JP6158171B2 - 合成ｃ型肝炎ゲノム、並びに、その製造方法及びその使用 - Google Patents

Description

［関連出願の相互参照］
本願は、２０１１年５月２日に出願の米国仮特許出願第６１／４８１，４５７号からの利益を主張するものである。斯かる米国仮特許出願は、あらゆる目的において、参照することにより本明細書に援用されて、本明細書で十分に説明したものとされる。

［政府権益の声明］
本発明は、助成番号．ＲＯ１ ＤＡ ０２４５６５の下で、米国政府による援助を受けてなされたものである。米国政府は、本発明に対して特定の権利を有する。

ＨＣＶは、小型エンベロープ型のフラビウィルス科ファミリーウィルスで、９．６ｋｂの単鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムであり、ＲＮＡゲノムは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ウィルス特異的蛋白を符号化するオープン・リーディング・フレームと、３’ＵＴＲとからなる。５‘ＵＴＲは、約３０００アミノ酸のポリプロテイン単鎖の翻訳に媒介する、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有する。ポリプロテインは、構造蛋白（コア、Ｅ１及びＥ２）をＮ末端に配置し、続いてｐ７や非構造蛋白（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂ）が残部に符号化されて、構成される。

効果的なＨＣＶワクチンへの認識されたニーズが存在する一方、抗原に用いるウィルス株の選択は任意となっている。ヒトとチンパンジーにおける研究で、宿主免疫システムがＨＣＶに対する効果的な応答を開始させることができると判明し、本効果は、潜在的に宿主の遺伝子に起因する可能性があるが、一度感染を除去したヒトでは、再びその反応が生じると思われる。ＨＣＶの遺伝的多様性は、ＨＩＶの多様性より広範であり、効果的なワクチン開発に対して多大な挑戦を課している。ワクチン候補としての適切な株の選択は重要である。なぜなら、１残基アミノ酸の置換であっても、そのエピトープに特異的なＴ細胞による認識が排除されて、ワクチン効果を低減し得るからである。ＨＩＶ−１においては、ワクチン候補として、祖先配列又は共通配列の使用が提案されている。モザイクアプローチ（個々エピトープの多様な変異配列を包含）により、共通配列と比べて、ＨＩＶ−１エピトープに反応する、より活性化されたＴ細胞を得た。モザイク候補は、近年、ＨＣＶ用にも特定されつつあるが、それらの効果は未だ不明である。

Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）は、世界中では約１億７千万人を侵す。急性Ｃ型肝炎患者の約２０−２５％は、ウィルスを自発的に排除するが、急性Ｃ型肝炎患者の７５〜８０％は慢性感染症を患う。慢性Ｃ型肝炎患者の約２０％は肝硬変を患い、慢性Ｃ型肝炎患者の４％は肝細胞がんを患い、慢性Ｃ型肝炎患者の６％が末期肝臓病を患う。利用可能なＨＣＶワクチンはなく、また、通常用いられるインターフェロンに基づく治療は、毒性があり、長期にわたり、高価であり、成功しない場合もあり、そして、病態が最も進行した場合に効果がない。

このように、ＨＣＶや関連ウィルスに対する、抗原、抗体、そしてワクチンを調製するためのより効果的な手段を実現する、まだ満たされていないニーズが、未だなお存在する。

本発明は、一実施形態に従い、合成Ｃ型肝炎ウィルスサブタイプ１ａ（Ｂｏｌｅ１ａ）のゲノムを符号化する核酸分子を提供し、該核酸分子は、配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の核酸配列、又はそれらの相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む。

本発明は、他の実施形態に従い、単離された核酸分子を提供し、該核酸分子は、配列番号１に示されたヌクレオチド配列あるいはそれらの相補鎖に特異的にハイブリダイズする。

本発明は、さらに他の実施形態に従い、ＰＣＲ用の一対のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し、第一のプライマーが、配列番号１に示されたヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする長さが約１０から約３０のヌクレオチドである単離された核酸分子であり、第二のプライマーが、配列番号１に示されたヌクレオチド配列の相補鎖に特異的にハイブリダイズする長さが約１０から約３０のヌクレオチドである単離された核酸分子である。

本発明は、さらに他の実施形態に従い、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸によって符号化された、単離されたポリペプチドを提供する。

本発明は、さらに他の実施形態に従い、配列番号２のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。

本発明は、一実施形態に従い、ウィルス粒子を提供し、該ウィルス粒子は、ａ）配列番号１のコア配列の最後の２７アミノ酸とそれに続くＥ１領域及びＥ２領域のアミノ酸配列と、ｂ）レポーターエレメントと、を含む。

本発明は、他の実施形態に従い、ＨＣＶ抗原を提供し、該ＨＣＶ抗原は、配列番号１に示されたヌクレオチド配列の１５〜１００の連続したアミノ酸を符号化するポリヌクレオチド分子を含む。

本発明は、他の実施形態に従い、抗体若しくはその抗原結合部位を提供し、該抗体若しくはその抗原結合部位は、配列番号１に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子に特異的に結合する。

本発明は、さらに他の実施形態に従い、試料中のＨＣＶの存在を調べるための試料の試験方法を提供し、該方法は、上述の抗体と特異的に結合する試料中のポリペプチドの存在を検出することを含む。

本発明は、一実施形態に従い、ＨＣＶに感染した対象を治療する方法を提供し、該方法は、前記対象に、上述の抗原を含有する医薬組成物を投与することを含み、該投与は、抗原に対する免疫応答を刺激するのに十分な量で対象に投与するもので、その結果、免疫応答が、対象内におけるＨＣＶウィルス量を低減するのに十分となる。

図１は、近接結合樹を表し、該近接結合樹は、ａ）Ｂｏｌｅ１ａとＹｕｓｉｍデータセットと、ｂ）Ｂｏｌｅ１ａとＥ１Ｅ２データセットとを示す。Ｂｏｌｅ１ａ配列は、両図において太文字で示す。 図２（ａ）は、多様性プロットであり、該多様性プロットは、サブタイプ１ａ配列（「ｓｕｂｔｙｐｅ １ａ」）間での非同義（ｄＮ）と同義（ｄＳ）多様性のペアワイズ平均を、Ｂｏｌｅ１ａ配列とサブタイプ１ａ配列との間の平均ペアワイズ距離と比較し、該比較では、２０コドンのスライドウィンドウサイズを用いている。この比較のために、３９０の全ゲノム配列のオリジナルデータセットを、ポリプロテインの参照配列の元データとした。図２（ｂ）は、Ｅ１Ｅ２のアラインメント比較を示し、この比較では、レファレンス配列としてのＢｏｌｅ１ａ配列、並びに、共通配列（３９０配列の）、Ｈ７７配列、ＨＣＶ−１配列及び１ｂ（Ｄ９０２０８）配列を用いる。垂直棒は、Ｂｏｌｅ１ａと比較して、各配列でアミノ酸違いがある位置を示し、アスタリスクは、ＨＶＲ１の位置を示す。 図３（ａ）では、Ｂｏｌｅ１ａ（アスタリスクで示す）は、代表性が高いことを示しており、それは、９残基アミノ酸の被覆様式（最も共通に観察される）の（ａ）カバー度に基づいており、Ｂｏｌｅ１ａとＹｕｓｉｍデータセット中のあらゆる他の配列によって提供されたデータによる。図３（ｂ）は、既知エピトープとの同一性をヒストグラムで示し、該ヒストグラムは、既知且つ共通の３３８個のＴ細胞エピトープと同じ配列のエピトープ配列のパーセントで示す。 図４は、様々なＨＣＶｐｐの感染力をｌｏｇ_１０（ＲＬＵ）で示す。黒の点線は、感染性ＨＣＶｐｐのＲＬＵ閾値を示す。左の群におけるバーは、それぞれ、培養液のみでのＢｏｌｅ１ａの平均感染力、抗ＣＤ８１添加でのＢｏｌｅ１ａの平均感染力、アイソタイプコントロール添加でのＢｏｌｅ１ａの平均感染力を示す。中央の群におけるバーは、それぞれ、培養液のみでのＨ７７の平均感染力、抗ＣＤ８１添加でのＨ７７の平均感染力、アイソタイプコントロール添加でのＨ７７の平均感染力を示す。エラーバーは、３回の実験から計算した標準偏差である。右の２つのバーは、全てのサブタイプ１ａＨＣＶｐｐの平均感染力を示し、感染性（線フレーム）と、非感染性（破線フレーム）である。エラーバーは、感染力の標準偏差を示す。

本発明は、合成ＨＣＶサブタイプ１ａゲノム（Ｂｏｌｅ１ａ）を提供するものであり、該ゲノム（Ｂｏｌｅ１ａ）は、ワクチンの研究及び開発、抗原製造、抗体製造、診断テスト、オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブ製造、並びにその他の使用に有用である。

本発明は、一以上の実施形態に従い、合成サブタイプ１ａＨＣＶウィルスゲノムを提供し、結果的に計算的に生成されたゲノムは、広く伝播している株の代表的なものであり、インビトロでの肝細胞がん細胞への進入に媒介する機能的なエンベロープ遺伝子を有し、ジェンバンクの如何なる他のサブタイプ１ａ配列よりもＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープにより適合するものであり、該適合の評価は、あらゆる９残基アミノ酸、又は、あらゆる既知の共通エピトープとの比較による。

本発明は、一実施形態に従い、合成Ｃ型肝炎ウィルスサブタイプ１ａ（Ｂｏｌｅ１ａ）のゲノムを符号化（エンコード）する核酸分子を提供し、該核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列、又はその相補鎖を含む。

本明細書で用いる「ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ」（核酸）は、「ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」（ポリヌクレオチド）、「ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」（オリゴヌクレオチド）、及び「ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ」（核酸分子）を含み、一般的にはＤＮＡやＲＮＡのポリマーを意味する。該ＤＮＡやＲＮＡは、単鎖でも二重鎖でもよく、合成物であっても自然資源から得たもの（例えば、単離及び／又は精製されたもの）でもよく、それらは、天然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチドを含んでよく、それらは、天然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチド間結合を含んでもよい。該改変されたヌクレオチド間結合には、非修飾のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間で形成されるホスフォジエステルに代えての、ホスフォロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）結合又はフォスフォロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合がある。核酸は、一般的には、如何なる挿入、欠質、反転、及び／又は置換も含まないことが好適である。しかしながら、本明細書で記載のとおり、いくつかの例においては、核酸は、１以上の挿入、欠質、反転、及び／又は置換を含むことが適し得る。

本発明の核酸は、一実施形態において、リコンビナントである。本明細書で用いた、用語「ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ」（リコンビナント）は、（ｉ）自然もしくは合成の核酸断片を、生きた細胞内で複製可能な核酸分子へ結合することによって、生きた細胞の外で再構成された分子、又は、（ｉｉ）前記（ｉ）で上述の分子の複製物からの結果物の分子を指す。本明細書での目的では、複製物は、インビトロでの複製物、又は、インビボでの複製物であり得る。

核酸は、先行技術として知られる手順により、化学合成及び／又は酵素的結合反応で構築できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１）と、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ， ＮＹ （１９９４）、を参照。例えば、核酸は自然に存在するヌクレオチドを用いて化学合成することもできるし、分子の生物学的な安定性を向上させたり、ハイブリダイズ形成での２本鎖の物理的な安定性を向上させたりする目的で設計される、種々の修飾をしたヌクレオチド（例えば、ホスフォロチオエート誘導体やアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて、化学合成をすることも出来る。核酸を生成するのに用いる修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−イオドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルラミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルラミノメチルウラシル，ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケウオシン、イノシン、Ｎ^６−イソペンテニルアデノシン、１-メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ^６−置換されたアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノーシルケウオシン、５´−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ^６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケウオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６−ジアミノプリンを挙げることが出来るがこれらに限定されるものではない。あるいは、本願の核酸の１以上を、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ （Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ， ＣＯ）やＳｙｎｔｈｅｇｅｎ （Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ）のような企業から購入することも出来る。

核酸は、Ｂｏｌｅ１ａポリペプチド、蛋白、又は、それらの断片、機能部位、機能的な変異体のいずれかを符号化するヌクレオチド配列を含む。例えば、核酸は、配列番号１を含むヌクレオチド配列を含み得、あるいは、配列番号１の縮重したヌクレオチド配列を含みうる。

