KR101518081B1 - Ｃ형 간염 바이러스(ｈｃｖ)에 대한 인간 항체 및 이것의 용도 - Google Patents

Ｃ형 간염 바이러스(ｈｃｖ)에 대한 인간 항체 및 이것의 용도 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서는 C형 간염 바이러스(HCV)에 결합하는 단리된 인간 단일클론 항체 및 관련된 항체를 주성분으로 하는 조성물 및 분자가 개시된다. 상기 인간 항체는, V-D-J 재조합 및 아이소타입 스위칭을 겪음으로써 인간 단일클론 항체의 다수의 아이소타입을 생산할 수 있는, 트랜스펙토마 또는 비인간 유전자이식 동물(예를 들어, 유전자이식 마우스)에서 생산될 수 있다. 상기 인간 항체를 포함하는 약학 조성물, 비인간 유전자이식 동물 및 인간 항체를 생산하는 하이브리도마와, 상기 인간 항체를 사용한 치료 및 진단 방법도 개시된다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스(ＨＣＶ)에 대한 인간 항체 및 이것의 용도{HUMAN ANTIBODIES AGAINST HEPATITIS C VIRUS(HCV) AND USES THEREOF}
[관련 출원]
본 출원은 2007년 2월 21일에 출원된 미국 가특허 출원 제60/902,432호를 기초로 이 출원과 공통되는 모든 주제에 대해 우선권과 이익을 주장한다. 상기 가특허 출원의 개시 내용은 그 전체를 본 명세서에서 참고로 포함한다.
[발명의 배경]
C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus: HCV)[초기에는 비A형 비B형 간염(non-A non-B hepatitis: NANBH)으로 명명되었음]는 플라비바이러스과(Flaviviridae family)에 속하는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 이것의 게놈은 약 3,000개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리단백질(polyprotein)을 코딩하는 단일의 긴 오픈 리딩 프레임을 포함한다[Choo et al. (1989) Science 244:359-362]. 이 폴리단백질은 숙주 세포 및 바이러스 프로테아제에 의해 바이러스 복제에 필요한 3개의 주요 구조 단백질과 몇 개의 비구조 단백질로 프로세싱된다. HCV의 뉴클레오티드 서열은 가변성이 커서, 다양성이 가장 큰 단리물은 단지 60%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 공유한다. 약간 다른 게놈 서열을 갖는 HCV의 몇 가지 상 이한 유전자형이 확인되었다.
전세계로부터 얻은 단리물은 현재 그 서열 데이터에 기초하여 각각 몇 개의 아형을 갖는 6개의 주유형으로 분류되었다[Simmonds et al. (1995) Hepatology 21:570-83]. 제1형 내지 제3형은 유럽에서 거의 모든 감염의 원인이 되고, 제4형은 이집트와 자이르, 제5형은 남아프리카, 제6형은 홍콩에 만연되어 있다.
상기 바이러스는 주로 혈액과 혈액 제품을 통해 전파된다. 감염된 개체의 대부분은 1990년(HCV에 대한 혈액 공급의 스크리닝이 실시됨) 이전에 수혈을 받은 적이 있거나, 정맥내 의약품을 사용한 적이 있다. 전세계 인구의 약 2∼4억 명이 HCV의 만성 감염자이며, 이들 중 약 2∼5백 만명이 미국에 거주하고 있다. 감염자의 약 80%에 영향을 주고 있는 HCV의 만성 감염은 일생 동안 지속되며 종종 간경화 및 간암의 발생을 초래하기도 한다.
HCV에 대한 백신은 이 바이러스의 항원 다양성이 매우 큰 점으로 인해 그 개발이 늦어지고 있다. 이용할 수 있는 백신이 있다 해도, 그 백신이 전세계적으로 수백만명의 만성 HCV 보균자가 직면하고 있는 문제를 덜지는 못한다.
중화 항체가 존재하긴 하지만 HCV에 대한 대부분의 항체는 감염 제거에 주된 역할을 하지 못한다. 그러나, 이들은 종 특이적인 경향이 있고 새로 출현한 변종에는 유효하지 않다.
현재, HCV 유발성 간 질환에 대해 임의의 입증된 효능을 갖는 유일한 치료법은 α-IFN의 사용을 수반하는 것인데, 그러나 이 치료법은 성공률이 제한적이었다. α-IFN 치료를 이용한 최상의 임상 시험도, 만성 환자의 40∼50%만이 반응하고 치 료를 중단할 경우 이들 환자 중 50%에서 병이 재발한다고 보고하고 있다. 또한, α-IFN 치료는 몇몇 HCV 유전자형에 대해서는 다른 유전자형보다 훨씬 덜 효과적이라는 증거도 있다.
현재, (α-IFN 이외에) HCV 감염에 대한 통상적인 의약품은 아직 개발되지 않았다. 따라서, HCV 감염을 치료 및 예방하기 위한 개선된 면역치료법이 필요하다.
[발명의 개요]
본 발명은 다종 다양한 HCV 단리물에 특이적으로 결합하여 이 바이러스가 세포를 감염시키는 능력을 억제하는 재조합 완전 인간 항HCV 단일클론 항체를 제공함으로써 전술한 문제를 해결한다.
일 실시형태에서, 이것은 상기 항체가 시험관내에서(예를 들어, HCV 슈도 바이러스 중화 분석에서) HCV를 중화시키는(즉, 억제 또는 차단하는) 능력에 의해 입증된다. 또 다른 실시형태에서, 이것은 상기 항체가 동물 또는 인간 등의 피험체의 생체내에서 HCV 감염력을 억제하는 능력에 의해 입증된다.
본 발명의 인간 단일클론 항체는 효율적으로 사실상 무한한 양으로 매우 정제된 형태로 제조될 수 있다. 따라서, 상기 항체는 HCV에 노출되었거나 노출된 것으로 의심되는 개체의 예후 판단, 진단 및/또는 치료에 적합하다. 상기 항체는 당업계에 공지된 인간 항체의 제조를 위한 다양한 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 예시된 바와 같이, 상기 항체는 인간 면역글로불린 유전자 분절을 발현하는 유전자이식 동물, 예를 들어 인간 Ig 유전자좌를 포함하는 유전자이식 마우스에서 생성할 수 있다. 또한, 상기 항체는 HCV에 감염된 피험체(예를 들어, 동물 및 인간)의 생존율을 증가시키기 위해, 단독으로, 또는 예를 들어 항HCV 백신 또는 다른 항체와 함께 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은
- 예를 들어 HCV 매개 이환 또는 사망으로부터 피험체를 보호하기 위해, 피험체의 HCV에 대한 예후 판단, 진단 및/또는 치료를 위한 완전 인간 재조합 항HCV 항체;
- 단독으로 또는 HCV 감염을 치료하기 위한 시판되는 백신과 함께 사용될 수 있는 1종 이상의 완전 인간 재조합 항HCV 항체를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물) 및/또는 키트; 및
- 단독으로 또는 능동 면역요법(HCV 백신)과 함께 이용될 수 있는 HCV에 감염된 피험체를 치료하기 위한 수동 면역요법의 개선된 방법
을 포함하나 이들에 한정되지 않는 몇 가지 이점을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 HCV E2 단백질의 비입체구조 에피토프(non-conformational epitope)에 특이적으로 결합한다. 특정 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 HCV E2 단백질 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이러한 에피토프는, 예를 들어, HCV E2 단백질의 1∼50번, 50∼100번, 100∼150번, 150∼200번, 200∼250번, 250∼300번, 300∼350번, 350∼400번, 400∼450번, 450∼500번, 500∼550번, 550∼600번, 600∼650번, 650∼700번, 700∼746번 아미노산, 또는 이들의 임의의 구역, 일부분 또는 범위 내에 존재할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 대략 아미노산 잔기 412∼464번, 412∼423번 또는 413∼420번 사이의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 HCV E2 단백질의 에피토프는 아미노산 잔기 412∼423번을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 HCV E2 단백질의 에피토프는 아미노산 잔기 412∼423번으로 구성된다. 일 실시형태에서, 상기 HCV E2 단백질은 아미노산 잔기 413번, 418번 및/또는 420번을 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 인간 단일클론 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 HCV E2 단백질에 약 10×10-6 M 미만의 KD로 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 HCV E2 단백질(또는 이것의 단편)에 적어도 약 10×10-7 M, 적어도 약 10×10-8 M, 적어도 약 10×10-9 M, 적어도 약 10×10-10 M, 적어도 약 10×10-11 M, 또는 적어도 약 10×10-12 M의 KD 또는 더욱 더 바람직한 KD로 특이적으로 결합한다.
다양한 다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 클론 83-128에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 영역 아미노산 서열(서열 번호 1), 클론 95-2에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 영역 아미노산 서열(서열 번호 3) 또는 클론 073-1에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 영역 아미노산 서열(서열 번호 5)과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 클론 83-128에 의해 생성된 항체의 가변 경쇄 영역 아미노산 서열(서열 번호 2), 클론 95-2에 의해 생성된 항체의 가변 경쇄 영역 아미노산 서열(서열 번호 4) 또는 클론 073-1에 의해 생성된 항체의 가변 경쇄 영역 아미노산 서열(서열 번호 6)과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 클론 83-128에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 영역 아미노산 서열(서열 번호 1), 클론 95-2에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 영역 아미노산 서열(서열 번호 3) 또는 클론 073-1에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 영역 아미노산 서열(서열 번호 5)과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 클론 83-128의 가변 경쇄 아미노산 서열(서열 번호 2), 95-2의 가변 경쇄 아미노산 서열(서열 번호 4) 또는 073-1의 가변 경쇄 아미노산 서열(서열 번호 5)과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산을 포함하는 가변 경쇄 영역을 둘 다 포함한다.
다른 특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 클론 83-128, 95-2 또는 073-1에 의해 생성된 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 특이적으로 결합하고/하거나, HCV 또는 이것의 일부분에 대한 결합을 위해 클론 83-128, 95-2 또는 073-1에 의해 생성된 항체와 경쟁한다.
상기 항체 또는 이것의 항원 결합 부분의 가변 중쇄 및 경쇄 영역은 일반적으로 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 이것은 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 가변 중쇄 CDR은 클론 83-128에 의해 생성된 항체의 CDR(서열 번호 7∼9), 클론 95-2에 의해 생성된 항체의 CDR(서열 번호 10∼12) 또는 클론 073-1에 의해 생성된 항체의 CDR(서열 번호 13∼15)과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%, 또는 그 이상 동일하다. 다른 특정 실시형태에서, 가변 경쇄 CDR은 클론 83-128에 의해 생성된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR(서열 번호 16∼18), 클론 95-2에 의해 생성된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR(서열 번호 19∼21) 또는 클론 073-1에 의해 생성된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR(서열 번호 22∼24)과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%, 또는 그 이상 동일하다.
따라서, 본 발명의 특정 항체 또는 단편은 클론 83-128에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 영역의 CDR(서열 번호 7∼9), 클론 95-2에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 영역의 CDR(서열 번호 10∼12) 또는 클론 073-1에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 영역의 CDR(서열 번호 13∼15)과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%, 또는 그 이상 동일한 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 클론 83-128에 의해 생성된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR(서열 번호 16∼18), 클론 95-2에 의해 생성된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR(서열 번호 19∼21) 또는 클론 073-1에 의해 생성된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR(서열 번호 22∼24)과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상 동일한 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다.
상기 항체 또는 이것의 항원 결합 부분의 가변 중쇄 영역은 또한 클론 83-128에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 영역의 CDR(서열 번호 7∼9), 클론 95-2에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 영역의 CDR(서열 번호 10∼12) 또는 클론 073-1에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 영역의 CDR(서열 번호 13∼15)과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%, 또는 그 이상 동일한 3개의 CDR 전부 및/또는 클론 83-128에 의해 생성된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR(서열 번호 16∼18), 클론 95-2에 의해 생성된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR(서열 번호 19∼21) 또는 클론 073-1에 의해 생성된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR(서열 번호 22∼24)과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상 동일한 3개의 CDR 전부를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 상기 항체의 가변 중쇄 영역 또는 이것의 항원 결합 부분은 또한 서열 번호 87∼89에 제시된 하나 이상의 중쇄 공통 서열 CDR 및/또는 서열 번호 90∼92에 제시된 하나 이상의 경쇄 공통 서열 CDR을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 인간 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 (a) 인간 VH 3-33 유전자에 의해 코딩되거나 이로부터 유래되는(즉, 이것의 생성물인) 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 인간 Vκ L6 유전자에 의해 코딩되거나 이로부터 유래되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 인간 단일클론 항체는, 예를 들어 이펙터 도메인(예를 들어, Fc 도메인)을 포함하는 전체 길이 항체뿐만 아니라 항체 일부분 또는 단편, 예컨대 단일쇄 항체 및 Fab 단편을 포함한다. 상기 항체는 또한 다양한 치료제(예를 들어, 항바이러스제 또는 독소) 및/또는 표지에 연결될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하이브리도마 클론 83-128, 073-1, 95-2, 95-14, 95-15, 95-18, 95-20, 95-21, 95-25, 95-26, 95-30, 95-38, 95-39, 95-42, 95-43, 95-48, 95-49, 95-52, 95-54, 95-58, 95-62 및 이들의 조합에 의해 생성된 항체의 항원 결합 부분을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호 25, 27 또는 29와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 동일한 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 서열 번호 26, 28 또는 30과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 동일한 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 전술한 핵산 중 어느 것을 단독으로 또는 조합하여(예를 들어, 하나 이상의 발현 벡터로부터 발현됨) 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 특징으로 한다.
본 발명의 항체를 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포는 다양한 진핵 세포, 예를 들어, 효모 세포, 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, 골수종 세포 또는 식물 세포를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HCV에 특이적으로 결합하여 상기 바이러스가 포유동물 세포를 감염시키는 능력을 억제하는 본 명세서에 기재된 것과 같은 1종 이상의 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물 및 키트를 특징으로 한다. 상기 조성물 또는 키트는 HCV에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체(예를 들어, 인간 단일클론 또는 다클론 항체) 또는 이들의 항원 결합 부분을 더 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 다클론 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 HCV E2 단백질에 특이적으로 결합한다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물 또는 키트는 (a) 제1 HCV 단리물에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 단일클론 항체; 및 (b) 제2 HCV 단리물에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 단일클론 항체를 둘 다 포함한다.
본 발명은 또한 HCV 질환, 예를 들어 HCV 매개 증상 또는 이환을 억제하는 데 유효한 양으로 본 명세서에 기재된 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이것의 항원 결합 부분(즉, HCV에 특이적으로 결합하는 것)을 피험체에 투여함으로써 피험체의 HCV 질환을 치료하는 방법을 특징으로 한다.
본 발명의 인간 단일클론 항체 또는 이것의 일부분(및 상기 항체 또는 이것의 일부분을 포함하는 조성물)은 피험체에게 다양한 적절한 방식으로, 예를 들어, 정맥내(IV), 피하(SC), 또는 근육내(IM)로 투여될 수 있다. 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 단독으로, 또는 다른 치료제, 예를 들어 제2 인간 단일클론 항체 또는 이것의 항원 결합 부분과 함께 투여될 수 있다. 일례로서, 상기 제2 인간 단일클론 항체 또는 이것의 항원 결합 부분은 제1 항체에 결합되는 단리물과 다른 제2 HCV 단리물에 특이적으로 결합한다. 또 다른 예로서, 상기 항체는 다른 제제, 예를 들어 항바이러스제와 함께 투여된다. 또 다른 예로서, 상기 항체는 다클론 γ-글로불린(예를 들어, 인간 γ-글로불린)과 함께 투여된다. 또 다른 예로서, 상기 항체는 HCV 백신 투여 전에, 후에 또는 동시에 투여된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HCV에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 인간 중쇄 이식유전자 및 인간 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 인간이 아닌 유전자이식 동물을 HCV, 예를 들어 생 또는 불활화 바이러스를 포함하는 조성물로 면역화하는 단계 및 상기 동물로부터 항체, 항체 생산 세포 또는 항체 코딩 핵산을 단리하는 단계를 포함한다. 상기 HCV는, 예를 들어 화학적 처리 및/또는 동결건조로 불활화할 수 있다. 이 방법은 HCV 또는 HCV E2 단백질에 대한 항체의 결합을 평가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 숙주 세포에서 인간 항체를 코딩하는 핵산(예를 들어, 항체의 항원 결합 영역 부분을 코딩하는 핵산)을 발현시킴으로써 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 전술한 핵산을 포함하는 하이브리도마(hybridoma) 또는 트랜스펙토마(transfectoma)를 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 인간 중쇄 이식유전자 및 인간 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 인간이 아닌 유전자이식 동물을, HCV 또는 HCV E2 단백질을 포함하는 조성물로 면역화하고, 상기 동물로부터 비장 세포를 단리하고, 상기 비장 세포로부터 하이브리도마를 생성하고, HCV 또는 이것의 HCV E2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택함으로써 HCV에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 하이브리도마를 제조하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기 HCV E2 단백질의 비입체구조 에피토프, 즉 아미노산 412∼464번, 412∼423번 또는 413∼420번을 포함하는 항원을 제공한다. 상기 항원은 항HCV E2 항체를 생성하거나, 그 존재를 스크리닝하거나, 검출하는 데 사용되거나, 또는 능동 면역요법의 제제로서, 즉 백신으로서 사용될 수 있다. 상기 항원은 단독으로, 또는 예를 들어 화학적 또는 유전자적으로 혼합 또는 접합된, 적절한 면역증강제(adjuvant) 또는 합텐과 함께 백신으로서 사용될 수 있다. 접합체는 변성독소, 바이러스 유사 입자(virus-like particle: VLP) 및 단백질 담체(모두 백신 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 디자인된 것임)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 능동 면역요법에 사용되는 항원은 또한 수동 면역요법과 함께, 예를 들어 본 명세서에 개시된 항HCV E2 항체 중 어느 것과 함께 사용될 수도 있다.
인간 단일클론 항체를 사용한 인간의 치료는 몇 가지 이점을 제공한다. 예를 들어, 상기 항체는 비인간 항체보다 인간에 있어서 면역원성이 더 적을 가능성이 있다. 이 치료법은 또한, 항체가 감염 부위에 도달하여 질병 유발 HCV를 바로 중화시키자 마자 HCV 불활화가 일어날 수 있기 때문에 신속하다. 인간 항체는 또한 비인간 항체보다 더 효율적으로 인체의 적소에 국재화한다. 게다가, 이 치료는 HCV에 특이적이고 재조합형이고 고순도이며, 종래의 치료법과는 달리 외래 물질로 오염될 가능성을 방지한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 후술하는 상세한 설명과 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
[도면의 간단한 설명]
도 1A 및 1B는 가용성 HCV 유전자형 1a E2-660(▲) 및 가용성 HCV 유전자형 1b E2-661(■)에 대한 인간 항체 95-2의 결합(도 1A) 및 인간 항체 83-128의 결합(도 1B)을 보여주는 그래프이다. ELISA 플레이트를 2 ㎍/ml의 항원으로 코팅하고 2배 희석된 항체로 프로빙하였다. 알칼리 포스파타제에 접합된 염소 항인간 2차 항체와 PNPP 기질로 결합된 항체를 검출하였다.
도 2A 및 2B는 인간 항체 95-2, 83-128 및 17C7(비관련 인간 mAb) 존재하에서의 다양한 HCV 유전자형 슈도바이러스에 의한 Hep3B 세포 감염의 중화를 보여주는 그래프이다. 5배 희석된 항체를 각각의 HCV 슈도바이러스와 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이 바이러스/항체 혼합물을 Hep3B 세포에 첨가한 후, 37℃에서 72시간 동안 항온처리하였다. 감염은 Brightglo 루시퍼라제 분석으로 정량하고 광 출력에 대해 Victor3 플레이트 판독기에서 판독하였다. 광견병 바이러스에 대한 인간 항체(17C7)를 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 3A 및 3B는, 환원(도 3A) 또는 비환원(도 3B) SDS-PAGE를 실시한 후 PVDF 멤브레인으로 이전한, HCV 유전자형 1a 및 1b 유래의 정제된 가용성 포유동물 발현 E2 단백질(E2-661)에 대한 항체 결합을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 웨스턴 블롯은 증강 화학발광 검출 시약과 함께 HRP에 접합된 항마우스 IgG(his) 또는 항인간 IgG(95-2 및 83-128)를 사용하여 항his 태그 단일클론(his), 83-128 및 95-2로 수행하였다. 가용성 E2의 유전자형은 블롯 위에 표시하였다. 검출에 사용된 1차 항체는 블롯 아래에 기재하였다. 킬로달톤으로 표시된 분자량 마커는 각 블롯 세트의 좌측에 기재하였다.
도 4는 박테리아 융합 단백질로서 발현된 HCV E2 412∼423 에피토프에 대한 인간 항체 95-2 및 83-128의 친화성을 보여주는 표이다. 염소 항인간 IgG Fc를 Biacore 칩에 아미드 커플링하였다. 인간 항체 95-2 및 인간 항체 83-128을 개별적으로 칩 상에 포획시키고 E2 412∼423 아미노산을 포함하는 E2-G 박테리아 발현 단백질을 다양한 농도로 흘려 보냈다. BIAevaluationTM 소프트웨어를 이용하여, 곡선을 피팅하고 친화도 상수를 계산하였다.
도 5는 E1 및 E2 포유동물 발현 단백질의 위치를 보여주는 HCV 폴리단백질의 맵이다. E1 및 E2 폴리단백질은 윗쪽에 아미노산 번호가 표시된 긴 흰색 박스로 위에 표시되어 있다. 막관통 도메인(TM)은 연회색 박스로 표시되어 있고, E2의 과가변 도메인 1(HVR1)은 진회색 박스로 표시되어 있다. 조작된 구성체로부터 발현된 포유동물 단백질은 진회색 막대로 아래에 표시되어 있다. 신호 펩티다제 절단 부위는 화살표로 표시되어 있다. 각각의 단백질 명칭 다음에 코딩된 아미노산을 괄호로 표시하고 발현된 단백질의 총 아미노산을 표시하였다.
