KR20110096591A

KR20110096591A - Ｈｃｖ 감염의 치료적 처리 및 예방을 위한 의약으로서 항 ｈｃｖ 모노클로날 항체

Info

Publication number: KR20110096591A
Application number: KR1020117016888A
Authority: KR
Inventors: 로버르토 부리오니; 마시모 클레멘티
Original assignee: 포모나 리세르사 에스.알.엘.
Priority date: 2008-12-22
Filing date: 2009-12-21
Publication date: 2011-08-30
Also published as: EP2376119B1; US8623363B2; RU2596409C2; ES2541323T3; CN102264393A; CN102264393B; RU2011130522A; EP2376119A1; KR101450955B1; WO2010073204A1; BRPI0923569B1; US20110256140A1; JP2012513457A; BRPI0923569A2; ITTO20080964A1; MX2011006722A

Abstract

본 발명은 HCV 감염의 치료적 처리 및 예방을 위한 의약으로서, 모노클로날 항체 e20 또는 이의 관능적 단편(functional fragment)에 관한 것이다. e20 항체는 알려진 모든 HCV 유전자형에 결합할 수 있고, 특히 유전자형 Ia, Ib, 2a, 및 4에 대해서 바이러스에 대항하여 강한 중성화 활성을 나타낸다. 또한, 약제학적 조성물은 모노클로날 항체 e20 또는 이의 관능적 단편, 및 약제학적으로 허용되는 첨가제, 캐리어 또는 희석제를 포함하는, HCV 감염의 치료 또는 예방을 위한 것으로 기재되었다.

Description

ＨＣＶ 감염의 치료적 처리 및 예방을 위한 의약으로서 항 ＨＣＶ 모노클로날 항체{ANTI-HCV MONOCLONAL ANTIBODY AS A MEDICAMENT FOR THE THERAPEUTIC TREATMENT AND PREVENTION OF HCV INFECTIONS}

본 발명은 HCV 감염의 치료적 처리 및 예방을 위한 의약으로서, C형 간염바이러스(Hepatitis C Virus) (HCV) E2 당단백질(glycoprotein)에 대항하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

HCV는 페리캡시드(pericapsid) 및 단일 가닥 RNA(single stranded RNA를 갖고, 플라비바이러스과(Flavivirus family)에 속하는 바이러스이다. 다른 HCV 분리체들(HCV isolates) 사이에서 관찰되는 유전적 차이(genetic difference)에 근거하여, 이 바이러스종은 6개의 다른 유전자형으로 분리되고, 이들 각각은 숫자로 표시된다. 각각의 유전자형은 많은 서브타입(subtype)을 포함하고, 그들 각각은 마크로 표시된다. 다른 HCV 유전자형의 유행 및 분산은 전세계에 걸쳐 다양하다. 유럽에서, 우세한 유전자형은 1b이고, 반면에 북아메리카에서 유전자형은 1a이다. 유전자형을 결정하는 것은 현재 가장 많이 사용되는 치료법인 알파 인터페론과 리바비린과의 조합에 근거하는 요법에 대한 잠재적인 반응을 결정하는데 기여하는 특정의 임상적 관점으로부터 중요하다. 사실, 유전자형 1 및 4는 인터페론계 요법으로 유전자 2, 3, 5 및 6보다 덜 반응적이다.

지금까지, C형 간염바이러스에 대항하여 효과적이라고 입증되는 백신 및 면역요법은 없었다. HCV의 항원 구조의 높은 가변성은 바이러스를 중성화시킬 수 있는 항체의 발전을 어느 정도 저해하지만, 다른 바이러스 유전자형을 향해 교차 반응성(cross-reactivity)을 부여받는다. 따라서, 이러한 특징을 제공받고, HCV 감염의 치료 및 예방에 실제로 효과적인 항-HCV 항체가 요구된다.

HCV에 대항한다고 지시된 항체는 선행 기술에 기재되었다. 예컨대, Burioni et al., Hepatology Vol. 28, n. 3, 1998은 다른 바이러스 유전자형(교차 반응성(cross-reactivity))으로부터 당단백질과 결합할 수 있고, HCV E2 당단백질 (HCV E2)에 특이적인 5개의 재조합 인간 항체 단편(five recombinant human antibody fragment) (Fab)을 인코딩(encoding)하는 시퀀스의 복제(cloning) 및 특성화(characterization)를 기재한다. 이 문헌에 기재된 Fabs 사이에, e20으로 지정된 항체 단편이 있다. Burioni et al., 1998, cit.는 e20이 HCV E2 결합(NOB 활성)을 중성화하는 높은 최소 활성을 갖는다는 것이 기재되어 있다. 그러나, 높은 NOB 활성에도 불구하고, 국제 특허 WO 03/064473에서는, e20 항체 단편이 높은 농도(80 mg/ml)에서 조차 바이러스성 감염을 중성화시킬 수 없다고 기재되어 있다(특히 WO 03/064473 page 16, lines 8-10 참조).