本発明は、さらに、単離もしくは精製された核酸を提供し、該核酸は、本明細書に記載のいずれかの核酸のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は、本明細書に記載のいずれかの核酸のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズされるヌクレオチド配列を含む。本発明は、一実施形態において、配列番号１の全長ヌクレオチド配列に相補的な核酸分子を提供する。

本明細書で定義したように、Ｂｏｌｅ１ａのポリペプチドもしくは蛋白の機能的部位もしくは機能的な多型としては、例えば、コア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５のいずれも、及びそれらのサブユニット、ＵＴＲ抗原蛋白、そしてそれらの断片を含む。

一実施形態において、単離された核酸分子が、配列番号１の近接する核酸配列と、例えば少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％若しくは９０％又はそれ以上で同等なヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列を含む。

ストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、好適には高ストリンジェンシーな条件でハイブリダイズする。「ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」（高ストリンジェンシーな条件）とは、ヌクレオチド配列が、標的配列（本明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれかのヌクレオチド配列）に、非特異的なハイブリダイゼーションより強く検出される程度で特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシーな条件は、正確な相補配列をもったポリヌクレオチドもしくは散在する不適正塩基がほんのわずかである配列を、ヌクレオチド配列に対応する配列が非常に小さな領域（例えば３〜１０塩基）しか有さないようなランダム配列から、区別しうる条件をいう。該相補性の小さな領域は、１４−１７塩基若しくはそれより多くの塩基をもった完全相補鎖より、容易に解離される。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、これらを容易に判別できる。比較的高いストリンジェンシー条件とは、例えば、およそ５０−７０℃でのＮａＣｌ 濃度が０．０２−０．１Ｍもしくは等張である様な、低塩、及び／又は高温の条件を含みうる。

本発明の核酸は、リコンビナント発現ベクターへ組み入れられうる。この観点から、本発明は、本発明の核酸のいずれかを含むリコンビナント発現ベクターを提供する。本明細書の目的によれば、用語「ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ」（リコンビナント発現ベクター）は、遺伝的に修飾されたオリゴヌクレオチド、宿主細胞によってｍＲＮＡ、蛋白、ポリペプチド、又はペプチドの発現を許容する、ポリヌクレオチドコンストラクトを意味するものであり、前記コンストラクトは、ｍＲＮＡ、蛋白、ポリペプチド、又はペプチドを符号化するヌクレオチド配列を含み、前記ベクターは、細胞内で十分にｍＲＮＡや蛋白、ポリペプチド、又はペプチドを発現する程度で細胞に導入されている。本願のベクターは、全体として、自然に発生するものではない。しかしながら、ベクターの一部は、自然に発生しうる。本願リコンビナント発現ベクターは、あらゆる種類のヌクレオチドを含むことができ、ＤＮＡやＲＮＡを含むが、これらに限定されるものではない。該ＤＮＡやＲＮＡは、単鎖であったり二重鎖であったり、合成されたものであったり、一部が自然物からえられるものであったり、そして、自然の、非自然の若しくは修飾されたヌクレオチドを含みうる。リコンビナント発現ベクターは、自然的発生、非自然的発生のヌクレオチド間結合、もしくは両種類の結合を含みうる。好適には、非自然発生、もしくは修飾ヌクレオチド、もしくはヌクレオチド間結合は、転写を阻害せず、あるいはベクターの複製を阻害しない。

本願のリコンビナント発現ベクターは、任意の適したリコンビナント発現ベクターであって、任意の適した宿主を形質転換あるいは遺伝子導入するのに用いられうる。適したベクターとしては、繁殖・増殖のため、もしくは発現のため、又は双方のために、設計されたものを含み、プラスミドやウィルスのようなものがある。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ， ＬａＪｏｌｌａ， ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、ｐＧＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）からなる群から選択されうる。バクテリオファージベクター、例えば、λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐII（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、そしてλＮＭ１１４９も使用されうる。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１、そしてｐＢＩＮ１９ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）を含む。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭｎｅｏ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。好適には、リコンビナント発現ベクターは、ウィルスベクター、例えばレンチウィルスベクターのようなレトロウィルスベクターが好適である。

本発明のリコンビナント発現ベクターは、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａやＡｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａに記載されている標準的なリコンビナントＤＮＡ技術を用いて調製されうる。発現ベクターの構築は、環状又は線状で、原核生物又は真核生物の宿主細胞内で機能する複製システムを含むように調製されうる。複製システムは、例えばＣｏｌＥｌ、２μｐｌａｓｍｉｄ、λ、ＳＶ４０、ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ、ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ、そして同様のものを由来としうる。

望ましくは、リコンビナント発現ベクターは、転写又は翻訳の開始コドンや終止コドンのような制御性の配列を含み、それらは、ベクターが導入される宿主（例えば、バクテリア、真菌、植物又は動物）に特異的であり、必要に応じ、ベクターはＤＮＡ塩基であるかＲＮＡ塩基であるかを考慮する。

リコンビナント発現ベクターは、１以上のマーカー遺伝子を含みうり、マーカー遺伝子は形質転換又は遺伝子導入された宿主を選別するのに用いられる。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性、抗生物質、重金属等に対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における補完、その他の同等物を含む。本発明の発現ベクターに適したマーカー遺伝子は、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、そしてアンピシリン耐性遺伝子を挙げられる。

リコンビナント発現ベクターは、ネイティブの又はノンネイティブのプロモーターを含み得、該プロモーターは、Ｂｏｌｅ１ａウィルスポリペプチド、又は、コア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、ＵＴＲそして同等物といった蛋白（それらの機能的部位や機能的な変異体を含む）を、符号化するヌクレオチド配列に操作的に結合され得、又は、上述のような、Ｂｏｌｅ１ａウィルスポリペプチドや蛋白、それらの断片を符号化するヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列や、それらに相補的な配列に結合されうる。

プロモーターの選択、例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的、そして発生特異的の選択は、その技術分野における通常の知識を有する者の範囲内である。同様に、プロモーターを有するヌクレオチド配列の組み合わせもなお、当業者の技術の範囲内である。プロモーターとしては、非ウィルス性プロモーターや、ウィルス性プロモーター、例えば、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターや、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、そして、マウス幹細胞ウィルスの末端反復配列中に認められるプロモーターを、挙げることができる。

本発明は、他の実施形態に従い、配列番号１のヌクレオチド配列、又はそれらの相補鎖を含む単離された核酸分子を含有する、単離された細胞を提供する。

本発明は、更に、本明細書に記載するリコンビナント発現ベクターのいずれかを含む、宿主細胞を提供する。本明細書で用いた様に、用語「ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ」（宿主細胞）は、発明性のリコンビナント発現ベクターを含有しうる任意の種類の細胞をいう。宿主細胞としては、真核生物細胞、例えば、植物、動物、真菌、又は藻類を挙げることができ、又は、原核細胞、例えば、細菌もしくは原虫を挙げることができる。宿主細胞としては、接着細胞であってもよいし、上清中で成長するような浮遊細胞を挙げることができる。適する宿主細胞としては、先行技術で知られるおり、例えば、ＤＨ５αＥ．ｃｏｌｉ ｃｅｌｌ、チャーイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、そして同等の細胞を挙げることができる。リコンビナント発現ベクターの増幅又は複製を目的として、宿主細胞は原核細胞、例えばＤＨ５α細胞が好適である。リコンビナントＢｏｌｅ１ａウィルス、ポリペプチド、又は蛋白を生成する目的では、哺乳類細胞が好適である。最も好適な宿主細胞は、ヒト細胞である。宿主細胞は、任意の種類の細胞を挙げることができ、任意の組織に由来し、そして任意の発生段階のものを挙げることができる。宿主細胞としては、例えばＨｅｐ３Ｂの様な肝細胞を挙げることができる。

さらに、本明細書に記載の少なくとも１個の宿主細胞を含む細胞集団も、本発明により提供される。細胞集団は、不均一な集団もありえ、該集団は、上述の任意のリコンビナント発現ベクターを含有する宿主細胞と、少なくとも１個の他の細胞、例えばいずれのリコンビナント発現ベクタ−をも含まない宿主細胞（肝細胞）や、皮膚細胞以外の細胞で、例えば、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋細胞、脳細胞等を含む。あるいは、細胞集団としては、実質的に均一な集団であってもよく、集団にはリコンビナント発現ベクターを含有する宿主細胞が大半である（例えば実質的にそのような細胞からなる集団である）。また、集団としてはクローナルな細胞集団であってよく、集団の全ての細胞が、リコンビナント発現ベクターを有した単一の宿主細胞のクローンであって、集団の全ての細胞がリコンビナント発現ベクターを有しているような細胞集団を挙げることができる。本発明の一実施形態によれば、細胞の集団は、本明細書に記載のリコンビナント発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローナルな集団である。

さらなる実施形態に従い、宿主細胞として哺乳類細胞を挙げることができ、好適には肝細胞又はそれらを由来とする細胞株である。

本発明は、一実施形態に従い、配列番号１に記載されたヌクレオチド配列又はそれらの相補鎖に特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子を提供する。他の実施形態において、配列番号１に記載のヌクレオチド配列又はそれらの相補鎖に特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子には、約１０から約１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドプライマー、若しくは約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０そして約９０ヌクレオチドの様々な長さのプライマーを含む。

本発明は、一実施形態に従い、ＰＣＲ用の一組のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し、該プライマーの第一のプライマーが、配列番号１に示されたヌクレオチド配列へ特異的にハイブリダイズする長さが約１０から約３０のヌクレオチドである単離された核酸分子であり、第二のプライマーが、配列番号１に示されたヌクレオチド配列の相補鎖へ特異的にハイブリダイズする長さが約１０から約３０のヌクレオチドである単離された核酸分子である。

本発明は、一実施形態に従い、単離されたポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、配列番号１に示されたヌクレオチド配列を含む核酸によって符号化され、配列番号２のアミノ酸配列を有する。

本発明は、一実施形態に従い、合成ウィルスゲノムポリヌクレオチド配列の構築方法を提供し、該配列は、例えば、一連の合成ＨＣＶウィルスゲノムポリヌクレオチド配列を含み、それらはウィルス粒子、偽粒子、そしてポリヌクレオチドの断片又は部分を構築するのに用い得るものであり、多くの用途に用い得、例えば、エピトープ抗原、抗体及びワクチンの生産に用いることができる。

一実施形態において、合成ウィルスゲノムポリヌクレオチド配列を合成する方法であって通常、次の工程を含む：

１．関心のあるウィルスの代表的な非リコンビナントのゲノムヌクレオチド配列を適当数選択し、アウトグループ配列を適当数選択する工程。代表的な試料を欠くゲノム領域の場合は、ステップ６へいく。

２．ＭＵＳＣＬＥ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２：１７９２−１７９７（２００４））やＣｌｕｓｔａｌＸのような、適切なアラインメントプログラムを用いて、配列をアラインメントする。

３．任意の個体の系統発生の特異体質を回避し、アラインメントの系統学的な情報価値のある２つの領域を適用したＢａｙｅｓｉａｎ ｏｒ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ法によって、２つの独立の系統樹を再構築する。系統樹用のパラメーターの収束を確認するための十分な回数の繰り返しを実行する。

４．ゲノム残部での祖先配列を推測するため両系統樹を使用する。評価に用いるプログラムは、各位置における確率分布で祖先配列を推測するものでなければならず、各塩基における確率が算出される（例えば、ＭｒＢａｙｅｓ又はＧａｒｌｉ）。

５．次の方法（方法Ｉ及びＩＩ）で、最終代表配列を推測する。

５ａ．ゲノムでの各ヌクレオチド位置ｉにおいて、両樹の最大事後確率（ＭＰＰ）残基が一致する場合、その位置（ｐｉ）における確率は、２つのＭＰＰｓのうち高いものが選択される。これらの位置は合致として確定される。

５ｂ．各不一致位置（ＭＰＰ残基が一致しない位置）において、（方法Ｉ）ステップ５ｄへ直接進み、又は、（方法ＩＩ）両樹を基に不一致位置を含むコドンｋの同時結合を計算する。該コドンにおける一致残基においては、前のステップで計算されるｐｉが、同時確率の計算に用いられる。