도 6A 및 6B는 E2의 포유동물 발현 C 말단 절단체의 렉틴 포획 ELISA의 결과를 보여주는 그래프이다. E2 아미노산을 포함하는 E2 융합 단백질의 포유동물 발현 C 말단 절단체(도 7에 표시됨)를 포함하는 세포 배양 상청액을 ELISA 플레이트에 코팅하고 2배 희석된 인간 항체 95-2(도 6A) 및 83-128(도 6B) 및 마우스 6 히스티딘 태그 항체(his 태그)로 프로빙하였다. 결합된 항체는 알칼리 포스파타제에 접합된 염소 항인간 항체(95-2 및 83-128) 또는 염소 항마우스 항체(his 태그)와 PNPP 기질을 사용하여 검출하였다.
도 7은 E2의 아미노 말단의 80개 아미노산에 걸쳐 있는 박테리아에서 발현된 단백질을 보여주는 맵이다. E2 단백질의 처음 80개 아미노산은 윗쪽에 아미노산 번호가 표시된 흰색 박스로서 위에 표시되어 있다. 아미노 말단의 27개 아미노산 과가변 영역 1(HVR1)은 진회색 박스로 표시되어 있다. 조작된 구성체로부터 발현된 단백질은 막대 왼쪽의 명칭과 함께 연회색 막대로 표시되어 있고 막대 아랫쪽에는 단백질의 시작 부분과 끝부분에 아미노산 번호가 표시되어 있다.
도 8A, 8B 및 8C는 박테리아에서 발현된 E2의 처음 80개 아미노산 단편에 대한 인간 항체 95-2(도 8A) 및 83-128(도 8B) 및 마우스 6 히스티딘 태그 항체(his 태그)(도 8C)의 결합을 보여주는 그래프이다. E2 아미노산을 포함하는 박테리아 발현 융합 단백질(도 7에 표시됨)을 ELISA 플레이트에 코팅하고 2배 희석된 항체로 프로빙하였다. 결합된 항체는 알칼리 포스파타제에 접합된 염소 항인간 항체(95-2 및 83-128) 또는 염소 항마우스 항체(his 태그)와 PNPP 기질을 사용하여 검출하였다.
도 9A, 9B 및 9C는 돌연변이를 갖는 E2 아미노산 412∼423을 포함하는 박테리아 발현 융합 단백질에 대한 인간 항체 95-2(도 9A) 및 83-128(도 9B) 및 마우스 6 히스티딘 태그 항체(his 태그)(도 9C)의 결합을 보여주는 그래프이다. 표시된 아미노산이 알라닌으로 돌연변이된 E2 아미노산 412∼423을 포함하는 박테리아 발현 융합 단백질을 ELISA 플레이트에 코팅하고 2배 희석된 항체로 프로빙하였다. 결합된 항체는 알칼리 포스파타제에 접합된 염소 항인간 항체(95-2 및 83-128) 또는 염소 항마우스 항체(his 태그)와 PNPP 기질을 사용하여 검출하였다.
도 10은 NIH에서 제공하는 Los Alamos HCV Sequence Database로부터의 E2 아미노산 412∼423 정렬을 보여주는 표이다. 아미노산 412∼423에 대한 프로토타입 유전자형 1a 서열의 단문자 아미노산 코드가 차트의 상좌측에 기재되어 있다(1a). 1a 서열과 동일한 임의의 아미노산은 점선으로 표시하였고, 임의의 위치에 표시된 아미노산은 프로토타입 유전자형 1a 서열과 상이한 것이다. 이러한 12개 아미노산 서열이 압축된 데이터베이스에서 확인된 횟수를 카운트 아래에 기재하였으며, 전체에 대한 백분율을 백분율 아래에 기재하였다. 본 발명의 유전자형 1a 및 1b 가용성 E2 단백질의 서열은 윗쪽 두 줄에 기재되어 있다.
도 11은 다른 유전자형 유래의 E2 아미노산 412∼423을 보여주는 표이다. 아미노산 412∼423에 대한 단문자 아미노산 코드가 프로토타입 유전자형 1a 서열로부터의 변화(밑줄)를 포함하는 단리물에 대해 기재되어 있다. 유전자형의 명칭은 우측에 기재되어 있으며 그 뒤로 괄호로 표시된 Genbank 수탁 번호가 기재되어 있다.
도 12A, 12B 및 12C는 다른 유전자형 유래의 E2 아미노산 412∼423에 대한 인간 항체 95-2(도 12A) 및 83-128(도 12B) 및 마우스 6 히스티딘 태그 항체(his 태그)(도 12C)의 결합을 보여주는 그래프이다. 표시된 유전자형 유래의 서열을 갖는 E2 아미노산 412∼423을 포함하는 박테리아 발현 융합 단백질을 ELISA 플레이트에 코팅하고 2배 희석된 항체로 프로빙하였다. 결합된 항체는 알칼리 포스파타제에 접합된 염소 항인간 항체(95-2 및 83-128) 또는 염소 항마우스 항체(his 태그)와 PNPP 기질을 사용하여 검출하였다.
도 13은 제한 부위를 포함하는 부가된 말단(볼드체의 소문자로 표시됨), 제한 효소 절단을 최적화하기 위한 추가적인 돌출부(밑줄친 소문자로 표시됨), 공통 Kozak 서열(볼드체의 밑줄친 소문자로 표시됨) 및 ATG 개시 코돈(볼드체의 밑줄친 대문자로 표시됨)을 포함하는 E1/E2 코돈 최적화 1a H77 서열(서열 번호 31)을 도시한다.
도 14는 클론 83-128(서열 번호 1), 95-2(서열 번호 3), 95-14(서열 번호 32), 95-38(서열 번호 33), 95-25(서열 번호 34), 95-42(서열 번호 35), 95-43(서열 번호 36), 95-49(서열 번호 37), 95-54(서열 번호 38), 95-58(서열 번호 39) 및 95-62(서열 번호 40)로부터 유래되고 E2-660 HCV 당단백질의 에피토프 412∼423에 대해 반응성을 나타내는 항체의 중쇄 가변 영역의 정렬을 도시한다.
도 15는 클론 83-128(서열 번호 2), 073-1(서열 번호 6), 95-2(서열 번호 4), 95-14(서열 번호 44) 및 95-38(서열 번호 53)로부터 유래된 항체의 경쇄 가변 영역의 정렬을 도시한다.
[상세한 설명]
본 발명을 더 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 먼저 특정 용어들을 정의한다. 상세한 설명 전반에 걸쳐 추가적인 정의도 설명한다.
정의
본 명세서에서 "C형 간염 바이러스", "HCV", "비A형 비B형 간염", 또는 "NANBH"는 서로 교환하여 사용될 수 있으며, C형 간염 바이러스의 RNA에 의해 코딩되거나 자연적 대립유전자 변이에 의해 발생되는 비리온의 임의의 "유전자형" 또는 "유전자 아형"("아형"이라고도 함), 또는 그 일부분(예를 들어, HCV의 유전자형 1a의 E2 단백질의 일부분)을 포함한다.
HCV는 5' 비번역 영역과, 그 뒤로 이어지는 약 3,010개 아미노산을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 구성된다. 상기 ORF는 342∼8,955 염기쌍의 뉴클레오티드에 걸쳐 있고 그 뒤로 3' 말단쪽에 또 다른 비번역 영역이 있다. 이 아미노산은 5'쪽에서 3'쪽으로 순서대로 10개 단백질, 즉 C; E1; E2; NS1; NS2; NS3; NS4(a 및 b); 및 NS5(a 및 b)로 세분된다. 이들 단백질은, 숙주 프로테아제 및 바이러스 프로테아제 둘 다에 의한 더 큰 폴리단백질의 절단으로부터 형성된다. 상기 C, E1 및 E2 단백질은 구조 단백질이고 NS1-NS5 단백질은 비구조 단백질이다. C 영역은 코어 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩한다. E1 및 E2는 바이러스를 피복하는 글리코실화된 외피 단백질이다. NS2는 아연 금속 프로테인아제일 수 있다. NS3은 헬리카제이다. NS4a는 NS4b와 NS5a 사이의 절단에 관여하는 세린 프로테아제 보조 인자로서 기능한다. NS5a는 세린 인단백질로서 그 기능은 알려져 있지 않다. 상기 NS5b 영역은 RNA 의존적 RNA 폴리머라제와 말단 트랜스퍼라제 활성을 둘 다 갖는다.
코어 단백질에 있어서의 변이에 의해 분류되는 약 여섯 개(6)의 상이한 유전자형(예를 들어, 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6)이 있으며, 각각의 유전자형 내에는 추가적인 변이를 나타내는 80개 이상의 유전자 아형이 있는데, 이들 중 일부는 1a; 1b; 1c; 2a; 2b; 2c; 3a; 3b; 4a; 4b; 4c; 4d; 4e; 5a; 및 6a를 포함한다.
본 명세서에서 언급되는 "항체"란 용어는 완전한 항체 및 이것의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원 결합 부분") 또는 단일쇄를 포함한다. "항체"란, 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질, 또는 그 항원 결합 부분을 말한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 상기 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, 즉 CL로 이루어진다. 상기 VH 영역 및 VL 영역은 골격구조 영역(FR)이라 불리는 더 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 과가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 하기 순서로 배열되는 3개의 CDR 및 4개의 FR, 즉 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 이루어진다. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 상기 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자[면역계의 각종 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분(Clq)을 포함함]에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 항체의 "항원 결합 부분"(또는 간단히 "항체 일부분")이란 용어는 항원(예를 들어, HCV)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원 결합 기능은 전체 길이 항체의 단편에 의해서도 발휘될 수 있는 것으로 확인되었다. 항체의 "항원 결합 부분"이란 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) Fab 단편, 즉 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉 힌지 영역에서 다이설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 한쪽 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편[Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]; 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 (vii) 경우에 따라 합성 링커에 의해 연결될 수 있는 2개 이상의 분리된 CDR의 조합을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, 즉 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합법을 이용하여, VL 영역과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자[단일쇄 Fv(scFv)라 함]를 형성한 단일 단백질쇄로 만들 수 있는 합성 링커에 의해 이들을 연결할 수 있다[참고 문헌: Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]. 이러한 단일쇄 항체도 또한 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에도 포함되는 것으로 한다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 알려진 통상의 기법을 이용하여 얻을 수 있으며, 이 단편을 완전한 항체와 동일한 방식으로 유용성이 있는지에 대해 스크리닝한다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기법, 또는 완전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조할 수 있다.
"이중 특이성" 또는 "이중 기능성" 항체란 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍을 가지고 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체를 말한다. 이중 특이성 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 비롯한 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어, 문헌[Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)]; 문헌[Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)]을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "단일클론 항체"란 용어는 단일 결합 특이성을 나타내고 특정 에피토프에 대해 친화성을 나타내는 항체를 말한다. 따라서, "인간 단일클론 항체"란 용어는 단일 결합 특이성을 나타내고 인간 생식세포계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 말한다. 일 실시형태에서, 인간 단일클론 항체는, 인간 중쇄 이식유전자와 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 인간이 아닌 유전자이식 동물(예를 들어, 유전자이식 마우스)로부터 얻은 B 세포를 불멸화 세포에 융합시킨 것을 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 명세서에서 사용되는 "재조합 인간 항체"란 용어는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 면역글로불린 유전자가 이식된 동물(예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환시킨 숙주 세포(예를 들어, 트랜스펙토마)로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. 그러나, 일부 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체에 대해 시험관내 돌연변이 유발(또는, 인간 Ig 서열 유전자가 이식된 동물이 사용될 경우, 시험관내 체세포 돌연변이 유발)을 실시할 수 있으며, 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포계 VH 서열 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되어 있지만 생체내 인간 항체 생식세포계 레퍼토리에 본래는 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
"인간 항체"란 용어는 인간 생식세포계 면역글로불린 서열의 가변 영역 및 불변 영역(존재할 경우)을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포계 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이 유발에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다[참고 문헌: Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; 및 Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546]. 그러나, "인간 항체"란 용어는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식세포계로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격구조 서열로 이식된 항체(즉, 인간화된 항체)를 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "이종성 항체(heterologous antibody)"란 이러한 항체를 생산하는 비인간 유전자이식 유기체와 관련하여 정의된다. 이 용어는, 상기 비인간 유전자이식 동물로 구성되지 않은 유기체에서 발견되고 일반적으로 상기 비인간 유전자이식 동물의 종 이외의 다른 종으로부터 유래되는 아미노산 서열 또는 그에 상응하는 코딩 핵산 서열을 갖는 항체를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "단리된 항체"란 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 실질적으로 포함하지 않는 항체(예를 들어, HCV에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 HCV가 아닌 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 포함하지 않음)를 의미하는 것이다. 또한, 단리된 항체는 일반적으로 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질을 실질적으로 포함하지 않는다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상이한 HCV 특이성을 갖는 "단리된" 단일클론 항체의 조합은 정의가 명확한 조성물로 조합된다.
"에피토프" 또는 "항원 결정 부위"란 용어는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위(예를 들어, HCV의 E1 또는 E2, 예를 들어, E2의 아미노산 412∼464)를 말한다. 에피토프는 인접된 아미노산으로부터 형성될 수도 있고 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 비인접 아미노산으로부터 형성될 수도 있다. 인접된 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출되어도 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매로 처리시 일반적으로 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체구조로 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체구조를 결정하는 방법으로는 당업계에 공지된 기법 및 본 명세서에 기재된 기법, 예를 들어 x선 결정학적 분석 및 2차원 핵 자기 공명을 들 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 에피토프(또는 항원 결정 부위)는, 더 큰 아미노산 분절(예를 들어, 3차원 구조를 갖는 단백질)에 내에 있을 때에도 에피토프/항원 결정 부위에 대한 친화성의 추가적인 증가가 관찰되지 않는다는 점에서 선형 에피토프로서 기능한다.
본 명세서에서 사용되는 "특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합하는", 및 "특이적으로 결합하는"이란 표현들은 특정 항원 상의 에피토프에 대한 항체의 결합을 나타낸다. 일반적으로, 항체는, 피분석물로서 재조합 HCV를, 리간드로서 항체를 사용하여 BIACORE 3000 장치로 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법에 의해 측정시 약 10-7 M 미만, 예컨대 약 10　-8 M 미만, 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만 또는 그 이하의 친화력(KD)으로 결합하며, 특정 항원 또는 밀접하게 관련된 항원이 아닌 비특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인)에의 결합에 대한 그 친화력보다 적어도 2배 더 큰 친화력으로 상기 특정 항원에 결합한다. 본 명세서에서 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"란 어구는 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"란 표현과 서로 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 인간 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 즉, HCV에의 결합을 위해 경쟁하는 항체를 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는, 예를 들어 한 항체가, 다른 항체가 표적 항원에 결합하는 것을 차단하는 능력을 보여줌으로써(즉, 경쟁적 결합 분석), 면역분석과 같은 통상적인 기법을 이용하여 확인할 수 있다. 경쟁적 결합은, 테스트 대상 면역글로불린이 HCV와 같은 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 분석으로 측정한다. 많은 유형의 경쟁적 결합 분석이 공지되어 있으며, 그 예로는 고상 직접 또는 간접 방사능 면역분석(RIA), 고상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석[참고 문헌: Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)]; 고상 직접 바이오틴-아비딘[참고 문헌: Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)]; 고상 직접 표지 분석, 고상 직접 표지 샌드위치 분석[참고 문헌: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)]; I-125 표지를 이용한 고상 직접 표지 RIA[참고 문헌: Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)]; 고상 직접 바이오틴-아비딘 EIA[Cheung et al., Virology 176:546 (1990)]; 및 직접 표지 RIA[Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)]를 들 수 있다. 일반적으로, 이같은 분석은 이들 중 어느 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원, 비표지 테스트 면역글로불린 및 표지된 참조 면역글로불린의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 테스트 면역글로불린 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정함으로써 측정한다. 통상적으로, 테스트 면역글로불린은 과량 존재한다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재할 경우, 이것은 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 적어도 50∼55%, 55∼60%, 60∼65%, 65∼70% 70∼75% 또는 그 이상 억제한다.
본 명세서에서 사용되는 "KD"란 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 의미한다. 일반적으로, 본 발명의 인간 항체는, 피분석물로서 재조합 인간 HCV를, 리간드로서 상기 항체를 사용하여 BIACORE 3000 장치로 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법에 의해 측정시 약 10-7 M 미만, 예컨대 약 10-8 M 미만, 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만 또는 그 이하의 해리 평형 상수(KD)로 HCV에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 "Koff"란 용어는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 해리 속도 상수를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "EC50"이란 용어는, 시험관내 또는 생체내 분석에서, 최대 반응의 50%, 즉, 최대 반응과 기저값 사이의 중간 지점에 해당하는 반응을 유발하는 항체 또는 이것의 항원 결합 부분의 농도를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "아이소타입"이란 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 말한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 IgG1 아이소타입이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 IgG2 아이소타입이다.
본 명세서에서 사용되는 "HCV를 중화하는", "HCV를 억제하는" 및 "HCV를 차단하는"이란 표현들은 본 발명의 항체가 HCV가 특정 세포를 감염시키는 것을 막는 능력을 나타내기 위해 서로 교환하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "비입체구조 에피토프"란 표현은 일반적으로 이러한 에피토프에 결합할 수 있는 항체와 결합하기에 충분한 인접된 아미노산 서열로 이루어진 선형 에피토프를 의미한다. 이것은 에피토프와 항체와의 결합이 일어나도록 3차원 구조를 형성하기 위해 불연속 아미노산 서열을 필요로 하는 입체구조 에피토프와 대조를 이룬다. 선형 에피토프는 또한, (예를 들어, 본 명세서에 기재된 것과 같은 면역블롯 분석에서) 변성 조건하에 이 에피토프가 이러한 에피토프를 인식하는 항체에 의해 여전히 결합될 수 있다는 점에서 입체구조 에피토프와 구별될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들어 잔기 412∼423을 포함하거나, 또는 잔기 412∼423으로 구성된 선형의, 예를 들어 비입체구조의 HCV E2 에피토프를 제공한다. 관련된 실시형태에서, 본 발명의 항체는 그러한 선형 에피토프에는 특이적으로 결합하지만 입체구조 에피토프에는 특이적으로 결합하지 않는다. 또한, 본 발명은 백신 개발, 항체의 생성에 사용되고/되거나 능동 면역요법 단독으로 또는 수동 면역요법과 함께 사용하기에 적합한 선형 에피토프를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 "아이소타입 스위칭"이란 항체의 클래스 또는 아이소타입이 한 Ig 클래스에서 다른 Ig 클래스 중 하나로 변경되는 현상을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "비스위칭 아이소타입"이란 아이소타입 스위칭이 발생하지 않을 때 생성되는 중쇄의 아이소타입 클래스를 말하며; 비스위칭 아이소타입을 코딩하는 CH 유전자는 일반적으로 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자로부터 바로 하류에 있는 제1 CH 유전자이다. 아이소타입 스위칭은 전형적 아이소타입 스위칭 또는 비전형적 아이소타입 스위칭으로서 분류되었다. 전형적 아이소타입 스위칭은 이식유전자 내의 하나 이상의 스위치 서열 영역을 연루시키는 재조합 사건에 의해 발생된다. 비전형적 아이소타입 스위칭은, 예를 들어, 인간 σμ 및 인간 Σμ 간의 상동성 재조합(δ 관련 결실)에 의해 발생될 수 있다. 대안적인 비전형적 스위칭 메커니즘, 예컨대 특히 이식유전자간 및/또는 염색체간 재조합이 발생하여 아이소타입 스위칭이 일어날 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "스위치 서열"이란 용어는 스위치 재조합을 담당하는 DNA 서열을 말한다. "스위치 도너" 서열, 일반적으로 μ 스위치 영역이 스위치 재조합 과정에서 결실되는 구성체 영역의 5'(즉, 상류)이 된다. "스위치 억셉터" 영역은 결실되는 구성체 영역과 대체 불변 영역(예를 들어, γ, ε 등) 사이가 된다. 항상 재조합이 일어나는 특정한 부위는 없기 때문에, 최종 유전자 서열은 일반적으로 그 구성체로부터 예측이 불가능하다.
본 명세서에서 사용되는 "글리코실화 패턴"이란 단백질에, 보다 구체적으로 면역글로불린 단백질에 공유 결합되는 탄수화물 단위의 패턴으로서 정의된다. 당업자가, 이종성 항체의 글리코실화 패턴이, 이식유전자의 CH 유전자가 유래된 종보다는 비인간 유전자이식 동물의 종에 있어서의 글리코실화 패턴과 더 유사하다고 인정할 때, 이종성 항체의 글리코실화 패턴은 비인간 유전자이식 동물의 종에 의해 생성된 항체에서 자연적으로 나타나는 글리코실화 패턴과 실질적으로 유사한 것을 특징으로 할 수 있다.
어떤 대상과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "천연(자연 발생)"이란 용어는 그 대상을 자연에서 발견할 수 있다는 사실을 나타낸다. 예를 들어, 자연의 공급원으로부터 단리할 수 있으며 실험실에서 인간이 의도적으로 조작한 것이 아닌 유기체(바이러스를 포함함) 내에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 천연이라 한다.
본 명세서에서 사용되는 "재배열된"이란 용어는, V 분절이 각각 실질적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 입체구조(conformation)로 V 분절이 D-J 분절 또는 J 분절 바로 가까이에 위치하는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 입체배열(configuration)을 의미한다. 재배열된 면역글로불린 유전자좌는 생식세포계 DNA와의 비교를 통해 확인할 수 있으며; 재배열된 유전자좌는 하나 이상의 재조합 헵타머/노나머 상동성 요소를 가지게 된다.
