, 방법.

실시양태 180.

실시양태 151 내지 179 중 어느 하나에 있어서, 각각 HBV 유전자에 대한 2개의 siRNA가 투여되고, 제1 siRNA는 서열 번호 119, 서열 번호 120, 또는 서열 번호 126를 포함하는 안티센스 가닥을 갖고; 제2 siRNA는 서열 번호 116의 뉴클레오티드 2850-3182의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 센스 가닥을 갖는 siRNA를 포함하는, 방법.

실시양태 181.

실시양태 151 내지 179 중 어느 하나에 있어서, HBV 유전자에 대한 2개의 siRNA가 투여되고, 여기서 2개의 siRNA는 HBV X 유전자에 대한 siRNA 및 HBV S 유전자에 대한 siRNA를 포함하는, 방법.

실시양태 182.

실시양태 151 내지 179 중 어느 하나에 있어서, 각각 HBV 유전자에 대한 2개의 siRNA가 투여되고, 제1 siRNA는 서열 번호 119, 서열 번호 123, 또는 서열 번호 125를 포함하는 안티센스 가닥을 갖고; 제2 siRNA는 서열 번호 121 또는 서열 번호 127을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는, 방법.

실시양태 183.

실시양태 181에 있어서, 제1 siRNA는 서열 번호 118, 서열 번호 122, 또는 서열 번호 124를 포함하는 센스 가닥을 갖고; 제2 siRNA는 서열 번호 120 또는 서열 번호 126을 포함하는 센스 가닥을 갖는, 방법.

실시양태 184.

실시양태 179 내지 183 중 어느 하나에 있어서, 2개의 siRNA가 동시에 투여되는 방법.

실시양태 185.

실시양태 137 내지 184 중 어느 하나에 있어서, 대상체에게 뉴클레오티(시)드 유사체를 투여하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는 대상체에게 또한 뉴클레오티(시)드 유사체가 투여되는 방법.

실시양태 186.

실시양태 185에 있어서, 뉴클레오티(시)드 유사체는 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(TDF), 테노포비르 알라페나미드(TAF), 라미부딘, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르(ETV), 텔비부딘, AGX-1009, 엠트리시타빈(FTC), 클레부딘, 리토나비르, 디피복실, 로부카비르, 팜비르, N-아세틸-시스테인(NAC), PC1323, theradigm-HBV, 티모신-알파 및 간시클로비르, 베시포비르(ANA-380/LB-80380), 또는 테노프비르-엑살리아데스(TLX/CMX157)인, 방법.

일부 경우, 본원에 제공된 항체, 항원-결합 단편, 융합 단백질, 핵산, 세포, 조성물, 조합, 용도 및 방법의 요소는 실시양태 또는 실시예를 참조하여 기술되거나 열거된다. 그러나, 본원에 기술된 실시예 및 실시양태는 추가적인 실시양태를 생성하기 위해 다양한 방식으로 결합될 수 있는 것으로 이해해야 한다.

실시예

다음에서, 본 개시내용의 다양한 실시예 및 측면을 설명하는 특정 실시예가 제시된다. 그러나, 본 개시내용은 본원에 설명된 특정 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않는다.

실시예 1: 항-HBV 항체에 의한 이량체 형성

항-HBV 항체는 PCT 공개 번호 WO 2017/060504에 개시되어 있다. 항-HBV 항체 "HBC34-v7"의 조작으로 특히 각각 서열 번호 38 및 57에 따른 VH 및 VL 아미노산 서열을 갖는 항체 "HBC34-v35"(PCT 공개 번호 WO 2020/132091)를 생산하였다. HBC34-v35는 피코몰 친화력으로 HBsAg에 결합하고 보존된 구조적 에피토프에 결합하는 10개의 HBV 유전자형과 D형 간염 바이러스를 강력하게 중화한다. HBC34-v35(IgG1로 발현되고 Fc 돌연변이 G236A, A330L, I332E, M428L 및 N434S(EU 넘버링; "GAALIE-MLNS" 또는 "GAALIE+MLNS" 또는 "MLNS-GAALIE" 또는 "MLNS + GAALIE"로 총칭)를 포함함)에 대한 대표적인 결합 및 중화 데이터가 도 1에 나와 있다.

HBC34-v35를 숙주 세포주에서 재조합 IgG(알로타입 G1m17, 1)로 발현시키고, 상청액으로부터 정제한 후, 투여용으로 제형화하였다. 1주 인큐베이션 후 제형의 크기-배제 크로마토그래피 분석에 따라 항체 단량체(즉, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 단일 항체 분자)에 해당하는 피크 및 항체 이량체(즉, 두 개의 단일 항체 분자에 의해 형성된 응집체)에 해당하는 고분자량 종이 나타났다(도 2).

이량체 형성이 Fab-Fab 상호작용을 통해 매개되고 재조합 Fab도 이량체화한다는 가설을 세웠다. 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 풍부한 IgG 이량체 및 Fab 이량체를 정제하였다. 도 3은 Fab 이량체 비율이 시간이 지남에 따라 천천히 증가함을 보여준다; 이량체 형성 동역학도 온도에 따라 증가하였다(데이터는 표시되지 않음).

Fab 이량체화의 다양한 모드가 기술되어 있다(예를 들어, Plath et al. MAbs 8 (5):928-940(2016)). Fab 이량체화 방식에 따라, Fab는 항원에 결합하는 능력을 유지하거나 상실할 것이다. 예를 들어, IgG 이량체는 결합 능력의 최대 50%를 잃을 것이고 4개의 Fab 중 2개는 영향을 받지 않을 것으로 예상할 수 있다. 도 4에 나타낸 바와 같이, HBC34-v35 이량체(전장 IgG 또는 Fab)는 표면 플라스몬 공명(SPR; 표면에 포획된 유사한 양(질량 기준)의 단량체 및 이량체 항체를 가짐)에 의해 결정된 바와 같이 HBsAg에 대한 감소된 결합을 가지며, CDR과 관련된 이량체화와 일치한다.

다음으로, HBC34-v35 rFab 이량체 또는 단량체의 결정화를 수행하였다. rFab 이량체를 분취용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리하였다(도 5A). RT에서 3 x 96 조건을 설정하였다(농도: 5.5 mg/ml). 세 가지 다른 조건에서 결정을 얻었지만 회절이 좋지 않았고 다결정이었다. 새로운 라운드의 인큐베이션 및 결정화 최적화로 고품질 회절이 생성되었다(도 5B). rFab 단량체에 대해서는 분취용 크기 배제 크로마토그래피를 정제에 사용하였다(도 6A). 40℃에서 인큐베이션한 후 얻은 물질은 결정을 생성하지 않았다(RT에서 3개의 트레이, 5 mg/mL 또는 9 mg/mL). 인큐베이션 단계 없이 모노머의 제2 배치를 제조하였다; 결정은 4℃에서 형성되었지만 RT에서는 형성되지 않았다(각각 4개의 트레이, 2개의 농도)(도 6B). Fab 이량체 결정 구조의 분석에 따르면 이량체화는 L-CDR2를 포함하고(도 7-9), 이량체 형태로 존재하는 Fab는 유사한 형태를 가지며, L-CDR2는 단량체와 이량체 사이에서 형태 변화를 겪는 것으로 나타났다(도 10). L-CDR2와 프레임워크 잔기 간의 잠재적인 상호작용이 확인되었다.

실시예 2: 이량체 형성이 감소된 조작된 항체

HBC34-v35는 L-CDR2에서의 것을 포함하여 생식계열 서열과 비교하여 경쇄에 여러 돌연변이를 포함한다. L-CDR2에 존재하고 Fab-Fab 상호작용에 관여하는 것으로 생각되는 3개의 인접한 아미노산을 생식계열로 복귀시켜 추가 변이체 항체 HBC34-v36을 생성하였다. 별도의 실험에서, HBC34-v35 및 HBC34-v36 Fab(>10 mg/mL)를 40℃에서 5-7일 동안 인큐베이션하고 이량체 백분율을 절대 크기 배제 크로마토그래피(aSEC)로 평가하였다. 도 11A에 나타낸 바와 같이, 생식계열 서열로의 복귀는 이량체화를 현저히 감소시켰다. 3 mg/mL의 HBC34-v36 전장 IgG는 40℃에서 2주 후에도 이량체화되지 않았다(데이터는 표시되지 않음).

실시예 3: 항체에 의한 결합 및 시험관내 중화

HBsAg에 결합하고 HBV 감염을 중화시키는 HBC34-v35 및 HBC34-v36의 능력을 비교하였다. 결합을 ELISA에 의해 평가하였고 HBC34-v36은 HBC34-v35와 유사한 결합 활성을 가지는 것으로 나타났다(각각 EC50 = 0.7 ng/mL vs. 0.6 ng/mL, 도 12). NTCP를 발현하는 HBV-감염 HepG2 세포의 세포 배양 상청액에서 HBeAg(유전자형 D)의 수준을 측정함으로써 중화를 평가하였다. 데이터는 도 13에 나타나 있으며, HBV 유전자형 D의 중화가 HBC34-v35보다 HBC34-v36에서 대략 3배 더 약함을 보여준다. 이러한 실험을 위해 항체에 야생형 IgG1 Fc가 포함되었다.