５ｃ．２つの樹から高い同時ＭＰＰを有するコドンが、そのコドンの位置の代表に選択される。このコドンに基づく分析により、コドンにおいて１つ以上の位置で不一致であるケースや、６倍の縮重コドンを収容するケースを解決（resolve）する。

５ｄ．コドン／ヌクレオチドＭＰＰのストリンジェントな閾値を決定するため、二次導関数での相違がＭＰＰ値で１０^−６より低い、コドン／ヌクレオチドＭＰＰｓの分布における変曲が、コドン／ヌクレオチドを解決するための閾値として用いられる。各樹に基づいた閾値と同等もしくはより多いＭＰＰである各コドン／ヌクレオチドは、祖先のものとして受け入れられ、その構成の位置は解決と確定される。

５ｅ．共分散分析は、未解決の位置（still-unresolved positions）を調べることに用いられる。系統学的再構成の基本的な仮定、すなわち、各サイトは独立して進化するとの仮定は、共変動や相互作用サイトを考慮しない。そのようなサイトを考慮に入れるために、観察され期待される塩基対の頻度が決定され、カイ二乗計算が式Ｉに示されるように計算され、Ｈｏｌｍ−Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法（α＝０．０５）を用いる多重比較法によって調整される。

５ｆ．調整されたカイ二乗計算を用い、未解決位置ｉと著しく共変動する解決位置ｊの全てが同定される。正の相互作用の場合（ｏｉｊ＞ｅｉｊ）は、正に相互作用する残基を含んだＭＰＰコドン／ヌクレオチドが選択される。負の相互作用の場合（ｏｉｊ＜ｅｉｊ）は、負に相互作用する塩基をともなうコドン／ヌクレオチド全てが除かれ、残りからＭＰＰコドンが選択される。

５ｇ．なお未解決なサイトには、閾値よりも低いものでもＭＰＰコドンを選択する（これは殆ど必須ではない）。

５ｈ．結果は代表的な配列である。

６．（代表的なシーケンス試料を欠くゲノム領域では）使用可能な配列を用いることで共通配列を決定する。

本明細書で用いた用語「ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ」（単離及び精製された）は、実質的に他の蛋白又は他のポリペプチドとの相互作用がないことを意味し、例えば、自然的に生じた蛋白であって、抗体の使用や他の方法の使用によって細胞成分や他の夾雑物から精製されたものや、リコンビナント宿主細胞培養物からの精製品のようなものをいう。

本願明細書で用いられた用語「ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ」（生物活性）は、酵素や蛋白であって、自然的に生じた分子が有する構造、制御、もしくは生物学的な機能を有するものをいう。

特定の実施形態において、本明細書で用いたアミノ酸配列の「ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎｔ」（機能的変異体）とは、関心持つ配列中に、わずかに１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個のアミノ酸置換しかないものを意味する。その機能的変異体は、アミノ酸配列に関連する少なくとも１つの生理活性を保持する。特定の実施形態において、機能的変異体は、全長のアミノ酸配列に関連する普通の生物活性と比べ、少なくとも４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、若しくはそれより多い活性を保持する。他の実施形態において、機能的変異体は、本明細書で開示のポリペプチド配列（又はそれらの断片）に対して、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％もしくは９８％で相同性のあるアミノ酸配列である。

本発明は、一実施形態に従い、ＨＣＶ偽粒子を提供し、該偽粒子は：ａ）配列番号１のコア配列の最後の２７アミノ酸と、それに続くＥ１及びＥ２領域のアミノ酸配列と、ｂ）レポーターエレメントを含む。偽ウィルス粒子は、他の実施形態に従い、レポーターエレメントとして、ルシフェラーゼポリペプチドやそれらの機能的部位を含む。

ＨＩＶは、異なる多くのウィルスのエンベロープ蛋白と、容易に偽型又は偽粒子を形成する。特に、ネイティブのＨＣＶのＥ１及びＥ２糖蛋白を有するＨＩＶ偽粒子は、ヒト肝臓癌細胞株Ｈｕｈ−７やＰＬＣ／ＰＲ５への感染性がある。感染力が著しくｐＨ依存的であり、Ｅ２特異的モノクローナル抗体の多くで著しく中和され得る。ＨＣＶ偽ウィルス粒子は、ウィルスｇｐｓを発現する発現プラスミド、からのベクターと、エンベロープを欠損したｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ^- Ｅ^- プロウィルスゲノムを、等量で２９３−Ｔ細胞へコトランスフェクションすることで、調製することができる。

本発明は、一実施形態に従い、ＨＣＶ抗原を提供し、該抗原は、配列番号１に示すヌクレオチド配列によって符号化されるポリペプチド、又はそれらの部分若しくは断片の１５から１００の連続するアミノ酸を符号化するポリヌクレオチド分子を含有する。本発明は、他の実施形態において、ＨＣＶ抗原を提供し、該ＨＣＶ抗原は、配列番号２のアミノ酸を含むポリヌクレオチド分子、又はそれらの部分若しくは断片を含むポリペプチドを含有する。本発明は、さらに他の実施形態において、本発明のＨＣＶ抗原を提供し、該ＨＣＶ抗原は、配列番号２のポリペプチドの、コア、Ｅ１及び／又はＥ２領域からのアミノ酸を符号化するポリヌクレオチド分子、又はそれらの部分若しくは断片を含む。

本発明は、一実施形態に従い、ＨＣＶに感染した対象を治療する方法を提供し、該方法は、前記対象に、上述の抗原を含有する医薬組成物を投与することを含み、該投与は、抗原に対する免疫応答を刺激するのに十分な量で対象に投与するもので、それゆえ対象における免疫応答が、ＨＣＶウィルス量を減らすのに十分な程度である。

本発明の目的として、投与に用いる本発明のワクチン組成物の含量及び投与量は、対象に免疫応答を十分刺激する程度に十分量であるべきで、それにより適当な時間枠で対象におけるＨＣＶのウィルス量が減少する。投与量は、治療をうける対象の体重だけでなく、特定の医薬品製剤の効率によって、及び、被験者における標的細胞集団の部位によって、決定されうる。

他の実施形態において、用語「ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ」（投与）は、本発明の医薬品組成物の少なくとも１以上が、対象の体内へ導入されることを意味し、好適には、対象は、疾病で治療を受けており、少なくとも１以上の組成物が、インビボで関心のある標的遺伝子用いて、一以上の疾患に関連する細胞、もしくは細胞集団に接触する。

本明細書で用いた様に、用語「ｔｒｅａｔ」（治療）及びそれらから派生する言葉も、疾患の治療処置だけでなく、診断や予防的な処置も含む。

本願明細書で用いた様に、用語「ｓｕｂｊｅｃｔ」（対象）は、哺乳類を指し、マウスやハムスターの様なげっ歯目の哺乳類や、ウサギの様なウサギ目を含むが、これらに限定されるものではない。哺乳類は、ネコ（猫）やイヌ（犬）を含む食肉目がよい。より好適には、哺乳類は、ウシ（牛）、ブタ（豚）を含むウシ目、又はウマ（馬）を含むウマ目がよい。最も好適には、哺乳類がサル目、セボイド目、もしくはシモイド目、又は真猿亜目（ヒトと類人猿）である。特に好適な哺乳類はヒトである。

更なる実施形態において、本発明の医薬品組成物は、１以上の添加剤の治療上の活性物と組み合わせて用いてもよく、該活性物は、上述の状態や疾病を処置することが出来ることで知られている。例えば、記載された本発明の組成物は、ＨＣＶ感染のような疾病もしくは状態を治療するために、１以上の治療上の活性物と組み合わせて用いることができる。本発明の製剤組成物と容易に組み合わせることができる他の治療上の活性物としては、限定されるべき例ではないが、酵素的核酸分子、アロステリック核酸分子、アンチセンス、デコイ、若しくはアプタマー核酸分子、モノクローナル抗体の様な抗体、小分子、そして、金属、塩、イオンを含む、他の有機及び／又は無機の化合物を挙げることができる。

一実施形態において、本発明は、抗体、もしくはその抗原結合部位を提供し、該抗体は、配列番号１に示す核酸分子、それらの部位若しくは断片の核酸分子、配列番号２のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド、又はそれらの部位もしくは断片に、特異的に結合する。

本発明は、モノクローナル抗体を提供し、該モノクローナル抗体は、コア、Ｅ１及び／又は Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５そしてそれらのサブユニット、及びそれらの断片の例のような、任意のＨＣＶポリペプチド又は蛋白に対する抗体である。一実施形態において、抗体はヒトのあるいはヒト化された抗体である。

さらに他の実施形態に従い、抗体は検出できる標識物で標識される。

機能的変異体は、実質的に一次構造配列が同じ由来物であるが、例えばインビトロ修飾もしくはインビボ修飾、化学的修飾及び／又は生物的修飾を含み、親株結合分子では認められないものを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。そのような修飾体には、特にアセチル化、アシレーション、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質由来物の共有結合、架橋、ジスルフィド結合形成、グリコシレーション、ヒドロキシル化、メチル化、酸化、ＰＥＧ化、蛋白加水分解反応、リン酸化、その他の反応を含みうる。

非限定的な例であるが、抗原上のエピトープに結合する抗体断片もしくは抗原結合断片としては、次の、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）_２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）発現ライブラリーで得られる断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、そしてＦｖ断片を挙げることができる。抗体は、ヒト由来であってよいし、ヒト以外の動物から得るものでもよいが、好適には、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、そしてブタのような哺乳類が好適である。好適には、マウスモノクローナル抗体や、それらの抗原結合断片若しくは結合部位である。さらに、キメラ抗体やハイブリッド抗体が本発明で包含される。

本発明のモノクローナル抗体としては、一実施形態において、培養溶液中に本発明の抗体を生産できるハイブリドーマを培養することにより得ることができ、培養溶液としては例えば、牛胎児血清を含むＲＰＭ１６４０がある。あるいは、ＰＣＲ法あるいは化学合成により、各可変領域を符号化するＤＮＡに重鎖又は軽鎖の定常領域を符号化するＤＮＡを連結された、重鎖もしくは軽鎖含む遺伝子を調製し、得た遺伝子を従来より用いられている、遺伝子を発現可能なベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ導入し、抗体を生産する為に遺伝子をＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）もしくはエシェリキア コリで発現させ、そして、得られた抗体を培養溶液からＰｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇカラムもしくは相当物を用いて精製することによっても、得ることができる。

更に、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、コア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５蛋白、及びそれらのサブユニット、並びに１以上の他の蛋白、を含む、任意のＨＣＶ蛋白もしくはそれらの断片を含むリコンビナント結合蛋白を免疫することで得た、哺乳類からのハイブリドーマを調製することで、得ることができる。バクテリア培地で結合蛋白を発現させ、バクテリア溶解液から結合蛋白を精製し、ＨＣＶ蛋白、もしくはそれらの断片を含む精製した結合蛋白を、アジュバントと混和して、精製した結合蛋白を哺乳類に接種する。接種された哺乳類は、３週間後に追加免疫され、脾臓とリンパ球は追加免疫後３日に回収する。リンパ球と脾細胞は、ＳＰ２／ｍＩＬ６細胞（ＡＴＣＣ）のようなマウスＢ細胞ハイブリドーマ細胞と融合され、製造元の説明に従い、ＨＦＣＳサプリメント（Ｒｏｃｈｅ）を用いて播種する。ハイブリドーマは、様々な種類のリコンビナントＨＣＶ蛋白や、それらの断片との反応性でスクリーニングする。

本発明の範囲には、バイオコンジュゲートの様なコンジュゲートを含み、該コンジュゲートは、発明性のモノクローナル抗体（それらの任意の機能的部位もしくは変異体を含む）、宿主細胞、宿主細胞の集団、もしくは抗体、又はそれらの抗体断片を含む。
コンジュゲートは、通常、コンジュゲートの合成方法と同様に、先行技術として知られている。例えば、Ｈｕｄｅｃｚ Ｆ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８： ２０９−２２３（２００５）や、Ｋｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．， ４４（１５）： ５４０５−５４１５ （２００５）を参照。

