JPWO2009011413A1 - エピトープタグ化c型肝炎ウイルス粒子の作製と利用 - Google Patents
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Abstract
Description
HCVに対する治療薬を開発するためには、感染性HCV粒子やHCVが増殖するメカニズムを研究するための細胞培養系が必要である。これまで、HCVを効率よく増殖させることのできる実験系としては、チンパンジーを用いた動物実験系のみしか存在しなかったことが、HCV治療薬の開発の遅れの主たる原因であった。しかし、2005年に脇田らによって、細胞培養系で感染性ウイルスを作製する技術が開発され(特許文献1および2、非特許文献2)、感染性HCV粒子を用いて、HCV治療薬を開発することが可能となった。
このような状況にあって、細胞培養系で産生された感染性HCV粒子を精製するための公知の技術(特許文献2および非特許文献3)よりも、簡便かつ高純度に感染性HCV粒子を精製する新たな技術開発の必要性がある。
細胞培養系で得られたタンパク質を簡便にかつ高純度に精製する方法としては、目的タンパク質を標識となるタンパク質との融合タンパク質として発現させ、標識となるタンパク質に対する抗体やこれに特異的に結合する分子で融合タンパク質を精製する技術が知られている。
標識となるタンパク質はエピトープタグあるいは単にタグ(Tag)と呼称される。エピトープタグとしては、FLAGペプチド、3XFLAGペプチド、HAペプチド,3XHAペプチド、mycペプチド、6XHisペプチド、GSTポリペプチド、MBPポリペプチド、PDZドメインポリペプチド、TAP(Tandem Affinity Purification)ペプチド、アルカリフォスファターゼ、アビジンなどが知られている。これらのペプチドまたはポリペプチドは、通常目的のタンパク質のN末端またはC末端に融合されるが、場合によっては目的のタンパク質内に挿入することもできる。
しかし、タンパク質にエピトープタグを付加する際に、タンパク質の種類、エピトープタグの種類、タンパク質上のエピトープタグの付加位置などによって、タンパク質本来の生物活性や立体構造が変化しないという保証はない。そのためタンパク質毎、エピトープタグの種類毎、さらにはエピトープタグの付加位置毎にエピトープタグ化タンパク質の生物学的機能を調べる必要がある。
HCVのゲノムは、約9600ヌクレオチドからなる(+)鎖の一本鎖RNAである。このゲノムRNAは、5’非翻訳領域(5’NTRまたは5’UTRとも表記する)、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、および3’非翻訳領域(3’NTRまたは3’UTRとも表記する)からなる。その構造領域にはHCVの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。
このようなHCVの構造タンパク質(Core、E1、E2およびp7)と非構造タンパク質(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、およびNS5B)は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。構造タンパク質のうち、Coreはコアタンパク質であり、E1およびE2はエンベロープタンパク質である。非構造タンパク質はウイルス自身の複製に関与するタンパク質であり、NS2はメタロプロテアーゼ活性、NS3はセリンプロテアーゼ活性(N末端側の3分の1)とヘリカーゼ活性(C末端側の3分の2)を有することが知られている。さらに、NS4AはNS3のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、NS5BはRNA依存RNAポリメラーゼ活性を有することも報告されている。
HCVはエンベロープと呼ばれる被膜で包まれている。エンベロープは宿主細胞の膜に由来する成分とウイルスに由来するタンパク質からなる。HCVのエンベロープを構成するタンパク質は、エンベロープタンパク質1(E1と呼称する)、エンベロープタンパク質2(E2と呼称する)およびp7からなる。特にE1およびE2はそのC末端に膜貫通領域を持っており、HCVの膜にこの膜貫通領域を介してアンカーされ、HCV粒子形成や感染に関与している(非特許文献4、非特許文献5)。
E2タンパク質のアミノ末端側にはウイルス株間で著しく配列の異なるところが2カ所存在し、超可変領域1(HVR1と呼称する)と超可変領域2(HVR2と呼称する)と命名されている(非特許文献6)。HVR1はE2タンパク質のアミノ末端部分の27アミノ酸からなり、E2タンパク質の表面に露出してB細胞エピトープになっている。HVR1のアミノ酸配列の多様性は最大80%を示すがアミノ酸が保存されている部分も数カ所認められることから、ウイルスの生存にはある一定の2次構造が必要であると考えられている。さらにHVR1にはシステイン残基やアスパラギン結合型糖鎖付加シグナルはほとんど存在しない。一方、HRV2は7アミノ酸よりなり、E2タンパク質のアミノ末端より91−97番目に位置している。HRV2はHCV1b型のゲノムに存在するが、他の遺伝型のHCVには存在しない。
HCVにおいてウイルス粒子にエピトープタグが挿入された例としては、JFH−1株(HCV2a型)のE2タンパク質のHVR1がHAペプチドに置換されたものが公知であり、感染性を有することが確かめられている(非特許文献2)。しかしながら、この感染性エピトープタグ化HCV粒子が高純度に精製できたとの報告はない。
本発明者らは、HCV粒子の細胞培養での生産性および感染性に影響しないエピトープタグの種類およびエピトープタグを付加するHCVタンパク質と付加位置との組み合わせを検討し、本発明の第一の目的であるエピトープタグ化HCV粒子の作製に成功した。さらに、このHCV粒子を高生産するクローンを作製し、産生されたエピトープタグ化HCV粒子が抗エピトープタグ抗体カラムを用いて1ステップで高純度に精製できることを確認し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の(1)〜(15)に関する。
(1) 下記の(a)、(b)または(c)を含む核酸であって、(a)、(b)または(c)のE2タンパク質コード配列の超可変領域1(HVR1)にエピトープタグペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸。
(a)C型肝炎ウイルス(HCV)のJFH−1株のゲノム
(b)HCVのJ6CF株の5’非翻訳領域、Coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列、ならびに、JFH−1株のNS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域、を含むキメラHCVゲノム
(c)HCVのJFH−1株の5’非翻訳領域、TH1株のCoreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列、ならびに、JFH−1株のNS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域、を含むキメラHCVゲノム
(2) 上記エピトープタグペプチドは、DYKDDDDKまたはDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKからなるアミノ酸配列を含む、上記(1)に記載の核酸。
(3) 上記エピトープタグペプチドは、リンカー配列をさらに含む、上記(1)または(2)に記載の核酸。
(4) 上記リンカー配列は、GGG配列、GGGGS配列もしくは(GGGGS)3配列、または、GGG配列、GGGGS配列もしくは(GGGGS)3配列の一部において1〜10個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含むリンカー配列である、上記(3)に記載の核酸。
(5) 配列番号11、12、30、31、41または42で示される、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の核酸(ただし核酸がRNAの場合は配列表の塩基記号「T」は「U」に読み替えるものとする)。
(6) 上記超可変領域1(HVR1)の最後の配列の次のアミノ酸を1番としたとき、122番目または124番目のアミノ酸であるアスパラギンをリジンに置換する変異を含む、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の核酸。
(7) 配列番号20または21で示される、上記(6)に記載の核酸(ただし核酸がRNAの場合は配列表の塩基記号「T」は「U」に読み替えるものとする)。
(8) 上記(1)〜(7)のいずれかに記載の核酸を含有するベクター。
(9) 上記(1)〜(7)のいずれかに記載の核酸をゲノムとして含有するエピトープタグ化HCV粒子。
(10) 上記(9)に記載のエピトープタグ化HCV粒子を含有する細胞。
(11) Huh7またはその派生株である、上記(10)に記載の細胞。
(12) 上記(10)または上記(11)に記載の細胞からエピトープタグ化HCV粒子を生成する生成ステップと、
上記エピトープタグ化HCV粒子を含有する液体を抗エピトープタグ抗体固定化担体に接触させ、そのエピトープタグ化HCV粒子を抗エピトープタグ抗体固定化担体に吸着させる吸着ステップと、
上記エピトープタグ化HCV粒子を上記抗エピトープタグ抗体固定化担体から遊離させてエピトープタグ化HCV粒子を得る遊離ステップと、
を備える、エピトープタグ化HCV粒子の精製方法。
(13) 上記遊離ステップは、エピトープタグペプチド含有緩衝液、カルシウム不含緩衝液、pH2.5〜pH4.0の0.1Mグリシン緩衝液、pH4.0〜pH5.0の1Mアルギニン塩酸緩衝液または0.1mM〜1mMの塩酸のいずれかを用いて、上記抗エピトープタグ抗体固定化担体から上記エピトープタグ化HCV粒子を遊離させる、上記(12)に記載の精製方法。
(14) 上記(9)に記載のエピトープタグ化HCV粒子を不活化して得られるHCVワクチン。
(15) 抗原としての上記(9)に記載のエピトープタグ化HCV粒子に対する抗HCV抗体。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2007−184587号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図2A、図2Bおよび図2Cは、pJ6/JFH−1(1XFLAG)、pJ6/JFH−1(3XFLAG)プラスミドの構築図を示す。図2Bは、図2Aの続きであり、図2Cは、図2Bの続きである。
図3は、J6/JFH−1 RNAおよびJ6/JFH−1(3XFLAG)RNAをHuh−7細胞に導入後の培養上清中のHCV Coreタンパク質量の変化を示す。J6/JFH−1ではその産生量に変化はなかったが、J6/JFH−1(3XFLAG)ではCore産生量が22日目まで減少したが、その後、増加し35日目でJ6/JFH−1とほぼ同じ産生量となった。