실시예 4: 추가적인 조작된 항체의 설계 및 시험

HBC34-v36을 출발점으로 사용하여 L-CDR2 및/또는 HBC34-v35에 대한 프레임워크 서열에 돌연변이를 갖는 추가의 조작된 변이체 항체를 생성하였다. 이 변이체를 HBC34-v37-HBC34-v50으로 명명하였다. 다양한 항체로부터의 경쇄 가변 영역 서열 및 HBC34-v35에 대한 돌연변이가 표 6에 요약되었다. 표 6에 나타낸 바와 같은 아미노산 잔기의 CDR 서열 및 번호는 Chemical Computing Group에 의해 개발된 시스템에 따른 것이다(chemcomp.com).

HBC34-v37-HBC34-v50의 HBsAg 결합 및 HBV 중화 활성을 본원에 기재된 분석법을 사용하여 시험하였다. 결합 분석으로부터의 결과는 도 14A-14E에 제공되었으며, HBC34-v47 및 HBC34-v48을 제외한 시험된 모든 변이체 항체가 HBC34-v35와 비교하여 유사하거나 심지어 더 강한 결합을 가지는 것으로 나타났다. HBC34-v47 및 HBC34-v48도 생산 수율이 낮아 추가 시험을 위해 선택되지 않았다. 중화 분석의 결과를 도 15에 제공하였으며, 여러 항체(HBC34-v40-HBC34-v46, HBC34-v49 및 HBC34-v50)가 HBC34-v35와 비교하여 유사하거나 심지어 개선된 중화 활성(EC50)을 가지는 것으로 나타났다. HBC34-v36-HBC34-v39는 덜 강력한 중화 활성을 가졌다.

실시예 5: 특정 조작된 항체의 정제

조작된 변이체 항체를 32일 동안 다양한 온도에서 인큐베이션 후 응집체 형성에 대해 평가하였다. 9개의 HBC34-v35 항체 변이체 및 모 HBC34-v35를 숙주 세포주에서 재조합 IgG(동종이형 G1m17, 1)로 발현시키고 상청액으로부터 정제하였다. 생산 후 1주일 이후에 항체를 받아 25 mg/ml로 농축하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석을 사용하여 -1일, 0일, 5일, 15일 및 32일에 항체 이량체에 해당하는 고분자량 종(HMWS)을 모니터링하였다. -1일 샘플을 농축 전에 평가하였다. 항체 조성물을 32일 분석 과정 동안 4℃(도 16A), 25℃(도 16B) 또는 40℃(도 16C)에서 인큐베이션하였다. 40℃에서 32일 인큐베이션 후 HMWS 빈도를 도 16D에 요약하여 나타냈다. 4개의 변이체 항체(-v40, -v44, -v45, -v50)는 낮은 HMWS 생성을 나타냈고(도 16D) 추가 연구를 위해 선택하였다.

실시예 6: 특정 조작된 항체에 의한 결합 및 시험관내 중화

HBC34-v40, HBC34-v44, HBC34-v45 및 HBC34-v50의 10개((A)-(J)) 유전자형으로부터의 HBsAg에 대한 결합을 FACS로 시험하였다. HBC34-v35가 참조로 포함되었다. 시험된 모든 변이체는 HBsAg에 결합했으며, HBC34-v40이 가장 강력한 결합을 나타냈다(도 17A-17J). 10개의 HBsAg-유전자형 D 돌연변이에 대한 HBC34-v40, HBC34-v44, HBC34-v45 및 HBC34-v50의 결합을 FACS에 의해 시험하였다. HBC34-v35가 참조로 포함되었다. 조작된 모든 변이체는 HBsAg에 결합하였다(도 18A-18K).

실시예 7: 특정 조작된 항체의 생산

HBC34-v35, HBC34-v40, HBC34-v44, HBC34-v45 및 HBC34-v50에 대한 항체 역가를 측정하여 숙주 세포에서의 생산성을 평가하였다. 항체를 숙주 세포주에서 재조합 IgG(알로타입 G1m17, 1)로 발현시키고 상청액으로부터 정제하였다. 5 ml 및 100 ml 규모의 형질감염 시스템을 모두 평가했으며, 100 ml 시스템은 이중 또는 삼중으로 시험하였다. 개별 5 ml 및 100 ml 규모 시험의 항체 역가와 100 ml 규모 시험의 평균 역가가 도 19에 나와 있다.

실시예 8: 특정 조작된 항체의 열안정성

HBC34-v35, HBC34-v40, HBC34-v44, HBC34-v45 및 HBC34-v50을 숙주 세포주에서 재조합 IgG(알로타입 G1m17, 1)로 발현시키고 상층액으로부터 정제하였다. 항체를 25 mg/ml로 농축하고 40℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 도 20에 도시된 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피 분석을 사용하여 4일째 항체 이량체에 해당하는 고분자량 종(HMWS)을 정량화하였다. HBC34-v35만이 4일 후 유의적인 HMWS를 나타냈다.

실시예 9: 항체 이량체 형성에 관여하는 경쇄 아미노산의 분석

구조적 연구에 의해 항체:항체 이량체 형성에 관여하는 HBC34-v35 VL 영역의 아미노산 잔기 수를 확인하였다. 2개의 HBC34-v35 항체 분자(여기서, "항체 분자 1" 및 "항체 분자 2")의 경쇄 잔기 사이의 상호작용이 도 21A, 22A 및 23A에 예시되어 있으며, 여기서, E49(항체 분자 1)는 S64 및 K51(항체 분자 2)과 상호작용하고; V50(항체 분자 1)은 V50(항체 분자 2)과 상호작용하고; K51(항체 분자 1)은 E49(항체 분자 2)와 상호작용하고; S64(항체 분자 1)는 E49(항체 분자 2)와 상호작용한다. 2개의 HBC34-v35 항체의 다른 경쇄 아미노산 사이의 상호작용이 도 21B, 22B 및 23B에 나타나 있으며, 여기서 R60(항체 분자 1)은 D81 및 Q78(항체 분자 2)과 상호작용하고; F61(항체 1)은 I74(항체 분자 2)와 상호작용하고; I74(항체 분자 1)는 F61(항체 분자 2)과 상호작용하고; Q78(항체 분자 1)은 R60(항체 분자 2)과 상호작용하고; D81(항체 분자 1)은 R60(항체 분자 2)과 상호작용한다.

4개의 조작된 항체, HBC34-v40, HBC34-v44, HBC34-v45 및 HBC34-v50은 강력한 결합을 유지하면서 낮은 응집 성향을 갖는 것으로 결정되었다.

HBC34-v40은 도 21C에 나타낸 바와 같이 모 HBC34-v35와 비교하여 L-CDR2(CCG 넘버링)에서 E49Q, V50D 및 K51S 돌연변이를 포함한다. 이들 돌연변이는 소수성 상호작용에서 정전기적 반발 및 염다리 손실로 변하지만, 염다리의 손실만으로는 응집을 감소시키기에 충분하지 않았다(E49Q 및 K51S 돌연변이를 포함하지만 V50D는 포함하지 않는 HBC34-v41과 비교하여, 도 16D 참조).

HBC34-v44는 도 22C에 나타낸 바와 같이 HBC34-v35와 비교하여 L-CDR2에서 E49A 돌연변이를 포함한다. 이 돌연변이로 인해 염다리가 손실된다.

HBC34-v45 및 HBC34-v50은 도 23C에 나타낸 바와 같이 HBC34-v35에 비해 R60에 프레임워크 돌연변이를 포함한다. HBC34-v45 및 HBC34-v50에서 R60N 및 R60K 돌연변이는 각각 이량체 형성을 감소시켰다. HBC34-v46에서 R60A 돌연변이는 이량체 형성 감소에 덜 효과적이었다(도 16D 참조).

전술한 다양한 실시양태들은 추가 실시양태를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 본 명세서 및/또는 출원 데이터 시트에 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 공보물은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 실시양태들의 측면은 추가 실시양태를 제공하기 위해 필요한 경우 다양한 특허, 출원 및 공보의 개념을 채택하도록 수정될 수 있다.

2020년 6월 24일에 출원된 미국 가출원 63/043,692는 그 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.

전술한 상세한 설명에 비추어 실시양태에 대해 이들 및 다른 변경이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 후술되는 청구범위에서 사용되는 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시된 특정한 실시양태로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 청구범위가 부여하는 동등한 전 범위와 함께 모든 가능한 실시양태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서 청구범위는 개시내용에 의해 제한되지 않는다.