抗体は、先行技術に知られている任意の型のイムノグロブリンを用いることができる。例えば、抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ等の任意のアイソタイプを用いることができる。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、自然的に発生する抗体でもよく、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトといった哺乳類より単離及び／又は精製された抗体を挙げることができる。あるいは、抗体は、遺伝的操作された抗体、例えば、ヒト化抗体やキメラ抗体を挙げることができる。抗体は、単量体でも多量体でもよい。また、その抗体は、コア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２，ＮＳ３、ＮＳ４そしてＮＳ５蛋白、並びにそれらのサブユニット、及びそれらの断片の例のような、任意のＨＣＶポリペプチドもしくは蛋白に対する、任意のレベルのアフィニティーやアビディティーをもち得る。

任意のＨＣＶ蛋白もしくはその断片へ、抗体が、結合する能力を試験する方法は、先行技術で知られており、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、そして、競合的阻害アッセイ法（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．， ｉｎｆｒａ及びＵＳ２００２／０１９７２６６Ａ１を参照）の様な、抗原−抗体結合アッセイを含む。

抗体を作製する適した方法は、先行技術で知られている。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ５： ５１１−５１９ （１９７６）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．）， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ （１９８８）、及びＣ．Ａ． Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）， Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， ５^ｔｈＥｄ．， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ（２００１））に記載されている。あるいは、ＥＢＶハイブリドーマ法 （Ｈａｓｋａｒｄ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ７４（２）： ３６１−６７ （１９８４）、及びＲｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １２１： １４０−６７（１９８６）、及び、バクテリオファージベクター発現システム（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｃｅｎｃｅ， ２４６： １２７５−８１（１９８９）を参照）が先行技術として知られている。更に、非ヒトの動物の抗体は、例えばＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔｓ ５，５４５，８０６、５，５６９，８２５、及び５，７１４，３５２並びにＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ２００２／０１９７２６６Ａ１に記載されている。

抗体は、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子に特異的な遺伝子導入したトランスジェニックマウスによって、生産されうる。その様な方法は、先行技術で知られており、例えば、ＵＳ特許５，５４５，８０６や５，５６９，８２５やＪａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ．に記載されている。

ヒト化された抗体を産生する方法は、先行技術でよく知られており、詳細には、例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，２２５，５３９、５，５８５，０８９と５，６９３，７６１に記載されている。ヒト化された抗体は、また、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，６３９，６４１や、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２３５： ９５９−９７３（１９９４）に記載される、抗体リサーフェシングテクノロジーを用いて産生され得る。

単鎖可変領域断片（ｓＦｖ）抗体断片、すなわち、合成ペプチドを介して、軽鎖抗体の領域に連結された重鎖抗体の可変領域を含む切断型Ｆａｂ断片を含む断片は、ルーチンのリコンビナントＤＮＡテクノロジー技術（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａを参照）を用いて産生し得る。同様に、ジスルフィドで安定化された変異領域断片（ｄｓＦｖ）はリコンビナントＤＮＡテクノロジー（Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ７： ６９７−７０４（１９９４））を参照）によって調製されうる。しかしながら、本発明の抗体断片は、これらの抗体断片の例示型に限定されるものではない。

他の実施形態において、抗体もしくはそれらの抗原結合断片は、検出できる標識物、例えば、ラジオアイソトープ、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチアネイト（ＦＩＴＣ）やフィコエチレン（ＰＥ））、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ウシペルオキシダーゼ）、エレメント粒子（例えば、金又は磁性の粒子）を含むように修飾される。

いったん本発明の抗体分子が、動物から、化学合成により、もしくはリコンビナント発現的に生産されると、先行技術で知られる方法により精製され得り、その先行技術としては、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、プロテインＡ／Ｇ免疫沈降クロマトグラフィー、そしてサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度差、又は蛋白の精製のための他の標準的な方法がある。さらに、本発明の抗体もしくはそれらの断片は、精製を容易にする為に、先行技術で知られる、もしくは本明細書に記載の異種のポリペプチド配列に結合されうる。

本発明の抗体は、抗原−抗体アフィニティーカラムを調製するために用いることができ、そのカラムは抗原の精製に使用されうる。例えば、ゲル支持体もしくはビーズは、様々な化合物により活性化され得、例えば、臭化シアン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化され、抗体はそこへ固着されうる。より詳細には、実施例の手段のように、抗体はＡｆｆｉｇｅｌ−１０（ＢｉｏＲａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）、すなわち、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化されたゲル支持体へ添加することができ、そして、抗体はアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成する。抗体はそれ故スペーサーアームと、アミド結合を介してゲルへ結合する。残りの活性化されたエステルは、１Ｍのエタノールアミン塩酸（ｐＨ８）で、クエンチングする。カラムは水で洗浄し、非結合の抗体もしくは外来蛋白を取り除くために、水洗浄と、続く０．２３Ｍのグリシン塩酸（ｐＨ２．６）で洗浄する。カラムは、適当な界面活性剤を含むｐＨ７．３のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化し、サンプル材料、例えば癌特異的な抗原を含む細胞培養上清もしくは細胞抽出物（適当な膜可溶界面活性剤を用いて調製する）をカラムでゆっくり通す。カラムは、吸光度低下がバックグランドになるまで、ＰＢＳ／界面活性剤で洗浄する。蛋白は、０．２３ＭのグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）／界面活性剤で溶出される。精製された抗原は、ＰＢＳ／界面活性剤で透析される。

宿主におけるＨＣＶの存在を検出する方法と、ＨＣＶ感染宿主の感染の治療もしくは防止方法は、さらに本発明により提供される。宿主におけるＨＣＶの存在を検出する本発明の方法は、（ｉ）宿主の細胞を含む試料に、本明細書に記載される本発明の任意の抗体、もしくはそれらの抗原結合断片を、接触させ、複合体を形成する工程、及び（ｉｉ）複合体を検出する工程を含み、該複合体の検出は宿主におけるＨＣＶ感染の存在を示唆するものである。

本発明は、一実施形態に従い、試料におけるＨＣＶの存在について、試料を試験する方法を提供し、該方法は、試料中において本明細書に記載の抗体に特異的に結合するポリペプチドの存在を検出する工程を含む。

本発明は、さらに、対象においてＨＣＶに感染した細胞を局在化させるための方法を提供し、特に細胞としては、コア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４そしてＮＳ５蛋白やそれらのサブユニット、そしてそれらの断片を発現する細胞であり、前記方法は、（ａ）対象に、本発明の、検出できるように標識されたモノクローナル抗体もしくはそれらの結合断片を投与する工程、（ｂ）対象内の感染した細胞へ、検出可能な標識（例えば、放射標識の、フルオロクローム標識の、もしくは酵素標識の、例えばＥＬＩＳＡを介して）で標識されるモノクローナル抗体、もしくはそれらの結合断片を、結合させる工程、（ｃ）被験者内の標識されたモノクローナル抗体やそれらの結合断片の位置を検出する工程を含む。

さらなる実施形態において、本発明の抗体は、例えば、フルオロフォア、クロモフォア、放射性核種、化学発光物質、生物発光物質そして酵素のような、検出できる成分で標識されうる。

本発明の抗体は、一実施形態において、先行技術で実施し知られているプロトコールや技術を用いて前記試薬で標識されたものである。例えば、抗体の放射ラベルに関する技術として、Ｗｅｎｚｅｌ ａｎｄ Ｍｅａｒｅｓ， Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８３）； Ｃｏｌｃｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １２１： ８０２−８１６ （１９８６）； 及びＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ３０３−３１６ （１９８５），を参照。

一実施形態において、抗体もしくはそれらの抗体断片は、静脈内投与、皮下投与、又は腹腔内投与、例えば注入のように、非経口的に届けられる。先行技術で知られる、適した緩衝液、キャリア、他の組成物は、投与のために適切な有効期間や適合性のために、抗体もしくは断片を含む処方組成に用いうる。これらの物質は、緩衝剤や蛋白安定化剤（例えばポリ多糖）のような補助的な成分を含みうる。

より詳細には、抗体もしくはそれらの結合断片の治療用製剤は、所望の純度の抗体もしくはそれらの結合断片が、任意の生理的に許容されるキャリア、賦形剤もしくは安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， （Ｅｄ．） Ａ． Ｏｓｏｌ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， （１９８５））と混合され、凍結乾燥もしく水溶液の状態で貯蔵するために調製される。許容されるキャリア、賦形剤、もしくは安定化剤としては、使用量と使用濃度で、被提供者にとって非毒性であり、緩衝剤、例えば、リン酸の、クエン酸の、その他の有機酸の緩衝剤を含み、アスコルビン酸を含む抗酸化剤を含み、低分子量ポリペプチド（例えば、１０〜１５アミノ酸残基、もしくはより小さなペプチド）、蛋白、例えば、血清アルブミン、ゲラチン、もしくはイムノグロブリンのような蛋白を含み、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマーを含み、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくリジンのようなアミノ酸を含み、単糖、二糖、そして、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物を含み、ＥＤＴＡのようなキレート剤を含み、マンニトールやソルビトールのような糖アルコールを含み、ナトリウムのような塩形成の対イオンを含み、及び／又はＴＷＥＥＮ^ＴＭ（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^ＴＭ（エチレンオキサイド（ＥＯ）と、ポリプロピルオキサイド（ＰＯ）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のブロックコポリマー）のような非界面活性剤を含む。抗体もしくはそれらの断片は、また、マイクロカプセル内に封入され得、該封入は、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゲラチンマイクロカプセル、そしてポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）によって調製され、コロイド性のドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、そしてナノカプセル）で調製され、マイクロエマルジョンにおいて調製される。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｓｕｐｒａで開示されている。

インビボ投与で用いられる抗体もしくはそれらの結合断片は、無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前であっても後であっても、滅菌濾過膜に通して濾過することで容易になしうる。抗体もしくはそれらの結合断片は、通常凍結乾燥状態もしくは溶液で保存される。

治療用抗体組成物は、一般的に、無菌の出入り口部を備える容器内に入れられ、該容器は、例えば、静脈内注射用バッグもしくはバイアルのような、皮下組織注射針で突き刺す留め部を有する容器である。本発明に従い、抗体もしくはそれらの結合断片の投与ルートとしては、公知の方法により、例えば、注入もしくは点滴による、静脈、腹腔内、筋肉内、動脈内、皮下、病巣内へのルートあってもよいし、エアロゾルもしくは鼻腔内ルートでもよく、下記に記載するような持続的な放出システムであってもよい。抗体、もしくはそれらの結合断片は、点滴により断続的に投与されたり、ボーラス注入により投与されたりする。持続的な放出調製の適した例としては、固体の疎水性ポリマーの半透膜マトリックスを挙げることができ、蛋白を含むもので、該マトリックスは、薄膜もしくはマイクロカプセルのような、造形品の形をとる。持続的に放出するマトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．， １５： １６７−２７７（１９８１） とＬａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．， １２： ９８−１０５（１９８２）に記載））、もしくはポリ（ビニルアルコール）、ポリ乳酸（ＵＳ特許３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， ２２： ５４７−５５６（１９８３））、非分解性エチレン−ビニル酢酸（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ）、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ^ＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体とリュープロリド酢酸とからなる投与可能な微粒子）のような分解性乳酸―グリコール酸共重合、そして、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸 （ＥＰ １３３，９８８）を挙げることができる。

治療用に用いる抗体の有効量は、例えば、治療上の治癒上の目標、投与ルート、年齢、状態、そして処置や治療を受ける患者の体質量、そして患者に提供されている補助的もしくは補助剤療法に依存する。従って、実務家にとっては、最適な治療効果を得るために、要求に応じて、投与量を調節したり、投与ルートを代えたりすることは、必要であるし、日常の業務である。典型的な一日の投与量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇもしくはそれより多い範囲であり、上述の要因はあるものの、好適には、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。典型的には、臨床医は、所望の効果に達するまでの投与量で抗体を投与するであろう。この治療の進捗は、容易に簡便な操作法によって監視される。

本発明に従い、多種のアジュバントが、抗原もしくはワクチンに対する免疫応答を高めるのに用いることができ、特異的な抗体を誘発しうる。免疫される宿主の種にもよるが、アジュバントとしては、フロイントのアジュバント（完全な、及び不完全な）、水酸化アルミニウムのような鉱質ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオールズ、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ニジトロフェノールのような界面活性剤、そして、ＢＣＧ （ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ） 及びコリネバクテリウム パリバムのような、潜在的にヒトアジュバントに有用なものを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