최근 본 발명자들은 선행기술, 특히 WO 03/064473에 언급된 것과 반대로, e20 단편이 생체외에서(in vitro ) 다른 HCV 유전자형에 의해 감염을 효과적으로 중성화시킬 수 있다는 것을 놀랍게도 발견했다. 이는 e20이 HCV 중성화 및 HCV-감염된 세포의 제거에 특히 적합하고, HCV 감염의 면역요법 및 면역-예방(immuno-prevention)을 위한 의약으로서의 용도로 적합하게 한다.

길고 복잡한 실험 조작이 요구되는 이러한 결과를 획득하는 것은 이하의 실험적 부분에 상세히 기술되었다.

최종 합성에 있어서, 본 발명자들에 의해 행해지는 실험적 조작은 e20 항체 단편이 이하 예상치 않은 특성을 나타낸다는 것을 설명하게 해준다:

-이는 유전자형 1b에 속하는 HCV 가닥에 기인한 자연적인 감염의 경로로 발생되지만, 공지된 HCV 유전자형 전체로부터 당단백질에 결합될 수 있고(특히 유전자형 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 및 6), 널리 교차-반응적이고;

-이는 HCV 가상 입자(HCV pseudo-particles)(HCVpp)에 근거한 중성화 분석에 의해 측정된 바와 같이 HCV 유전자형 1a, 1b, 2a 및 4에 대해 특히 높은 중성화능을 갖고;

-또한, e20과 HCV E2 당단백질의 결합에 필수적인 소정의 아미노산 잔기는 HCV 감염에 필수적이고, 이는 e20 결합을 피할 수 있는 돌연변이체(mutant)는 동시에 감소된 복제능(replication ability)을 제공한다는 것을 설명한다.

상기 언급된 특징은 HCV 감염의 면역 요법 및 면역 예방을 위한 의약으로서 e20 항체 단편의 사용의 종결(the end of using the e20 antibody fragment)에 명백히 유용하다.

본 발명의 제1 목적은 HCV 감염의 치료적 처리 또는 예방을 위한 의약으로, 복수의 다른 HCV 유전자형(genotype)으로부터 HCV E2 당단백질(glycoprotein)을 결합할 수 있는 모노클로날 항체 또는 이의 단편으로서, 상기 모노클로날 항체(monoclonal antibody) 또는 이의 단편(fragment)은 아미노산 시퀀스(sequence) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1와 적어도 90% 동일한 시퀀스를 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 부위(heavy chain variable region) 및 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2와 적어도 90% 동일한 시퀀스를 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 부위(light chain variable region)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 또는 이의 단편이다.

더욱 바람직한 시퀀스 동일성 퍼센트는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이고, "적어도(at least)"는 나열된 퍼센트 각각을 말한다.

본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 중쇄 가변 부위는 뉴클레오티드(nucleotide) 시퀀스 SEQ ID NO: 3에 의해 인코딩되고, 경쇄 가변 부위는 SEQ ID NO: 4에 의해 인코딩된다.

