JP2004524829A - C型肝炎ウイルスのe2糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体、ならびにc型肝炎の診断、治療、および予防におけるそれらの使用 - Google Patents
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Description
[技術分野]
本発明は、肝炎ウイルス学の分野に属する。特に本発明は、C型肝炎ウイルス(HCV)のエンベロープ2(E2)タンパク質に特異的なモノクローナル抗体、ならびにC型肝炎の診断、治療、および予防におけるこれらの抗体の使用に関する。
【0002】
[発明の背景]
元来は非A、非B型肝炎と呼ばれたC型肝炎は、A型肝炎およびB型肝炎とは血清学的に別個の疾患であると1975年に初めて説明された(Feinstone, S.M. et al.(1975) N. Engl. J. Med., 292:767−770)。C型肝炎は依然として輸血による肝炎の主要な種類であって、かつ主要な地域感染型肝炎の一つであるが、HCVゲノムのクローニングおよびシーケンシングによるC型肝炎の原因物質としてのC型肝炎ウイルス(HCV)の同定がなされるまで、当該疾患の理解に関してほとんど進歩がなかった(Choo, A.L. et al. (1989) Science , 288:359−362)。この研究により得られた配列情報から、HCVは、小型エンベロープ正鎖RNAウイルスであると特徴付けられた。
【0003】
HCVは、世界中に広がった急性および慢性肝炎の両方の主要原因である(Weiner, A.J. et al. (1990) Lancet, 335:1−3)。HCVに急性感染した個体の約80%が慢性感染になり、これらの個体の20%以上がそのうちに肝硬変を発症する(Alter, H.J. Seeff, L.B.: Transfusion Associated Hepatitis, In: Zuckerman, A.J. Thomas, H.C. (eds): Viral Hepatitis: Scientific Basis and Clinical Management, Edinburgh Churchill Livingstone, 1993)。感染個体の大多数において、HCVは慢性疾患を引き起こして、肝機能の損失をもたらし、かつ肝臓移植をしなければ、最終的には死に至る。移植を受けた患者はそれでもなお、体内を循環しているHCVから、新たな肝臓が再感染する危険に曝されている。さらに、HCV感染と肝細胞癌の発症との間に強い関連が見出されている(Bukh et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:1848−1851)。HCV感染は、その他の疾患、例えばいくつかの自己免疫疾患とも関連すると考えられる(Manns, M.P.(1993) Intervirol., 35:108−115; Lionel, F. (1994) Gastroenterology, 107: 1550−1555)。したがって、有意の罹患率および死亡率が、世界中でHCV感染により引き起こされている。現在、HCV感染を予防かつ/または治療するための免疫予防法または免疫療法はなく、さらに、現在の薬剤療法は部分的に有効であるに過ぎない。したがって有効な免疫予防法または免疫療法の開発は、最優先されるべきものである。
【0004】
C型肝炎ウイルスは、N末端ヌクレオキャプシドタンパク質(「コア」と呼ばれる)および2つのエンベロープ糖タンパク質「E1」および「E2」からなる3つの推定構造タンパク質を含む(Houghton et al. (1991) Hepatology, 14: 381−388参照)。
【0005】
HCV E1およびE2タンパク質は、免疫予防学および免疫療法の開発に大いに関係がある。実際、これらの分子を基礎にした組換えワクチンは、霊長類試験においてHCVによる実験的攻撃に対して防御的であることが示されている。特に、Choo等((1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 1294−98)は、免疫原としてHCV−1の組換えE1およびE2タンパク質を用いて、同種株のHCVによる攻撃に対するチンパンジーの予防接種の成功を報告した。しかしながらChoo等は、異種株のHCVによる攻撃に対する防御は実証していない。多数のHCV単離物の配列分析に基づいたHCVゲノムの異常分散性の発見(Bukh et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1993) 90: 8234−8238, Bukh et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8239−8243)は、多数種の株のHCVによる攻撃に対して防御できなければ、ワクチンとして適切ではないことを示唆する。この結論は、Farci等(Farci, P. et al. (1992) Science, 258: 135−140)およびPrince等(Prince, A.M. et al. (1992) J. Infect. Dis., 165: 438−443)の両者の研究により支持されており、各々が、ある一つの株のHCVによる感染は、再感染によるC型肝炎の程度を緩和するが、それは密接に関連した株による再感染に対して防御しないという証拠を提示した。
【0006】
HCVに対して生産された抗体はそのウイルスの感染性を中和し得る(Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68:1494−1500; Farci et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 7792−96)ため、感染の危険に曝されているか、または感染性作用物質に最近曝露されたことのある個体に、高反応性中和抗HCV抗体調製物を投与することにより、免疫化個体に受動免疫を提供し得る。
【0007】
したがって、HCV感染の危険性が高いか、またはHCVに最近曝露されたことのある個体を防御するために用いることができる、HCVに対する抗体が必要である。好ましくは、中和抗体は種々の株のHCVに対して広範に交差反応性を有する。
【0008】
[発明の概要]
本発明は、C型肝炎ウイルス(HCV)E2ポリペプチド抗原に対して免疫学的結合親和性を示し、かつ種々の株のHCVに対して交差反応性を有するヒトモノクローナル抗体に関する。
【0009】
本発明は、これらの抗体のγ1鎖のFRおよびCDRのアミノ酸配列に、ならびにこれらのアミノ酸配列をコードする核酸分子にも関する。
【0010】
本発明はさらに、本明細書中に記載される特異的抗体が得られるコンビナトリアルライブラリーに関するが、それは、そのライブラリーはHCVタンパク質に対する付加的モノクローナル抗体のリポジトリ(repository)を提供するためである。
【0011】
したがって本発明は、このライブラリーから単離され得るモノクローナル抗体にも関するが、この場合、このような抗体は、HCV E2ポリペプチドに対する抗体、ならびにその他のHCVポリペプチドに対する抗体を含み得る。
【0012】
さらに本発明は、哺乳類、好ましくはヒトにおける肝炎の予防、治療、および検出のための予防薬、治療薬および診断薬の開発における本発明のモノクローナル抗体の使用に関する。