本発明の抗体は、さらに、体外診断用への応用に有用であり、前記抗体が特異性をしめす抗原を保持したＨＣＶ感染細胞を検出するものである。上述のように、体外診断の方法は、免疫学的もしくは免疫化学的なＨＣＶ感染細胞（例えば、ヒト組織上の、若しくは切除試料から分離された細胞）の検出を含み、ＨＣＶ関連抗原（例えば、血液試料中の、又は、他の生物学的な体液の）の血清学的な検出を含む。免疫化学的技術は、組織試料のような生物学的試料を、一以上の本発明の抗体を用いて染色する工程と、試料上における、同族の抗原に結合した抗体を含む抗原抗体複合体の存在を検出する工程を含む。試料においてそのような抗原抗体複合体が形成されるということは、組織にＨＣＶが存在することを示す。

試料上での抗体の検出は、免疫酵素学的方法のような公知の技術を用いて達成することができ、該免疫学的方法の例としては、免疫ペルオキシダーゼ染色、アビジン−ビオチン技術、もしくは免疫蛍光学的技術（例えば、Ｃｉｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｅ．， １２１： ５６２−７９ （１９８６） やＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， （２^ｎｄ Ｅｄ）， １１３−１１７， Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８６）を参照）がある。血清学的診断技術としては、腫瘍関連抗原の検出及び定量を含むものであり、該腫瘍関連抗原とは、上述で記載したように、癌で苦しむと思われる患者の血清や他の生物学的な体液へ分泌もしくは「流れ出る」ものである。そのような抗原は、先行技術で知られる技術を用いて体液中で検出が可能であり、該技術として、放射免疫学的測定法（ＲＩＡ）や酵素結合性免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）があり、流出した抗原と反応する抗体は、体液試料における抗原の存在を検出するのに用いられる（例えば、Ｕｏｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ４２： １１ （１９８１）やＦａｙｅｄ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍａｒｋｅｒｓ， １４： １５５−１６０ （１９９８）を参照）。

本発明は、一実施形態において、対象からの生物学的試料中に、ＨＣＶ蛋白に特異的な抗体であって、循環する血清抗体を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出する方法を提供し、該ＥＬＩＳＡアッセイは、（ａ）ＨＣＶ蛋白もしくは少なくとも１つの該蛋白の断片に特異的な抗体を少なくとも１つ有する、少なくとも１つの前記生物学的試料を、ＨＣＶ蛋白もしくはそれらの断片へ接触させる工程と、（ｂ）ＨＣＶ蛋白もしくはそれらの断片と、前記生物学的試料中に存在するＨＣＶ特異的な抗体もしくはそれらの断片との、抗原抗体複合体の形成を、検出する工程を含む方法である。

前記抗体又は本発明の文脈で用いた抗体は、それら自体を、検出可能な標識へ結合されうる。かかる検出可能な標識によって、一次免疫複合体の存在もしくは量を決定できる。あるいは、一次免疫複合体内で結合される第一に添加された組成物は、一次抗体に結合親和性のある第二の結合リガンドを用いることによって、検出可能である。これらの場合、第二の結合リガンドは、それ自体がしばしば抗体であり、該抗体は「二次」抗体と呼ばれうる。一次免疫複合体は、標識された、二次の結合リガンドもしくは抗体と、二次免疫複合体を形成するのに十分な時間接触させる。その二次免疫複合体は、非特異的に結合している標識抗体もしくは標識リガンドが洗われ、二次免疫複合体中に残った標識物が検出される。

一実施形態において、患者におけるＨＣＶの感染の存在や程度を検出する方法が提供され、該方法は、患者からの体液や組織切片の試料における抗原量を決定する工程と、抗原の量と、患者における感染の存在及び程度とを相関する工程を含む方法である。一実施形態では、抗原は、（ｉ）コア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２，ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５蛋白、およびそれらのサブユニット、並びにそれらの断片に特異的なモノクローナル抗体を、試料や組織切片へ添加し、（ｉｉ）ペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗マウスのヤギＩｇＧを添加し、（ｉｉｉ）ジアミノベンゼンとペルオキシダーゼとを固定し、（ｉｖ）赤褐色の茶色であれば、細胞が抗原を生産したことを示す観点で、試料もしくは切片を調べることで検出する。

本発明は、別の実施形態において、コア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４およびＮＳ５蛋白、およびそれらのサブユニット、並びにそれらのフラグメントの１０ｋＤのリコンビナントバージョンを用いて、アフィニティー精製ポリクローナル抗体を作製する方法を提供する。共通のリーダーペプチドは、バクテリアへ遺伝子導入し、そしてリーダーペプチドが発現され好適には水溶液中に可溶となる。ポリクローナル抗体は、通常、特定の抗原で免疫されたヤギやウサギの血清から得る。一実施形態において、前記抗原は、コア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４およびＮＳ５蛋白、およびそれらのサブユニット、並びにそれらのフラグメントの１０ｋＤのリコンビナントバージョンである。抗血清は、非特異的な抗体を除くためにアフィニティー精製され、感度があがりバックグラウンドが低減する。さらなる精製では、関連する動物種間での潜在的な非特異反応物を除去したり、他の重鎖及び軽鎖との交差反応性を低減する。一実施形態において、精製された抗体は、検出できるマーカー、例えばローダミンで標識される。精製されたポリクローナル抗体は、公知の先行技術を用いて、パラフィン中に包埋し固定された組織試料を使って、抗原を検出する用途に用いられる。

さらなる方法として、２ステップアプローチにより、１次免疫複合体を検出する方法を含む。上述のとおり、一次抗体に結合親和性を有する第二の結合リガンド、例えば抗体が、二次免疫複合体を形成するのに用いられる。洗浄後、二次免疫複合体は、２次抗体に結合親和性のある第３の結合リガンドもしくは抗体と、免疫複合体（三次免疫複合体）形成をするのに十分な時間で接触させる。第三のリガンド、又は、抗体は、検出可能な標識に結合され、それゆえ、形成された３次免疫複合体の検出が、可能となる。

本発明のモノクローナル抗体は、注入されたり、時間をかけて徐々に拡散させたりすることで、非経口的に投与されうる。本発明のモノクローナル抗体の投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、体腔内、もしくは経皮的に投与でき、単独であってもよいし、活性細胞と組み合わせてもよい。非経口投与の為の調製としては、無菌溶液や、非水溶液性の溶液、上清、そしてエマルジョンを含む。非水溶液性の溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような食物油、そしてエチルオレートのような注入可能な有機エステルを挙げることができる。水溶性のキャリアとしては、水、アルコール性の／水溶性の溶液、エマルジョン、もしくは上清で、生理食塩水や緩衝培地を含む。非経口的な溶媒としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖液、ブドウ糖と塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、もしくは固定油を含む。静脈内用の溶媒としては、液体の栄養補充薬、（リンゲルのブドウ糖液を基本組成とするような）電解質補充薬、および同等物を含む。非経口の他の添加物として、例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート物質、及び不活性ガス、並びに同等物が存在しうる。

本発明によるモノクローナル抗体もしくはそれらの結合断片は、一実施形態において、種々の皮膚細胞もしくは他の細胞における、ＨＣＶ蛋白やそれらの断片の何れかの存在を、量的、又は、質的に検出するのに用いる。これは、例えば、蛍光標識した抗体を用い、光学顕微鏡検出、フローサイトメトリック検出、蛍光定量的検出と組み合わせる免疫蛍光法により達成できる。さらに、本発明による抗体およびそれらの結合断片は、さらに、組織学的に用いることができ、該組織学的な方法は、免疫蛍光法、免疫電子顕微鏡法、非免疫学的な測定法、又は、切片上細胞の腫瘍特抗原検出の用途があり、例えば、モニタリングにおける使用、診断における使用、もしくは検出アッセイにおける使用がある。

さらに他の実施形態において、切片上検出は、患者から組織試料を除去し、そこへ本発明の標識抗体を適用することにより達成できる。抗体もしくはそれらの抗原結合断片は、好適には、生物試料上に標識された抗体もしくは断片を覆うことで適用できる。かかる工程での使用により、抗原、保存変異体、もしくはペプチド断片の存在を決定できるだけでなく、調査した組織において、その分布も決定できる。広範多種の組織学的方法、例えば染色工程の任意の何れかを、切片上検出法で達成するように、修正をすることは、その技術分野における通常の知識を有する者は容易に認識する事項である。

本発明の免疫測定法によれば、生物試料を、固相支持体もしくはキャリア上へ、接触や固相することができ、支持体やキャリアの例としては、ニトロセルロースや他の固相支持体、マトリックスを挙げることができ、それらは、細胞や細胞粒子、膜、もしくは可溶性蛋白を固相可能である。支持体は、適した緩衝液で洗浄され、検出できるように標識された抗体で、処置される。固相支持体を緩衝液で２度洗浄し、未固相の抗体を除く。固相支持体上の結合標識物の量は、従来法に従い検出できる。従って、本発明の他の実施形態において、本明細書に記載したような固相支持体に結合するモノクローナル抗体、もしくはそれらの結合断片を含む組成物が提供される。

抗原もしくは抗体に結合できる任意の支持体は、固相支持体、固相キャリア、固相マトリックスによって意味される。公知の支持体、キャリアとしては、ガラス、プラスチック、ナイロンウール、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、フィルム、レジン、自然のもしくは修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、アルミナゲル、班れい岩、およびマグネチックを含む。キャリアの性質としては、本発明の目的からすれば、ある程度可溶性であるか、不溶性である。支持体の材料としては、結合された分子が抗原や抗体を結合できる性質であれば、実質的には、いかなる潜在的な構造立体配置をも有し得る。それゆえ、支持体立体配置は、ビーズのように球状であってよく、試験管の内部表面のように円柱状であってよく、またロッドの外部表面の立体配置でもよい。あるいは、表面は、シート、フィルム、テストストリップ、スティック、それらの同等物のように、平坦であってもよい。

一実施形態において、固相支持体は、結合の反応条件には不活性であり、モノクローナル抗体、結合断片もしくは抗体の結合パートナーを接着させるための反応性基、又は、活性化された基を有しうる。固相支持体は、クロマトグラフィー支持体としても有用でもあり、糖質ポリマーＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭ （架橋化アガロースビーズ）、ＳＥＰＨＡＤＥＸ^ＴＭ （架橋化デキストランゲル）、もしくはアガロースがある。実際、抗体もしくは抗原を結合するための、かかる支持体の多くは、商業的に入手可能であり、その技術分野の通常の知識を有する者に知られている。

得た抗体の結合能は、公知の方法で決定されうる。本発明の腫瘍特異的抗体に関しては、かかる蛋白分子を検出可能なように標識する方法は、多く知られており、先行技術で用いられている。例えば、一実施形態において、抗体は検出可能なように標識でき、例えば、酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）での使用の為に、抗体は酵素へ結合される（Ｖｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ， ２： １−７ （１９７８）； Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ７３： ４８２−５２３ （１９８１））。抗体へ結合された酵素は、適当な基質、好適には、発色性の基質と反応させ、例えば、分光光度法、蛍光定量法、もしくは目視法によって検出可能な、化学成分を得る。抗体を検出可能なように標識するのに用いられる酵素の例としては、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらの記載に限定されるものではない。検出は、酵素の発色基質を用いる発色法により、又は、同等に調製された標準品もしくはコントロールと比べ、基質の酵素反応の程度を視覚的に比較することで、達成されうる。

本発明の抗体もしくはそれらの抗原結合断片は、蛍光物質を用いてでも標識されうる。蛍光的に標識された抗体が、適当な波長の光に暴露されると、その存在が蛍光によって検出されうる。もっとも共通で用いられる蛍光標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレサミンを挙げることができる。

本発明の抗体は、また、代わりの実施形態において、抗体を化学発光の化合物へカップリングすることで検出可能に標識することができる。化学発光標識の抗体は、それゆえ、化学反応経過の間で産生される発光の存在を検出することで決定される。特に有用な化学発光標識の例としては、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、及びシュウ酸エステルを含むが、これらに限定されるものではない。同様に、生物発光化合物は、本発明の抗体を標識するのに用いることができる。生物発光は、生物システムにおいて見出された化学発光の一種で、触媒作用の蛋白が、化学発光反応の効率を上昇させる。生物発光蛋白の存在は、発光の存在を検出ことにより決定される。有用な生物発光標識化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンを挙げることができる。

