RU2596409C2 - Моноклональное антитело против hcv в качестве лекарственного средства для терапевтического лечения и профилактики инфекций hcv - Google Patents

Моноклональное антитело против hcv в качестве лекарственного средства для терапевтического лечения и профилактики инфекций hcv Download PDF

Info

Publication number
RU2596409C2
RU2596409C2 RU2011130522/10A RU2011130522A RU2596409C2 RU 2596409 C2 RU2596409 C2 RU 2596409C2 RU 2011130522/10 A RU2011130522/10 A RU 2011130522/10A RU 2011130522 A RU2011130522 A RU 2011130522A RU 2596409 C2 RU2596409 C2 RU 2596409C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
hcv
fragment
monoclonal antibody
antibody
variable region
Prior art date
Application number
RU2011130522/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2011130522A (ru
Inventor
Роберто Буриони
Массимо Клементи
Original Assignee
Помона Ричерка С.Р.Л.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Помона Ричерка С.Р.Л. filed Critical Помона Ричерка С.Р.Л.
Publication of RU2011130522A publication Critical patent/RU2011130522A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2596409C2 publication Critical patent/RU2596409C2/ru

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1081Togaviridae, e.g. flavivirus, rubella virus, hog cholera virus
    • C07K16/109Hepatitis C virus; Hepatitis G virus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18Antivirals for RNA viruses for HIV
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55Fab or Fab'
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Данное изобретение относится к области биотехнологии. Предложено применение моноклонального антитела или его фрагмента, содержащих по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи антитела e20 и способных связываться с гликопротеином Е2 HCV из генотипов 1а, 1b, 2а, 2b или 4, для нейтрализации инфекции вируса гепатита С (HCV). Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в лечении и профилактике инфекций HVC. 5 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 ил.