【0013】
さらに本発明は、治療薬、予防薬、または診断薬として用いるための、本発明の抗体を含むキットに関する。
【0014】
本発明のこれらのおよびその他の目的は、本発明の以下の説明を考察した後に、さらに十分に理解されよう。
【0015】
[発明の詳細な説明]
本発明は、HCV E2に対する免疫学的結合親和性を示す5つのヒトモノクローナル抗体であって、無症候性慢性HCV感染患者(患者H)から単離された骨髄リンパ球および形質細胞RNAから調製されたファージディスプレイライブラリーからのFab断片として単離される抗体に関する。特に本発明の抗体は、可溶性形態のHCV E2糖タンパク質を利用してHCV E2抗原に特異的なFab分子を選択するパニング法を用いて選択された。
【0016】
Fab断片をFcドメインと組み合わせることにより単離Fab断片からの無傷な免疫グロブリンを製造する方法は、当業者に既知である。「抗体」という用語は、無傷な免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分を指すために本明細書中で用いられる。例示的抗体分子は、無傷な免疫グロブリン分子、実質的に無傷な免疫グロブリン分子、および例えば抗原結合断片、すなわちFab、Fab’、F(ab’)2、Fd、F(v)およびsFvを含む免疫グロブリン分子の一部分、ならびに親抗体分子の免疫学的結合特性を示すそのキメラ抗体分子である。
【0017】
「免疫学的結合親和性」および「免疫反応性」という用語は、本明細書中で互換的に用いられる場合、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリンとの特異性を有する抗原との間に生じる非共有結合相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の親和性は、相互作用の解離定数(Kd)に換算して表すことができ、この場合、Kdが小さいほど親和性は大きいことを表す。表2は、HCV−E2に対して誘導される5つのモノクローナル抗体のうち、2つのモノクローナル抗体が特に高い親和性を有する(HCV#4およびHCV#7)ことを示す。選択された抗体の免疫学的結合特性は、当該技術分野で周知の方法を用いて定量することができる。このような方法の一つは、抗原結合部位/抗原複合体の会合速度および解離速度の測定を伴うが、この場合、その速度は複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、ならびに両方の速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメーターによっている(Davies et al. (1990) Ann. Rev. Biochem., 59: 439−73参照)。
【0018】
本発明の5つのクローンのγ1鎖の可変領域のアミノ酸配列(HCV#1、HCV#4、HCV#7、HCV#12およびHCV#13)は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、および配列番号5として図1に示されている。配列番号1〜5は各々、4つのFRが隣接する3つの連続CDRを含む連続アミノ酸配列からなるが、この場合、アミノ酸配列はFR1のN末端で開始して、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3を通して連続して、FR4のC末端で終わる。
【0019】
「FR」という用語は、「超可変領域」と呼ばれる重鎖および軽鎖のV領域内の3つの高度分岐ストレッチと隣接する保存配列である「フレームワーク領域」を意味する。抗体分子においては、N末端抗原結合表面は結合抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖の3つの超可変領域を含む。軽鎖の3つの超可変領域は、三次元空間で互いに関して形成される。重鎖および軽鎖の各々の3つの超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「CDR」と呼ばれる。
【0020】
本明細書中で用いる場合、「FR組」という用語は、重鎖または軽鎖V領域のCDR組のCDRを組み立てる4つのフランキングアミノ酸配列を意味する。いくつかのFR(フレームワーク領域)残基は、結合抗原と接触し得る。しかしながら、FRは主として抗原結合部位に、特にCDRに直接隣接するFR残基中にV領域をフォールディングするのに関与する。
【0021】
「CDR組」という用語は、重鎖または軽鎖V領域の3つの超可変領域を意味する。重鎖または軽鎖のN末端から進行して、これらの相補性決定領域はそれぞれ「CDR1」、「CDR2」、および「CDR3」として示される。CDRは抗原−抗体結合に関与し、CDR3は特に、抗原−抗体結合に特異的な特有の領域を含む。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖V領域の各々からのCDR組からなる6つのCDRを含み得る。
【0022】
現在、系統発生学的分析に基づいて同定された多数の別個のサブタイプを有するHCVの6つの既知の別個の遺伝子型が存在する(Houghton, M. (1996) Fields Virology, 3rd Edition, Fields et al., eds., Lippencott−Raven Publishers, Philadelphia, PA; Simmonds et al., J. Gen. Virol., (1993) 74:2391−99)。γ1鎖アミノ酸配列が図1に示されている5つの抗体分子のうち、HCV E2エンベロープ糖タンパク質に特異的な4つの新規のヒトモノクローナル抗体分子は「交差遺伝子型反応性」を有する、すなわち少なくとも2つの遺伝子型由来のHCV単離物のE2抗原決定基と特異的に結合する抗体分子である。
【0023】
したがって本発明は、配列番号1〜配列番号5で示されたγ1鎖アミノ酸配列のCDRおよびFR組をコードする核酸分子にも関する。各々のプラスミドがpComb3Hベクター中にγ1重鎖(Fd部分)およびκ軽鎖遺伝子を含有する5つのヒトモノクローナル抗体をコードするDNA構築物が、2000年11月30日にAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、ATCC特許寄託指定番号:PTA−2747、PTA−2748、PTA−2749、PTA−2745、PTA−2746を有する。
【0024】
本発明は、遺伝暗号の縮重に起因するこれらの核酸配列の変異にも関する。Fab分子の重鎖および軽鎖部分に関するコード配列は、単離または合成することができ、発現のための任意の適切なベクターまたはレプリコン中にクローニングすることができる。適当なベクターの例としては、細菌、哺乳類、酵母、およびウイルス発現系が挙げられる。
【0025】
本発明のFab分子は、確証済のアミノ酸配列に基づいて、タンパク質合成の従来の方法を用いて生産することもできる。
【0026】