図4は、J6/JFH−1 RNAおよびJ6/JFH−1(3XFLAG)RNAをHuh−7細胞に導入後、4,17,30,43日目のHCV CoreおよびE2タンパク質の発現を示す。J6/JFH−1(3XFLAG)において、30,43日目のE2タンパク質の分子量は4日目よりも低くなっていることが示された。
図5は、J6/JFH−1(3XFLAG)RNAをHuh−7細胞に導入後、4,17,30,43日目のHCVE2タンパク質をエンドグリコシダーゼ(PNGase F)で処理したときの挙動を示す。エンドグリコシダーゼ処理することにより、図4で見られたような分子量の違いは見られなくなった。
図6は、J6/JFH−1(3XFLAG)RNA導入後、8日目と39日目のHCVゲノムの配列解析を示す。RNA導入後から39日目でE2領域の糖鎖付加部位であるアスパラギン(N6)がリジン(K)に置換されていた。
図7は、J6/JFH−1(3XFLAG)ウイルスの精製溶液中のHCV Coreタンパク質量を示す。1XFLAGペプチドまたは3XFLAGペプチド溶出によりHCV Coreタンパク質が検出されたことから、HCV粒子の精製が確認された。
図8は、精製したJ6/JFH−1(3XFLAG)ウイルス溶液中に含まれる夾雑タンパク質について示す。精製したウイルス溶液中には夾雑タンパク質はほとんど含まれていなかった。
図9は、精製したJ6/JFH−1(3XFLAG)ウイルスの感染性について示す。各ウイルスを感染後、4日目の細胞内のHCV RNAを定量した。精製したウイルスは未精製のウイルスと同等の感染性を有することが確認された。
図10A、図10Bおよび図10Cは、pJ6/JFH−1(1XFLAG)N→K、pJ6/JFH−1(3XFLAG)N→Kプラスミドの構築図を示す。図10Bは、図10Aの続きであり、図10Cは、図10Bの続きである。
図11は、HCV E2の構造図を示す。N1〜N11は糖鎖付加部位、HVRはHyper Variable Region、TMDはTrans Membrane Domainを示す。JFH−1のE2 HVR1のアミノ酸の一部(下線)の部分を除き、そこにFLAGタグ配列(下線)を挿入した。
図12A、図12Bおよび図12Cは、pJFH−1(1XFLAG)、pJFH−1(3XFLAG)プラスミドの構築図を示す。図12Bは、図12Aの続きであり、図12Cは、図12Bの続きである。
図13は、HCV E2の構造図を示す。N1〜N11は糖鎖付加部位、HVRはHyper Variable Region、TMDはTrans Membrane Domainを示す。pTH/JFH−1のE2 HVR1のアミノ酸の一部(下線)の部分を除き、そこにFLAGタグ配列(下線)を挿入した。
図14A、図14Bおよび図14Cは、pTH/JFH−1(1XFLAG)、pTH/JFH−1(3XFLAG)プラスミドの構築図を示す。図14Bは、図14Aの続きであり、図14Cは、図14Bの続きである。
また、本明細書中に引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が本明細書に参考として、援用される。
1.エピトープタグ化HCV粒子
本発明にかかる「エピトープタグ化HCV粒子」とは、HCVの構造タンパク質内にエピトープタグペプチドが付加されたHCV粒子を意味する。このエピトープタグ化HCV粒子は、細胞培養系で生産でき、好ましくは感染性を保有している。
細胞培養系でHCV粒子を生産するためには、JFH−1株由来の全長遺伝子、またはJFH−1株と他のHCV株とのキメラ遺伝子を用いる必要があり、その基本技術は、WO04104198A1、WO06022422A1、Wakita,T.et al.,Nat.Med.11:791−796,2005、およびLindenbach,BD.et al.,Science 309:623−626,2005に記載されている。
すなわち、HCV粒子を生成できる遺伝子の1つの形態は、JFH−1株のウイルスゲノムRNAであって、5’側から3’側に順番に、5’非翻訳領域、Coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域からなるRNAである。
HCV粒子を生成できる遺伝子の別な形態は、2種類以上のHCV株のウイルスゲノムRNAからなるキメラ遺伝子であって、たとえば、5’側から3’側に順番に、JFH−1株以外のHCV株の5’非翻訳領域、Coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列およびNS2タンパク質コード配列、ならびに、JFH−1株のNS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域からなるRNAである。
具体的には、HCV粒子を生成できる遺伝子としては、下記の(a)、(b)および(c)の核酸、すなわち、
(a)5’側から3’側に順番に、JFH1株のゲノム(すなわちJFH−1株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域を含む核酸:(配列番号30:pJFH−1(1XFLAG)、配列番号31:pJFH−1(3XFLAG)参照))
(b)5’側から3’側に順番に、J6CF株の5’非翻訳領域、Coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列、ならびに、JFH−1株のNS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域を含むキメラHCVゲノム(好ましくは、5’側から3’側に順番に、J6CF株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、およびNS2タンパク質コード領域のN末端16アミノ酸残基までコードする配列、ならびに、JFH−1株のNS2タンパク質コード領域のN末端17アミノ酸残基からC末端までコードする配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域からなるキメラHCVゲノム:配列番号10:pJ6/JFH−1、配列番号11:pJ6/JFH−1(1XFLAG)、配列番号12:pJ6/JFH−1(3XFLAG)参照)
(c)5’側から3’側に順番に、JFH1株の5’非翻訳領域、TH1株のCoreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列、ならびに、JFH−1株のNS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域を含むキメラHCVゲノム(好ましくは、5’側から3’側に順番に、JFH−1株由来の5’非翻訳領域、TH株のCoreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、およびNS2タンパク質コード領域のN末端33アミノ酸残基までコードする配列、ならびに、JFH−1株のNS2タンパク質コード領域のN末端34アミノ酸残基からC末端までコードする配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域からなるキメラHCVゲノム:配列番号40:pTH/JFH1、配列番号41:pTH/JFH1(1XFLAG)、配列番号42:pTH/JFH1(3XFLAG)参照)、を挙げることができる。
本発明では、上記HCVゲノムに対し、そのE2タンパク質コード配列の超可変領域1(HVR1)中にエピトープタグペプチドであるDYKDDDDKGGG(配列番号49)またはDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGGG(配列番号50)をコードする核酸配列をインフレームで挿入するか、または当該領域の一部を上記エピトープタグペプチドで置換し、エピトープタグ化HCVゲノムDNAを作製する。そして、このDNAを用いて「エピトープタグ化HCV粒子」を培養細胞系で産生させ、高純度で精製されたエピトープタグ化HCV粒子を取得する。
2.エピトープタグ化HCV粒子の作製
(1)HCV構造タンパク質内にエピトープタグを持つHCVゲノムDNAの作製
本明細書で用いられる「エピトープタグ(あるいは単にタグ(Tag)と呼称する)」は、HCVの標識に使用可能のものであれば特に限定されるものではないが、たとえば、FLAGペプチド(flagペプチド、Flagペプチドとも呼称する)、3XFLAGペプチド(3xFLAGペプチド、3xFlagペプチド、3Xflagペプチドとも呼称する)、HAペプチド、3XHAペプチド、mycペプチド、6XHisペプチド、GSTポリペプチド、MBPポリペプチド、PDZドメインポリペプチド、TAP(Tandem Affinity Purification)ペプチド、アルカリフォスファターゼ、アビジン等を挙げることができる。本発明においては、エピトープタグペプチドとしてFLAGペプチド(アミノ酸配列:DYKDDDDK(配列番号51))または3XFLAFGペプチド(アミノ酸配列:DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK(配列番号52))を用いるが、なかでも3XFLAGペプチドがより好適である。
上記エピトープタグを付加する場所はHCV粒子のE2タンパク質のHVR1領域である。エピトープタグは、HVR1領域内において各HCV株間での相同性が低いE2タンパク質のN末端から数えて、8〜19番目アミノ酸の間にインフレームで(読み枠がズレないように)挿入するか、あるいは上記N末端の11〜17番目のアミノ酸を除去して、ここにエピトープタグペプチドを挿入するのがより好適である。
上記エピトープタグのC末端には、必要に応じて適当なリンカーを付加する。リンカーとして、アミノ酸配列GGG(配列番号53)、GGGGS(配列番号54)、または(GGGGS)×3((GGGGS)3ともいう)、あるいは、これらのアミノ酸配列の一部に、1〜10個程度、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜2個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含むペプチドが使用され、好適な例としてGGG、GGGGS(配列番号54)、(GGGGS)×3が挙げられるが、GGGがより好適である。
上記エピトープタグをコードする核酸をHCVゲノムに導入する方法としては、エピトープタグをコードする核酸配列を含む合成プライマーでHCVゲノムのcDNAを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、得られたPCR産物を適宜制限酵素処理、ライゲーション処理によりHCVゲノムのcDNAに組み換える方法が挙げられる。これらの手法の例は、後述の実施例に示されている。