Description

Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу против гликопротеина E2 вируса гепатита C (HCV) в качестве лекарственного средства для терапевтического лечения и профилактики инфекций HCV.
HCV представляет собой вирус, имеющий перикапсид и одноцепочечную РНК, который принадлежит к семейству Flavivirus. Основываясь на генетических различиях, наблюдаемых среди различных изолятов HCV, этот вид вируса разделяют на 6 различных генотипов, каждый из которых обозначен номером. В свою очередь, каждый генотип содержит несколько субтипов, каждый из которых обозначен буквой. Частота заболеваний и распространение различных генотипов HCV различны по всему миру. В Европе преобладающим генотипом является генотип 1b, тогда как в Северной Америке преобладает генотип 1a. Определение генотипа важно с клинической точки зрения, поскольку такой признак способствует определению возможного ответа на лечение, основанное на комбинации интерферона-α с рибавирином, которое является в настоящее время наиболее используемым лечением. Фактически генотипы 1 и 4 менее чувствительны, чем генотипы 2, 3, 5 и 6, к лечению, основанному на интерфероне.
До сих пор не существует вакцин и иммунотерапевтических средств, для которых действительно доказана эффективность против вируса гепатита C. Высокая вариабельность антигенной структуры HCV до сих пор является помехой для разработки антител, способных нейтрализовать вирус, которые при этом обеспечивают перекрестную реактивность с различными генотипами вируса. Таким образом, существует потребность в антителах против HCV, которые обладают такими признаками и, таким образом, действительно обладают эффективностью при лечении и профилактике инфекций HCV.
Антитела, направленные против HCV, описаны в предшествующем уровне техники. Например, Burioni et al., Hepatology Vol. 28, n. 3, 1998, описывают клонирование и определение характеристик последовательностей, кодирующих пять фрагментов рекомбинантных антитела человека (Fab), обладающих специфичностью к гликопротеину E2 HCV (HCV E2), которые способны связываться с гликопротеинами различных генотипов вируса (перекрестная реактивность). Среди описанных в данной статье Fab представлен фрагмент антитела, обозначенный e20. Burioni et al., 1998, cit. пишут, что e20 обладает высокой минимальной активностью по нейтрализации связывания HCV E2 (NOB-активность). Однако несмотря на высокую NOB-активность в международной патентной заявке WO 03/064473 указано, что фрагмент антитела e20 не способен нейтрализовать вирусную инфекцию при высокой концентрации (80 мкг/мл) (в частности, см. WO 03/064473, стр. 16, строки 8-10).
К настоящему времени авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что вопреки установленному в известном уровне техники и, в частности, в WO 03/064473, фрагмент e20 способен эффективно нейтрализовать инфицирование различными генотипами HCV in vitro. Это делает e20 особенно подходящим для нейтрализации HCV и элиминации HCV-инфицированных клеток и для применения в качестве лекарственного средства для иммунотерапии и иммунопрофилактики инфекций HCV.
Для достижения такого результата потребовалась длительная и сложная экспериментальная работа, которая подробно описана в нижеследующем экспериментальном разделе.
В сумме экспериментальная работа, проведенная авторами настоящего изобретения, позволила показать, что фрагмент антитела e20 проявляет следующие неожиданные свойства:
- он образуется в ходе естественной инфекции штаммом HCV, относящимся к генотипу 1b, но способен связываться с гликопротеинами всех известных генотипов HCV (в частности, генотипов 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 и 6) и по существу обладает высокой перекрестной реактивностью;
- он обладает чрезвычайно высокой способностью к нейтрализации генотипов 1a, 1b, 2a и 4 HCV, которую измеряли с помощью анализа нейтрализации, основанного на псевдочастицах HCV (HCVpp);
- определенные аминокислотные остатки, необходимые для связывания e20 с гликопротеином E2 HCV, также важны для инфекции HCV, что подсказывает, что мутанты, способные уходить от связывания с e20, в то же самое время обладают сниженной способностью к репликации.
По-видимому, указанные выше признаки полезны в отношении использования фрагмента антитела e20 в качестве лекарственного средства для иммунотерапии и иммунопрофилактики инфекций HCV.
Таким образом, первой целью изобретения является моноклональное антитело или его фрагмент, способные связывать гликопротеин E2 HCV, полученный из нескольких различных генотипов HCV, выполняющие функцию лекарственного средства для терапевтического лечения или профилактики инфекций HCV, которые отличаются тем, что моноклональное антитело или его фрагмент содержат по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No: 1 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID No: 1, и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID No: 2.
Более предпочтительное процентное значение идентичности последовательностей составляет по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, где выражение «по меньшей мере» относится к каждому перечисленному процентному значению.
В одном из вариантов осуществления изобретения вариабельную область тяжелой цепи кодирует нуклеотидная последовательность SEQ ID No: 3, а вариабельную область легкой цепи кодирует SEQ ID No: 4.