以下の実施例で、さらに本発明を説明するが、当然に、発明の範囲を制限するように解釈されるべきものではない。

被験者：ボルティモアの肝炎コホートの前後急性研究（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ Ａｆｔｅｒ Ａｃｕｔｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ（ＢＢＡＡＳＨ） ｃｏｈｏｒｔ）では、Ｃ型肝炎感染症の危険のあるヒトの前向き研究である。参加適格者は、登録者としては、抗ＨＣＶ抗体の血清陰性で、静脈内の薬物使用者若しくは薬物使用歴のあるものである。各参加者から、承諾書を得た。一旦登録されると、参加者は静脈内の薬物使用とその合併症を減らすカウンセリングを受ける。月毎の経過観察のためにデザインされたプロトコールにおいて、血清、血漿、及び抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために血液が採取される。急性のＨＣＶ感染症の参加者は、治療の評価のために受診した。斯かる研究は、ジョンホプキンス医科大学の治験審査委員会によって承認された。

合成コード配列の再構築：ＨＣＶサブタイプ１ａ（ｎ＝３９０）や１ｂ（ｎ＝２９６）の配列は、ポリ蛋白のオープン・リーディング・フレームの全長を少なくとも含み、ヒト試料から得られた。前記配列は、疫学的に重複するものではなく、ジェンバンクからダウンロードされた（アクセス番号は、ＡＢ０１６７８５， ＡＢ０４９０８７−１０１， ＡＢ１５４１７７， ＡＢ１５４１７９， ＡＢ１５４１８１， ＡＢ１５４１８３， ＡＢ１５４１８５， ＡＢ１５４１８７， ＡＢ１５４１８９， ＡＢ１５４１９１， ＡＢ１５４１９３， ＡＢ１５４１９５， ＡＢ１５４１９７， ＡＢ１５４１９９， ＡＢ１５４２０１， ＡＢ１５４２０３， ＡＢ１５４２０５， ＡＢ１９１３３３， ＡＢ２４９６４４， ＡＢ４２９０５０， ＡＦ００９６０６， ＡＦ１３９５９４， ＡＦ１６５０４５， ＡＦ１６５０４７， ＡＦ１６５０４９， ＡＦ１６５０５１， ＡＦ１６５０５３， ＡＦ１６５０５５， ＡＦ１６５０５７， ＡＦ１６５０５９， ＡＦ１６５０６１， ＡＦ１６５０６３， ＡＦ１７６５７３， ＡＦ２０７７５２−７４， ＡＦ２０８０２４， ＡＦ３１３９１６， ＡＦ３５６８２７， ＡＦ４８３２６９， ＡＦ５１１９４８−５０， ＡＪ０００００９， ＡＪ１３２９９６−９７， ＡＪ２３８７９９−８００， ＡＪ２７８８３０， ＡＹ０４５７０２， ＡＹ４６０２０４， ＡＹ５８７８４４， ＡＹ６１５７９８， ＡＹ６９５４３７， ＡＹ９５６４６３−８， Ｄ１０７４９， Ｄ１０９３４， Ｄｌ１１６８， Ｄ１４４８４， Ｄ５０４８０−８２， Ｄ６３８５７， Ｄ８５５１６， Ｄ８９８１５， Ｄ８９８７２， Ｄ９０２０８， ＤＱ０７１８８５， ＤＱ８３８７３９，ＥＦ０３２８８３， ＥＦ０３２８８６， ＥＦ０３２８９２， ＥＦ０３２９００， ＥＦ４０７４１１−５７， ＥＦ４０７４５８−５０４， ＥＦ６２１４８９， ＥＦ６３８０８１， ＥＵ１５５２１３−１６， ＥＵ１５５２１７−３５， ＥＵ１５５２３３， ＥＵ１５５２３６−３８１， ＥＵ２３４０６１，ＥＵ２３４０６３−６５， ＥＵ２３９７１３， ＥＵ２３９７１４， ＥＵ２３９７１５−１７， ＥＵ２５５９２７−９９， ＥＵ２５５９６０−２，ＥＵ２５６０００−１， ＥＵ２５６００２−９７， ＥＵ２５６０４５， ＥＵ２５６０５４， ＥＵ２５６０５９， ＥＵ２５６０６１−２， ＥＵ２５６０６４−６， ＥＵ２５６０７５−１０３， ＥＵ２５６１０４， ＥＵ２５６１０６−７， ＥＵ２６０３９５−６， ＥＵ３６２８８２， ＥＵ３６２８８８−９０１， ＥＵ３６２９１１， ＥＵ４８２８３１−２， ＥＵ４８２８３３， ＥＵ４８２８３４−８９，ＥＵ４８２８３９， ＥＵ４８２８４９， ＥＵ４８２８５９， ＥＵ４８２８６０， ＥＵ４８２８７４， ＥＵ４８２８７５， ＥＵ４８２８７７， ＥＵ４８２８７９−８１， ＥＵ４８２８８３， ＥＵ４８２８８５−６， ＥＵ４８２８８８， ＥＵ５２９６７６−８１， ＥＵ５２９６８２， ＥＵ５６９７２２−２３， ＥＵ５９５６９７−９９， ＥＵ６６０３８３−８５， ＥＵ６６０３８６， ＥＵ６６０３８７， ＥＵ６６０３８８， ＥＵ６７７２４８， ＥＵ６７７２５３， ＥＵ６８７１９３−９５， ＥＵ８５７４３１， ＥＵ８６２８２３−２４， ＥＵ８６２８２６−２７， ＥＵ８６２８３５， ＦＪ０２４０８６， ＦＪ０２４０８７， ＦＪ０２４２７４−７６， ＦＪ０２４２７７， ＦＪ０２４２７８， ＦＪ０２４２７９， ＦＪ０２４２８０−８２， ＦＪ１８１９９９−２０１， ＦＪ２０５８６７−６９， ＦＪ３９０３９４−９５， ＦＪ３９０３９６−８， ＦＪ３９０３９９， ＦＪ４１０１７２， Ｌ０２８３６， Ｍ５８３３５， Ｍ８４７５４， Ｕ０１２１４， Ｕ１６３６２， Ｕ４５４７６， Ｕ８９０１９， Ｘ６１５９６）である。

本発明を説明する目的で、以下、３９０サブタイプ１ａの配列データセットを、「オリジナルデータセット」と呼ぶ。。配列は、ＭＵＳＣＬＥｖ３．０（ＮｕｃｌｅｉＡｃｉｄｅ Ｒｅｓ．３２：１７９２−１７９７（２００４））を用いてアライメントされ、ＢｉｏＥｄｉｔｖ７．０．５．３１０８（ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＲＮａｓｅＰ／ｉｎｆｏ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ＢＩＯＥＤＩＴ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ（ａｃｃｅｓｓｅｄ ２０ Ｆｅｂ ２００５））を用いて修正された。個人の系統の特異体質を避けるために、我々は、ソフトウェアプログラムを用いて２つの独立した系統樹を作製した。該ソフトウェアプログラムは、例えば、全ゲノムアライメント（ポジション番号は、レファレンスゲノムＨ７７に基づき、ジェンバンクのアクセス番号はＡＦ００９６０６である）から、ポジション８６９−１２９２（Ｃｏｒｅ／Ｅ１）と、ポジション８２７６−８６１５（ＮＳ５Ｂ）に、ＭｒＢａｙｅｓｖ３．２（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９：１５７２−１５７４（２００３））に適用するように、確率分布として、系統学的な再構築及び祖先配列の再構築を許容する。これらの断片は、最も系統的に有益な情報であったことから、選択された。これら断片は、本発明では、以降、「Ｓｉｍｍｏｎｄｓ」領域と記載する。ＭｒＢａｙｅｓｖ３．２での３０００万回の反復により、Ｔｒａｃｅｒｖ１．５（Ｒａｍｂａｕｔ Ａ， 著者から利用可能〔ｂｅａｓｔ．ｂｉｏ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｒａｃｅｒ〕）を用い、両Ｓｉｍｍｏｎｄｓ領域から推定される系統樹のためのパラメーターの収束を確認した。両Ｓｉｍｍｏｎｄｓ領域は、可能性のある樹の膨大さによって、予期された異なる樹を生成した。にもかかわらず、これらの２つのデータセットの分析は、類似モデルのパラメーターに収束した。更に、ＨＣＶにおける組換えは、稀である。それゆえ、同じ系統樹又は同じ進化の歴史は、ゲノム全長に対して、正確であると仮定できる。

両Ｓｉｍｍｏｎｄｓ領域で再構築した系統樹を用いて、各ＨＣＶ１ａコード領域の祖先配列が推定された。祖先配列は、各ポジションに対する確率分布として得られ、そのような方法で、各塩基を観察する可能性がある。

合成ＨＣＶゲノムのコンピューターによる調製：Ｂｏｌｅ１ａは、本発明の方法の実施形態を用いて得た。

１．ゲノムにおける各ヌクレオチドの位置（ｉ）とし、もし、両樹が最大事後確率（ＭＰＰ）残基で一致するならば、その位置ｐｉの確率は、２つのＭＭＰのうち大きいほうが選択される。これらの位置は、合致として確定される。

２．不一致の位置（ＭＰＰ残基が一致しない位置）では、両樹に基づく不一致位置を含むコドンｋの結合確率は、ｐｃ_ｋ（ｃｏｒｅ−Ｅ１）とｐｃ_ｋ（ＮＳ５Ｂ）と割りあてた。そのようなコドンにおける一致残基では、前のステップで計算されたｐｉは、結合確率を計算する際に用いられた。

３．２つの樹からの高結合ＭＰＰを有するコドンは、そのコドン位置を代表するものとして選択された。このコドンに基づく分析は、コドンにおける１以上の位置で不一致であるケースを解決し、６倍の縮重コドンを収容する。

４．コドンＭＰＰのストリンジェント閾値を決定するために、コドンＭＰＰｓの分布における変曲は０．９８３７であり、該コドンＭＭＰにおける分布は、第二派生物での多様性がＭＰＰ値で１０^−６より小さいことが判明し、個々の残基ＭＰＰｓ＞０．９９に相当するものである。

５．各樹に基づき０．９８３７以上のＭＰＰを有する各コドンは、祖先配列として受け入れられ、その構成位置は解決として定義される。

６．共分散分析は、未だ解決されていない位置を調べるために用いられた。各サイトは独立的に進化するとの系統学的再構築の基本的な仮定は、サイトの共変動や相互作用を無視するものである。斯かるサイトを考慮にいれると、観察され予期される塩基対の頻度は、決定され、式１に示すようにカイ二乗測定基準が計算され、ホルム−ボンフェローニ法（α＝０．０５）を用いた多重比較法に適用される。

調整されたカイ二重測定基準により、未解決の位置ｉとともに著しく共変動する、すべての解決されたポジションｊが、特定される。正の相互作用（ｏ_ｉｊ＞ｅ_ｉｊ）の場合、正の相互作用残基を含むＭＰＰコドンが選択される。負の相互作用（ｏ_ｉｊ＜ｅ_ｉｊ）では、負の相互作用残基を有するすべてのコドンが除去され、残りからＭＰＰコドンが選択される。

７．未解決のサイトでは、例え０．９８３７より低くとも、ＭＰＰコドンが選択された（実施例ｘに記載のように、これはあまり必要ではない）。

５’ＵＴＲと、３’ＵＴＲのシーケンス再構成：５’ＵＴＲと３’ＵＴＲは、非翻訳（コード）領域であるが、ウィルスの複製においてはそれらは必須である。しかしながら、３９０配列のうち、６つのみが、完全に配列決定された５’ＵＴＲ領域を有し、４つのみが、完全に配列決定された３’ＵＴＲ領域を有するものであった。したがって、我々は非翻訳領域を良好にデザインするための追加配列を用いた。５’−ＵＴＲ（ｎ＝２５７）と３’−ＵＴＲ（ｎ＝４６）配列は、ＢＢＡＡＳＨコホートで実際に感染した被験者から産生されたクローンの配列に由来するものであった。我々は、５’ＵＴＲの９０％の共通配列は、完全な配列を伴った前記６配列に由来する共通配列と同一であり、また、Ｈ７７の５’ＵＴＲとも同一であることを見出した。３’ＵＴＲ配列は、Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖらによる分類に基づき、４つのバーツに分けた。我々は、９０％の共通配列を第一のパーツと決定した。この第一のパーツは、遺伝子型の間でも著しい多様性を伴う短い配列である。３’ＵＴＲの第２の断片では、我々は、ホモポリマー状のウラシルトラクト（ｕｒａｃｉｌ ｔｒａｃｔ）の長さの中央値が５１残基であると決定しており、その長さは複製に好ましい長さでもある。我々は、第三の断片のための中央値の長さの断片を、散在したＣ残基とともに主にＵを組成とするポリピリミジントラクトに選択した。最後（３末端）の部位は、保存された９８塩基の配列であり、この９８塩基の配列のために、我々は９０％の共通配列を用い、未関連の研究から得た１５の追加配列で確認されている。