使用するHCV株は限定されるものではなく、HCV株の塩基配列を用いた系統解析法によって分類される遺伝子型1a(例えばH77株(GenBank アクセッション番号AF011751))、遺伝子型1b(例えばJ1株(GenBank アクセッション番号D89815)、Con1株(GenBank アクセッション番号AJ238799、Con−1株、con1株と称することもある)、TH株(Wakita,T.et al.,J.Biol.Chem.,269,14205−14210,1994、特開2004−179))、遺伝子型2a(例えばJFH−1株(GenBank アクセッション番号AB047639、JFH1株と称することもある)、J6CF株(GenBank アクセッション番号AF177036)、JCH−1(GenBank アクセッション番号AB047640)、JCH−2(GenBank アクセッション番号AB047641)、JCH−3(GenBank アクセッション番号AB047642)、JCH−4(GenBank アクセッション番号AB047643)、JCH−5(GenBank アクセッション番号AB047644)、JCH−6(GenBank アクセッション番号AB047645))、遺伝子型2b(例えばHC−J8株(GenBank アクセッション番号D01221))、遺伝子型3a(例えばNZL1株(GenBank アクセッション番号D17763))、遺伝子型3b(例えばTr−Kj(GenBank アクセッション番号D49374))の6タイプのいずれに属する株を使用することができる。本明細書の実施例においては、本発明の好ましい例として、非構造タンパク質コード配列および3’非翻訳領域はJFH−1株由来のもので、5’非翻訳領域および構造タンパク質コード配列がTH1株、JFH−1株またはJ6CF株由来の核酸配列を使用した。
HCVのHVRに所望のエピトープタグペプチドを挿入するには、HCVゲノムRNAのcDNAをクローン化したベクターを鋳型にして、エピトープタグペプチドをコードした合成DNAをプライマーとして、PCRを行う。これにより、エピトープタグが目的の場所に付加/挿入されたエンベロープタンパク質をコードするcDNAを得ることができる。
さらに、エピトープタグを持つエンベロープタンパク質をコードするcDNA断片を適切な制限酵素で消化して単離し、T7プロモーターなどのプロモーターの下流に完全長のHCVゲノムRNAのcDNAをクローン化したベクターを上記と同じ制限酵素で消化し、同じ位置に単離したエピトープタグ配列を持ったエンベロープタンパク質をコードするcDNA断片を挿入することでエピトープタグを有する完全長HCV cDNAを得ることができる。
ここで使用する完全長のHCVゲノムRNAのcDNAをクローン化したベクターは、このベクターから転写されたRNAをHuh7細胞などのHCV許容性細胞に導入すると、HCV粒子を産生可能なものであり、その構造や作製の詳細はWO04104198A1、WO06022422A1、Wakita,T.et al.,Nat.Med.11:791−796,2005、Lindenbach,BD.et al.,Science 309:623−626,2005に記載されている。
(2)細胞培養系によるエピトープタグ化HCV粒子の産生
プロモーターの制御下にエピトープタグコード配列を持つHCV cDNAからRNAを合成し、このRNAを細胞に導入することでエピトープタグ化HCV粒子を含有する細胞が得られ、上記細胞を培養することでエピトープタグ化HCV粒子を作製することができる。プロモーターとしては、限定するものではないが、T7プロモーター、SP6プロモーター、T3プロモーターが挙げられるが、T7プロモーターが特に好ましい。
T7プロモーターの制御下にHCV cDNAを導入し、クローン化した核酸を鋳型として、in vitroでRNAを作製するためには、MEGAscript T7 kit(Ambion社)などのキットを用いることができる。
RNAを導入する細胞は、HCV粒子形成を許容する細胞で有れば良く、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY−N9細胞、HeLa細胞、293細胞、あるいはHuh7細胞、HepG2細胞、IMY−N9細胞、HeLa細胞または293細胞にCD81遺伝子および/またはClaudin1遺伝子を発現させた細胞が挙げられる。なかでもHuh7細胞またはHuh7細胞の派生株が好適に使用される。Huh7細胞の派生株としては、Huh7.5細胞、Huh7.5.1細胞を挙げることができる。
RNAを細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法が挙げられるが、リポフェクション法およびエレクトロポレーション法が好ましく、エレクトロポレーション法がより好適である。
RNAの代わりにcDNAを細胞に導入してもよく、この場合、エピトープタグコード配列を付加したHCV cDNAをRNAポリメラーゼIプロモーターとターミネーターとからなるベクター(Neumann,G.et al.,Virology,202:477−479,1994、WO2007/037428A1)に機能しうる態様で挿入して、RNAと同じ方法で細胞に導入し、発現させる。
細胞のウイルス粒子産生能は、培養液中に放出されたHCVウイルス粒子を構成する、例えば、Coreタンパク質、E1タンパク質、またはE2タンパク質に対する抗体を用いて評価することができる。また、培養液中のHCVウイルス粒子が含有するHCVゲノムRNAを、特異的プライマーを用いたRT−PCR法により増幅して検出することによって、HCVウイルス粒子の産生能を間接的に評価することもできる。
作製されたウイルスが感染能を有しているか否かは、HCV RNAを導入した細胞を培養して得られた上清でHCV許容性細胞(たとえばHuh7)を処理して、たとえば48時間後に上記細胞を抗コア抗体で免疫染色して感染細胞数を数えるか、上記細胞の抽出物をSDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ウエスタンブロットにて、コアタンパク質を検出することで評価できる。
(3)エピトープタグ化HCV粒子産生細胞株の取得
HCVゲノムの効率的な複製には、ゲノムの塩基配列に変異が起こることが必要であることが示されており(Lohmann,V.et al.,J.Virol.75:1437−1449,2001)、複製を向上させる変異は適合変異(adaptive mutation)と呼ばれている。上記(2)により作製したHCVゲノムRNAが導入された細胞を継代培養することで、HCV粒子を持続的に生産する細胞株を得ることができる。このように培養を続けることで、HCVゲノムに適合変異が起こり、HCV粒子生産が著しく向上することがある。
上記(a)から(c)の核酸において、HVR1配列(Puntoriero,G.et al.,EMBO J.17:3521−3533,1998)の最後の配列の次のアミノ酸を1番としたとき、122番目または124番目のアミノ酸であるアスパラギンがリジンに置換するような変異は、エピトープタグ化HCV粒子の産生する際の変異として好適である。中でも(a)または(b)の核酸では124番目のアミノ酸がアスパラギンからリジンに置換するように変異することがより好適であり、(c)の核酸では122番目のアミノ酸がアスパラギンからリジンに置換するように変異することがより好適である。この位置のアスパラギンは糖鎖の修飾を受ける領域であると考えられ、糖鎖が付加されないことが、HCV粒子の高生産性と関係があることが示唆される。
本発明での適合変異は、前述の通り継代培養によって得ることもできるが、人為的に導入することもできる。適合変異を人為的に導入する場合、変異導入用プライマーを設計し、これを用いたPCRを行なうことにより変異が導入されたDNAを合成することができる。また、突然変異体作製キットとして市販されているQuick Charge II XL Site−Directed Mutagenesis kit(Stratagene社)を用いて変異体を作製してもよい。
本発明での適合変異は、ハイブリダイゼーション技術では1アミノ酸が変異するのに必要な核酸の変異を検出することは困難であるが、HCVの遺伝子配列をシークエンスすることで確認することができる。
(4)エピトープタグ化HCV粒子の精製
エピトープタグ化HCV粒子の精製には、そのエピトープタグに結合することの出来るタンパク質を結合させた担体が用いられる。タンパク質としてはエピトープタグペプチドに対する抗体がもっとも一般的である。本発明においては、好適なエピトープタグがFLAGペプチドまたは3XFLAGペプチドであり、これらのペプチドに結合することの出来る抗FLAG抗体であるM2抗体やM5抗体を結合(固定化)させた担体(いずれもシグマ社より入手できる)等が使用できる。
FLAGエピトープタグ化HCV粒子産生細胞または3XFLAGエピトープタグ化HCV粒子産生細胞の培養上清、あるいは該HCV粒子含有液体、を抗FLAG抗体結合担体カラムにかけ、カラムをリン酸緩衝液で洗浄し、FLAGペプチドまたは3XFLAGペプチドを含む緩衝液で、抗FLAG抗体結合担体に結合したHCV粒子を溶出することができる。カルシウム依存的にFLAGペプチドに結合する抗体であるM5抗体を結合させた担体を使用する場合は、カルシウムを含有する緩衝液でHCV粒子を結合させ、カルシウム不含の緩衝液でHCV粒子を担体から溶出させることができる。
その他の溶出方法としては、抗体結合担体からのタンパク質を溶出する一般的な方法を使用することができる(Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。たとえば溶出溶液として、0.1Mグリシン緩衝液(pH2.5〜pH4.0)または1Mのアルギニン塩酸緩衝液(pH4.0〜pH5.0)が使用できる(Ejima,D.et al.,Anal.Biochem.345:250−257,2005)。さらに0.1mM〜1mMの塩酸を使用することができる。また、溶出されたHCV粒子が変性しないように、溶出後の緩衝液のpHを中性付近(pH6.0〜pH8.0)にするのが望ましい。
このようにして精製されたHCV粒子をSDS−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ウエスタンブロットにて、HCV由来タンパク質を検出することでHCV粒子が精製できたか否かを判断できる。
3.エピトープタグ化HCV粒子の利用
(1)ワクチン
純度の高いエピトープタグ化HCV粒子はワクチンとしての用途、抗HCV抗体作製のための抗原としての用途に好適である。
具体的には、作製されたエピトープタグ化HCV粒子を当該分野で既知の方法により不活化して用いることができる。ウイルスの不活化は、ホルマリン,β−プロピオラクトン,グルタルジアルデヒド等の不活化剤を、例えば、ウイルス浮遊液に添加混合し、ウイルスと反応させることにより達成することができる(Appaiahgari et al.,Vaccine,22:3669−3675,2004)。
さらに、紫外線で照射することによりウイルスの感染性を失わせ、迅速に不活化することもできる。紫外線照射は、ウイルスを構成するタンパク質などへの影響が少なく、ウイルスの不活化を行うことができる。不活化するための紫外線の線源としては一般に市販されている殺菌灯、特に15W殺菌灯を用いて行うことができるが、それに限るものではない。また、本発明においては、HCV粒子は上記に記載した方法により精製したものを用いているが、不活化方法は精製・未精製などの状態により限られるものではない。好ましくはエピトープタグ化HCV粒子を含む溶液を20mW/cm2の紫外線で室温にて5分以上照射することにより、エピトープタグ化HCV粒子を不活化することができる。