Термин «антитело» предназначен для обозначения любого класса полноразмерного иммуноглобулина и любого его фрагмента, содержащего вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, такого как, например, Fab, F(ab')2, CDR (определяющая комплементарность область) или одноцепочечное антитело, содержащее вариабельную область как тяжелой, так и легкой цепи, или области CDR или каркас, содержащий одну или несколько копий фрагментов CDR из вариабельной области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. Он включает функциональные фрагменты антител, обозначаемые ScFv, диатела, VHH или выделенные легкие или тяжелые цепи. Кроме того, выражение «антитело» охватывает антитела, которые можно создать, используя последовательности вариабельной области фрагмента антитела e20 в процессе перетасовки для вариабельной области легкой цепи, для того, чтобы установить комбинации VH/VL с усовершенствованной аффинностью, стабильностью и/или свойствами рекомбинантного получения. Выражение «антитело» также включает полноразмерные иммуноглобулины любого типа или фрагменты иммуноглобулинов, слитые с обладающими специфичностью полноразмерными иммуноглобулинами или фрагментами иммуноглобулинов, которые могут нацелить фрагмент антитела e20 или иммуноглобулин на конкретные ткани, клетки или растворимые белковые структуры. Моноклональное антитело по изобретению предпочтительно представляет собой моноклональное антитело человека.
Антитело, использованное в изобретении, может находиться в свободной форме или в форме конъюгата. Антитело в форме конъюгата представляет собой антитело, как определено выше, конъюгированное с молекулой, которая способна модулировать персистентность in vivo, содействовать распределению в организме или ограничивать его, снижать чувствительность к протеолитическим средствам, снижать антигенность, повышать цитотоксическую способность и/или облегчать определение в жидкостях и тканях организма. Неограничивающие примеры молекул, подходящих для получения конъюгата, включают сывороточный альбумин человека, мальтоза-связывающий белок, глутатион-S-трансферазу, белки p3 или p8 оболочки фага, пептиды, сахара, ПЭГ или ПЭГ-подобные молекулы, токсины животного, растительного или микробиологического происхождения, цитокины, ферменты, хемилюминесцентные соединения, биолюминесцентные соединения, атомы металлов, радиоизотопы, флуоресцентные соединения, метящие группы или субстраты для фосфорилирования, гликозилирования, убиквитинилирования, сумоилирования или эндопротеолитического расщепления. Для того чтобы облегчить образование конъюгата, C-конец или N-конец антитела можно модифицировать, например, посредством вставки дополнительных аминокислотных остатков, например, одного или нескольких остатков цистеина, которые способны образовывать дисульфидные связи. Антитело, использованное в изобретении, также можно связать с эритроцитами человека или другими клеточными носителями, с конкретными составами или с системами с замедленным высвобождением, такими как, но без ограничения, липосомы, дендримеры, микросомы, наночастицы, микрокапсулы, вирусные векторы и т. п.
Другой целью изобретения является фармацевтическая композиция для терапевтического лечения или профилактики инфекций HCV, которая содержит фармацевтически эффективное количество моноклонального антитела или его фрагмента, как определено выше.
Композицию по изобретению можно вводить субъекту, инфицированному HCV или подверженному риску инфицирования HCV. Можно использовать любой подходящий путь введения, включая парентеральный, пероральный, окулярный, местный, локорегионарный путь, клизму или аэрозольное введение. Парентеральное введение включает внутримышечную инъекцию, внутривенную инъекцию, внутрилимфатическую инъекцию, подкожную или внутрикожную инъекцию и инфузию.
Композицию по изобретению можно получать в любой фармацевтической форме, которая подходит для выбранного пути введения, например, в форме инъецируемого раствора или суспензии, инфузии, таблетки, капсулы, крема, мази, лосьона или суппозитория.
Композиция по изобретению содержит антитело или его фрагмент, как определено выше, в качестве активного начала, а также подходящие фармацевтические эксципиенты, носители или разбавители, известные специалистам в данной области.
Дополнительной целью изобретения является антиидиотипическое антитело, способное специфически связываться с идиотипом антитела или его фрагмента, как определено выше. Антиидиотипическое антитело по изобретению можно получить стандартными способами для получения антиидиотипических антител, которые известны специалистам в данной области per se.
Дополнительно настоящее изобретение подробно описано в следующем экспериментальном разделе, который предоставлен исключительно в качестве иллюстрации со ссылкой на прилагаемые чертежи, где на фиг. 1 показано связывание e20 с гликопротеинами E2 HCV из различных генотипов. Данные приведены в виде процентных значений для положительных флуоресцентных клеток. На фиг. 2 показана нейтрализующая активность Fab e20 при использовании вирусных псевдочастиц, которые экспонируют гликопротеины E1-E2 генотипа 1a: UKN1A20.8 (a); E1E2 генотипа 1b: UKN1B5.23 (b); E1E2 генотипа 2a: UKN2A1.2 (c); E1E2 генотипа 2b: UKN2B1.1 (d); E1E2 генотипа 4: UKN4.21.16 (e). (f) Нейтрализующая активность Fab e20 в концентрации 15 мкг/мл при использовании вирусных псевдочастиц, которые экспонируют E1-E2 из различных генотипов (UKN1A20.8, UKN1B5.23, UKN2A1.2, UKN2B1.1; UKN3A13.6, UKN4.21.16, UKN5.15.11, UKN6.5.8).
На фиг. 3 показана нейтрализующая активность e20 и других антител против HCV (e137, AP33) при использовании системы HCVcc (генотип 2a). JFH-1 инфекционность в присутствии e20 и отрицательного контроля Fab (c33-3) показаны в виде количества вирусной РНК, нормализованного к РНК глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, как определяли посредством количественной ПЦР с обратной транскрипцией.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ
Стратегия клонирования
Получение случайных комбинаторных библиотек, представленных на поверхностях нитевидных фагов дает инструмент с широкими возможностями для отбора моноклональных антител человека с высокой аффинностью. Фактически процедура отбора, основанная на фаговом дисплее, является чрезвычайно гибкой, и ее можно оптимизировать с тем, чтобы отбирать антитела с перекрестной реактивностью. В частности, e20 клонировали в виде Fab фрагмента IgG1 B-лимфоцитарного репертуара женщины в возрасте 58 лет с персистирующей инфекцией штаммом HCV, относящимся к генотипу 1b. Для того чтобы отобрать клоны с перекрестной реактивностью, библиотеку, полученную от пациента, подвергали пэннингу с рекомбинантным гликопротеином E2 HCV, полученным из изолята вируса, принадлежащего к генотипу, отличному от 1a. В кратком изложении, при таком подходе можно получить антитела, образуемые в ходе естественной инфекции, которые к тому же одинаково способны связываться с различными гликопротеинами, с которыми никогда не сталкивалась иммунная система пациента, выбранного для исследования.
