KR20210126558A - B형 간염 바이러스를 중화하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

B형 간염 바이러스를 중화하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 B형 간염 표면 항원 (HBsAg)의 항원 루프 영역에 결합할 수 있고, B형 간염 바이러스 (HBV)와 델타 간염 바이러스 (HDV) 모두의 감염을 중화할 수 있는, 항체 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체 및 항원 결합 단편이 결합하는 에피토프 뿐만 아니라 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 이러한 항체 및 항체 단편을 코딩하는 핵산 및 이러한 항체 및 항체 단편을 생산하는 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 B형 및 D형 간염의 진단, 예방 및 치료에 있어서의 본 발명의 항체 및 항체 단편의 용도에 관한 것이다.

Description

B형 간염 바이러스를 중화하는 항체 및 이의 용도
서열 목록에 관한 설명
본 출원과 관련된 서열 목록을 서면 사본이 아닌 텍스트 형식으로 제공하며, 이는 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 이름은 930485_402WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 이 텍스트 파일은 109KB로, 2019년 12월 16일에 생성되었으며 EFS-Web을 통해 전자문서로 제출되었다.
본 발명은 B형 간염 바이러스 (HBV) 및 델타 간염 바이러스 (HDV)에 대한 면역요법 및 그의 용도 분야에 관한 것이다. 본원에 기술된 항 B형 간염 결합 단백질, 예컨대 항체 및 이의 항원 결합 단편은 HBV 외피 단백질 (HBsAg)의 S 도메인의 항원 루프 영역에 자리한 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항 B형 간염 결합 단백질은 공지된 임의의 또는 모든 HBsAg 유전자형들 뿐만 아니라 HBsAg 변이체들에도 결합할 수 있고, HBV 감염을 중화시킬 수 있다. 이러한 결합 단백질을 코딩하는 핵산 및 이러한 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포도 본원에 제공된다. 또한, 본 발명은 질병의 진단, 예방 및 치료에서 뿐만 아니라 스크리닝 방법에 있어서의 본원에 기술된 항체 및 항체 단편의 사용 방법을 제공한다.
배경기술에 관하여 말하자면, HBV는 (i) 3개의 관련 표면 단백질 (B형 간염 표면 항원, HBsAg) 및 지질을 함유하는 외피 및 (ii) 바이러스 DNA 게놈 및 DNA 폴리머라제를 둘러싸고 있는 정20면체형 뉴클레오캡시드로 이루어진다. 상기 HBV 캡시드는 RNA의 게놈 전단계(pregenome) 복제 복합체의 패키징 도중에 감염된 세포의 세포질에서 형성되어, 입자의 루멘에서 프리게놈의 역전사에 의해 바이러스 DNA 게놈을 합성하는 동안 발아(bud)하는 능력을 얻게 된다. 상기 3개의 HBV 외피 단백질인 S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg는 소포체에서 복잡한 막관통 폴딩을 만들어, 이황화 결합된 동종- 및 이종이량체를 형성한다. 세포내 막에서 발아하는 동안, 세포질 preS 영역 내 짧은 선형 도메인은 캡시드 표면 상의 결합 부위들과 상호작용한다. 그 후, 비리온(virion)은 혈액 중으로 분비된다. 또한, 표면 단백질은 캡시드의 부재 하에서도 발아할 수 있어, 비리온에 비해 3-4 로그로 초과하여 분비되기도 하는 준바이러스 입자 (subviral particle, SVP)를 형성할 수 있다. 높은 수준의 HBsAg는 HBsAg 특이적 T 세포 반응을 고갈시킬 수 있어, 만성 B형 간염 (CHB) 환자에서 바이러스 면역내성의 중요한 인자로서 제안된다 (Chisari FV, Isogawa M, Wieland SF, Pathologie Biologie, 2010;58:258-66).
B형 간염 바이러스는 잠재적으로 생명을 위협하는 급성 및 만성 간 감염을 일으킨다. 급성 B형 간염은 증상을 동반하거나 동반하지 않는 전격성 간염(fulminant hepatitis) 발생의 위험이 있는 바이러스혈증을 특징으로 한다 (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure. Hepatology. 2015 Aug 3. doi: 10.1002/hep.28025. [정식발행 전 온라인발행]). 1982년 이래 B형 간염에 대해 효과적인 백신을 이용할 수 있음에도 불구하고, WHO 보고에 따르면 2억 4천만명의 사람들이 만성 B형 간염에 감염되어 있으며, 매년 78만명이 넘는 사람들이 B형 간염 합병증으로 사망한다. 만성 B형 간염 (CHB) 환자들 중 약 3분의 1이 간경화, 간부전 및 간세포 암종을 나타내어, 매년 60만명이 사망한다 (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure. Hepatology. 2015 Aug 3. doi: 10.1002/hep.28025. [정식발행 전 온라인발행]).
HBV에 감염된 환자들의 경우, HDV의 동시감염 또는 중복감염의 결과로서 심각한 합병증이 발생할 수 있다. WHO에 따르면, D형 간염은 전세계적으로 약 천오백만명의 사람들을 감염시킨다. HDV는 오직 HBV의 존재 하에서만 증식할 수 있기 때문에 준바이러스 위성체로 여겨진다. HDV는 공지된 것들 중 가장 작은 동물 바이러스의 하나로, 그 게놈은 고작 1.6 kb이며, S 및 L HDAg를 코딩한다. HDV의 게놈 복제를 위해 필요한, RNA 폴리머라제를 포함하는 기타 모든 단백질들은 숙주 세포에 의해 제공되며, HDV 외피는 HBV에 의해 제공된다. 허용 세포로 도입되는 경우, HDV RNA 게놈은 복제하여 HDV 코딩된 단백질의 다수의 복사체와 결합되어 리보핵산단백질 (RNP) 복합체를 조립한다. RNP는 HBV 외피 단백질에 의해 세포로부터 전파되며, 이로써 분비되기 전에 골지 전단계(pre-Golgi) 구획의 루멘으로 발아하는 지질단백질 소포들을 조립할 수 있다. 게다가, HBV 외피 단백질은 감염되지 않은 세포에 대한 HDV의 표적화 기전도 제공함으로써 HDV의 확산을 담보하게 된다.
HDV로 유발되는 합병증으로는, 급성 감염에서 간부전을 경험할 가능성 증가 및 신속한 간경화증으로의 진행과 함께, 만성 감염에서 간암이 발생할 확률 증가를 포함한다. D형 간염은 B형 간염 바이러스와 함께, 모든 간염 감염들 중 가장 높은 20%의 사망률을 갖는다. (Fattovich G, Giustina G, Christensen E, Pantalena M, Zagni I, Realdi G, Schalm SW. Influence of hepatitis delta virus infection on morbidity and mortality in compensated cirrhosis type B. Gut. 2000 Mar;46(3):420-6). 만성 HDV 감염에만 승인된 요법은 인터페론-알파이다. 하지만, 인터페론-알파를 사용한 HDV의 치료는 비교적 비효율적이고 내약성이 좋지 않다. 인터페론-알파를 이용한 치료는 해당 환자들 중 4분의 1에서 치료 후 6개월째에 지속된 바이러스 반응을 초래한다. 또한, 뉴클레오시(티)드 유사체 (NA)는 델타 간염에서는 널리 시험되어 왔었으나, 이들은 효과가 없는 것으로 나타났다. NA와 인터페론을 사용한 조합 치료도 기대에 미치지 못한 것으로 밝혀졌다 (Zaigham Abbas, Minaam Abbas Management of hepatitis delta: Need for novel therapeutic Options. World J Gastroenterol 2015 August 28; 21(32): 9461-9465). 따라서, 새로운 치료 옵션이 필요한 실정이다.
본원에 제공된 도면들은 본 발명에 포함된 특허대상을 보다 상세하게 예시하기 위한 것이다. 도면들은 어떠한 식으로든 본 발명을 한정하려는 것이 아니다.
도 1은 직접 항원 기반 ELISA 분석에서 측정한, HBC34-V7 및 본 발명의 유전자 조작된 2개의 항체 ("HBC34-V34"; "HBC34-V35")의 나타낸 농도에서 HBsAg adw (상단 패널) 및 HBsAg adr (하단 패널)에 대한 결합을 나타낸다. 모든 항체들은 IgG1 (g1m17, 1 동종형)로 제조되었다.
도 2a-2k는 모든 공지된 HBsAg 유전자형 (각각 (a)-(j)) 및 가상 대조군 (k)에 대한 HBC34-V7, HBC34-V34 및 HBC34-V35의 결합을 나타낸 것이다. PCT 공보 WO 2017/060504호의 실시예 5에 나타낸 바와 같이, HBsAg 항원성 외부 루프를 나타내는 유전자형 대표 서열을 사용하였다. 염색은 FACS에 의해 수행하였다. 항체 농도는 그래프의 x축에 표시된 바와 같았다.
도 3a-3v는 HBsAg에 대한 특정 HBC 항체의 시험관내 결합 (3a-3r) 및 중화 (3s-3v)를 나타낸 것이다. 도 3a 및 3b는 직접 항원 기반 ELISA 분석에서 야생형 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 HBC34-V7 및 HBC34-V35의 HBsAg adw에 대한 결합을 나타낸 것이다 (2개의 실험; "실험 1"의 데이터는 도 3a에 나타내었고, "실험 2"의 데이터는 도 3b에 나타냄). 항원 결합 곡선은 각 도면의 상단 패널에 나타내었다. EC50 값 [그래프패드 프리즘(Graphpad prism)을 사용해 곡선을 피팅하여 측정함]은 각 도면의 중간 패널에 나타내었다. 코팅되지 않은 플레이트 (대조군)에 대한 결합은 각 도면의 하단 패널에 나타내었다. Fc 영역: "HBC34v7" 및 "HBC34-V35" = 야생형 Fc; "HBC34-V35-MLNS" = M428L/N434S가 있는 Fc. "HBC34-V35-MLNS-GAALIE" = M428L/N434S/G236A/A330L/I332E가 있는 Fc. 3개의 HBC34-V35 로트를 시험하였다. 2개의 HBC34-V35-MLNS 로트와 2개의 HBC34-v35-MLNS-GAALIE 로트를 시험하였다. 1개의 HBC34-V7 로트를 사용하였다. 도 3c-3h는 공지된 10개의 모든 HBV 유전자형 또는 가상 대조군의 HBsAg를 발현하는 Expi293 세포에 대한 HBC34-V35, HBC34-V35-MLNS, 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE의 결합을 나타낸 것이다. 결합은 유세포분석법에 의해 측정되었다. 데이터는 가상 형질감염된 세포로 얻은 신호를 배제하는 것으로 정의된 형질감염된 모집단의 평균 형광 강도(y-축)로 나타낸다. 각 HBsAg에 대해, 3가지 시험 제품의 단계 희석액을 시험하였다 (12점, 1/3, 10 ㎍/ml에서 시작). 도 3i-3r은 19개(19)의 HBsAg 변이체 또는 가상 대조군의 HBsAg를 발현하는 Expi293 세포에 대한 HBC34-V35, HBC34-V35-MLNS 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE의 결합을 나타낸 것이다. 결합은 유세포분석법에 의해 측정되었다. 데이터는 가상 형질감염된 세포로 얻은 신호를 배제하는 것으로 정의된 형질감염된 모집단의 평균 형광 강도로 나타낸다. 각 HBsAg에 대해, 3가지 시험 제품의 단계 희석액을 시험하였다 (12점, 1/3, 10 ㎍/ml에서 시작). 항체 농도는 x-축에 나타난 바와 같았다. 도 3s 및 3u는 NTCP를 발현하는 HBVD 감염된 HepG2 세포의 세포 배양 상청액 중 HBsAg (상단) 및 HbeAg (하단)의 수준을 측정하여 평가된 HBV 유전자형 D에 대해 표시된 HBC 항체들의 중화 능력을 나타낸 것이다. 데이터는 2개의 독립적인 실험 중 한 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 도 3t 및 3v는 EC50 값을 보여주고 있다. EC50 값의 기하 평균과 범위(괄호 안)는 두 독립적인 실험에서 결정되었다.
도 4는 HDV 가성형태화(pseudotyping) 시스템을 사용하여 HBC34-V35-MLNS-GAALIE에 의한 각 HBV 유전자형의 중화도(EC50 값)를 나타낸 것이다.
도 5-8은 HBV 감염의 생체내 마우스 모델에서 혈청 HBAg 수준에 대한 HBC34-V35의 효과를 나타낸 것이다. HBV 유전자형 C에 감염된 SCID 마우스에 1차 인간 간세포를 이식하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 1, 5 또는 15 mg/kg의 HBC34-V35 또는 PBS (대조군)를 투여하였다. 도 5는 치료 전후의 혈청 HBV DNA 농도를 나타낸 것이다. 도 6은 치료 전후의 혈청 HBsAg 농도를 나타낸 것이다. 도 7은 치료 전후의 혈청 HBeAg 농도를 나타낸 것이다. 도 8은 치료 전후의 혈청 HBcrAg 농도를 나타낸 것이다. "Tmt" = 치료.
도 9a-9f는 인간 FcR에 대한 HBC34-V35-MLNS 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE의 결합을 나타낸 것이다. (A)-(E) 생물층 간섭굴절측정법(BLI)에 의해 평가된 FcγR에 대한 결합. His 태깅된 인간 FcγR [(A) FcγRIIa 대립유전자 H131; (B) FcγRIIa 대립유전자 R131; (C) FcγRIIIa 대립유전자 F158; (D) FcγRIIIa 대립유전자 V158; (E) FcγRIIb]을 2 ㎍/ml로 항-펜타-His 센서 상에 6분간 포획하였다. 그런 다음, FcγR이 로딩된 센서를, (Fab 단편을 통해 인간 mAb를 가교하는데에) 특이적인 F(ab')₂단편인 1 ㎍/ml의 affiniPure F(ab')₂단편 염소 항-인간 IgG의 존재 하에 각각 2 ㎍/ml의 mAb를 함유하는 동역학 완충액 (pH 7.1)에 5분간 노출시킨 후 (플롯의 왼쪽 부분), 추가로 4분간 동일한 완충액에서 해리 단계를 수행하였다 (플롯의 오른쪽 부분). 결합 및 해리 프로파일은 Octet® RED96 (ForteBio)을 사용하여 간섭 패턴의 변화로서 실시간으로 측정하였다. (F) BLI (생물층 간섭굴절측정법)를 사용하여 측정한, 다양한 pH에서 FcRn에 대한 HBC34 항체의 시험관내 결합. 시점 0초는 기준선 버퍼에서부터 항체를 함유하는 버퍼로 전환되는 시점을 나타낸다. 시점 300초 (수직 점선)는 해당 pH에서 공버퍼로 전환되는 시점을 나타낸다. 곡선은 간섭 패턴의 변화에 대한 결합 및 해리 프로파일을 나타낸다.
도 10은 Octet®로 측정된 HBC34-V35-MLNS 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE의 인간 C1q에 대한 결합을 나타낸 것이다. 항-인간 Fab (CH1) 센서를 사용하여, Fab 단편을 통해, HBC34v35-MLNS 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE mAb의 전장 IgG1을 10 ㎍/ml로 10분간 포획하였다. 이후, IgG가 로딩된 센서를, 3 ㎍/ml의 정제된 인간 C1q를 포함하는 동역학 완충액 (pH 7.1)에 4분간 노출시킨 다음 (플롯의 왼쪽 부분), 동일한 완충액에서 추가로 4분간 해리 단계를 수행하였다 (플롯의 오른쪽 부분). 결합 및 해리 프로파일은 Octet® RED96 (ForteBio)을 사용하여 간섭 패턴의 변화로서 실시간으로 측정하였다.
도 11a 및 11b는 유전자 조작된 주르캇 (Jurkat) 세포에서 NFAT 매개된 루시페라제 리포터의 수용체 결합 활성화를 이용한 인간 FcγRIIIa의 시험관내 활성화를 나타낸 것이다. FcγRIIIa 활성화는 재조합 HBsAg (Engerix B)가 표적 항원으로 사용되는 검증된 시판용 바이오리포터 분석을 사용하여 시험하였다. HBC34-V35-MLNS와 HBC34-V35-MLNS-GAALIE 및 대조군(Ctr) mAb의 단계 희석액을 37℃에서 25분간 0.2 ㎍/ml의 HBsAg와 함께 항온배양하였다. FcγRIIIa 저친화성 대립유전자 F158(A) 또는 FcγRIIIa 고친화성 대립유전자 V158(B)을 발현하는 주르캇 효과기 세포(Promega)를 분석 완충액에 재현탁시킨 후 분석 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 24시간 동안 항온배양한 후, Bio-Glo-TM 루시퍼라제 분석 시약(Promega)를 첨가하고, 광도계(Bio-Tek)를 이용하여 발광도를 정량하였다.
도 12a 및 12b는 유전자 조작된 주르캇 세포에서 NFAT 매개된 루시페라제 리포터의 수용체 결합 활성화를 이용한 인간 FcγRIIIa의 시험관내 활성화를 나타낸 것이다. 인간 FcγRIIa의 활성화는 재조합 HBsAg (Engerix B)가 표적 항원으로 사용되었던 검증된 시판용 바이오리포터 분석을 사용하여 측정하였다. HBC34v35-MLNS와 HBC34-V35-MLNS-GAALIE 및 대조군 mAb(Ctr)의 단계 희석액을 2 ㎍/ml(A) 또는 0.2 ㎍/ml(B)의 HBsAg와 함께 37℃에서 25분간 배양하였다. FcγRIIa 고친화성 대립유전자 H131을 발현하는 주르캇 효과기 세포(Promega)를 분석 완충액에 재현탁시킨 후 분석 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 23시간 동안 항온배양한 후, Bio-Glo-TM 루시퍼라제 분석 시약(Promega)를 첨가하고, 광도계(Bio-Tek)를 이용하여 발광도를 정량하였다.
도 13a 및 13b는 유전자 조작된 주르캇 세포에서 NFAT 매개된 루시페라제 리포터의 수용체 결합 활성화를 이용한 인간 FcγRIIb의 시험관내 활성화를 나타낸 것이다. 인간 FcγRIIb의 활성화는 재조합 HBsAg (Engerix B)가 표적 항원으로 사용되었던 검증된 시판용 바이오리포터 분석을 사용하여 시험하였다. HBC34-V35-MLNS와 HBC34-V35-MLNS-GAALIE 및 대조군(Ctr) mAb의 단계 희석액을 37℃에서 15분간 1 ㎍/ml의 HBsAg와 함께 항온배양하였다. FcγRIIb를 발현하는 주르캇 효과기 세포(Promega)를 분석 완충액에 재현탁시킨 후 분석 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 20시간 동안 항온배양한 후, Bio-Glo-TM 루시퍼라제 분석 시약(Promega)를 첨가하고, 광도계(Bio-Tek)를 이용하여 발광도를 정량하였다. 도 13b에서, 도 13a의 대조군 mAb를 "Ctr mAb1"로 명명하였다. "Ctr mAb2"로 명명된 제2 대조군 mAb는, FcγRIIb에 대한 결합을 향상시키는 하기의 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc를 포함하는 HBC34-V35의 한 형태이다: G237D/P238D/H268D/P271G/A330R (Mimoto et al., Prot Eng Des Sel. 26(10):589- 598 (2013)).
도 14a 및 14b는 HBC34-V35-MLNS 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE의 존재 하에 인간 1차 NK 세포에 의한 PLC/PRF/5 인간 간암 세포의 시험관내 사멸을 나타낸 것이다. (A) ADCC는 이형 접합성 고친화성 (V158) 및 저친화성 (F158) FcγRIIIa (F/V)를 발현하기 위해 이전에 유전자형이 분석된 한 기증자로부터 갓 분리된 NK 세포를 사용하여 시험하였다. HBC34-V35, HBC34-V35-MLNS, HBC34-V35-MLNS-GAALIE, 항-HBV mAb 17.1.41 및 대조군 mAb의 단계 희석액을 HBsAg 분비성 간암 세포주인 PLC/PRF/5 (알렉산더 세포라고도 함)에 첨가하였다. PLC/PRF/5 세포를 항체와 함께 실온에서 10분간 항온배양하였다. NK 세포를 분석 플레이트 (효과기 세포 대 표적 세포의 비율 10:1)에 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 항온배양하였다. 젖산 탈수소효소(LDH) 방출을 측정하여 세포 사멸을 판단하였다. (B) 유세포분석법에 의해 평가한 HBC34-V35 및 17.1.41 mAb에 의한 PLC/PRF/5 인간 간암 세포의 염색. 다양한 농도의 HBC34-V35 및 17.1.41 mAb로 염색하기 전에 세포를 광범위하게 세척하고, 포름알데히드(4%)로 고정시키거나, 또는 고정 및 투과(사포닌 0.5%)시켰다. 이러한 인간 (HBC34-V35의 경우, 유전자 조작된 인간) mAb의 결합은 Fcγ 단편 특이적 항체인 Alexa Fluor® 647 AffiniPure F(ab')₂단편 염소 항-인간 IgG를 사용하여 유세포분석법으로 측정하였다.