V 분절과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "비재배열된" 또는 "생식세포계 입체배열"이란 표현은, V 분절이 D 분절 또는 J 분절에 바로 인접하도록 재조합되지 않은 입체배열을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "핵산 분자"란 용어는 DNA 분자와 RNA 분자를 포함하는 것이다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
HCV에 결합하는 항체 또는 항체 일부분(예를 들어, VH, VL, CDR3)을 코딩하는 핵산과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "단리된 핵산 분자"란 표현은, 항체 또는 항체 일부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 HCV 이외의 항원에 결합하는 항체를 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열(상기 다른 서열은 본래 인간 게놈 DNA에서 상기 핵산의 측면에 위치할 수 있다)을 포함하지 않는 핵산 분자를 나타내는 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 서열 번호에 개시된 서열의 "보존적 서열 변형", 즉, 해당 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 해당 아미노산 서열을 포함하는 항체의 항원에 대한 결합을 파괴하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형을 포함한다. 이러한 보존적 서열 변형은 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 예를 들어, 변형은 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발과 같은 당업계에 공지된 표준 기법에 의해 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타 분지형 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 인간 항HCV 항체 내의 예상 비필수 아미노산 잔기를 동일한 측쇄 패밀리에 속하는 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것이 바람직하다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산의 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다[참고 문헌: Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)].
대안으로, 또 다른 실시형태에서, 포화 돌연변이 유발 등에 의해 항HCV 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 돌연변이를 도입하고, 얻어진 변형된 항HCV 항체를 결합 활성에 대해 스크리닝할 수 있다.
"공통 서열(consensus sequence)"은 관련된 서열의 패밀리에서 발생 빈도가 가장 높은 아미노산(또는 뉴클레오티드)으로부터 형성된 서열이다[참고 문헌: Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)]. 단백질 패밀리에 있어서, 상기 공통 서열의 각 위치는 그 패밀리의 해당 위치에서 발생 빈도가 가장 높은 아미노산이 차지한다. 2개 아미노산이 동일한 빈도로 발생할 경우, 어느 하나를 공통 서열에 포함시킬 수 있다. 면역글로불린의 "공통 골격구조"란 공통 면역글로불린 서열 내의 골격구조 영역을 말한다.
도 14에 도시된 바와 같이, 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역 CDR에 대한 공통 서열은 E2-660 HCV 당단백질의 에피토프 412∼423에 대해 반응성을 나타내는 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 최적 정렬하여 도출한다. 예를 들어, 클론 83-128(서열 번호 1), 95-2(서열 번호 3), 95-14(서열 번호 32), 95-38(서열 번호 33), 95-25(서열 번호 34), 95-42(서열 번호 35), 95-43(서열 번호 36), 95-49(서열 번호 37), 95-54(서열 번호 38), 95-58(서열 번호 39) 및 95-62(서열 번호 40)로부터 유래된 항체를, CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 공통 서열을 얻기 위해 최적으로 정렬한다. 이에 따라, 중쇄 가변 영역의 CDR1에 대한 공통 서열은 서열 번호 87에 제시된 "1YGMH"인 것으로 확인되며, 여기서 "1"은 소형 및 극성 아미노산 잔기를 나타낸다. 중쇄 가변 영역의 CDR2에 대한 공통 서열은 서열 번호 88에 제시된 "VIWXDX7NXYYADS1516G"인 것으로 확인되며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, "7"은 소형 및 극성 아미노산 잔기를 나타내며, "15"는 소수성 아미노산 잔기를 나타내고, "16"은 극성 및 양으로 하전된 아미노산 잔기를 나타낸다. 중쇄 가변 영역의 CDR3에 대한 공통 서열은 서열 번호 89에 제시된 "ARDI567XR10X12IYFD17"인 것으로 확인되며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, "5"는 페닐알라닌을 나타내거나 아미노산이 없음을 나타내며, "6"은 세린 또는 트레오닌을 나타내고, "7" 및 "12"는 소수성 아미노산 잔기를 나타내고, "10"은 소형 아미노산 잔기를 나타내며, "17"은 방향족 아미노산 잔기를 나타낸다.
마찬가지로, 경쇄 가변 영역의 CDR에 대한 공통 서열은, 도 15에 도시된 바와 같이, E2-660 HCV 당단백질의 에피토프 412∼423에 대해 반응성을 나타내는 항체의 아미노산 서열을 최적 정렬하여 도출할 수 있다. 예를 들어, 클론 83-128(서열 번호 2), 073-1(서열 번호 6), 95-2(서열 번호 4), 95-14(서열 번호 44) 및 95-38(서열 번호 53)로부터 유래된 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을, 상기 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 공통 서열을 얻기 위해 최적으로 정렬한다. 상기 경쇄 가변 영역의 CDR1에 대한 공통 서열은 서열 번호 90에 제시된 "RASQSVXSYLA"인 것으로 확인되고, 여기서 "X"는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 상기 경쇄 가변 영역의 CDR2에 대한 공통 서열은 서열 번호 91에 제시된 "DASNRAT"인 것으로 확인된다. 상기 경쇄 가변 영역의 CDR3에 대한 공통 서열은 서열 번호 92에 제시된 "QQRSNW7T"인 것으로 확인되며, 여기서 "7"은 소형 및 소수성 아미노산 잔기를 나타낸다.
핵산에 있어서, "실질적인 상동성"이란 표현은 2개의 핵산 또는 이것의 지정된 서열이 최적으로 정렬되어 비교되었을 때 이들이 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 가지면서 뉴클레오티드의 적어도 약 80%, 일반적으로 적어도 약 90%∼95%, 더 바람직하게는 적어도 약 98%∼99.5%에 있어서 동일한 것을 의미한다. 대안으로, 실질적인 상동성은 분절들이 선택적 하이브리드화 조건하에 가닥의 상보 가닥에 하이브리드화할 경우 존재한다.
두 서열 간의 동일성(%)은, 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려했을 때의, 서열들이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수(즉, 상동성(%) = 동일한 위치의 수/위치의 총수×100)이다. 두 서열 간의 서열 비교 및 동일성(%) 측정은 후술하는 비제한적인 실시예에 기재된 바와 같은 수학적 알고리즘을 이용하여 수행할 수 있다.
두 뉴클레오티드 서열 간의 동일성(%)은, NWSgapdna.CMP 행렬 및 갭 가중치 40, 50, 60, 70 또는 80 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 이용하고, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하여 측정할 수 있다. 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 동일성(%)은 또한, PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 페널티 4를 이용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)으로 통합된 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘[CABIOS, 4:11-17 (1989)]을 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 동일성(%)은, Blossum 62 행렬 또는 PAM250 행렬 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 이용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램으로 통합된 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘[J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)]을 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 또한, 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위해, 예를 들어 관련된 서열을 확인하기 위해, "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]을 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해, NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어 길이 = 12를 이용하여 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행할 수 있다. 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해서는, XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3을 이용하여 BLAST 단백질 검색을 수행할 수 있다. 비교를 목적으로 갭이 있는 정렬을 얻기 위해서는, 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Res. 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST를 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 이용할 수 있다.
상기 핵산은 전체 세포에, 세포 용해물에, 또는 부분 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 알려진 다른 방법을 비롯한 표준 기법에 의해, 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포내 핵산 또는 단백질로부터 정제되었을 때 "단리된" 또는 "실질적으로 정제된" 것이라고 한다. 이와 관련하여, 문헌[F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조할 수 있다.
cDNA, 게놈 또는 또는 이들의 혼합물 유래의 본 발명의 핵산 조성물은 종종 천연 그대로의 서열(변형된 제한 부위 등은 제외)로도 존재하지만 표준 기법에 따라 돌연변이되어 유전자 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열의 경우, 이러한 돌연변이는 원하는 대로 아미노산 서열을 변경할 수 있다. 특히, 천연 그대로의 V, D, J 서열, 불변 서열, 스위치 서열 및 본 명세서에 기재된 그 밖의 이러한 서열과 실질적으로 상동성이거나 이로부터 유래된 DNA 서열이 고려된다(여기서, "유래된"이란 서열이 다른 서열과 동일하거나 그로부터 변경되었음을 나타냄).
핵산이 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있도록 배치될 때 이 핵산을 "작동 가능하게 연결되어 있다"라고 한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 이것이 서열의 전사에 영향을 미칠 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 전사 조절 서열과 관련하여, "작동 가능하게 연결된"이란 연결된 DNA 서열이 연속적이고, 필요에 따라 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 연속적이며 리딩 프레임 내에 있음을 의미한다. 스위치 서열의 경우, "작동 가능하게 연결된"이란 서열들이 스위치 재조합을 수행할 수 있음을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "벡터"란 용어는 자신에게 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"가 있는데, 플라스미드란 추가의 DNA 분절을 결찰시킬 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 벡터의 또 다른 유형으로는 추가적인 DNA 분절을 바이러스 게놈으로 결찰시킬 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 일부 벡터는 숙주 세포로 도입될 때 이 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로 도입될 때 숙주 세포의 게놈으로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 일부 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본 명세서에서 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태이다. 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 유형이기 때문에, 본 명세서에서는 "플라스미드"와 "벡터"가 서로 교환하여 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)와 같은 이같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함하고자 한다.
본 명세서에서 사용되는 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히, "숙주 세포")란 용어는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 말한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손까지 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후대에 특정한 변형이 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손은 어버이 세포와 실제로는 동일하지 않을 수도 있지만, 본 명세서에서 사용되는 "숙주 세포"라는 용어의 범위에는 여전히 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "치료하다", "치료하는", 및 "치료"란 표현들은 본 명세서에 기재된 치료 또는 예방 수단을 의미한다. "치료" 방법은 이러한 치료를 요하는 피험체, 예를 들어 HCV 매개 질환을 앓고 있는 피험체 또는 결국 그러한 질환에 걸릴 수 있는 피험체에게, 상기 질환을 예방, 치유, 지연시키거나, 그 중증도를 경감하거나, 그 하나 이상의 증상을 완화할 목적으로, 또는 이러한 치료를 하지 않았을 때 예상되는 것보다 길게 피험체의 생존을 연장시킬 목적으로, 본 발명의 인간 항체를 투여하는 것을 이용한다.
본 명세서에서 사용되는 "HCV 매개 질환"이란 용어는 HCV 감염과 관련된 질병 상태 및/또는 증상을 포함한다. 일반적으로, "HCV 매개 질환"이란 용어는 HCV의 관여를 요하는 임의의 질환, 또는 그 증상의 개시, 진행 또는 지속을 의미한다. 대표적인 HCV 매개 질환으로는, 예를 들어 간경화 및 간암을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
"유효량" 또는 "유효 투여량"이란 용어는 원하는 효과를 얻기에 또는 적어도 부분적으로 원하는 효과를 얻기에 충분한 양으로서 정의된다. "치료학적으로 유효한 양"이란 질병 또는 그 질병을 이미 앓고 있는 환자에 있어서의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로서 정의된다. 이러한 용도에 유효한 양은 치료 대상 질환의 중증도 및 환자 자신의 면역계의 전반적 상태에 따라 달라진다.
"환자"란 용어는 예방적 또는 치료적 처치를 받는 인간 및 다른 포유동물 피험체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "피험체"란 용어는 임의의 인간 또는 인간이 아닌 동물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물은, 염증성 질환, 예를 들어 류마티스 관절염과 같은 관절염을 앓고 있는 피험체를 치료하는 데 사용될 수 있다. "인간이 아닌 동물(비인간 동물)"이란 용어는 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 인간이 아닌 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
달리 정의하지 않는다면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 적절한 방법 및 재료는 후술하는 것들이다. 상충이 있는 경우, 정의를 비롯한 본 명세서는 조절될 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시를 위한 것으로서 한정을 의도한 것이 아니다.
본 발명의 다양한 양태들을 하기 서브섹션에서 더욱 상세히 설명할 것이다.
개요
HCV는 인간에게 치명적인 간세포 병리 현상을 유발한다. 본 명세서에서는, 특히 HCV에 감염된 동물, 더 특히, 인간 피험체의 치료 및 예방을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 HCV E2 단백질 또는 이것의 일부분을 인식하는 항체를 포함한다. 특히, 재조합 완전 인간 단일클론 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, 이러한 인간 단일클론 항체는 인간 면역글로불린 유전자 분절을 발현하는 마우스에서 생산된다(후술함). 항HCV 항체의 조합 역시 제공된다.
본 발명의 신규한 방법은 피험체의 HCV 매개 질환을 억제하기 위해 HCV에 결합하는 항체(및 이것의 항원 결합 부분)를 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 인간 단일클론 항HCV 항체는 HCV를 중화시키고 HCV 감염 및 그 후유증, 예를 들어 간경화 및/또는 간염을 억제할 수 있다. 다른 예로서, HCV 매개 질환을 억제하기 위해 항HCV 항체(예를 들어, 항HCV E2 단백질 단일클론 항체)의 조합을 투여할 수 있다. 상기 인간 단일클론 항체는 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다.
Ⅰ. HCV에 대한 인간 항체의 제조
본 발명은 HCV, 예를 들어 인간 HCV에 결합하는 완전 인간 항체를 포함한다. HCV에 결합하는 예시적인 인간 단일클론 항체는 83-128, 95-2, 95-14, 95-38 및 073-1을 포함한다.
본 발명의 인간 단일클론 항체는 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)]에 기재된 표준 체세포 하이브리드화 기법과 같은 다양한 공지된 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 체세포 하이브리드화 기법이 바람직하긴 하지만, 원칙적으로 다른 단일클론 항체 제조 기법, 예를 들어 B 림프구의 바이러스 또는 암 유전자 형질전환, 인간 항체 유전자의 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 기법을 이용할 수도 있다.
본 발명의 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위한 바람직한 동물계는 쥐과 동물계이다. 면역화 프로토콜 및 면역화된 비장 세포의 단리 및 융합 기법을 비롯한 마우스에서의 하이브리도마 생산 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
일 실시형태에서, HCV에 대한 인간 단일클론 항체는, 마우스 면역계가 아니라 인간 면역계의 일부를 보유하는 유전자이식 마우스를 이용하여 생성한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에서 "HuMAb 마우스"라 칭하는 유전자이식 마우스를 이용하는데, 이 마우스는, 내인성 μ 및 κ쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 비재배열 인간 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니좌를 포함한다[Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859]. 따라서, 상기 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 발현 감소를 나타내며, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 이식유전자는 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 겪어서 고친화성 인간 IgGκ 단일클론 항체를 생성한다[Lonberg, N. et al. (1994), supra; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; 및 Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546]. HuMAb 마우스의 제조에 대해서는 하기 섹션 II와 이하의 문헌에 상세히 기재되어 있다[Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851]. 또한, 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호(모두 Lonberg 및 Kay, 및 GenPharm International의 특허); 미국 특허 제5,545,807호(Surani et al.); 국제 공개 공보 WO 98/24884(1998년 6월 11일 공개); WO 94/25585(1994년 11월 10일 공개); WO 93/1227(1993년 6월 24일 공개); WO 92/22645(1992년 12월 23일 공개); WO 92/03918(1992년 3월 19일 공개)도 참조할 수 있다.
면역화
HCV에 대한 완전 인간 단일클론 항체를 생성하기 위해, 인간 면역글로불린 유전자(예를 들어, HCo12, HCo7)를 포함하는 유전자이식 마우스를, 예를 들어 문헌[Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474):856-859]; 문헌[Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851] 및 WO 98/24884에 기재된 바와 같이, HCV 항원 및/또는 HCV를 발현하는 세포의 정제 또는 농축 조제물로 면역화할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, HuMAb 마우스는 재조합 HCV 단백질 또는 HCV를 발현하는 세포주를 면역원으로 하여 면역화한다. 대안으로, 마우스를 HCV 코딩 DNA로 면역화할 수도 있다. 1차 주입시 상기 마우스가 6∼16주령인 것이 바람직하다. 예를 들어, 재조합 HCV 항원의 정제 또는 농축 조제물(10∼100 ㎍)을 HuMAb 마우스에 복강 주사로 면역화하는 데 사용할 수 있다. HCV 항원의 정제 또는 농축 조제물을 사용한 면역화가 항체를 발생시키지 않을 경우, 면역 반응을 촉진하기 위해 HCV 단백질을 발현하는 세포(예를 들어, 세포주)로 마우스를 면역화할 수도 있다. 대표적인 세포주로는 HCV를 과발현하는 안정한 CHO 및 Raji 세포주를 들 수 있다. 다양한 항원을 이용한 누적된 경험에 의해, 처음에는 완전 프로인트 면역증강제와 함께 항원을 복강내(IP) 또는 피하(SC) 주사하여 면역화하고, 그 후 격주로 불완전 프로인트 면역증강제와 함께 항원을 IP/SC 주사하여 면역화(총 10회까지)를 실시할 경우 HuMAb 유전자이식 마우스가 최상으로 반응한다는 것이 확인되었다. 면역 반응은 후안구동 채혈로 얻은 혈장 샘플을 사용하여 면역화 프로토콜 진행 전반에 걸쳐 모니터링할 수 있다. 상기 혈장을 (후술하는 바와 같이) ELISA로 스크리닝하고 충분한 항HCV 인간 면역글로불린 역가를 갖는 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 마우스를 희생시켜 비장을 적출하기 3일 전에 마우스에 항원을 정맥내로 추가 접종할 수 있다.
항원을 주성분으로 하는 백신 및 이것의 접합체
본 발명은 또한, HCV 감염에 대한 능동 면역화에 사용하기 위한, HCV E2 외피 당단백질의 보존된 비입체구조 에피토프, 예를 들어, HCV E2 단백질의 아미노산 412∼464, 412∼423 또는 413∼420을 제공한다. 이러한 에피토프는 단독으로 사용되거나 또는, 예를 들어 상기 에피토프에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 변형시킬 수 있다.
화학적으로 구성된 항원 접합체는 널리 알려진 입수가 용이한 다양한 가교 결합 시약을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 가교 결합 시약은, 선택된 항원 상에서 상이한 반응성 아미노산 또는 탄수화물 측쇄와 공유 결합을 형성하는 동종 작용성 또는 이종 작용성 화합물, 예를 들어 SPDP, SATA, SMCC, DTNB일 수 있다.
담체는 OMPC(나이세리아 메닝기티디스의 외막 단백질 복합체), BSA(소 혈청 알부민), OVA(난알부민), THY(소 타이로글로불린), KLH(키홀 림펫 헤모시아닌) 및 TT(파상풍 변성독소 단백질)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 바이러스 유사 입자(VLP)로 자체 조립되는 능력을 갖는 다른 담체로는 B형 간염 바이러스의 HbSAg(표면 항원 단백질) 및 HBcAg(코어 항원 단백질), 로타바이러스 캡시드 단백질, 인간 파필로마 바이러스의 L1 단백질, E형 간염 바이러스 입자, 폴리오마 바이러스 단백질 및 소 파필로마 바이러스 구조 단백질을 들 수 있다[참고 문헌: J. of Phar. Sciences 95:70-79 (2005)].
접합은, 예를 들어, 말레이미드/티올 커플링, 브로모아세트아미드/티올 커플링 및 히스티딘 선택적 가교 결합 중 하나 이상을 이용하여, 유전적 또는 화학적으로 수행할 수 있다. 접합은, 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(sSMCC), N-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MBS), 글루타르알데히드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDCI), 비스-디아조벤지딘(BDB), N-아세틸 호모시스테인 티오락톤(NAHT) 및 N-[ε-말레이미도카프로일옥시]설포숙신이미드 에스테르(sEMCS) 중 하나 이상으로 구성된 군에서 선택되는 가교 결합제를 사용하여 수행할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 가교 결합제는 N-[ε-말레이미도카프로일옥시]설포숙신이미드 에스테르(sEMCS)이다.
HCV에 대한 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
HCV에 대한 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터 비장 세포와 림프절 세포를 분리하여 마우스 골수종 세포주와 같은 적절한 불멸화 세포주에 융합시킬 수 있다. 그 후, 생성된 하이브리도마를 항원 특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을, 50% PEG(w/v)를 사용하여 SP2/0-Ag8.653 비분비 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1580)에 융합시킬 수 있다. 평면 바닥 미량적정 플레이트에 세포를 약 1×105개 플레이팅한 후, 통상적인 시약 이외에 10% 태아 클론 혈청 및 1× HAT(Sigma)를 함유하는 선택 배지에서 2주 동안 항온처리할 수 있다. 약 2주 후, HAT를 HT로 교체한 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 그 후, 개개의 세포를 인간 항HCV 단일클론 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA로 스크리닝하거나, HCV 단백질을 발현하는 세포(예를 들어, HCV를 발현하는 CHO 세포주) 표면에 대한 결합에 대해서는, FLISA(형광 결합 면역흡착 분석)로 스크리닝할 수 있다. 광범위한 하이브리도마 증식이 발생되면, 통상 10∼14일 후 배지를 관찰할 수 있다. 항체 분비 하이브리도마를 재플레이팅하고, 다시 스크리닝하여, 인간 IgG에 대해 여전히 양성일 경우, 항HCV 단일클론 항체를 제한 희석으로 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 그 후, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여, 특징 분석을 위해 조직 배양 배지 중에서 항체를 생성할 수 있다.
HCV에 대한 인간 단일클론 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
본 발명의 인간 항체는 또한, 예를 들어 당업계에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기법 및 유전자 형질감염법을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 제조할 수 있다[Morrison, S. (1985) Science 229:1202].
예를 들어, 일 실시형태에서, 관심있는 유전자(들), 예를 들어 인간 항체 유전자를, WO　87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템 또는 당업계에 잘 알려져 있는 다른 발현 시스템에서 사용되는 것과 같은 진핵세포 발현 플라스미드 등의 발현 벡터로 결찰시킬 수 있다. 클로닝된 항체 유전자를 갖는 정제된 플라스미드를 CHO 세포 또는 NSO 세포와 같은 진핵 숙주 세포 또는 대안으로 식물 유래 세포, 진균류 세포 또는 효모 세포와 같은 다른 진핵 세포로 도입할 수 있다. 이들 유전자를 도입하는 데 사용되는 방법은 전기천공, 리포펙틴, 리포펙타민 등을 이용한 방법과 같이 당업계에 공지된 방법일 수 있다. 이러한 항체 유전자를 숙주 세포에 도입한 후 이 항체를 발현하는 세포를 확인하여 선별할 수 있다. 이러한 세포가 트랜스펙토마에 해당하며, 이것은 후에 그 발현 수준을 늘리기 위해 증폭되고 항체 생산을 위해 확대될 수 있다. 이러한 배양 상청액 및/또는 세포로부터 재조합 항체를 단리하여 정제할 수 있다.