本発明はさらに、これらのヒトモノクローナル抗体を得ることができる、本明細書中に記載されたファージディスプレイライブラリーに関する。このライブラリーは、2000年11月30日にAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、ATCC特許寄託指定番号PTA−2750を有する。本発明はさらに、寄託されたファージディスプレイライブラリーからヒトモノクローナル抗体を作製する方法に関する。当業者は、ファージディスプレイライブラリーからモノクローナル抗体を単離する方法についての知識を有する。好ましい実施形態では、本方法は、(1)パニングのような免疫親和性技法を用いて予備選定抗原と免疫反応するファージ粒子を選択すること、(2)選択ファージ粒子で細菌を感染させること、(3)回収されたクローンからファージミドDNAを調製および分析すること、および(4)さらなる分析のために当該クローンから可溶性Fab断片を発現させて、精製することを含む。もちろん、スクリーニングに用いられる予め選択される抗原は、HCV E2タンパク質もしくはペプチド断片、または例えばE1およびコア構造タンパク質もしくは非構造タンパク質である、E2以外のHCVの任意のその他のタンパク質(またはそのペプチド断片)であり得ることを当業者は容易に理解するであろう。上記の方法を用いることにより、HCVに対する、またはある個体のRNAからライブラリーを調製したその個体中に存在する可能性がある任意のその他の病原体に対する付加的ヒトモノクローナル抗体が、本発明のライブラリーから単離され得る。
【0027】
本発明は、γ1鎖配列が配列番号1〜5で示される5つのモノクローナル抗体、または寄託されたファージディスプレイライブラリーから得られるHCVに対するモノクローナル抗体を、診断薬として使用することにも関する。当該抗体は、生物学的試料中のHCVの存在に関して試験するためのインビトロ診断薬として用いることもできる。特に、本発明の新規の特異的結合分子は、HCVを保有し、かつ/またはHCVに感染した個体をスクリーニングおよび同定するための高感度な方法、ならびにHCV混入血液または血液製品をスクリーニングするための高感度な方法において用いられ得る。本発明の結合分子は、治療個体における抗HCV療法の進行をモニタリングするためのアッセイ、およびHCV剤の調査および研究に用いられるHCV培養の成長速度をモニタリングするためのアッセイにおいても用いられ得る。
【0028】
一実施形態では、個体から得られる生物学的液体または生物学的組織のような試料は、試料中に存在し得るHCV抗原と抗体との免疫学的複合体の形成が可能な条件下で、診断的に有効量の本発明の1つまたは複数のヒトモノクローナル抗体と接触させられる。次に試料中にHCVが存在することを示す免疫学的複合体の形成が、イムノアッセイにより検出される。このようなアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素イムノアッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ等が挙げられるが、これらに限定されない。この場合、抗体に直接的または間接的に接合される検出可能な化合物または組成物に関連して、本明細書中で用いられる「標識」とは、診断目的で用いられ得る。標識はそれ自体検出可能であり(例えば放射性同位元素標識または蛍光標識)、または酵素を標識した場合に、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。
【0029】
免疫療法および免疫予防法はウイルス中和抗体を基礎にしているので、本発明の抗体は、好ましくは中和抗体、さらに好ましくは異なる遺伝子型に属するHCV単離物由来のE2抗原と免疫反応性を有する中和抗体である。中和活性を有する所定の抗体の能力を評価するために用いることができるインビトロアッセイが当該技術分野でいくつか既知である。例えば本発明に係るモノクローナル抗体によるCD81とE2の結合の阻害は(表3参照)、インビトロでの潜在的な中和活性の指標となる。さらに、実施例6に記載されたような結合の中和(NOB)アッセイは、HCV中和抗体を評価するために、かつヒト細胞とのHCVの結合の阻害を評価するために用いられ得る。図2は、HCV#4モノクローナル抗体および実験的NOB陽性対照のすべてが、細胞とHCVの結合を阻害するというNOBアッセイの結果を示す。
【0030】
したがって本発明は、予防目的または治療目的のための薬学的組成物として本発明の抗体を使用することにも関する。従って、このような組成物は免疫予防または免疫療法薬として用いられる。
【0031】
予防的に供給される場合、本発明の医薬組成物(1つまたは複数)は、任意の1つまたは複数のHCV株に任意に曝露する前に、またはウイルスの感染に起因する任意の症状が表れる前に提供される。本発明の医薬組成物(単数または複数)を予防的投与することは、哺乳類におけるこれらのウイルスの任意のその後の感染を防止するか、または弱めるのに役立つ。治療的に使用するためには、本発明の医薬組成物(単数または複数)は、感染した時(または感染した直後)に、あるいは感染の任意の症状、またはこれらのウイルスにより引き起こされる任意の疾患もしくは有害作用が表れた時に提供される。医薬組成物(単数または複数)の治療的投与は、感染または疾患を弱めるのに役立つ。したがって、本発明の医薬組成物(単数または複数)は、C型肝炎ウイルスへ曝露されると予想されるときに前もって、または感染した後に提供することができる。
【0032】
あるいは、組換え抗体をコードする遺伝子は、哺乳類細胞中へ遺伝子を移入するために開発された多数のウイルスベースの系を用いて、発現または同時発現するために適当な哺乳類宿主細胞中に導入され得る。例えばレトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利な手段を提供する。一本鎖VHまたはVLドメインポリペプチドをコードする選択ヌクレオチド配列は、当該技術分野で既知の技法を用いて、ベクター中に挿入され、かつレトロウイルス粒子中にパッケージングされ得る(Marasco et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 223−238)。次に組換えウイルスが単離され、被験体に送達され得る。多数の適切なレトロウイルス系が記載されている(米国特許第5,219,740号;Miller (1990) Hum. Gene Therapy, 1:5−14; Scarpa et al (1991) Virology, 180: 849−52; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8033−7;およびBoris−Lawrie and Temin (1993) Curr. Opin. Genet. Develop., 3: 102−9)。さらに、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、あるいは種々の細菌プラスミド由来の発現ベクターは、標的器官、標的組織、または標的細胞集団へヌクレオチド配列を送達するために用いられ得る。当業者に周知の方法を、1つまたは複数の組換え抗体をコードする配列を適当な転写調節要素および翻訳調節要素とともに含む発現ベクターを構築するために用いることができる。これらの方法としては、インビトロ組換えDNA技法、合成技法、ならびにインビボ遺伝子組換えが挙げられる。このような技法は、J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY、およびF.M. Ausubel, et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NYに記載されている。
【0033】