도 15a 및 15b는 HBC34-V35-MLNS와 HBC34-V35-MLNS-GAALIE 및 HBsAg의 존재 하에 1차 인간 NK 세포의 시험관내 활성화를 나타낸 것이다. NK 세포의 활성화는 (A) 동형 접합성의 고친화성 (V158) 및 (B) 저친화성 (F158) FcγRIIIa를 발현하기 위해 이전에 유전자형이 분석된 두 기증자로부터 갓 분리한 세포를 사용하여 시험하였다. HBC34-V35, HBC34-V35-MLNS-GAALIE 및 HBC34v35-LALA mAb의 단계 희석액을 NK 세포와 함께 4시간 동안 항온배양하였다. NK 세포의 활성화는, NK 세포 활성의 확인을 위한 기능적 마커로서, NK 세포를 항-CD107a mAb로 염색하여 유세포분석법으로 측정하였다. LAMP-1이라고도 알려진 CD107a는 NK 세포의 탈과립화에 대한 마커이다.
도 16은 HBC34-V35-MLNS-GAALIE와 폴리머라제/역전사효소 억제제 엔테카비르(ETV) 간의 시험관내 약물 상호작용 연구의 결과를 나타낸 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 당업계의 숙련가가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다.
본 발명 전반에서, 문맥상 달리 해석해야 할 경우가 아니라면, "포함하다"라는 용어와 "포함하고" 및 "포함하는"과 같은 이의 변형태는, 예를 들어 "갖는", "갖고", "함유하는", "~를 함유한다" 등과 동의어로 사용되며, 언급된 구성요소, 비율, 정수 (적절한 경우에는 이의 분수, 예컨대 정수의 1/10 및 1/100), 농도 또는 단계도 포함하는 것으로 이해되나, 명시되지 않은 다른 구성요소, 비율, 정수, 농도 또는 단계를 배제하는 것은 아니다. 달리 명시하지 않는 한, 임의의 농도 범위, 비율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 인용된 해당 범위 내의 임의의 정수값 및, 적절한 경우에는 이의 분수(예컨대, 정수의 1/10 및 1/100)도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 임의의 물리적 특징, 예컨대 중합체 서브유닛, 크기 또는 두께와 관련하여 본원에 언급된 임의의 수 범위는, 달리 명시하지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. "~로 이루어진"이라는 용어는 "~를 포함하다"라는 용어의 한 실시형태를 지칭하는 것으로, 이 경우에는 언급하지 않은 임의의 다른 구성요소, 정수 또는 단계들은 배제된다. 본 발명의 내용에서, "~를 포함하다"라는 용어는 "~로 이루어진"이라는 용어를 포함한다. "~로 필수적으로 이루어지는" 이라는 용어는 "~를 포함하는"과 같지 않으며, 청구항에 특정된 물질 또는 단계나, 또는 청구된 특허대상의 기본적인 특성들에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 지칭한다.
또한, 본원에 기재된 구조 및 치환기들의 다양한 조합으로부터 유도된 각 화합물 또는 화합물들의 그룹은 각 화합물 또는 화합물들의 그룹이 개별적으로 기술되어 있는 것과 동일한 정도로 본 출원에 의해 개시되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 특정 구조 또는 특정 치환체들에 대한 선택도 본 발명의 범위 내이다.
본 발명을 설명하는 내용 (청구범위의 내용 포함)에서 사용되는 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")의 용어 및 이와 유사한 언급대상은, 본원에서 달리 명시하지 않거나 문맥에서 명백히 모순되지 한, 단수와 복수를 모두 포괄하는 것으로 해석한다. 대안 (예컨대, "또는")의 사용은 대안들 중의 하나 또는 양자 모두 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 수치 범위를 언급한 것은, 해당 범위에 속하는 각 개별 수치들을 개별적으로 언급하는 것에 대한 편법을 제공하고자 한 것이다. 본원에서 달리 언급하지 않는 한, 각 개별 수치들은 이들이 본원에 개별적으로 언급되는 것처럼 본 명세서 내에 포함된다. 본 명세서에서 어떠한 표현도 임의의 청구되지 않은 구성요소가 본원에 개시된 특허대상의 실시에 필수적인 것으로 이해되어서는 안된다.
"실질적으로"라는 말은 "완전히"를 배제하지는 않는 것으로, 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 특정 실시형태에서, "실질적으로"는 기준 조성물, 방법 또는 용도와 비교하였을 때의 본 발명의 조성물, 방법 또는 용도의 주어진 양, 효과 또는 활성을 가리키며, 기준 조성물, 방법 또는 용도의 양, 효과 또는 활성의 50% 이하의 양, 효과 또는 활성의 감소, 예컨대 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 이하의 감소를 나타낸다.
본원에 사용된 "약"이라는 용어는, 달리 명시하지 않는 한, 명시된 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다.
"임의의" 또는 "임의로"라는 말은, 뒤에 기술되는 구성요소, 성분, 사건이나 부대상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있고, 그 해당 기재가 상기 구성요소, 성분, 사건 또는 부대상황이 발생하는 경우와 그렇지 않는 경우를 모두 포함한다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "질환"이라는 용어는, 일반적으로 "장애" 및 (의학적 병태에서와 같은) "병태"와 동의어로서, 상기 용어들은 모두 정상적인 기능을 손상시키는 인간 또는 동물 신체 또는 그 일부들 중 하나의 비정상적인 상태를 반영한다는 점에서 서로 교환하여 사용하고자 하며, 통상적으로 특징적인 징후와 증상으로 나타나고, 질환에 걸린 인간 또는 동물의 수명을 감소시키거나 삶의 질을 저하시킨다.
본원에서, 대상체 또는 환자의 "치료"에 대한 언급은 예방, 방지, 약화, 개선 및 요법도 포함하고자 한다. 치료의 이점으로는 개선된 임상 결과; 질병과 관련된 증상의 완화 또는 경감; 증상의 발생 감소; 삶의 질 개선; 장시간의 무병 상태; 질병의 정도 감소; 질병 상태의 안정화; 질병 진행의 지연; 차도; 생존; 장기간의 생존; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. "대상체" 또는 "환자"라는 용어들은 인간을 비롯한 모든 포유동물을 의미하기 위해 본원에서 상호교환하여 사용한다. 대상체의 예로는 인간, 소, 개, 고양이, 말, 염소, 양, 돼지 및 토끼를 포함한다. 한 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
"아미노산"은 자연 발생적 아미노산 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 상기 자연 발생적 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생적 아미노산으로는, 유전자 코드에 의해 코딩되는 것들 뿐만 아니라 차후 변형되는 아미노산들, 예컨대 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린을 들 수 있다. 아미노산 유사체라고 하면 자연 발생적 아미노산과 동일한 기본적인 화학적 구조, 즉 수소, 카복실기, 아미노기 및 R 기에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 가리킨다. 이러한 유사체들은 변형된 R 기를 갖거나 (예컨대, 노르루신) 또는 변형된 펩타이드 백본을 가지지만, 자연 발생적 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조를 보유하고 있다. 아미노산 모방체라고 하면, 아미노산의 일반 화학 구조식과는 다르지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 구조를 갖는 화합물을 가리킨다.
본원에 사용된 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어들과 이러한 용어들의 변형태는, (정상 또는 변형된) 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 유전자 코드에 의해 정의된 20개의 아미노산 또는 아미노산 유사체 또는 모방체로부터 선택되는 복수개의 아미노산을 포함하거나 이들로 구성될 수 있으며, 이들은 각각 펩타이드 결합에 의해 적어도 하나의 다른 아미노산에 연결되어 있다. 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 L-아미노산 및/또는 D-아미노산 (또는 이의 유사체 또는 모방체)을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 또한, "펩타이드", "폴리펩타이드", "단백질"이라는 용어들은 펩타이드가 천연 모체 펩타이드의 생물학적 작용(들)을 모방하거나 길항할 수 있는 펩타이드가 아닌 구조 성분들을 함유하는 펩타이드 유사체로 정의되는 "펩타이드 모방체 (peptidomimetic)"도 포함한다. 특정 실시형태에서, 펩타이드 모방체는 효소적으로 절단가능한 펩타이드 결합과 같은 특성들이 결여되어 있다.
펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 이들 아미노산에 더하여 유전자 코드에 의해 정의된 20개 아미노산 이외의 아미노산들을 포함할 수 있거나, 또는 유전자 코드에 의해 정의된 20개 아미노산 이외의 아미노산들로 구성될 수도 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 내용에서 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 해독후 성숙 과정과 같은 자연적 과정에 의해, 또는 당업계에 공지되어 있으며 본원에 설명된 것들을 포함하는 화학적 과정 (예컨대, 합성 과정)에 의해 변형된 아미노산들을 포함할 수 있다. 이러한 변형들은 폴리펩타이드의 어느 곳에서나 나타날 수 있는데; 예를 들어, 펩타이드 골격에서; 아미노산 사슬에서; 또는 카르복시 말단 또는 아미노 말단 말단에서 나타날 수 있다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 유비퀴틴화 이후와 같이 분지될 수 있거나, 분지화를 동반하거나 동반하지 않은 고리형일 수도 있다. 또한, "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어들은 변형된 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질도 포함한다. 예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유결합 고정, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합 고정, 포스파티딜이노시톨의 공유결합 고정, 공유 또는 비공유 가교결합, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 페길화를 비롯한 글리코실화, 수산화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 가수분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 세네로일화, 황산화, 아미노산 부가, 예컨대 아르기닐화 또는 유비퀴틴화를 포함할 수 있다. 이러한 변형에 대해서는 문헌들에 설명된 바 있다 (문헌 [Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2nd Ed., T. E. Creighton, New York]; [Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York]; [Seifter et al. (1990) Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182: 626-646] 및 [Rattan et al., (1992) Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62] 참고). 따라서, "펩타이드", "폴리펩타이드", "단백질" 등의 용어들은 예를 들어 지질펩타이드, 지질단백질, 당펩타이드, 당단백질 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질, 펩타이드 및 폴리펩타이드의 변이체들도 고려된다. 특정 실시형태에서, 변이체 단백질, 펩타이드 및 폴리펩타이드는 본원에 기재된 바와 같이 정의되거나 또는 기준으로 삼은 아미노산 서열의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에 사용된 "(폴리)펩타이드" 및 "단백질"은 펩타이드 결합에 의해 연결된 복수개의 아미노산 단량체와 같은 아미노산 잔기들의 중합체와 관련하여 서로 교환해서 사용될 수 있다.
"핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 공유 결합된 뉴클레오타이드들을 포함하는 중합체 화합물을 가리키며, 이는 천연 서브유닛 (예: 퓨린 또는 피리미딘 염기) 또는 비천연 서브유닛 (예: 모르폴린 고리)로 구성될 수 있다. 퓨린 염기에는 아데닌, 구아닌, 하이폭산틴 및 크산틴이 포함되고, 피리미딘 염기에는 우라실, 티민 및 시토신이 포함된다. 핵산 단량체들은 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 결합의 유사형에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 결합의 유사형으로는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트 등을 포함한다.
핵산 분자에는 단일 또는 이중 가닥일 수 있는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 폴리리보핵산 (RNA), 폴리데옥시리보핵산 (DNA)이 포함된다. 핵산 분자가 단일 가닥인 경우, 코딩 가닥 또는 비코딩 (안티센스) 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 (올리고뉴클레오타이드 포함) 및 이의 단편은, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 시험관내 해독에 의해 생성되거나, 또는 결찰, 절단, 엔도뉴클레아제 작용 또는 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 생성될 수 있다.
아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자는 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열들을 포함한다. 뉴클레오타이드 서열의 일부 형태들은 인트론(들)이 공동전사 또는 전사후 기전을 통해 제거될 수 있는 정도로 해당 인트론(들)을 포함할 수도 있다. 서로 다른 뉴클레오타이드 서열들은 유전자 코드의 중복성 또는 축중성의 결과로서, 또는 스플라이싱에 의해, 또는 양자 모두의 결과로서 동일한 아미노산 서열을 코딩할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자의 변이체들도 고려된다. 변이체 핵산 분자들은, 본원에 기술한 바와 같이 정의되거나 기준으로 삼은 폴리뉴클레오타이드의 핵산 분자와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일하거나, 또는 약 65-68℃에서 0.015M의 염화나트륨, 0.0015M의 시트르산나트륨, 또는 약 42℃에서 0.015M의 염화나트륨, 0.0015M의 시트르산나트륨 및 50% 포름아미드의 엄중성 혼성화 조건 하에서 폴리뉴클레오타이드에 혼성화한다. 핵산 분자 변이체들은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 것과 같은 본원에 기재된 기능성을 갖는 융합 단백질 또는 그의 결합 도메인을 코딩하는 능력을 보유하고 있다.
본원에 사용된 "서열 변이체"라는 용어는 기준 서열과 비교하였을 때 하나 이상의 변형을 갖는 임의의 서열을 가리키는 것으로, 여기서 기준 서열은 임의의 공개된 서열 및/또는 "서열 및 서열 번호 표"에 열거한 서열, 즉 서열번호 1 내지 서열번호 139의 서열이다. 따라서, "서열 변이체"라는 용어는 뉴클레오타이드 서열 변이체 및 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열의 내용에서의 서열 변이체의 경우, 기준 서열도 뉴클레오타이드 서열인 한편, 아미노산 서열의 내용에서 서열 변이체에 대한 특정 실시형태에서, 기준 서열도 아미노산 서열이다. 본원에 사용된 "서열 변이체"는 기준 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일할 수 있다.
"서열 동일성 %"는 서열들을 비교하여 결정된, 2개 이상의 서열들 간의 관계를 가리킨다. 서열 동일성을 결정하는 방법은 비교되는 서열들 간에 최적의 정합을 제공하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 서열들을 최적의 비교를 위해 정렬할 수 있다 (예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭을 도입할 수 있음). 또한, 비상동성 서열은 비교 목적에서 무시될 수도 있다. 본원에서 언급한 서열 동일성 %는, 달리 명시하지 않는 한, 기준 서열의 길이에 대하여 계산된다. 서열 동일성과 유사성을 결정하는 방법은 공중이 이용가능한 컴퓨터 프로그램에서 찾아볼 수 있다. 서열 정렬 및 동일성 % 계산은 BLAST 프로그램 (예: BLAST 2.0, BLASTP, BLASTN 또는 BLASTX)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 프로그램에 사용된 수학적 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명의 내용 안에서는, 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용되는 경우, 분석 결과는 참조된 프로그램의 "디폴트 값"을 기준으로 하는 점에 대해서는 이해할 수 있을 것이다. "디폴트 값"이라고 하면, 처음 초기화할 때 소프트웨어에 본래 로딩되어 있는 값 또는 매개변수의 임의의 세트를 의미한다.
핵산 (뉴클레오타이드) 서열의 내용과 관련하여 "서열 변이체"는 기준 서열에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 결실 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 기준 뉴클레오타이드 서열의 서열에 삽입된 것인, 변경된 서열을 가진다. 뉴클레오타이드는 본원에서 표준 1문자 명칭 (A, C, G 또는 T)으로 언급한다. 유전자 코드의 중복성으로 인해, 뉴클레오타이드 서열의 "서열 변이체"는 각 기준 아미노산 서열에서의 변화, 즉 아미노산 "서열 변이체"를 초래할 수 있거나 그렇지 않을 수도 있다. 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열 변이체는 아미노산 서열 변이체 (예를 들어, 잠재성 (silent) 돌연변이)를 초래하지 않는다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 "비잠재성" 돌연변이를 초래하는 뉴클레오타이드 서열 변이체도 고려된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 변이체는 기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85 %, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 본원에 개시된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 기준 또는 야생형 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 코돈 최적화된 형태를 지칭하기도 한다. 본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Scholten et al., Clin. Immunol. 119:135-145 (2006)] 참조). 코돈 최적화는 공지된 기술들 및 GenScript® OptimumGeneTM 도구 또는 GeneArt 유전자 합성 도구 (써모 피셔 사이언티픽)와 같은 도구들을 사용하여 수행할 수 있다. 코돈 최적화된 서열들에는 부분적으로 코돈 최적화된 서열 (즉, 적어도 하나의 코돈이 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화됨) 및 완전히 코돈 최적화된 서열이 포함된다.
아미노산 서열과 관련하여 "서열 변이체"는 기준 아미노산 서열과 비교하였을 때 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 삽입되는 것인, 변형된 서열을 가진다. 변형의 결과로서, 이러한 서열 변이체는 기준 서열과 적어도 80%, 적어도 85 %, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 예를 들어, 기준 서열의 아미노산 100개당 10개 이하의 변형, 즉 결실, 삽입 또는 치환의 임의의 조합을 갖는 변이체 서열은 기준 서열과 "적어도 90% 동일"하다.
"보존적 치환"은 특정 단백질의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치거나 변형을 주지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 일반적으로, 보존적 치환은 치환된 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것을 말한다. 보존적 치환에는 하기의 군들 중 하나에서 발견되는 치환이 포함된다: 1군: 알라닌 (Ala 또는 A), 글리신 (Gly 또는 G), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T); 2군: 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 Z); 3군: 아스파라긴 (Asn 또는 N), 글루타민 (Gln 또는 Q); 4군: 아르기닌 (Arg 또는 R), 리신 (Lys 또는 K), 히스티딘 (His 또는 H); 5군: 이소루신 (Ile 또는 I), 루신 (Leu 또는 L), 메티오닌 (Met 또는 M), 발린 (Val 또는 V); 및 6군: 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 티로신 (Tyr 또는 Y), 트립토판 (Trp 또는 W). 추가로 또는 대안적으로, 아미노산들은 유사한 기능, 화학 구조 또는 조성 (예: 산성, 염기성, 지방족, 방향족 또는 황 함유)에 따라 보존적 치환군으로 분류할 수 있다. 예를 들어, 지방족 군은, 치환을 위해 Gly, Ala, Val, Leu 및 Ile를 포함할 수 있다. 다른 보존적 치환군에는 다음이 포함된다: 황 함유: Met 및 시스테인 (Cys 또는 C); 산성: Asp, Glu, Asn 및 Gln; 작은 지방족, 비극성 또는 약간의 극성 잔기들: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; 극성, 음으로 하전된 잔기들 및 이들의 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; 극성, 양으로 하전된 잔기들: His, Arg 및 Lys; 큰 지방족, 비극성 잔기들: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 큰 방향족 잔기들: Phe, Tyr 및 Trp. 추가의 정보에 대해서는 문헌 [Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company]에서 찾아볼 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드에 이르는 길이 범위의 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기들의 서열내 삽입도 포함할 수 있다. 말단 삽입의 예로는 리포터 분자 또는 효소에 대한 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
일반적으로, 서열 변이체에서의 변형은 각 기준 서열의 목적하는 기능을 제거하거나 현저하게 감소시키지는 않는다. 예를 들어, 본 발명의 변이체 서열은, 기준 서열을 갖는 (또는 기준 서열에 의해 코딩되는) 항체 또는 항원 결합 단편에 비해, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 HBV 및 HDV 감염을 충분히 중화시키기 위해, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 서열의 기능을 유의하게 감소시키거나 완전히 제거하지 않는 것이 바람직하다. 목적한 구조 또는 기능성을 제거하지 않으면서도, 각각 어떠한 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기들이 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 것에 관한 지침은, 예컨대 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 찾아볼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 지정된 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 "유래된" 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 원래의 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 가리키는 것이다. 특정 서열로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 그것이 유래된 서열 또는 그의 일부와 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 이로써 "본질적으로 동일한"은 상기 정의된 바와 같은 서열 변이체를 포함한다. 특정 펩타이드 또는 단백질로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 해당 특정 펩타이드 또는 단백질의 상응하는 도메인으로부터 유래될 수 있다. 이러한 맥락에서 "상응하는"이라는 말은 동일한 기능성 또는 관심대상 특성을 보유하고 있음을 가리킨다. 예를 들어, "세포외 도메인"은 (다른 단백질의) 또 다른 "세포외 도메인"에 상응하거나, 또는 "막횡단 도메인"은 (다른 단백질의) 또 다른 "막횡단 도메인"에 상응한다. 따라서, 펩타이드, 단백질 및 핵산의 "상응하는" 부분은 당업자라면 누구나 쉽게 식별할 수 있다. 이와 유사하게, 다른 (예컨대, "소스") 서열에서 "유래된" 서열은 당업자에 의해 해당 소스 서열에서 그 기원을 갖는 것으로 식별될 수 있다.