SEQUENCE LISTING <110> Vir Biotechnology, Inc. Humabs BioMed SA <120> ENGINEERED HEPATITIS B VIRUS NEUTRALIZING ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 930485.414WO <140> PCT <141> 2021-06-23 <150> US 63/043,692 <151> 2020-06-24 <160> 173 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <221> VARIANT <222> (1)...(11) <223> Xaa = any amino acid <400> 1 Xaa Xaa Xaa Thr Cys Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = P, T or S <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = C or S <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = R, K, D or I <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = M or T <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = T, A or I <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa = T, P or L <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa = Q, H or L <400> 2 Xaa Xaa Xaa Thr Cys Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 226 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <223> S domain of HBsAg (GenBank acc. no. 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Synthetic sequence HBC34-V35-50 CL (codon-optimized)_2 <400> 99 ggacagccaa aggctgctcc atctgtgacc ctgtttccac cctcttccga ggagctgcag 60 gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc tctgacttct accctggagc tgtgacagtg 120 gcttggaagg ctgatagctc tcccgtgaag gctggcgtgg agacaacaac ccctagcaag 180 cagtctaaca ataagtacgc cgcttccagc tatctgtctc tgacaccaga gcagtggaag 240 tcccaccgct cttattcctg ccaggtgacc catgagggca gcaccgtgga gaagacagtg 300 gcccccaccg agtgttct 318 <210> 100 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1)...(33) <223> Xaa = Cys <400> 100 Xaa Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr 1 5 10 15 Xaa Pro Ser Asp Gly Asn Ala Thr Ala Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp 20 25 30 Xaa <210> 101 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 101 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly 1 5 10 15 <210> 102 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 102 Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser 1 5 10 15 Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr 20 25 <210> 103 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1)...(33) <223> Xaa = Cys <400> 103 Xaa Ser Met Tyr Pro Ser Ala Ser Ala Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn 1 5 10 15 Xaa Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser 20 25 30 Xaa <210> 104 <211> 11 <212> PRT <213> Heptatits B Virus <220> <223> amino acids 120 - 130 of the S domain of HBsAg (HBV-D J02203 <400> 104 Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly 1 5 10 <210> 105 <211> 11 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = R or K <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = M or T <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = T or I <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = T, P, or L <400> 105 Pro Cys Xaa Thr Cys Xaa Xaa Xaa Ala Gln Gly 1 5 10 <210> 106 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 106 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Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys 1 5 10 <210> 113 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <400> 113 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Cys 1 5 10 15 <210> 114 <211> 14 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <400> 114 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe 1 5 10 <210> 115 <211> 5 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <221> VARIANT <222> (1)...(5) <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 115 Pro Cys Arg Xaa Cys 1 5 <210> 116 <211> 3182 <212> DNA <213> Hepatits B Virus <400> 116 aattccacaa ccttccacca aactctgcaa gatcccagag tgagaggcct gtatttccct 60 gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgttctga ctactgcctc tcccttatcg 120 tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc 180 ctaggacccc ttctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata 240 ccgcagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac taccgtgtgt 300 cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcttg tcctccaact 360 tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tcttcctctt catcctgctg 420 ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct 480 ctaattccag gatcctcaac aaccagcacg ggaccatgcc ggacctgcat gactactgct 540 caaggaacct ctatgtatcc ctcctgttgc tgtaccaaac cttcggacgg aaattgcacc 600 tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc ggaaaattcc tatgggagtg ggcctcagcc 660 cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 720 actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc 780 ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc 840 ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc taaattttat gggttatgtc attggatgtt 900 atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc 960 ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg 1020 ctgccccttt tacacaatgt ggttatcctg cgttgatgcc tttgtatgca tgtattcaat 1080 ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga 1140 acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 1200 ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcatgcg tggaaccttt tcggctcctc 1260 tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa 1320 acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tatcccgcaa atatacatcg tttccatggc 1380 tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 1440 cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc 1500 gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 1560 cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 1620 cgtgaacgcc caccaaatat tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc 1680 aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 1740 gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 1800 ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcttg ttcatgtcct 1860 actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat cgacccttat 1920 aaagaatttg gagctactgt ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt ctttccttca 1980 gtacgagatc ttctagatac cgcctcagct ctgtatcggg aagccttaga gtctcctgag 2040 cattgttcac ctcaccatac tgcactcagg caagcaattc tttgctgggg ggaactaatg 2100 actctagcta cctgggtggg tgttaatttg gaagatccag cgtctagaga cctagtagtc 2160 agttatgtca acactaatat gggcctaaag ttcaggcaac tcttgtggtt tcacatttct 2220 tgtctcactt ttggaagaga aacagttata gagtatttgg tgtctttcgg agtgtggatt 2280 cgcactcctc cagcttatag accaccaaat gcccctatcc tatcaacact tccggagact 2340 actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga 2400 aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aatctcaatg ttagtattcc 2460 ttggactcat aaggtgggga actttactgg gctttattct tctactgtac ctgtctttaa 2520 tcctcattgg aaaacaccat cttttcctaa tatacattta caccaagaca ttatcaaaaa 2580 atgtgaacag tttgtaggcc cactcacagt taatgagaaa agaagattgc aattgattat 2640 gcctgccagg ttttatccaa aggttaccaa atatttacca ttggataagg gtattaaacc 2700 ttattatcca gaacatctag ttaatcatta cttccaaact agacactatt tacacactct 2760 atggaaggcg ggtatattat ataagagaga aacaacacat agcgcctcat tttgtgggtc 2820 accatattct tgggaacaag atctacagca tggggcagaa tctttccacc agcaatcctc 2880 tgggattctt tcccgaccac cagttggatc cagccttcag agcaaacacc gcaaatccag 2940 attgggactt caatcccaac aaggacacct ggccagacgc caacaaggta ggagctggag 3000 cattcgggct gggtttcacc ccaccgcacg gaggcctttt ggggtggagc cctcaggctc 3060 agggcatact acaaactttg ccagcaaatc cgcctcctgc ctccaccaat cgccagtcag 3120 gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt 3180 gg 3182 <210> 117 <211> 3215 <212> DNA <213> Hepatitis B Virus <400> 117 ctccacaaca ttccaccaag ctctgctaga tcccagagtg aggggcctat attttcctgc 60 tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact actgcctcac ccatatcgtc 120 aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag agcacaacat caggattcct 180 aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240 acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccacgtgtcc 300 tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaacttg 360 tcctggctat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420 atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480 acttccagga acatcaacta ccagcacggg accatgcaga acctgcacga ttcctgctca 540 aggaacctct atgtttccct cttgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg 600 tattcccatc ccatcatcct gggctttcgc aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660 tttctcctgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720 tgtttggctt tcagctatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780 gagtcccttt ttacctctat taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttgaaccct 840 aataaaacca aacgttgggg ctactccctt aacttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900 ggtactttac cgcaggaaca tattgtacaa aaactcaagc aatgttttcg aaaattgcct 960 gtaaatagac ctattgattg gaaagtatgt caaagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020 gcccctttta cacaatgtgg ctatcctgcc ttgatgcctt tatatgcatg tatacaatct 1080 aagcaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc tgtgtaaaca atatctaaac 1140 ctttaccccg ttgcccggca acggtcaggt ctctgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200 acgggttggg gcttggccat aggccatcgg cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260 ccgatccata ctgcggaact cctagcagct tgttttgctc gcagccggtc tggagcgaaa 1320 cttatcggaa ccgacaactc agttgtcctc tctcggaaat acacctcctt tccatggctg 1380 ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc 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gtatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280 cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340 tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400 gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtatccctt 2460 ggactcataa ggtgggaaac tttactgggc tttattcttc tactgtacct gtctttaatc 2520 ctgattggaa aactccctcc tttcctcaca ttcatttaca ggaggacatt attaatagat 2580 gtcaacaata tgtgggccct ctgacagtta atgaaaaaag gagattaaaa ttaattatgc 2640 ctgctaggtt ctatcctaac cttaccaaat atttgccctt ggacaaaggc attaaaccgt 2700 attatcctga atatgcagtt aatcattact tcaaaactag gcattattta catactctgt 2760 ggaaggctgg cattctatat aagagagaaa ctacacgcag cgcctcattt tgtgggtcac 2820 catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgacaaggc 2880 atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 2940 cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcac 3000 tggccagagg caaatcaggt aggagcggga gcatttggtc cagggttcac cccaccacac 3060 ggaggccttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacaacact gccagcagca 3120 cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaagacagc ctactcccat ctctccacct 3180 ctaagagaca gtcatcctca ggccatgcag tggaa 3215 <210> 118 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBV001 sense <400> 118 gugugcacuu cgcuucaca 19 <210> 119 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBV001 antisense <400> 119 ugugaagcga agugcacacu u 21 <210> 120 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBV003 sense <400> 120 gguggacuuc ucucaauuuu a 21 <210> 121 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBV003 antisense <400> 121 uaaaauugag agaaguccac cac 23 <210> 122 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBV002v2 sense <400> 122 gugugcacuu cgcuucaca 19 <210> 123 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBV002v2 antisense <400> 123 ugugaagcga agugcacacu u 21 <210> 124 <211> 19 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Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 131 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Drosophila Antennapedia protein <400> 131 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 <210> 132 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence CDR framework <400> 132 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn 20 25 <210> 133 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence CDR framework <400> 133 Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr 1 5 10 15 Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala 20 25 30 <210> 134 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 <400> 134 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 135 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence GL L2 <400> 135 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 136 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence v36 + Q49E <400> 136 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 137 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence v36 + D50V <400> 137 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Val Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 138 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence v36 + S51K <400> 138 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 139 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence v36 + K52Y <400> 139 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Ser Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 140 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence v36 + D50V + K52Y <400> 140 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Val Ser Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 141 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 +K51S + S64A <400> 141 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 142 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 +E49Q <400> 142 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Val Lys Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 143 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 +E49A <400> 143 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Ala Val Lys Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 144 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 +R60N <400> 144 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Asn Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 145 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 +R60A <400> 145 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 146 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 +K51S + S64A + R60N + I74A <400> 146 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Asn Phe Ser Gly Ala Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ala Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 147 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 +R60N + S64A + I74A <400> 147 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Asn Phe Ser Gly Ala Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ala Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 148 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 +K51S <400> 148 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 149 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 + R60K <400> 149 Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ile Pro Glu Lys Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys 35 40 45 <210> 150 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence CDRH1 (IMGT) <400> 150 Gly Arg Ile Phe Arg Ser Phe Tyr 1 5 <210> 151 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence CDRH2 - short (IMGT) <400> 151 Gln Asp Gly Ser Glu Lys 1 5 <210> 152 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence CDRH2 - long (IMGT) <400> 152 Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys 1 5 <210> 153 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence CDRH3 (IMGT) <400> 153 Ala Ala Trp Ser Gly Asn Ser Gly Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 154 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence CDRL1 (IMGT) <400> 154 Lys Leu Gly Asn Lys Asn 1 5 <210> 155 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v35, -v45, -v46, -v48 CDRL2 - short <400> 155 Glu Val Lys 1 <210> 156 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v36, -v40 CDRL2 - short (IMGT) <400> 156 Gln Asp Ser 1 <210> 157 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v37 CDRL2 - short (IMGT) <400> 157 Glu Asp Ser 1 <210> 158 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v38, -v41, CDRL2 - short (IMGT) <400> 158 Gln Val Ser 1 <210> 159 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v39 CDRL2 - short (IMGT) <400> 159 Gln Asp Lys 1 <210> 160 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v42, -v47, -v49, -v50 CDRL2 - short (IMGT) <400> 160 Glu Val Ser 1 <210> 161 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v43 CDRL2 - short (IMGT) <400> 161 Gln Val Lys 1 <210> 162 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v44 CDRL2 - short (IMGT) <400> 162 Ala Val Lys 1 <210> 163 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v35, -v45, -v46, -v48 CDRL2 - long <400> 163 Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 164 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v36 CDRL2 - long (IMGT) <400> 164 Val Ile Tyr Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 165 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v37 CDRL2 - long (IMGT) <400> 165 Val Ile Tyr Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 166 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v38 CDRL2 - long (IMGT) <400> 166 Val Ile Tyr Gln Val Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 167 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v39 CDRL2 - long (IMGT) <400> 167 Val Ile Tyr Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 168 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v40 CDRL2 - long (IMGT) <400> 168 Val Ile Tyr Gln Asp Ser Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 169 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v41 CDRL2 - long (IMGT) <400> 169 Val Ile Tyr Gln Val Ser Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 170 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v42, -v47, -v49, -v50 CDRL2 - long <400> 170 Val Ile Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 171 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v43 CDRL2 - long (IMGT) <400> 171 Val Ile Tyr Gln Val Lys Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 172 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v44 CDRL2 - long (IMGT) <400> 172 Val Ile Tyr Ala Val Lys Tyr Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 173 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-v35-v50 CDRL3 (IMGT) <400> 173 Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val 1 5