Исследование последовательностей тяжелой и легкой цепи
Секвенирование генов тяжелой и легкой цепи e20 и исследование их мутационных паттернов (таблица 1) показали, что это антитело получено в результате соматического мутационного процесса, который представляет собой процесс, вызванный в клоне антитела посредством непрерывного контакта с конкретным антигеном, для того, чтобы усовершенствовать аффинность самого антитела к антигену.
Что касается тяжелой цепи, e20 проявляет гомологию нуклеотидной последовательности с геном зародышевой линии ниже 85%. Мутационный паттерн показывает типичное распределение для соматически мутировавшего клона, со специфической поляризацией в определяющих комплементарность областях (CDR). Исследование соединительной области e20 (которая представляет собой соединительную область, которая дает начало CDR3) показывает, что она состоит из гена V, принадлежащего к подсемейству VH 1-69 (широко представленный ген в гуморальном ответе человека против HCV), ген D, принадлежащий к подсемейству D2-21, и ген JH, принадлежащий к подсемейству JH4.
Аналогичным образом легкая цепь e20 (изотип κ) проявляет процентное значение мутации, согласующееся с соматическим мутационным процессом, как показано посредством поляризации в CDR. Исследование соединительной области показывает, что CDR3 легкой цепи e20 происходит из соединения гена κV, принадлежащего подсемейству κV3-15, и гена κJ, принадлежащего подсемейству κJ5.
Данные о последовательностях позволяют сделать заключение о том, что e20 не является искусственным антителом, но напротив на самом деле присутствует в репертуаре антител пациента, выбранного для исследования.
Таблица 1
a)
Ген V Ген D Ген J Длина CDR3 % мутировавших нуклеотидов % мутировавших аминокислот Мутации R:S
FR CDR FR CDR FR CDR
V1-69 D2-21 J4 18 9,4 16,9 19 38 13:2 5:1
b)
Ген V Ген J Длина CDR3 % мутировавших нуклеотидов % мутировавших аминокислот Мутации R:S
FR CDR FR CDR FR CDR
KV3-15 KJ5 9 1,5 10,4 1,5 11,5 1:2 3:5
В приведенной выше таблице 1 показаны мутационные паттерны для зародышевых линий и гена V в тяжелой цепи a) и легкой цепи b) e20. Процентные значения мутаций аминокислот и нуклеотидов вычисляли в соответствии со способом выравнивания авторов Kabat и Wu с учетом FR1, FR2 и FR3 для легких и тяжелых цепей, CDR1 и CDR2 для тяжелых цепей и CDR1, CDR2 и CDR3 для легких цепей. Также приведено отношение заместительных мутаций (R) к молчащим мутациям (S).
Оценка связывания e20 с E2, полученными из различных генотипов HCV
Фрагмент e20 в форме Fab исследовали на способность к распознаванию гликопротеина E2 из генотипов HCV, отличных от 1b (т. е. от генотипа штамма, которым был инфицирован пациент, от которого получили e20) и 1a (т. е. от генотипа, использованного для клонирования Fab). Сложности, проявившиеся при получении растворимых форм E2 из различных генотипов HCV, потребовали использования альтернативного подхода, основанного на FACS.
В кратком изложении, эпителиальные клетки почки человека 293T (HEK) растили в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 5% заменимых аминокислот, 200 мМ глутамина, стрептомицина (100 мкг/мл) и пенициллина (100 Ед/мл). После достижения 80% конфлюентности 2×106 клеток HEK высевали в 10 см чашки и через 24 часа трансфицировали с использованием 3 мкг phCMV-7, экспрессирующего вектора, который кодирует гликопротеины E1E2 из различных генотипов HCV, используя протокол трансфекции с фосфатом кальция. Среду заменяли через 16 часов после трансфекции, а затем клетки инкубировали при температуре 37°C в течение 24 часов. Среду удаляли, монослой клеток дважды промывали в PBS. Добавляли 5 мл буфера для диссоциации и инкубировали клетки при температуре 37°C в течение 5 минут. Клетки промывали дважды в PBS и центрифугировали на скорости 1000 об/мин в течение 5 минут; в осадок, полученный из каждой чашки, добавляли 1,2 мл фиксирующего реактива. Клетки инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Образцы промывали в 5 мл PBS с добавлением 2% фетальной телячьей сыворотки (FPBS), затем центрифугировали на скорости 1000 об/мин в течение 5 минут.
В осадок добавляли 100 мкл пермеабилизирующего реактива с 50 мкл Fab e20 в конечной концентрации 10 мкг/мл. Аналогичный протокол повторяли для нетрансфицированных клеток, которые использовали в качестве контроля. После инкубации в течение 40 минут при комнатной температуре образцы промывали в 5 мл FPBS и добавляли в осадок 50 мкл ФИТЦ-конъюгированного вторичного антитела. Клетки инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре и промывали дважды в 5 мл FPBS. Наконец, супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 300 мкл FPBS и проводили анализ клеток с помощью FACS. Связывающую активность выражали в виде процентного значения положительных флуоресцентных клеток, полученного из процентного значения клеток, обладающих более высоким уровнем флуоресценции, чем клетки без Fab e20. В каждый эксперимент включали рекомбинантный Fab человека (c33-3), обладающий специфичностью к неструктурному антигену HCV (NS3) в качестве отрицательного контроля.
Этот подход показал, что Fab e20 способен распознавать экспрессируемые E2 HCV из всех генотипов (1a; 1b; 2a; 2b; 3; 4; 5; 6) при более высоком процентном значении флуоресцентных клеток, чем тот, что получен при использовании контрольного Fab. Результаты приведены на фиг. 1.
Оценка связывания e20 с гликопротеинами E2 из HCV 1a, мутировавшими в CD81-связывающих областях