대안으로, 이러한 클로닝된 항체 유전자를 이. 콜라이(E. coli)와 같은 다른 발현계 또는 완전한 유기체에서 발현시키거나 합성에 의해 발현시킬 수 있다.
완전한 항체를 발현시키기 위한 부분적 항체 서열의 사용
항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, 개개의 항체들 간에는 CDR 내의 아미노산 서열이 CDR 외부의 서열보다 더 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 특정 천연 항체로부터 유래된 CDR 서열이 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터 유래된 골격구조 서열에 그래프팅된 것을 포함하는 발현 벡터를 구성함으로써 상기 특정 천연 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다[참고 문헌: Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525; 및 Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033]. 이러한 골격구조 서열은, 생식세포계 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 이러한 생식세포계 서열은 성숙 항체 유전자 서열과는 다른데, 그 이유는 이들이, B 세포 성숙 과정에서 V(D)J 결합에 의해 형성되는, 완전하게 조립된 가변 유전자를 포함하지 않기 때문이다. 생식세포계 유전자 서열은 또한 각각의 가변 영역이 균등하게 존재한다는 점에서 고친화성 2차 레퍼토리 항체의 서열과도 다르다. 예를 들어, 체세포 돌연변이는 골격구조 영역 1의 아미노 말단부와 골격구조 영역 4의 카복시 말단부에서 비교적 드물다. 게다가, 많은 체세포 돌연변이는 항체의 결합 특성을 유의적으로 변경하지 않는다. 이러한 이유로, 본래 항체의 결합 특성과 유사한 결합 특성을 갖는 완전한 재조합 항체를 재생성하기 위해 특정 항체의 전체 DNA 서열을 얻을 필요는 없다[참고 문헌: PCT/US99/05535(1999년 3월 12일 출원)]. CDR 영역에 걸쳐 있는 부분 중쇄 및 경쇄 서열이 일반적으로 이 목적에 충분하다. 이 부분 서열은 어느 생식세포계 가변 유전자 분절 및 연결 유전자 분절이 재조합된 항체 가변 유전자에 기여했는지를 확인하는 데 사용된다. 그 후, 그 생식세포계 서열을 가변 영역의 누락 부분을 채우는 데 사용한다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 단백질 성숙 과정에서 절단되어 최종 항체의 특성에 기여하지 않는다. 누락 서열을 추가하기 위해, 클로닝된 cDNA　서열을 결찰 또는 PCR　증폭에 의해 합성 올리고뉴클레오티드와 결합시킬 수 있다. 대안으로, 전체 가변 영역을 중복되는 짧은 올리고뉴클레오티드 세트로서 합성하고 PCR 증폭으로 결합시켜 완전한 합성 가변 영역 클론을 생성할 수 있다. 이 과정은 특정 제한 부위의 제거 또는 포함, 또는 특정 코돈의 최적화와 같은 특정한 이점을 갖는다.
천연 서열과 동일한 아미노산 코딩 능력을 갖는 합성 V 서열을 생성하기 위해, 하이브리도마 유래의 중쇄 및 경쇄 전사체의 뉴클레오티드 서열을 이용하여, 중복되는 합성 올리고뉴클레오티드 세트를 디자인한다. 합성 중쇄 및 카파쇄 서열은 천연 서열과 3가지 방식에서, 즉, 반복된 뉴클레오티드 염기 연속체가 개입하여 올리고뉴클레오티드 합성 및 PCR 증폭을 촉진한다는 것; 최적 번역 개시 부위가 Kozak 규칙에 따라 도입된다는 것[Kozak, 1991, J.　Biol. Chem.　266:19867-19870]; 및 HindIII　부위가 번역 개시 부위의 상류에 도입된다는 것에 있어서 상이할 수 있다.
중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 둘 다에 있어서, 최적화된 코딩 가닥 서열과 상응하는 비코딩 가닥 서열은, 상응하는 비코딩 올리고뉴클레오티드의 대략 중간 지점에서 출발하여 30∼50개 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로 분해된다. 따라서, 각각의 쇄에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 150∼400개 뉴클레오티드의 분절에 걸쳐 있는 중복된 이중 가닥 세트로서 조립될 수 있다. 그 후, 이 풀(pool)을 주형으로 사용하여 150∼400개 뉴클레오티드로 된 PCR 증폭 생성물을 생성한다. 일반적으로, 단일 가변 영역 올리고뉴클레오티드 세트를 2개의 풀로 나누고, 이것을 별도로 증폭시켜 2개의 중복되는 PCR 생성물을 얻는다. 그 후, 이러한 중복되는 생성물을 PCR 증폭에 의해 결합시켜 완전한 가변 영역을 형성한다. 또한, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 중복 단편(카파 경쇄의 BbsI 부위 또는 감마 중쇄의 AgeI 부위를 포함함)을 PCR 증폭에 포함시켜 발현 벡터 구성체로 쉽게 클로닝할 수 있는 단편을 생성하는 것이 바람직할 수 있다.
그 후, 재구성된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클로닝된 프로모터, 리더 서열, 번역 개시 서열, 리더 서열, 불변 영역, 3' 비번역 영역, 폴리아데닐화 서열 및 전사 개시 서열과 결합시켜 발현 벡터 구성체를 형성한다. 상기 중쇄 및 경쇄 발현 벡터 구성체를 단일 벡터에서 결합시키고, 숙주 세포로 동시 형질감염, 순차 형질감염, 또는 독립적 형질감염시킨 후, 이것을 융합시켜 상기 두 쇄를 모두 발현하는 숙주 세포를 형성할 수 있다.
발현 벡터의 구성에 사용하기 위한 플라스미드는, PCR에 의해 증폭된 V　중쇄 및 V　카파 경쇄 cDNA　서열이 완전한 중쇄 및 경쇄 미니유전자를 재구성하는 데 사용될 수 있도록 구성할 수 있다. 이러한 플라스미드는 완전한 인간 IgG1κ 또는 IgG4κ　항체를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 완전한 인간 항체 및 키메라 항체는 또한 IgG2, IgG3, IgE, IgA, IgM 및 IgD 항체를 포함한다. 유사한 플라스미드를 다른 중쇄 아이소타입의 발현을 위해, 또는 람다 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 위해 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 인간 항HCV 항체의 하나 이상의 구조적 특징을, 본 발명의 항체가 가진 하나 이상의 기능상의 특성, 예를 들어 HCV에 결합하거나 HCV를 중화시키는 특성을 보유하도록, 구조적으로 관련된 인간 항HCV 항체를 생성하는 데 사용한다. 일 실시형태에서, 본 발명 항체의 하나 이상의 CDR 영역을 공지된 인간 골격구조 영역 및 CDR과 재조합에 의해 결합시켜, 재조합에 의해 조작된 추가적인 본 발명의 인간 항HCV 항체를 생성할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 골격구조 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 상기 인간 항체 서열은 천연 인간 항체이거나 또는 몇 종의 인간 항체의 공통 서열일 수 있다[참고 문헌: Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993); 및 Carter et al., WO 92/22653].
따라서, 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 (1) 인간 중쇄 골격구조 영역 및 인간 중쇄 CDR(여기서, 상기 인간 중쇄 CDR 중 적어도 하나는 본 명세서에 기재된 인간 중쇄 CDR 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함); 및 (2) 인간 경쇄 골격구조 영역 및 인간 경쇄 CDR(여기서, 상기 인간 중쇄 CDR 중 적어도 하나는 본 명세서에 기재된 인간 경쇄 CDR 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함)을 포함하고 HCV에 결합하는 능력을 보유하는 항체를 제조하는 것을 포함하는 인간 항HCV 항체의 제조 방법을 제공한다. 항체가 HCV에 결합하는 능력은 실시예에 기재된 것과 같은 표준 결합 분석(예를 들어, ELISA 또는 FLISA)을 이용하여 측정할 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화성에 있어서 특별히 중요한 역할을 한다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다[참고 문헌: Hall et al., J. Imunol., 149:1605-1612 (1992); Polymenis et al., J. Immunol., 152:5318-5329 (1994); Jahn et al., Immunobiol., 193:400-419 (1995); Klimka et al., Brit. J. Cancer, 83:252-260 (2000); Beiboer et al., J. Mol. Biol, 296:833-849 (2000); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc., 116:2161-2162 (1994); Ditzel et al., J. Immunol., 157:739-749 (1996)]. 따라서, 상기에 기재된 바와 같이 제조된 본 발명의 재조합 항체는 바람직하게는 항체 83-128, 95-2, 95-14, 95-38 및 073-1의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3을 포함한다. 상기 항체는 항체 83-128, 95-2, 95-14, 95-38 및 073-1의 CDR2를 더 포함할 수 있다. 상기 항체는 항체 83-128, 95-2, 95-14, 95-38 및 073-1의 CDR1을 더 포함할 수 있다. 상기 항체는 CDR의 임의의 조합을 더 포함할 수 있다.
따라서, 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 또한, (1) 인간 중쇄 골격구조 영역, 인간 중쇄 CDR1 영역, 인간 중쇄 CDR2 영역 및 인간 중쇄 CDR3 영역(여기서, 상기 인간 중쇄 CDR3 영역은 83-128, 95-2, 95-14, 95-38 및 073-1의 CDR3, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 서열 목록에 제시된 바와 같은 95-2의 인간 중쇄 CDR3 영역으로부터 선택됨); 및 (2) 인간 경쇄 골격구조 영역, 인간 경쇄 CDR1 영역, 인간 경쇄 CDR2 영역 및 인간 경쇄 CDR3 영역(여기서, 상기 인간 경쇄 CDR3 영역은 83-128, 95-2, 95-14, 95-38 및 073-1의 CDR3, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 서열 목록에 제시된 바와 같은 95-2의 인간 경쇄 CDR3 영역으로부터 선택됨)을 포함하며 HCV에 결합하는 항HCV 항체를 제공한다. 상기 항체는 항체 83-128, 95-2, 95-14, 95-38 및 073-1의 중쇄 CDR2 및/또는 경쇄 CDR2를 더 포함할 수 있다. 상기 항체는 83-128, 95-2, 95-14, 95-38 및 073-1의 중쇄 CDR1 및/또는 경쇄 CDR1을 더 포함할 수 있다.
전술한 조작된 항체의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역은 본 명세서에 개시된 항체 83-128, 95-2, 95-14, 95-38 및 073-1의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 그러나, 당업자라면 항체가 HCV에 효과적으로 결합하는 능력을 그대로 유지한 채(예를 들어, 보존적 서열 변형), 83-128, 95-2, 95-14, 95-38 및 073-1의 정확한 CDR 서열로부터의 약간의 편차가 발생할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 또 다른 실시형태에서, 상기 조작된 항체는, 예를 들어, 항체 83-128, 95-2, 95-14, 95-38 및 073-1의 하나 이상의 CDR과 90%, 95%, 98% 또는 99.5% 동일한 하나 이상의 CDR로 이루어질 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 보다 유리한 결합 정반응 속도(on-rate), 보다 유리한 결합 역반응 속도(off-rate), 또는 이들 둘 다를 달성하여 이상적인 결합 상수에 도달할 수 있도록 하기 위해 CDR의 잔기를 하나 이상 변경할 수 있다. 이러한 방법을 이용하면, 예를 들어 KD 10-10 M 이하와 같이 극히 높은 결합 친화력을 갖는 항체를 얻을 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있고 본 명세서에 기재되어 있는 친화성 성숙 기법을 이용하여 CDR 영역(들)을 변경한 후 얻어진 결합 분자를 결합에 있어서 원하는 변화를 갖는지에 대해 스크리닝할 수 있다. 따라서, CDR(들)이 변경됨에 따라, 결합 친화력 및 면역원성에 있어서의 변화를 모니터링하고 점수를 매겨서, 최상의 조합 결합 및 낮은 면역원성을 위해 최적화된 항체를 얻을 수 있다.
CDR 내의 변형에 더하여 또는 그 대신에, 인간 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 골격구조 영역, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4 중 하나 이상 내에, 인간 항체의 결합 친화력을 없애지 않는 한, 변형을 유도할 수 있다. 골격구조 내 몇 개 위치의 아미노산이 많은 항체에 있어서 CDR 확인(예를 들어, CDR과 상호작용할 수 있음)에 중요한 것으로 알려져 있다[참고 문헌: Chothia and Lesk, supra, Chothia et al., supra; 및 Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215:175 (1990), 이들 모두 본 명세서에서 참고 문헌으로 포함함]. 상기 문헌의 저자들은 몇몇 공지된 항체의 구조를 분석함으로써 CDR 입체구조에 중요한 보존된 골격구조 잔기를 확인하였다. 분석된 항체들은 CDR의 입체구조에 기초할 때 한정된 수의 구조적 부류 또는 "정규(canonical)" 부류에 속하였다. 정규 부류의 구성원 내에 있어서의 보존된 골격구조 잔기를 "정규" 잔기라 한다. 정규 잔기는 경쇄의 2번, 25번, 29번, 30번, 33번, 48번, 64번, 71번, 90번, 94번 및 95번 잔기와 중쇄의 24번, 26번, 29번, 34번, 54번, 55번, 71번 및 94번 잔기를 포함한다. 추가 잔기(예를 들어, CDR 구조 결정 잔기)는 문헌[Martin and Thorton (1996) J. Mol. Biol. 263:800]의 방법에 따라 확인할 수 있다. 특히, 경쇄의 2번, 48번, 64번 및 71번 위치의 아미노산과 중쇄의 26∼30번, 71번 및 94번 위치의 아미노산(카밧에 따른 넘버링)이 많은 항체에 있어서 CDR과 상호작용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 경쇄의 35번 위치의 아미노산과 중쇄의 93번 및 103번 위치의 아미노산 역시 CDR과 상호작용할 가능성이 있다. CDR의 입체구조에 영향을 줄 수 있는 추가 잔기는 문헌[Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487]의 방법에 따라 확인할 수 있다. 이러한 잔기는 "버니어(vernier)" 잔기라 칭해지며, CDR 아래에 가까이 위치하는(즉, 그 아래에서 "플랫폼"을 형성하는) 골격구조 영역 내의 잔기이다.
"VL-VH 계면에 관여하는" 잔기 또는 "패킹 잔기"는, 예를 들어 문헌[Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66 (1985)] 또는 Chothia 등의 상기 문헌에 정의된 VL과 VH 사이의 계면에 있는 잔기를 포함한다.
때때로, 특정 아미노산이 전술한 카테고리 중 하나 이상에 속하는지에 대해서는 약간 애매한 점이 있다. 이러한 경우, 하나는 특정 치환을 가지고 있고 다른 하나는 그렇지 않은 택일적인 변이 항체가 제조된다. 이렇게 제조된 택일적인 변이 항체는 본 명세서에 기재된 분석 중 어느 하나로 원하는 활성을 갖는지에 대해 테스트하여 바람직한 항체를 선택할 수 있다.
골격구조 영역 내에 있어서의 치환에 대한 추가 후보는 인간 항체에 있어서는 해당 위치에서 드문 또는 "희귀한" 아미노산이다. 이러한 아미노산은 인간 생식세포계 서열의 동등한 위치로부터의 아미노산 또는 보다 전형적인 인간 항체의 동등한 위치로부터의 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 치환은, 인간 항체의 인간 골격구조 영역 내의 아미노산이 해당 위치에서 희귀하고 생식세포계 서열에 있어서의 상응하는 아미노산이 인간 면역글로불린 서열에 있어서의 그 위치에서 흔한 경우, 또는 인간 항체에 있어서 아미노산이 해당 위치에서 희귀하고 생식세포계 서열에 있어서의 상응하는 아미노산이 다른 인간 서열에 비해 역시 희귀한 경우 바람직할 수 있다. 드문 아미노산을 인간 항체에 있어서 전형적으로 발생하는 생식세포계 서열 유래의 아미노산으로 치환함으로써, 인간 항체의 면역원성을 줄일 수 있는 것으로 생각된다.
본 명세서에서 사용되는 "드문"이란 용어는 대표적인 서열 샘플에서 해당 위치에서 발생하는 아미노산이 서열의 약 20% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만, 더욱 바람직하게는 약 5% 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 3% 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 2% 미만 및 더욱 더 바람직하게는 약 1% 미만인 것을 나타내며, 본 명세서에서 사용되는 "흔한"이란 용어는 대표적인 샘플에서 아미노산이 서열의 약 25%를 초과하고 일반적으로 약 50%를 초과하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 모든 인간 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열은 각각, 서로에 대해 특별히 상동성이고 중요한 특정 위치에서 동일한 아미노산을 갖는 서열의 "부분군"으로 분류된다[[Kabat et al., supra]. 인간 항체 서열의 아미노산이 인간 서열들 중에서 "드문" 것인지 "흔한" 것인지를 결정할 때, 대개는, 그 인간 항체 서열과 동일한 부분군의 인간 서열만을 고려하는 것이 바람직하다.
일반적으로, 인간 항체의 골격구조 영역은 이것이 유래된 인간 생식세포계 서열의 골격구조 영역과 일반적으로는 실질적으로 동일하고, 더 일반적으로는 동일하다. 물론, 골격구조 영역 내 아미노산 중 다수는 항체의 특이성 또는 친화성에 거의 또는 전혀 직접적인 기여를 하지 않는다. 따라서, 골격구조 잔기의 다수의 개개의 보존적 치환은 생성된 인간 면역글로불린의 특이성 또는 친화성을 현저히 변화시키지 않고서 허용될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 상기 인간 항체의 가변 골격구조 영역은 인간 생식세포계 가변 골격구조 영역 서열 또는 이러한 서열의 공통 서열에 대해 85% 이상의 서열 동일성을 공유한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 인간 항체의 가변 골격구조 영역은 인간 생식세포계 가변 골격구조 영역 서열 또는 이러한 서열의 공통 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다.
단일클론 항체는, HCV E2 단백질의 선형 에피토프에 단순히 결합하는 것 이외에도, 본 발명 항체의 다른 기능상의 특성을 유지하도록, 예컨대 다중 유전자형의 HCV E2에 결합하는 특성 및/또는 극히 높은 친화력으로, 예를 들어 10-9 M 이하의 KD로 결합하는 특성을 보유하도록 선택될 수 있다.
HCV에 대한 인간 단일클론 항체의 특징 분석
본 발명의 인간 단일클론 항체는 각종 공지된 기법을 이용하여 HCV에 대한 결합에 대해 분석할 수 있다. 일반적으로, 상기 항체를 먼저 ELISA로 분석한다. 간단히 설명하면, 미량적정 플레이트를 PBS 중의 정제된 HCV로 코팅하고, 그 후 PBS에 희석한 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 비관련 단백질로 차단할 수 있다. 각각의 웰에 HCV로 면역화한 마우스로부터 얻은 혈장 희석액을 첨가하여 37℃에서 1∼2시간 동안 항온처리한다. 플레이트를 PBS/Tween 20으로 세척하고, 그 후 알칼리 포스파타제에 접합된 염소 항인간 IgG Fc 특이적 다클론 항체와 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 세척 후, ABTS 기질을 사용하여 플레이트의 반응을 발현시키고, OD 405 nm에서 분석한다. 최고 역가를 나타낸 마우스를 융합에 사용하는 것이 바람직하다.
전술한 바와 같은 ELISA 분석을 항체를 스크리닝하는 데, 즉 HCV 면역원과의 양성 반응성을 나타내는 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하는 데 이용할 수 있다. 그 후, HCV에 바람직하게는 높은 친화력으로 결합하는 하이브리도마를 서브클로닝하여 후속 분석을 행할 수 있다. 그 후, 어버이 세포의 반응성을 유지한(ELISA로 확인), 각 하이브리도마 유래의 1개 클론을 세포 은행의 제조와 항체 정제를 위해 선택할 수 있다.
인간 항HCV 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 롤러 바틀, 2 L 스피너 플라스크 또는 다른 배양 시스템에서 증식시킬 수 있다. 상청액을 여과하고 농축시킨 후 단백질 A-세파로스(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 Pharmacia 제품)를 사용한 친화성 크로마토그래피로 단백질을 정제할 수 있다. 완충액을 PBS로 교환한 후, 흡광 계수 1.43을 이용한 OD280에 의해, 또는 바람직하게는 네펠로 분석법(nephelometric analysis)으로 농도를 측정할 수 있다. IgG는 겔 전기영동 및 항원 특이적 방법으로 확인할 수 있다.
선택된 인간 항HCV 단일클론 항체가 독특한 에피토프에 결합하는지를 확인하기 위해, 각각의 항체를 시판되는 시약(미국 일리노이주 록포드 소재의 Pierce 제품)으로 바이오틴화할 수 있다. 바이오틴화된 MAb 결합은 스트렙타비딘 표지 프로브로 검출할 수 있다. 정제된 항체의 아이소타입을 확인하기 위해, 당업계에 공지된 기법을 이용하여 아이소타입 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 미량적정 플레이트의 웰을 10 ㎍/ml의 항인간 Ig로 4℃에서 밤새 코팅할 수 있다. 5% BSA로 차단한 후, 이 플레이트를 10 ㎍/ml의 단일클론 항체 또는 정제된 아이소타입 대조군과 실온에서 2시간 동안 반응시킨다. 그 후, 웰을 인간 IgG1 또는 다른 인간 아이소타입 특이적 접합 프로브와 반응시킬 수 있다. 전술한 바와 같이 플레이트의 반응을 발현시켜 분석한다.
항HCV 인간 IgG에 대해서는 웨스턴 블로팅을 이용하여 HCV 항원과의 반응성을 추가로 테스트할 수 있다. 요약하면, HCV를 발현하는 세포로부터 추출한 세포 추출물을 조제하여 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 멤브레인으로 이전시켜 20% 마우스 혈청으로 차단하고 테스트하고자 하는 단일클론 항체로 프로빙한다. 인간 IgG 결합은 항인간 IgG 알칼리 포스파타제를 사용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 정제(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma Chem. Co. 제품)를 이용하여 발현시킬 수 있다.