Claims (186)

1. 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
   (i) 서열 번호 34의 아미노산 서열, 서열 번호 35 또는 서열 번호 36의 아미노산 서열, 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
   (ii) 서열 번호 41, 40, 42, 및 43 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열 번호 49, 44-48, 및 50-53 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 및 서열 번호 55 또는 56에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고,
   여기서 선택적으로 VL은 서열 번호 58에 대해 R60N 치환 돌연변이, R60A 치환 돌연변이, R60K 치환 돌연변이, S64A 치환 돌연변이, I74A 치환 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 치환 돌연변이(들)의 아미노산 넘버링은 서열 번호 58에 따르며, 추가로 선택적으로 VL은 서열 번호 58에 대해 임의의 추가 돌연변이(들)를 포함하지 않고,
   항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합할 수 있고, 선택적으로 유전자형 D, A, B, C, E, F, G, H, I, 또는 J, 또는 이들의 임의의 조합의 B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염을 중화시킬 수 있는,
   항체 또는 이의 항원 결합 단편.
2. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편:
   (i) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 49 및 55에 따른 아미노산 서열;
   (ii) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 46 및 55에 따른 아미노산 서열;
   (iii) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 47 및 55에 따른 아미노산 서열;
   (iv) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 48 및 55에 따른 아미노산 서열;
   (v) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 45 및 55에 따른 아미노산 서열;
   (vi) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 50 및 55에 따른 아미노산 서열;
   (vii) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 51 및 55에 따른 아미노산 서열;
   (viii) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 52 및 55에 따른 아미노산 서열; 또는
   (ix) VH에 각각 서열 번호 34, 35 및 37에 따른 아미노산 서열 및 VL에 각각 서열 번호 41, 53 및 55에 따른 아미노산 서열.
3. 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
   (i) 서열 번호 34에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열 번호 35 또는 36에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 및 서열 번호 37에 따른 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
   (ii) 서열 번호 40-43 중 어느 하나에 따른 CDRL1 아미노산 서열, 서열 번호 49, 44-48, 및 50-53 중 어느 하나에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 서열 번호 55 또는 56에 따른 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고,
   여기서 CDR은 CCG 넘버링 시스템에 따라 정의되며,
   항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합할 수 있고, 선택적으로 유전자형 D, A, B, C, E, F, G, H, I, 또는 J, 또는 이들의 임의의 조합의 B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염을 중화시킬 수 있으되, 단 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 45에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하지 않는,
   항체 또는 이의 항원 결합 단편.
4. 제3항에 있어서, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열은 다음 서열 번호에 따른, 항체 또는 항원-결합 단편:
   (i) 각각 34, 35, 37, 41, 49, 및 55;
   (ii) 각각 34, 35, 37, 41, 46, 및 55;
   (iii) 각각 34, 35, 37, 41, 47, 및 55;
   (iv) 각각 34, 35, 37, 41, 48, 및 55;
   (v) 각각 34, 35, 37, 41, 45, 및 55;
   (vi) 각각 34, 35, 37, 41, 50, 및 55;
   (vii) 각각 34, 35, 37, 41, 51, 및 55;
   (viii) 각각 34, 35, 37, 41, 52, 및 55;
   (ix) 각각 34, 35, 37, 41, 53, 및 55; 또는
   (x) 각각 34, 35, 37, 41, 44, 및 55.
5. 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 VH 및 VL은 각각 HBC34-v40; HBC34-v36; HBC34-v37; HBC34-v38; HBC34-v39; HBC34-v41; HBC34-v42; HBC34-v43; HBC34-v44; HBC34-v45; HBC34-v46; HBC34-v47; HBC34-v48; HBC34-v49; 또는 HBC34-v50에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3을 포함하고,
   여기서 CDR은 IMGT 넘버링에 따라 정의되며, 선택적으로 VL은 서열 번호 58에 대해 R60N 치환 돌연변이, R60A 치환 돌연변이, R60K 치환 돌연변이, S64A 치환 돌연변이, I74A 치환 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하고, 여기서 치환 돌연변이(들)의 아미노산 넘버링은 서열 번호 58에 따르며, 추가로 선택적으로 VL은 서열 번호 58에 대해 임의의 추가 돌연변이(들)를 포함하지 않는,
   항체 또는 이의 항원 결합 단편.
6. 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 VH 및 VL은 각각 HBC34-v40; HBC34-v36; HBC34-v37; HBC34-v38; HBC34-v39; HBC34-v41; HBC34-v42; HBC34-v43; HBC34-v44; HBC34-v45; HBC34-v46; HBC34-v47; HBC34-v48; HBC34-v49; 또는 HBC34-v50에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3을 포함하고,
   여기서 CDR은 CCG 넘버링에 따라 정의되며, 선택적으로 VL은 서열 번호 58에 대해 R60N 치환 돌연변이, R60A 치환 돌연변이, R60K 치환 돌연변이, S64A 치환 돌연변이, I74A 치환 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하고, 여기서 치환 돌연변이(들)의 아미노산 넘버링은 서열 번호 58에 따르며, 추가로 선택적으로 VL은 서열 번호 58에 대해 임의의 다른 돌연변이(들)를 포함하지 않는,
   항체 또는 이의 항원 결합 단편.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   (i) VH는 서열 번호 38 또는 39에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고/거나;
   (ii) VL은 서열 번호 서열 번호 62, 58-61, 63-66, 69, 71, 및 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진,
   항체 또는 이의 항원 결합 단편.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   (i) VH는 서열 번호 38 또는 39에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(즉, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 또는 그 사이의 임의의 비정수 값) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고/거나;
   (ii) VL은 서열 번호 62, 58-61, 63-66, 69, 71, 및 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(즉, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 또는 그 사이의 임의의 비정수 값) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진,
   항체 또는 이의 항원 결합 단편.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, VH 및 VL은 (i) 각각 38 및 62; (ii) 각각 38 및 59; (iii) 각각 38 및 60; (iv) 각각 38 및 61; (v) 각각 38 및 58; (vi) 각각 38 및 63; (vii) 각각 38 및 64; (viii) 각각 38 및 65; (ix) 각각 38 및 66; (x) 각각 38 및 71; 또는 (xi) 각각 38 및 72에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(즉, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 사이의 임의의 비정수 값) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
10. 서열 번호 38 또는 39의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 62, 57-61, 및 63-72 중 어느 하나의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 변이체는 R60A; R60N; R60K; S64A; 및 I74A 돌연변이 중 어느 하나 이상을 포함하고, 여기서 선택적으로 VL 변이체는 각각 서열 번호 62, 57-61, 및 63-72와 비교하여 임의의 추가 돌연변이를 포함하지 않는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
11. 서열 번호 38 또는 39의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 62, 57-61, 및 63-72 중 어느 하나의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 변이체는 Q78, D81, 또는 둘 모두에서 치환 돌연변이(예를 들어, 보존적 아미노산 치환, 또는 생식계열 인코딩 아미노산으로의 돌연변이)를 포함하고, 선택적으로 VL 변이체는 각각 서열 번호 62, 57-61, 및 63-72와 비교하여 임의의 추가 돌연변이를 포함하지 않는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, VH는 서열 번호 38 또는 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고/거나; VL은 서열 번호 62, 58-61, 63-66, 69, 71, 또는 72 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
13. 제1항 내지 제9항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, VH 및 VL은 다음 서열 번호에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체 또는 항원-결합 단편:
    (i) 각각 38 및 62;
    (ii) 각각 38 및 59;
    (iii) 각각 38 및 60;
    (iv) 각각 38 및 61;
    (v) 각각 38 및 58;
    (vi) 각각 38 및 63;
    (vii) 각각 38 및 64;
    (viii) 각각 38 및 65;
    (ix) 각각 38 및 66;
    (x) 각각 38 및 71; 또는
    (xi) 각각 38 및 72.
14. 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 여기서 VH 및 VL은 다음 서열 번호에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고:
    (i) 각각 38 및 62;
    (ii) 각각 38 및 66;
    (iii) 각각 38 및 67;
    (iv) 각각 38 및 68; 또는
    (v) 각각 38 및 72,
    여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합할 수 있고 유전자형 D, A, B, C, E, F, G, H, I, 또는 J, 또는 이들의 임의의 조합의 B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염을 중화시킬 수 있는, 항체 또는 항원 결합 단편.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, D형 간염 바이러스(HDV)에 의한 감염을 중화시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 샘플이 약 40℃에서 약 120 내지 약 168시간 동안 인큐베이션된 경우 상기 샘플에서 상기 복수의 12% 미만, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하 또는 2% 이하가 이량체에 포함되고, 여기서 선택적으로 이량체의 존재는 절대 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정되는, 항체 또는 항원 결합 단편.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 항체 또는 항원 결합 단편의 인큐베이션에 따라 복수의 참조 항체 또는 항원 결합 단편의 인큐베이션에 비해 이량체의 형성이 감소되고,
    여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열 번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하며,
    선택적으로 항체 이량체의 존재는 절대 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정되는,
    항체 또는 항원 결합 단편.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 4℃에서 5일, 15일 및/또는 32일 인큐베이션 시;
    (ii) 25℃에서 5일, 15일 및/또는 32일 인큐베이션 시; 및/또는
    (iii) 40℃에서 5일, 15일 및/또는 32일 인큐베이션 시,
    참조 항체와 비교하여 샘플 또는 조성물에서 더 낮은 양의 이량체를 형성하고/하거나, 이량체를 감소된 빈도로 형성하고/거나, 총 항체 또는 항원 결합 단편 분자를 더 낮은 비율로 형성하며,
    여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열 번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는,