Fab e20 также тестировали на панели E1E2, полученных из H77 (генотип 1a), которые мутировали в консервативных областях, которые, как описано, играют ключевую роль в связывании CD81 и в инфекционности псевдочастиц HCV (HCVpp). Каждое консервативное положение в этой области мутировали в аланин. Все эти замены привели к потере инфекционности в описанном ниже анализе HCVpp. Связывание Fab e20 с гликопротеином E2 HCV устраняли посредством некоторых из этих ключевых мутаций (таблица 2).
Данные, описанные в таблице 2, указывают на то, что e20 связывается с областью E2, необходимой для вирусной инфекции. Эти данные также подтверждают, что e20 связывается с областью, критичной для связывания AP33, нейтрализующим антителом против HCV с большей перекрестной реактивностью, но менее подходящим в качестве шаблона для конструирования вакцинного лекарственного средства и для использования в качестве иммунотерапевтического средства, принимая во внимание, что иммунотерапия гетерологичными антителами не оправдана и что присутствие похожих антител в репертуаре человека встречается чрезвычайно редко (Tarr et al. J Gen Virol. 88:2991. 2007). Еще более примечательно, что данный анализ ясно показал, что все мутанты, которые не распознавал e20, не допускают инфекцию клеток-мишеней в псевдовирусной модели.
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
В приведенной выше таблице 2 показано связывание e20 с E1E2, полученными из мутантов H77 (генотип 1a). Связывающая активность выражена в виде процентного значения от того, что измерено для белка H77 дикого типа.
Оценка нейтрализующей активности e20 на псевдочастицах HCV, полученных из различных генотипов
Затем подтверждали нейтрализующую активность Fab e20 в анализе нейтрализации, основанном на псевдочастицах HCV (HCVpp).
В кратком изложении эпителиальные клетки почки человека 293T (HEK) и клетки гепатомы человека Huh-7 растили в DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 5% заменимых аминокислот, 200 мМ глутамина, стрептомицина (100 мкг/мл) и пенициллина (100 Ед/мл). После достижения 80% конфлюентности 2×106 клеток HEK высевали в 10 см чашки и через 24 часа совместно трансфицировали с использованием 8 мкг вектора вируса лейкемии мыши (MLV) Gag-Pol, 8 мкг MLV вектора для переноса, который кодирует люциферазу, и 3 мкг полноразмерного экспрессирующего вектора phCMV-7a, который кодирует гликопротеины E1E2 из различных генотипов HCV. Днем позже среду для трансфекции заменяли на 5 мл свежей среды, содержащей 10 мМ HEPES. Клетки инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°C. Клетки-мишени (Huh-7) высевали в 24-луночные планшеты в количестве 2,5×104 на лунку и инкубировали в течение ночи при температуре 37°C. Псевдочастицы HCV (HCVpp) собирали через 24 часа после замены среды, центрифугировали на скорости 2000 об/мин в течение 10 минут и фильтровали через мембраны с размером пор 0,45 мкм и использовали в анализе нейтрализации.
В частности, 60 мкл содержащей HCVpp среды смешивали с 90 мкл Fab e20 с другими концентрациями и инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°C. Такую смесь добавляли в клетки-мишени Huh-7 и клетки инкубировали в течение 3 часов при температуре 37°C. В конце удаляли инокулят, в каждую лунку добавляли 1 мл свежей среды и клетки инкубировали при температуре 37°C в течение 4 дней. Клетки промывали дважды в PBS и затем лизировали с использованием 100 мкл лизисного буфера (Promega), по инструкциям производителя. Клеточный лизат переносили в 96-луночные планшеты и в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата/буфера (Promega). Инфекцию клеток анализировали посредством измерения люминесцентной активности (считыватель планшетов Chameleon, Hidex), которая приведена в относительных световых единицах (ОСЕ). Нейтрализующую активность определяли в виде процентного значения инфекции посредством сравнения полученной люминесценции с тем, что определяли в лунках с HCVpp в отсутствие антител, способных к конкуренции (отр.). В каждый эксперимент в качестве отрицательного контроля включали рекомбинантный Fab человека (c33-3) со специфичностью к неструктурному антигену HCV (NS3).
Этот подход показал, что e20 способен резко нейтрализовать генотипы HCV 1a и 4. e20 проявляет 50% нейтрализующую активность в отношении генотипа 1a в концентрации 7,5 мкг/мл и 75% ингибирование в отношении генотипа 4 в концентрации 15 мкг/мл (фиг. 2a, 2e и 2f). Однако это антитело также способно резко нейтрализовать генотипы HCV 1b и 2a. Более подробно, в концентрации 15 мкг/мл e20 показывает 40% нейтрализацию и 75% инфекционность в отношении генотипов 1b и 2a соответственно (фиг. 2b, 2c и 2f). Наконец, e20 способен нейтрализовать в меньшей степени HCVpp, содержащие гликопротеины E1E2 генотипа 2b, проявляя 20% ингибирование в концентрации 15 мкг/мл (фиг. 2d и 2f).
Нейтрализующая активность e20 в отношении штамма HCV, выращенного в культуре клеток (генотип 2a, штамм JFH1)
Также тестировали нейтрализующую активность e20 в отношении HCV, используя модельную систему HCVcc (HCV культура клеток), посредством использования стабильной клеточной линии гепатомы человека, которая содержит кДНК, встроенную в хромосому, из HCV генотипа 2a (JFH1) и высоко продуцирующих контагиозных вирусов (фиг. 3). Такая система позволяет оценить нейтрализующую активность посредством использования контагиозного штамма вируса гепатита C. В этой группе экспериментов Fab e20 в различных концентрациях инкубировали со средой, содержащей вирус, созданный в анализе HCVcc. Через 3 часа смесь добавляли к клеткам-мишеням (Huh7.5). Инфекционность оценивали посредством измерения уровней плюс-цепей РНК HCV. Fab e20 показал сильную нейтрализующую активность, поскольку в концентрации 1 мкг/мл, которая является очень низкой, он способен полностью устранять инфекционность HCV генотипа 2a. Нейтрализующая активность Fab e20 сравнима с моноклональным антителом IgG AP33 мыши, одним из наиболее сильных нейтрализующих антител с перекрестной реактивностью, описанных на сегодняшний день.