ＨＣＶ偽粒子（ＨＣＶｐｐ）システム：コアの最後の２７アミノ酸とそれに続くＥ１領域及びＥ２領域を符号化したＢｏｌｅ１ａのヌクレオチド配列の領域は、合成されて（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ， Ｂｏｔｈｅｌｌ， ＷＡ）、Ｇａｔｅｗａｙクローン技術を用いて、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５／Ｄｅｓｔ（Iｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）にサブクローニングした。Ｅ１Ｅ２領域は、クローニングの後に配列決定し、変異を認めなかった。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む偽粒子は、記載に基づいて産生した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １００：７２７１−７２７６（２００３）； Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １０１：１０１４９−１０１５４〔２００４〕；Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４１： ６６７−６７５（２００５））。概略としては、ｅｎｖ欠失ＨＩＶプロウィルスゲノムと、ルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含む、ｐＮＬ４−３．Ｌｕｃ．Ｒ⁻Ｅ⁻プラスミドと、Ｂｏｌｅ１ａ Ｅ１Ｅ２を発現するプラスミドとを、ＨＥＫ２９３細胞へ、同時遺伝子導入した。遺伝子導入（トランスフェクション）の後、４８時間と７２時間後に、上清を含むＨＣＶｐｐを回収した。感染性の比較のために、Ｈ７７由来のＥ１Ｅ２糖蛋白を発現する偽粒子、他のサブタイプの１ａＨＣＶウィルス（ｐｐ１ａ４６）由来のＥ１Ｅ２糖蛋白を発現する偽粒子、及び、Ｅ１Ｅ２を含まない模擬（ｍｏｃｋ）の偽粒子は、Ｂｏｌｅ１ａＥ１Ｅ２を発現する偽粒子と同時に生産した。偽粒子の２倍連続希釈法は、Ｈｅｐ３Ｂ肝がん細胞に感染させるのに用い、９６ウェルプレートに２ウェルづつ播種し５時間後、培養溶液を交換し、感染後から７２時間でルシフェラーゼ活性を測定した。細胞は、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）で溶解し、ルシフェラーゼ活性は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）とＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０ ＣｈｅｍIｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ （Ｂｅｒｔｈｏｌｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。

ＣＤ８１ブロッキング試験：Ｈｅｐ３ｂ細胞は、マウス抗ヒトＣＤ８１モノクローナル抗体（１００μｇ／ｍｌ， ｃｌｏｎｅ １．３．３．２２， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又は、マウスＩｇＧ１抗体に対する アイソタイプコントロール（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＵＳＡ）を用い３７℃で１時間でインキュベーションし、ＨＣＶｐｐ感染を上述のように評価した。

ヒト血漿による中和反応：熱不活化した血漿又は血清は、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭで１：４で希釈し、各ＨＣＶｐｐライブラリーと１時間３７℃でインキュベーション（最終ＨＣＶｐｐ希釈が１：１００）し、９６ウェルプレートに２ウェルづつＨｅｐ３ｂ肝がん細胞を添加し、５時間３７℃でインキュベーションし、続いて、培養液を交換した。ルシフェラーゼ活性は上述のとおり測定した。ＨＣＶｐｐ感染は、「血漿サンプル及び血清サンプル（ＲＬＵテスト）の存在下の相対的光ユニット（ＲＬＵｓ）」対「ノーマルヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒｅｍｅｎｔ， ＣＡ）及びＢＢＡＡＳＨ参加者の血清陰性者からのプール血漿（ＲＬＵコントロール）の存在下での平均感染」で測定した。パーセント中和は、〔１−（ＲＬＵテスト／ＲＬＵコントロール）〕×１００で計算された。

多様性分析：多様性プロットは、ＶａｒＰｌｏｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ１．２（ｓｒａｙ．ｍｅｄ．ｓｏｍ．ｊｈｍｉ．ｅｄｕ／ｓｃｒｏｆｔｗａｒｅ／ＶａｒＰｌｏｔの著者より入手可能）を用いて作成した。プロットは、２０コドンのウィンドウサイズ及び１のステップサイズを用いて作成した（Ｔ細胞エピトープの上限制限を反映するため）。同義及び非同義の距離は、ＮｅｉとＧｏｊｏｂｏｒｉのモデル（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．３：４１８−４２６（１９８６））を用いて計算した。Ｅ１Ｅ２ピクセルアラインメント（図２ｂ）は、ＶｉｓＳＰＡｖ１．６（ｓｒａｙ．ｍｅｄ．ｓｏｍ．ｊｈｍｉ．ｅｄｕ／ＳＣＲｏｆｔｗａｒｅ／ＶｉｓＳＰＡ／）を用いて作図した。

Ｂｏｌｅ１ａゲノム配列は、ジェンバンクにアクセスナンバー（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）ＪＱ７９１１９６で寄託されている。

（実施例１）
Ｅ１領域とＮＳ５Ｂ領域の樹は、アライメント（ギャップを文字としてカウントした）において、９９９２ヌクレオチドサイトのうち９７６３（〜９８％）で一致する祖先配列を生成した。各樹に、０．９８３７以上のＭＰＰのコドン閾値を適用すると、６８／３０１２（２．２％）の未解決コドン（ｕｎｒｅｓｏｌｖｅｄ ｃｏｄｏｎｓ）が残った。これらの６８コドンのうち、４２は同義コドン間から選ばれ、２６は非同義コドン間から選ばれた。共分散ネットワークは、両義性を解決するために用いた。

（実施例２）
共変動位置：６８個の未解決コドンのうち、４個は、ゲノムにおける解決位置（Ｈ７７位置１１５７、１６１１、２１２０及び６５５４）への依存に基づいて決定した。４個の位置（１１５７、１６１１、２１２０及び６５５４）は、同義の変化であった。位置１６１１と６５５４は、ゲノムにわたって複数のサイトリンクしており（それぞれ５０と３）、位置１１５７と２１２０は、１つの他の解決位置にリンクしていた。共変動は、統計的にのみ検出され、生物学的な結合については更なる研究における課題である。

（実施例３）
Ｂｏｌｅ１ａの代表的な特徴：一旦、Ｂｏｌｅ１ａの完全な代表的な配列が決定されると、Ｂｏｌｅ１ａが、ヌクレオチド又は蛋白のＨＣＶサブタイプ１ａ配列のあらゆるセットを表すもので、再構築されたもの由来の単なる配列でないことを確かることが望まれていた。これを確かめるため、確認のために２つの追加データセットを用いた。第一のデータセットは、Ｙｕｓｉｍらの論文（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９１：１１９４−１２０６（２０１０））からであり、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ ＨＣＶデータベースから収集された。このデータセットは、１４３シーケンスを含み、それらのうち１３６は、オリジナルデータセットに存在するが、その報告の著者らは、関連する配列をリサンプリングするのを避けるために、データセットを精選した（ｃｕｒａｔｅｄ）。このデータセットは、Ｙｕｓｉｍデータセットと呼ばれる。第２のデータセット（Ｅ１Ｅ２データセットと呼ばれる）は、２１４のＥ１Ｅ２配列を含む。これらは、我々が進行中のＢＢＡＡＳＨコホートから得られたものである。後者データセットの配列は、ジェンバンクでの、又は、ＬＡＮＬデータベースからの全長の配列に関するものではない。近接結合樹は、Ｂｏｌｅ１ａは中心から連続して枝分かれしていることから、Ｂｏｌｅ１ａは、ＹｕｓｉｍデータセットやＥ１Ｅ２データセットの両方の代表であることが示唆される（図１）。

全長ゲノムの対比較によると、Ｂｏｌｅ１ａは、オリジナルデータセットにおける他のどの配列よりもサブタイプ１ａ配列への類似性が高い（図２ａでは、非同義距離の平均低下及び中央値低下は、それぞれ、３９％と４４％である）。ゲノムにおける２０コドン（Ｔ細胞エピトープのサイズでの上限制限に近似する）のスライディングウィンドウでは、Ｂｏｌｅ１ａの類似性は、全体で９８％より高い（類似性の平均及び中央値は、それぞれ、９８．４％と９８．９％であった）。驚くべきことではないが、Ｂｏｌｅ１ａと循環しているゲノムであるサブタイプ１ａとの間での類似性が低いのは、高頻度可変性領域１（ＨＶＲ１）であった。ＨＶＲ１での類似性は、７３％程度の低さであった（同じ位置で単離されたサブタイプ１ａの間での類似性は６４％であった）。（ｉ）Ｂｏｌｅ１ａ配列と、（ｉｉ）オリジナルデータセット、Ｈ７７、ＨＣＶ−１、及び１ｂの配列の共通配列と、の比較から、ＨＶＲ１における変動性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）が示された（図２ｂのアスタリスクで示すように）。

Ｂｏｌｅ１ａアミノ酸配列の全ての９残基アミノ酸を、潜在的なエピトープカバー度を表すために、Ｙｕｓｉｍデータセットにおける配列と比較した。本比較のために、９残基アミノ酸を用いたのは、典型的なＭＨＣクラスＩ依存エピトープ長さに基づくものであり、そうしたエピトープ長さは、ＨＣＶ感染の自発的な排除における免疫制御の重要な成分である、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるものである。Ｙｕｓｉｍデータセット又はオリジナルデータセットと比較すると、Ｂｏｌｅ１ａは、ＨＣＶポリプロテインにおける、正確に一致する９残基アミノ酸のカバー度が、７８％を示した（データは不掲載、方法はＹｕｓｉｍに記載）。Ｅ１Ｅ２データセットの高多様性のＥ１領域及びＥ２領域においては、Ｂｏｌｅ１ａは、正確に一致する９残基アミノ酸のカバー度が、５８％であった。Ｙｕｓｉｍのデータセットについて個々の蛋白で比較した結果、Ｅ１やＥ２のような不均一性が高い領域は、コアやＮＳ４Ｂのような保存性の高い領域よりも、Ｂｏｌｅ１ａによるカバー度が低いことが確認された。全てのケースにおいて、Ｂｏｌｅ１ａは、レファレンス配列のＨ７７より、優れた９残基アミノ酸のカバー度を示した。Ｂｏｌｅ１ａは、全長ゲノム比較において、１個又は２個の位置での不一致が許容された状況では、いずれの９残基アミノ酸でも９９％の一致を示した。要するに、Ｂｏｌｅ１ａは、ゲノムの各位置における、全ての様式（最も頻繁に観察される）の９残基アミノ酸が９５％の一致であることが分かり、Ｙｕｓｉｍデータセットにおける個々の配列では、中央値様式での９残基アミノ酸のカバー度が８０％であった（図３ａ）。

（実施例４）
９残基アミノ酸のカバー度の比較において認められる明らかな制限は、全ての９残基アミノ酸がＴ細胞エピトープとして認識されるものではないからである。エピトープカバー度に焦点を当てるために、公知のサブタイプ１ａのＴ細胞エピトープの全て（ＣＤ４とＣＤ８の両方）を、免疫エピトープデータベース（ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／）から選択した。これらのエピトープは、少なくとも１アッセイでポジティブな結果を得たものである。データベースの５４８エピトープのうち、３３８のエピトープが、Ｙｕｓｉｍデータセット配列の少なくとも半分に存在していた（ＡＦ２７１６３２及びＡＸ１００５６３は、それぞれがＨＣＶ−１及びＨ７７と関連することにより除かれる）。Ｂｏｌｅ１ａは、これらの３３８エピトープの最高カバー度（１００％）を示した（図３ｂ）。ＨＣＶ−１やＨ７７は、ＨＣＶ免疫において抗原として共通に用いられているが、これらの３３８エピトープのうち、それぞれ、３１７と３１６（〜９３％）の一致にすぎない。図３ｂは、Ｙｕｓｉｍデータセットにおける全ての配列のエピトープカバー度の分散を示している。配列の８０％に存在したエピトープが含まれるとき、Ｂｏｌｅ１ａは９４％のカバー度を示し、Ｈ７７とＨＣＶ−１は、それぞれ、８７％と９１％のカバー度を示した（データ非掲載）。ＨＣＶ−１やＨ７７が、これらのエピト―プが派生する多くの研究で抗原として用いられてきた第１の分離株であったので、これらのカバー度は、分析バイアスが部分的に入ったことによるものかもしれない。最後に、エピトープの変異体をインターフェロンガンマ エリスポット分析で測定したところ、Ｂｏｌｅ１ａゲノムにおける変異体は、Ｈ７７や単純な共通配列を含む、他の配列よりも連続して免疫原性があることが示されている（データ非掲載）。