    항체 또는 항원 결합 단편.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체에 포함되는 조성물 중 항체 또는 항원 결합 단편 분자의 백분율이 이량체에 존재하는 조성물 중 참조 항체 분자의 백분율의 각각 4/5 미만, 3/4 미만, 1/2 미만, 1/3 미만, 1/4 미만, 1/5 미만, 1/6 미만, 1/7 미만, 1/8 미만, 1/9 미만, 또는 1/10 미만인, 항체 또는 항원 결합 단편.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 숙주 세포가 참조 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 참조 숙주 세포 보다 항체 또는 항원 결합 단편의 양을 각각 1.5x 이상, 2x 이상, 3x 이상 또는 4x 이상 제공하고, 여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열 번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 참조 형질감염 세포에서 생산된 참조 항체 또는 항원 결합 단편에 비해 더 높은 역가로 형질감염된 세포에서 생산되고, 여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열 번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 참조 항체 또는 항원 결합 단편이 생산되는 역가보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배 또는 적어도 4배 더 높은 역가로 형질감염된 세포에서 생산되고, 여기서 참조 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열 번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3.2 이하, 3.0 미만, 2.5 미만, 2.0 미만, 1.5 미만 또는 1.0 미만의 EC50(ng/ml)으로 HBsAg(adw)에 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 3.5 미만, 3.4 미만, 3.3 미만, 3.2 미만, 3.1 미만, 3.0 미만, 2.9 미만, 2.8 미만, 2.7 미만, 2.6 미만, 2.5 미만, 2.4 미만, 2.3 미만, 2.1 미만, 2.0 미만, 1.9 미만, 1.8 미만, 1.7 미만, 1.6 미만, 1.5 미만, 1.4 미만, 1.3 미만, 1.2 미만, 1.1 미만, 또는 1.0 미만의 EC50(ng/ml)으로 HBsAg(예를 들어, adw 아형의 것)에 결합할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 0.9 내지 2.0, 또는 0.9 내지 1.9, 또는 0.9 내지 1.8, 또는 0.9 내지 1.7, 또는 0.9 내지 1.6, 또는 0.9 내지 1.5, 또는 0.9 내지 1.4, 또는 0.9 내지 1.3, 또는 0.9 내지 1.2, 또는 0.9 내지 1.1, 또는 0.9 내지 1.0, 또는 1.0 내지 2.0의 EC50(ng/ml)으로 HBsAg(예를 들어, adw 아형의 것)에 결합할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 2.0 이하의 EC50(ng/ml)으로 HBsAg(adw)에 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, B형 간염 바이러스 감염 중화 EC50이 20 ng/ml 미만, 바람직하게는 15 ng/ml 이하, 보다 바람직하게는 10 ng/mL 이하인, 항체 또는 항원 결합 단편.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 또는 7 ng/mL의 감염 중화 EC50으로 B형 간염 바이러스 감염을 중화시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 서열 번호 34, 35, 37, 41, 44, 및 55에 제시된 아미노산 서열에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고 선택적으로 서열 번호 38에 제시된 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는 참조 항체 또는 항원-결합 단편의 감염 중화 EC50보다 낮은 감염 중화 EC50으로 B형 간염 바이러스 감염을 중화시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체, 모노클로날 항체, 정제된 항체, 단일쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 다중-특이성 항체 또는 항원 결합 단편인 항체 또는 항원 결합 단편.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이성 항체 또는 항원 결합 단편인 항체 또는 항원 결합 단편.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 모이어티를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
34. 제33항에 있어서, Fc 모이어티는 돌연변이를 포함하지 않는 참조 Fc 모이어티과 비교하여 FcRn에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
35. 제33항 또는 제34항에 있어서, Fc 모이어티는 돌연변이를 포함하지 않는 참조 Fc 모이어티과 비교하여 FcγR, 바람직하게는 FcγRIIA 및/또는 FcγRIIIA에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 모이어티는 IgG1과 같은 IgG 이소형이거나, 또는 IgG1과 같은 IgG 이소형으로부터 유래되는, 항체 또는 항원-결합 단편.
37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, Ig G1m17, 1(IgHG1^*01)을 포함하거나 그로부터 유래되는 항체 또는 항원 결합 단편.
38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, FcRn에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이는
    (i) M428L/N434S;
    (ii) M252Y/S254T/T256E;
    (iii)T250Q/M428L;
    (iv) P257I/Q311I;
    (v) P257I/N434H;
    (vi) D376V/N434H;
    (vii) T307A/E380A/N434A; 또는
    (viii) (i)-(vii)의 임의의 조합을 포함하고,
    여기서 Fc 모이어티의 아미노산 넘버링은 EU 넘버링 시스템에 따르는, 항체 또는 항원-결합 단편.
39. 제38항에 있어서, FcRn에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이는 M428L/N434S를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, FcγR에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이는 S239D; I332E; A330L; G236A; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 Fc 모이어티의 아미노산 넘버링은 EU 넘버링 시스템에 따르는, 항체 또는 항원-결합 단편.
41. 제40항에 있어서, FcγR에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이는 다음의 것을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편:
    (i) S239D/I332E;
    (ii) S239D/A330L/I332E;
    (iii) G236A/S239D/I332E; 또는
    (iv) G236A/A330L/I332E.
42. 제40항 또는 제41항에 있어서, FcγR에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이는 G236A/A330L/I332E를 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로 항체 또는 항원 결합 단편은 S239D를 포함하지 않으며, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 선택적으로 위치 239에서 천연 S를 추가로 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
43. 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 모이어티는 아미노산 치환 돌연변이 M428L; N434S; G236A; A330L; 및 I332E를 포함하고, 선택적으로 S239D를 포함하지 않는, 항체 또는 항원-결합 단편.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 79의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 73의 아미노산 서열에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CH1-CH2-CH3 또는 아미노산 치환 G236A; A330L; I332E; M428L; N434S(EU 넘버링) 중 하나 이상을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
46. 제45항에 있어서, CH1-CH2-CH3은 C-말단 리신이 제거된, 항체 또는 항원-결합 단편.
47. 선택적으로 C-말단 리신이 제거된 서열 번호 75에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄(HC); 및 경쇄(LC)를 포함하는 항체로서, 여기서 LC는 (i) 서열 번호 62, 58-61 및 63-72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열 및 (ii) 서열 번호 79에 제시된 CL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체.
48. 제47항에 있어서, LC는 서열 번호 62, 66, 67 및 72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
49. 선택적으로 C-말단 리신이 제거된 서열 번호 76에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄(HC); 및 경쇄(LC)를 포함하는 항체로서, 여기서 LC는 (i) 서열 번호 62, 58-61 및 63-72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열 및 (ii) 서열 번호 79에 제시된 CL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체.
50. 제49항에 있어서, LC는 서열 번호 62, 66, 67 및 72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는,인 항체.
51. 선택적으로 C-말단 리신이 제거된 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄(HC); 및 경쇄(LC)를 포함하는 항체로서, 여기서 LC는 (i) 서열 번호 62, 58-61 및 63-72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열 및 (ii) 서열 번호 79에 제시된 CL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체.
52. 제51항에 있어서, LC는 서열 번호 62, 66, 67 및 72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
53. 선택적으로 C-말단 리신이 제거된 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄(HC); 및 경쇄(LC)를 포함하는 항체로서, 여기서 LC는 (i) 서열 번호 62, 58-61 및 63-72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열 및 (ii) 서열 번호 79에 제시된 CL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 항체.
54. 제53항에 있어서, LC는 서열 번호 62, 66, 67 및 72 중 어느 하나에 제시된 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, HBsAg 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H, I, 및 J, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 유전자형의 HBsAg에 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.
56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, HBV 감염을 갖는 포유동물에서 HBV DNA의 혈청 농도를 감소시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.
57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, HBV 감염을 갖는 포유동물에서 HBsAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.
58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, HBV 감염을 갖는 포유동물에서 HBeAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.
59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, HBV 감염을 갖는 포유동물에서 HBcrAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.
60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
61. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역(VL) 및 선택적으로 경쇄 불변 도메인(CL)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
62. 제61항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 폴리뉴클레오티드.
63. 제62항에 있어서, 서열 번호 89, 85-88, 및 90-99 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 50% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 서열 번호 81 또는 서열 번호 82에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 서열 번호 89, 85-88, 및 90-99 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
65. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 서열 번호 83에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 서열 번호 89, 85-88, 및 90-99 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
66. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 서열 번호 84에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 서열 번호 89, 85-88, 및 90-99 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
67. 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
68. 제67항에 있어서, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 포함하는 벡터.
69. 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 및/또는 제67항 또는 제68항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
70. (i) 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편;
    (ii) 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드;
    (iii) 제67항 또는 제68항에 따른 벡터;
    (iv) 제69항의 숙주 세포; 또는
    (v) (i)-(iv)의 임의의 조합,
    및 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
71. (a) 다음으로부터 선택되는 구성요소:
    (i) 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편;
    (ii) 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드;
    (iii) 제67항 또는 제68항에 따른 벡터;
    (iv) 제69항의 숙주 세포;
    (v) 제70 항의 약학적 조성물; 또는
    (vi) (i)-(vi)의 임의의 조합; 및
    (b) (1) B형 간염 감염 및/또는 D형 간염 감염을 예방, 치료, 약화 및/또는 진단하기 위해 구성요소를 사용하기 위한 설명서 및/또는 (2) 주사기와 같은, 대상체에게 구성요소를 투여하기 위한 수단을 포함하는 키트.
72. 제70항 또는 제71항에 있어서,
    (i) 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 텔비부딘, 테노포비르 또는 이들의 임의의 조합을 선택적으로 포함하는 중합효소 억제제;
    (ii) 선택적으로 IFN베타 및/또는 IFN알파를 포함하는 인터페론;
    (iii) 체크포인트 억제제 - 여기서 체크포인트 억제제는 선택적으로 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및/또는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함함 -;
    (iv) 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제; 또는
    (v) (i)-(iv)의 임의의 조합을 추가로 포함하는,
    조성물 또는 키트.
73. 제72항에 있어서, 중합효소 억제제는 라미부딘을 포함하는, 조성물 또는 키트.
74. 제69항의 숙주 세포를 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하기에 충분한 조건 및 시간에서 배양하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 방법.
75. 대상체에서 B형 간염 감염 및/또는 D형 간염 감염을 예방, 치료, 약화 및/또는 진단하기 위한 약제의 제조에서의 i) 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편; (ii) 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드; (iii) 제67항 또는 제68항의 벡터; (iv) 제69항의 숙주 세포; 및/또는 (v) 제70항, 제72항 또는 제73항의 약학적 조성물의 용도.