다른 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 (그것이 유래된) 출발 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 동일할 수 있다. 그러나, 다른 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은, (그것이 유래된) 출발 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 대해 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있는데, 특히 다른 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 (그것이 유래된) 출발 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 대하여 상술한 바와 같은 기능적 서열 변이체일 수도 있다. 예를 들어, 펩타이드/단백질에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있거나, 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 결실이 발생할 수도 있다.
본원에 사용된 "돌연변이"라는 용어는 기준 서열, 예컨대 상응하는 게놈, 야생형 또는 기준 서열과 비교하였을 때, 핵산 서열 및/또는 아미노산 서열에서의 변화에 관한 것이다. 예컨대, 기준 게놈 서열과 비교할 때의 돌연변이는, 예를 들어 (자연 발생) 체세포 돌연변이, 자발적 돌연변이, 유도 돌연변이, 예를 들어 효소, 화학 물질 또는 방사선에 의한 유도 돌연변이, 또는 부위 특이적 돌연변이 유발법 (핵산 서열 및/또는 아미노산 서열에서 특이적이고 의도적인 변화를 주는 분자 생물학적 방법)에 의해 얻은 돌연변이일 수 있다. 따라서, "돌연변이" 또는 "돌연변이 유발"이라는 용어들은, 예컨대 핵산 서열 또는 아미노산 서열에서, 물리적으로 돌연변이를 만들거나 유도하는 것도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 치환, 결실 및 삽입 뿐만 아니라, 여러 개의 연속된 뉴클레오타이드 또는 아미노산들의 역위도 포함한다. 아미노산 서열에서 돌연변이를 만들기 위해, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 도입하여 (재조합) 돌연변이된 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 돌연변이는, 예를 들어 상이한 아미노산을 코딩하거나, 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈을 제공하기 위해 하나의 아미노산을 코딩하는 핵산 분자의 코돈을 (예컨대, 그 안의 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드 염기를 변경하여) (예를 들어, 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해) 변경함으로써, 또는 서열 변이체를 합성함으로써 달성될 수 있다.
핵산 분자를 세포 내로 삽입하는 내용과 관련하여, "도입된"이라는 용어는 "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하고, 진핵 또는 원핵 세포 내로 핵산 분자를 도입하는 것에 대한 언급도 포함하는데, 여기서, 상기 핵산 분자는 세포의 게놈 (예: 염색체, 플라스미드, 색소체 또는 미토콘드리아 DNA)에 도입되거나, 자율 레플리콘으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현될 수도 있다(예: 형질감염된 mRNA).
본원에 사용된 "재조합"이라는 용어 (예: 재조합 항체, 재조합 단백질, 재조합 핵산 등)는 자연적으로 발생하지 않고, 재조합 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리되는 임의의 분자 (항체, 단백질, 핵산 등)를 지칭한다. "재조합"은 "유전자 조작된" 또는 "비천연"과 동의어로 사용될 수 있으며, 이는 적어도 하나의 유전적 변형을 포함하거나 외인성 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 유기체, 미생물, 세포, 핵산 분자 또는 벡터를 지칭할 수 있고, 이 경우 이러한 변경 또는 변형들은 유전 공학 (즉, 인간 개입)에 의해 도입된다. 유전적 변형에는, 예를 들어 단백질, 융합 단백질 또는 효소를 코딩하는 발현가능한 핵산 분자를 도입하는 변형, 또는 다른 핵산 분자의 부가, 결실, 치환, 또는 세포 유전 물질의 다른 기능 붕괴가 포함된다. 추가의 변형으로는, 예를 들어 해당 변형이 폴리뉴클레오타이드, 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비코딩 조절 영역을 포함한다.
본원에 사용된 "이종성" 또는 "비내인성" 또는 "외인성"이라는 말은, 숙주 세포 또는 대상체에 고유한 것이 아닌 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자 또는 활성, 또는 변형된 숙주 세포 또는 대상체에 고유한 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자 또는 활성을 지칭한다. 이종성, 비내인성 또는 외인성에는, 해당 구조, 활성 또는 양자 모두가 해당 유전자, 단백질, 화합물 또는 핵산 분자의 천연 및 변형태 간에 서로 다르도록 돌연변이시키거나 그게 아니면 변형시킨 유전자, 단백질, 화합물 또는 핵산 분자가 포함된다. 특정 실시형태에서, 이종성, 비내인성 또는 외인성인 유전자, 단백질, 또는 핵산 분자는 숙주 세포 또는 대상체에 대해서는 내인성이 아닐 수는 있으나, 대신에 이러한 유전자, 단백질 또는 핵산 분자를 코딩하는 핵산들을 접합, 형질전환, 형질감염, 전기천공 등에 의해 숙주 세포에 부가했을 수도 있고, 이 경우 상기 부가된 핵산 분자는 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있거나, 또는 염색체외 유전 물질로서 (예를 들어, 플라스미드 또는 다른 자기 복제 벡터로서) 존재할 수 있다. "상동성" 또는 "상동체"라는 용어는 숙주 세포, 종 또는 균주에서 발견되거나 유래된 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자 또는 활성을 가리킨다. 예를 들어, 폴리펩타이드를 코딩하는 이종성 또는 외인성 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자는 천연 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자에 상동성일 수 있고 상동성 폴리펩타이드 또는 활성을 코딩할 수 있지만, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 변경된 구조, 서열, 발현 수준 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 비내인성 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자 뿐만 아니라 코딩된 폴리펩타이드 또는 활성은 동일한 종, 상이한 종, 또는 이들의 조합으로부터 유래할 수 있다.
본원에 사용된 "내인성" 또는 "천연"이라는 용어는 숙주 세포 또는 대상체에 정상적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드, 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이라는 표현들은 서로 교환하여 사용할 수 있으며, 이러한 모든 명칭들은 후대 개체도 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 단어들은 1차 대상체 세포 및 형질전환의 횟수와는 상관없이 그로부터 유래된 배양물도 포함한다. 또한, 모든 후대 개체들은 고의적이거나 의도치 않은 돌연변이로 인해 DNA 함량이 정확히 동일하지 않을 수도 있음을 이해해야 할 것이다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일하거나 실질적으로 동일한 기능, 표현형 또는 생물학적 활성을 갖는 변이 후대 개체들이 포함된다. 별도의 명칭을 의도한 경우라면, 그 문맥상 명확해질 것이다.
본 발명은 부분적으로는, B형 간염 및 델타 간염 바이러스를 중화할 수 있는 항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 상세한 설명에 따른 항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질의 실시형태들은 HBV 및 HDV를 예방, 치료 또는 약화, 또는 진단하는 방법에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 항체, 항원 결합 단편, 및 융합 단백질은 B형 간염 바이러스 표면 항원의 2개 이상의 서로 다른 유전자형 및 B형 간염 바이러스 표면 항원의 2개 이상의 서로 다른 감염성 돌연변이에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질은 공지된 모든 B형 간염 바이러스 표면 항원의 유전자형 및 공지된 모든 B형 간염 바이러스 표면 항원의 감염성 돌연변이에 결합한다.
항체 및 항원 결합 단편
한 양태에서, 본 발명은 HBsAg의 항원 루프 영역에 결합할 수 있고, B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스에 의한 감염을 중화할 수 있는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본원에서, 문맥상 명백히 다르게 나타나 있지 않는 한, "항체"라고 하면, 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 온전한 항체 (경쇄가 결여된 중쇄 항체들도 "항체"라는 용어에 여전히 포함되는 것으로 이해한다) 뿐만 아니라, 상기 온전한 항체에 의해 인식되는 항원 표적 분자에 결합하는 능력을 가지거나 보유하는 온전한 항체의 임의의 항원 결합 부분 또는 단편, 예컨대 scFv, Fab 또는 F(ab')2 단편을 지칭한다. 따라서, 본원에서 "항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 온전한 항체를 포함하는 다클론 및 단일클론 항체, 및 이의 기능적 (항원 결합) 항체 단편, 예컨대 단편 항원 결합 (Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 단쇄 항체 단편, 예컨대 단쇄 가변 단편 (scFv), 및 단일 도메인 항체 (예: sdAb, sdFv, 나노항체) 단편을 포함한다. 상기 용어는 면역글로불린의 유전적으로 조작되고/조작되거나 그렇지 않으면 변형된 형태, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체 및 이종접합 항체, 다중특이적, 예컨대 이중특이적 항체, 이원항체, 삼원항체 및 사원항체, 탠덤 이중-scFv, 탠덤 삼중-scFv를 망라한다. 달리 언급하지 않는 한, "항체"라는 용어는 그의 기능적 항체 단편을 망라하는 것으로 이해해야 한다. 상기 용어는 임의 부류의 항체 또는 이의 하위 부류, 예컨대 IgG 및 이의 하위 부류인 IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 온전한 항체 또는 전장 항체를 망라한다.
본원에 사용된 "항원 결합 단편", "단편" 및 "항체 단편"이라는 용어들은, 해당 항체의 항원 결합 활성을 유지하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하기 위해 상호 교환하여 사용된다. 항체 단편의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 단쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv를 포함한다.
인간 항체들은 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 [van Dijk, M. A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374]). 인간 항체는, 내인성 면역글로불린 생성이 부재하는 경우, 면역유발시 인간 항체에 대한 완전한 레퍼토리 또는 선별된 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자이식 동물 (예컨대, 마우스)에서 제조될 수도 있다. 인간 생식세포 계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이러한 생식세포 계열 돌연변이 마우스에 이식하게 되면, 항원으로 면역유발시 인간 항체를 생성할 수 있을 것이다 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555]; [Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258]; [Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 3340). Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555]; [Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258]; [Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 3340]을 참고함). 또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리로 제조될 수도 있다 (Hoogenboom, H. R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). 문헌 [Cole et al.] 및 [Boerner et al.]의 기술들도 인간 단일클론 항체의 제조에 사용할 수 있다 ([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; 및 [Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95]). 인간 단일클론 항체는 문헌 [Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. (2004): An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10(8):871-5]에 기술된 바와 같이 개선된 EBV-B 세포 불멸화를 사용하여 제조할 수도 있다. 본원에 사용된 "인간 항체"라는 용어는, 본 발명의 항체 및 항체 단편에 따른 특성을 만들기 위해, 예를 들어 가변 영역에서 변형된 이러한 항체들도 포함한다.
본원에 사용된 "가변 영역" [경쇄 가변 영역 (VL), 중쇄 가변 영역 (VH)]이라는 용어는, 대부분의 경우, 항체가 항원에 결합하는데 직접적으로 관여하는 경쇄 및 중쇄 쌍의 각 가변 영역 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명에 따른 항체는 임의의 동형 (예를 들어, IgA, IgG, IgM, IgE, IgD; 즉, α, γ, μ, ε 또는 δ 중쇄를 포함)의 것일 수 있다. 예를 들어, IgG 동형 내에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위부류일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 IgG1 항체이다. 본원에서 제공된 항체 또는 항원 결합 단편은 κ 또는 λ 경쇄를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 HBsAg 특이적 항체는 IgG 동형의 것으로, 감염된 세포로부터 HBV 및 HBsAg의 방출을 차단할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 명세서에 따른 항체는 세포 내에서 결합하여 HBV 비리온 및 HBsAg의 방출을 차단할 수 있다.
"VL" 및 "VH"이라는 용어들은 각각 항체 경쇄 및 중쇄의 가변 결합 영역을 지칭한다. 가변 결합 영역은 "상보성 결정 영역" (CDR) 및 "프레임워크 영역" (FR)으로 알려진 별개의 명확한 하위 영역들로 구성되어 있다. "상보성 결정 영역" 및 "CDR"이라는 용어들은 "초가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어이며, 항원 특이성 및/또는 결합 친화성을 부여하고 프레임워크 서열에 의해 분리되는, TCR 또는 항체 가변 영역 내의 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 면역글로불린 결합 단백질의 각 가변 영역에는 3개의 CDR이 있는데, 예를 들어, 항체의 경우, VH 및 VL 영역은 6개의 CDR인 HCDR1, HCDR2, HCDR3; LCDR1, LCDR2, LCDR3 (본원에서 각각 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로도 지칭함)을 포함한다. 본원에 사용된, CDR의 "변이체"는 최대 1-3개의 아미노산 치환, 결실 또는 이들의 조합을 갖는 CDR 서열의 기능적 변이체를 가리킨다.
면역글로불린 서열은 넘버링 방식 [예: 카바트 (Kabat), EU, 국제 면역유전학 정보 시스템 (International Immunogenetics Information System, IMGT) 및 아호(Aho)]에 따라 정렬될 수 있으며, 이를 통해 동등한 잔기 위치들에 주를 달아서, 항원 수용체 넘버링 및 수용체 분류 (ANARCI) 소프트웨어 도구를 사용하여 서로 다른 분자들을 비교할 수 있다 (2016, Bioinformatics 15:298-300). 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편이 중쇄 (HC), 경쇄 (LC) 또는 양자 모두의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다는 점은 이해될 것이다. 예를 들어, 전장인 온전한 IgG 항체 단량체는 일반적으로 VH, CH1, CH2, CH3, VL 및 CL을 포함한다. Fc 성분들에 대해서는 본원에 추가로 기술되어 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 본원에 개시된 VH 및 VL 서열 중 어느 하나에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함한다.
표 1은 본 발명에 따른 예시적인 특정 항체들의 중쇄 가변 영역 (VH), 경쇄 가변 영역 (VL), CDR, 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)의 아미노산 서열들을 나타낸 것이다.
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본원에 기재된 항체의 단편은, 펩신 또는 파파인과 같은 효소를 사용한 소화를 포함하는 방법 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 결합의 절단에 의해 항체로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 항체의 단편은 중쇄 또는 경쇄 서열의 일부를 클로닝 및 발현시켜 수득할 수 있다. 본 발명은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄로부터 유래된 단쇄 Fv 단편 (scFv)을 포함하는데, 예를 들어 본 명세서에 따른 항체 유래의 CDR을 포함하는 scFv, 중쇄 또는 경쇄 단량체 및 이량체, 단일 도메인 중쇄 항체, 단일 도메인 경쇄 항체 뿐만 아니라, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 펩타이드 링커에 의해 연결된 단쇄 항체도 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 정제된 항체, 단일클론 항체, 단쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv를 포함한다.
본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은, 실시형태에서, 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 등)일 수 있고, 본원에 개시된 바와 같이 임의의 다중특이적인 포맷으로 제공될 수도 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 이중특이적 또는 삼중특이적 항체와 같은 다중특이적 항체이다. 이중특이적 항체의 포맷은, 예를 들어 문헌 [Spiess et al., Mol. Immunol. 67(2):95 (2015)] 및 [Brinkmann and Kontermann, mAbs 9(2):182-212 (2017)]에 개시되어 있으며 (이러한 이중특이적 포맷과 이를 제조하는 방법은 본원에 참고로 포함됨), 예를 들어 이중특이적 T 세포 관여항체 (BiTE), DART, KIH (놉-인투-홀, Knobs-Into-Holes) 어셈블리, scFv-CH3-KIH 어셈블리, KIH 공통 경쇄 항체, TandAb, 삼중 항체, TriBi 미니항체, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2-scFv2, 4가의 HCab, 인트라바디, CrossMab, 이중 작용 Fab (DAF) (투인원 또는 포인원), DutaMab, DT-IgG, 전하 쌍(Charge Pairs), Fab-아암(arm) 익스체인지(Exchange), SEEDbodies, Triomab, LUZ-Y 어셈블리, Fcab, κλ-bodies, 직교성 Fab, DVD-IgG, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zybody 및 DVI-IgG (포인원)을 포함한다. 이중특이적 또는 다중특이적 항체는, 본 발명의 또 다른 HBV 및/또는 HDV 특이적 결합 도메인과 조합되거나, HBV 및/또는 HDV에 (예를 들어, 동일하거나 상이한 에피토프에서) 특이적으로 결합하는 상이한 결합 도메인과 조합되거나, 또는 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 결합 도메인과 조합된, 본 발명의 HBV 및/또는 HDV 특이적 결합 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 단편은 1가 또는 다가의 상호작용을 부여할 수 있어, 상술한 바와 같은 다양한 구조들에 포함될 수 있다. 예를 들어, scFv 분자는 3가인 "삼원항체" 또는 4가인 "사원항체"를 제조하기 위해 합성될 수 있다. 상기 scFv 분자들은 2가의 미니항체를 생성하는 Fc 영역의 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 서열은, 본 발명의 해당 서열이 본 발명의 에피토프를 표적으로 하고, 해당 분자의 다른 영역들이 다른 표적들에 결합하는 다중특이적 분자들의 성분일 수 있다. 예시적인 분자들로는, 이중특이적 Fab2, 삼중특이적 Fab3, 이중특이적 scFv 및 이원항체를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다 (Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).
본원에 기재된 것과 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (scFv를 포함하나 이에 한정되지는 않음)은, 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 융합 단백질에 포함될 수 있다. 본원에 사용된 "융합 단백질"은, 단일 사슬에서 적어도 2개의 별개의 도메인 또는 모티프를 갖는 단백질을 가리키며, 여기서 상기 도메인 또는 모티프들은 물론 단백질 중에서 함께 또는 소정의 배열로 나타나지는 않는다. 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 재조합적으로 유전자 조작하는 등의 PCR을 이용하여 작제될 수 있거나, 또는 이러한 융합 단백질을 합성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 융합 단백질은 숙주 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포의 표면에서 발현될 수 있다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 (i) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예컨대, scFv)을 포함하는 세포외 성분; (ii) 막횡단 성분 (예컨대, CD4, CD8, CD27, CD28의 막횡단 도메인, 또는 이의 기능적 변이체 또는 부분, 또는 이들의 임의의 조합); 및 (iii) 보조자극 단백질의 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체 또는 일부를 포함하는 세포내 성분 [예컨대, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD2, CD5, ICAM-1 (CD54), LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), GITR, CD30, CD40, BAFF-R, HVEM, LIGHT, MKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3의 신호전달 도메인, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 이의 기능적 변이체, 또는 이들의 임의의 조합] 및/또는 효과기 도메인 (예컨대, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, Wnt, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2 또는 이들의 임의의 조합)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질은, 세포 면역요법에서의 사용을 위해 T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포와 같은 숙주 세포의 세포 표면 상에서 발현될 수 있는, 키메라 항원 수용체 분자 (CAR)를 포함한다. CAR 분자들 및 디자인 원리들에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4):388 (2013)]; [Harris and Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 37(3):220 (2016)]; [Stone et al., Cancer Immunol. Immunother., 63(11):1163 (2014)]; [Xu et al., 2018 Oncotarget 9:13991]; [Androulla et al., 2018 Curr. Pharm. Biotechnol. Volume 19 (April 2018)]; [Wu et al., 2016 Expert Opin. Biol. Ther. 16:1469]; [Ren et al., 2017 Protein Cell 8:634]에 설명되어 있으며; 이러한 CAR 분자, CAR 디자인 및 CAR 디자인 원리들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명 전반에 걸쳐, 항체, 이의 항원 결합 단편 및 융합 단백질은 개별적으로 혹은 총괄하여 (예를 들어, 임의의 조합으로) "결합 단백질"로서 지칭될 수 있다.
본 발명에 따른 결합 단백질은 정제된 형태로 제공될 수도 있다. 예를 들어, 항체는 다른 폴리펩타이드들을 실질적으로 함유하지 않는 조성물 중에 존재할 수 있는데, 예를 들어 해당 조성물 중 90% 미만 (중량 기준), 통상적으로 60% 미만 및 보다 통상적으로 50% 미만이 다른 폴리펩타이드들로 구성된다.
본 발명에 따른 결합 단백질은 인간 및/또는 인간이 아닌 (또는 이종성) 숙주에서; 예컨대, 마우스에서 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 항체는 인간 숙주가 아닌, 인간이 아닌 숙주에서 면역원성인 동위원소를 가질 수 있다. 인간에서 사용하기 위한 본 발명의 항체는 통상적으로 마우스, 염소, 토끼, 랫트, 비영장류 포유동물 등과 같은 숙주로부터 분리되지 않은 것들, 및 경우에 따라서는 인간화 또는 제노(xeno)-마우스로부터 수득되지 않은 것들을 포함한다. 또한, 공지되어 있거나 잠재적인 면역원성 및/또는 기타 잠재적인 장애들을 감소시키거나, 또는 마우스와 같은 인간이 아닌 동물에서 항체의 원하는 구조 및/또는 기능성을 부여하도록 유전자 조작된, 본원에 개시된 항체의 변이 형태들도 본원에 고려된다 (예를 들어, 마우스에서; 예컨대 마우스를 사용한 모델 연구에서, 하나 이상의 인간 아미노산 잔기, 서열 또는 모티프가, 면역원성이나 기타 장애들이 감소 또는 저해되었거나, 또는 원하는 구조 및/또는 기능을 갖게된 잔기, 서열 또는 모티프로 대체된 "쥐과류화된" 항체).