II. 인간 단일클론 항HCV 항체를 생성하는 비인간 유전자이식 동물의 제조
또 다른 양태에서, 본 발명은 HCV에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체를 발현할 수 있는 유전자이식 마우스와 같은 비인간 유전자이식 동물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 마우스가 HCV 항원 및/또는 HCV를 발현하는 세포로 면역화될 경우 인간 항HCV 항체를 생성하도록 인간 중쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자이식 마우스를 제공한다. 상기 인간 중쇄 이식유전자는, 본 명세서에서 상세히 설명되고 예시되는 바와 같이, 마우스의 염색체 DNA로 통합될 수 있으며, 유전자이식 마우스, 예를 들어 HuMAb 마우스의 경우에도 그러하다. 이러한 유전자이식 마우스는 V-D-J 재조합 및 아이소타입 스위칭을 겪음으로써 HCV에 대한 인간 단일클론 항체(예를 들어, IgG)의 다중 아이소타입을 생성할 수 있다. 아이소타입 스위칭은, 예를 들어 전형적 또는 비전형적 아이소타입 스위칭에 의해 발생할 수 있다.
이종성 항체 레퍼토리를 갖는, 외래 항원 자극에 반응하는 비인간 유전자이식 동물의 설계는 유전자이식 동물에 포함된 이종성 면역글로불린 이식유전자가 B 세포 발달 경로 전반에서 정확히 기능할 것을 요한다. 이는, 예를 들어, 이종성 중쇄 이식유전자의 아이소타입 스위칭을 포함한다. 따라서, 이식유전자는 항체의 아이소타입 스위칭 및 다음 중 하나 이상이 일어나도록 구성되어야 한다: (1) 높은 발현 수준 및 세포 유형 특이적 발현, (2) 기능적 유전자 재배열, (3) 대립유전자 배제의 활성화 및 이에 대한 반응, (4) 충분한 1차 레퍼토리의 발현, (5) 신호 전달, (6) 체세포 과돌연변이, 및 (7) 면역 반응이 일어나는 동안의 이식유전자 항체 유전자좌의 우세.
상기 기준을 전부 만족시켜야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 유전자이식 동물의 내인성 면역글로불린 유전자좌를 기능적으로 파괴하는 실시형태에서는, 상기 이식유전자가 대립유전자 배제를 활성화시킬 필요가 없다. 또한, 상기 이식유전자가 기능적으로 재배열된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를 포함하는 실시형태에서는, 기능적 유전자 재배열이라는 두 번째 기준은 적어도 이미 재배열된 이식유전자의 경우에는 불필요하다. 분자 면역학에 관한 배경 정보는 문헌[Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y]을 참조할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체를 생성하는 데 사용된 비인간 유전자이식 동물은 유전자이식 동물의 생식세포계에 있어서의 재배열 이종성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 이식유전자, 비재배열 이종성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 이식유전자, 또는 재배열 이종성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 이식유전자와 비재배열 이종성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 이식유전자의 조합을 포함한다. 각각의 중쇄 이식유전자는 하나 이상의 CH 유전자를 포함한다. 또한, 상기 중쇄 이식유전자는, 유전자이식 동물의 B 세포에서 이종성 이식유전자 코딩 다중 CH 유전자의 아이소타입 스위칭을 지지할 수 있는 기능성 아이소타입 스위치 서열을 포함할 수 있다. 이러한 스위치 서열은 이식유전자 CH 유전자의 공급원 역할을 하는 종 유래의 생식세포계 면역글로불린 유전자좌에서 자연적으로 발생하는 것이거나, 또는 그러한 스위치 서열은 이식유전자 구성체를 수용한 종(유전자이식 동물)에서 발생하는 것으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 유전자이식 마우스를 제조하는 데 사용되는 인간 이식유전자 구성체는, 이것이 마우스 중쇄 유전자좌에서 자연적으로 발생하는 것과 유사한 스위치 서열을 통합시킨다면 아이소타입 스위칭 사건의 빈도를 더 높일 수 있는데, 이는 아마도 마우스 스위치 서열은 마우스 스위치 리콤비나제 효소 시스템과 함께 기능하도록 최적화되는 반면 인간 스위치 서열은 그렇지 않기 때문인 것 같다. 스위치 서열은 단리하여 통상적인 클로닝법으로 클로닝하거나, 또는 면역글로불린 스위치 영역 서열과 관련된 공개된 서열 정보에 기초하여 설계된 중복 합성 올리고뉴클레오티드로부터 새로 합성할 수 있다[Mills et al., Nucl. Acids Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989)]. 상기 유전자이식 동물 각각에 대해, 기능적으로 재배열된 이종성 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 이식유전자가 상기 유전자이식 동물의 B 세포의 상당 비율에서 발견된다(10% 이상).
본 발명의 유전자이식 동물을 생성하는 데 사용되는 이식유전자는 하나 이상의 가변 유전자 분절, 하나의 다양성 유전자 분절, 하나의 연결 유전자 분절 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 분절을 코딩하는 DNA를 포함하는 중쇄 이식유전자를 포함한다. 상기 면역글로불린 경쇄 이식유전자는 하나 이상의 가변 유전자 분절, 하나의 연결 유전자 분절 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 분절을 코딩하는 DNA를 포함한다. 상기 경쇄 및 중쇄 유전자 분절을 코딩하는 유전자 분절은 비인간 유전자이식 동물로 이루어진 것이 아닌 종 유래의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 분절로부터 유래되거나 이에 상응한다는 점에서 비인간 유전자이식 동물에 이종성이다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 이식유전자는 개별 유전자 분절이 재배열되지 않도록, 즉, 기능성 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코딩하도록 재배열되지 않도록 구성된다. 이러한 비재배열 이식유전자는 V 유전자 분절, D 유전자 분절 및 J 유전자 분절의 재조합(기능적 재배열)을 지지하며, 바람직하게는 HCV 항원에 노출될 때 비인간 유전자이식 동물에 있어서의 형성된 재배열 면역글로불린 중쇄의 D 영역 유전자 분절의 전부 또는 일부가 통합되도록 지지한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 이식유전자는 비재배열 "미니 유전자좌"를 포함한다. 이러한 이식유전자는 일반적으로 C 분절, D 분절 및 J 분절의 상당 부분뿐만 아니라 V 유전자 분절의 부분 집합을 포함한다. 이러한 이식유전자 구성체의 경우, 다양한 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 클래스 스위치 영역, RNA 프로세싱을 위한 스플라이스 도너 및 스플라이스 억셉터 서열, 재조합 신호 등은 이종성 DNA로부터 유래된 상응하는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열은 본 발명에서 사용되는 비인간 동물과 동일한 종 또는 관련된 종 유래의 이식유전자로 통합될 수 있다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자 분절은 유전자이식 마우스에서 사용하기 위한 설치류 면역글로불린 인핸서 서열과 함께 이식유전자로 통합될 수 있다. 대안으로, 합성 조절 서열이 이식유전자로 통합될 수 있는데, 이 경우 이러한 합성 조절 서열은 포유동물의 게놈에서 자연적으로 발생하는 것으로 알려진 기능성 DNA 서열에 상동성이 아니다. 합성 조절 서열은 합의 규칙(consensus rule), 예를 들어 스플라이스 억셉터 부위 또는 프로모터/인핸서 모티프의 허용 가능한 서열을 특정하는 것에 따라 디자인된다. 예를 들어, 미니 유전자좌는 천연 생식세포계 Ig 유전자좌와 비교하여 비필수 DNA 부분(예를 들어, 개재 서열; 인트론 또는 그 일부분)의 하나 이상의 내부(즉, 해당 부분의 말단에서가 아님) 결실을 갖는 게놈 면역글로불린 유전자좌의 일부분을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, HCV에 대한 인간 항체를 생성하는 데 사용되는 유전자이식 동물은, WO 98/24884의 실시예 12에 기재된 이식유전자(예를 들어, pHC1 또는 PHC2)를 1 카피 이상, 일반적으로 2∼10 카피, 때때로 25∼50 카피 또는 그 이상 포함하고, WO 98/24884의 실시예 5, 6, 8 또는 14에 기재된 경쇄 이식유전자를 1 카피 포함하는 동물과 교배되며, 그 새끼는 WO 98/24884의 실시예 10에 기재된 JH 결실 동물과 교배된다. 동물들은 이들 3가지 형질 각각에 대해 동형접합성이 되도록 교배된다. 이러한 동물들은 하기 유전자형, 즉, 인간 중쇄 비재배열 미니 유전자좌(WO 98/24884의 실시예 12에 기재됨) 1 카피(염색체 반수체 세트당), 재배열된 인간 K 경쇄 구성체(WO 98/24884의 실시예 14에 기재됨) 1 카피(염색체 반수체 세트당) 및 기능성 JH 분절을 모두 제거하는 각각의 내인성 마우스 중쇄 유전자좌에서의 결실(WO 98/24884의 실시예 10에 기재됨)을 포함한다. 이러한 동물들은, JH 분절의 결실(WO 98/24884의 실시예 10)에 대해 동형접합성인 마우스와 교배되어, JH 결실에 대해 동형접합성이고 인간 중쇄 및 경쇄 구성체에 대해 단가 유전자 접합성인 새끼를 낳는다. 얻어진 동물에 항원을 주사하고 이것을 상기 항원에 대한 인간 단일클론 항체의 제조에 사용한다.
이러한 동물로부터 분리한 B 세포는 각각의 유전자를 1 카피만 포함하고 있기 때문에 인간 중쇄 및 경쇄에 대하여 단일 특이적이다. 또한, 이 세포는 인간 또는 마우스 중쇄에 대하여 단일 특이적인데, 왜냐하면 두 내인성 마우스 중쇄 유전자 카피가 WO 98/24884의 실시예 9 및 12에 기재된 대로 도입된 JH 영역에 걸친 결실에 의해 비기능성이기 때문이다. 또한, B 세포의 상당 부분은 인간 또는 마우스 경쇄에 대하여 단일 특이적인데, 왜냐햐면 재배열된 인간 κ 경쇄 유전자의 단일 카피의 발현이 B 세포의 상당 부분에서 대립유전자적 및 아이소타입적으로 내인성 마우스 κ쇄 및 γ쇄 유전자의 재배열을 배제하기 때문이다.
본 발명에서 이용되는 유전자이식 마우스는 본래의 마우스와 이상적으로는 실질적으로 유사한 유의적인 레퍼토리를 갖는 면역글로불린을 생산한다. 따라서, 예를 들어, 내인성 Ig 유전자가 불활성화된 실시형태에서는, 총 면역글로불린 수준이 혈청의 약 0.1∼10 mg/ml, 바람직하게는 0.5∼5 mg/ml, 이상적으로는 약 1.0 mg/ml 이상이다. IgM으로부터 IgG로의 스위치를 수행할 수 있는 이식유전자가 유전자이식 마우스에 도입될 경우, 성체 마우스의 IgG 대 IgM의 혈청 비는 바람직하게는 약 10:1이다. IgG 대 IgM 비는 미성숙 마우스에서 훨씬 더 작다. 일반적으로, 비장 및 림프절 B 세포의 약 10% 이상, 바람직하게는 40∼80%가 오로지 인간 IgG 단백질만을 발현한다.
이 레퍼토리는 이상적으로는 본래의 마우스에서 나타나는 것에 가까울 것이고, 일반적으로 약 10% 이상, 바람직하게는 25∼50% 또는 그 이상이다. 일반적으로, 주로 마우스 게놈으로 도입된 상이한 V 영역, J 영역 및 D 영역의 수에 따라, 적어도 약 천 여종, 바람직하게는 104∼106종 또는 그 이상의 상이한 면역글로불린(이상적으로는 IgG)이 생산된다. 이러한 면역글로불린은 전형적으로 고항원성 단백질(예를 들어, 스타필로코커스 단백질 A)의 절반 또는 그 이상을 인식한다. 일반적으로, 이 면역글로불린은 소정의 항원에 대해 10-7 M 이하, 예컨대 10　-8 M 이하, 10-9 M 이하 또는 10-10 M 이하 또는 심지어 그 이하의 친화력(KD)를 나타낸다.
소정의 항원 유형에 대한 항체 반응에서 나타나는 V 유전자의 선택을 제한하기 위해 소정의 레퍼토리를 갖는 마우스를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 소정의 레퍼토리를 갖는 중쇄 이식유전자는, 예를 들어 인간에 있어서 소정의 항원 유형에 대한 항체 반응에 우선적으로 사용되는 인간 VH 유전자를 포함할 수 있다. 대안으로, 다양한 이유(예를 들어, 소정의 항원에 대한 고친화성 V 영역을 코딩할 가능성이 낮다는 것; 체세포 돌연변이 및 친화성 강화를 겪을 수 있는 경향이 적다는 것; 또는 특정 인간에 대해 면역원성이라는 것)로 인해 소정의 레퍼토리로부터 일부 VH 유전자를 배제시킬 수 있다. 따라서, 다양한 중쇄 또는 경쇄 유전자 분절을 포함하는 이식유전자의 재배열 전에, 유전자이식 동물 이외의 유기체 종으로부터 유래되는 것과 같은 그러한 유전자 분절을, 예를 들어 하이브리드화 또는 DNA 서열분석에 의해 쉽게 확인할 수 있다.
전술한 유전자이식 마우스는, 예를 들어 HCV 항원 및/또는 HCV 단백질을 발현하는 세포의 정제 또는 농축 조제물로 면역화할 수 있다. 대안으로, 유전자이식 마우스를 HCV 단백질을 코딩하는 DNA로 면역화할 수 있다. 그 후 이 마우스는 이식유전자간 스위치 재조합(시스 스위칭)에 의해 클래스 스위칭을 겪고 HCV에 반응성인 면역글로불린을 발현하는 B 세포를 생산하게 된다. 이 면역글로불린은 인간 항체("인간 서열 항체"라고도 함)일 수 있으며, 이때 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 체세포 돌연변이 및 V 영역 재조합 접합에 의해 유도된 서열뿐만 아니라 생식세포계에 의해 코딩된 서열을 포함할 수 있는 인간 이식유전자 서열에 의해 코딩되며; 이러한 인간 항체는 인간 VL 또는 VH 유전자 분절 및 인간 JL 또는 DH 및 JH 분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일하다고 할 수 있으며, 다만, 체세포 돌연변이 및 차등적 V-J 및 V-D-J 재조합 접합으로 인해 다른 비생식세포계 서열이 존재할 수도 있다. 각각의 항체 서열의 가변 영역은 일반적으로 80% 이상이 인간 생식세포계 V, J 유전자 분절에 의해, 중쇄의 경우에는, D 유전자 분절에 의해 코딩되며; 대개의 경우 가변 영역의 85% 이상이 이식유전자 상에 존재하는 인간 생식세포계 서열에 의해 코딩되고; 종종 가변 영역 서열의 90% 또는 95% 또는 그 이상이 이식유전자 상에 존재하는 인간 생식세포계 서열에 의해 코딩된다. 그러나, 체세포 돌연변이 및 VJ 및 VDJ 접합에 의해 비생식세포계 서열이 도입되기 때문에, 인간 서열 항체는 흔히 마우스의 생식세포계의 인간 이식유전자(들)에서 발견되는 인간 V, D 또는 J 유전자 분절에 의해 코딩되지 않는 일부 가변 영역 서열(및 더 적은 빈도로 불변 영역 서열)을 갖는다. 일반적으로, 이러한 비생식세포계 서열(또는 개개의 뉴클레오티드 위치)은 CDR 내에 또는 그 가까이에, 또는 체세포 돌연변이가 밀집하는 것으로 알려진 영역에 모여있다.
소정의 항원에 결합하는 인간 항체는, 인간 서열 γ 쇄(예컨대, γ1, γ2a, γ2B 또는 γ3) 및 인간 서열 경쇄(예컨대, κ)를 포함하는 인간 항체가 생성되도록 하는 아이소타입 스위칭으로부터 유래될 수 있다. 이러한 아이소타입 스위칭 인간 항체는, 특히 2차(또는 후속) 항원 노출 후에, 일반적으로 가변 영역 내에, 또한 종종 CDR의 약 10개 잔기 내에, 친화성 성숙 및 항원에 의한 B 세포의 선택으로 인해, 종종 하나 이상의 체세포 돌연변이(들)를 포함한다. 이러한 고친화성 인간 항체는 10-7 M 이하, 예컨대 10　-8 M 이하, 10-9 M 이하 또는 10-10 M 이하 또는 심지어 그 이하의 결합 친화력(KD)을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 명세서에 기재된 것과 같은 유전자이식 마우스로부터 유래된 B 세포를 포함한다. 상기 B 세포는 인간 HCV에 고친화력(예를 들어, 10-7 M 미만의 KD)으로 결합하는 인간 단일클론 항체를 발현하는 하이브리도마를 생성하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 피분석물로서 재조합 인간 HCV를, 인간 HCV에 결합하는 리간드로서 해당 항체를 사용하여 BIACORE 3000 장치로 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법에 의해 측정시 10-7 M 이하, 예컨대 10　-8 M 이하, 10-9 M 이하 또는 10-10 M 이하 또는 심지어 그 이하의 친화력(KD)을 갖는 인간 항체를 생성하는 하이브리도마를 제공하며, 여기서 상기 항체는
(1) 인간 VL 유전자 분절 및 인간 JL 분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CL 유전자 분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 불변 영역으로 이루어진 인간 서열 경쇄; 및
(1) 인간 VH 유전자 분절, 경우에 따라 D 영역 및 인간 JH 분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CH 유전자 분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 불변 영역으로 이루어진 인간 서열 중쇄
를 포함한다.
HCV에 대한 고친화성 인간 단일클론 항체의 발생은, 통합된 인간 면역글로불린 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자이식 마우스에서 인간 가변 영역 유전자 분절의 레퍼토리를 증폭시키는 방법에 의해 촉진시킬 수 있으며, 상기 방법은 상기 통합된 인간 면역글로불린 이식유전자에 존재하지 않는 V 영역 유전자 분절을 포함하는 V 영역 이식유전자를 상기 게놈에 도입하는 것을 포함한다. 종종, 상기 V 영역 이식유전자는, 인간 게놈에서 자연적으로 발생할 수도 있고 또는 재조합 방법에 의해 독립적으로 함께 스플라이싱될 수 있는, 부적절한 또는 생략된 V 유전자 분절을 포함할 수 있는 인간 VH 또는 VL(VK) 유전자 분절 어레이의 일부분을 포함하는 효모 인공 염색체이다. 흔히, 적어도 5개 이상의 기능성 V 유전자 분절이 YAC에 포함된다. 이러한 변형예에서, V 레퍼토리 증폭 방법에 의해 생산된 유전자이식 마우스를 제조할 수 있으며, 이 경우 상기 마우스는 V 영역 이식유전자 상에 존재하는 V 영역 유전자 분절에 의해 코딩된 가변 영역 서열과 인간 Ig 이식유전자에 의해 코딩된 C 영역을 포함하는 면역글로불린쇄를 발현한다. V 레퍼토리 증폭 방법에 의하면, 적어도 5개의 상이한 V 유전자를 갖는 유전자이식 마우스를 생성할 수 있으며; 적어도 약 24개 또는 그 이상의 V 유전자를 포함하는 마우스도 생성할 수 있다. 일부 V 유전자 분절은 비기능성(예를 들어, 위(僞) 유전자 등)일 수 있고; 이러한 분절들은 유지되거나 또는 필요에 따라 당업자가 이용 가능한 재조합 방법에 의해 선택적으로 결실시킬 수 있다.
마우스 생식세포계를, J 및 C 유전자 분절을 포함하는 인간 Ig 이식유전자에 사실상 존재하지 않는 증폭된 V 분절 레퍼토리를 갖는 기능성 YAC을 포함하도록 조작할 경우, 그 형질은 유전되어, 증폭된 V 분절 레퍼토리를 갖는 기능성 YAC이 상이한 인간 Ig 이식유전자를 갖는 마우스 생식세포계로 도입되는 배경을 비롯하여 다른 유전적 배경으로 전해질 수 있다. 증폭된 V 분절 레퍼토리를 갖는 다기능성 YAC을 인간 Ig 이식유전자(또는 다중 인간 Ig 이식유전자)와 함께 작용하도록 생식세포계로 도입할 수 있다. 이러한 이식유전자를 본 명세서에서 YAC 이식유전자라고 칭하지만, 이것은 게놈으로 통합될 때 효모에서의 자가 복제에 필요한 서열과 같은 효모 서열을 실질적으로 갖지 않을 수 있으며; 이러한 서열들은 효모에서의 복제가 더 이상 필요하지 않게 되면(즉, 마우스 ES 세포 또는 마우스 전접합체로 도입되기 전), 경우에 따라 유전자 조작(예를 들어, 제한 분해 및 펄스장 겔 전기영동 또는 다른 적당한 방법)에 의해 제거할 수 있다. 인간 서열 면역글로불린 발현의 형질을 전파시키는 방법으로는, 인간 Ig 이식유전자(들)와, 경우에 따라, 증폭된 V 분절 레퍼토리를 갖는 기능성 YAC을 갖는 유전자이식 마우스를 육종하는 것을 포함한다. VH 유전자 분절과 VL 유전자 분절 둘 다 YAC에 존재할 수 있다. 상기 유전자이식 마우스는, 인간 Ig 이식유전자 및/또는 다른 인간 림프구 단백질을 코딩하는 이식유전자를 비롯하여 다른 인간 이식유전자를 보유하는 배경을 포함하여 당업자가 원하는 임의의 배경 내로 육종할 수 있다. 본 발명은 또한 증폭된 V 영역 레퍼토리 YAC 이식유전자를 갖는 유전자이식 마우스에 의해 생산된 고친화성 인간 서열 면역글로불린을 제공한다. 전술한 설명이 본 발명 유전자이식 동물의 바람직한 실시형태를 설명하는 것이지만, 하기 4개 카테고리로 분류되는 다른 실시형태도 고려된다:
I. 비재배열 중쇄 및 재배열 경쇄 면역글로불린 이식유전자를 포함하는 유전자이식 마우스;
II. 비재배열 중쇄 및 비재배열 경쇄 면역글로불린 이식유전자를 포함하는 유전자이식 마우스;
III. 재배열 중쇄 및 비재배열 경쇄 면역글로불린 이식유전자를 포함하는 유전자이식 마우스; 및
IV. 재배열 중쇄 및 재배열 경쇄 면역글로불린 이식유전자를 포함하는 유전자이식 마우스.
이러한 유전자이식 동물 카테고리에 있어서, 선호되는 바람직한 순서는 내인성 경쇄 유전자(또는 적어도 K 유전자)가 상동성 재조합(또는 다른 방법)에 의해 녹아웃(konk out)된 경우 II > I > III > IV이며, 내인성 경쇄 유전자가 녹아웃되지 않고 대립유전자 배제에 의해 우세하게 된 것일 경우에는 I > II > III > IV이다.