本発明のワクチンは、溶液または懸濁液のいずれかの形態で、10%〜95%、好ましくは25%〜70%の活性成分(ウイルス粒子またはその一部分)を含有し、投与可能に調製される。液体中の溶解または懸濁に適した固形物の形態で調製することができる。調製物は乳濁され、またはリポソームにカプセル化してもよい。
HCV粒子などの活性免疫原性成分は、薬学的に受容可能であって、活性成分に適合した賦形剤がしばしば混合される。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの混合物が挙げられる。さらに、所望に応じて、ワクチンは、少量の補助剤(例えば加湿剤または乳化剤)、pH緩衝剤、および/またはワクチンの効能を高めるアジュバントを含有し得る。有効であり得るアジュバントの例は、限定されないが、たとえば、水酸化アルミニウム、N−アセチル−ムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(CGP11637、nor−MDPと称せられる)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(CGP19835A、MTP−PEと称せられる)、およびRIBIを包含する。RIBIは、バクテリアから抽出した3成分、すなわちモノホスホリルリピドA、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格(HPL+TDM+CWS)を2%スクアレン/Tween(登録商標)80エマルジョン中に含有している。アジュバントの効能は、HCV粒子から構成されるワクチンを投与することにより生じる、抗体の量を測定することにより決定され得る。
本発明のワクチンは、通常非経口的に、例えば皮下注射または筋内注射のような、注射により投与される。他の投与態様に適切な別の処方としては、坐薬、およびある場合には経口処方薬が挙げられる。
所望により、アジュバント活性を有する1以上の化合物をHCVワクチンに加えることができる。アジュバントは、該免疫系の非特異的刺激因子である。それらは、HCVワクチンに対する宿主の免疫応答を増強する。当技術分野で公知のアジュバントの具体例としては、フロイント完全および不完全アジュバント、ビタミンE、非イオンブロック重合体、ムラミルジペプチド、サポニン、鉱油、植物油およびCarbopolが挙げられる。粘膜適用に特に適したアジュバントとしては、例えば、大腸菌(E.coli)易熱性毒素(LT)またはコレラ(Cholera)毒素(CT)が挙げられる。他の適当なアジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、油性乳剤(例えば、Bayol(登録商標)またはMarcol 52(登録商標)のもの)、サポニンまたはビタミンEソリュビリゼートが挙げられる。したがって、好ましい形態においては、本発明のワクチンはアジュバントを含む。
例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内に投与する注射剤において、本発明のワクチンと医薬上許容される担体または希釈剤の他の具体例には、安定化剤、炭水化物(例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン)、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清または脱脂乳などのタンパク質含有物質、およびバッファー(例えば、リン酸バッファー)などともに投与することができる。
本発明のワクチンは、投与剤形に適した方法で、そして予防および/または治療効果があるような量で投与される。投与されるべき量は、通常投与当たり抗原を0.01μgから100,000μgまでの範囲であり、これは、処置される患者、その患者の免疫系での抗体合成能、および所望の防御の程度に依存し、経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内投与経路などの投与経路にも依存する。
本発明のワクチンは、単独投与スケジュールで、または好ましくは複合投与スケジュールで与えられ得る。複合投与スケジュールでは、接種の開始時期に1〜10の個別の投与を行い、続いて免疫応答を維持するおよびまたは強化するのに必要とされる時間間隔で、例えば2回目の投与として1〜4ヵ月後に、別の投与を行い得る。必要であれば、数ヶ月後に引続き投与を行い得る。投与のレジメもまた、少なくとも部分的には、個体の必要性により決定され、医師の判断に依存する。
また本発明のワクチンは、他の免疫制御剤(例えば、免疫グロブリン)と共に投与してもよい。
さらに本発明のワクチンは、健常人に投与し、健常人にHCVに対する免疫応答を誘導し、新たなHCV感染に対し、予防的に使用してもよい。さらにまた、HCVに感染した患者に投与し、生体内にHCVに対する強い免疫反応を誘導することにより、HCVを排除する治療的ワクチンとして使用してもよい。
(2)エピトープタグ化HCV粒子を抗原として誘発される抗HCV抗体
本発明のエピトープタグ化HCV粒子は簡便に精製でき、高純度であるため、抗体作製のための抗原として有用である。
すなわち、動物の血清には不純物に対する抗体が含まれているため、動物の免疫に用いるHCV粒子サンプルに不純物が存在する場合、この不純物に対する抗体を除くために血清をHCV抗原カラムなどで精製する必要がある。しかしながら、本発明のエピトープタグ化HCV粒子は高純度なHCVとして得られるため、このような精製工程は不要である。
抗HCV抗体は、本発明のエピトープタグ化HCV粒子を哺乳類または鳥類に投与することで作製することができる。哺乳類動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、モルモット、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、ラマなどを挙げることができる。ヒトコブラクダ、フタコブラクダおよびラマはH鎖のみからなる抗体を作製するには好適である。鳥類動物としては、ニワトリ、ガチョウ、ダチョウなどを挙げることができる。本発明の粒子を投与された動物の血清を採取して、既知の方法に従って抗体を取得することができる。
本発明のエピトープタグ化HCV粒子で免疫した動物の細胞を用いてモノクローナル抗体産生細胞を産生するハイブリドーマを作製することができる。ハイブリドーマを製造する方法は周知であり、Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,1988)に記載された方法を用いることができる。
モノクローナル抗体産生細胞は、細胞融合により作製してもよく、また癌遺伝子DNAの導入やEpstein−Barrウイルスの感染によりBリンパ球を不死化させるような他の方法で作製してもよい。
これらの方法によって得られたモノクローナル抗体やポリクローナル抗体はHCVの診断や治療、予防に有用である。
本発明のエピトープタグ化HCV粒子を用いて作製された抗体は、C型肝炎の治療、予防を目的として使用される。さらに臓器移植によるドナー臓器からのHCVの感染予防にも使用される。さらに上記抗体は、既存の抗ウイルス剤たとえば、インターフェロン、リバビリンなどとの併用でも使用できる。
抗HCV抗体の有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.001mgから1000mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり0.01〜100000mg/bodyの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明のエピトープタグ化HCV粒子を用いて作製された抗HCV抗体を含有する治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
上記治療剤の投与経路は特に限定されないが、好ましくは、皮下、皮内、筋肉内投与であり、より好ましくは、静脈内投与である。なお、治療剤の投与時期は、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わない。
本発明のエピトープタグ化HCV粒子を用いて作製された抗HCV抗体を有効成分として含有する治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ(Remington’s Pharmaceutical Science,Latest Edition,Mark Publishing Company,Easton,米国)、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および医薬添加物の例としては、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン(HSA)、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて、たとえば上記の中から単独でまたは適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定されるものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製されたエピトープタグ化HCV粒子を用いて作製された抗HCV抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばTween80、Tween20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
HCVゲノムRNAのcDNAとして、5’UTRからNS2のN末端16アミノ酸残基までが遺伝子型2aのJ6CF株(GenBank アクセッション番号AF177036、Yanagi,M.et al.,Virology,262(1999)p250−263)、NS2のN末端17アミノ酸残基から3’UTRまでが同じく遺伝子型2a株のJFH−1株(GenBank アクセッション番号AB047639、Kato,T.et al.,Gastroenterology,125(2003)p1808−1817)であるJ6/JFH−1キメラのcDNAを使用した。挿入するFLAGタグとしてはFLAG配列を1回または3回繰り返したcDNAを挿入した。作製されたこれらのプラスミドをそれぞれpJ6/JFH−1(1XFLAG)、pJ6/JFH−1(3XFLAG)と呼ぶ。
これらの遺伝子から翻訳されるFLAGタグの挿入部位近傍のアミノ酸配列をE2タンパク質のN末端のアミノ酸から図1に示した。J6/JFH1のコードするE2タンパク質のN末端のアミノ酸配列を配列番号1、pJ6/JFH−1(1XFLAG)のコードするE2タンパク質のN末端のアミノ酸配列を配列番号2、pJ6/JFH−1(3XFLAG)のコードするE2タンパク質のN末端のアミノ酸配列を配列番号3に記載した。また、これらのプラスミドの作製方法を図2(A)−(C)に示す。