"항체(antibody)"란 경쇄 가변 부위 및 중쇄 가변 부위, 예컨대 Fab, F(ab')₂, CDR (상보적 결정 부위(Complementary Determining Region)), 또는 중쇄 및 경쇄 가변 부위 또는 CDRs를 포함하는 단일쇄 항체, 또는 면역 중쇄 및 경쇄 가변 부위로부터 유도되는 CDR 단편의 하나 이상의 복제(copies)로 이루어진 스캐폴드(scaffold)를 포함하는 풀 길이(full-length) 면역글로불린(immunoglobulins) 및 임의의 단편의 과(class)를 말하는 것이다. 이는 ScFvs, 디아바디(diabodies), VHHs 또는 분리된 경쇄 또는 중쇄로 지정된 기능적 항체 단편을 포함한다. 또한, "항체"는 개선된 친화성, 안정성 및/또는 재조합 생성 특성(recombinant production properties)을 갖는 VH/VL 조합을 수립하기 위해서, 경쇄 가변 부위의 재편성(shuffling) 단계에 있어서, e20 항체 단편 가변 부위의 시퀀스를 사용함으로써 발생될 수 있는 항체를 포함한다. 또한, "항체"는 e20 항체 단편 또는 면역 글로불린(immunoglobulin)을 특정 조직, 세포 또는 가용성 프로테인 구조(soluble protein structures)로 표적화(target)할 수 있는, 특정 풀 길이(full-length) 면역 글로불린 또는 면역 글로불린 단편으로 접합된(fused), 풀 길이 면역 글로불린 또는 면역글로불린 단편 중 임의의 형태를 포함한다. 본 발명의 모노클로날 항체는 인간이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 항체는 유리된 형태(free form) 또는 콘쥬게이트된 형태(conjugated form)일 수 있다. 콘쥬게이트된 형태는 상기 기재된 바와 같이, 생체내 지속성(in vivo persistency)을 조절하고, 생체 분산(body distribution)을 증진시키거나 제한하고(promoting or limiting), 단백분해제(proteolytic agent)의 감도를 감소시키고, 항원성(antigenicity)을 감소시키고, 세포독성능(cytotoxic ability)을 증가시키고 및/또는 체액 및 조직에서의 탐지(detection)를 가능하게 할 수 있는 분자와 콘쥬게이션(conjugated)되어 있는 항체이다. 콘쥬게이션에 적합한 한정되지 않는 예로는 인간 혈청 알부민(human serum albumin), 말토오스-결합 프로테인(maltose-binding protein), 글루타티온-S-전달효소(glutathione-S-transferase, 파아지 외피(phage coat) p3 또는 p8 프로테인, 펩티드, 설탕, PEG, PEG 유사 분자, 동물-, 식물- 또는 미생물- 유래 독소(toxins), 시토킨(cytokines), 효소, 화학 발광 화합물(chemiluminescent compounds), 생물 발광 화합물(bioluminescent compounds), 금속원자(metal atoms), 방사성 동위 원소(radioisotopes), 형광 화합물(fluorescent compounds), 태깅기(tagging group) 또는 인산화반응(phosphorylation), 글리코실화(glycosylation), 유비퀴틴화(ubiquitination), 수모화(SUMOylation) 또는 연속적으로 절단된(endoproteolytic cleavage) 기질을 들 수 있다. 콘쥬게이션을 가능하게 하기 위해서, 항체 C-말단 또는 N-말단은, 예컨대 추가적인 아미노산 잔기, 예컨대 디설파이드 브릿지를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 삽입함으로써 변형될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체는 인간 적혈구 또는 다른 세포 캐리어(cell carrier), 특정 포뮬레이션(formulation), 또는 방출 지연된 시스템(sustained-release systems), 예컨대 그것에 한정되지 않고, 리포솜(liposome), 덴드리머(dendrimer), 마이크로솜(microsomes), 나노입자, 마이크로캡슐, 바이러스 벡터(virus vector) 등에 결합될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 기재된 바와 같은 모노클로날 항체 또는 이의 단편의 약제학적 유효량(pharmaceutically effective amount)을 포함하는, HCV 감염의 치료적 처리 또는 예방을 위한 약제학적 조성물(pharmaceutical composition)이다.

본 발명의 조성물은 HCV에 감염되거나 또는 감염될 위험이 있는 피험자에 투여될 수 있다. 임의의 적당한 투여 경로는 비경구(parenteral), 경구(oral), 눈의(ocular), 국부의(topical), 국소 영역의(loco-regional) 관장(enema) 또는 에어로졸 투여(aerosol administration)를 포함하여 채용될 수 있다. 비경구 투여로는 근육내 주사(intramuscular injection), 정맥내 주사(intravenous injection), 림프내 주사(intralymphatic injection), 피하(subcutaneous) 또는 피내 주사(intradermic injection) 및 투입(infusion)을 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 선택된 투여 경로에 적합한 임의의 약제학적 형태, 예컨대 주사가능한 용액(injectable solution) 또는 서스펜션(suspension), 수액(infusion), 타블렛(tablet), 캡슐(capsule), 크림, 연고(ointment), 로션, 또는 좌약(suppository)의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 기재된 바와 같이, 유효성분(active principle)으로서, 당업자에 잘 알려진 적당한 약제학적 첨가제(pharmaceutical excipient), 캐리어(carrier) 또는 희석제(diluent)뿐만 아니라 항체 또는 이의 단편을 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 기재된 바와 같이 항체 또는 이의 단편의 유전자형(idiotype)과 특이적으로 결합할 수 있는 항-유전자형 항체(anti-idiotype antibody)이다. 본 발명의 항-유전자형 항체는 당업자에 그 자체로 잘 알려진, 항-유전자형 항체를 얻는 종래의 방법에 의해 얻어질 수 있다.