III. 항체 접합체/면역독소
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료 성분(therapeutic moiety), 예컨대 세포독소, 약물(예를 들어, 면역억제제) 또는 방사성 동위원소에 접합된 인간 항HCV 단일클론 항체를 특징으로 한다. 이들 항체가 세포독소에 접합될 경우 이러한 항체 접합체를 "면역독소"라 부른다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한(예를 들어, 사멸시키는) 임의의 제제를 포함한다. 그 예로는 택솔, 사이토칼라신 B, 그래미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 들 수 있다. 치료제로는 대사길항물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로포스파마이드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP)(시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(이전 명칭: 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전 명칭: 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)), 및 유사분열 억제제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체를 방사성 동위원소, 예를 들어 방사성 요오드에 접합시켜, 암과 같은 HCV 관련 질환을 치료하기 위한 세포독성 방사성 의약품을 생성할 수 있다.
본 발명의 항체 접합체는 일정 생물학적 반응을 변경시키기 위해 이용될 수 있다. 치료 성분은 전형적인 화학적 치료제에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 약물 부분은 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어 효소 활성 독소 또는 이것의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ와 같은 단백질; 또는 생물학적 반응 조절제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 다른 사이토카인 또는 성장 인자를 포함할 수 있다.
이러한 치료 성분을 항체에 접합시키는 기법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; 문헌[Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; 문헌[Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; 문헌["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)]; 및 문헌[Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)]을 참조할 수 있다.
IV. 약학 조성물
또 다른 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화된 본 발명의 인간 단일클론 항체, 또는 이것의 항원 결합 부분(들) 중 하나 또는 그 조합을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 조성물은 다종의(예를 들어, 2종 이상의) 본 발명의 단리된 인간 항체의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물의 각각의 항체가 HCV의 상이한 소정의 에피토프에 결합한다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 병용 요법으로, 즉, 다른 제제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 병용 요법은 항염증제, DMARD(질병 조절 항류마티스제), 면역억제제, 화학요법제 및 건선제와 같은 1종 이상의 추가 치료제와 함께 본 발명의 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 방사선 치료제와 함께 투여될 수 있다. CD4 특이적 항체 및 IL-2 특이적 항체와 같은 다른 항체와의 동시 투여도 본 발명에 포함된다. CD4 특이적 항체 또는 IL-2 특이적 항체와의 이같은 병용은 자가면역 질환 및 이식 거부반응을 치료하는 데 특히 유용한 것으로 생각된다.
본 명세서에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"란 표현은 생리학적으로 적합한 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 상기 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 이중 특이성 및 다중 특이성 분자를, 상기 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용 및 다른 자연 상태로부터 그 화합물을 보호하는 재료로 코팅할 수 있다.
"약학적으로 허용되는 염"이란 모화합물의 소정의 생물학적 활성을 유지하고 임의의 원치않는 독성 효과를 부여하지 않는 염을 말한다[참고 문헌: Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19]. 이러한 염의 예로는 산 부가염과 염기 부가염을 들 수 있다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 인산 등과 같은 비독성 무기산으로부터 유도된 것과 지방족 모노- 또는 디카복실산, 페닐 치환 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 및 방향족 설폰산 등의 비독성 유기산으로부터 유도된 것을 포함한다. 염기 부가염으로는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 알칼리 토금속으로부터 유도된 것과 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 염소, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등과 같은 비독성 유기 아민으로부터 유도된 것을 포함한다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 투여 경로 및/방식은 원하는 결과에 따라 달라지게 된다. 활성 화합물은 화합물이 신속 방출되는 것을 방지하는 담체와 함께, 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제제로서 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법 다수가 특허되어 있고 당업계에 널리 공지되어 있다. 이와 관련하여, 예를 들어 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조할 수 있다.
본 발명의 화합물을 특정 투여 경로로 투여하기 위해서는, 그 화합물을 이 화합물의 불활성화를 방지하는 재료로 코팅하거나 이것과 함께 투여할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물을 적절한 담체에 함유시켜, 예를 들어 리포솜 또는 희석제에 함유시켜 피험체에 투여할 수 있다. 약학적으로 허용되는 희석제는 염수와 완충 수용액을 포함한다. 리포솜은 수중유중수형 CGF 에멀션과 통상적인 리포솜을 포함한다[Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27].
약학적으로 허용되는 담체는 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액과 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용에 대해서는 당업계에 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는 본 발명의 약학 조성물에 이들을 사용하는 것이 고려된다. 추가적인 활성 화합물도 상기 조성물에 혼입될 수 있다.
치료용 조성물은 일반적으로 멸균되어야 하고 제조 및 저장 조건에서 안정해야 한다. 이 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 리포솜 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정연한 구조체로서 제제화될 수 있다. 상기 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용하고, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올(예컨대, 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨)을 포함시키는 것이 바람직하다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 상기 조성물에 포함시킴으로써 주사용 조성물이 장기간에 걸쳐 흡수되도록 할 수 있다.
멸균 주사액은, 활성 화합물을, 필요에 따라 전술한 성분들 중 하나 또는 그 조합과 함께 적절한 용매에 필요량 혼입한 후 멸균 정밀여과하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은, 염기성 분산매와 상기에 열거된 것들 중 필요한 다른 성분을 포함하는 멸균 비이클에 활성 화합물을 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법으로는 미리 멸균 여과한 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 소정의 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동 건조(동결 건조)가 있다.
투여 계획은 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 최적으로 얻을 수 있도록 조정한다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여할 수도 있고, 경시적으로 몇 차례의 분할 투여를 할 수도 있으며, 치료 상황의 위급성에 따라 투여량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 인간 항체는 피하 주사로 주 1회 또는 2회, 또는 피하 주사로 월 1회 또는 2회 투여할 수 있다.
투여의 용이성과 용량 균일성을 위해 비경구 조성물을 단위 투여 제형으로 제제화하는 것이 유익할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 단위 투여 제형이란 치료하고자 하는 피험체에 알맞게 단위 용량으로서 제조된 물리적으로 분리된 단위를 의미하며; 각각의 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 산출하도록 계산된 일정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 투여 제형에 대한 상세는, (a) 활성 화합물 특유의 특성 및 얻고자 하는 특정 치료 효과와, (b) 개개인에 있어서의 감수성을 치료하기 위해 이러한 활성 화합물을 합성하는 분야 고유의 제약에 의해 결정되고 이에 직접적으로 좌우된다.
약학적으로 허용되는 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예컨대 아스코빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 플로필 갈레이트, α-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 솔비톨, 타르타르산, 인산 등을 들 수 있다.
치료용 조성물의 경우, 본 발명의 제제는 경구, 비내, 국소(협측 및 설하를 포함함), 직장, 질내 및/또는 비경구 투여에 적합한 제제를 포함한다. 이 제제는 편의상 단위 투여 제형으로 제공되며 제약업계에 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 단일 제형으로 만들기 위해 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료 대상 피험체와 특정 투여 경로에 따라 달라진다. 단일 투여 제형으로 만들기 위해 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 산출하는 조성물의 양이 된다. 일반적으로, 이 양은 100% 중에서, 약 0.001%∼약 90%의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.005%∼약 70%, 가장 바람직하게는 약 0.01%∼약 30%의 활성 성분이다.
질내 투여에 적합한 본 발명의 제제는 또한 당업계에 적절하다고 알려진 담체를 함유하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제제를 포함한다. 본 발명 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 제형으로는 분말제, 스프레이제, 연고, 페이스트제, 크림, 로션, 겔, 용액제, 패치 및 흡입제를 들 수 있다. 활성 화합물은 멸균 상태에서 약학적으로 허용되는 담체 및 필요에 따라 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"이란 어구는 장내 또는 국소 투여 이외의 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수강내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물에 이용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물, 식물유, 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트를 들 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅재를 사용하고, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
이러한 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 상기 멸균 절차를 이용하고 또 각종 항균제와 항진균제(예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등)를 포함시킴으로써 미생물 침입을 방지할 수 있다. 당, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 조성물에 함유시키는 것도 바람직할 수 있다. 또한, 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 제제를 함유시킴으로써 주사용 약학 제형의 흡수를 연장시킬 수 있다.
본 발명의 화합물이 인간 및 동물에게 의약으로서 투여될 경우, 이 화합물은 단독으로, 또는 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 예를 들어 0.001∼90%(더 바람직하게는, 0.005∼70%, 예컨대 0.01∼30%)의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물로서 투여될 수 있다.
선택된 투여 경로에 관계없이, 적절한 수화된 형태 및/또는 본 발명의 약학 조성물로서 사용될 수 있는 본 발명의 화합물은 당업자에게 알려진 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용되는 제형으로 제제화된다.
본 발명 약학 조성물 중 활성 성분의 실제 용량 수준은 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 효과를 얻기에 효과적이며 환자에게 독성이 없는 활성 성분의 양이 되도록 변경할 수 있다. 선택된 용량 수준은, 의약 분야에 잘 알려져 있는, 이용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 그 에스테르, 염 또는 아미드의 활성을 비롯한 다양한 약동학적 요인, 투여 경로, 투여 시간, 이용된 특정 화합물의 분비 속도, 치료 기간, 이용된 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 나이, 성별, 체중, 상태, 치료 대상 환자의 전반적인 건강 상태 및 과거 병력 및 기타 요인들에 따라 달라진다. 당업계에서 통상적인 기술을 갖는 의사 또는 수의사는 필요한 약학 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는, 약학 조성물 중에 이용되는 본 발명 화합물의 용량을, 원하는 치료 효과를 얻기 위해 필요한 용량보다 적은 용량에서 출발하여, 원하는 효과를 얻을 때까지 그 용량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명 조성물의 적절한 1일 용량은 치료 효과를 제공하는 데 유효한 최저 용량에 해당하는 화합물 양이다. 이러한 유효량은 일반적으로 전술한 요인들에 좌우된다. 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 투여가 바람직하고, 표적 부위 가까이 투여하는 것이 바람직하다. 필요에 따라, 치료용 조성물의 유효 1일 용량을, 경우에 따라 단위 투여 제형으로, 하루 동안 적절한 간격을 두고 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상으로 분할하여 별도로 투여할 수 있다. 본 발명 화합물을 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 이 화합물을 약학 제제(조성물)로서 투여하는 것이 바람직하다.
치료용 조성물은 당업계에 공지된 의료 기구를 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 치료용 조성물은 미국 특허 제5,399,163호, 제5,383,851호, 제5,312,335호, 제5,064,413호, 제4,941,880호, 제4,790,824호 또는 제4,596,556호에 개시된 기구와 같은 무바늘 피하 주사 기구를 사용하여 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 임플란트 및 모듈의 예로는 미국 특허 제4,487,603호에 개시된 제어된 속도로 약물을 분주하기 위한 이식용 마이크로 주입 펌프; 미국 특허 제4,486,194호에 개시된 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료용 기구; 미국 특허 제4,447,233호에 개시된 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프; 미국 특허 제4,447,224호에 개시된 연속적 약물 전달을 위한 가변 유량 이식용 주입 장치; 미국 특허 제4,439,196호에 개시된 다챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템; 및 미국 특허 제4,475,196호에 개시된 삼투 약물 전달 시스템을 들 수 있다. 이러한 많은 다른 임플란트, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 생체내에서의 적절한 분포가 확보될 수 있도록 제제화할 수 있다. 예를 들어, 혈뇌 장벽(BBB)은 다수의 고친수성 화합물을 차단한다. (필요에 따라) 본 발명의 치료용 화합물이 BBB를 관통하도록 하기 위해서는, 이것을, 예를 들어 리포솜에 넣어 제제화할 수 있다. 리포솜의 제조 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호를 참조할 수 있다. 상기 리포솜은 특정 세포 또는 기관으로 선택적으로 수송되어 표적화된 약물 전달을 향상시키는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다[참고 문헌: V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685]. 예시적인 표적화 부분은 폴레이트 또는 바이오틴[참고 문헌: 미국 특허 제5,416,016호(Low et al.)]; 만노사이드[Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]; 항체[P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]; 계면활성 단백질 A 수용체[Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134], 본 발명의 제제뿐만 아니라 본 발명 분자의 성분들을 포함할 수 있는 다양한 종; p120[Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 치료용 화합물은 리포솜 내에 넣어 제제화하며; 더 바람직한 실시형태에서, 상기 리포솜은 표적화 부분을 포함한다. 가장 바람직한 실시형태에서, 리포솜 내의 치료용 화합물은 종양 또는 감염에 가까운 부위로 볼루스 주사에 의해 전달된다. 이 조성물은 주사기 사용이 용이할 정도로 유동성이어야 한다. 이 조성물은 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하고 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다.
류마티스 관절염과 관련하여 "치료학적으로 유효한 양"은 바람직하게는 환자에 있어서 ACR 개선도 예비 정의(ACR Preliminary Definition of Improvement) ACR20을 유도하고, 더 바람직하게는 ACR 개선도 예비 정의 ACR50을 유도하며, 더욱 더 바람직하게는 ACR 개선도 예비 정의 ACR70을 유도한다.
ACR 개선도 예비 정의 ACR20은 다음과 같이 정의된다:
압통 관절수(Tender Joint Count: TCJ) 및 종창 관절수(Swollen Joint Count: SWJ)에 있어서 20% 이상의 개선이 있음과, 하기 5가지 평가 중 3가지에서 20% 이상의 개선이 있음: 환자의 통증 평가(VAS), 환자의 종합적 평가(VAS), 의사의 종합적 평가(VAS), 환자 자신이 평가한 장애(HAQ), 급성상 반응 물질(CRP 또는 ESR).
ACR50 및 ACR70은 동일한 방식으로 각각 50% 이상 및 70% 이상의 개선도를 보이는 것으로 정의된다. 추가적인 상세 사항은 문헌[Felson et al. in American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism (1995) 38: 727-735]을 참조할 수 있다.
화합물의 암 억제 능력은 인간 종양에 있어서의 효능을 예측할 수 있는 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 대안으로, 조성물의 이러한 특성은, 당업자에게 공지된 분석에 의해, 시험관내 억제와 같이 화합물이 억제하는 능력을 조사함으로써 평가할 수 있다. 치료용 화합물의 치료학적 유효량은 피험체의 종양 크기를 줄이거나 또는 다른 방식으로 피험체의 증상을 개선시킬 수 있다. 당업자는 피험체의 체격, 피험체의 증상의 중증도 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 요인에 기초하여 상기 유효량을 결정할 수 있다.
항체가 간경화를 치료 또는 예방하는 능력은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 따라 평가할 수 있다.
이 조성물은, 조성물이 주사기로 투여될 수 있을 정도로 유동성이어야 하고 멸균되어야 한다. 담체는 물 이외에도 등장성 완충 염수 용액, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용하고, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올(예컨대, 만니톨 또는 솔비톨 및 염화나트륨)을 포함시키는 것이 바람직하다. 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아르산알루미늄 또는 젤라틴을 주사용 조성물에 포함시킴으로써 상기 주사용 조성물이 장기간에 걸쳐 흡수되도록 할 수 있다.
활성 화합물이 전술한 바와 같이 적절히 보호될 경우, 이 화합물은, 예를 들어 비활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다.
V. 본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 HCV에 대한 인간 항HCV 항체(이 항체의 유도체 및 접합체를 포함함) 및 상기 항체를 함유하는 조성물은 다양한 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 용도에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 간경화, 간세포 암종 및 간암 발생을 포함하나 이에 한정되지 않는 HCV 매개 질환의 치료에 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 HCV 매개 질환(예를 들어, 간 질환)을 치료 또는 예방하는 데 유효한 양으로 본 발명의 인간 항체를 피험체에 투여함으로써 상기 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 항체는 단독으로, 또는 HCV 매개 질환을 치료 또는 예방하기 위해 상기 항체와 공조하거나 또는 함께 상승적으로 작용하는 세포독소 또는 α-IFN과 같은 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 항체를 사용하는 치료에 적합한 다른 질환으로는 HCV 매개 간세포 병리 현상, HCV 매개 간경화 및/또는 HCV 매개 간암을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 HCV에 의해 매개되는 각종 질환을 시험관내 또는 생체내에서 진단하는 데 사용될 수 있다. 구체적으로, 이 항체는 HCV 수준, 또는 HCV를 포함하는 세포 수준을 검출하는 데 사용될 수 있다. 대안으로, 이 항체는 HCV 기능을 억제 또는 중화시키는 데 사용될 수 있으며, 이는 HCV 기능에 의해 유발된 질병 증상을 예방 또는 완화시킬 수 있다.
본 발명의 인간 항HCV 항체를 포함하고, 경우에 따라 사용 설명서를 포함하는 키트 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이 키트는 α-IFN 또는 본 발명의 1종 이상의 추가 인간 항체(예를 들어, 제1 인간 항체와 상이한 HCV 항원의 에피토프에 결합하는 상보 활성을 갖는 인간 항체)와 같은 1종 이상의 추가 반응제를 더 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체로 치료되는 환자에게는 인간 항체의 치료 효과를 증대 또는 증강시키는 다른 치료제가 (본 발명 인간 항체의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후에) 추가로 투여될 수 있다.
하기 실시예에서는 본 발명의 다른 실시형태를 설명한다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 추가로 예시되나, 이 실시예는 추가적인 한정으로서 해석되어서는 안 된다. 본 출원 전반에서 인용된 서열 목록, 도면과, 모든 참고 문헌, 특허 및 특허 출원 공개 공보는 명백히 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명되나, 이 실시예는 청구의 범위에 기재된 발명의 범위를 한정하지 않는다.
재료 및 방법
실시예 전반에서, 달리 명시하지 않는다면 하기 재료 및 방법을 이용하였다.
일반적으로, 본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는다면, 통상적인 화학, 분자 생물학 기법, 재조합 DNA 기법, 면역학 기법(특히, 예를 들어, 항체 기술) 및 폴리펩티드 제조 분야의 표준 기법을 이용한다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]; 문헌[Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996)]; 문헌[Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996)]; 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999)]; 및 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)]을 참조할 수 있다. HCV의 생물학적 특성을 분석하기 위한 시험관내 및 생체내 모델 시스템에 대해서는, 예를 들어 문헌[Cell culture models and animal models of viral hepatitis. Part II: hepatitis C, Lab. Anim. (NY).; 34(2):39-47 (2005)] 및 문헌[The chimpanzee model of hepatitis C virus infections, ILAR J.;42(2):117-26 (2001)]에 기재되어 있다.
코돈 최적화 HCV 유전자형 1a E1/E2 발현 구성체의 조립
간단히 설명하면, E2 유전자형 1a, 균주 H77(프로토타입 1a 서열) 단백질 서열(Genbank 수탁 번호 NC004102)을 코딩하는 핵산 서열을 구성하여 pCDNA 벡터로 도입하였다. 이 뉴클레오티드 서열을, 포유동물에서의 발현을 개선하기 위해, 코돈 선호도가 최적화되도록 변경하였다. 이 서열을 IDT에서 구입한 올리고뉴클레오티드를 사용한 오버래핑(overlapping) PCR을 이용하여 조립하고, C 말단 myc 및 6 히스티딘 태그와 프레임 내에 HindIII 및 XbaI 부위를 갖는 pCDNA3.1-myc, his 발현 벡 터로 클로닝하였다. 그 후 이 벡터를 서열 분석하여 구성체가 올바른지를 확인하였다.
E1/E2 코돈 최적화 1a H77 서열은, 제한 부위를 포함하는 부가된 말단(볼드체 소문자), 제한 효소 절단을 담보하는 추가적인 돌출부(밑줄친 소문자) 및 ATG 개시 코돈(볼드체의 밑줄친 대문자)을 갖는 공통 Kozak 서열(볼드체의 밑줄친 소문자)을 갖는다(서열 번호 27 및 도 13 참조).
가용성 E2 단백질을 발현시키기 위한 코돈 최적화된 HCV 유전자형 1a E2-661 발현 구성체(pCDNA-1a-CO-E2-661)의 조립
364∼661번 아미노산을 코딩하는 E2 단백질의 일부분을, pCDNA-1a-CO-E1/E2를 주형으로 사용하여 PCR로 증폭시키고, C 말단 6 히스티딘 태그와 프레임 내에 HindIII 및 XbaI을 갖는 pCDNA3.1-his 발현 벡터로 클로닝하였다. 이 벡터를 서열 분석하여 구성체가 올바른지를 확인하였다.
코돈 최적화된 HCV 유전자형 1a E2-661의 발현 및 정제
리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen)을 사용하여 293T 인간 조직 배양 세포의 일시적 형질감염을 수행하였다. 이 세포로부터 분비 단백질 함유 상청액을 수집하고, 니켈 친화성 크로마토그래피를 이용하여 상기 상청액으로부터 1a E2-661을 정제하였다. 단백질 농도는 OD 280 nm에 기초하여 측정하고, 쿠마시 염색 SDS-PAGE 및 Biodesign International로부터 입수한 시판되는 E2 마우스 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 추가로 평가하였다.
야생형 HCV 유전자형 1a E1/E2 발현 벡터(pCDNA-1a-E1/E2)의 조립
HCV1a H77 코딩 서열의 E1/E2(165∼746번 아미노산)를, HindIII 및 XbaI 클로닝 부위, 공통 Kozak 서열 및 개시 코돈을 도입하기 위해 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시킨 후, C 말단 6 히스티딘 태그와 프레임 내에 HindIII 및 XbaI을 갖는 pCDNA3.1-his 발현 벡터로 클로닝하였다. 이 벡터를 서열 분석하여 구성체가 올바른지를 확인하였다.