活性成分として、1つまたは複数の抗体、抗体断片、sFv分子、またはそれらの組合せを含む医薬組成物の調製は、当業者に一般的に知られている。通常、このような組成物は注射することができる形態(例えば液体溶液または懸濁液、あるいは注射前に溶液または溶液中の懸濁液とするのに適した固体形態)として調製される。当該組成物は一般に、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等の1つまたは複数の「薬学的に許容可能な賦形剤またはビヒクル」、およびそれらの組合せも含む。さらに、例えば湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質等の少量の補助物質がこのようなビヒクル中に存在していてもよい。
【0034】
個々の患者にとって治療的に有効なモノクローナル抗体の量は、副作用を最小限に抑えながら、治療または予防効果が得られるように、個体に投与される抗体の量を滴定することにより確定することができる。送達される組成物の量は、治療される被験体、被験体自体の免疫応答を高める被験体の免疫系の能力、および保護したい程度に依存する。必要とされる正確な量は、特に、治療される個体の年齢および一般的状態、治療される症状の重篤度、および選択された特定の抗HCV薬およびその投与方式などによって変わる。当業者は、適切な有効量を容易に確定することができる。したがって、組成物の「治療上の有効量」は、HCV疾患症状の治療または予防をもたらすのに十分である量であればよい。有効量は、組成物を投与した後に、HCVの量を測定することにより確定され得る。HCVのレベルは、当該技術分野で既知の、例えばRT−PCRなどのインビトロアッセイにより測定され得る。治療を受けている個体に関する抗体の血漿濃度は、通常0.1μg/ml〜100μg/mlである。概して、哺乳類の体重1kg当たり約5mg〜約20mgの範囲である投与量の抗体をレシピエントに提供するのが望ましいが、それより低い用量または高い用量を投与してもよい。さらに接種物は、通常約1μg〜約50mg/接種(用量)、好ましくは約10μg〜約10mg/用量、最も好ましくは約100μg〜約5mg/用量の濃度のペプチドを含む。
【0035】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮等(これらに限定されない)を含むいくつかの経路のうちの1つにより投与され得る。さらに薬学的組成物は、単回または多数回投与スケジュールでの免疫予防薬として、あるいは多数回投与または連続投与スケジュールでの免疫治療法として投与され得る。多数回投与スケジュールとは、主な治療コースが1回以上の別個の投与、好ましくは1〜10回の投与で、その後は、必要に応じて一定の間隔でさらに投与され、それにより組成物の作用を保持または強化し得るスケジュールである。したがって、投薬レジメンは、少なくとも一部は、治療される被験体の特定の必要性に基づいても決定され、そして投与医の判断によっている。
【0036】
したがって本発明は、HCV感染の受動免疫療法における本発明の中和モノクローナル抗体の使用にも関する。無傷な免疫グロブリン分子を含む抗体、実質的に無傷な免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の一部分ならびにそのキメラ抗体分子のほかに、抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む、当該技術分野で既知であるいくつかの治療的に有用な分子が存在する。このような分子の1つが、無傷抗原結合部位を含むヘテロダイマーからなるFab分子である。酵素ペプシンは、IgGを、いくつかの断片(例えば2つの抗原結合部位を含む「F(ab)2」断片)に切断し得る。「Fv」断片は、IgM免疫グロブリン分子の、そして時としてはIgGまたはIgA免疫グロブリン分子の選択的タンパク質分解切断により生産され得る。しかしながら、Fv断片は、より一般的には、当該技術分野で既知の組換え技法を用いて得ることができる。Fv断片としては、例えば自然抗体分子の抗原認識および結合能力の多くを有する抗原結合部位を含む非共有結合VH::VLヘテロダイマー(Inbar et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2659−62; Hochman et al. (1976) Biochem., 15:2706−10;およびEhrlich et al., (1980) Biochem., 19:4091−6参照)が挙げられる。受動免疫療法に用いられる場合、患者は、治療的に有効量の1つまたは複数の中和ヒトモノクローナル抗体を投与される。本発明の受動免疫療法は、HCVに感染した個体、またはHCV感染の危険に直面している個体に実施され得る。
【0037】
したがって本発明は、本発明の抗体、およびファージディスプレイライブラリー由来の付加的抗体からなる群の少なくとも1つの抗体、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関するが、このような担体としては、生理学的に許容可能な緩衝剤、例えば生理食塩水またはリン酸塩緩衝生理食塩水が挙げられる。
【0038】
本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体に関する。一実施形態では、抗イディオタイプ抗体は、当業者に既知の方法により、本発明のモノクローナル抗体で宿主動物を免疫化することにより調製することができる。Fc領域に対する免疫学的応答を排除するために、宿主動物と同一種により生産された抗体を用いてもよく、または投与抗体のFc領域を除去してもよい。医薬組成物の調製においては、本発明のモノクローナル抗体を用いるよりもむしろ、産生された抗イディオタイプ抗体が用いられ得る。
【0039】
本発明の抗体および/またはファージディスプレイライブラリーから得られた抗体は、キットの形態で、単独で、または医薬組成物の形態で供給され得る。
【0040】
本発明の実施においては、別記しない限り、当該技術分野の技術内のウイルス学、微生物学、分子生物学および組換えDNA技法の従来の方法を用いる。このような技法は、文献中で十分に説明されている(例えばSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual,(2nd Edition, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II(D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis, (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization, (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation, (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture, (R. Freshney, ed. 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, (1984); Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II(B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.)参照)。