Claims (6)

1. Применение моноклонального антитела или его фрагмента, способного связываться с гликопротеином Е2 HCV из генотипов 1а, 1b, 2а, 2b или 4, для нейтрализации HCV инфекции, где моноклональное антитело или его фрагмент содержат по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No: 1, и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2.
2. Применение по п.1, где моноклональное антитело или его фрагмент представляют собой полноразмерный иммуноглобулин или фрагмент иммуноглобулина, содержащий по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и одну вариабельную область легкой цепи.
3. Применение по п.1, где фрагмент выбран из Fab, F(ab′)2 или одноцепочечного антитела, содержащего вариабельные области как тяжелой, так и легкой цепи.
4. Применение по п.1, где моноклональное антитело или его фрагмент находятся в свободной форме.
5. Применение по п.1, где моноклональное антитело или его фрагмент конъюгировано с молекулой, способной модулировать персистенцию in vivo, содействовать распределению в организме или ограничивать его, снижать чувствительность к протеолитическим средствам, снижать антигенность, повышать цитотоксическую способность и/или облегчать определение в жидкостях и тканях организма.
6. Применение по п.1, где моноклональное антитело или его фрагмент слито со специфическим полноразмерным иммуноглобулином или фрагментом иммуноглобулина, который способен нацеливать антитело на конкретные ткани, клетки или растворимые белковые структуры.
RU2011130522/10A 2008-12-22 2009-12-21 Моноклональное антитело против hcv в качестве лекарственного средства для терапевтического лечения и профилактики инфекций hcv RU2596409C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITTO2008A000964 2008-12-22
IT000964A ITTO20080964A1 (it) 2008-12-22 2008-12-22 Anticorpo monoclonale anti-hcv come medicamento per il trattamento terapeutico e la prevenzione di infezioni da hcv
PCT/IB2009/055867 WO2010073204A1 (en) 2008-12-22 2009-12-21 Anti-hcv monoclonal antibody as a medicament for the therapeutic treatment and prevention of hcv infections