具体的には、JFH1株由来ゲノムRNA全領域に対応するcDNAをpUC19プラスミド中にクローニングすることにより構築されたプラスミドDNAであるpJFH1(Wakita,T.et al.Nat.Med.,11(2005)p791−796、国際公開WO2004/104198)をEcoRIで消化後、さらにBclIで部分消化し、EcoRI部位から最初のBclI部位までの断片(約2840bp)が除去されたプラスミドDNA断片を精製した。一方、pUC19プラスミド中にクローニングされたJ6CF株由来ゲノムcDNA、pJ6CF(GenBank アクセッション番号AF177036、Yanagi,M.,et al.,Virology 262:250−263,1999)をEcoRIとBclIで部分消化して得られる約2840bpの断片を上記の断片に連結し、J6/JFH1を得た。
次に、J6/JFH1 cDNAを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーE2−F(配列番号4)および1F−R(配列番号5)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.1とした。
次に、J6/JFH1 cDNAを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーE2−R(配列番号6)および1F−F(配列番号7)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 1分30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.2とした。
次にJ6/JFH1 cDNAを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーE2−F(配列番号4)および3F−R(配列番号8)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.3とした。
次に、J6/JFH1 cDNAを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーE2−R(配列番号6)および3F−F(配列番号9)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 1分30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.4とした。
それぞれのPCR産物を精製し、15μlのH2Oに溶かした。PCR産物no.1とPCR産物no.2のDNAを各1μlずつ混合した。これを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーE2−F(配列番号4)およびE2−R(配列番号6)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 2分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.5とした。
次にPCR産物no.3とPCR産物no.4のDNAを各1μlずつ混合した。これを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーE2−F(配列番号4)およびE2−R(配列番号6)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 2分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.6とした。それぞれのPCR産物を精製し、30μlのH2Oに溶かした。
J6/JFH1 cDNAおよび精製したPCR産物no.5を制限酵素KpnIで消化し、各HCV cDNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら2つのDNA断片とLigation Mix(タカラバイオ社、日本)を混合し、2つのDNA断片を連結した。このベクターをpJ6/JFH−1(1XFLAG)と名付けた。このpJ6/JFH−1(1XFLAG)は、5’側から3’側に順番に、J6CF株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、およびNS2タンパク質領域のN末端16アミノ酸残基までコードする配列、ならびに、JFH−1株のNS2タンパク質領域のN末端17アミノ酸残基からC末端間でコードする配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質領域および3’非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列であり、上記E2のHVR1領域にFLAGペプチド配列をコードする塩基配列を含む。
次いで、J6/JFH1 cDNAおよび精製したPCR産物no.6を制限酵素KpnIで消化し、各HCV cDNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら2つのDNA断片とLigation Mix(タカラバイオ社、日本)を混合し、2つのDNA断片を連結した。このベクターをpJ6/JFH−1(3XFLAG)と名付けた。このpJ6/JFH−1(3XFLAG)は、5’側から3’側に順番に、J6CF株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列およびNS2タンパク質領域のN末端16アミノ酸残基までコードする配列、ならびに、JFH−1株のNS2タンパク質領域のN末端17アミノ酸残基からC末端までコードする配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質領域および3’非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列であり、上記E2のHVR1領域にFLAGペプチド配列を3回繰り返した塩基配列を含む。
pJ6/JFH−1を配列番号10、pJ6/JFH−1(1XFLAG)を配列番号11、pJ6/JFH−1(3XFLAG)を配列番号12としてこれらの塩基配列を配列表に示した。
実施例2:In vitro RNA合成と細胞内への導入
pJ6/JFH−1,pJ6/JFH−1(1XFLAG)、pJ6/JFH−1(3XFLAG)をXba Iで切断し、フェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。この切断したプラスミドを鋳型として、MEGAscript T7 kit(Ambion社)を用いて各HCV RNAの合成を行った。
3×106個のHuh−7細胞と5μgのHCV RNAをCytomix溶液(120mM KCl,0.15mM CaCl2,10mM K2HPO4/KH2PO4,25mM Hepes,2mM EGTA,5mM MgCl2,20mM ATP,50mM Glutathione)400μlで懸濁し、4mmキュベットに移した後、Gene Pulser(BioRad社)を用いて260V、950μFでエレクトロポレーションを行った。その後、HCV RNA導入細胞を10cm2ディッシュに播種し、継代培養を行った。
実施例3:J6/JFH−1(3XFLAG)RNA導入細胞によるHCV粒子の産生
J6/JFH−1,J6/JFH−1(3XFLAG)RNAを導入した各細胞の継代時に、HCV抗原ELISAテストキット(オーソ社)を用いて培養上清中に含まれるHCV Coreタンパク質を定量し、HCV粒子産生の確認を行った。その結果、J6/JFH−1 RNA導入ではその産生量に変化は見られずほぼ一定だった。しかしながら、J6/JFH−1(3XFLAG)RNA導入では培養上清中のHCV Core量は導入21日目までは経時的に減少していったが、導入から22日を経過した時点でCore量が上昇し始め、35日経過時点でJ6/JFH−1と同程度のCore産生量を示した(図3)。このことから、J6/JFH−1(3XFLAG)RNAは、Huh−7細胞導入当所は高いウイルス産生能を有していないが、後にウイルスゲノム内にウイルス産生に必要な適合変異が導入され、J6/JFH−1 RNAと同様のウイルス産生能を有するようになると考えられた。
実施例4:J6/JFH−1(3XFLAG)RNA導入細胞によるHCVタンパク質の発現
J6/JFH−1,J6/JFH−1(3XFLAG)RNA導入から4,17,30,43日目の細胞内のHCVタンパク質発現をウェスタンブロッティングにより確認した。解析にあたって、RNAを導入していないHuh−7細胞から得られた細胞抽出試料を陰性対象とした。それぞれの細胞からの抽出試料のSDS−PAGEを行い、PVDF膜(Immobilon−P,Millipore社)にブロッティングした。その後、抗Coreモノクローナル抗体、抗FLAGモノクローナル抗体(M2抗体、シグマ社)および抗E2モノクローナル抗体と、これらの抗体を認識するHRP標識2次抗体を用いて、ECL Plus(GE Healthcare社)にて細胞内で翻訳されたCoreタンパク質およびE2タンパク質を検出した。
その結果、J6/JFH−1(3XFLAG)導入において、30,43日目でのE2タンパク質はRNA導入時のE2タンパク質より分子量が軽くなっていることが示された(図4)。Coreタンパク質においてはそのような変化は見られなかった。そこで、これらのE2タンパク質を脱糖鎖酵素であるPNGase Fで処理したところ、そのような分子量の違いはみられなくなっていた(図5)。このことから、J6/JFH−1(3XFLAG)RNAゲノムのE2領域は細胞の継代を重ねることによって、そのゲノム内に変異を生じ、その部位は糖鎖結合部位である可能性が示唆された。
実施例5:継代を重ねたJ6/JFH−1(3XFLAG)ウイルス感染細胞内のHCVゲノム配列解析
J6/JFH−1(3XFLAG)ウイルスが高い感染性を有するために必要な適合変異を調べるために、RNA導入から8日目と39日目の感染細胞内のtotal RNAを抽出し、この中に含まれるHCVゲノムの配列解析を行った。
その結果、E2領域の糖鎖付加部位の一つであるアスパラギンAAU(N)がリジンAAA(K)に置換されており、この部位の糖鎖修飾が無くなることにより、RNA導入時のE2タンパク質よりも分子量が軽くなることが示された(図6)。なお、本アスパラギンはJ6CF株(GenBank アクセッション番号AF177036、Yanagi,M.et al.,Virology,262(1999)p250−263)のCoreタンパク質のN末端配列であるメチオニンを1として数えて534番目のアミノ酸に対応する。
実施例6:J6/JFH−1(3XFLAG)ウイルス粒子の精製
J6/JFH−1(3XFLAG)ウイルス粒子を精製するために、J6/JFH−1(3XFLAG)RNA導入から56日目の培養上清を用いた。この培養上清600μlに、0.1M glycine−HCl(pH3.5)で前処理したM2抗体agarose(シグマ社)500μlを加え、4℃で2時間転倒混和を行った。フロースルーを回収し、M2抗体agaroseをTBS bufferで3回洗浄後、200μlの1XFLAGペプチド(シグマ社)溶液または3XFLAGペプチド(シグマ社)溶液を用いて3回溶出操作を行った。これらの溶出サンプルのHCV Coreタンパク質量をHCV抗原ELISAテストキット(オーソ社)により定量したところ、どちらのFLAGペプチドでも溶出でき、その精製効率は約5%であった(図7)。