【0041】
ここで実施例により本発明を説明するが、実施例は例示のためであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【0042】
実施例
本明細書中の実施例は、本発明を実施する種々の態様を例示するものであり、いかなるようにも本発明の範囲を限定するよう意図されない。実施例には、例えばベクターの構築、このようなベクター中へのcDNAの挿入、あるいはその結果生じるベクターを適当な宿主中へ導入することなど、用いられた従来の方法に関する詳細な説明は含まれない。このような方法は当業者に周知であり、多数の出版物中に、例えばSambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, (1989)に記載されている。
【0043】
実施例1
ドナー
HCVに慢性感染している無症候性患者である患者Hから、骨髄を吸引した。骨髄リンパ球および形質細胞をフィコール比重遠心法で分離し、10%ジメチルスルホキシド、10%ウシ胎児血清、およびRPMI1640培地(Bio Whittaker; Walkersville, MD)中の生育可能単一細胞懸濁液として液体窒素中で保存した。
【0044】
実施例2
γ1/κ抗体ファージライブラリーの構築
全RNAを〜108の骨髄リンパ球および形質細胞(RNA単離キット;Stratagene)から抽出し、オリゴ(dT)プライマー(Gibco/BRL, Rockville, MD)を用いてmRNAをcDNAに逆転写した。rTthDNAポリメラーゼ(Perkin Elmer; Gaithersburg, MD)を用いてPCRにより、cDNAを増幅した。「94℃で15秒、52℃で50秒、および68℃で90秒」のサイクルを30サイクル実施した。ヒトκ鎖遺伝子に特異的なプライマーを用いて、患者κ鎖遺伝子を増幅した。遺伝子の5’末端を認識する9つのファミリー特異的ヒトVHプライマーを用いて、ヒトγ1鎖遺伝子のFdセグメント(可変および一次定常ドメイン)を増幅した(Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978−82, 1991; Persson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2432−6, 1991)。
【0045】
Williamson等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 4141−5, 1993; erratum Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:1193, 1993)による記載に従って、pComb3Hファージディスプレイベクター中に増幅κ鎖をクローニングした。PCR産物の3’末端でrTthDNAポリメラーゼにより付加された付加的アデノシンヌクレオチドにより、pGEM−Tクローニングベクター(Promega; Madison, WI)中に増幅γ1鎖をクローニングした。Glamann等(J. Virol., 72: 585−92,1998)の記載に従って、γ1−pGEM−Tクローンはエシェリヒア・コリXL−1Blue(Stratagene; La Jolla, CA)中に形質転換され、固相増幅により2リットルの容積に拡張させた。γ1−pGEM−TライブラリーをXhoIおよびSpeI(Boehringer Mannheim; Nutley, NJ)で消化し、XhoIおよびSpeIで消化されたκ鎖pComb3Hライブラリーに連結した。連結産物はエシェリヒア・コリXL−1Blue中に形質転換された。固相増幅により、形質転換体を2リットルの容積に拡張させた。1.9×107クローンの最終ライブラリーを、使用するまで、12.5%グリセロール−LBブロス中に−80℃で保存した。
【0046】
すべてのパニング実験および固相酵素免疫検定法(ELISA)において、CHO細胞中で発現された組換え可溶性切断型(truncated)E2タンパク質(Lesniewski et al., J. Med. Virol., 45: 415−22, 1995)を50mMの炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)中に1μg/mlに希釈し、4℃で一晩、EIA/RIA A/2プレート(Corning Costar; Acton, MA)に吸着させた。ヤギ抗ヒトIgG(H+L)特異的抗体(Pierce; Rockford, IL)を用いて、Fabを検出した。これを、上記のような50mM炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)中で1:1000に希釈して、マイクロタイターウェルに被覆した。
【0047】
Barbas等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978−82, 1991)およびWilliamson等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 4141−5, 1993; erratum Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:1193, 1993)による以前の記載に従って、コンビナトリアルライブラリースクリーニングを実施した。アンピシリン100μg/mlおよび1%(v/v)グルコース(Sigma; St. Louis, MO)を補充したLuria−Bertani(LB)ブロス(Gibco/BRL, Rockville, MD)中に、ライブラリーストックからの約109個の細菌を接種し、増幅し、次に50の感染多重度でヘルパーファージVCS M13(Stratagene; La Jolla, CA)で感染させて、ファージ粒子の表面に提示されるライブラリーを作製した。ファージをHCV E2被覆ELISAウェル上でパニングした。すべてにおいて、3回のパニングを実施した。選定ライブラリーの増幅後、ファージミドDNAを抽出し、制限酵素消化によりベクターを修飾して、ファージのバクテリオファージコートタンパク質IIIコード領域を除去した(Bender et al. Hum. Antibodies Hybridomas, 4:74−9, 1993)。ファージミドDNAは再連結され、エシェリヒア・コリXL−1Blue(Stratagene)中に形質転換され、可溶性Fabを生産した。コロニーを、マイクロタイタープレートの各ウェル中のLBブロス中に接種して、30℃で一晩インキュベートした。Glamann等(J. Virol., 72: 585−92, 1998)に従って、Fab産生を誘導し、E2との反応性に関して、ならびにFabの存在に関して、ELISAにより細菌上清を試験した。
【0048】
実施例3
FAB産生およびFAB特異性の分析