야생형 HCV 유전자형 1a E2-660 발현 벡터(pCDNA-1a-E2-660)의 조립
364∼660번 아미노산을 코딩하는 E2 단백질의 일부분을, pCDNA-1a-E1/E2를 주형으로 사용하여 PCR로 증폭시키고, C 말단 6 히스티딘 태그와 프레임 내에 HindIII 및 XbaI을 갖는 pCDNA3.1-his 발현 벡터로 클로닝하였다. 이 벡터를 서열 분석하여 구성체가 올바른지를 확인하였다.
HCV 유전자형 1b, 2b, 3a 및 4a E1/E2 발현 벡터(pCDNA-E1/E2)의 조립
고역가 유전자형 1b, 2b, 3a 및 4a HCV 양성 환자 혈청을 입수하여 그 혈청으로부터 RNA를 분리하였다. 코어 유전자 및 E1/E2 유전자의 측면에 위치하는 p7 유전자의 말단에 상보적인 유전자형 특이적 프라이머를 사용하여 상기 분리된 RNA에 대해 RT-PCR을 수행하였다. HindIII 및 XbaI 클로닝 부위, 공통 Kozak 서열 및 개시 코돈을 도입하기 위해 프라이머를 사용하여 E1/E2 코딩 서열(165∼746번 아미노산)을 PCR로 증폭시켰다. 이 서열을 C 말단 6 히스티딘 태그와 프레임 내에 HindIII 및 XbaI을 갖는 pCDNA3.1-his 발현 벡터로 클로닝한 후 서열을 분석하였다. blast 검색으로 서열이 예상 유전자형인지를 확인하였으나, 데이터베이스 내에 이 서열과 정확히 일치하는 것이 없었다.
HCV 유전자형 1b E2-661 발현 벡터(pCDNA-1b-E2-661)의 조립
364∼661번 아미노산을 코딩하는 E2 단백질의 일부분을, pCDNA-1b-E1/E2를 주형으로 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 그 후, 이 서열을 C 말단 6 히스티딘 태그와 프레임 내에 HindIII 및 XbaI을 갖는 pCDNA3.1-his 발현 벡터로 클로닝하였다. 그 후 이 벡터를 서열 분석하여 구성체가 올바른지를 확인하였다. 발현 및 정제는 1a E2-661에 대해 상기에 기재된 것과 실질적으로 동일하게 수행하였다.
HCV 유전자형 1a E2 HVR1 결실 발현 벡터의 조립
E2의 과가변 영역 1(HVR1)을 코딩하는 뉴클레오티드가 결실된 E1/E2 코딩 구성체를 생성하기 위해, pCDNA-1a-E1/E2를 주형으로 사용하고, 411번 아미노산에서 출발하는 E2 영역(384∼410번 아미노산(HVR1)은 건너뜀)에 대한 돌출부를 포함하는 3' 프라이머를 사용하여 E1을 PCR로 증폭시켰다. 별도의 반응으로, pCDNA-1a-E1/E2를 주형으로 사용하고 E1의 3' 말단에 대한 돌출부를 포함하는 5' 프라이머를 사용하여 411∼746번 아미노산을 코딩하는 E2 영역을 PCR로 증폭시켰다. E2에 대한 HVR1을 코딩하는 영역없이 E1-E2 접합부에서 상보적 돌출부를 포함하는 E1 및 E2 PCR 생성물을 혼합한 후, HindIII 부위를 갖는 E1의 5' 말단 및 XbaI 부위를 갖는 E2의 3' 말단에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 이 서열을 C 말단 6 히스티딘 태그와 프레임 내에 HindIII 및 XbaI을 갖는 pCDNA3.1-his 발현 벡터로 클로닝하였다. 그 후 이 벡터를 서열 분석하여 구성체가 올바른지를 확인하였다.
코돈 최적화 HCV 유전자형 1a E2 절단형 발현 벡터의 조립
E2의 C 말단의 아미노산이 제거된, 포유동물에서의 발현을 위한 절단형 벡터를 제조하였다. 원하는 아미노산을 코딩하는 E2 단백질의 일부분을, pCDNA-1a-CO-E1/E2를 주형으로 사용하여 PCR로 증폭시키고 C 말단 6 히스티딘 태그와 프레임 내에 HindIII 및 XbaI을 갖는 pCDNA3.1-his 발현 벡터로 클로닝하였다. 그 후 이 벡터를 서열 분석하여 구성체가 올바른지를 확인하였다. 다음과 같은 구성체가 제조되었다:
o pCDNA-1a-CO-E2-624 (E2 아미노산 384∼624번)
o pCDNA-1a-CO-E2-584 (E2 아미노산 384∼584번)
o pCDNA-1a-CO-E2-544 (E2 아미노산 384∼544번)
o pCDNA-1a-CO-E2-504 (E2 아미노산 384∼504번)
o pCDNA-1a-CO-E2-464 (E2 아미노산 384∼464번)
각 구성체로부터의 발현 및 정제는 1a E2-661에 대해 상기에 기재된 것과 실질적으로 동일하게 수행하였다.
렉틴 ELISA
항체 반응성을 측정하기 위해 E2 절단체를 이용하여 렉틴 포획 ELISA를 수행하였다. 요약하면, 96웰 플레이트를 갈란투스 니발리스(Galanthus nivalis: GNA) 렉틴으로 코팅하였다. 일시적 형질감염된 293개 세포의 상청액으로부터 얻은 E2 절단체를, 단백질 포획을 위해 GNA 렉틴으로 코팅한 96웰 플레이트에 첨가하였다. 그 후, 하이브리도마 상청액을 상기 96웰 플레이트에 첨가하여 단백질 반응성을 측정하였다. 결합된 항체는 항인간 알칼리 포스파타제 2차 항체 및 PNPP 기질을 이용하 여 검출하였다.
HCV 유전자형 1a E2 당단백질의 384∼464번 아미노산에 걸쳐 있는 박테리아 발현 구성체의 조립
그 후, E2의 작은 부분이 생성되도록, 박테리아 발현을 위한 N 말단 티오레독신 융합을 이용하여 융합 단백질을 조작하였다.
제1 세트 단백질의 경우, 원하는 아미노산을 코딩하는 E2 단백질의 일부분을, pCDNA-1a-E1/E2를 주형으로 사용하여 PCR로 증폭시키고, C 말단 myc 및 6 히스티딘 태그와 프레임 내에 EcoRI 및 HindIII를 갖는 pET32 발현 벡터로 클로닝하였다. 그 후 이 벡터를 서열 분석하여 구성체가 올바른지를 확인하였다. 다음과 같은 구성체가 제조되었다:
o pET32-E2-A (아미노산 384∼463번)
o pET32-E2-B (아미노산 411∼463번)
o pET32-E2-C (아미노산 432∼463번)
o pET32-E2-D (아미노산 436∼463번)
o pET32-E2-E (아미노산 384∼431번)
이 벡터를 BL21-DE3 이. 콜라이 박테리아(Invitrogen)로 형질전환시키고, IPTG로 발현을 유도하였다. 박테리아를 용해하여 니켈 친화성 크로마토그래피로 관심있는 단백질을 정제하였다. 단백질 농도는 OD 280 nm에 기초하여 측정하고 쿠마시 염색 SDS-PAGE와 myc 및 히스티딘 태그에 특이적인 마우스 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 추가 평가하였다.
제2 세트 단백질에 대해서는, 어닐링될 때 EcoRI 및 HindIII 돌출부를 가지고 원하는 아미노산을 코딩하는 상보성 인산화 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 이 DNA를 C 말단 myc 및 6 히스티딘 태그와 프레임 내에 EcoRI 및 HindIII를 갖는 pET32 발현 벡터로 클로닝하였다. 그 후 이 벡터를 서열 분석하여 구성체가 올바른지를 확인하였다. 다음과 같은 구성체가 제조되었다:
o pET32-E2-G (아미노산 412∼423번)
o pET32-E2-H (아미노산 432∼443번)
o pET32-E2-I (아미노산 436∼447번)
발현 및 정제는 제1 세트 단백질에 대해 상기에 기재된 것과 실질적으로 동일하게 수행하였다.
HCV E2-412∼423 에피토프의 알라닌 스캐닝 돌연변이체의 생성
항체와의 접촉에 중요한 아미노산 접촉부를 확인하기 위해, 박테리아 발현 구성체에서 412∼423 에피토프 내의 각각의 아미노산을 개별적으로 알라닌으로 돌연변이시켰다. 어닐링될 때 EcoRI 및 HindIII 돌출부를 가지고 원하는 변화를 갖는 E2 412∼413 영역을 코딩하는 상보성 인산화 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 이 DNA를 C 말단 myc 및 6 히스티딘 태그와 프레임 내에 EcoRI 및 HindIII를 갖는 pET32 발현 벡터로 클로닝하였다. 그 후 이 벡터를 서열 분석하여 구성체가 올바른지를 확인하였다. 다음과 같은 구성체가 제조되었다:
o pET32-E2-G-Q412A (Q가 A로 바뀐 아미노산은 412번)
o pET32-E2-G-L413A
o pET32-E2-G-I414A
o pET32-E2-G-N415A
o pET32-E2-G-T416A
o pET32-E2-G-N417A
o pET32-E2-G-G418A
o pET32-E2-G-S419A
o pET32-E2-G-W420A
o pET32-E2-G-H421A
o pET32-E2-G-I422A
o pET32-E2-G-N423A
발현 및 정제는 다른 박테리아 단백질에 대해 상기에 기재된 것과 실질적으로 동일하게 수행하였다.
슈도바이러스 생성 및 중화 분석
HIV 외피 당단백질 발현을 방지하는 돌연변이를 포함하는 HIV 골격과 표적 세포에서 루시퍼라제 발현을 유도하는 루시퍼라제 유전자(pNL4-3.Luc.R-E-)를 갖는 슈도바이러스를 생성하였다. HCV E1/E2 당단백질은, pNL4-3.Luc.R-E-와 함께, 다양한 유전자형(1a, 1b, 2b, 3a 및 4a)으로부터 유래된 pcDNA E1/E2로 293 세포를 동시 형질감염시켜 트랜스 작용으로 제공되었다. 형질감염으로부터 48∼72시간 경과 후 세포로부터 분비된 바이러스 입자를 함유하는 상청액을 회수하고 Centricon 70 농축기 및/또는 한외 원심분리를 이용하여 농축시켰다. 그 후, 슈도바이러스를 항 체 존재 또는 부재하에 Hep3B 세포(ATCC)를 감염시키는 데 사용하였다. 슈도바이러스를 항체와 실온에서 1시간 동안 사전 항온처리한 후 Hep3B 세포에 첨가하였다. 항온처리 72시간 후, BrightGlo 루시퍼라제 분석(Promega)을 이용한 루시퍼라제 검출로 감염을 정량하고 Victor3 플레이트 판독기(Perkin Elmer)로 판독하였다.
Biacore 친화성 측정
염소 항인간 IgG(Fc)를 플로우 셀(flow cell) 1 및 2에서 Biacore로부터 입수한 CM5 센서 칩에 아미드 커플링하였다. HBS-P 완충액(Biacore)만을 사용하여 플로우 셀 2에서 인간 항체(95-2 또는 83-128)를 포획하였다. HBS-P 완충액 중 125 nM, 62.5 nM, 31.3 nM 및 15.6 nM 농도로 50 ㎕/min로 200초 동안 플로우 셀 1(백그라운드용) 및 플로우 셀 2(인간 항체와의 특이적 항온처리용) 둘 다에 E2-G를 흘려 보냈다. 주입을 중단한 후, 완충액을 상기 두 플로우 셀에 흘려 보내서 해리 데이터를 수집하였다. BIAevaluation 소프트웨어를 이용하여 데이터를 평가하고 곡선을 피팅함으로써 친화도 상수를 측정하였다.
마우스 면역화
Medarex로부터 입수한 인간 IgG 유전자가 이식된 마우스(HuMab 마우스)를 가용성 E2 단백질로 면역화하여 면역 반응을 발생시켰다. 마우스 85083는 프로인트 면역증강제와 함께 1a E2-661을 1회 주사하고, MPL + TDM 면역증강제(Sigma)를 14회 주사하여 면역화시켰다. 마우스 97895는 MPL + TDM + CWS 면역증강제(Sigma)와 함께 1a E2-661을 1회 주사하고, MPL + TDM 면역증강제를 5회 주사하여 면역화하였다.
비장 융합 및 하이브리도마 선별
마우스 비장을 적출하여 비장 세포를 분리하였다. 하이브리도마 생성을 위한 표준 PEG 융합 프로토콜에 따라 비장 세포를 마우스 골수종에 융합하였다. 그 후, 하이브리도마 상청액을, 1a E2-661에 대해 반응성인 항체 생산에 대해 ELISA로 스크리닝하고, 양성 세포는 추가 분석에 사용하였다.
하이브리도마 항체 유전자의 단리 및 서열 분석
Qiagen RNeasy 키트를 사용하여 하이브리도마 세포로부터 RNA를 단리하였다. 제한 부위를 포함하는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 중쇄 가변 영역에 대해 RT-PCR을 수행하였으며, 얻어진 서열을 클로닝하고 구성체를 서열 분석하였다. 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 경쇄 가변 영역에 대해 RACE를 수행하였다. 이 서열을 TOPO 벡터로 클로닝하고 이 벡터를 서열 분석하였다. 유전자 특이적 프라이머를 디자인하여 PCR 증폭과 제한 부위 추가에 사용하였다.
실시예 1: 항HCV 단일클론 항체의 생성
마우스 면역화, 하이브리도마 생산 및 선별
"HuMab 마우스에서의 인간 단일클론 항체의 생성"이라는 표제하의 상기 섹션에 기재된 바와 제조되고 미국 캘리포니아주 밀피타스 소재의 Medarex가 공급한 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 유전자이식 마우스를 HCV 유전자형 1a E2 외피 당단백질의 가용성 형태로 면역화하였다. 상기 항원은 프로인트 완전 면역증강제 또는 RIBI 면역증강제와 함께 투여되었다. 가용성 E2 단백질(1a E2-661)에 대한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 마우스 혈청 반응을 모니터링하였다. 면역화된 동물로부터 비장 B 세포를 분리하고 표준 비장 세포 융합법을 이용하여 마우스 골수종(P3X-AG8.653) 세포에 융합시켰다. 클론 하이브리도마를 생성하여, E2-661에 대한 항체의 생산에 대해 ELISA를 이용하여 스크리닝하였다. 양성 하이브리도마를, HCV 유전자형 1a 및 유전자형 1b E2-661에 대해 동등한 반응성을 갖는지에 대해 하이브리도마 상청액의 양을 줄여가면서 ELISA로 분석하였다. 유전자형 1a E2-661 및 1b E2-661에 대해 동등한 반응성을 나타내는 하이브리도마를, Hep3B 세포의 HCV 슈도바이러스 감염력을 중화시키는 능력에 대해 테스트하였다. 이러한 선별 과정에 의해, HCV 슈도바이러스를 중화시키고 ELISA로 분석시 1a 가용성 단백질과 1b E2 가용성 단백질에 대해 동등한 반응성을 갖는 20개의 하이브리도마가 얻어졌다. 구체적으로, 19개 하이브리도마가 마우스 #97895로부터 유래되었고 이것은 다음과 같은 IgG1 항체를 생산하였다: 95-2; 95-14; 95-15; 95-18; 95-20; 95-21; 95-25; 95-26; 95-30; 95-38; 95-39; 95-42; 95-43; 95-48; 95-49; 95-52; 95-54; 95-58; 및 95-62. HCV 슈도바이러스를 중화시키고 ELISA로 분석시 1a 가용성 단백질과 1b E2 가용성 단백질에 대해 동등한 반응성을 갖는 1개 하이브리도마, 즉 83-128 또한 마우스 #85083으로부터 확인되었으며, 이것은 IgG3 항체를 생산하였다. HCV 슈도바이러스를 중화시키고 ELISA로 분석시 1a 가용성 단백질과 1b E2 가용성 단백질에 대해 동등한 반응성을 갖는 1개 하이브리도마, 즉 073-1 역시 마우스 #113073으로부터 확인되었으며, 이것은 IgG3 항체를 생산하였다. 이러한 21개 하이브리도마를 추가로 특징 분석하였다.
항체 서열 분석 및 클로닝
인간 항체 83-128(마우스 #85083으로부터의 하이브리도마 유래) 및 073-1(마우스 #113073으로부터의 하이브리도마 유래)의 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 서열 분석하고 인간 IgG1/카파 항체에 대한 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 벡터로 클로닝하였다. 이것은 인간 항체 83-128 및 073-1을 IgG3 항체에서 IgG1 항체로 변화시켰다.
마우스 #97895로부터의 19개 하이브리도마 유래의 인간 항체의 중쇄 가변 서열을 서열 분석하여 비교하였다. 19개 항체 모두 상당한 서열 동일성(즉, >96% 동일함)을 공유하는 것으로 확인되었다. 중화 분석 데이터에 기초하여 3개 하이브리도마, 즉 95-2, 95-14 및 95-38을 선택하여 그 경쇄 가변 영역 서열을 결정하였다. 인간 항체 95-2, 95-14 및 95-38의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 인간 IgG1/카파 항체에 대한 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 벡터로 클로닝하였다. 항체를 일시적 형질감염으로 발현시키고 정제하고 HCV 슈도바이러스 중화 분석으로 직접 비교하였다. 마우스 #97895로부터의 인간 항체 95-2를 선택하여 추가로 특징 분석하였다.
클론 95-14, 95-49, 95-62, 95-42, 95-58, 95-25, 95-43, 95-54, 95-2, 95-38, 83-128, 073-1에 의해 생산된 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 32, 37, 40, 35, 39, 34, 36, 38, 3, 33, 1 및 5에 제시되어 있다. 클론 95-2, 95-14, 95-38, 073-1 및 83-128에 의해 생산된 항체의 경쇄 가변 영역의 아 미노산 서열은 각각 서열 번호 4, 44, 53, 6 및 2에 제시되어 있다.
클론 95-2, 95-14, 95-38, 073-1 및 83-128에 의해 생산된 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 27, 48, 57, 29 및 25에 제시되어 있고; 클론 95-2, 95-14, 95-38, 073-1 및 83-128에 의해 생산된 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 28, 49, 58, 30 및 26에 제시되어 있다.
실시예 2: 항체 특징 분석
HCV 유전자형 1a 및 1b - 가용성 E2 ELISA
가용성 HCV 유전자형 1a E2-660(▲) 및 가용성 HCV 유전자형 1b E2-661(■)에 대한 인간 항체 95-2의 반응성(도 1A) 및 인간 항체 83-128의 반응성(도 1B)을 비교하였다. ELISA 플레이트를 2 ㎍/ml의 항원으로 코팅하고 2배 희석된 항체로 프로빙하였다. 결합된 항체는 알칼리 포스파타제에 접합된 염소 항인간 2차 항체와 PNPP 기질을 사용하여 검출하였다. 상기 두 인간 항체, 즉 95-2 및 83-128은 두 유전자형에 대해 동등하게 반응하는 것으로 확인되었다(도 1 참조). 이러한 실험은 95-14 항체, 95-38 항체 및 073-1 항체에 대해서도 수행되었으며, 이들 3종 모두 유전자형 1a 및 1b를 동등하게 인식하였다(데이터는 제시하지 않음).
다중 유전자형 유래의 HCV 슈도바이러스의 중화
인간 항체 95-2 및 83-128 둘 다가 HCV 슈도바이러스의 다중 유전자형을 중화시키는 능력을 Hep3B 세포를 사용하여 측정하였다. 5배 희석된 항체를 HCV 슈도바이러스와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 바이러스와 항체 혼합물을 Hep3B 세포에 첨가한 후, 37℃에서 72시간 동안 항온처리하였다. 감염은 Brightglo 루시퍼라제 분석으로 정량하고 Victor3 플레이트 판독기로 광 출력을 판독하였다. 아이소타입 일치 비관련 인간 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 상기 두 인간 항체, 즉 95-2 및 83-128은 HCV 유전자형 1a, 1b, 2b, 3a 및 4a 슈도바이러스를 중화시키는 것으로 확인되었다(각각 도 2A, 2B, 2C, 2D 및 2E 참조). 항체 073-1 또한 상기에 열거된 슈도바이러스 모두를 중화시키는 것으로 확인되었다(데이터는 제시하지 않음).
유전자형 1a 및 1b E2 가용성 단백질의 환원 및 비환원 웨스턴 블롯
환원 또는 비환원 SDS-PAGE를 실시한 HCV 유전자형 1a 및 1b로부터의 가용성 E2 단백질(E2-661)에 대한 인간 항체 95-2 및 83-128의 반응성을 분석하였다. 웨스턴 블롯은, 증강 화학발광 검출 시약과 함께 HRP에 접합된 항마우스 IgG(his) 또는 항인간 IgG(95-2 및 83-128)를 사용하여, 항his 태그 단일클론 항체(his), 항체 83-128 및 95-2로 수행하였다. 상기 두 인간 항체 95-2 및 83-128은, 변성 환원 겔로 전기영동한 후 PVDF 멤브레인으로 이전시킨 E2-661을 인식하는 것으로 확인되었다(도 3 참조).
박테리아 융합 단백질로서 발현된 E2 412∼423 에피토프에 대한 인간 항체 95-2 및 83-128의 결합 친화력
박테리아 융합 단백질로서 발현된 E2 412∼423 에피토프에 대한 인간 항체 95-2 및 83-128의 결합 친화력을 측정하여 도 4에 요약하였다. 염소 항인간 IgG Fc를 Biacore 칩에 아미드 커플링하였다. 인간 항체 95-2 및 83-128을 개별적으로 칩 상에 포획시키고, E2 412∼423 아미노산을 포함하는 E2-G 박테리아 발현 단백질을 다양한 농도로 흘려 보냈다. BIAevaluationTM 소프트웨어를 이용하여 곡선을 피팅하고 친화도 상수를 계산하였다.