（実施例５）
Ｂｏｌｅ１ａ偽粒子：レンチウィルス偽粒子を使用したとき、個々のＥ１Ｅ２試験単離体の約７５％が、低い感染活性であった（バックグランドよりも５標準偏差だけ高い値未満）（図４）。エンベロープ遺伝子の多様性は、非常に高く、２０コドンウィンドウにおける非同義の多様性平均３６％を伴う（図２）。この多様性や我々の手法の結果として、Ｂｏｌｅ１ａは、我々が調査したゲノムの中でも特徴的なＨＶＲ１配列（ＥＴＨＶＴＧＧＳＡＡＲＡＴＡＧＦＡＧＬＦＴＰＧＡＫＱＮ）（配列番号３）であり、ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）やＨＭＭＥＲ（ｈｍｍｅｒ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ）を用いたこのペプチド配列の調査でも、同一配列は見つからなかった。感染力ためのネガティブな予測因子であるが機能を測定するために、Ｂｏｌｅ１ａのＥ１Ｅ２配列をレンチウィルス偽粒子に再構成して用いた。驚いたことに、ＨＣＶｐｐ−Ｂｏｌｅ１ａは、Ｈｅｐ３Ｂ標的細胞に、高感染性で十分に特徴付けされた単離ＨＣＶｐｐ−Ｈ７７に匹敵する高効率で感染した（図４）。Ｂｏｌｅ１ａ ＨＣＶｐｐを抗ＣＤ８１抗体でブロッキングすると、感染力で少なくとも１０倍減少し（ｐ＝０．０００８）、一方、アイソタイプコントロール抗体は感染力が変化しなかった（ｐ＝０．８５；図４）。閾値より低いＲＬＵ値（図４）は、高分散で複製能が低いことが分かった。サブタイプ１ａ ＨＣＶｐｐの比較パネルにおいて、ストップコドン、フレームシフト変異、若しくは他の明確な欠損を含むものは除外しているが、これらのクローンの多くで感染力低下を起こしたという、他の生物学的特徴が若しくは人為的特徴があることは、明白である。重要なことに、この実験の目的は、Ｂｏｌｅ１ａ Ｅ１Ｅ２が、それらの合成起源やＨＣＶエンベロープの高可変性にもかかわらず、全てにおいて機能的であるか否かを決定することである。すなわち、このＥ１Ｅ２はＨＣＶｐｐシステムにおいて感染性であることは、全く予期しないものであった。更に、Ｂｏｌｅ１ａ ＨＣＶｐｐは、ヒト血清で容易に中和された。ＢＢＡＡＳＨ被験者の３０％が、エントリーの少なくとも８５％を阻害し、ＢＢＡＡＳＨコホートからの被験者の９０％（４０中３６）で、Ｂｏｌｅ１ａ ＨＣＶｐｐエントリーの少なくとも５０％を阻害し、一方で、ノーマルヒト血清やＨＣＶ血清陰性のプール血清では、非中和が観察された。

この概念証明実験によって、Ｂｏｌｅ１ａエンベロープＥ１Ｅ２ヘテロダイマーは、折りたたみと会合を正確にできることが分かった。ＨＣＶ Ｅ１とＥ２遺伝子は、宿主細胞へのエントリーに重要であるため、抗体を介したウィルス中和の重要な標的でもある。免疫学的に操縦される明らかなエスケープ変異を欠いているため、Ｂｏｌｅ １ａは、ＨＣＶ適応度を決定する研究の理想的な基盤を表すであろう。

（実施例６）
予備解析から、Ｂｏｌｅ１ａからのエピトープは、試験された単離物の中で最も免疫原性が高いことが示された。Ｂｏｌｅ１ａエピトープが従来の見解と異なるというこれらの場合（１５試験中２試験）では、慢性的に感染した患者から得たＴ細胞は、循環配列や共通配列からの対応するエピトープよりも、Ｂｏｌｅ１ａエピトープをよく認識した（データ非掲載）。Ｂｏｌｅ１ａは、循環する株の代表であるから、ウィルス適応性を阻害するエスケープ変異を含むことはないようである。例えば、Ｂｏｌｅ１ａ配列は、位置１４４４にＹを有し、一方、その位置のＦは、エスケープ変異であると信じられている。そのエスケープ変異は、ＮＳ３の１４３６−１４４４エピトープに、あまり強くないＴ細胞反応を引き起こすものである。更に、Ｂｏｌｅ１ａは、ＫＬＶＡＬＧＩＮＡＶ（配列番号４）配列をＮＳ３の１４０６−１４１６に含む。このエピトープの３つの変異体は、これらの変異体を最も解釈しやすいエスケープをするＭＨＣ結合能における変化を伴わずに、Ｔ細胞反応を減少させることを示した。

（実施例７）
上記に記載の本発明の方法を用いることで、２つの追加の合成ＨＣＶゲノムポリヌクレオチド配列を調製した。配列は、第２のＨＣＶサブタイプ１ａ（配列番号５）とその分離されたアミノ酸配列（配列番号６）、ＨＣＶサブタイプ１ｂ（配列番号７）とその分離されたアミノ酸配列（配列番号８）である。

本願で引用した、文献、特許出願、及び特許を含むすべての参考文献は、各参考文献が、個別に及び特に示されて参照することにより援用され、完全に本明細書で説明したものとされるのと同じ程度に、参照することにより本明細書に援用される。

発明を記載する文章中（特に、以下のクレームの文章）で、用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び同様の指示語の使用は、本願に別段の指示がない限り、又は明確に文書中で否定されない限り、単数と複数の両方をカバーするように構成される。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」「ｈａｖｉｎｇ」「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」は、記載された別段の指示がない限り、オープンエンド用語（例えば、含まれることを意味するが、それに限定するものではないとの意味）として構成される。本願での値の範囲の記述は、本願に別段の指示がない限り、範囲に含まれる各区切られた値を単独に参照する、簡単な方法として機能しており、本願で個々に繰り返すかのように、各個別の値が明細書中に組み込まれる。本願に記載される全ての方法は、本願に別段の指示がない限り又は文章中で明確に否定されない限り、任意な適切な順序で実施することができる。本願で用いる、いかなる全ての例示もしくは、例示の言語（例えば「ｓｕｃｈ ａｓ」）は、別段のクレームがない限り、単に発明をよく説明するために用いるだけで、発明の範囲を限定することをもたらすものではない。明細書中のいかなる言語も、クレームされていない要素を、発明の実施に不可欠なものとする解釈をしてはならない。

本発明の好適な実施形態は、明細書に記載してあり、発明者が認識している、発明を実施するためのベストモードを含む。これらの好ましい実施形態における変形は、先行技術文献を読むその分野の通常の知識を有する者にとって、明白である。発明者は、通常の知識を有する当業者が、そのような変形を適当なものとして採用することを期待しており、さらに発明者は、本願で特に記載された事項以外で実施されることも意図している。したがって、本発明は、適用法で許容される、本文添付のクレームに記載の主題と、適用法で許容される全ての修正と均等物を含む。さらに、明細書に別段の指示がなく、文章中で明らかに否定されない限り、上記記載の要素の組み合わせから派生しうる全ての変形型の中で、上記記載の要素のいかなる組み合わせをも、本発明によって包含される。

Claims (10)

1. 配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列の相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む合成のＣ型肝炎ウィルスサブタイプ１ａ（Ｂｏｌｅ１ａ）のゲノムを符号化する核酸分子。
2. 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む単離された宿主細胞。
3. 宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項２に記載の単離された宿主細胞。
4. 請求項１に記載の核酸によって符号化される単離されたポリペプチド。
5. 配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
6. （ａ）配列番号１の配列の該当する部分に符号化されるコア配列の最後の２７アミノ酸と、続くＥ１とＥ２領域のアミノ酸配列と、
   （ｂ）レポーターエレメントを含む、ウィルス粒子。
7. 前記レポーターエレメントが、ルシフェラーゼポリ蛋白又は該ルシフェラーゼポリ蛋白の機能的部位である、請求項６に記載のウィルス粒子。
8. 配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドのコア領域の最後の２７アミノ酸、並びにＥ１及びＥ２領域のアミノ酸配列を含む、ＨＣＶ抗原。
9. 請求項８に記載の抗原を含む、ＨＣＶに感染した対象を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、対象における前記抗原に対する免疫応答を刺激するのに十分な量で、対象に投与され、前記免疫応答が、対象におけるＨＣＶのウィルス量を減らすのに十分である、医薬組成物。
10. （ａ）２以上のＨＣＶポリヌクレオチド配列を得て、
    （ｂ）適切なアラインメントプログラムを用いてポリヌクレオチド配列を整列させ、
    （ｃ）前記（ｂ）において、系統樹用のパラメーターの収束を確認するための十分な繰り返しのために、アライメントの系統学的に有益な情報の２つの領域を適用したベイジアン法又は最尤法を用いて、２以上の系統樹をアライメントから作製し、
    （ｄ）評価に用いるプログラムが、各位置における確率分布として祖先配列を推測しなければならず、各塩基における確率を発生させるもので、系統樹及び推測された祖先配列の両方を、ＨＣＶゲノムの残部の祖先配列を推測するために用い、
    （ｅ）次の方法（方法Ｉ及びII）、すなわち、
    ゲノムにおける各ヌクレオチド位置ｉにおいて、両樹の最大事後確率（ＭＭＰ）残基が一致する場合、その位置における確率（ｐｉ）は、２つのＭＭＰｓのうち高いものが選択され、これらの位置は合致として確定し、
    各不一致位置（ＭＰＰ残基が一致しない位置）において、直接ステップ（ｆ）へ進み（方法Ｉ）、又は、両樹に基づく不一致位置を含むコドンｋの結合確率を計算し（方法II）、
    該コドン中の一致残基においては、前記ステップで計算されるｐｉが結合確率を計算するのに用いられ、
    ２つの樹から高い結合ＭＰＰを有するコドンが、そのコドン位置の代表に選択される方法で最終代表配列を推測し、
    （ｆ）二次導関数での相違が１０^−６より低いＭＰＰ値での、コドン／ヌクレオチドＭＰＰｓの分布における変曲が、コドン／ヌクレオチドを解決するための閾値として用いられ、
    各樹に基づく閾値以上のＭＰＰを有する各コドン／ヌクレオチドは、祖先のものとして受け入れられ、その構成の位置は解決位置と確定されるように、コドン／ヌクレオチドＭＰＰのためのストリンジェントな閾値を決定し、
    （ｇ）観察及び予期される塩基組合せの頻度が決定され、カイ二乗測定基準は、式１に示されるように計算され、ホルム−ボンフェローニ法（α＝０．０５）を用いた多重比較法により調整され、未解決位置を決定するために共分散分析を使用し、
    （ｈ）未解決位置ｉと著しく共変動する全ての解決位置ｊを同定する、調整されたカイ二乗測定基準を用い、正の相互作用の場合（ｏｉｊ＞ｅｉｊ）、正に相互作用する残基を含むＭＰＰコドン／ヌクレオチドが選択され、負の相互作用の場合（ｏｉｊ＜ｅｉｊ）、負に相互作用する塩基を含む全てのコドン／ヌクレオチドが除かれ、残りからＭＰＰコド
    ンが選択され、そして、
    （ｉ）合成のＨＣＶポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの断片若しくは一部を合成する、
    合成のＨＣＶウィルスポリヌクレオチドの調製方法。