본 발명은 첨부되는 도면을 참조함으로써 설명에 의해 제공되는 이하 실험적 부분을 더 상세히 기재한다.
도 1은 다른 유전자형으로부터 HCV E2 당단백질(glycoproteins)과 e20의 결합을 나타낸다. 데이터는 양성 형광 세포(positive fluorescent cells)의 퍼센트로서 나타낸다.
도 2는 유전자형 1a: UKN1A20.8 (a); E1E2 유전자형 1b: UKN1B5.23 (b); E1E2 유전자형 2a: UKN2A1.2 (c); E1E2 유전자형 2b: UKN2B1.1 (d); E1E2 유전자형 4: UKN4.21.16 (e)로부터 E1-E2 당단백질을 나타내는 바이러스 가상 입자(virus pseudo-particles)에 의해 Fab e20의 중성화 활성(neutralising activity)을 나타낸다. 바이러스 가상 입자를 사용함으로써 15㎍/ml에서 Fab e20의 (f) 중성화 활성은 다른 유전자형(UKN1A20.8, UKN1B5.23, UKN2A1.2, UKN2B1.1; UKN3A13.6, UKN4.21.16, UKN5.15.11, UKN6.5.8)으로부터 E1-E2를 나타낸다.
도 3은 HCVcc 시스템(유전자형 2a)을 사용함으로써 e20 및 다른 항-HCV 항체(e137, AP33)의 중성화 활성(neutralising activity)을 나타낸다. e20 및 음성 대조구 Fab(negative control Fab) (c33-3)의 존재하에 JFH-1 감염성은 양적 역전사 PCR(quantitative reverse transcription)에 의해 측정된 바와 같이 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 RNA(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase RNA)에 대한 바이러스성 RNA의 양으로 나타낸다.

실험적 부분( EXPERIMENTAL SECTION )

복제 통계( Cloning strategy )

필라멘트형 파아지(filamentous phages)의 표면 상에 나타낸 임의의 조합 라이브러리(combinatorial libraries)의 제조(preparation)는 고친화성 인간 모노클로날 항체를 선택하는 매우 강력한 수단을 나타낸다. 사실, 파아지 표시(phage display)에 근거한 선택 절차(selection procedure)는 매우 다양하고, 교차-반응 항체(cross-reactive antibodies)를 선택하기 위해 최적화될 수 있다. 특히, e20은 유전자형 1b에 속하는 HCV 가닥에 지속적으로 감염되는 58세 노인 여성의 림프구 B 레퍼토리(lymphocyte B repertoire)로부터 IgG1 Fab 단편으로 복제된다. 교차-반응 복제를 선택하기 위해, 환자로부터 유래된 라이브러리는 다른 유전자형, 즉 1a에 속하는 분리된 바이러스로부터 유래된 재조합 HCV E2 당단백질(recombinant HCV E2 glycoprotein)에 대항하여 팬닝(panning)이 행해진다. 간단히, 자연적 감염의 경로에서 발생되는 항체를 얻는 것이 가능하다는 이러한 접근은 연구를 위해 선택되는 환자의 면역 시스템(immune system)에 의해 접해지지 않는 다른 당단백질과 결합할 수 있다.

중쇄 및 경쇄 시퀀스의 연구

e20 중쇄 및 경쇄 유전자의 시퀀싱 및 유전적 패턴의 연구(표 1)는 이 항체가 신체적 돌연변이 과정(somatic mutation process), 즉 항원(antigen)에 대한 항체(antibody)의 친화성을 증진시키기 위해 특정 항원과 연속적으로 접촉함으로써 항체 클론에 자극되는 과정으로부터 유래된다는 것을 보여준다.

중쇄에 관하여, e20은 배선 유전자(germinal line gene)와 85% 미만의 뉴클레오티오 시퀀스 유사성(nucleotide sequence homology)을 나타낸다. 돌연변이 패턴은 상보적 결정 부위(Complementarity Determining Regions)(CDRs)에 있어서 특이적 편극(specific polarisation)으로 신체적으로 돌연변이된 클론(somatically mutated clone)을 위해 일반적인 분산을 나타낸다. e20 결합 부위(즉 CDR3을 생성하는 결합 부위(joining region))의 검사는 이것이 VH1-69 아과(VH1-69 subfamily)에 속하는 V 유전자(인간 항-HCV 체액 반응(human anti-HCV humoral response)에 있어서, 높게 나타낸 유전자), D2-21 아과(D2-21 subfamily)에 속하는 D 유전자, 및 JH4 아과(JH4 subfamily)에 속하는 JH 유전자로 이루어진다는 것을 나타낸다.