본 발명의 예시적인 쥐과류화된 항체의 아미노산 서열들은 표 2에 제공하였다.
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본원에 사용된 "중화 항체" (또는 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질)라고 하면, 숙주 (예컨대, 숙주 유기체 또는 숙주 세포)에서 감염을 개시 및/또는 지속시키는 병원체의 능력을 중화, 즉 방지, 억제, 감소, 지연 또는 방해할 수 있는 것들이다. "중화 항체" 및 "~을 중화시키는 항체" 또는 "~을 중화하는 항체"라는 용어들은 본원에서 서로 교환하여 사용된다. 이러한 항체들은, 단독으로 또는 조합하여 (예컨대, 2개 이상의 본원에 개시된 항체들을 조합하거나, 또는 본 발명의 항체와, HBV B 및/또는 D 감염을 중화할 수 있는 항체를 포함하는 항체 제제이거나 항체 제제가 아닐 수 있는, 또 다른 제제를 조합하여), 능동 백신접종과 함께 적절한 처방시 예방제 또는 치료제로서, 진단 도구로서, 또는 본원에 기재된 바와 같은 생산 도구로서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "~에 특이적으로 결합하는" 또는 "~에 대해 특이적인"이라는 말은, 표적 분자에 대하여 (해당 결합 반응에 있어서 해리도 [Koff]에 대한 친화도 [Kon]의 비율과 같은) 105 M-1 이상의 친화도 또는 Ka로 결합 단백질 (예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편) 또는 결합 도메인이 회합 또는 결합하는 것을 의미하지만, 샘플 중의 임의의 다른 분자들 또는 성분들과 유의하게 회합 또는 결합하지는 않는다. 결합 단백질 또는 결합 도메인은 "고친화성" 결합 단백질 또는 결합 도메인, 또는 "저친화성" 결합 단백질 또는 결합 도메인으로 분류될 수 있다. "고친화도" 결합 단백질 또는 결합 도메인이라고 하면, 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1 또는 적어도 1013 M-1의 Ka를 갖는 결합 단백질 또는 결합 도메인을 지칭한다. "저친화도" 결합 단백질 또는 결합 도메인이라고 하면, 최대 107 M-1, 최대 106 M-1 또는 최대 105 M-1의 Ka를 갖는 결합 단백질 또는 결합 도메인을 지칭한다. 대안적으로, 친화도는 M 단위 (예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M)의 특정 결합 상호작용에 대한 평형 해리 상수(Kd)로 정의될 수도 있다. "결합" 및 "특이적으로 결합하는"이라는 용어들과 유사한 언급들은 비특이적인 접착을 포함하지 않는다.
결합 단백질의 결합은 적절한 분석법, 예컨대 표면 플라스몬 공명 (SPR) 방법, 예를 들어 Biacore™ 시스템; 동역학 배제 분석, 예컨대 KinExA®; 및 (예컨대, ForteBio® Octet 플랫폼을 사용하는) 생물층 간섭굴절측정법; 등온 적정 열량측정법 (ITC) 등, 예를 들어 450 nm에서의 광학 밀도 또는 유세포분석법 등에 의한 영상촬영을 사용하는 (예컨대, 직접 또는 간접) 항원 결합 ELISA를 이용하여 측정 또는 평가될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 HBsAg의 항원 루프 영역에 결합할 수 있다. B형 간염 바이러스의 외피는 일반적으로 하기의 3가지 "HBV 외피 단백질" ("HBsAg", "B형 간염 표면 항원"이라고도 알려짐)을 포함한다: S 단백질("소형"의 경우, S-HBsAg라고도 지칭함), M 단백질 ("중형"의 경우, M-HBsAg라고도 지칭함) 및 L 단백질 ("대형"의 경우, L-HBsAg라고도 지칭함). S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg는 동일한 C-말단끝 ("S 도메인"이라고도 칭하며, 226개 아미노산)을 공유하는데, 이는 S 단백질 (S-HBsAg)에 해당하는 것으로서, 바이러스 어셈블리 및 감염력에 있어 중요하다. S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg는 소포체 (ER)에서 합성되고, 조립되어, 골지체를 통해 입자들로서 분비된다. 상기 S 도메인은 4개의 예상된 막횡단 (TM) 도메인을 포함하는데, 이로써 S 도메인의 N-말단과 C-말단 모두가 내강에 노출된다. 막횡단 도메인 TM1 및 TM2는 모두 ER 막으로의 공동해독 단백질 통합에 필요한 것으로 생각되며, 막횡단 도메인 TM3 및 TM4는 S 도메인의 3번째 C-말단에 위치한다. HBsAg의 "항원 루프 영역"은 HBsAg의 S 도메인의 예상된 TM3 및 TM4 막횡단 도메인 사이에 위치하며, 이로써 상기 항원 루프 영역은 S 도메인의 아미노산 101 내지 172를 포함하고, 여기에는 총 226개의 아미노산이 포함되어 있다 (Salisse J. and Sureau C., 2009, Journal of Virology 83: 9321-9328). 감염력 결정요인은 HBV 외피 단백질의 항원 루프 영역에 있다. 특히, HBsAg의 119 내지 125 사이의 잔기들에는 HBV 및 HDV의 감염력에 중요한 것으로 생각되는 CXXC 모티브가 포함되어 있다 (Jaoude GA, Sureau C, Journal of Virology, 2005;79:10460-6).
HbsAg의 S 도메인 아미노산 서열 내의 위치를 본원에서 언급하는 경우, 이러한 위치들은 서열번호 3 (하기에 나타냄)에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 천연 또는 인공 서열 변이체를 기준으로 하여 구성한다.
MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFFCLWVYI
(서열번호 3; 아미노산 101 내지 172는 밑줄로 나타내었음)
예를 들어, "S 도메인의 아미노산 101 내지 172"라는 표현은 서열번호 3에 따른 폴리펩타이드의 101 내지 172번 위치의 아미노산 잔기들을 가리킨다. 그러나, 당업자라면 누구나, 돌연변이 또는 변이 (예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 치환, 결실 및/또는 부가를 포함하고, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 상이한 유전자형의 HBsAg 또는 상이한 HBsAg 돌연변이를 포함)가 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 서열에서 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 그 생물학적 특성에 영향을 미치지 않으면서 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 서열에 인공적으로 도입될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본원에 사용된 "HBsAg의 S 도메인"이라는 용어는, 예를 들어 서열번호 3에 따른 폴리펩타이드 및 이의 천연 또는 인공 돌연변이를 비롯한, 이러한 모든 폴리펩타이드를 망라한다. 또한, HBsAg의 S 도메인의 서열 단편이 본원에 기재되어 있는 경우 (예를 들어, HBsAg의 S 도메인의 아미노산 101-172 또는 아미노산 120-130), 이들은 서열번호 3의 상응하는 서열 단편들 뿐만 아니라, 이의 천연 또는 인공 돌연변이의 상응하는 서열 단편들도 포함한다. 예를 들어, "HBsAg의 S 도메인의 101 내지 172번 위치의 아미노산 잔기"라는 말은, 서열번호 3의 101 내지 172번 위치의 아미노산 잔기 및 이의 돌연변이 (천연 또는 인공 돌연변이)의 상응하는 단편들도 망라한다. 본원에 사용된 "상응하는 서열 단편들" 및 "상응하는 단편들"이라는 말은, 해당 서열들을 최적화 정렬하는 경우, 즉 해당 서열들이 가장 높은 동일성 %를 얻도록 정렬하는 경우에 서열들의 동일한 위치에 위치하고 있는 단편들을 지칭한다.
M 단백질 (M-HBsAg)은 "pre-S2"라고 불리는 55개의 아미노산들의 N-말단 도메인에 의해 확장된 S 단백질에 해당한다. L 단백질 (L-HBsAg)은 "pre-S1" (유전자형 D)이라고 하는 108개의 아미노산들의 N-말단 도메인에 의해 확장된 M 단백질에 해당한다. 상기 L 단백질의 pre-S1 및 pre-S2 도메인은, 바이러스 어셈블리에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되는, 바이러스 입자의 내면 (ER의 세포질측)에 존재할 수 있거나, 또는 표적 세포들과의 상호작용에 이용가능하고 바이러스 감염력에 중요한 바이러스 입자의 외면 (ER의 내강측)에 존재할 수 있다. 또한, HBV 표면 단백질 (HBsAg)은 비리온 외피에 통합될 뿐만 아니라 ER-골지 중간 구획 막에서 자발적으로 발아(bud)하여, 분비에 의해 해당 세포로부터 방출되는 빈 (empty) "준바이러스 입자" (SVP)를 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은 HBsAg의 항원 루프 영역에 결합하고, S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg 모두에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스에 의한 감염을 중화시킨다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스의 바이러스 감염력을 감소시킨다.
실험실에서 바이러스 감염력 (또는 "중화")을 연구하여 정량하기 위해, 표준 "중화 분석"이 사용될 수 있다. 중화 분석의 경우, 동물 바이러스는 일반적으로 세포 및/또는 세포주에서 증식시킨다. 배양된 세포들을, 시험할 항체 (또는 항원 결합 단편 또는 융합 단백질)의 존재 (또는 부재) 하에 고정량의 HBV 또는 HDV와 함께 항온배양시키는, 중화 분석이 사용될 수 있다. 이러한 분석에서, 세포 배양 상청액으로 분비된 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 또는 B형 간염 e 항원 (HBeAg)의 수준을 사용할 수 있고/있거나, 판독치를 제공하기 위해 HBcAg 염색을 평가할 수도 있다. 예를 들어, HDV의 경우에는, 델타 항원 면역형광 염색을 평가할 수도 있다.
HBV 중화 분석의 특정 실시형태에서, 배양된 세포, 예를 들어 HepaRG 세포, 예컨대 분화된 HepaRG 세포들을, 시험할 항체의 존재 또는 부재 하에 고정량의 HBV와 함께 항온배양한다. 이러한 실시형태에서, 항온배양은, 예를 들어 37℃에서 16시간 동안 수행될 수 있다. 상기 배양은 (예컨대, 4% PEG 8000을 보충한) 배지 중에서 수행할 수 있다. 배양 후, 세포들을 세척하고 더 배양할 수도 있다. 바이러스 감염력을 측정하기 위해, 예를 들어 감염 후 7일째 내지 11일째까지, 배양 상청액으로 분비된 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 및 B형 간염 e 항원 (HBeAg)의 수준을 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 측정할 수 있다. 추가로, HBcAg 염색은 면역형광 분석에서 평가할 수 있다. HDV 중화 분석의 한 실시형태에서, (HBV 대신에) 분화된 HepaRg 세포 상에서 HDV 감염 접종원으로서 HDV 보균자의 혈청이 사용될 수 있다는 차이점을 제외하고는, 본질적으로 HBV의 경우와 동일한 분석법이 사용될 수 있다. 검출을 위해서, 델타 항원 면역형광 염색을 판독치로 사용할 수 있다.
본 발명의 결합 단백질의 실시형태는 높은 중화 효능을 가진다. 특정 실시형태에서, B형 간염 바이러스 (HBV) 및 델타 간염 바이러스 (HDV)의 50% 중화에 필요한 본원에 기술된 항체의 농도는, 예를 들어 약 10 ㎍/ml 이하이다. 다른 실시형태에서, HBV 및 HDV의 50% 중화에 필요한 결합 단백질의 농도는 약 5 ㎍/ml이다. 다른 실시형태에서, HBV 및 HDV의 50% 중화에 필요한 본원에 기술된 결합 단백질의 농도는 약 1 ㎍/ml이다. 또 다른 실시형태에서, HBV 및 HDV의 50% 중화에 필요한 결합 단백질의 농도는 약 750 ng/ml이다. 추가의 실시형태에서, HBV 및 HDV의 50% 중화에 필요한 본원에 기술된 결합 단백질의 농도는 500 ng/ml 이하이다. 이러한 실시형태에서, HBV 및 HDV의 50% 중화에 필요한 본원에 기술된 결합 단백질의 농도는 450 ng/ml 이하, 400 ng/ml 이하, 350 ng/ml 이하, 300 ng/ml 이하, 250 ng/ml 이하, 200 ng/ml 이하, 175 ng/ml 이하, 150 ng/ml 이하, 125 ng/ml 이하, 100 ng/ml 이하, 90 ng/ml 이하, 80 ng/ml 이하, 70 ng/ml 이하, 60 ng/ml 이하 또는 50　ng/ml 이하로부터 선택될 수 있다.
HBV 및 HDV를 모두 중화할 수 있는 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 B형 간염 및 D형 간염의 예방과 치료에 유용하다. HDV 감염은 통상적으로 HBV 감염과 동시에 또는 그 이후에 발생하며 (예를 들어, HDV는 그 자체 복제를 위해서 HBV의 도움을 필요로 하기 때문에, HBV 부재 하의 HDV 접종은 D형 간염을 유발하지 않음), D형 간염은 일반적으로 만성 HBV 보균자에서 관찰된다.
개시된 결합 단백질의 실시형태들은 HBsAg 및 HBV의 제거를 촉진한다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 HBV 및 B형 간염 바이러스의 준바이러스 입자 (SVP) 모두의 제거를 촉진한다. HBsAg 또는 준바이러스 입자의 제거는, 예를 들어 B형 간염 환자의 혈액 샘플 중의 HBsAg의 수준을 측정함으로써 평가할 수 있다. 이와 유사하게, HBV의 제거는, 예를 들어 B형 간염 환자의 혈액 샘플 중의 HBV의 수준을 측정함으로써 평가할 수 있다.
HBV에 감염된 환자의 혈청에는, 감염성 입자 (HBV) 이외에도, 비교적 작은 구체와 다양한 길이의 필라멘트 형태의 HBV 외피 단백질 (HBsAg)만으로 구성된 빈 준바이러스 입자 (SVP)가 통상 과량으로 (일반적으로 1,000 내지 100,000배로) 존재한다. 준바이러스 입자들은 HBV의 세포내 바이러스 복제와 유전자 발현을 크게 향상시키는 것으로 나타났다 (Bruns M. et al. 1998 J Virol 72(2): 1462-1468). 감염력은 바이러스의 수 뿐만 아니라 SVP의 수에도 좌우되기 때문에, 이것은 HBV를 함유하는 혈청의 감염력의 내용과도 관련이 있다 (Bruns M. et al. 1998 J Virol 72(2): 1462-1468). 또한, 과량의 준바이러스 입자들은 중화 항체들을 흡수함으로써 유도하는 역할을 하여 감염의 제거를 지연시킬 수도 있다. B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 손실의 달성은, 경우에 따라서는, 치료의 이상적인 종료점이자, 만성 B형 간염 (CHB)의 치료에 가장 근접한 결과로서 간주된다.
본 발명의 결합 단백질의 실시형태들은 HbsAg의 제거를 촉진할 수 있다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 B형 간염 바이러스의 준바이러스 입자의 제거를 촉진할 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 단백질은 만성 B형 간염을 치료하는데 사용될 수 있다.
임의의 본 발명에 개시된 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 HBsAg 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 유전자형의 HBsAg에 결합할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 HBsAg 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J에 결합할 수 있다. 서로 다른 HBsAg 유전자형의 예로는 하기를 포함한다: GenBank 등록번호 J02203 (HBV-D, ayw3); GenBank 등록번호 FJ899792.1 (HBV-D, adw2); GenBank 등록번호 AM282986 (HBV-A); GenBank 등록번호 D23678 (HBV-B1 일본); GenBank 등록번호 AB117758 (HBV-C1 캄보디아); GenBank 등록번호 AB205192 (HBV-E 가나); GenBank 등록번호 X69798 (HBV-F4 브라질); GenBank 등록번호 AF160501 (HBV-G USA); GenBank 등록번호 AY090454 (HBV-H 니카라과); GenBank 등록번호 AF241409 (HBV-I 베트남); 및 GenBank 등록번호 AB486012 (HBV-J 보르네오). 서로 다른 유전자형의 HBsAg의 S 도메인 항원 루프 영역의 예시적인 아미노산 서열들이 본원에 기재되어 있다 (예를 들어, 서열번호 5 내지 15).
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 10개의 HBsAg 유전자형인 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J 중 하나 이상, 경우에 따라서는 적어도 6개에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 10개의 HBsAg 유전자형인 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J 중 적어도 8개에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 단백질은 10개의 HBsAg 유전자형인 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J의 10개 모두에 결합할 수 있다. HBV는 게놈 서열에 따라 수개의 유전자형으로 분화된다. 현재까지, HBV 게놈의 8가지의 잘 알려진 유전자형 (A-H)이 정의된 바 있다. 또한, I 및 J의 2가지 다른 유전자형들도 확인되었다 (Sunbul M., 2014, World J Gastroenterol 20(18): 5427-5434). 유전자형은 질병의 진행에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 항바이러스 치료에 대한 반응에서 유전형들 간의 차이가 확인되었다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 항원 루프 영역에 돌연변이가 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 또는 18개의 HBsAg 돌연변이에 결합할 수 있으며, 이러한 돌연변이(들)은 HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R 및 HBsAg N146A 중 하나 이상으로부터 선택된다. 이러한 돌연변이들은 Genbank 등록번호 FJ899792 (서열번호 4)인 HBsAg 유전자형 D의 S 도메인에 기초하여 자연 발생된 돌연변이들이다. 본원에 언급된 각 돌연변이들에서 돌연변이된 아미노산 잔기(들)을 명칭으로 나타내었다.
서열번호 4:
MENVTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSTLSPFLPLLPIFFCLWVYI
(항원 루프 영역, 즉 아미노산 101 내지 172는 밑줄로 나타냄).
상이한 돌연변이체들의 HBsAg S 도메인 항원 루프 영역의 아미노산 서열들을 서열 번호 16 내지 33으로 나타내었다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 하기들 중 하나 이상, 및 경우에 따라서는 하기로부터 선택된 적어도 12개의 감염성 HBsAg 돌연변이에 결합할 수 있다: HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R 및 HBsAg N146A. 일부 이러한 실시형태에서, 결합 단백질은 하기로부터 선택된 적어도 15개의 감염성 HBsAg 돌연변이에 결합할 수 있다: HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R 및 HBsAg N146A. 일부 실시형태에서, 결합 단백질은 하기의 감염성 HBsAg 돌연변이 각각에 결합할 수 있다: HBsAg Y100C/P120T; HBsAg P120T; HBsAg P120T/S143L; HBsAg C121S; HBsAg R122D; HBsAg R122I; HBsAg T123N; HBsAg Q129H; HBsAg Q129L; HBsAg M133H; HBsAg M133L; HBsAg M133T; HBsAg K141E; HBsAg P142S; HBsAg S143K; HBsAg D144A; HBsAg G145R; 및 HBsAg N146A.
특정 실시형태에서, 상기 결합 단백질 (예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)은 HBV에 감염된 포유동물에서 HBV DNA의 혈청 농도를 감소시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 HBV에 감염된 포유동물에서 HBsAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 HBV에 감염된 포유동물에서 HBeAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 HBV에 감염된 포유동물에서 HBcrAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 단백질은 포유동물에서 해당 결합 단백질의 단회 투여 후 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일, 또는 그 이상 동안 HBV DNA, HBsAg, HBeAg 및/또는 HBcrAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있다.
"에피토프" 또는 "항원 에피토프"라는 용어는 동족 결합 분자, 예컨대 면역글로불린, 키메라 항원 수용체 또는 다른 결합 분자에 의해 인식되어 특이적으로 결합되는 임의의 분자, 구조, 아미노산 서열 또는 단백질 항원결정기를 포함한다. 에피토프 항원결정기는 일반적으로 아미노산이나 당 측쇄와 같은 화학적으로 활성인 표면 분자의 그룹을 포함하며, 특유의 3차원 구조적 특징부들 뿐만 아니라 특유의 전하 특징부들을 보유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 HbsAg의 항원 루프 영역의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 115 내지 133, HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 내지 133, 또는 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 내지 130으로부터 선택된 적어도 2개의 아미노산에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 115 내지 133, HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 내지 133, 또는 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 내지 130으로부터 선택된 적어도 3개의 아미노산에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 단백질은 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 115 내지 133, HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 내지 133, 또는 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 내지 130으로부터 선택된 적어도 4개의 아미노산에 결합할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 아미노산들의 위치 (예를 들어, 115 내지 133, 120 내지 133, 120 내지 130)는 상술한 바와 같은 HBsAg의 S 도메인을 가리키는데, 이는 3개의 HBV 외피 단백질인 S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg 모두에 존재하고, 여기서 S-HBsAg는 통상적으로 HBsAg의 S 도메인에 해당한다.