76. (i) 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편; (ii) 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드; (iii) 제67항 또는 제68항의 벡터; (iv) 제69항의 숙주 세포; 및/또는 (v) 제70항, 제72항 또는 제73항의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 B형 간염 및/또는 D형 간염 감염을 치료, 예방 및/또는 약화시키는 방법.
77. 제76항에 있어서, (vi) 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 텔비부딘, 테노포비르 또는 이들의 임의의 조합을 선택적으로 포함하는 중합효소 억제제; (vii) 선택적으로 IFN베타 및/또는 IFN알파를 포함하는 인터페론; (viii) 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및/또는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 선택적으로 포함하는 체크포인트 억제제; (ix) 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제; 또는 (x) (vi)-(ix)의 임의의 조합의 하나 이상을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
78. 제76항 또는 제77항에 있어서, B형 간염 감염은 만성 B형 간염 감염인, 방법.
79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 간 이식을 받은 적이 있는, 방법.
80. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 B형 간염에 대해 면역화되지 않은, 방법.
81. 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신생아인, 방법.
82. 제76항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 혈액 투석을 받고 있거나 받은 적이 있는, 방법.
83. 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물의 단일 용량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
84. 제83항에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 2 내지 18 mg/kg(대상체 체중)의 범위로 포함하는, 방법.
85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 최대 6 mg, 최대 10 mg, 최대 15 mg, 최대 18 mg, 최대 25 mg, 최대 30 mg, 최대 35 mg, 최대 40 mg, 최대 45 mg, 최대 50 mg, 최대 55 mg, 최대 60 mg, 최대 75 mg, 최대 90 mg, 최대 300 mg, 최대 900 mg, 또는 최대 3000 mg으로 포함하거나, 또는
    약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 25 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 30 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 50 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 60 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 90 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 100 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 150 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 200 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 300 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 500 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 750 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 900 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 1500 mg 내지 3000 mg의 범위, 또는 2000 mg 내지 3000 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는
    약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 25 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 30 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 50 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 60 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 90 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 100 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 150 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 200 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 300 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 500 mg 내지 900 mg의 범위, 또는 750 mg 내지 900 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는
    약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 25 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 30 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 50 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 60 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 90 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 100 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 150 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 200 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 300 mg 내지 500 mg의 범위, 또는 400 mg 내지 500 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는
    약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 25 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 30 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 50 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 60 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 90 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 100 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 150 mg 내지 300 mg의 범위, 또는 200 mg 내지 300 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는
    약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 25 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 30 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 50 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 60 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 90 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 100 mg 내지 200 mg의 범위, 또는 150 mg 내지 200 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는
    약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 25 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 30 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 50 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 60 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 75 mg 내지 100 mg의 범위, 또는 90 mg 내지 100 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는
    약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 25 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 25 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 25 mg의 범위, 또는 15 mg 내지 25 mg의 범위, 또는 20 mg 내지 25 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는
    약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1 mg 내지 50 mg의 범위, 또는 1 mg 내지 25 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 50 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 25 mg의 범위, 또는 10 내지 50 mg의 범위, 또는 10 내지 25 mg의 범위, 또는 1 내지 15 mg의 범위, 또는 5 mg 내지 15 mg의 범위, 또는 10 mg 내지 15 mg의 범위의 양으로 포함하거나, 또는
    약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, 또는 1000 mg, 또는 그 이상의 양으로 포함하거나, 또는
    약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 3000 mg 미만, 2500 mg 미만, 2000 mg 미만, 1500 mg 미만, 1000 mg 미만, 900 mg 미만, 500 mg 미만, 300 mg 미만, 200 mg 미만, 100 mg 미만, 90 mg 미만, 75 mg 미만, 50 mg 미만, 25 mg, 또는 10 mg 미만, 1 mg 초과, 2 mg 초과, 3 mg 초과, 4 mg 초과, 또는 5 mg 초과의 양으로 포함하는,
    방법.
86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 항체를 100 mg/mL 내지 200 mg/mL 범위, 예컨대 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 또는 200 mg/mL, 바람직하게는 150 mg/mL의 농도로 포함하는, 방법.
87. 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 약 75 mg의 항체를 포함하는, 방법.
88. 제83항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 약 90 mg의 항체를 포함하는, 방법.
89. 제83항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 300 mg 이하의 항체를 포함하는, 방법.
90. 제83항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 900 mg 이하의 항체를 포함하는, 방법.
91. 제83항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물의 단일 용량은 3,000 mg 이하의 항체를 포함하는, 방법.
92. 제83항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 피하 주사에 의해 단일 용량을 투여하는 것을 포함하고, 선택적으로 단일 용량은 6 mg의 항체 또는 18 mg의 항체를 포함하거나 이로 이루어진, 방법.
93. 제83항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내 주사에 의해 단일 용량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
94. 제83항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물은 물, 선택적으로 USP 물을 추가로 포함하는, 방법.
95. 제83항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물은 히스티딘을 약학적 조성물 중에 선택적으로 10 mM 내지 40 mM의 범위, 예컨대 20 mM의 농도로 추가로 포함하는, 방법.
96. 제83항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물은 디사카라이드, 예컨대 수크로스를 선택적으로 5%, 6%, 7%, 8% 또는 9%, 바람직하게는 약 7%(w/v)로 추가로 포함하는, 방법.
97. 제83항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물은 계면활성제 또는 삼블록 공중합체, 선택적으로 폴리소르베이트 또는 폴록사머-188, 바람직하게는 폴리소르베이트 80(PS80)을 추가로 포함하고, 여기서 선택적으로 폴리소르베이트 또는 폴록사머-188은 0.01% 내지 0.05%(w/v)의 범위, 바람직하게는 0.02%(w/v)로 존재하는, 방법.
98. 제83항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물은 5.8 내지 6.2 범위, 5.9 내지 6.1 범위, 또는 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 또는 6.2의 pH를 갖는, 방법.
99. 제98항에 있어서, 약학적 조성물은
    (i) 150 mg/mL의 항체;
    (ii) USP 물;
    (iii) 20 mM 히스티딘;
    (iv) 7% 수크로스; 및
    (v) 0.02% PS80을 포함하고,
    여기서 약학적 조성물은 6의 pH를 포함하는,
    방법.
100. 제83항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 성인인, 방법.
101. 제100항에 있어서, 대상체는 18세 내지 65세 범위인, 방법.
102. 제83항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 체중이 40 kg 내지 125 kg이고/이거나 대상체는 체질량 지수(BMI)가 18 내지 35 kg/m²인, 방법.
103. 제83항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 예를 들어, 2회 양성 혈청 HBsAg, HBV DNA 및/또는 HBeAg로 정의되는 만성 HBV 감염을 갖고; 여기서 2회는 적어도 6개월 간격인, 방법.
104. 제83항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 간경변증이 없는, 방법.
105. 제104항에 있어서, 간경변증의 부재는
     섬유스캔 평가(예를 들어, 약학적 조성물의 단일 용량을 투여하기 전 6개월 이내); 또는
     간 생검(예를 들어, 약학적 조성물의 단일 용량을 투여하기 전 12개월 이내)에 의해 결정되고,
     여기서, 바람직하게는 간경변의 부재는 Metavir F3 섬유증의 부재 또는 F4 간경변의 부재에 의해 결정되는, 방법.
106. 제83항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 단일 용량이 투여되기 전에, 선택적으로 120일 이내에, 추가로 선택적으로 60일 이내에 뉴클레오시(티)드 역전사효소 억제제(NRTI)를 투여받는, 방법.
107. 제106항에 있어서, NRTI는 테노포비르; 테노포비르 디소프록실(예를 들어, 테노포비르 디프록실 푸마레이트); 테노포비르 알라페나미드; 엔테카비르; 라미부딘; 아데포비르; 및 아데포비르 디피복실 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
108. 제83항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 단일 용량이 투여되기 28일 전까지 혈청 HBV DNA 농도가 100 IU/mL 미만인, 방법.
109. 제83항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 단일 용량 투여 전에 혈청 HBsAg 농도가 3,000 IU/mL 미만이고, 선택적으로 단일 용량 투여 전 혈청 HBsAg 농도가 1,000 IU/mL 미만인, 방법.
110. 제83항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 단일 용량이 투여되기 28일 전까지 혈청 HBsAg 농도가 3,000 IU/mL 이상이고, 선택적으로 단일 용량이 투여되기 28일 전까지 혈청 HBsAg 농도가 1,000 IU/mL 이하인, 방법.