마찬가지로, e20 경쇄(유전자형 k)는 CDRs에서의 편극으로 나타낸 바와 같이, 신체적으로 돌연변이된 클론과 일치하는 돌연변이 퍼센트를 나타낸다. 결합 부위의 검사는 e20 경쇄 CDR3이 kV3-15 아과에 속하는 kv, 및 kJ5 아과에 속하는 kJ의 결합으로부터 발생된다는 것을 나타낸다.

시퀀스 데이터는 e20이 인공적 항체가 아니지만 연구를 위해 선택된 환자의 항체 레퍼토리에 실제로 존재한다는 결론을 고려한다.

상기 표 1은 e20 경쇄 a) 및 중쇄 b)에서의 배선(germinal lines)에 대한 돌연변이 패턴을 나타낸다. 아미노산 및 뉴클레오티드 돌연변이 퍼센트는 경쇄 및 중쇄에 대한 FR1, FR2, 및 FR3, 중쇄에 대한 CDR1 및 CDR2, 경쇄에 대한 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 고려함으로써 카밧 및 위(Kabat and Wu)의 얼라이먼트 방법(alignment method)에 따라 산출된다. 잠재성 돌연변이(silent mutation)(s)에 대한 치환 돌연변이(replacement mutations)(R)의 비율이 보고되었다.

다른 HCV 유전자형으로부터 유래된 E2 와 결합하는 e20 의 평가

Fab의 형태의 e20 단편은 1b (즉, e20이 얻어지는 사람으로부터 환자를 감염시키는 가닥의 유전자형(the genotype of the strain that had infected the patient from whom e20 was obtained)) 및 1a (즉, Fab을 복제하는데 사용되는 유전자형)을 제외한 HCV 유전자형으로부터 E2 당단백질을 인식하는 능력이 테스트된다. 가용성 E2를 얻는데 겪게 되는 어려움은 다른 FACS계 접근의 용도에 요구되는 다른 HCV 유전자형으로부터 형성한다.

간단히, 293T 인간 상피성 신장 세포(human epithelial kidney cells)(HEK)를 10% 태아 혈청(fetal calf serum), 5% 비필수 아미노산(non-essential amino acids), 200 mM 글루타민(glutamine), 스트렙토마이신(streptomycin) (100mg/ml) 및 페니실린(penicillin) (100 U/ml)으로 보강된 둘베코의 변형된 독수리 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) (DMEM)에서 배양하였다. 80% 융합(confluence)에 도달하면, 2×10⁶ HEK 세포는 10 cm 플레이트에 파종(seed)하고, 24시간 후 3mg의 phCMV-7, 칼슘 포스페이트 감염 프로토콜(calcium phosphate transfection protocol)을 사용함으로써 다른 HCV 유전자형으로부터 E1E2 당단백질을 인코딩하는 발현 벡터에 감염시켰다. 배지를 감염 16시간 후 교체하고, 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양했다. 배지를 제거하고, 세포 단층을 PBS로 두번 세정했다. 5 ml의 해리 완충제(dissociation buffer)를 첨가하고, 37℃에서 5분 동안 배양했다. 세포를 PBS로 두번 세정하고, 5분 동안 1000 rpm으로 원심분리(centrifuged)하고; 1.2 ml의 고정 시약(fixing reagent)을 각 플레이트로부터 얻어진 펠렛에 첨가하였다. 세포는 실온에서 15분 동안 배양했다. 시료를 2% 태아 혈청(FPBS)으로 보강된 5 ml의 PBS로 세정한 후 5분 동안 1000 rpm으로 원심분리했다.