これらの溶出サンプルの純度を調べるために、HCV Core 0.1fmol相当の溶出サンプルおよび未精製の培養上清のSDS−PAGEを行った。その後、銀染色を行い各溶液中に含まれる夾雑タンパク質を確認したところ、溶出サンプルではほとんど夾雑タンパク質は確認されなかった(図8)。以上から、溶出サンプルはHCV粒子が高純度に精製されていることが確かめられた。
実施例7:精製したJ6/JFH−1(3XFLAG)ウイルスの感染性の評価
実施例6で精製したJ6/JFH−1(3XFLAG)ウイルスの感染性を評価するために、培養細胞を用いての感染実験を行った。Huh−7細胞を8wellガラスチャンバーに1×104cell/wellで播種し、24時間培養後、HCV Core 1fmol相当のウイルス液を3時間感染させた。感染後、DMEM(シグマ社)で2回洗浄し、そこから4日間培養を行った。4日後の細胞内のtotal RNAをTrizol Reagent(invitrogen社)の添付マニュアルに従って抽出した。このtotal RNA中のHCV RNA量を定量的RT−PCR法により測定した。使用するプライマーおよびプローブはHCV RNAの5’−UTR領域を標的としたセンスプライマーS−17(配列番号13)、アンチセンスプライマーR−19(配列番号14)およびタックマンプローブ(配列番号15)を用いた。このプライマーおよびプローブと抽出したtotal RNAを混合し、TaqMan EZ RT−PCR CORE REAGENTS(Applied Biosystems)の添付マニュアルに従いRT−PCR反応溶液を調製し、7500Fast Real−Time PCR System(Applied Biosystems)による検出を行った。その結果、精製したJ6/JFH−1(3XFLAG)ウイルス溶液はHuh−7細胞に対して感染性を有することが示された(図9)。このことから、HCV E2のHVR1領域にFLAGタグ配列を挿入したウイルスは高純度に精製することが可能であり、その精製ウイルスは感染性を有することが示された。
実施例8:J6/JFH−1(1XFLAG)E2 N→KおよびJ6/JFH−1(3XFLAG)E2 N→K変異プラスミドの構築
実施例5で示した、J6/JFH−1(3XFLAG)ウイルスが高い感染性を有するために必要な適合変異(E2領域の糖鎖付加部位のアスパラギンAAT(N6)からリジンAAA(K)への置換)を持つプラスミドpJ6/JFH−1(1XFLAG)N→KおよびpJ6/JFH−1(3XFLAG)N→Kの構築を行った。プラスミドの作製方法を図10(A)−(C)に示す。
具体的には、pJ6/JFH−1(1XFLAG)を鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマー1141S−2a(配列番号16)およびJ6E2−K−R(配列番号17)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 1分30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.7とした。
次に、pJ6/JFH−1(3XFLAG)を鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマー1141S−2a(配列番号16)およびJ6E2−K−R(配列番号17)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 1分30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.8とした。
次に、pJ6/JFH−1を鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーJ6E2−K−F(配列番号18)および3189R−IH(配列番号19)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 1分30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.9とした。
それぞれのPCR産物を精製し、50μlのH2Oに溶かした。PCR産物no.7とPCR産物no9のDNAを各1μlずつ混合した。これを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマー1141S−2a(配列番号16)および3189R−IH(配列番号19)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 2分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.10とした。
次に、PCR産物no.8とPCR産物no.9のDNAを各1μlずつ混合した。これを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマー1141S−2a(配列番号16)および3189R−IH(配列番号19)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 2分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.11とした。それぞれのPCR産物を精製し、30μlのH2Oに溶かした。
pJ6/JFH1および精製したPCR産物no.10を制限酵素KpnIで消化し、各HCV cDNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら2つのDNA断片とLigation Mix(タカラバイオ社、日本)を混合し、2つのDNA断片を連結した。このベクターをpJ6/JFH−1(1XFLAG)N→Kと名付けた。このpJ6/JFH−1(1XFLAG)N→Kは、5’側から3’側に順番に、J6CF株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列およびNS2タンパク質領域のN末端16アミノ酸残基までコードする配列、ならびに、JFH−1株のNS2タンパク質領域のN末端17アミノ酸残基からC末端間でコードする配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質領域および3’非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列であり、上記NS2のHVR1領域にFLAGペプチド配列をコードする塩基配列を含み、かつCoreタンパク質のN末端配列であるメチオニンを1として数えて532番目のアミノ酸がリジンとなるような塩基配列を含む。
次いで、pJ6/JFH1および精製したPCR産物no.11を制限酵素KpnIで消化し、各HCV cDNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら2つのDNA断片とLigation Mix(タカラバイオ社、日本)を混合し、2つのDNA断片を連結した。このベクターをpJ6/JFH−1(3XFLAG)N→Kと名付けた。このpJ6/JFH−1(3XFLAG)N→Kは、5’側から3’側に順番に、J6CF株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列およびNS2タンパク質領域のN末端16アミノ酸残基までコードする配列、ならびに、JFH−1株のNS2タンパク質領域のN末端17アミノ酸残基からC末端までコードする配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質領域および3’非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列であり、上記NS2のHVR1領域にFLAGペプチド配列を3回繰り返した塩基配列を含み、かつCoreタンパク質のN末端配列であるメチオニンを1として数えて532番目のアミノ酸がリジンとなるような塩基配列を含む。
pJ6/JFH−1(1XFLAG)N→Kを配列番号20、pJ6/JFH−1(3XFLAG)N→Kを配列番号21としてこれらの塩基配列を配列表に示した。
実施例9:J6/JFH−1(1XFLAG)E2 N→KおよびJ6/JFH−1(3XFLAG)E2 N→Kウイルスの作製
実施例8で作製したプラスミドをそれぞれXbaIで切断し、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。この切断したプラスミドを鋳型にMEGAscript T7 kit(Ambion社)を用いて各HCV RNAの合成を行った。
3×106個のHuh−7細胞と5μgのHCV RNAをCytomix溶液(120mM KCl,0.15mM CaCl2,10mM K2HPO4/KH2PO4,25mM Hepes,2mM EGTA,5mM MgCl2,20mM ATP,50mM Glutathione)400μlで懸濁し、4mmキュベットに移した後、Gene Pulser(BioRad社)を用いて260V、950μFでエレクトロポレーションを行った。その後、HCV RNA導入細胞を10cm2ディッシュに播種し、継代培養を行った。
J6/JFH−1(1XFLAG)E2 N→KおよびJ6/JFH−1(3XFLAG)E2 N→K RNAを導入した各細胞の継代時に、HCV抗原ELISAテストキット(オーソ社)を用いて培養上清中に含まれるHCV Coreタンパク質を定量し、HCV粒子産生の確認を行った。培養初期から後期にわたって、変異を導入しないRNAを導入した細胞の培養上清中に含まれるHCV Core量と変異を導入したRNAを導入した細胞の培養上清に含まれるHCV Core量とを比較すると後者の方が高いことが示された。
実施例10:HCV E2 HVR1領域にFLAGタグ配列を挿入したJFH−1プラスミドの構築
実施例1と同様な方法で、遺伝子型2a株のJFH−1株(GenBank アクセッション番号AB047639、Kato,T.et al.,Gastroenterology,125(2003)p1808−1817)のHVR1内にエピトープタグ配列を導入した。エピトープタグとしてはFLAG配列を1回または3回繰り返したcDNAを挿入した。これらのプラスミドをそれぞれJFH−1(1XFLAG)、JFH−1(3XFLAG)と呼ぶ。
これらの遺伝子から翻訳されるFLAGタグの挿入部位近傍のアミノ酸配列をE2タンパク質のN末端のアミノ酸から図11に示した。
pJFH−1(pJFH1と呼称されることもある)のコードするE2タンパク質のN末端の配列を配列番号22、pJFH−1(1XFLAG)のコードするE2タンパク質のN末端の配列を配列番号23、pJFH−1(3XFLAG)のコードするE2タンパク質のN末端の配列を配列番号24に記載した。また、これらのプラスミドの作製方法を図12(A)〜(C)に示す。