111. 제83항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 단일 용량이 투여되기 28일 전까지 HBe-항원(HBeAg)-음성인, 방법.
112. 제83항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 단일 용량이 투여되기 28일 전까지 항-HB 항체에 대해 음성인, 방법.
113. 제83항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 단일 용량의 투여 전에:
     (i) 섬유증이 없고/없거나, 간경변이 없고/거나;
     (ii) 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) < 2 x 정상 상한(ULN)을 갖는,
     방법.
114. 제83항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량 투여 후 56일에 대상체는 단일 용량 투여 전 0일 내지 28일에서 대상체의 혈청 HBsAg와 비교하여 혈청 HBsAg의 >2배 감소(예를 들어, 혈청 내 HBsAg의 농도, 예를 들어 Abbott ARCHITECT 검정을 사용하여 결정됨)를 갖는, 방법.
115. 제83항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량의 투여 후(예를 들어, 단일 용량의 투여 후 56일에) 대상체는
     (i) 참조 대상체와 비교하여 HBV의 간내 확산이 감소되거나 덜 심각하고/거나;
     (ii) HBV에 대한 적응 면역 반응을 포함하는,
     방법.
116. 제83항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 남성인, 방법.
117. 제83항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 여성인, 방법.
118. 100 mg/mL 내지 200 mg/mL 범위, 예컨대 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 또는 200 mg/mL, 바람직하게는 150 mg/mL 농도의 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편; 및
     약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
119. 제118항에 있어서, 최대 6 mg, 최대 18 mg, 최대 75 mg, 최대 90 mg, 최대 300 mg, 최대 900 mg, 또는 최대 3000 mg의 항체를 포함하는 약학적 조성물.
120. 제118항 또는 제119항에 있어서, 약 75 mg의 항체를 포함하는 약학적 조성물.
121. 제118항 또는 제119항에 있어서, 약 90 mg의 항체를 포함하는 약학적 조성물.
122. 제118항 또는 제119항에 있어서, 약 300 mg의 항체를 포함하는 약학적 조성물.
123. 제118항 또는 제119항에 있어서, 약 900 mg의 항체를 포함하는 약학적 조성물.
124. 제118항 또는 제119항에 있어서, 약 3,000 mg의 항체를 포함하는 약학적 조성물.
125. 제118항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 물, 선택적으로 USP 물을 포함하는 약학적 조성물.
126. 제118항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 히스티딘을 약학적 조성물 중에 선택적으로 10 mM 내지 40 mM, 예컨대 20 mM의 농도로 포함하는 약학적 조성물.
127. 제118항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 디사카라이드, 예컨대 수크로스를 선택적으로 5%, 6%, 7%, 8%, 또는 9%, 바람직하게는 약 7% (w/v)로 포함하는 약학적 조성물.
128. 제118항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제, 선택적으로 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 80(PS80)을 포함하고, 선택적으로 폴리소르베이트는 0.01% 내지 0.05%(w/v)의 범위, 바람직하게는 0.02%(w/v)로 존재하는 약학적 조성물.
129. 제118항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, pH는 5.8 내지 6.2의 범위, 5.9 내지 6.1의 범위, 또는 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 또는 6.2인, 약학적 조성물.
130. 제118항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서,
     (i) 150 mg/mL의 항체;
     (ii) USP 물;
     (iii) 20 mM 히스티딘;
     (iv) 7% 수크로스; 및
     (v) 0.02% PS80을 포함하고,
     pH 6인,
     약학적 조성물.
131. 제83항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량 투여 후, 대상체의 혈청 HBsAg는 기준선과 비교하여 1.0 log¹⁰ IU/mL, 1.5 log¹⁰ IU/mL 이상만큼 감소되고, 여기서 선택적으로 감소는 단일 용량 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8일 이상 동안 지속되는, 방법.
132. 제83항 내지 제117항 및 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량의 투여 후, 대상체의 혈청 HBsAg는 기준선과 비교하여 적어도 8일, 적어도 15일, 적어도 22일 또는 적어도 29일 동안 감소되는, 방법.
133. B형 간염 및/또는 D형 간염 감염의 시험관내 진단 방법으로서,
     (i) 대상체로부터의 샘플을 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
     (ii) 항원과 항체를 포함하거나 항원과 항원 결합 단편을 포함하는 복합체를 검출하는 단계를 포함하는,
     방법.
134. 제133항에 있어서, 샘플은 대상체로부터 단리된 혈액을 포함하는, 방법.
135. 항-B형 간염 및/또는 항-D형 간염 백신에서 올바른 형태의 에피토프의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서,
     (i) 백신을 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
     (ii) 항원과 항체를 포함하거나 항원과 항원 결합 단편을 포함하는 복합체가 형성되었는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는,
     방법.
136. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
     (i) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA, 또는 둘 다에 대한 강화된 결합을 갖고, 여기서 인간 FcγRIIA는 선택적으로 H131 또는 R131이고/거나, 인간 FcγRIIIA는 선택적으로 F158 또는 V158이고;
     (ii) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 FcγRIIB에 대한 감소된 결합을 갖고;
     (iii) 인간 FcγRIIB에 결합하지 않고;
     (iv) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드와 비교하여 인간 C1q에 대한 감소된 결합을 갖고;
     (v) 인간 C1q에 결합하지 않고;
     (vi) FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA, 또는 둘 다를, G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드보다 더 큰 정도로 활성화하고, 여기서 인간 FcγRIIA는 선택적으로 H131 또는 R131이고/거나, 인간 FcγRIIIA는 선택적으로 F158 또는 V158이고;
     (vii) 인간 FcγRIIB를 활성화하지 않고;
     (viii) HBsAg의 존재 하에 G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 폴리펩티드보다 더 큰 정도로 인간 자연 살해(NK) 세포를 활성화하고, 여기서 참조 폴리펩티드는 선택적으로 HB Ag, 선택적으로 HBsAg에 결합하고;
     (ix) HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 HBsAg 변이체에 결합할 수 있고/거나;
     (x) HBsAg에 결합하고 G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 참조 항체 또는 항원 결합 단편과 비교하여 HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 HBsAg 변이체에 대한 개선된 결합을 갖는,
     항체 또는 항원 결합 단편.
137. 만성 HBV 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 만성 HBV 감염을 치료하는 방법으로서,
     대상체에게 HBV 항원 부하를 감소시키는 작용제를 투여하는 단계; 및
     제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항-HBV 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는,
     방법.
138. 만성 HBV 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 만성 HBV 감염을 치료하는 방법으로서,
     대상체에게 HBV 유전자 발현 억제제를 투여하는 단계; 및
     제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항-HBV 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는,
     방법.
139. 제137항 또는 제138항에 있어서, RNAi 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열 번호 116의 뉴클레오티드 1579-1597와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
140. 제137항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열 번호 116의 뉴클레오티드 1579-1597을 포함하는, 방법.
141. 제137항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는, 방법.
142. 제137항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는, 방법.
143. 제137항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 이중 가닥 영역은 길이가 15-30개 뉴클레오티드 쌍인, 방법.
144. 제137항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 이중 가닥 영역은 길이가 17-23개 뉴클레오티드 쌍인, 방법.
145. 제137항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 이중 가닥 영역은 길이가 17-25개 뉴클레오티드 쌍인, 방법.
146. 제137항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 이중 가닥 영역은 길이가 23-27개 뉴클레오티드 쌍인, 방법.
147. 제137항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 이중 가닥 영역은 길이가 19-21개 뉴클레오티드 쌍인, 방법.
148. 제137항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 이중 가닥 영역은 길이가 21-23개 뉴클레오티드 쌍인, 방법.
149. 제137항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 각 가닥은 15-30개의 뉴클레오티드를 갖는, 방법.
150. 제137항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 각 가닥은 19-30개의 뉴클레오티드를 갖는, 방법.
151. 제137항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제는 siRNA인, 방법.
152. 제151항에 있어서, siRNA는 HBsAg 단백질, HBcAg 단백질 및 HBx 단백질 또는 HBV DNA 중합효소 단백질을 인코딩하는 HBV 전사체의 발현을 억제하는, 방법.
153. 제151항 또는 제152항에 있어서, siRNA는 P 유전자, NC_003977.2의 뉴클레오티드 2309-3182 및 1-1625; S 유전자(L, M 및 S 단백질 인코딩), NC_003977.2의 뉴클레오티드 2850-3182 및 1-837; HBx, NC_003977.2의 뉴클레오티드 1376-1840; 또는 C 유전자, NC_003977.2의 뉴클레오티드 1816-2454에 의해 인코딩된 표적의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드에 결합된, 방법.
154. 제151항 또는 제152항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(서열 번호 119)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
155. 제151항 또는 제152항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(서열 번호 119)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
156. 제151항 또는 제152항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(서열 번호 119)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
157. 제151항 또는 제152항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(서열 번호 119)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진, 방법.
158. 제154항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 센스 가닥은 5'- GUGUGCACUUCGCUUCACA-3'(서열 번호 118)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
159. 제154항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 센스 가닥은 5'- GUGUGCACUUCGCUUCACA-3'(서열 번호 118)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진, 방법.
160. 제151항 또는 제152항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(서열 번호 121)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
161. 제151항 또는 제152항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(서열 번호 121)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
162. 제151항 또는 제152항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(서열 번호 121)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
163. 제151항 또는 제152항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥은 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(서열 번호 121)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진, 방법.
164. 제154항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 센스 가닥은 5'- GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA-3'(서열 번호 120)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
165. 제154항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 센스 가닥은 5'- GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA-3'(서열 번호 120)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진, 방법, 사용을 위한 조성물 또는 용도.
166. 제151항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 상기 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고, 여기서 상기 센스 가닥은 3'-말단에 부착된 리간드에 접합된, 방법.
167. 제166항에 있어서, 리간드는 1가 링커, 2가 분지형 링커 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체인, 방법.
168. 제166항 또는 제167항에 있어서, 리간드는
     