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011130522A RU2011130522A (ru) 2013-01-27
RU2596409C2 true RU2596409C2 (ru) 2016-09-10

Family

ID=40848278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011130522/10A RU2596409C2 (ru) 2008-12-22 2009-12-21 Моноклональное антитело против hcv в качестве лекарственного средства для терапевтического лечения и профилактики инфекций hcv

Country Status (11)

Country Link
US (1) US8623363B2 (ru)
EP (1) EP2376119B1 (ru)
JP (1) JP2012513457A (ru)
KR (1) KR101450955B1 (ru)
CN (1) CN102264393B (ru)
BR (1) BRPI0923569B1 (ru)
ES (1) ES2541323T3 (ru)
IT (1) ITTO20080964A1 (ru)
MX (1) MX2011006722A (ru)
RU (1) RU2596409C2 (ru)
WO (1) WO2010073204A1 (ru)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITTO20080204A1 (it) 2008-03-17 2009-09-18 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali atti a reagire con una pluralita di sottotipi del virus influenzale a
ITTO20080398A1 (it) 2008-05-27 2009-11-28 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali aventi proprieta' di cross-neutralizzazione omosubtipica per virus influenzali di tipo a sottotipo h1
IT1395961B1 (it) 2009-06-01 2012-11-02 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali come medicamento per il trattamento terapeutico e/o profilattico delle infezioni da virus influenzale a (h1n1) di origine suina (s-oiv)
JP6158171B2 (ja) * 2011-05-02 2017-07-05 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ 合成c型肝炎ゲノム、並びに、その製造方法及びその使用
JP2014523878A (ja) * 2011-06-14 2014-09-18 グローブイミューン,インコーポレイテッド D型肝炎ウイルス感染の治療又は予防のための酵母ベースの組成物及び方法
CN104974246A (zh) * 2014-04-01 2015-10-14 中国科学院上海巴斯德研究所 一种中和丙型肝炎病毒的全人单克隆抗体及其用途
GB201415714D0 (en) * 2014-09-05 2014-10-22 Medical Res Council Antibodies and antigen binding fragments thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003064473A2 (en) * 2002-01-30 2003-08-07 Roberto Burioni Human monoclonal antibody fab fragments directed against hcv e2 glycoprotein and endowed with in vitro neutralizing activity

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA836080B (en) 1982-08-23 1984-04-25 Scripps Clinic Res Broad spectrum influenza antisera
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US6812024B2 (en) 1987-03-16 2004-11-02 Mcgready Roland Keith Anti-paratopic antibody as an immunogen
US5245015A (en) * 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
WO1992015885A1 (en) 1991-03-11 1992-09-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods for selecting antibody reagents; anti-idiotype antibodies; and aids vaccine formulations
ATE255902T1 (de) 1992-03-09 2003-12-15 San Diego Regional Cancer Ct Ein anti-idiotypischer antikörper und seine verwendung in der diagnose und therapie von hiv- verwandten krankheiten
EP0621339B1 (en) 1992-09-17 2001-10-24 Takara Shuzo Co. Ltd. Immunogenic human influenza A virus haemagglutinin polypeptides
JP2996864B2 (ja) 1994-03-30 2000-01-11 寳酒造株式会社 抗体可変領域dna
US6057421A (en) 1994-11-30 2000-05-02 Immpheron, Inc. Variable heavy and light chain regions of murine monoclonal antibody 1F7
WO2002055560A2 (en) * 2000-12-01 2002-07-18 The Gouvernment Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies specific for the e2 glycoprotein of hepatitis c virus and their use in the diagnosis, treatment, and prevention of hepatitis c
FR2817869B1 (fr) 2000-12-07 2005-01-14 Technopharm Anticorps monoclonal humain dirige contre le virus influenza ou un fragment de celui-ci
US6768004B2 (en) 2001-01-11 2004-07-27 Mueller Sybille Nucleotide sequences encoding variable regions of heavy and light chains of monoclonal antibody 1F7, an anti-idiotypic antibody reactive with anti-HIV antibodies
US6964199B2 (en) * 2001-11-02 2005-11-15 Cantocor, Inc. Methods and compositions for enhanced protein expression and/or growth of cultured cells using co-transcription of a Bcl2 encoding nucleic acid
JP4495969B2 (ja) 2002-01-17 2010-07-07 ポリマン サイエンティフィック イミューンバイオロジッシュ フォーシュング ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ファフツング Hiv−1中和抗体を誘導する抗イディオタイプ抗体
US20080014205A1 (en) 2006-05-15 2008-01-17 Lawrence Horowitz Neutralizing Antibodies to Influenza Viruses
AU2007295073A1 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza antibodies, compositions, and related methods
AU2008300516A1 (en) 2007-09-20 2009-03-26 Bracco Imaging Spa Method for the preparation of new oligoclonal antibodies
ITTO20080204A1 (it) 2008-03-17 2009-09-18 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali atti a reagire con una pluralita di sottotipi del virus influenzale a
ITTO20080398A1 (it) 2008-05-27 2009-11-28 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali aventi proprieta' di cross-neutralizzazione omosubtipica per virus influenzali di tipo a sottotipo h1
EP2552485B1 (en) 2010-03-26 2017-03-08 Pomona Ricerca S.r.l. Full-length immunoglobulins of the igg isotype capable of recognizing a heterosubtype neutralizing epitope on the hemagglutinin stem region and their use as anti-influenza medicament