100 ml의 투과가능한 시약을 최종 농도 10 mg/ml에서 50 ml의 Fab e20을 갖는 펠렛에 첨가했다. 동일한 프로토콜을 대조구로 사용된 비감염된 세포(non-transfected cell)에 행했다. 실온에서 40분 동안 배양한 후, 샘플을 5 ml의 FPBS로 세정하고, 50 ml의 FITC-콘쥬게이트 2차 항체(FITC-conjugated secondary antibody)를 펠렛에 가했다. 세포를 실온에서 20분 동안 배양하고, 5 ml의 FPBS로 두번 세정했다. 최종적으로, 상청액(supernatant)을 제거하고, 펠렛을 300 ml의 FPBS로 재현탁(resuspended)하고, 세포를 FACS로 분석했다. 결합 활성(binding activity)은 Fab e20 없는 세포보다 높은 형광 레벨(fluorescence level)을 갖는 세포의 퍼센트로부터 얻어지는 양성 형광 세포의 퍼센트로서 발현된다. 비구조적 HCV 항원(non-structural HCV antigen)(NS3)에 특이적인 재조합 인간 Fab (c33-3)는 각각의 실험에 음성 대조구(negative control)로서 포함된다.

이러한 접근은 Fab e20이 통제군 Fab로 얻어지는 것보다 높은 형광 세포의 퍼센트를 갖는 발현된 HCV E2 유전자형(1a; 1b; 2a; 2b; 3; 4; 5; 6) 모두를 인식(recognising)할 수 있다는 것을 나타낸다. 그 결과를 이하 도 1에 나타낸다.

CD81 -결합 부위로 변이된 HCV 1a로부터 E2 당단백질에 결합하는 e20 의 평가

Fab e20은 CD81 결합 및 HCV 가상 입자(HCV pseudo-particles)(HCVpp)의 감염에 중요한 것으로 기재된 보존된 부위 내에 변이된 H77 (유전자형 1a)로부터 유래된 E1E2의 패널에 대항하여 테스트된다. 이 부위 내에서 각각의 보존된 위치는 알라닌으로 변이된다. 이러한 치환 모두는 이하에 기재된 HCVpp 분석에서 감염성의 감소를 야기한다. Fab e20 HCV E2 당단백질의 결합은 이들 중요한 돌연변이의 일부에 의해 폐지된다(abrogated)(표 2).

표 2에 기재된 데이터는 e20이 바이러스 감염에 필수적인 E2 부위에 결합된다는 것을 설명한다. 또한, 이들 데이터는 e20이 면역 요법의 용도 및 백신 약물의 고안에 대한 견본으로 적합하지 않지만, 이종의 항체를 갖는 면역 요법이 실현가능하지 않고, 인간 레퍼토리에서의 동일한 항체의 존재가 매우 드물다는 것을 고려하여, AP33 결합, 최대 교차-반응성을 갖는 항-HCV 항체를 중성화시키는데 중요한 부위와 결합한다는 것을 확인해준다(Tarr et al. J Gen Virol. 88:2991. 2007). 더욱 흥미롭게도, 이 분석은 e20에 의해 인식되지 않은 모든 돌연변이는 가상 바이러스 모델에서 표적 세포의 감염을 가능하지 않게 한다는 것을 명백히 나타낸다.

상기 표 2는 H77 돌연변이로부터 유래된 E1E2에 결합하는 e20을 나타낸다(유전자형 1a). 결합 활성은 야생형 H77 프로테인(wild-type H77 protein)으로 측정된 것의 퍼센트로서 표현했다.

다른 유전자형으로부터 유래된 HCV 가상 입자에 대한 e20 중성화 특성의 평가

Fab e20 중성화 활성은 HCV 가상 입자(HCV pseudo-particles) (HCVpp)에 근거한 중성화 분석(neutralisation assay)으로 변화된다.

간단히, 293T 인간 상피성 신장 세포(human epithelial kidney cells)(HEK) 및 Huh-7 간암 세포(Huh-7 human hepatoma cells)를 10% 태아 혈청(fetal calf serum), 5% 비필수 아미노산(non-essential amino acids), 200 mM 글루타민(glutamine), 스트렙토마이신(streptomycin) (100mg/ml) 및 페니실린(penicillin) (100 U/ml)으로 보강된 DMEM에서 배양하였다. 80% 융합(confluence)에 도달하면, 2×10⁶ HEK 세포는 10 cm 플레이트에 파종(seed)하고, 24시간 후 8㎍의 쥐 백혈병 바이러스 벡터(mouse leukemia virus vector)(MLV) Gag-Pol, 루시페라아제(luciferase)를 인코딩하는 8㎍의 MLV 전이 벡터, 및 다른 HCV 유전자형으로부터 E1E2 당단백질을 인코딩하는 3㎍의 풀 길이 phCMV-7a 발현 벡터로 감염시킨다. 하루 후, 감염 매체를 10 mM HEPES를 함유하는 5 ml의 프레시한 매체로 교체했다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양했다. 표적 세포(Huh-7)를 웰당 2.5x10⁴로 24웰(well) 플레이트에 파종하고, 37℃에서 밤새 배양했다. 배지의 교체 후, HCV 가상 입자(HCVpp)를 24시간 동안 수거(collected)하고, 10분 동안 2000 rpm에서 원심분리하고, 0.45 mm 세공 멤브레인(pore-size membranes)을 통해 여과시키고, 중성화 분석(neutralisation assay)을 사용했다.