Glamann等(J. Virol., 72: 585−92, 1998)の記載に従って、細菌培養およびFab断片精製を実施した。色素結合アッセイ(BioRad; Hercules, CA)およびA280nm(1.0mg/mlと等価の1.4光学濃度単位の吸光係数を用いて)の両方により、タンパク質濃度を求めた。Fab純度は、コロイドクーマシーブルー染色(Sigma)を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動により求めた。精製Fabを、製造業者のプロトコール(Pierce)に従って、重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)で希釈し、4℃でビオチン化した。ビオチン化した後、Fabをリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)に対して4℃で一晩透析し、必要な場合には、濃縮器Centricon−30(Amicon/Millipore; Bedford, MA)で濃縮した。
【0049】
タンパク質抗原でELISAマイクロタイタープレートを被覆することにより、ELISA分析を実施した。具体的には、1μg/mlのタンパク質抗原HCV E2および10μg/mlの非特異的タンパク質(例えば、チログロブリン、リゾチーム、グリセルアルデヒド−3−ホスフェート、ニワトリアルブミン、およびシトクロムC(Sigma))を用いて、マイクロタイタープレートを被覆した。抗原で被覆したウェルを、3%ウシ血清アルブミン(BSA)−PBSを用いて室温で1時間遮断し、PBS−Tween20(0.05%(v/v))で2回洗浄し、50μlの粗製Fabをウェルに添加した。37℃で1時間のインキュベーション後、プレートをPBS−Tween20で4回洗浄した。結合Fabを、ヤギ抗ヒトIgG(Fab特異的)アルカリ性ホスファターゼ標識二次抗体(Sigma)の1:5000希釈液で検出した。ジエタノールアミン緩衝液(Pierce)中の1mg/mlのp−ニトロフェニルホスフェート(Sigma)を用いて、アッセイ色を発色させた。650nmの波長を参照して、405nmでの光学濃度を確定した。
【0050】
実施例4
HCV特異的FABクローンの核酸シーケンシング、分析、およびBST N1フィンガープリンティング
以下のシーケンシングプライマー:重鎖5’−ATTGCCTACGGCAGCCGCTGG−3’(HC1;配列番号6)および5’−GGAAGTAGTCCTTGACCAGGC−3’(HC4;配列番号7);κ鎖5’−ACAGCTATCGCGATTGCAGTG−3’(LC1;配列番号8)および5’−CACCTGATCCTCAGATGGCGG−3’(LC4;配列番号9)とともに、Ampli−TaqDNAポリメラーゼ(Perkin−Elmer; Gaithersburg, MD)を用いることにより、ABI PRISM Dyeターミネーターサイクルシーケンシングレディー反応キットで、核酸シーケンシングを実施した(Glamann et al. J. Virol., 72: 585−92, 1998)。その結果生じた配列を、SequencherおよびMac Vector(Oxford Molecular Group)ソフトウェアパッケージで分析した。全利用可能ヒト可変セグメントIg生殖系配列をまとめたものであるV−BASEプログラムで、配列類似性を検索した(Cook et al. Immnol. Today, 16: 237:42, 1995)。すべての既知のヒト免疫グロブリン遺伝子の配列類似性を検索した結果を、表1に要約する。Bst N1(New England Biologicals; Beverly, MA)フィンガープリンティングするために、プラスミドDNA1μgを1Uの酵素で、60℃で一晩、消化した。制限消化物を、3%アガロースゲル上で分析した。ヒトγ1重鎖を高頻度に切断する制限酵素Bst N1を用いて、Fabクローンの種々の重鎖配列に関してスクリーニングした(Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581−97, 1991)。配列分析によりBst N1消化物の結果を確かめたが、5つの特有のγ1重鎖のみを、HCV#1、HCV#4、HCV#7、HCV#12およびHCV#13と同定した(図1)。
【0051】
すべての既知のヒト免疫グロブリン遺伝子の配列類似性を検索することにより、特定の生殖系起源の5つのモノクローナル抗体を評価した。2つのγ1重鎖配列(HCV#1およびHCV#13)はヒトVH4ファミリーの生殖細胞系セグメントと最も高い相同性を示したが、一方、他の3つのγ1重鎖配列(HCV#4、HCV#7、およびHCV#12)は、ヒトVH1ファミリーの生殖系セグメントと最も高い相同性を示した(表1)。κ−軽鎖配列は、ヒトVκファミリーの生殖系セグメントと様々な相同性を示した。
【0052】
【表1】
【0053】
実施例5
HCVモノクローナル抗体の親和性の決定
競合阻害ELISAにより、モノクローナル抗体の親和性(平衡解離定数Kd)を決定した(Persson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 2432−6, 1991; Rath et al. J. Immunol. Meth., 106: 245−9, 1988)。簡単に述べると、Fabのlog10希釈液をE2被覆ウェル上で滴定し、Fab濃度を10分の1に低減することにより、Fabの結合が実質的に減少した希釈液を、競合ELISAに用いた。次にこの濃度のFabを37℃で2時間インキュベートすると、E2被覆ウェル中で、溶液中のE2の濃度のlog10が減少した。プレートをPBS/Tween−20で4回洗浄し、抗ヒトIgG(Fab特異的)アルカリ性ホスファターゼ標識二次抗体(Sigma)の1:5000希釈液を用いて、結合Fabを検出した。A405nm値の減少%をプロットし、50%阻害(I50)値を推定した。I50値でのE2の濃度は、抗原に対する抗体の親和性(Kd)を表す。
【0054】
5つのHCVクローンすべてに関して親和性を測定したが、HCV#12は決定できなかった(表2)。配座エピトープを認識するHCV E2特異的モノクローナル抗体は、可溶性E2タンパク質に対する親和性(1.6〜40.5nM)を示した。4つのクローンに関するKd値を決定したが、HCV#12のKd値はおそらくはアッセイに関する感受性の下限値(<107M)未満であるために、決定不可能であったと考えられる。HCV#4およびHCV#7モノクローナル抗体は、それぞれ1.6および3.5nMの高平衡解離定数(Kd)を有した。
【0055】
【表2】
【0056】
実施例6
HCVモノクローナル抗体によるCD81との組換えE2タンパク質の結合の中和
可溶性E2タンパク質と推定細胞受容体CD81との間の結合の阻害を測定した。CD81−E2相互作用の遮断を分析するために、Forns等(Virology, 274: 75−85, 2000)により記載されたアッセイを実施した。負の対照として用いられる無関係なFabHEV#31(Schofield et al., J. Virol., 74: 5548−55, 2000)、および正の対照としてのH79血清(一次HCV感染の開始後2年目の患者Hからの血漿)を用いて、CD81−E2相互作用を遮断する能力に関して、Fabを力価測定した。ELISAフォーマットでの組換え可溶性E2と組換えCD81−チオレドキシン融合タンパク質の結合を遮断する能力に関して、モノクローナル抗体を力価測定した。モノクローナル抗体HCV#4およびHCV#7はともに、CD81−E2結合を効率的に阻害した(それぞれ2.4および1.9μg/ml)(要約に関しては表3参照)。
【0057】
【表3】
【0058】
実施例7
HCV−モノクローナル抗体相互作用の遮断および阻害