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003064473A2 (en) * 2002-01-30 2003-08-07 Roberto Burioni Human monoclonal antibody fab fragments directed against hcv e2 glycoprotein and endowed with in vitro neutralizing activity

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BURIONI R. et al., "Cross-reactive pseudovirus-neutralizing anti-envelope antibodies coexist with antibodies devoid of such activity in persistent hepatitis C virus infection", Virology, 2004, 327(2): 242-248. BUGLI F. et al., "Mapping B-cell epitopes of hepatitis C virus E2 glycoprotein using human monoclonal antibodies from phage display libraries", Journal of virology, 2001, 75(20): 9986-9990. BURIONI R. et al., "Nonneutralizing human antibody fragments against hepatitis C virus E2 glycoprotein modulate neutralization of binding activity of human recombinant Fabs", Virology, 2001, 288(1): 29-35. BURIONI R. et al., "Diverging effects of human recombinant anti-hepatitis C virus (HCV) antibody fragments derived from a single patient on the infectivity of a vesicular stomatitis virus/HCV pseudotype." Journal of virology, 2002, 76(22): 11775-11779. BURIONI R. et al., "Dissection of human humoral immune response against hepatitis C virus E2 glycoprotein by repertoire cloning and generatio *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012513457A (ja) 2012-06-14
KR20110096591A (ko) 2011-08-30
WO2010073204A1 (en) 2010-07-01
US8623363B2 (en) 2014-01-07
BRPI0923569A2 (pt) 2016-01-26
EP2376119A1 (en) 2011-10-19
US20110256140A1 (en) 2011-10-20
RU2011130522A (ru) 2013-01-27
KR101450955B1 (ko) 2014-10-15
CN102264393A (zh) 2011-11-30
ITTO20080964A1 (it) 2010-06-23
ES2541323T3 (es) 2015-07-17
CN102264393B (zh) 2013-09-11
BRPI0923569B1 (pt) 2021-09-21
EP2376119B1 (en) 2015-04-22
MX2011006722A (es) 2011-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6022515B2 (ja) 抗a型インフルエンザウイルス中和抗体およびその使用
RU2596409C2 (ru) Моноклональное антитело против hcv в качестве лекарственного средства для терапевтического лечения и профилактики инфекций hcv
CA2776249C (en) Rsv-specific binding molecule
Tarr et al. An alpaca nanobody inhibits hepatitis C virus entry and cell‐to‐cell transmission
JP6462599B2 (ja) Rsv融合タンパク質のエピトープ及びそのエピトープを認識する抗体
JP5475774B2 (ja) ヒトサイトメガロウイルス中和抗体およびその使用
CN106519034A (zh) 抗pd‑1抗体及其用途
US20140322204A1 (en) Treatment and prevention of viral infections
BRPI0914012A2 (pt) anticorpo humano, composição farmacêutica, molécula de ácido nucléico, célula, clone de célula b imortalizado, polipeptídeo imunogênico isolado ou purificado, método de inibição da infecção pelo vírus da dengue. método de tratamento da infecção pelo vírus da dengue, método de triagem de polipeptídeos, método monitoramento da qualidade das vascinas contra o vírus da dengue, vacina, uso do anticorpo e epítopo
JP2019516348A (ja) 重症熱性血小板減少症候群ウイルスの外膜糖タンパク質に結合する抗体及びその用途
JP2023018064A (ja) 抗fam19a5抗体及びその用途
KR20020091093A (ko) 씨형간염 치료제
JP2005510201A (ja) Hiv−1に対する中和ヒトモノクローナル抗体、それらの産生および使用
JP2014526886A (ja) マクロファージ遊走阻止因子(mif)とd−ドーパクロームトートメラーゼ(d−dt)に交差反応性がある抗体
CN106749645B (zh) 一种全人源抗丙型肝炎病毒的中和抗体
TW201620931A (zh) 具有抗c型肝炎病毒的感染抑制活性的抗體
CN107286237B (zh) 一种抗丙型肝炎病毒抗体的获取以及应用
US20170313764A1 (en) Hepatitis c virus specific antibody
KR20220012297A (ko) 항-b형 간염 바이러스 항체 및 이의 용도
AU2012254920A1 (en) Improvements in or relating to treatment and prevention of viral infections
JP2013230152A (ja) ウイルス感染の治療及び予防又は治療及び予防の改善
WO2014065822A1 (en) Hepatitis c virus neutralizing epitopes, antibodies, and methods

Legal Events

Date Code Title Description
FA94 Acknowledgement of application withdrawn (non-payment of fees)

Effective date: 20160315

FZ9A Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal)

Effective date: 20160413