     

     인,
     방법.
169. 제168항에 있어서, siRNA는 하기 구조로 나타낸 바와 같이 리간드에 접합된, 방법:
     

     

     
     상기에서, X는 O 또는 S이다.
170. 제151항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 데옥시-뉴클레오티드, 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시 변형 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 잠금 해제 뉴클레오티드, 구조적으로 제한된 뉴클레오티드, 구속된 에틸 뉴클레오티드, 염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형 뉴클레오티드, 2'-C-알킬 변형 뉴클레오티드, 2'-하이드록실 변형 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 변형 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기를 포함하는 뉴클레오티드, 테트라하이드로피란 변형 뉴클레오티드, 1,5-언하이드로헥시톨 변형 뉴클레오티드, 사이클로헥세닐 변형 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 아데노신-글리콜 핵산, 또는 5'-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는 변형된 뉴클레오티드인, 방법.
171. 제151항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA는 포스페이트 백본 변형, 2' 리보스 변형, 5' 트리포스페이트 변형 또는 GalNAc 접합 변형을 포함하는, 방법.
172. 제171항에 있어서, 포스페이트 백본 변형은 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 방법.
173. 제171 항 또는 제172항에 있어서, 2' 리보스 변형은 플루오로 또는 -O-메틸 치환을 포함하는, 방법.
174. 제151항 내지 제159항 및 제166항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA는 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(서열 번호 122)를 포함하는 센스 가닥 및 5'-UsGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusU-3'(서열 번호 123)를 포함하는 안티센스 가닥을 갖고,
     여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
     Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;
     s는 포스포로티오에이트 결합이고;
     L96은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤리놀인,
     방법.
175. 제151항 내지 제159항 및 제166항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA는 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(서열 번호 124)를 포함하는 센스 가닥 및 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(서열 번호 125)를 포함하는 안티센스 가닥을 갖고,
     여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
     Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;
     (Agn)은 아데노신-글리콜 핵산(GNA)이고;
     s는 포스포로티오에이트 결합이고;
     L96은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤리놀이다.
176. 제151항 내지 153항 및 160항 내지 173항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA는 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(서열 번호 124)를 포함하는 센스 가닥 및 5'-UsGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusU-3'(서열 번호 125)를 포함하는 안티센스 가닥을 갖고,
     여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
     Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고,;
     s는 포스포로티오에이트 결합이고;
     L96은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤리놀인,
     방법, 사용을 위한 조성물, 또는 용도.
177. 제137항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간이고 치료 유효량의 RNAi 작용제 또는 siRNA가 대상체에게 투여되고; 여기서 RNAi 작용제 또는 siRNA의 유효량은 약 1 mg/kg 내지 약 8 mg/kg인, 방법.
178. 제137항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제 또는 siRNA는 대상체에게 1일 2회, 1일 1회, 2일마다, 3일마다, 주 2회, 주 1회, 격주로, 4주마다 또는 한 달에 한 번 투여되는, 방법.
179. 제137항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제 또는 siRNA는 4주마다 대상체에게 투여되는, 방법.
180. 제151항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 HBV 유전자에 대한 2개의 siRNA가 투여되고, 제1 siRNA는 서열 번호 119, 서열 번호 120, 또는 서열 번호 126를 포함하는 안티센스 가닥을 갖고; 제2 siRNA는 서열 번호 116의 뉴클레오티드 2850-3182의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 센스 가닥을 갖는 siRNA를 포함하는, 방법.
181. 제151항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, HBV 유전자에 대한 2개의 siRNA가 투여되고, 여기서 2개의 siRNA는 HBV X 유전자에 대한 siRNA 및 HBV S 유전자에 대한 siRNA를 포함하는, 방법.
182. 제151항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 HBV 유전자에 대한 2개의 siRNA가 투여되고, 제1 siRNA는 서열 번호 119, 서열 번호 123, 또는 서열 번호 125를 포함하는 안티센스 가닥을 갖고; 제2 siRNA는 서열 번호 121 또는 서열 번호 127을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는, 방법.
183. 제181항에 있어서, 제1 siRNA는 서열 번호 118, 서열 번호 122, 또는 서열 번호 124를 포함하는 센스 가닥을 갖고; 제2 siRNA는 서열 번호 120 또는 서열 번호 126을 포함하는 센스 가닥을 갖는, 방법.
184. 제179항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 siRNA가 동시에 투여되는 방법.
185. 제137항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 뉴클레오티(시)드 유사체를 투여하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는 대상체에게 또한 뉴클레오티(시)드 유사체가 투여되는 방법.
186. 제185항에 있어서, 뉴클레오티(시)드 유사체는 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(TDF), 테노포비르 알라페나미드(TAF), 라미부딘, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르(ETV), 텔비부딘, AGX-1009, 엠트리시타빈(FTC), 클레부딘, 리토나비르, 디피복실, 로부카비르, 팜비르, N-아세틸-시스테인(NAC), PC1323, theradigm-HBV, 티모신-알파 및 간시클로비르, 베시포비르(ANA-380/LB-80380), 또는 테노프비르-엑살리아데스(TLX/CMX157)인, 방법.

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