특히, 60ml의 HCVpp-함유 배지를 90ml 의 다른 농도의 Fab e20와 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 이러한 혼합물을 Huh-7 표적 세포에 첨가하고, 세포를 37℃에서 3시간 동안 배양했다. 최종적으로, 접종이 제거되고, 1 ml의 프레시한 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포를 4일 동안 37℃에서 배양했다. 제조업자의 지침에 따라, 세포를 PBS로 두번 세정한 후 100 ml의 용해 완충제(lysis buffer)(Promega)로 용해시켰다. 세포 용해물(cell lysate)을 96-웰 플레이트로 옮기고, 100ml의 기질/완충제(Promega)를 각 웰에 첨가했다. 세포의 감염은 RLUs(relative light units)로 제공되는 형광 활성(Chameleon plate reader, Hidex)을 측정함으로써 분석했다. 중성화 활성(neutralising activity)은 경쟁(competition)할 수 있는 항체의 부재하에(neg) HCVpp 웰에 검출되는 것으로 얻어지는 발광(luminescence)을 비교함으로써 감염의 퍼센트로서 결정된다. 비구조적 HCV 항원 (NS3)에 특이적인 재조합 인간 Fab (c33-3)는 각 실험에서 음성 대조구(negative control)로서 포함된다.

이러한 접근은 e20이 HCV 유전자형 1a 및 4를 강력히 중성화할 수 있다는 것을 보여준다. E20은 7.5 ㎍/ml 농도에서 유전자형 1a에 대한 50% 중성화 활성을 보여주고, 15 ㎍/ml에서 유전자형 4에 대한 75% 억제를 보여준다(도 2a, 2e, 및 2f). 그러나, 이 항체는 HCV 유전자형 1b 및 2a를 강력히 중화할 수도 있다. 더욱 상세하게, 15 ㎍/ml에서, e20은 유전자형 1b 및 2a의 40% 중성화 및 75% 감염성을 각각 보여준다(도 2b, 2c, 및 2f). 최종적으로, e20 은 15 ㎍/ml에서 20% 억제를 보여주는 유전자형 2b E1E2 당단백질을 갖는 낮은 정도의 HCVpps로 중성화될 수 있다(도 2d 및 2f).

셀 배양액에서 배양된 HCV 가닥의 e20 중성화 활성(유전자형 2a, 가닥 JFH1 )

HCV e20의 중성화 활성은 HCV 유전자형 2a (JFH1) 및 높은 생성 감염 바이러스(highly producing infective viruses) (도 3)로부터 염색체(chromosome)에 통합된 cDNA를 함유하는 안정한 인간 간염 세포선(human hepatoma cell line)을 사용함으로써, HCVcc 모델 시스템(HCV 세포 배지(HCV cell culture))을 사용함으로써 테스트했다. 이러한 시스템은 감염성 간염 C 바이러스 가닥(hepatitis C virus strain)을 사용함으로써 중성화 활성의 평가를 감안한다. 이러한 실험에 있어서, Fab e20의 다른 농도는 HCVcc 분석에서 발생하는 바이러스를 함유하는 배지에서 배양된다. 3시간 후, 혼합물을 표적 세포(Huh7.5)에 첨가했다. 감염성은 HCV 양성 가닥 RNA(HCV positive strand RNA)의 레벨을 측정함으로써 평가되었다. Fab e20은 매우 낮은 농도, 1mg/ml에서 강한 중성화 활성을 나타내고, HCV 유전자형 2a의 감염성을 완전히 폐지할 수 있다. Fab e20 중성화 활성은 지금까지 기재된 가장 강력한 교차-중성화 항체(cross-neutralising antibodies) 중 하나인 쥐 AP33 IgG 모노클로날 항체(mouse AP33 IgG monoclonal antibody)에 필적할 만하다.