에피토프의 내용에서 본원에 사용된 "~에 의해 형성된"이라는 용어는, 결합 단백질이 결합하게 되는 에피토프가 선형 (연속적) 또는 입체형 (불연속적)일 수 있음을 의미한다. 선형 또는 연속적 에피토프는 그의 아미노산의 선형 서열, 즉 1차 구조에 따라 항체에 의해 인식되는 에피토프이다. 입체형 에피토프는 3차원 형태와 단백질 구조에 따라 인식될 수 있다. 따라서, 해당 에피토프가 선형 에피토프이고 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 115 내지 133번 위치 또는 아미노산 120 내지 133번 위치에서 선택된 위치에 위치한 하나 이상의 아미노산을 포함하는 경우, 해당 에피토프에 의해 포함된 아미노산들은 1차 구조의 인접한 위치들에 위치할 수 있다 (예컨대, 아미노산 서열에서 연속적인 아미노산들임). 입체형 에피토프 (3D 구조)의 경우, 아미노산 서열은 일반적으로 에피토프로서 3차원 구조를 형성하므로, 해당 에피토프를 형성하는 아미노산은 1차 구조의 인접한 위치에 있을 수도 있고 없을 수도 있다 (즉, 해당 아미노산 서열에서 연속적인 아미노산일 수도 있고 아닐 수도 있음).
특정 실시형태에서, 결합 단백질이 결합하는 에피토프는 입체형 에피토프이다. 일부 실시형태에서, 결합 단백질은 HBsAg의 항원 루프 영역의 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는데, 여기서 상기 적어도 2개의 아미노산은 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 내지 133 또는 아미노산 120 내지 130으로부터 선택되고, 상기 적어도 2개의 아미노산은 (일차 구조의) 인접한 위치에 위치하지 않는다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 HBsAg의 항원 루프 영역의 적어도 3개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는데, 여기서 상기 적어도 3개의 아미노산은 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 내지 133 또는 아미노산 120 내지 130으로부터 선택되고, 상기 3개의 아미노산 중 적어도 2개의 아미노산은 (일차 구조의) 인접한 위치에 위치하지 않는다. 일부 실시형태에서, 결합 단백질은 HBsAg의 항원 루프 영역의 적어도 4개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는데, 여기서 상기 적어도 4개의 아미노산은 HbsAg의 S 도메인의 아미노산 120 내지 133 또는 아미노산 120 내지 130으로부터 선택되고, 상기 4개의 아미노산 중 적어도 2개의 아미노산은 (일차 구조의) 인접한 위치에 위치하지 않는다.
1차 구조의 인접 위치에 위치하지 않는, 본 발명에 개시된 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질이 결합하는 아미노산 (즉, 에피토프를 형성하는 아미노산들)은, 경우에 따라서는, 상기 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질이 결합하지 않는 하나 이상의 아미노산들에 의해 이격되어 떨어져 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 아미노산은 해당 에피토프에 의해 포함된 인접 위치에 위치하지 않은 2개의 아미노산들 사이에 위치할 수 있다.
특정 실시형태에서, 결합 단백질은 HBsAg의 S 도메인의 적어도 아미노산 P120, C121, R122 및 C124를 포함하는 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열번호 88에 따른 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다:
PCRXC
여기서, X는 임의의 아미노산이거나 아미노산이 아니거나; X는 임의의 아미노산이거나; X는 T, Y, R, S 또는 F이거나; X는 T, Y 또는 R이거나; 또는 X는 T 또는 R이다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열번호 80에 따른 아미노산 서열:
TGPCRTC
또는 서열번호 80과 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열번호 85에 따른 아미노산 서열:
STTSTGPCRTC
또는 서열번호 85와 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 HBsAg의 S 도메인의 적어도 아미노산 145 내지 151을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다:
GNCTCIP
(서열번호 81).
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열번호 80에 따른 아미노산 서열 및 서열번호 81에 따른 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열번호 85에 따른 아미노산 서열 및 서열번호 87에 따른 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 결합 단백질이 결합하게 되는 에피토프는 선형 (연속적) 또는 입체형 (불연속적)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 입체형 에피토프에 결합하고, 이러한 특정 실시형태에서, 상기 입체형 에피토프는 비환원 조건 하에서만 존재한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 선형 에피토프에 결합한다. 이러한 특정 실시형태에서, 상기 선형 에피토프는 비환원 조건 및 환원 조건 하에 모두 존재한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열번호 1에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 HBsAg의 항원 루프 내의 에피토프에 결합한다:
X1 X2 X3 TC X4 X5 X6A X7G
여기서, X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 임의의 아미노산 (서열번호 1)일 수 있다.
일부 실시형태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 서열번호 3의 아미노산 120 내지 130과 비교하였을 때 보존적으로 치환된 아미노산이다. 일부 실시형태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 서열번호 5 내지 33 중 임의의 서열의 아미노산 20 내지 30과 비교하였을 때 보존적으로 치환된 아미노산이다.
특정 실시형태에서, 서열번호 1의 X1은 소형 아미노산이다. 본원에 사용된 "소형" 아미노산은, 알라닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 시스테인, 글리신, 프롤린, 세린, 트레오닌 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산을 지칭한다. 이러한 특정 실시형태에서, X1은 프롤린, 세린 또는 트레오닌이다.
특정 실시형태에서, 서열번호 1의 X2는 소형 아미노산이다. 특정 실시형태에서, X2는 시스테인 또는 트레오닌으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 서열번호 1의 X3은 하전된 아미노산 또는 지방족 아미노산이다. 본원에 사용된 "하전된" 아미노산은, 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 글루탐산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산을 지칭한다. 본원에 사용된 "지방족" 아미노산은, 알라닌, 글리신, 이소루신, 루신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산을 지칭한다. 특정 실시형태에서, X3은 아르기닌, 리신, 아스파르트산 또는 이소루신으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 1의 X4는 소형 아미노산 및/또는 소수성 아미노산이다. 본원에 사용된 "소수성" 아미노산은, 알라닌, 이소루신, 루신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 티로신, 메티오닌, 프롤린 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산을 지칭한다. 특정 실시형태에서, X4는 메티오닌 또는 트레오닌으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 1의 X5는 소형 아미노산 및/또는 소수성 아미노산이다. 특정 실시형태에서, X5는 트레오닌, 알라닌 또는 이소루신으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 1의 X6은 소형 아미노산 및/또는 소수성 아미노산이다. 특정 실시형태에서, X6은 트레오닌, 프롤린 또는 루신으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 1의 X7은 극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이다. 본원에 사용된 "극성" 아미노산은, 아스파르트산, 아스파라긴, 아르기닌, 글루탐산, 히스티딘, 리신, 글루타민, 트립토판, 티로신, 세린 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산을 지칭한다. 이러한 특정 실시형태에서, X7은 글루타민, 히스티딘 또는 루신이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 서열번호 2에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 HBsAg의 항원 루프 내의 에피토프에 결합한다:
X1 X2 X3 TC X4 X5 X6A X7G
여기서, X1은 P, T 또는 S이고,
X2는 C 또는 S이며,
X3은 R, K, D 또는 I이고,
X4는 M 또는 T이며,
X5는 T, A 또는 I이고,
X6은 T, P 또는 L이며,
X7은 Q, H 또는 L임.
(서열번호 2)
서열번호 1 또는 2에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 에피토프와 관련하여, 본원에 사용된 "~에 의해 형성된"이라는 용어는 개시된 결합 단백질이 서열번호 1 또는 2의 각각의 모든 아미노산에 반드시 결합한다는 것을 의미하려는 것이 아님을 주목해야 한다. 특히, 결합 단백질은 서열번호 1 또는 2의 일부 아미노산에만 결합할 수 있으며, 이로써 다른 아미노산 잔기들은 "스페이서"로서 작용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은, 하기 표 3에 나타낸 서열번호 5 내지 33으로부터 선택된 아미노산 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 아미노산에 의해 형성된 HBsAg의 항원 루프 내의 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 하기 표 3에 나타낸 서열 5 내지 33 중 어느 하나 이상에 따른 아미노산 서열을 함유하는 HBsAg의 항원 루프 영역, 또는 그의 서열 변이체에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 하기 표 3에 나타낸 서열 5 내지 33 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 함유하는 모든 HBsAg의 항원 루프 변이체에 결합한다.
표 3: 본원에서 사용된 서로 다른 유전자형 및 돌연변이의 HBsAg의 S 도메인의 항원 루프 영역의 예시적인 아미노산 서열들 (HBsAg의 S 도메인의 잔기 101-172: 관련 돌연변이를 포함시키기 위해 HBsAg의 S 도메인의 잔기 100-172를 언급하고 있는 서열번호 16은 예외).
Figure pct00013
Figure pct00014
특정 양태에서, 본 발명은 하기 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다: (i) 서열번호 41 또는 67에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% (즉, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 (ii) 서열번호 42, 59, 65, 89, 90 또는 111 내지 120 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)으로서, 단, IMGT 넘버링에 따른 VL의 40번 위치에 있는 아미노산이 시스테인이 아닌, 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 HBsAg의 항원 루프 영역에 결합하여 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스에 의한 감염을 중화시키는 것인, 상기 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
추가의 실시형태에서, (i) VH는 서열번호 41 또는 67에 따른 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 포함하고/포함하거나; (ii) VL은 서열번호 42, 59, 65, 89, 90 또는 111 내지 120 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 포함한다.
특정 실시형태에서, VL의 40번 위치에 있는 아미노산은 알라닌이다. 다른 실시형태에서, VL의 40번 위치에 있는 아미노산은 세린이다. 또 다른 실시형태에서, VL의 40번 위치에 있는 아미노산은 글리신이다.
본원에 개시된 임의의 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열번호 (i) 34-36, 37, 38 및 40; (ii) 34, 66, 36, 37, 38 및 40; (iii) 34-36, 37, 39 및 40; (iv) 34, 66, 36, 37, 39 및 40; (v) 34-36, 37, 38 및 58; (vi) 34, 66, 36, 37, 38 및 58; (vii) 34-36, 37, 39 및 58; 또는 (vii) 34, 66, 36, 37, 39 및 58에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 VL은 서열번호 89에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 VL은 서열번호 90에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 VL은 서열번호 111 내지 120 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시형태에서, VH는 서열번호 41에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시형태에서, VH는 서열번호 67에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 실시형태에서, VH는 서열번호 41에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, VL은 서열번호 89에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시형태에서, VH는 서열번호 41에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, VL은 서열번호 90에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시형태에서, VH는 서열번호 41에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, VL은 서열번호 111 내지 120에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시형태에서, VH는 서열번호 67에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, VL은 서열번호 89, 90 및 111 내지 120에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다: (i) 서열번호 95에 따른 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 (ii) 서열번호 96에 따른 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 HBsAg의 항원 루프 영역에 결합하여 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스에 의한 감염을 중화시키는 것인, 상기 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
추가의 실시형태에서, (i) VH는 서열번호에 따른 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 포함하고/포함하거나; (ii) VL은 서열번호 96에 따른 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 97 내지 102에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 각각 포함한다.
특정 실시형태에서, VH는 서열번호 95에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, VL은 서열번호 96에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
Fc 모이어티
일부 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질 (예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 Fc 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 Fc 모이어티는 인간 기원으로부터, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4로부터, 또는 다른 Ig 부류 또는 동형으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgG1로부터 유래된 Fc 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "Fc 모이어티"라는 용어는 파파인 절단 부위 (예컨대, 중쇄 불변 영역의 첫 번째 잔기를 114로 취하는, 천연 IgG의 잔기 216)의 바로 상류부에 있는 경첩 영역에서 시작해서 면역글로불린 중쇄의 C-말단에서 끝나는 면역글로불린 중쇄의 일부를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로부터 유래된 서열을 의미한다. 따라서, 상기 Fc 모이어티는 완전한 Fc 모이어티 또는 이의 부분 (예컨대, 도메인)일 수 있다. 특정 실시형태에서, 완전한 Fc 모이어티는 경첩 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인 (예컨대, EU 아미노산 위치 216 내지 446)을 포함한다. 추가적인 라이신 잔기(K)는 때로는 Fc 모이어티의 C-말단끝에 존재하지만, 성숙한 항체로부터 절단되는 경우가 많다. Fc 모이어티 내의 아미노산 위치는 카바트의 EU 넘버링 시스템에 따라 번호가 매겨졌으며, 예컨대 문헌 [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. Health and Human Services, 1983 and 1987]을 참조한다. Fc 모이어티의 아미노산 위치는 IMGT 넘버링 시스템 (C-도메인에 대한 고유 넘버링 및 엑손 넘버링 포함) 및 카바트 넘버링 시스템에 따라 번호가 매겨질 수 있다.
일부 실시형태에서, Fc 모이어티는 경첩 (예컨대, 상부, 중간 및/또는 하부 경첩 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이의 변이체, 부분 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 모이어티는 적어도 경첩 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 상기 Fc 모이어티는 완전한 Fc 모이어티이다. 인간 IgG1 동형의 예시적인 Fc 모이어티의 아미노산 서열은 서열번호 137에 제시되어 있다. 또한, 상기 Fc 모이어티는 자연 발생 Fc 모이어티에 대하여 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 경첩 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인 중 적어도 하나, 또는 이들의 일부가 결실될 수 있다. 예를 들어, Fc 모이어티는 하기를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다: (i) CH2 도메인 (또는 이의 일부)에 융합된 경첩 도메인 (또는 이의 일부), (ii) CH3 도메인 (또는 이의 일부)에 융합된 경첩 도메인 (또는 이의 일부), (iii) CH3 도메인 (또는 이의 일부)에 융합된 CH2 도메인 (또는 이의 일부), (iv) 경첩 도메인 (또는 이의 일부), (v) CH2 도메인 (또는 이의 일부), 또는 (vi) CH3 도메인 또는 이의 일부.
본 발명의 Fc 모이어티는, 자연 발생 Fc 모이어티에 의해 부여되는 적어도 하나의 바람직한 기능을 유지하거나 향상시킬 수 있고/있거나 자연 발생 Fc 모이어티의 바람직하지 않은 기능을 감소시키면서도, 자연 발생 면역글로불린 분자의 완전한 Fc 모이어티로부터 아미노산 서열이 변화하도록 변형될 수 있다. 이러한 기능들로는, 예를 들어 Fc 수용체 (FcR) 결합, (예컨대, FcRn에 대한 결합에 의한) 항체 반감기 조절, ADCC 기능, 단백질 A 결합, 단백질 G 결합 및 보체 결합을 포함한다. 이러한 기능들과 관련이 있는 자연 발생 Fc 모이어티의 부분들은 당업계에 설명되었던 바 있다.
예를 들어, 보체 캐스케이드를 활성화하기 위해, 면역글로불린 분자(들)이 항원 표적에 부착되는 경우에 C1q 단백질 복합체는 적어도 두 분자의 IgG1 또는 한 분자의 IgM에 결합할 수 있다 (Ward, E. S., and Ghetie, V., Ther. Immunol. 2 (1995) 77-94). 버튼 (Burton), D.R.은 아미노산 잔기 318 내지 337을 포함하는 중쇄 영역이 보체 고정화에 관여되어 있음을 기재하고 있다 (Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206). 던컨 (Duncan), A. R. 및 윈터 (Winter), G.는 부위 특이적 돌연변이 유발을 사용하여 Glu318, Lys320 및 Lys322가 C1q에 대한 결합 부위를 형성한다고 보고하였다 (Nature 332 (1988) 738-740). C1q의 결합에서의 Glu318, Lys320 및 Lys 322 잔기의 역할은 이러한 잔기들을 함유하는 짧은 합성 펩타이드의 보체 매개형 용해를 억제하는 능력에 의해 확인되었다.
예를 들어, FcR 결합은 조혈 세포를 포함하는 세포 상의 특수화된 세포 표면 수용체인 Fc 수용체 (FcR)와 (항체의) Fc 모이어티의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. Fc 수용체는 면역글로불린 초게열에 속하고, 면역 복합체의 식균작용에 의한 항체 코팅된 병원체의 제거, 및 항체 의존적 세포 매개형 세포독성 (ADCC; Van de Winkel, J. G., and Anderson, C. L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524)을 통해, 적혈구, 및 상응하는 항체로 코팅된 다양한 다른 세포 표적들 (예컨대, 종양 세포)의 용해를 모두 매개하는 것으로 밝혀졌다. FcR은 면역글로불린 부류에 대한 특이성으로 정의되며; IgG 항체에 대한 Fc 수용체들은 FcγR로 지칭하고, IgE의 경우 FcεR, IgA의 경우에는 FcαR 등으로 칭하며, 신생아 Fc 수용체는 FcRn이라 지칭한다. Fc 수용체 결합에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Ravetch, J. V., and Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492]; [Capel, P. J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34]; [de Haas, M., et al., J Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341]; 및 [Gessner, J. E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248]에 설명되어 있다.
천연 IgG 항체의 Fc 도메인에 의한 수용체 (FcγR)의 가교결합은 식균작용, 항체 의존적 세포 세포독성, 염증 매개체의 방출, 뿐만 아니라 면역 복합체 제거 및 항체 생산의 조절을 비롯한 광범위한 효과기 기능들을 촉발시킨다. 수용체 (예컨대, FcγR)의 가교결합을 제공하는 Fc 모이어티들도 본원에서 고려된다. 인간에 있어서, 현재까지 하기와 같은 3가지 부류의 FcγR에 대하여 특성이 분석되었다: (i) FcγRI (CD64)로서, 높은 친화도로 단량체성 IgG에 결합하고 대식세포, 단핵구, 호중구 및 호산구에서 발현되는 것인, FcγRI (CD64); (ii) FcγRII (CD32)로서, 중간 내지 낮은 친화도로 복합체화된 IgG에 결합하고, 특히 백혈구에서 광범위하게 발현되며, 항체 매개형 면역의 중추적인 역할을 하는 것으로 생각되고, FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIC로 분류될 수 있으며, 면역계에서 다른 기능들을 수행하지만, IgG-Fc에 대해 낮은 유사 친화도로 결합하고, 이러한 수용체들의 엑토도메인은 매우 상동성인 것인, FcγRII (CD32); 및 (iii) FcγRIII (CD16)로서, 중간 내지 낮은 친화도로 IgG에 결합하고, 하기의 2가지 형태로 발견되는 것인, FcγRIII (CD16): NK 세포, 대식세포, 호산구, 및 일부 단핵구와 T 세포에서 발견되고 ADCC를 매개하는 것으로 생각되는 FcγRIIIA; 및 호중구에서 많이 발현되는 FcγRIIIB.
FcγRIIA는 사멸에 관여하는 다수의 세포들 (예컨대, 대식세포, 단핵구, 호중구)에서 발견되어, 사멸 과정을 활성화시킬 수 있는 것으로 보인다. FcγRIIB는 억제 과정에서 역할을 하는 것으로 보이며, B 세포, 대식세포와 비만 세포 및 호산구에서 발견된다. 중요한 점은, 모든 FcγRIIB 중 75%가 간에서 발견되는 것으로 밝혀졌다는 것이다 (Ganesan, L. P. et al., 2012: “FcγRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes,” Journal of Immunology 189: 4981-4988). FcγRIIB는 LSEC라고 불리는 간 사인형 내피세포 (Liver Sinusoidal Endothelium)와 간의 쿠퍼 (Kupffer) 세포에서 풍부하게 발현되며, LSEC는 작은 면역 복합체 제거의 주요 부위이다 (Ganesan, L. P. et al., 2012: FcγRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes. Journal of Immunology 189: 4981-4988).
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 FcγRIIb에 결합하기 위한 Fc 모이어티, 특히 Fc 영역, 예를 들어 IgG 유형 항체를 포함한다. 나아가, 문헌 [Chu, S. Y. et al., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933]에 기술된 바와 같이 돌연변이 S267E 및 L328F를 도입함으로써 FcγRIIB 결합을 향상시키기 위해 Fc 모이어티를 유전자 조작하는 것도 가능하다. 이로써, 면역 복합체들의 제거가 향상될 수 있다 (Chu, S., et al., 2014: Accelerated Clearance of IgE In Chimpanzees Is Mediated By Xmab7195, An Fc-Engineered Antibody With Enhanced Affinity For Inhibitory Receptor FcγRIIb. Am J Respir Crit, American Thoracic Society International Conference Abstracts). 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 특히 문헌 [Chu, S. Y. et al., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933]에 기재된 바와 같이 돌연변이 S267E 및 L328F를 사용하여 유전자 조작된 Fc 모이어티를 포함한다.