具体的には、pJFH−1 cDNAを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーJFH1−F(配列番号25)およびJFH1−1F−R(配列番号26)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.12とした。
次に、pJFH−1 cDNAを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマー3189R−IH(配列番号19)およびJFH1−1F−F(配列番号27)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 1分30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.13とした。
次にJFH1 cDNAを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーJFH1−F(配列番号25)およびJFH1−3F−R(配列番号28)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.14とした。
次に、pJFH−1 cDNAを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマー3189R−IH(配列番号19)およびJFH1−3F−F(配列番号29)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 1分30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.15とした。
それぞれのPCR産物を精製し、15μlのH2Oに溶かした。PCR産物no.12とPCR産物no.13のDNAを各1μlずつ混合した。これを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーJFH1−F(配列番号25)および3189R−IH(配列番号19)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 2分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.16とした。
次にPCR産物no.14とPCR産物no.15のDNAを各1μlずつ混合した。これを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーJFH1−F(配列番号25)および3189R−IH(配列番号19)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 2分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.17とした。それぞれのPCR産物を精製し、30μlのH2Oに溶かした。
pJFH−1 cDNAおよび精製したPCR産物no.16を制限酵素EcoRIおよびKpnIで消化し、各HCV cDNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら2つのDNA断片とLigation Mix(タカラバイオ社、日本)を混合し、2つのDNA断片を連結した。このベクターをpJFH−1(1XFLAG)と名付けた。このpJFH−1(1XFLAG)は、JFH1株の遺伝子をコードする塩基配列で、E2のHVR1領域にFLAGペプチド配列をコードする塩基配列を含む。次いで、pJFH1 cDNAおよび精製したPCR産物no.17を制限酵素EcoRIおよびKpnIで消化し、各HCV cDNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら2つのDNA断片とLigation Mix(タカラバイオ社、日本)を混合し、2つのDNA断片を連結した。このベクターをpJFH−1(3XFLAG)と名付けた。このpJFH−1(3XFLAG)は、JFH1株の遺伝子をコードする塩基配列で、E2のHVR1領域にFLAGペプチド配列を3回繰り返した塩基配列を含む。
pJFH−1(1XFLAG)を配列番号30、pJFH−1(3XFLAG)を配列番号31としてこれらの塩基配列を配列表に示した。
実施例11:HCV E2 HVR1領域にFLAGタグ配列を挿入したTH/JFH1プラスミドの構築
HCVゲノムRNAのcDNAとして、5’UTRからNS2のN末端16アミノ酸残基までが遺伝子型1bのTH1株((Wakita,T.et al.,J.Biol.Chem.,269,14205−14210,1994、特開2004−179)、NS2のN末端17アミノ酸残基から3’UTRまでが同じく遺伝子型2a株のJFH−1株(GenBank アクセッション番号AB047639、Kato,T.et al.,Gastroenterology,125(2003)p1808−1817)であるTH/JFH−1キメラのcDNAを使用し、TH/JFH1のHVR1内にエピトープタグ配列を導入した。挿入するエピトープタグとしてはFLAG配列を1回または3回繰り返したcDNAを挿入した。これらのプラスミドをそれぞれpTH/JFH−1(1XFLAG)、pTH/JFH−1(3XFLAG)と呼ぶ。
これらの遺伝子から翻訳されるFLAGタグの挿入部位近傍のアミノ酸配列を、E2タンパク質のN末端のアミノ酸配列由来ものとして図13に示した。
pTH/JFH−1のコードするE2タンパク質のN末端の配列を配列番号32、pTH/JFH−1(1XFLAG)のコードするE2タンパク質のN末端の配列を配列番号33、pTH/JFH−1(3XFLAG)のコードするE2タンパク質のN末端の配列を配列番号34に記載した。また、これらのプラスミドの作製方法を図14に示す。
まず、TH/JFH−1を作製した。pJFH−1 cDNAを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーJFH1−A(配列番号43)およびJFH1−B(配列番号44)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行い、JFH−1の5’非翻訳領域とプライマーJFH1−Bに含まれるTHのCoreの一部の増幅を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.18とした。
次に、pTH(Wakita et al.,J.Biol.Chem.,269:14205−14210,1994およびMoradpour et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,246:920−924,1998)を鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーTH−C(配列番号45)およびTH−D(配列番号46)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行い、THのCoreからNS2の一部分とプライマーTH−Cに含まれるJFH−1の5’非翻訳領域の一部分およびプライマーYH−Dに含まれるJFH−1のNS2の一部分の増幅を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.19とした。
pJFH−1を鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーJFH1−E(配列番号47)およびJFH1−F(配列番号48)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行い、JFH−1のNS2、NS3の一部とプライマーJFH1−Eに含まれるTHのNS2の一部の増幅を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.20とした。
上記PCR産物no.18,no.19,no.20とプライマーJFH−AおよびJFH−Eを用いてPCRを行い、JFH−1の5’翻訳領域からTH株のCoreからNS2の一部、JFH−1のNS2からNS3の一部のフラグメントを得た(PCR産物no.21)。
次に、pJFH−1およびPCR産物no.21をそれぞれEcoR I、SpeIで制限酵素処理を行い、ライゲーションし、pTH/JFH−1を得た。このプラスミドを用いて、pTH/JFH−1(1XFLAG)、pTH/JFH−1(3XFLAG)を作製する方法を図14(A)−(C)に示す。
具体的には、pTH/JFH−1 cDNAを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーTH−F(配列番号35)およびTH−1F−R(配列番号36)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.22とした。
次に、pTH/JFH−1 cDNAを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマー3189R−IH(配列番号19)およびTH−1F−F(配列番号37)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 1分30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.23とした。
次にpTH/JFH1 cDNAを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーTH−F(配列番号35)およびTH−3F−R(配列番号38)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.24とした。
次に、pTH/JFH−1 cDNAを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマー3189R−IH(配列番号19)およびTH−3F−F(配列番号39)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 1分30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.25とした。
それぞれのPCR産物を精製し、15μlのH2Oに溶かした。PCR産物no.22とPCR産物no.23のDNAを各1μlずつ混合した。これを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーTH−F(配列番号35)および3189R−IH(配列番号19)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 2分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.26とした。