실시예 3: 에피토프 확인
인간 항체 83-128 및 95-2가 인식하는 E2 단백질 영역의 확인
인간 항체 83-128 및 95-2가 인식하는 E2 단백질 영역을 확인하기 위해, 포유동물에서 발현된 E2 단백질의 카복시 말단 절단체를 렉틴 ELISA로 포획하고 83-128 및 95-2로 프로빙하였다(구성체 맵은 도 5 참조, ELISA 데이터는 도 6 참조). 데이터에 기초할 때, 이들 항체에 대한 에피토프는 E2의 412∼464번 아미노산 내에 있다. 예상대로, 모든 항체(95-14, 95-49, 95-62, 95-42, 95-58, 95-25, 95-43, 95-54, 95-2, 95-38 및 073-1)가 역시 E2 단백질의 상기 영역에 맵핑되었다.
에피토프를 추가로 규정하기 위해, 박테리아에서 발현된 융합 단백질을 사용하였는데, 그 이유는 E2의 더 작은 단편은 포유동물 시스템에서 잘 발현되지 않기 때문이다. 정제된 단백질을 ELISA 플레이트에 코팅하고 인간 항체 83-128 및 95-2로 프로빙하였다(구성체 맵은 도 7 참조, ELISA 데이터는 도 8 참조). 인간 항체 83-128 및 95-2 둘 다 E2 412∼423번 아미노산을 포함하는 모든 구성체를 인식하였으므로, 412∼423번 아미노산을 에피토프인 것으로 확인하였다. 이 실험은 073-1 항체를 사용해서도 수행하였는데, 이것 역시 412∼423 에피토프를 인식하였다(데이 터는 제시하지 않음).
412∼423 에피토프 내의 중요한 접촉 부분을 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 이용하여, E2-G 박테리아 융합 단백질에서 412∼423 에피토프 내의 각각의 아미노산을 알라닌으로 개별적으로 변경하였다. 정제된 단백질을 ELISA 플레이트에 코팅하고 인간 항체(83-128) 및 인간 항체(95-2) 둘 다로 프로빙하였다. 융합 단백질 상의 (His)6 에피토프 태그에 특이적인 항his 단일클론 항체를 플레이트의 코팅을 위한 대조군으로 사용하였다(도 9 참조). 데이터에 기초하여, 413번 및 420번 잔기가 인간 항체 95-2에 대한 결합에 중요한 것으로 확인되었고; 413번, 418번 및 420번 잔기가 인간 항체 83-128에 대한 결합에 중요한 것으로 확인되었다.
412∼423 에피토프 내의 자연 발생 변화의 빈도를 측정하기 위해, E2의 이 영역을, 오직 완전한 서열과 유사한 서열을 한 서열로 줄여가는 수작업 최적화에 의해 압축된 Los Alamos HCV 서열 데이터베이스에 기록된 서열에 대하여 분석하였다. 정렬(도 10)에 기초하면, 압축 데이터베이스 내 서열의 77.7%가 본 실시예에서 이용된 1a 및 1b 발현 E2 단백질의 이러한 영역의 서열과 동일하다. 따라서, 인간 항체 95-2 및 83-128은 이들 단백질을 인식할 것이다.
이 영역 내의 보고된 서열 차이의 일부가 인간 항체 95-2 및 83-128 인식에 영향을 주는지를 확인하기 위해, 412∼423 에피토프를 포함하는 E2 박테리아 발현 융합 단백질로 서열 변화를 도입하였다(도 11). 이 데이터베이스에 포함되지 않은 문헌[Tarr et al. (2006) Hepatology (Genbank 수탁 번호 AY785283)]에 기록된 유전자형 5 균주 유래의 서열을 포함시켰다. 정제된 단백질을 항체(83-128) 및 항체(95-2) 둘 다로 프로빙한 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 융합 단백질 상의 his 태그에 특이적인 항his 단일클론 항체를 플레이트의 코팅을 위한 대조군으로 사용하였다(도 12). 인간 항체 95-2는 유전자형 6a를 제외하고 모든 구성체를 인식하였으며, 특정 유전자형 5 서열의 경우 인식이 10배 약했다. 인간 항체 83-128은, 특정 유전자형 5 및 6a 서열로부터 유래된 것을 제외하고, 모든 구성체를 인식하였으며 5a의 인식은 약했다.
실시예 4: 시험관내 모델
시험관내 모델에서 본 발명의 인간 항체가 항바이러스 활성을 갖는지와 HCV 감염을 억제하는 능력을 갖는지를 테스트한다. 예를 들어, (i) HCV에 의한 1차 간세포의 감염; (ii) 간세포주의 안정한 형질감염; 및 (iii) 예를 들어, 문헌[C. Guha et al. ("Cell culture models and animal models of viral hepatitis. Part II: hepatitis C" Lab Animal (NY) 2005, 34(2):39-47)]에 기재된 바와 같이 전체 길이 또는 게놈 하부 레플리콘을 이용한 형질감염을 비롯하여 HCV 감염의 수많은 시험관내 모델이 당업계에 알려져 있고 본 발명의 인간 항체를 테스트하는 데 이용된다. 이러한 시험관내 모델에서 배양된 세포를 본 발명의 인간 항체 또는 적절한 대조군 항체에 노출시키고, 상기 항체가 HCV 감염 및 바이러스 활성에 미치는 영향을 당업계에 공지된 표준 기법을 이용하여, 예를 들어, 정량적, 실시간 역전사/폴리머라제 연쇄 반응(RT/PCR)을 이용하여, 예를 들어, HCV 바이러스 RNA를 검출함으 로써 모니터링한다.
실시예 5: 생체내 동물 모델
생체내 동물 모델에서 본 발명의 인간 항체가 C형 간염 바이러스 감염을 억제하는 능력을 테스트한다. 특히, 본 발명의 인간 항체를 문헌[R. E. Lanford et al. (ILAR J. 2001;42(2):117-26)]에 기재된 바와 같이 침팬지 동물 모델에서 테스트한다. Lanford 등의 문헌에 기재된 바와 같이, 침팬지[판 트로글로다이트(Pan troglodytes)]는 C형 간염 바이러스(HCV) 감염에 감수성이 있는 유일한 실험 동물로서 감염의 임상 경로 관찰, 바이러스의 물리적 특성 확인 및 HCV 핵산의 최종 클로닝을 비롯하여 비A형 비B형 간염에 관한 초기 연구에서 도구로서 사용되었다. 침팬지 모델은 HCV 감염에 있어서의 초기 사건의 분석에 중요한데, 그 이유는 침팬지가 노출시부터 샘플을 얻을 수 있는 집단에 해당하고 노출된 모든 침팬지가 관찰 대상이 되기 때문이다. 이러한 이유로, 침팬지는 진정으로 비선택적인 집단에 해당한다. 대조적으로, 인간 코호트는 대개 질병 상태 또는 항체 반응성에 따라 선택되며, 일반적으로 수십년 동안 감염된 상태로 있는 개체를 포함한다. 침팬지 모델은 바이러스 제거에 관여하는 인자의 이해 향상, 감염에 대한 면역 반응의 분석 및 백신의 개발에 필수적이다. HCV의 감염성 cDNA 클론의 개발은 침팬지의 사용에 달려 있으며, 침팬지는 바이러스 복제에 있어 중요한 서열을 평가하기 위해 역유전학을 이용함에 있어서 계속 필요로 될 것이다. 또한, 침팬지는 HCV 감염 과정에서 간 유전자 발현에 있어서의 전체적인 변화 범위를 규명하기 위해 DNA 마이크로어레이 기술과 함께 이용되어 왔다. 침팬지는 계속해서 HCV 질환의 이해와 치료법의 개발에 중요한 측면을 제공할 것이다.
따라서, 침팬지에 HCV를 접종하고 추가적으로 본 발명의 인간 항체를 투여한다. 대조군 동물에는 HCV를 투여하고 본 발명의 인간 항체를 투여하지 않거나 적절한 대조군 항체를 투여한다. 본 발명의 인간 항체는 HCV 접종 전, HCV 접종시, 또는 HCV 접종 후에 침팬지에 투여한다. 그 후, 인간 항체가 HCV 감염, 진행 및 제거에 미치는 영향을 당업계의 표준 분석을 이용하여 모니터링한다. 예를 들어, HCV 감염 및/또는 제거는, (i) 간 손상의 지표가 되는 혈청 알라닌 아미노 트랜스퍼라제(ALT) 수준 증가를 측정하고; (ii) 예를 들어, 정량적, 실시간 역전사/폴리머라제 연쇄 반응(RT/PCR)에 의해, 혈청 중의 HCV 바이러스 RNA를 검출하고; 및 (iii) 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 분석 및 재조합 면역블롯 분석에 의해, 항HCV 항체 반응을 평가함으로써, 모니터링할 수 있다. 이러한 분석은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 Lanford 등의 문헌에 기재된 바와 같이 수행한다. 또한, 전술한 것과 유사한 실험을 통해, 예를 들어 Lanford 등의 문헌에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체가 HCV E1 및/또는 E2 단백질에 대한 반응에 미치는 영향을 평가한다. 대조군 동물에 비해, 본 발명의 인간 항체에 노출된 동물에 있어서의 HCV 감염의 하향 조절, HCV 진행의 감소 또는 HCV 제거의 증가가 나타난 것은 본 발명의 항체가 HCV 감염의 예방 또는 치료에 유효성이 있음을 나타낸다.
또한, 감염의 급성기 또는 바이러스 제거 기간 동안 여러 시점에, 감염된 동물의 간에 있어서의 유전자 발현의 변화를 모니터링함으로써, 침팬지의 HCV 감염에 있어서의 점진적인 변화에 본 발명의 인간 항체가 미치는 영향을 모니터링하기 위 해 DNA 마이크로어레이를 이용한다. 항체에 노출된 동물과 항체에 노출되지 않은 대조군 동물에서, 감염 전과, 감염과 제거가 일어나는 동안(예를 들어, 감염 후 16주까지) 여러 시점에 얻은 간 조직에 대해 DNA 마이크로어레이 분석을 수행한다. 이러한 연구는, 예를 들어, 실질적으로 Lanford 등의 문헌에 기재된 바와 같이, 약 6,800종의 유전자를 대표하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 Affymetrix Human FL DNA 마이크로어레이를 사용하여 수행할 수 있다.
실시예 6: 인체 투여를 위한 항HCV 항체의 제조
공지된 기법을 이용하여, 본 발명의 인간 항체를 클로닝하고 그 생산이 촉진되거나 증가되도록 재조합에 의해 발현시킬 수 있다.
본 발명의 항체 클론의 가변 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 재조합 DNA 방법을 이용하여 pIE-Ugamma1F 벡터에 클로닝할 수 있다. 이 벡터를 이. 콜라이에서 증폭시키고 정제하여 CHO 세포에 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 96웰 디쉬에 웰당 4×105개 세포로 플레이팅하고, G418를 사용하여 벡터 형질감염을 선별한다. 그 후, G418 내성에 의해 선별한 내성 클론을 IgG 생산을 위한 다른 트랜스펙토마와 함께 분석한다. 항체의 발현은, 메토트렉세이트 농도를 증가시키면서 함께 배양하여 증폭시킬 수 있다. 175 nM 메토트렉세이트에서 증식할 수 있는 배양물을, 추가 진행을 위한 단일 세포 클로닝을 위해 선택한다. 96웰 플레이트에 저밀도로 배양물을 플레이팅하면 단일 세포 또는 클론으로부터 발생되는 배양물이 생성되었다. 이 배양물을 인간 IgG 생산에 대해 스크리닝하고, 고농도의 IgG를 생산하는 세포를 일반적으로 후속 사용을 위해 선택한다. 메토트렉세이트 증폭 클론을 증식시켜 다수의 세포 동결 바이알을 포함하는 세포 뱅크를 생성한다. 대안으로, 글루타민 신세타제(GS) 벡터를, 예를 들어, 메티오닌 설폭시민을 이용하여 수행하는 세포 선별과 함께 이용할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,827,739호; 제5,122,464호; 제5,879,936호; 및 제5,891,693호 참조).
형질감염된 세포로부터 항체를 제조하기 위해, 이전 단계에서 단리한 클론 유래의 세포를 생물 반응기용 접종물로서 배양하고 증식시킨다. 생물 반응기는 일반적으로 500 L 용량의 배양 배지를 수용한다. 생물 반응기에서 세포 생존율이 떨어질 때까지 세포를 배양하는데, 생존율 하락은 배양물에서 최대 항체 농도가 형성되었음을 나타낸다. 세포를 여과로 분리한다. 여과물을 단백질 A 컬럼에 적용한다. 항체를 컬럼에 결합시키고 저 pH 세척액으로 용리시킨다. 그 후, 항체를 Q-세파로스 컬럼에 적용하여, 잔류 오염물, 예컨대 CHO 세포 단백질, DNA 및 다른 오염물(예를 들어, 존재할 경우, 바이러스 오염물)을 제거한다. Q-세파로스 컬럼으로부터 항체를 용리시키고, 나노 여과하고, 농축시키고, PBS와 같은 완충액으로 세척한다. 그 후, 이 조제물을 무균 상태에서 투여용 바이알로 분액한다.
균등 범위
당업자라면 본 명세서에 기재된 발명의 특정 실시형태의 다양한 균등 범위를 이해하거나 통상적인 실험만을 이용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등 범위는 하기 청구의 범위에 포함되는 것이다. 종속항에 개시된 실시형태의 임의의 조합도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
참고 문헌 인용
본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 계류중인 특허 출원은 그 전체가 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
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SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS <120> HUMAN ANTIBODIES AGAINST HEPATITIS C VIRUS (HCV) AND USES THEREOF <130> MJI-005PC <140> Concurrently Herewith <141> Concurrently Herewith <150> 60/902,432 <151> 2007-02-21 <160> 92 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Glu Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ile Ser Leu Val Arg Asp Ala Phe Ile Tyr Phe Asp Phe 100 105 110 Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> 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tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcct 300 acgaattacc atggttcggg gagttattat atctactttg actactgggg ccagggaacc 360 ctggtcaccg tctcctca 378 <210> 30 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 30 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcac cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact gggtcacctt cggccaaggg 300 acacgactgg agatcaaa 318 <210> 31 <211> 1785 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 31 cgctatagaa gcttgccgcc accatggcca ccggcaacct gcccggctgc tccttctcca 60 tcttcctgct ggccctgctg tcctgcctga ccgtgcccgc ctccgcctac caggtgcgca 120 actcctccgg cctgtaccac gtgaccaacg actgccctaa ctcctccatc gtgtacgagg 180 ccgccgacgc catcctgcac actcctggct gcgtgccctg cgtgcgcgag ggcaacgcct 240 cccgctgctg ggtggccgtg actcctaccg tggccacccg cgacggcaag ctgcccacca 300 cccagctgcg ccgccacatc gacctgctgg tgggctccgc caccctgtgc tccgccctgt 360 acgtgggcga cctgtgcggc tccgtgttcc tggtgggcca gctgttcacc ttctctcctc 420 gccgccactg gaccacccag gactgcaact gctccatcta ccctggccac atcaccggcc 480 accgcatggc ctgggacatg atgatgaact ggtctcccac cgccgccctg gtggtggccc 540 agctgctgcg catccctcag gccatcatgg acatgatcgc cggcgcccac tggggcgtcc 600 tggccggcat cgcctacttc tccatggtgg gcaactgggc caaggtgctg gtggtgctgc 660 tgctgttcgc cggcgtggac gccgagaccc acgtgacggg cggctccgcc ggccgcacca 720 ccgccggcct ggtgggcctg ctgacacccg gcgccaagca gaacatccag ctgatcaaca 780 ccaacggctc ctggcacatc aactccaccg ccctgaactg caacgagtcc ctgaacaccg 840 gctggctggc cggcctgttc taccagcaca agttcaactc ctccggctgt cccgagcgcc 900 tggcctcctg ccgccgcctg accgacttcg cccagggctg gggccctatc tcctacgcca 960 acggctccgg cctggacgag cggccctact gctggcacta ccctcctcgc ccttgcggca 1020 tcgtgcccgc caagtccgtg tgcggccctg tgtactgctt cactccctct cccgtggtgg 1080 tgggcaccac cgaccgctcc ggcgctccca cctactcctg gggcgccaac gacaccgacg 1140 tgttcgtgct gaacaacacc cgccctcctc tgggcaactg gttcggctgc acctggatga 1200 actccaccgg cttcaccaag gtgtgcggcg cgcctccctg cgtgatcggc ggcgtgggca 1260 acaacaccct gctgtgccct accgactgct tccgcaagca tcccgaggcc acctactccc 1320 gctgcggctc cgggccctgg atcactcctc gctgcatggt ggactatccc taccgcctgt 1380 ggcactatcc ctgcaccatc aactacacca tcttcaaggt gcgcatgtac gtgggcggcg 1440 tggagcaccg cctggaggcg gcgtgcaact ggacccgcgg cgagcgctgc gacctggagg 1500 accgcgaccg ctccgagctg tctcctctgc tgctgtccac cacccagtgg caggtgctgc 1560 cctgctcctt caccaccctg cccgcgctgt ccaccggcct gatccacctg caccagaaca 1620 tcgtggacgt gcagtacctg tacggcgtgg gctcctccat cgcgtcctgg gcgatcaagt 1680 gggagtacgt ggtgctgctg ttcctgctgc tggcggacgc gcgcgtgtgc tcctgcctgt 1740 ggatgatgct gctgatctcc caggcggagg cgtctagagg agtca 1785 <210> 32 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ile Phe Thr Met Val Arg Gly Val Phe Ile Tyr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 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construct <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Glu Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asn Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ile Phe Thr Met Val Arg Gly Val Phe Ile Tyr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp 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<211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 48 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt catcctcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaaataa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagacatc 300 tttactatgg ttcggggagt ttttatctac tttgactact ggggccaggg aaccctggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 49 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 49 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttggc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta 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agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggcttg atggaagtaa cacatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatt tctagagaca attccaagaa cacgctgttt 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagacatc 300 tttactgtgg ctcggggagt tattatctac tttgactact ggggccaggg aaccctggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 58 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 58 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact gggtcacctt cggccaaggg 300 acacgactgg agatcaaa 318 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 59 Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 60 Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 61 Gln Leu Val Asn Ser Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 62 Gln Leu Ile Asn Ser Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 63 His Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 64 Gln Leu Ile Lys Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 65 Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Val Asn 1 5 10 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 66 Gln Phe Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 67 Gln Leu Ile Lys Asn Gly Ser Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 68 Gln Leu Val Lys Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 69 His Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 70 His Leu Val Asn Ser Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 71 Gln Leu Ile His Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 72 Gln Leu Val Lys Thr Glu Gly Asn Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 73 Asn Leu Ile Lys Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 74 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 74 Gln Leu Ile Tyr Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 75 Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Leu Asn 1 5 10 <210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 76 Tyr Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 77 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 77 Ser Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 78 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 78 Asn Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 79 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 79 His Leu Val Asn Ser Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 80 Gln Leu Val Asn Ser Ser Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 81 Gln Leu Ile Asn Ser Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 82 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 82 Gln Leu Ile Gln Asn Gly Ser Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 83 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 83 Gln Phe Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 84 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 84 Gln Leu Ile Lys Asn Gly Ser Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 85 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 85 Gln Leu Ile Lys Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 1 5 10 <210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 86 Gln Leu Ile Asn Ser Asn Gly Ser Trp His Val Asn 1 5 10 <210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> variable small, polar amino acid <400> 87 Xaa Tyr Gly Met His 1 5 <210> 88 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> variable small, polar amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> variable hydrophobic amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> variable positively charged polar amino acid <400> 88 Val Ile Trp Xaa Asp Xaa Xaa Asn Xaa Tyr Tyr Ala Asp Ser Xaa Xaa 1 5 10 15 Gly <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Phe or not present <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> variable hydrophobic amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> variable small amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> variable hydrophobic amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> variable aromatic amino acid <400> 89 Ala Arg Asp Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Ile Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Xaa <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> variable amino acid <400> 90 Arg Ala Ser Gln Ser Val Xaa Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 92 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> variable small, hydrophobic amino acid <400> 92 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Xaa Thr 1 5

Claims (66)

  1. (a) 서열 번호 1 및 2를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역; 또는
    (b) 서열 번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 번호 18을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 서열 번호 8을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 번호 17을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 서열 번호 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1 및 서열 번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1
    을 포함하는, 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 전체 길이 항체인 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    - Fc 도메인을 포함하거나;
    - 단일쇄 항체이거나;
    - Fab 단편인 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체의 항원 결합 부분을 포함하며, 상기 항원 결합 부분은 (a) 서열번호 1 및 2; 또는 (b) 서열번호 7 내지 9 및 16 내지 18을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  5. HCV에 결합하는 항체의 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산으로서, 서열 번호 25 및 서열 번호 26을 포함하는 단리된 핵산.
  6. 제5항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 1종 이상의 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이것의 항원 결합 부분 및 HCV 매개 질환의 치료에 사용하는 것에 관한 설명서를 포함하는 키트.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체의 HCV 감염의 치료 방법에 사용하기 위한 것인 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
  9. 제8항에 있어서,
    (a) 피험체가 인간이거나;
    (b) 항체 또는 이것의 항원 결합 부분이 정맥내, 근육내, 또는 피하 투여하기 위한 것인 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
  10. 제8항에 있어서, 상기 방법은 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을
    (i) 제2 항체 또는 이것의 항원 결합 부분;
    (ii) 항바이러스제; 또는
    (iii) HCV 백신
    으로부터 선택되는 제2 치료제와 함께 투여하는 것을 포함하는 것인 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
  11. 포유동물에서의 HCV 매개 질병 또는 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 약학적으로 허용되는 담체 중에 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, HCV에 결합하는 제2 항체를 더 포함하는 조성물.
  13. 포유동물로부터 얻은 체액을 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 항원 결합 부분과 접촉시키는 단계 및 결합이 발생하는지를 확인하는 단계를 포함하는 HCV 감염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  14. 제5항의 핵산을 포함하는 숙주 세포
  15. 제10항에 있어서, 상기 HCV 백신은 HCV E2 단백질 또는 이것의 단편인 항체 또는 이것의 항원 결합 부분.
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