B 세포에서, FcγRIIB는 추가의 면역글로불린 생산을 억제하고, 예를 들어 IgE 부류로의 동형 스위칭도 억제하는 기능을 하는 것으로 보인다. 대식세포에서, FcγRIIB는 FcγRIIA를 통해 매개되는 식균작용을 억제하는 것으로 생각된다. 호산구 및 비만 세포에서, 상기 B형은 상기 세포들의 개별 수용체에 대한 IgE의 결합을 통해 이러한 세포들의 활성화를 억제하는데 도움을 줄 수 있다.
FcγRI 결합과 관련하여, E233-G236, P238, D265, N297, A327 및 P329 중 적어도 하나의 천연 IgG에서의 변형은 FcγRI에 대한 결합을 감소시킨다. 상응하는 위치 IgG1 및 IgG4로 치환된 233 내지 236번 위치의 IgG2 잔기들은 FcγRI에 대한 IgG1 및 IgG4의 결합을 103배로 감소시키고 항체 민감성 적혈구에 대한 인간 단핵구 반응을 제거하였다 (Armour, K. L., et al. Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).
FcγRII 결합과 관련하여, FcγRIIA에 대한 감소된 결합은, 예를 들어 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 및 K414 중 적어도 하나의 IgG 돌연변이의 경우에 발견된다.
인간 FcγRIIA의 2가지 대립형질 형태는, IgG1 Fc에 고친화도로 결합하는 "H131" 변이체와 저친화도로 IgG1 Fc에 결합하는 "R131" 변이체가 있다. 예컨대, 문헌 [Bruhns et al., Blood 113:3716-3725 (2009)]을 참조한다.
FcγRIII 결합과 관련하여, FcγRIIIA에 대한 감소된 결합은, 예를 들어 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y236, A327, K338 및 D376 중 적어도 하나의 돌연변이의 경우에 발견된다. Fc 수용체에 대한 인간 IgG1의 결합 부위 맵핑, 상기 언급된 돌연변이 부위들, 및 FcγRI와 FcγRIIA에 대한 결합을 측정하는 방법들에 대해서는, 문헌 [Shields, R. L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604]에 설명되어 있다.
인간 FcγRIIIA의 2가지 대립형질 형태는, IgG1 Fc에 저친화도로 결합하는 "F158" 변이체와 고친화도로 IgG1 Fc에 결합하는 "V158" 변이체가 있다. 예컨대, 문헌 [Bruhns et al., Blood 113:3716-3725 (2009)]을 참조한다.
FcγRII에 대한 결합과 관련하여, 천연 IgG Fc의 두 영역, 즉 (i) IgG Fc의 하부 경첩 부위, 특히 아미노산 잔기 L, L, G, G (234 내지 237, EU 넘버링) 및 (ii) IgG Fc의 CH2 도메인의 인접 영역, 특히 예를 들어 P331의 영역에서 하부 경첩 영역에 인접한 상부 CH2 도메인의 루프 및 가닥은 FcγRII와 IgG 사이의 상호작용에 관여하는 것으로 보인다 (Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318). 또한, FcγRI는 IgG Fc 상의 동일한 부위에 결합하는 것으로 보이는 한편, FcRn과 단백질 A는 CH2-CH3 계면에 있는 것으로 보이는 IgG Fc 상의 서로 다른 부위에 결합한다 (Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318).
또한, (예를 들어, 돌연변이(들)를 포함하지 않는 기준 Fc 모이어티 또는 이를 함유하는 항체와 비교하였을 때) 하나의 (즉, 하나 이상의) Fcγ 수용체에 대한 본 발명의 Fc 모이어티의 결합 친화도를 증가시키는 돌연변이들도 고려된다. 예컨대, 문헌 [Delillo and Ravetch, Cell 161(5):1035-1045 (2015)] 및 [Ahmed et al., J. Struc. Biol. 194(1):78 (2016)]을 참조하며, 여기의 Fc 돌연변이 및 기술들은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 개시된 임의의 실시형태에서, 결합 단백질은 G236A; S239D; A330L; 및 I332E; 또는 이들 중 임의의 2개 이상을 포함하는 조합; 예컨대 S239D/I332E; S239D/A330L/I332E; G236A/S239D/I332E; G236A/A330L/I332E (본원에서 "GAALIE"로도 지칭함); 또는 G236A/S239D/A330L/I332E로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 Fc 모이어티는 S239D를 포함하지 않는다.
특정 실시형태에서, 상기 Fc 모이어티는 FcRn 결합에 대한 결합에 관여하는 Fc 모이어티의 적어도 일부를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 Fc 모이어티는 (예컨대, 약 6.0의 pH에서) FcRn에 대한 결합 친화도를 개선하는 (예컨대, 결합을 향상시키는) 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 일부 실시형태에서는, 이에 의해 해당 Fc 모이어티를 포함하는 분자의 생체내 반감기를 (예를 들어, 다른 것들은 동일하지만 변형(들)을 포함하지 않는 기준 Fc 모이어티 또는 항체에 비해) 연장시킨다. 특정 실시형태에서, 상기 Fc 모이어티는 IgG Fc를 포함하거나 그로부터 유래되고, 반감기 연장 돌연변이는 하기들 중 임의의 하나 이상을 포함한다: M428L; N434S; N434H; N434A; N434S; M252Y; S254T; T256E; T250Q; P257I Q311I; D376V; T307A; E380A (EU 넘버링). 특정 실시형태에서, 반감기 연장 돌연변이는 M428L/N434S (본원에서 "MLNS"로도 지칭함)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 반감기 연장 돌연변이는 M252Y/S254T/T256E를 포함한다. 특정 실시형태에서, 반감기 연장 돌연변이는 T250Q/M428L을 포함한다. 특정 실시형태에서, 반감기 연장 돌연변이는 P257I/Q311I를 포함한다. 특정 실시형태에서, 반감기 연장 돌연변이는 P257I/N434H를 포함한다. 특정 실시형태에서, 반감기 연장 돌연변이는 D376V/N434H를 포함한다. 특정 실시형태에서, 반감기 연장 돌연변이는 T307A/E380A/N434A를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 치환 돌연변이 M428L/N434S를 포함하는 Fc 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합 단백질은 치환 돌연변이 G236A/A330L/I332E를 포함하는 Fc 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 G236A 돌연변이, A330L 돌연변이 및 I332E 돌연변이 (GAALIE)를 포함하고, S239D 돌연변이를 포함하지 않는 (예컨대, 239번 위치에 천연 S를 포함하는) (예컨대 IgG) Fc 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 치환 돌연변이: M428L/N434S 및 G236A/A330L/I332E를 포함하고, 임의로 S239D를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 치환 돌연변이: M428L/N434S 및 G236A/S239D/A330L/I332E를 포함하는 Fc 모이어티를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 하기를 포함한다: 본원 및/또는 PCT 공보 WO 2017/060504호에 개시된 예시적인 항-HBV 항체들 [항체 HBC34, HBC34-V7, HBC34-V23, HBC34-V31, HBC34-V32, HBC34-V33, HBC34-V34, HBC34-V35, 경쇄의 40번 위치에서 치환 돌연변이 (예컨대, 천연 시스테인의 알라닌, 세린 등으로의 치환)를 포함하는 HBC 항체들의 본원에 개시된 변이체들 및 HBC24 포함] 중 어느 하나에 따른 CDR 및/또는 가변 도메인 및/또는 중쇄 및/또는 경쇄; 및 G236A 돌연변이, A330L 돌연변이 및 I332E (GAALIE) 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티로서, 상기 Fc 모이어티가 임의로 M428L/N434S (MLNS) 돌연변이를 추가로 포함하는 것인, Fc 모이어티. 특정 실시형태에서, 상기 Fc 모이어티는 S239D를 포함하지 않는다.
특정 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 34에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 35 또는 66에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 서열번호 36에 따른 CDRH3 아미노산 서열, 서열번호 37에 따른 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 38 또는 39에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 서열번호 58 또는 40에 따른 CDRL3 아미노산 서열; 및 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 Fc 모이어티는 S239D 돌연변이를 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 상기 Fc 모이어티는 MLNS 돌연변이를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 41 또는 67 중 어느 하나에 따른 중쇄 가변 도메인 (VH) 아미노산 서열 및 서열번호 42, 59, 65, 89, 90 및 111 내지 120 중 어느 하나에 따른 경쇄 가변 도메인 (VL) 아미노산 서열; 및 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 Fc 모이어티는 MLNS 돌연변이를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 138 또는 91 또는 92에 따른 중쇄 아미노산 서열 및/또는 서열번호 93 또는 94 중 어느 하나에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 91에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 93에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 91에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 94에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 92에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 93에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 92에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 94에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 97에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 98에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 서열번호 99에 따른 CDRH3 아미노산 서열, 서열번호 100에 따른 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 100에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 서열번호 102에 따른 CDRL3 아미노산 서열; 및 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 Fc 모이어티는 MLNS 돌연변이를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 95에 따른 중쇄 가변 도메인 (VH) 아미노산 서열 및 서열번호 96에 따른 경쇄 가변 도메인 (VL) 아미노산 서열; 및 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 Fc 모이어티는 MLNS 돌연변이를 추가로 포함한다.
본 발명에 개시된 임의의 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, 기준 폴리펩타이드 (즉, GAALIE 돌연변이를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는, 결합 단백질일 수 있는 폴리펩타이드)에 비해 인간 FcγRIIa 및/또는 인간 FcγRIIIa에 대한 결합이 향상되었다.
특정 실시형태에서, 기준 폴리펩타이드는 (예컨대, 동일한 동형의) 야생형 Fc 모이어티이거나 하나 이상의 치환 돌연변이 (또는 삽입 또는 결실)를 포함하나, 단, 상기 치환 돌연변이가 GAALIE가 아니거나 또는 GAALIE를 포함하지 않는, Fc 모이어티인 Fc 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이 (및 임의로 다른 치환 돌연변이, 예컨대 MLNS)를 갖는 HBC34-V35 항체를 포함하고, 기준 폴리펩타이드는 (야생형 Fc 모이어티를 포함하는) HBC34-V35이다. 특정 실시형태에서, 기준 폴리펩타이드는 인간 FcγRIIa 및/또는 인간 FcγRIIIa에 대한 결합에 영향을 미치는 것으로 알려져 있거나 그러한 것으로 생각되는 치환 돌연변이를 포함하지 않는다.
폴리펩타이드 간의 결합, 예컨대 Fc 모이어티 (또는 이를 포함하는 결합 단백질)와 인간 Fcγ 수용체, 예컨대 인간 FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA 또는 인간 Fc FcγRIIB, 또는 보체 단백질, 예컨대 C1q 간의 결합은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정 또는 감지한다. 예를 들어, 생물층 간섭굴절측정법 (BLI) 분석은, 제1 관심대상 폴리펩타이드 (예컨대, GAALIE 돌연변이를 포함하는 HBC34v35) 및 센서 기질 상에 포획된 제2 관심대상 폴리펩타이드 (예를 들어, FcγRIIA (H131), FcγRIIA (R131), FcγRIIIA (F158), FcγRIIIA (V158) 또는 FcγRIIb) 간의 실시간 결합과 해리를 측정하기 위해 제조업체의 지침에 따라 Octet® RED96 (미국 캘리포니아주 프리몬트 소재의 ForteBio) 장비를 사용하여 수행할 수 있다.
특정 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, GAALIE 돌연변이를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 기준 폴리펩타이드에 비해서, 인간 FcγRIIA (H131), 인간 FcγRIIA (R131), 인간 FcγRIIIA (F158), 인간 FcγRIIIA (V158), 또는 이들의 임의의 조합에 대한 결합이 향상되었다. 특정 실시형태에서, 향상된 결합은, BLI 분석에서 기준 결합 단백질과 비교하였을 때, 신호 이동에 있어서 증가 (예컨대, 더 높은 피크 신호; 더 큰 결합 속도; 더 느린 해리 속도; 더 큰 곡선 아래 면적 중 하나 이상)에 의해 결정된다. 특정 실시형태에서, 상기 BLI 분석은 Octet® RED96 (미국 캘리포니아주 프리몬트 소재의 ForteBio) 장비의 사용을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 상기 BLI 분석은 항-펜타-태그 센서 상에 포획되어 상기 결합 단백질에 노출된, 태그된 인간 FcγR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 IgG Fab를 포함하고, 상기 BLI 분석은 상기 포획된 인간 FcγR을 항-IgG Fab 결합 단편의 존재 하에 상기 결합 단백질에 노출시켜 상기 Fab 단편을 통해 상기 결합 단백질을 가교결합시키는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, 기준 폴리펩타이드에 비해서 인간 FcγRIIA (H131), 인간 FcγRIIA (R131), 인간 FcγRIIIA (F158) 및/또는 인간 FcγRIIIA (V158)에 대한 결합이 향상되었는데, 여기서 상기 향상된 결합은 BLI 분석에서 기준 결합 단백질을 사용하여 관찰된 신호 이동보다 1.5, 2, 2.5, 3배 또는 그 이상의 신호 이동 (나노미터)을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, 기준 폴리펩타이드에 비해서 인간 FcγRIIA (H131), 인간 FcγRIIA (R131), 인간 FcγRIIIA (F158) 및 인간 FcγRIIIA (V158)에 대한 결합이 향상되었다.
본 발명의 개시된 임의의 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, 기준 폴리펩타이드에 비해 인간 FcγRIIB에 대한 결합이 감소되었다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, 예를 들어 BLI 분석에서 기저선에 대하여 통계적으로 유의한 신호 이동이 없는 것으로 결정된 바와 같이, 인간 FcγRIIB에 결합하지 않는다.
본 발명의 개시된 임의의 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, 기준 폴리펩타이드에 비해 인간 C1q (보체 단백질)에 대한 결합이 감소되었다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, BLI 분석에서 기저선에 대하여 통계적으로 유의한 신호 이동이 없는 것으로 결정된 바와 같이, 인간 C1q에 결합하지 않는다.
본 발명의 개시된 임의의 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, 인간 FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA 또는 양자 모두를 기준 폴리펩타이드 (즉, GAALIE 돌연변이를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 HbsAg 특이적 결합 단백질일 수 있는 폴리펩타이드)보다 더 큰 정도로 활성화시킨다. 특정 실시형태에서, 기준 폴리펩타이드는 야생형 Fc 모이어티이거나 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하나, 단, 상기 치환 돌연변이가 GAALIE가 아닌, Fc 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이 (및 임의로 다른 치환 돌연변이, 예컨대 MLNS)를 갖는 HBC34-V35 항체를 포함하고, 기준 폴리펩타이드는 야생형 Fc 모이어티를 갖는 HBC34-V35이다.
인간 FcγR의 활성화는 당업계에 공지된 방법들을 사용하여 측정 또는 검출될 수 있다. 예를 들어, 유효성이 잘 검증된, 시판중인 바이오리포터 분석은, (i) 관심대상 FcγR 및 (ii) NFAT 반응 요소의 제어 하에 있는 반딧불이 루시퍼라제 리포터를 안정적으로 발현하는 주르캇 효과기 세포 (Promega; 카탈로그 번호: G9798)의 존재 하에, HBsAg 특이적 결합 단백질을 재조합 HBsAg (Engerix B, 글락소스미스클라인)와 함께 항온배양시키는 단계를 수반한다. 세포 표면 발현 FcγR에 대한 Fc의 결합은 루시페라제 리포터 유전자의 NFAT 매개형 발현을 유도한다. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 Bio-GloTM 루시퍼라제 분석 시약 (Promega)을 사용하여 광도계 (예컨대, Bio-Tek)로 발광도를 측정한다. 활성화는 하기 공식을 사용하여 백그라운드에 대한 상대 발광 단위 (RLU)의 평균으로 나타낸다: (결합 단백질 (예컨대, mAb)의 농도 [x]에서의 RLU - 백그라운드의 RLU).
특정 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, 기준 폴리펩타이드보다 더 큰 정도로 인간 FcγRIIA (H131), 인간 FcγRIIA (R131), 인간 FcγRIIIA (F158) 및 인간 FcγRIIIA (V158)를 활성화시킨다. 특정 실시형태에서, 더 큰 정도의 활성화라고 하면, 본원에 기술된 바와 같은 발광 바이오리포터 분석을 사용하여 측정된 더 큰 피크 발광도 및/또는 더 넓은 곡선 아래 발광 면적을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, 기준 폴리펩타이드보다 더 큰 정도로 인간 FcγRIIA (H131), 인간 FcγRIIA (R131) 및 인간 FcγRIIIA (F158)를 활성화시키는데, 여기서 상기 더 큰 활성화 정도는 기준 결합 단백질을 사용하여 관찰된 피크 RLU보다 1.5, 2, 2.5, 3배 또는 그 이상 더 큰 피크 RLU를 포함한다.
본 발명에 개시된 임의의 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, 상술한 바와 같은 발광 바이오리포터 분석에서 통계적으로 유의미하고/유의미하거나 측정가능한 RLU이 없는 것으로 측정된 것과 같이, 인간 FcγRIIB를 활성화시키지 않는다.
본 발명의 개시된 임의의 실시형태에서, 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, HBsAg의 존재 하에 인간 자연 살해 (NK) 세포를 기준 폴리펩타이드보다 더 큰 정도로 활성화시킨다. 특정 실시형태에서, NK 세포의 활성화는 (예컨대, 유세포분석법에 의한) CD107a 발현에 의해 측정된다. 특정 실시형태에서, 상기 NK 세포는 V158/V158 동형접합성, F158/F158 동형접합체 또는 V158/F158 이형접합성 FcγRIIIa 유전자형을 포함하는 세포를 포함한다.
본 발명에 따른 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하는 임의의 결합 단백질은, 본원에 기재된 하기 임의의 하나 이상의 특징들을 수행하거나 보유할 수 있다: 예를 들어, 기준 폴리펩타이드와 비교하였을 때, 인간 FcγRIIA 및/또는 인간 FcγRIIIA에 대해 향상된 결합; 기준 폴리펩타이드와 비교하였을 때, 인간 FcγRIIB에 대해 감소된 결합 (및/또는 인간 FcγRIIB에 대한 결합 없음); 기준 폴리펩타이드와 비교하였을 때, 인간 C1q에 대해 감소된 결합 (및/또는 인간 C1q에 대한 결합 없음); 기준 폴리펩타이드보다 더 큰 정도로 FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA 또는 양자 모두를 활성화시킴; 인간 FcγRIIB를 활성화시키지 않음; 및/또는 HBsAg의 존재 하에 기준 폴리펩타이드 (예컨대, HBsAg에 특이적이고 GAALIE 돌연변이를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 항체)보다 인간 자연 살해 (NK) 세포를 더 큰 정도로 활성화시킴.