次にPCR産物no.24とPCR産物no.25のDNAを各1μlずつ混合した。これを鋳型として、Phusion High−Fidelity DNA Polymeraseキット(FINNZYMES社)に添付されていた、10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMのプライマーTH−F(配列番号35)および3189R−IH(配列番号19)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES社)を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 2分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.27とした。それぞれのPCR産物を精製し、30μlのH2Oに溶かした。
pTH/JFH−1 cDNAおよび精製したPCR産物no.26を制限酵素KpnIで消化し、各HCV cDNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら2つのDNA断片とLigation Mix(タカラバイオ社、日本)を混合し、2つのDNA断片を連結した。このベクターをpTH/JFH−1(1XFLAG)と名付けた。このpTH/JFH−1(1XFLAG)は、TH1株の遺伝子をコードする塩基配列で、E2のHVR1領域にFLAGペプチド配列をコードする塩基配列を含む。
次いで、pTH/JFH1 cDNAおよび精製したPCR産物no.27を制限酵素KpnIで消化し、各HCV cDNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら2つのDNA断片とLigation Mix(タカラバイオ社、日本)を混合し、2つのDNA断片を連結した。このベクターをpTH/JFH−1(3XFLAG)と名付けた。このpTH/JFH−1(3XFLAG)は、TH1株の遺伝子をコードする塩基配列で、E2のHVR1領域にFLAGペプチド配列を3回繰り返した塩基配列を含む。
pTH/JFH1を配列番号40、pTH/JFH−1(1XFLAG)を配列番号41、pTH/JFH−1(3XFLAG)を配列番号42としてこれらの塩基配列を配列表に示した。
上記実施例で作製されたベクター類から合成されたRNAはいずれも、培養HCV許容性細胞(Huh7等)に導入すると、エピトープタグ化HCV粒子を生成した。そして、エピトープタグ化HCV粒子含有培養上清を、抗エピトープタグ抗体を固定した担体を充填したカラムに通すことによって、エピトープタグ化HCV粒子を特異的に吸着し、その後の溶離処理により、該HCV粒子を精製することができた。
本発明の方法によって提供されるHCV粒子は高純度であるため、HCVの予防または治療用ワクチンとして好適に利用できる。さらに、本発明にかかるエピトープタグ化HCV粒子はHCVに対する抗体を誘導するツールとしても利用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号2:pJ6/JFH−1(1XFLAG)のコードするE2タンパク質のN末端の配列
配列番号3:pJ6/JFH−1(3XFLAG)のコードするE2タンパク質のN末端の配列
配列番号4:プライマー(E2−F)
配列番号5:プライマー(1F−R)
配列番号6:プライマー(E2−R)
配列番号7:プライマー(1F−F)
配列番号8:プライマー(E2−F)
配列番号9:プライマー(3F−R)
配列番号10:pJ6/JFH−1
配列番号11:pJ6/JFH−1(1XFLAG)
配列番号12:pJ6/JFH−1(3XFLAG)
配列番号13:プライマー(S−17)
配列番号14:プライマー(R−19)
配列番号15:プローブ
配列番号16:プライマー(1141S−2a)
配列番号17:プライマー(J6E2−K−R)
配列番号18:プライマー(J6E2−K−F)
配列番号19:プライマー(3189R−1H)
配列番号20:pJ6/JFH−1(1×FLAG)N→K
配列番号21:pJ6/JFH−1(3×FLAG)N→K
配列番号22:pJFH−1のコードするE2タンパク質のN末端の配列
配列番号23:pJFH−1(1XFLAG)のコードするE2タンパク質のN末端の配列
配列番号24:pJFH−1(3XFLAG)のコードするE2タンパク質のN末端の配列
配列番号25:プライマー(JFH1−F)
配列番号26:プライマー(JFH1−1F−R)
配列番号27:プライマー(JFH1−1F−F)
配列番号28:プライマー(JFH1−3F−R)
配列番号29:プライマー(JFH1−3F−F)
配列番号30:pJFH−1(1XFLAG)
配列番号31:pJFH−1(3XFLAG)
配列番号32:pTH/JFH1のコードするE2タンパク質のN末端の配列
配列番号33:pTH/JFH−1(1XFLAG)のコードするE2タンパク質のN末端の配列
配列番号34:pTH/JFH−1(3XFLAG)のコードするE2タンパク質のN末端の配列
配列番号35:プライマー(TH−F)
配列番号36:プライマー(TH−1F−R)
配列番号37:プライマー(TH−1F−F)
配列番号38:プライマー(TH−3F−R)
配列番号39:プライマー(TH−3F−F)
配列番号40:pTH/JFH1
配列番号41:pTH/JFH1(1XFLAG)
配列番号42:pTH/JFH1(3XFLAG)
配列番号43:プライマー(JFH1−A)
配列番号44:プライマー(JFH1−B)
配列番号45:プライマー(TH−C)
配列番号46:プライマー(TH−D)
配列番号47:プライマー(JFH1−E)
配列番号48:プライマー(JFH1−F)
配列番号49:エピトープタグペプチド(1XFLAG+Linker)
配列番号50:エピトープタグペプチド(3XFLAG+Linker)
配列番号51:エピトープタグペプチド(1XFLAG)
配列番号52:エピトープタグペプチド(3XFLAG)
配列番号53:リンカー
配列番号54:リンカー
[配列表]
Claims (15)
- 下記の(a)、(b)または(c)を含む核酸であって、前記(a)、前記(b)または前記(c)のE2タンパク質コード配列の超可変領域1(HVR1)にエピトープタグペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸。
(a)C型肝炎ウイルス(HCV)のJFH−1株のゲノム
(b)C型肝炎ウイルス(HCV)のJ6CF株の5’非翻訳領域、Coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列、ならびに、JFH−1株のNS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域、を含むキメラC型肝炎ウイルス(HCV)ゲノム
(c)C型肝炎ウイルス(HCV)のJFH−1株の5’非翻訳領域、TH1株のCoreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列、ならびに、JFH−1株のNS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域、を含むキメラC型肝炎ウイルス(HCV)ゲノム - 前記エピトープタグペプチドは、DYKDDDDKまたはDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKからなるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記エピトープタグペプチドは、リンカー配列をさらに含む、請求項1または2に記載の核酸。
- 前記リンカー配列は、GGG配列、GGGGS配列もしくは(GGGGS)3配列、または、前記GGG配列、前記GGGGS配列もしくは前記(GGGGS)3配列の一部において1〜10個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含むリンカー配列である、請求項3に記載の核酸。
- 配列番号11、12、30、31、41または42で示される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸(ただし核酸がRNAの場合は配列表の塩基記号「T」は「U」に読み替えるものとする)。
- 前記超可変領域1(HVR1)の最後の配列の次のアミノ酸を1番としたとき、122番目または124番目のアミノ酸であるアスパラギンをリジンに置換する変異を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸。
- 配列番号20または21で示される、請求項6に記載の核酸(ただし核酸がRNAの場合は配列表の塩基記号「T」は「U」に読み替えるものとする)。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸を含有するベクター。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸をゲノムとして含有するエピトープタグ化C型肝炎ウイルス(HCV)粒子。
- 請求項9に記載のエピトープタグ化C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を含有する細胞。
- Huh7またはその派生株である、請求項10に記載の細胞。
- 請求項10または11に記載の細胞からエピトープタグ化C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を生成する生成ステップと、
前記エピトープタグ化C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を含有する液体を抗エピトープタグ抗体固定化担体に接触させ、前記エピトープタグ化C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を前記抗エピトープタグ抗体固定化担体に吸着させる吸着ステップと、
前記エピトープタグ化C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を前記抗エピトープタグ抗体固定化担体から遊離させて前記エピトープタグ化C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を得る遊離ステップと、
を備える、エピトープタグ化C型肝炎ウイルス(HCV)粒子の精製方法。 - 前記遊離ステップは、エピトープタグペプチド含有緩衝液、カルシウム不含緩衝液、pH2.5〜pH4.0の0.1Mグリシン緩衝液、pH4.0〜pH5.0の1Mアルギニン塩酸緩衝液または0.1mM〜1mMの塩酸のいずれかを用いて、前記抗エピトープタグ抗体固定化担体から前記エピトープタグ化C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を遊離させる、請求項12に記載の精製方法。
- 請求項9に記載のエピトープタグ化C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を不活化して得られるC型肝炎ウイルス(HCV)ワクチン。
- 抗原としての請求項9に記載のエピトープタグ化C型肝炎ウイルス(HCV)粒子に対する抗C型肝炎ウイルス(HCV)抗体。
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