SEQUENCE LISTING <110> Bait Biotecnologie Applicate Italiane S.r.l. <120> Anti-HCV monoclonal antibody as a medicament for the therapeutic treatment and prevention of HCV infections <130> PC960EC <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val 1 5 10 15 Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp His Tyr Gly Ile Asn Trp Val 20 25 30 Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro 35 40 45 Val Phe Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr 50 55 60 Ile Thr Ala Asp Asp Ser Thr Gly Thr Ala Phe Leu Glu Leu Thr Arg 65 70 75 80 Leu Thr Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Thr Pro His Gln 85 90 95 Leu His Val Leu Arg Gly Gly Lys Ala Leu Ser Pro Trp Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr 115 <210> 2 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Arg Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asp Trp Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 3 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctgctcgagc agtcaggggc tgaggtgaag aagcctgggt cctcggtgaa ggtctcctgc 60 aaggcttctg gagaccacta tggtatcaac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctg 120 gagtggatgg gcggtatcat ccctgtcttt ggcacaacta cctacgcaca gaagttccag 180 ggcagagcca ccattaccgc ggacgactcc acggggacgg cctttttgga gctgaccaga 240 ctgacatttg acgacacggc cgtctatttc tgtgcgacac ctcaccaact gcatgtcctc 300 cggggcggta aagccctctc cccctgggac tactggggcc agggaacc 348 <210> 4 <211> 306 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggccgagc tcacccagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agtaacttag cctggtacca gcagaaacgt 120 ggccaggctc ccagtctcct catctacgga acatctacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataatgatt ggccctccac cttcggccaa 300 gggaca 306

Claims

HCV 감염의 치료적 처리 또는 예방을 위한 의약으로, 복수의 다른 HCV 유전자형(genotype)으로부터 HCV E2 당단백질(glycoprotein)을 결합할 수 있는, 모노클로날 항체 또는 이의 단편으로서:
상기 모노클로날 항체(monoclonal antibody) 또는 이의 단편(fragment)은 아미노산 시퀀스(sequence) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1와 적어도 90% 동일한 시퀀스를 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 부위(heavy chain variable region) 및 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2와 적어도 90% 동일한 시퀀스를 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 부위(light chain variable region)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
제1항에 있어서,
유전자형 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 및 6으로부터 HCV E2 당단백질을 결합할 수 있는, 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서,
적어도 하나의 중쇄 가변 부위 및 적어도 하나의 경쇄 가변 부위를 포함하는 풀 사이즈 면역글로불린(full-size immunoglobulin) 또는 면역글로불린 단편인, 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
제3항에 있어서,
상기 단편은 Fab, F(ab')₂, CDR (상보적 결정 부위(Complementary Determining Region)), 또는 중쇄 및 경쇄 가변 부위 또는 CDRs를 포함하는 단일쇄 항체, 또는 면역 중쇄 및 경쇄 가변 부위로부터 유도되는 CDR 단편의 하나 이상의 복제(copies)로 이루어진 스캐폴드(scaffold)로부터 선택되는, 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
유리된 형태(free form)인, 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
생체내 지속성(in vivo persistency)을 조절하고, 생체 분산(body distribution)을 증진시키거나 제한하고, 단백분해제(proteolytic agent)의 감도를 감소시키고, 항원성(antigenicity)을 감소시키고, 세포독성능(cytotoxic ability)을 증가시키고 및/또는 체액 및 조직에서의 탐지(detection)를 가능하게 할 수 있는 분자와 콘쥬게이션(conjugated)되어 있는, 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
항체를 특정 조직, 세포 또는 가용성 프로테인 구조(soluble protein structure)로 표적화(targeting)할 수 있는 특정 풀 길이(full-length) 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편과 접합되는(fused), 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 모노클로날 항체 또는 이의 단편의 약제학적 유효량을 포함하는, HCV 감염의 치료적 처리 또는 예방을 위한 약제학적 조성물(pharmaceutical composition).
제8항에 있어서,
비경구(parenteral), 경구(oral), 눈의(ocular), 국부의(topical), 국소 영역의(loco-regional) 관장(enema) 또는 에어로졸 투여(aerosol administration)에 적합한 약제학적 복용 형태인, 약제학적 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서,
주사가능한 용액(injectable solution) 또는 서스펜션(suspension), 수액(infusion), 타블렛(tablet), 캡슐(capsule), 크림, 연고(ointment), 로션, 또는 좌약(suppository)의 형태인, 약제학적 조성물.
HCV 감염의 치료적 처리 또는 예방을 위한 의약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 모노클로날 항체 또는 이의 단편의 용도.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체의 유전자형(idiotype)과 특이적으로 결합할 수 있는, 항-유전자형 항체(anti-idiotype antibody).