感受性ヒトT細胞系HPBMa10−2にHCVウイルス粒子が付着するのを、Shimizu等(J. Virol., 68: 1494−1500, 1994)により確立された方法により、本発明のHCVモノクローナル抗体のうちの2つによって阻害した。簡単に述べると、抗体および患者Hからのウイルス接種物(103.550%チンパンジー感染用量/mlでのH77)を一緒に、4℃で一晩インキュベートした。次に、この抗体−ウイルス混合物を、3×105個の細胞の懸濁液1mlに添加し、37℃で2時間インキュベートした。PBSで2回洗浄後、RNA抽出を実施した後、RT−PCR処理を施して、細胞関連HCVゲノムを検出した(Shimizu et al. (1994) J. Virol., 68: 1494−1500)。
【0059】
HCV E2特異的モノクローナル抗体、抗HVR1(超可変領域1)ウサギ過免疫(86I、87I)または前免疫血清(87P)、およびウイルス(103.550%チンパンジー感染用量/mlでのH77)を一緒に、4℃で一晩インキュベートした。次にこの抗体−ウイルス混合物を、3×105個のHPBMa10−2細胞(感受性ヒトT細胞系、Shimizu et al. J. Virol.,1994)の懸濁液1mlに添加した。モノクローナル抗体が、連続ヒトT細胞系へのウイルス付着を阻害する能力を、RT−PCRにより決定した。RT−PCRデータの例を、図2に示す。5つのMAbすべてに関する予備データの要約を、図2の表に示す。
【0060】
実施例8
HCV遺伝子型間の抗E2の交差反応性
これらのモノクローナル抗体により認識されるエピトープがHCV遺伝子型間においてどの程度広範に保存されているかを決定するために、免疫蛍光アッセイを実施した。特に、遺伝子型1a、1b、2a、3a、4a、5a、および6a由来の完全な細胞内形態のE2を発現するプラスミドを構築した。それぞれのプラスミドを用いてトランスフェクトさせたHuh−7細胞の免疫蛍光染色により、種々の遺伝子型のHCV E2と5つのモノクローナル抗体との反応性を決定した。E2構築物はすべて、E1のC末端由来の20個のアミノ酸、およびE2およびp7の両方の完全なアミノ酸配列を含んでいた。遺伝子型1a構築物pE2−1aは、Forns等(Vaccine, 17: 1992−2002, 1999)によりすでに記載されている。遺伝子型1b(pE2−1b)および遺伝子型2a(pE2−2a)構築物は、完全長コンセンサス感染性cDNAクローンpJ4L6SF(遺伝子型1b;Yanagi et al. Virology, 244: 161−72, 1998)およびpJ6CF(遺伝子型2a;Yanagi et al. Virology, 262: 250−63, 1999)から調製した。遺伝子型3a、4a、5a、および6a構築物は、感染性血清攻撃プール(challenge pools)(Bukh et al. J. of Infectious Diseases, 178: 1193−1197, 1998; Bukh et al. Intervirology, 44: 132−142, 2001)から調製した。
【0061】
8のチャンバを有する顕微鏡スライド中にある、ほぼ集密的Huh−7細胞を、リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬(Gibco/BRL)を用いて、製造業者のプロトコールに従って、1チャンバ当り1μgのDNAでトランスフェクトした。37℃で48時間インキュベートした後、細胞を固定し、氷冷アセトンで透過性にした。モノクローナル抗体を5%BSA−PBS中で1:10に希釈し、かつH79を5%BSA−PBS中で1:100に希釈した。スライドを簡単に風乾し、次に一次抗体を添加して、加湿チャンバ中において室温で40分間インキュベートした。それぞれのスライドをPBS中で15分間3回洗浄した後、1:100で希釈した抗ヒトIgG(H+L)FITC(Pierce)二次抗体を添加した。暗所において室温で30分間インキュベートした後、スライドを再び洗浄した後、蛍光顕微鏡により調査した。表4は、交差遺伝子型反応性アッセイの結果を要約するが、HCV#12以外のモノクローナル抗体はすべて、HCV E2遺伝子型1aおよび1bとの交差反応性を示した。HCV#4は、6つすべての主要HCV遺伝子型(1a〜6a)由来のE2との交差反応性を示した。HCV#1およびHCV#13は、遺伝子型4a由来のE2との交差反応性を示した。HCV#7も、遺伝子型3a、4a、および5a由来のE2と交差反応をした。E2の超可変領域(HVR1)を有さない、表面発現されたE2661△HVR1(遺伝子型1a)が正の対照として用いられ、すべてのモノクローナル抗体により認識された。したがって、本発明のモノクローナル抗体はすべて、E2タンパク質のHVR1中のエピトープに対して誘導される抗体ではない。
【0062】
【表4】
【0063】
実施例9
間接的競合ELISAによるエピトープマッピング
間接的競合アッセイは、E2タンパク質上の5つのMAbにより認識されるエピトープの相対的トポロジーを決定するために実施されるものである(図3)。競合モノクローナル抗体をE2被覆ウェル上で力価測定し、適切な希釈率を決定して、A405nmで、かつプレートに被覆された抗原を飽和しない濃度で、約1.0のO.D.読取値を得た。競合アッセイのために、非標識モノクローナル抗体の3倍希釈液をE2被覆ウェル中において37℃で1時間インキュベートし、次にPBS−Tween−20で4回洗浄した。競合モノクローナル抗体(ビオチン化チンパンジーFabまたはマウスIgG)の単一希釈液を、すべてのウェル中において37℃で1時間インキュベートした。PBS−Tween−20で4回洗浄後、競合体モノクローナル抗体の結合を、抗マウスIgG(H+L鎖特異的)アルカリホスファターゼ接合抗体(Pierce)を用いて、またはストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(Pierce)の添加により検出した。上記と同様に発色させた。可溶性E2との結合に関する互いの競合に基づいて、MAbを2つの群に分けた:(1)HCV#4およびHCV#7;ならびに(2)HCV#1、HCV#12、およびHCV#13。したがって、MAbは、E2糖タンパク質上のエピトープのうち少なくとも2つの異なるエピトープに対して誘導されると思われる。
【0064】
実施例10
チンパンジーにおけるインビボモニタリングによるHCVのインビトロ中和の測定
50%チンパンジー感染性用量(CID50)の64倍のHCV(H77株)を、HCVに対するヒトモノクローナル抗体の混合物とともに、4℃で一晩インキュベートする。翌朝、混合物をナイーブチンパンジーに静脈内接種する。肝炎の生化学的証拠(例えばALT、ICD、GGTP)、感染のウイルス学的証拠(例えばウイルス血症のRT−PCR)およびHCVに対する抗体の血清学的証拠に関して、チンパンジーを毎週追跡調査する。チンパンジーが1ヶ月間、HCV感染の証拠を示さないままである場合には、モノクローナル抗体のオリジナルプールのサブセットを用いて実験を反復する。チンパンジーが感染するまで、モノクローナル抗体の異なるサブセットを用いて、この手順を反復する。必要な場合には、モノクローナル抗体が中和させているか否かを正確に確定するために、さらに別のチンパンジーに接種する。すべてのモノクローナル抗体が中和させていることを確認した場合は、チンパンジーの感受性に関する正の対照として、他のウイルスに対して向けられるモノクローナル抗体を用いて、当該手順を反復する。
【0065】