특정 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하고, (i) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 기준 폴리펩타이드와 비교하였을 때, 인간 FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA 또는 양자 모두에 대한 결합을 향상시켰고 (여기서 상기 인간 FcγRIIA는 임의로 H131 또는 R131이고/이거나, 상기 인간 FcγRIIIA는 임의로 F158 또는 V158임); (ii) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 기준 폴리펩타이드와 비교하였을 때, 인간 FcγRIIB에 대한 결합을 감소시켰으며; (iii) 인간 FcγRIIB에 결합하지 않고; (iv) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 기준 폴리펩타이드와 비교하였을 때, 인간 C1q에 대한 결합을 감소시켰으며; (v) 인간 C1q에 결합하지 않고; (vi) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 기준 폴리펩타이드보다 더 큰 정도로 FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA 또는 양자 모두를 활성화시키며 (여기서, 상기 인간 FcγRIIA는 임의로 H131 또는 R131이고/이거나, 상기 인간 FcγRIIIA는 임의로 F158 또는 V158임); (vii) 인간 FcγRIIB를 활성화시키지 않고; (viii) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 기준 폴리펩타이드보다 더 큰 정도로 HBsAg의 존재 하에 인간 자연 살해 (NK) 세포를 활성화시키며 (여기서, 상기 기준 폴리펩타이드는 임의로 HB Ag, 임의로 HBsAg에 결합하는 항체임); (ix) 약 12.75 ng/mL 내지 약 19.9 ng/mL, 또는 약 12.75 ng/mL 내지 약 12.84 ng/mL, 또는 약 12.79 ng/mL, 또는 약 16.22 ng/mL 내지 약 19.9 ng/mL, 또는 약 17.97 ng/mL의 HBsAg EC50을 가지고/가지거나, (b) 약 10.78 ng/mL 내지 약 13.72 ng/mL, 또는 약 10.78 ng/mL 내지 약 10.93 ng/mL, 또는 약 10.85 ng/mL, 또는 약 11.59 ng/mL 내지 약 13.72 ng/mL, 또는 약 12.61 ng/mL의 HBeAg EC50을 가지며 (여기서, 상기 HBV는 임의로 HBV 유전자형 D이고, 상기 EC50은 HepG2 세포에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 투여 후 7일째에 NTCP를 과발현하고 HBV에 감염된 HepG2 세포에 의해 분비된, HBsAg 또는 HBeAg를 각각 측정하여 시험관내에서 임의로 측정됨); (x) 약 10.43 ng/mL 내지 약 22.41 ng/mL, 또는 약 13.81 ng/mL 내지 약 16.56 ng/mL, 또는 약 15.12 ng/mL, 또는 약 12.24 ng/mL 내지 약 22.41 ng/mL, 또는 약 16.56 ng/mL, 또는 약 10.43 ng/mL 내지 약 20.08 ng/mL, 또는 약 14.47 ng/mL의 HBsAg EC50을 가지고/가지거나, (b) 약 10.39 ng/mL 내지 약 13.99 ng/mL, 또는 약 10.63 ng/mL 내지 약 10.66 ng/mL, 또는 약 10.64 ng/mL, 또는 약 10.39 ng/mL 내지 약 10.60 ng/mL, 또는 약 10.49 ng/mL, 또는 약 13.25 ng/mL 내지 약 13.99 ng/mL, 또는 약 13.61 ng/mL의 HBeAg EC50을 가지며 (여기서, 상기 HBV는 임의로 HBV 유전자형 D이고, 상기 EC50은 HepG2 세포에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 투여 후 7일째에 NTCP를 과발현하고 HBV에 감염된 HepG2 세포에 의해 분비된, HBsAg 또는 HBeAg를 각각 측정하여 시험관내에서 임의로 측정됨); (xi) HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 HBsAg 변이체에 결합할 수 있으며; (xii) HBsAg에 결합하고 G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 기준 항체 또는 항원 결합 단편과 비교하였을 때, HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 HBsAg 변이체에 대한 결합을 향상시켰고/향상시켰거나; (xiii) (a) 약 2.34 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 A의 HBV; (b) 약 2.22 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 B의 HBV; (c) 약 0.92 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 C의 HBV; (d) 약 1.10 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 D의 HBV; (e) 약 1.12 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 E의 HBV; (f) 약 1.93 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 F의 HBV; (g) 약 1.43 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 G의 HBV; 및/또는 (h) 약 1.93 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 H의 HBV를 중화할 수 있다 (여기서, 상기 EC50은 HBV 유전자형의 HBsAg를 발현하도록 유전자 조작된 재조합 HDV를 사용하여 임의로 측정됨).
대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 결합 단백질의 Fc 모이어티는 단백질 A 결합에 필요한 것으로 당업계에 공지된 적어도 일부를 포함할 수 있고/있거나; 본 발명의 항체의 Fc 모이어티는 단백질 G 결합에 필요한 것으로 당업계에 공지된 Fc 분자의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 보유된 기능은 HBsAg 및 HBVg의 제거를 포함한다. 따라서, 특정 실시형태에서, Fc 모이어티는 FcγR 결합에 필요한 것으로 당업계에 공지된 적어도 일부를 포함한다. 따라서, 상기 개괄한 바와 같이, Fc 모이어티는 적어도, (i) 천연 IgG Fc의 하부 경첩 부위, 특히 아미노산 잔기 L, L, G, G (234 내지 237, EU 넘버링), 및 (ii) 천연 IgG Fc의 CH2 도메인의 인접 영역, 특히 예를 들어 P331의 영역에서 상기 하부 경첩 영역에 인접한 상부 CH2 도메인의 루프 및 가닥, 예를 들어 P331 주변의 천연 IgG Fc의 상부 CH2 도메인의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속적인 아미노산의 영역들, 예컨대 천연 IgG Fc의 아미노산 320 내지 340 (EU 넘버링) 사이의 영역들을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 Fc 영역을 포함한다. 본원에 사용된 "Fc 영역"이라는 용어는 항체 중쇄의 2개 이상의 Fc 모이어티에 의해 형성된 면역글로불린의 일부를 지칭한다. 예를 들어, Fc 영역은 단량체성이거나, 또는 "단쇄" Fc 영역 (즉, scFc 영역)일 수 있다. 단쇄 Fc 영역들은 단일 폴리펩타이드 사슬 내에 결합된 (예를 들어, 인접한 단일 핵산 서열 내에 코딩된) Fc 모이어티들로 이루어져 있다. 예시적인 scFc 영역들은 WO 2008/143954 A2호에 개시되어 있으며, 본원에 참고로 포함된다. 상기 Fc 영역은 이량체성 Fc 영역이거나 이를 포함할 수 있다. "이량체성 Fc 영역" 또는 "dcFc"는 2개의 개별 면역글로불린 중쇄의 Fc 모이어티들 의해 형성된 이량체를 가리킨다. 상기 이량체성 Fc 영역은 2개의 동일한 Fc 모이어티들의 동종이량체 (예컨대, 자연 발생 면역글로불린의 Fc 영역) 또는 2개의 동일하지 않은 Fc 모이어티들의 이종이량체 [예컨대, 상기 이량체성 Fc 영역의 한 Fc 단량체는 다른 Fc 단량체에 존재하지 않는 적어도 하나의 아미노산 변형 (예: 치환, 결실, 삽입 또는 화학적 변형)을 포함하거나, 또는 한 Fc 단량체는 다른 단량체와는 달리 절단될 수 있음]일 수 있다.
특정 실시형태들은 서열번호 91 또는 서열번호 92 또는 서열번호 138에 따른 중쇄 (예컨대, VH-경첩-CH1-CH2-CH3) 및 서열번호 93 또는 서열번호 94에 따른 경쇄 (즉, VL-CL)를 갖는 항체 및 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 91에 따른 중쇄 및 서열번호 93에 따른 경쇄를 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 92에 따른 중쇄 및 서열번호 94에 따른 경쇄를 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 91에 따른 중쇄 및 서열번호 94에 따른 경쇄를 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 92에 따른 중쇄 및 서열번호 93에 따른 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 129에 따른 중쇄를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 138에 따른 중쇄, 및 임의로 서열번호 93 또는 94에 따른 경쇄를 포함하거나 이로 이루어진다. 이러한 서열들은 서열 목록에 제시되어 있다.
본 발명에 개시된 Fc 모이어티들은 동일하거나 상이한 부류 및/또는 하위부류의 Fc 서열 또는 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc 모이어티는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위부류의 면역글로불린 (예컨대, 인간 면역글로불린), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, Fc 영역의 Fc 모이어티는 동일한 부류 및 하위부류의 것이다. 그러나, Fc 영역 (또는 Fc 영역의 하나 이상의 Fc 모이어티)은 키메라성일 수도 있어서, 이로써 키메라성 Fc 영역은 서로 다른 면역글로불린 부류 및/또는 하위부류로부터 유래된 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이량체성 또는 단쇄 Fc 영역의 Fc 모이어티들 중 적어도 2개는 서로 다른 면역글로불린 부류 및/또는 하위부류로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이량체성 Fc 영역은 2개 이상의 서로 다른 동형 또는 하위부류의 서열; 예컨대: SEEDbody ("가닥 교환 유전자 조작된 도메인")을 포함할 수 있으며, 이에 대해서는 문헌 [Davis et al., Protein Eng. Des. Sel. 23(4):195 (2010)]을 참조한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 키메라성 Fc 영역은 하나 이상의 키메라성 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키메라성 Fc 영역 또는 모이어티는 제1 하위부류 (예컨대, IgG1, IgG2 또는 IgG3 하위부류)의 면역글로불린으로부터 유래된 하나 이상의 부분을 포함할 수 있는 한편, 상기 Fc 영역 또는 모이어티의 잔여부는 다른 하위부류의 것이다. 예를 들어, Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역 또는 모이어티는 제1 하위부류 (예컨대, IgG1, IgG2 또는 IgG4 하위부류)의 면역글로불린으로부터 유래된 CH2 및/또는 CH3 도메인, 및 제2 하위부류 (예컨대, IgG3 하위부류)의 면역글로불린 유래의 경첩 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 Fc 영역 또는 모이어티는 제1 하위부류 (예컨대, IgG4 하위부류)의 면역글로불린으로부터 유래된 경첩 및/또는 CH2 도메인, 및 제2 하위부류 (예컨대, IgG1, IgG2 또는 IgG3 하위부류)의 면역글로불린 유래의 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키메라성 Fc 영역은 제1 하위부류 (예컨대, IgG4 하위부류)의 면역글로불린 유래의 Fc 모이어티 (예컨대, 완전한 Fc 모이어티) 및 제2 하위부류 (예컨대, IgG1, IgG2 또는 IgG3 하위부류)의 면역글로불린 유래의 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 Fc 영역 또는 모이어티는 IgG4 면역글로불린 유래의 CH2 도메인 및 IgG1 면역글로불린 유래의 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 Fc 영역 또는 모이어티는 IgG4 분자 유래의 CH1 도메인과 CH2 도메인 및 IgG1 분자 유래의 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 Fc 영역 또는 모이어티는 항체의 특정 하위부류의 CH2 도메인의 일부, 예컨대 CH2 도메인의 EU 위치 292-340을 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc 영역 또는 모이어티는 IgG4 모이어티에서 유래된 CH2의 위치 292-340 및 IgG1 모이어티에서 유래된 CH2의 잔여부를 포함할 수 있다 (다르게는, CH2의 292-340이 IgG1 모이어티에서 유래되고, CH2의 잔여부가 IgG4 모이어티에서 유래될 수 있음).
또한, 본 발명의 임의의 항체, 항원 결합 단편 또는 Fc 영역 또는 모이어티가 임의의 동종형 및/또는 일배체형의 것일 수도 있다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 G 동종형은 문헌 [Jefferis and LeFranc, mAbs 1(4):1-7 (2009)]에 개시된 것들을 포함하며, 여기의 동종형 G1m (1(a); 2(x); 3(f); 및 17(z)); G2m (23(n)); G3m (21(g1); 28(g5); 11(b0); 5(b2); 13(b3); 14(b4); 10(b5); 15(s); 16(t); 6(c3); 24(c5); 26(u); 및 27(v)); A2m (1 및 2); 및 Km (1; 2; 및 3)과 일배체형, 생성된 아미노산 서열 및 이들의 조합은 본원에 참고로 포함된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체, 항원 결합 단편, 또는 Fc 영역 또는 모이어티는 IgG1 동종형 g1m17, k1을 포함한다.
또한, Fc 영역 또는 모이어티는 (추가로 또는 대안적으로), 예를 들어 키메라성 경첩 영역을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 상기 키메라성 경첩은, 예를 들어 부분적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 분자 (예컨대, 상부 및 하부 중간 경첩 서열) 및 부분적으로 IgG3 분자 (예컨대, 중간 경첩 서열)로부터 유래될 수 있다. 또 다른 예로서, Fc 영역 또는 모이어티는 부분적으로 IgG1 분자 및 부분적으로 IgG4 분자로부터 유래한 키메라성 경첩을 포함할 수도 있다. 또 다른 예로서, 상기 키메라성 경첩은 IgG4 분자 유래의 상부 및 하부 경첩 도메인 및 IgG1 분자 유래의 중간 경첩 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 키메라성 경첩은, 예를 들어 IgG4 경첩 영역의 중간 경첩 도메인에 EU 위치 228에 프롤린 치환 (Ser228Pro)을 도입하여 제조할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 키메라성 경첩은 EU 위치 233-236이 IgG2 항체 및/또는 Ser228Pro 돌연변이로부터 유래한 아미노산을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 경첩의 잔여 아미노산들은 IgG4 항체로부터 유래한 것이다 (예컨대, 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVAGP의 키메라성 경첩). 본 발명에 따른 항체의 Fc 모이어티에 사용될 수 있는 추가의 키메라성 경첩은 US 2005/0163783 A1호에 설명되어 있다.
본원에 개시된 결합 단백질의 일부 실시형태에서, Fc 모이어티 또는 Fc 영역은, 인간 면역글로불린 서열 (예컨대, 인간 IgG 분자 유래의 Fc 영역 또는 Fc 모이어티)로부터 유래한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 그러나, 폴리펩타이드는 또 다른 포유동물 종들에 유래한 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 영장류 Fc 모이어티 또는 영장류 결합 부위가 대상체의 폴리펩타이드에 포함될 수 있다. 다르게는, 하나 이상의 쥐과류의 아미노산이 Fc 모이어티 또는 Fc 영역에 존재할 수도 있다.
핵산 분자
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
표 4는 본 발명에 따른 예시적인 VH-, VL-, CH-, CL-, HC- 및 LC를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열들을 나타낸 것이다:
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
유전자 코드의 중복성으로 인해, 본 발명은 이러한 핵산 서열의 서열 변이체, 특히 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 이러한 서열 변이체도 포함한다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자는 서열번호 103 내지 110 및 130 내지 136 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%의 동일성을 공유하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 상기 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포에 의한 발현을 위해 코돈 최적화된다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 서열번호 103 내지 110 및 130 내지 136 중 어느 하나에 따른 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 103에 따른 VH-코딩 뉴클레오타이드 서열, 및 서열번호 105에 따른 VL-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 103에 따른 VH-코딩 뉴클레오타이드 서열, 및 서열번호 104에 따른 VL-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 108에 따른 VH-코딩 뉴클레오타이드 서열, 및 서열번호 109에 따른 VL-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한, 본원에서는 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 서열번호 103에 따른 VH-코딩 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 110에 따른 VL-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 코딩된 항체 또는 항원 결합 단편이 HBsAg의 항원 루프 영역에 결합하여 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스 감염을 중화시키는 것인, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드도 제공된다.
본원에 개시된 임의의 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 130에 따른 CH1-경첩-CH2-CH3-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/하거나, 서열번호 131에 따른 HC (VH-CH1-경첩-CH3-CH3)-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 132에 따른 CL-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/포함하거나, 서열번호 133에 따른 LC (VL-CL)-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 134에 따른 CL-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/포함하거나, 서열번호 135 또는 서열번호 136에 따른 LC (VL-CL)-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
벡터
본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는, 벡터, 예를 들어 발현 벡터들도 본 발명의 범위 내에 추가로 포함된다.
"벡터"라는 용어는 핵산 분자를 포함하는 작제물을 지칭한다. 본 발명의 내용에 있어서 벡터는 목적하는 핵산 서열을 도입하거나 보유하기에 적절하다. 이러한 벡터는 저장 벡터, 발현 벡터, 클로닝 벡터, 전달 벡터 등일 수 있다. 저장 벡터는 핵산 분자의 적절한 저장을 가능케 하는 벡터이다. 따라서, 벡터는, 예를 들어 본 명세서에 따른 목적한 항체 또는 이의 항체 단편에 상응하는 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "발현 벡터"는 적절한 숙주에서 핵산 분자의 발현을 유효하게 할 수 있는 적절한 제어 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 함유하는 DNA 작제물을 가리킨다. 이러한 제어 서열들로는, 전사를 실행하기 위한 프로모터 (예컨대 이종성 프로모터), 이러한 전사를 제어하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적절한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종료를 제어는 서열을 포함한다. 관심대상 핵산 분자의 전사에 기여하는 발현 벡터의 임의의 요소들은 벡터에 대해 이종성일 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 바이러스 또는 단순히 잠재적인 게놈 삽입물일 수도 있다. 일단 적절한 숙주 내로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제 및 기능할 수 있거나, 경우에 따라서는 게놈 자체 내로 통합될 수도 있다. 본 명세서에서, "플라스미드", "발현 플라스미드", "바이러스" 및 "벡터"는 서로 혼용하여 사용되는 경우가 많다.
클로닝 벡터는 일반적으로 핵산 서열을 벡터에 도입하는데 사용될 수 있는, 클로닝 부위를 포함하는 벡터이다. 클로닝 벡터는, 예를 들어 플라스미드 벡터 또는 박테리오파지 벡터일 수 있다.
전달 벡터는 핵산 분자를 세포 또는 유기체 내로 전달하는데 적합한 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명의 내용에서 벡터는, 예를 들어 RNA 벡터 또는 DNA 벡터일 수 있다. 벡터는 DNA 분자일 수 있다. 예를 들어, 본 출원에서 말하는 소위 벡터는 클로닝 부위, 선별 마커, 예컨대 항생제 내성 인자, 및 벡터의 증식에 적합한 서열, 예컨대 복제 기점을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 출원의 내용에서 벡터는 플라스미드 벡터이다. 이러한 특정 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 포함한다.
세포
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 발현하는 세포 ("숙주 세포"로도 칭함); 또는 본 발명에 따른 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포도 제공한다.
이러한 세포의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 진핵 세포, 예컨대 효모 세포, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포; 및 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 이러한 특정 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포주, 예컨대 CHO 세포 [예컨대, DHFR-CHO 세포 (Urlaub et al., PNAS 77:4216 (1980), CHO-KSV], 인간 배아 신장 세포 (예컨대, HEK293T 세포), PER.C6 세포, Y0 세포, Sp2/0 세포, NS0 세포, 인간 간세포, 예컨대 Hepa RG 세포, 골수종 세포 또는 하이브리도마 세포이다. 포유동물 숙주 세포주의 다른 예로는, 마우스 세르톨리 세포 (예컨대, TM4 세포); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 원숭이 신장 세포 (CV1); 인간 자궁경부암 세포 (HELA); 인간 폐세포 (W138); 인간 간세포 (Hep G2); 개과 신장 세포 (MDCK); 버팔로 랫트 간세포 (BRL 3A); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포를 포함한다. 또한, 항체 생산에 적절한 포유동물 숙주 세포주로는, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu,　Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003)]에 기술된 것들도 포함한다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포는 이. 콜라이와 같은 원핵 세포이다. 이. 콜라이와 같은 원핵 세포에서의 펩타이드의 발현은 잘 확립되어 있다 (예컨대, 문헌 [Pluckthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991)] 참조. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아 중에서 제조될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해서는, 예를 들어, 미국특허 5,648,237호; 5,789,199호; 및 5,840,523호를 참조한다.
본 발명의 결합 단백질을 발현하는데 유용한 곤충 세포들은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) Sf9 세포, 트리코프루시아 니 (Trichoplusia ni) BTI-TN5B1-4 세포, 및 스포도프테라 프루기페르다 SfSWT01 "MimicTM" 세포를 포함한다. 예컨대, 문헌 [Palmberger et al., J. Biotechnol. 153(3-4):160-166 (2011)]을 참조한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주들이 확인되었다.
사상균류 또는 효모와 같은 진핵 미생물도 단백질 코딩 벡터를 클로닝하거나 발현하기에 적합한 숙주이고, "인간화된" 글리코실화 경로를 가져, 일부 혹은 전부 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생성하는 진균 및 효모 균주를 포함한다. 문헌 [Gerngross,　Nat. Biotech.　22:1409-1414 (2004)]; [Li et al.,　Nat. Biotech.　24:210-215 (2006)]을 참조한다.
또한, 식물 세포도 본 발명의 결합 단백질을 발현하기 위한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, (예컨대, 미국특허 5,959,177호; 6,040,498호; 6,420,548호; 7,125,978호; 및 6,417,429호에 기술된) PLANTIBODIES™ 기법은 유전자이식 식물을 사용하여 항체를 생산한다.
일부 실시형태에서, 융합 단백질은 면역 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포, 또는 NK-T 세포 또는 이들의 임의의 하위유형에 의해 세포 표면에서 발현된다.
본 발명과 양립가능한 임의의 단백질 발현 시스템을 사용하여 개시된 결합 단백질을 생산할 수 있다. 적합한 발현 시스템으로는, 문헌 [Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Fernandez et al., 1999]에 기술된 유전자이식 동물들을 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포는 발현 벡터를 갖는 본 명세서에 따른 벡터로 형질감염될 수 있다. "형질감염"이라는 용어는 핵산 분자, 예컨대 DNA 또는 RNA (예컨대, mRNA) 분자를 세포 내로, 예컨대 진핵 세포 내로 도입하는 것을 지칭한다. 본 명세서의 내용에서, "형질감염"이라는 용어는 핵산 분자를 세포 내로, 예컨대 포유동물 세포를 비롯한 진핵 세포 내로 도입하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 방법들을 포함한다. 이러한 방법들로는, 예를 들어 전기천공법, 예컨대 양이온성 지질 및/또는 리포솜에 기반한 리포펙션, 인산칼슘 침전법, 나노입자 기반 형질감염, 바이러스 기반 형질감염, 또는 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민 등과 같은 양이온성 중합체를 기반으로 하는 형질감염을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 도입은 비바이러스성이다.