実施例11
チンパンジーにおけるHCVに対する受動免疫予防法
1つまたは複数の中和HCVモノクローナル抗体を、ナイーブチンパンジーに静脈内注入する。次に、64CID50のHCVを用いてチンパンジーをチャレンジする。肝炎の生化学的証拠(例えばALT、ICD、GGTP)、感染のウイルス学的証拠(例えばウイルス血症のRT−PCR)、およびHCVに対する抗体の血清学的証拠に関して、6ヶ月間チンパンジーを毎週追跡調査する。チンパンジーがHCV感染をしないままである場合には、受動免疫予防法が成功したとみなした。
【0066】
実施例12
チンパンジーにおける慢性HCV感染に対する受動免疫療法
1つまたは複数の中和HCVモノクローナル抗体を、HCVに慢性的に感染しているチンパンジーに静脈内注入する。肝炎の生化学的証拠(例えばALT、ICD、GGTP)、感染のウイルス学的証拠(例えばウイルス血症のRT−PCR)、およびHCVに対する抗体の血清学的証拠に関して、チンパンジーにおけるHCV感染の経過を毎週調査する。複製レベルの変化が認められない場合、注入する抗体の用量を増大させる。臨床的応答(PCRにより測定した場合の、血中のウイルスゲノムの力価の減少)が検出された場合、モノクローナル抗体の用量を調整して、その下限有効力価を決定する。一定間隔で当該容量をチンパンジーに投与して、受動免疫療法により恒久的に感染が除去され得るか否かを決定する。
【図面の簡単な説明】
【図1】
HCV#1(配列番号1)、HCV#4(配列番号2)、HCV#7(配列番号3)、HCV#12(配列番号4)、HCV#13(配列番号5)で示される、5つのE2特異的モノクローナル抗体のγ1鎖のFRおよびCDRのアミノ酸配列を示す。ここで、FRはフレームワーク領域を意味し、CDRは相補性決定領域を意味する。
【図2】
HCV感染に感受性を有するヒトT細胞系であるHPBMa10−2細胞に、患者H(H77)由来のウイルス接種物が吸着するのを阻害したことを示す、結合の中和(NOB)吸着阻害アッセイの結果を示す。HCV#4は細胞関連ウイルスの力価を減少したが、HCV#7に関するPCR力価の減少は認められなかった。したがって、HCV#4は、HPBMa10−2細胞にHCVが吸着するのを遮断した。ウサギ高度免疫血清86Iおよび87Iは、細胞へのHCV吸着の阻害に関する正の対照として用いられた。ウサギ前免疫血清87Pは、負の対照として用いられた。
【図3】
E2タンパク質上での5つのモノクローナル抗体の間接的競合ELISAによるエピトープマッピングの結果を示す。非標識HCV#4FabをE2被覆ELISAウェルと反応させて、ビオチン化HCV#1()、HCV#4()、HCV#7()、HCV#12()およびHCV#13()の結合を、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ接合体を用いて検出した。非標識HCV#4は、E2被覆ウェルにビオチン化HCV#4およびHCV#7が結合するのを阻害した。
Claims (26)
- C型肝炎ウイルス(HCV)E2抗原に対する免疫学的結合親和性を示すヒトモノクローナル抗体であって、配列番号1〜配列番号5で示されるアミノ酸配列から選択されるγ鎖CDR3領域アミノ酸配列を有するモノクローナル抗体。
- C型肝炎ウイルス(HCV)E2抗原に対する免疫学的結合親和性を示すヒトモノクローナル抗体であって、配列番号1〜配列番号5で示されるγ鎖可変領域アミノ酸配列のうちの1つを有するモノクローナル抗体。
- C型肝炎ウイルス(HCV)E2抗原に対する免疫学的結合親和性を示すヒトモノクローナル抗体であって、該抗体をコードするDNA構築物が、ATCC受託番号:PTA−2747、PTA−2748、PTA−2749、PTA−2745、PTA−2746からなる群から選択されるATCCアクセッション番号を有するモノクローナル抗体。
- 配列番号1〜配列番号3および配列番号5のアミノ酸配列から選択されるγ鎖CDR3領域を有し、かつHCV遺伝子型1aおよび1b由来のE2抗原との免疫反応性を有する請求項1記載のモノクローナル抗体。
- 配列番号2のアミノ酸配列から選択されるγ鎖CDR3領域を有し、かつHCV遺伝子型1a、1b、2a、3a、4a、5a、および6a由来のE2抗原との免疫反応性を有する請求項1記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1〜3記載の抗体の重鎖免疫グロブリンアミノ酸配列および軽鎖免疫グロブリンアミノ酸配列をコードする核酸分子。
- 請求項6記載の核酸分子を含むDNA構築物。
- ATCC特許寄託指定番号:PTA−2750を有するファージディスプレイライブラリー。
- 請求項8記載のファージディスプレイライブラリーから単離されるヒトモノクローナル抗体。
- HCVポリペプチドとの免疫反応性を有する請求項9記載の抗体。
- HCV E2ポリペプチドとの免疫反応性を有する請求項10記載の抗体。
- 請求項1、2、3、10、または11記載の抗体の抗原結合断片。
- 請求項1、2、3、10、または11記載の少なくとも1つの抗体、および適切な賦形剤、希釈剤、または担体を含む医薬組成物。
- 請求項12記載の抗原結合断片、および適当な賦形剤、希釈剤、または担体を含む医薬組成物。
- 生物学的試料中のC型肝炎ウイルスの検出方法であって、
a)抗体とC型肝炎ウイルス抗原との間の免疫複合体を形成するのに適した条件下で、請求項1、2、3、10、または11記載の少なくとも1つの抗体と試料を接触させること、および
b)前記免疫複合体の存在を検出すること
を含む方法。 - 生物学的試料中のC型肝炎ウイルスの検出方法であって、
a)抗原結合断片とC型肝炎ウイルス抗原との間の免疫複合体を形成するのに適した条件下で、請求項12記載の少なくとも1つの抗原結合断片と試料を接触させること、および
b)前記免疫複合体の存在を検出すること
を含む方法。 - 前記生物学的試料は、肝細胞、骨髄、血清、血漿、唾液、リンパ球、またはその他の単核細胞からなる群から選択される請求項15記載の方法。
- 前記生物学的試料は、肝細胞、骨髄、血清、血漿、唾液、リンパ球、またはその他の単核細胞からなる群から選択される請求項16記載の方法。
- HCVに感染した哺乳類への受動免疫療法の提供方法であって、治療的に有効量の、請求項1、2、3、10、または11記載の少なくとも1つのヒトモノクローナル抗体を前記哺乳類に投与することを含む方法。
- HCVに感染した哺乳類への受動免疫療法の提供方法であって、治療的に有効量の、請求項12記載の少なくとも1つの抗原結合断片を前記哺乳類に投与することを含む方法。
- C型肝炎の予防方法であって、HCVによる攻撃から哺乳類を防御するのに有効な量の、請求項1、2、3、10または11記載の少なくとも1つのモノクローナル抗体を前記哺乳類に投与することを含む方法。
- C型肝炎の予防方法であって、HCVによる攻撃から哺乳類を防御するのに有効な量の、請求項12記載の少なくとも1つの抗原結合断片を前記哺乳類に投与することを含む方法。
- 請求項1、2、3、10、または11記載の抗体に対する抗イディオタイプ抗体。
- 請求項12記載の抗原結合断片に対する抗イディオタイプ抗体。
- 請求項1、2、3、10、または11記載のモノクローナル抗体を含むHCVの検出のためのキット。
- 請求項12記載の抗原結合断片を含むHCVの検出のためのキット。
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