또한, 본 발명의 세포는, 예컨대 본 명세서에 따른 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키기 위한, 본 명세서에 따른 벡터로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염시킬 수 있다. 이러한 실시형태에서, 세포는 결합 단백질을 코딩하는 본원에 기재된 바와 같은 벡터로 안정적으로 형질감염된다. 다르게는, 세포는 본 명세서에 따른 결합 단백질을 코딩하는 본 발명에 따른 벡터로 일시적으로 형질감염될 수 있다. 본원에 개시된 임의의 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에 대해 이종성일 수 있다.
관련 양태에서, 본 발명은 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 생산하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 생산하기에 충분한 조건과 시간 하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 항체, 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질을 이종적 방식으로 발현하는 재조합 숙주 세포도 제공한다. 예를 들어, 세포는 그 항체가 전부 또는 일부 수득되었던 종들과는 다른 종들의 것일 수 있다 (예컨대, 인간 항체 또는 유전자 조작된 인간 항체를 발현하는 CHO 세포). 일부 실시형태에서, 숙주 세포의 세포 유형은 자연에서 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하지 않는다. 또한, 숙주 세포는 해당 항체 또는 항원 결합 단편의 천연 상태로 (또는 해당 항체 또는 항원 결합 단편이 유전자 조작되거나 유래된 모체 항체의 천연 상태로) 존재하지 않는 항체 또는 항원 결합 단편에 해독후 변형 (PTM; 예컨대, 글리코실화 또는 푸코실화)을 제공할 수도 있다. 이러한 PTM은 기능적 차이 (예컨대, 면역원성 감소)를 유도할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 숙주 세포에 의해 생성되는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 그 천연 상태의 항체 (또는 모체 항체)와 구별되는 하나 이상의 해독후 변형을 포함할 수 있다 (예를 들어, CHO 세포에 의해 생성된 인간 항체는, 인간으로부터 분리되고/분리되거나 천연 인간 B 세포 또는 형질 세포에 의해 생성되는 경우에, 해당 항체와는 구별되는 하나 이상의 해독후 변형을 포함할 수 있음).
항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질의 임의의 추가적인 특징들
본 발명의 항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질은, 예를 들어 치료 부위에 전달하기 위한 약물에 커플링되거나, 또는 관심대상 세포들을 포함하는 부위의 영상촬영을 용이하게 하기 위해 검출가능한 표지에 커플링될 수 있다. 항체를 약물 및 검출가능한 표지에 커플링시키는 방법은, 검출가능한 표지를 사용하여 영상촬영하는 방법들과 마찬가지로 당업계에 잘 알려져 있다. 매우 다양한 표지를 사용하여 표지된 항체들은 광범위하게 다양한 분석에 이용될 수 있다. 본 발명의 항체 (또는 항원 결합 단편 또는 융합 단백질)와 HBsAg, 특히 HBsAg의 항원 루프 영역 상의 관심대상 에피토프 간의 항체-항원 복합체 형성은, 해당 항체에 검출가능한 물질을 부착함으로써 용이하게 검출할 수 있다. 적절한 검출 수단으로는, 방사성핵종, 효소, 조효소, 형광체, 화학발광체, 색소원, 효소 기질 또는 보조인자, 효소 억제제, 보결 분자단 복합체, 자유 라디칼, 입자, 염료 등과 같은 표지의 사용을 포함한다. 적절한 효소의 예로는, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적절한 보결 분자단 복합체의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광성 물질의 예로는 루미놀을 들 수 있고; 생물발광성 물질의 예로는 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린을 포함하고; 적절한 방사성 물질의 예로는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다. 이러한 표지된 시약들은 방사선면역검정, 효소 면역검정, 예컨대 ELISA, 형광 면역검정 등과 같은 잘 알려진 다양한 분석법들에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 표지된 항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질은, 예를 들어 US 3,766,162호; US 3,791,932호; US 3,817,837호; 및 US 4,233,402호에 기술된 바와 같이 이러한 분석들에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은, 세포독소, 치료제 또는 방사성 금속 이온 또는 방사성 동위원소와 같은 치료 모이어티에 접합시킬 수 있다. 방사성 동위원소의 예로는, 이에 국한되지는 않지만, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 등을 포함한다. 이러한 항체 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변형하는데 사용될 수 있으며; 약물 모이어티는 고전적인 화학 치료제로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소와 같은 독소를 포함할 수 있다.
이러한 치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기술들은 익히 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256]; [ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653]; [Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985)]; ["Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316]; 및 [Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158]을 참조한다.
다르게는, 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질은 US 4,676,980호에 기재된 바와 같이 이종접합체를 형성하기 위해 제2 항체 또는 그의 항체 단편 (또는 제2 융합 단백질)에 접합시킬 수도 있다. 또한, 예를 들어 US 4,831,175호에 기재된 바와 같이, 해당 상세한 설명의 항체와 표지 간에 링커를 사용할 수도 있다. 항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질은, 예를 들어 US 5,595,721호에 기재된 바와 같이, 방사성 요오드, 인듐, 이트륨, 또는 당업계에 공지된 다른 방사성 입자로 직접 표지될 수도 있다. 치료는 예를 들어 WO00/52031호; WO00/52473호에 기술된 바와 같이, 동시에 또는 후속적으로 투여되는 접합 및 비접합된 항체, 항원 결합 단편 및/또는 융합 단백질을 사용하는 치료의 조합으로 이루어질 수도 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질은 고체 지지체에 부착시킬 수도 있다. 추가로, 본 발명의 항체, 이의 기능적 항체 단편 또는 융합 단백질은, 예를 들어 이들의 순환 반감기를 증가시키기 위해, 중합체에 대한 공유 접합에 의해 화학적으로 변형시킬 수도 있다. 중합체의 예들과 이들을 펩타이드에 부착시키는 방법들에 대해서는 US 4,766,106호; US 4,179,337호; US 4,495,285호 및 US 4,609,546호에 나타나 있다. 일부 실시형태에서, 중합체는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로부터 선택될 수 있다. PEG는 실온에서 물에 가용성이며, 일반식은 다음과 같다: R(O-CH2-CH2)nO-R (상기 식에서, R은 수소이거나, 또는 알킬 또는 알칸올기와 같은 보호기일 수 있음) 특정 실시형태에서, 상기 보호기는 1 내지 8개의 탄소를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 보호기는 메틸일 수 있다. 기호 n은 양의 정수이다. 한 실시형태에서, n은 1 내지 1,000이다. 또 다른 실시형태에서, n은 2 내지 500이다. 일부 실시형태에서, PEG의 평균 분자량은 1,000 내지 40,000, 2,000 내지 20,000 및 3,000 내지 12,000에서 선택된다. 또한, PEG는 하나 이상의 하이드록시기를 가질 수 있으며, 예를 들어 PEG는 말단 하이드록시기를 가질 수 있다. 예를 들어, 이것은 억제제 상의 유리 아미노기와 반응하도록 활성화되어 있는 말단 하이드록시기이다. 그러나, 반응기의 유형과 양은 본 명세서의 공유 접합된 PEG/항체를 달성하기 위해 다양할 수 있다는 점을 이해할 수 있을 것이다.
수용성 폴리옥시에틸화 폴리올도 본원에 기재된 항체 및 항원 결합 단편의 내용에서 이용될 수 있다. 이들은 폴리옥시에틸화 소르비톨, 폴리옥시에틸화 글루코스, 폴리옥시에틸화 글리세롤 (POG) 등을 포함한다. 한 실시형태에서, POG가 사용된다. 어떠한 특정 이론으로 국한시키고자하는 것은 아니지만, 폴리옥시에틸화 글리세롤의 글리세롤 백본이, 예를 들어 모노-, 디-, 트리글리세리드에서 동물과 인간에 자연적으로 발생하는 동일한 백본이기 때문에, 상기 분지는 체내에서 반드시 외래 제제로 간주되는 것은 아니다. POG는 PEG와 동일한 범위의 분자량을 가질 수 있다. 순환 반감기를 증가시키는데 사용할 수 있는 또 다른 약물 전달 시스템은 리포솜이다. 리포솜 전달 시스템을 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 다른 약물 전달 시스템들도 당업계에 공지되어 있는데, 예를 들어 문헌 [Poznansky et al. (1980)] 및 [Poznansky(1984)]에 언급되어 있다.
본 발명의 항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질은 정제된 형태로도 제공될 수 있다. 통상적으로, 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은 다른 폴리펩타이드들을 실질적으로 함유하지 않는 조성물 중에 존재할 것인데, 예를 들어 해당 조성물 중 90% 미만 (중량 기준), 통상적으로 60% 미만 및 보다 통상적으로 50% 미만이 다른 폴리펩타이드들로 구성된다.
본 발명의 항체, 융합 단백질 또는 항원 결합 단편은 인간이 아닌 (또는 이종성) 숙주, 예컨대 마우스에서 면역원성일 수 있다. 특히, 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은 인간 숙주가 아닌, 인간이 아닌 숙주에서 면역원성인 이디오토프 (idiotope)를 가질 수 있다. 특히, 인간에 사용하기 위한 본 발명의 이러한 항체들로는, 마우스, 염소, 토끼, 랫트, 비영장류 포유동물 등과 같은 숙주로부터 쉽게 분리할 수 없는 것들, 및 인간화 또는 제노-마우스로부터 일반적으로 수득될 수 없는 것들을 포함한다.
항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질의 제조
본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마 기술을 사용하는 단일클론 항체를 제조하는 일반적인 방법론은 잘 알려져 있다 (Kohler, G. and Milstein, C., 1975; Kozbar et al. 1983). 한 실시형태에서, WO2004/076677호에 기재된 대안적인 EBV 불멸화 방법이 사용된다.
한 실시형태에서, 항체는 WO 2004/076677호에 기재된 방법을 사용하여 제조된다. 이러한 방법들에서는, 항체를 생산하는 B 세포들을 EBV 및 다클론성 B 세포 활성화제를 사용하여 형질전환시킨다. 세포 증식 및 분화에 대한 추가의 자극제들을 형질전호나 단계를 수행하는 동안에 임의로 첨가하여 효율을 더 향상시킬 수 있다. 이러한 자극제들은 IL2 및 IL-15와 같은 사이토카인일 수 있다. 한 양태에서, IL-2는 불멸화의 효율을 더 개선하기 위해 불멸화 단계 동안 첨가되지만, 그 사용이 필수적인 것은 아니다. 다음으로, 이러한 방법들을 사용하여 생성된 불멸화 B 세포들은 당업계에 공지된 방법 및 이로부터 분리된 항체를 사용하여 배양시킬 수 있다.
항체를 제조하는 또 다른 방법은 WO 2010/046775호에 설명되어 있다. 이러한 방법에서는, 형질 세포들을 제한된 수로 배양하거나, 또는 마이크로웰 배양 플레이트에서 단일 형질 세포로 배양한다. 항체들을 형질 세포 배양물에서 분리할 수 있다. 또한, 형질 세포 배양물로부터, RNA를 추출하고 당업계에 공지된 방법을 사용하여 PCR을 수행할 수 있다. 항체의 VH 및 VL 영역을 RT-PCR (역전사효소 PCR)에 의해 증폭시키고, 시퀀싱하여, 발현 벡터 내로 클로닝시킨 후, 이를 HEK293T 세포 또는 다른 숙주 세포 내로 형질감염시킬 수 있다. 발현 벡터에서 핵산의 클로닝, 숙주 세포의 형질감염, 형질감염된 숙주 세포의 배양 및 생산된 항체의 분리는 당업자에게 공지된 임의의 방법들을 사용하여 수행될 수 있다.
항체는 필요하다면 여과, 원심분리, 및 HPLC 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 다양한 크로마토그래피 방법을 사용하여 추가로 정제할 수도 있다. 의약품 등급의 항체를 제조하는 기술들을 비롯한, 항체, 예컨대 단일클론 항체의 정제 기술들은 당업계에 잘 알려져 있다.
분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 본 명세서의 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 목적한 DNA 서열은 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 사용하여 완전히 또는 부분적으로 합성할 수도 있다. 부위 특이적 돌연변이 유발 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술들을 적절하게 사용할 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 융합 단백질 분자 또는 이들의 단편을 코딩하는 DNA 서열의 발현에 임의의 적절한 숙주 세포/벡터 시스템을 사용할 수도 있다. 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이 및 다른 미생물 시스템들은, 부분적으로, 항체 단편, 예컨대 Fab 및 F(ab')2 단편, 특히 Fv 단편 및 단쇄 항체 단편, 예를 들어 단쇄 Fv의 발현을 위해 사용할 수도 있다. 진핵생물, 예컨대 포유동물의 숙주 세포 발현 시스템들은, 완전한 항체 분자를 비롯한 더 큰 항체 분자들의 생산을 위해 사용될 수 있다. 적절한 포유동물 숙주 세포로는, 본원에 개시된 예시적인 숙주 세포와 세포주들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은, 본 명세서의 항체 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질을 발현시키기에 적절한 조건 하에, 본 발명의 핵산을 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 항체 분자를 분리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질 분자의 제조 방법도 제공한다.
항체 분자 또는 항체 단편은 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드만을 포함할 수 있으며, 이 경우 해당 숙주 세포를 형질감염시키기 위해서는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 서열만이 사용될 필요가 있다. 중쇄와 경쇄를 모두 포함하는 생성물의 제조를 위해, 세포주를 2개의 벡터, 즉 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 벡터와 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 다르게는, 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 서열들을 포함하는 단일 벡터를 사용할 수도 있다.
다르게는, 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 및 융합 단백질은 (i) 숙주 세포에서, 예컨대 본 명세서에 따른 벡터의 사용에 의해, 본 발명에 따른 핵산 서열을 발현시키는 단계, 및 (ii) 상기 발현된 목적 생성물을 분리시키는 단계에 의해 제조될 수 있다. 추가적으로, 상기 방법은 (iii) 상기 분리된 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함할 수도 있다. 형질전환된 B 세포들과 배양된 형질 세포들에 대하여, 목적한 특이성 또는 기능의 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 생산하는 것들을 스크리닝할 수 있다.
스크리닝은 임의의 면역검정, 예컨대 ELISA에 의해, 조직 또는 세포 (형질감염된 세포 포함)의 염색에 의해, 중화 분석에 의해, 또는 목적한 특이성 또는 기능을 확인하기 위해 당업계에 공지된 다수의 다른 방법들 중 한 방법에 의해 수행될 수 있다. 분석은, 예를 들어 단지 항원 결합 항체가 아닌 중화 항체를 선택하기 위해; 표적으로 삼은 세포의 특성, 예컨대 신호전달 캐스케이드, 이들의 모양, 이들의 증식 속도, 이들의 다른 세포에 영향을 미치는 능력, 다른 세포들 또는 다른 시약들 또는 조건의 변화에 의한 영향에 대한 반응, 이들의 분화 상태 등을 변화시킬 수 있는 항체를 선택하기 위해, 단순히 하나 이상의 항원에 대한 인식을 기반으로 하여 선택할 수 있거나, 목적한 기능을 추가로 기반으로 하여 선택할 수도 있다.
이후, 형질전환된 개별 B 세포 클론들은 양성으로 형질전환된 B 세포 배양물로부터 생산될 수 있다. 양성 세포들의 혼합물로부터 개별 클론들을 분리하기 위한 클로닝 단계는 한계 희석, 미세조작, 세포 분류에 의한 단일 세포 침착 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
배양된 형질 세포의 핵산은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 HEK293T 세포 또는 공지된 다른 숙주 세포들에서 분리, 클로닝 및 발현시킬 수 있다.
본원에 기재된 불멸화된 B 세포 클론들 또는 형질감염된 숙주 세포들은, 다양한 방식으로, 예컨대 단일클론 항체의 공급원으로서, 관심대상인 단일클론 항체를 코딩하는 핵산 (DNA 또는 mRNA)의 공급원으로서, 연구를 위해서 등으로 사용될 수 있다.
약제학적 조성물
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터 및/또는 본 발명에 따른 세포를 포함하는 약제학적 조성물도 제공한다.
약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제도 포함할 수 있다. 담체 또는 부형제가 투여를 용이하게 할 수는 있지만, 그 자체가 해당 조성물을 투여받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 유도해서는 안 된다. 독성이 있어서도 안된다. 적절한 담체는 크고, 천천히 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 리포솜, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 약제학적으로 허용가능한 담체는 활성 성분 또는 불활성 성분일 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 염, 예를 들어 무기산염, 예컨대 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염, 또는 유기산염, 예컨대 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염 및 벤조산염이 사용될 수 있다.
약제학적 조성물의 약제학적으로 허용가능한 담체는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조제들도 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체들은 해당 약제학적 조성물이 대상체에 의한 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제형화될 수 있게 해준다.
본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액인 주사제로 제조될 수 있다. 주사 전 액체 비히클에서의 용액 또는 현탁액에 적절한 고체 형태도 제조될 수 있다 (예컨대, 보존제를 함유하는 멸균수로 재구성하기 위한, Synagis™ 및 Herceptin™과 유사한 감압동결건조된 조성물). 조성물은, 예를 들어 연고, 크림 또는 분말과 같은 국소 투여용으로 제조될 수도 있다. 조성물은, 경구 투여를 위해, 예컨대 정제 또는 캡슐, 스프레이, 또는 (임의로 향미를 첨가한) 시럽으로 제조될 수 있다. 조성물은, 폐투여를 위해, 미세 분말 또는 스프레이를 사용하는, 예컨대 흡입기로 제조될 수 있다. 조성물은 좌약 또는 질좌약으로 제조될 수 있다. 조성물은, 예를 들어 비강, 귀 또는 안구 투여를 위해 점적제로 제조될 수 있다. 조성물은 배합 조성물이 대상체에게 투여되기 직전에 재구성될 수 있도록 설계된 키트 형태일 수도 있다. 예를 들어, 감압동결건조된 항체는 멸균수 또는 멸균 완충수와 함께 키트 형태로 제공될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물 중 활성 성분은 항체 분자, 항체 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체이고, 특히 조성물 중 활성 성분은 본원에 기술된 항체, 항체 단편, 융합 단백질 또는 이의 변이체 및 유도체이다. 이러한 이유로, 이는 위장관에서 분해되기 쉽다. 따라서, 조성물이 위장관을 사용하는 경로에 의해 투여되는 경우에, 해당 조성물은 분해로부터 항체를 보호하나 일단 위장관에서 흡수되었다면 항체를 방출하는 제제를 함유할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체에 대한 심도있는 논의는 문헌 [Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472]에서 살펴볼 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 5.5 내지 8.5의 pH를 가질 수 있고, 일부 실시형태에서 이는 6 내지 8일 수 있다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물의 pH는 약 7일 수 있다. 완충액을 사용하여 pH를 유지할 수 있다. 조성물은 무균 및/또는 무발열원일 수 있다. 조성물은 인간에 있어서 등장성일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 밀봉 용기에 밀봉하여 공급된다.
본 발명의 범위 내에는 여러가지 투여 형태로 존재하는 조성물들이 있는데; 그 형태로는, 이에 제한되지는 않지만, 예컨대 주사 또는 주입에 의해, 예를 들어 일시 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 적절 형태를 포함한다. 해당 제품이 주사 또는 주입용인 경우, 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 유화제의 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형제를 함유할 수 있다. 다르게는, 항체 분자는 적절한 멸균 액체와 함께 사용하기 전에 재구성을 위한 건조 형태일 수 있다. 비히클은 일반적으로, 화합물, 예컨대 약제학적 활성 화합물, 특히 본 명세서에 따른 항체를 저장, 수송 및/또는 투여하기에 적절한 물질인 것으로 이해한다. 예를 들어, 비히클은 약제학적 활성 화합물, 특히 본 명세서에 따른 항체를 저장, 수송 및/또는 투여하기에 적합한 생리학적으로 허용가능한 액체일 수 있다. 본 발명의 조성물은 일단 제제화되면 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 한 실시형태에서, 조성물은 포유동물, 예컨대 인간 대상체에 투여하는데 적당하다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은, 이에 제한되지는 않지만, 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 복강내, 척수강내, 뇌실내, 경피, 피부, 국소, 피하, 비강내, 장내, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 임의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이도 본 명세서의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어 경구 투여를 위해 정제, 캡슐 등으로, 국소 투여를 위해, 또는 주사용으로서, 예컨대 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있다. 또한, 주사 전 액체 비히클에서의 용액 또는 현탁액에 적절한 고체 형태도 이용될 수 있는데, 예컨대 해당 약제학적 조성물이 감압동결건조된 형태인 것이다.
주사, 예컨대 정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 고통 부위에서의 주사의 경우, 활성 성분은 발열원이 없고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태로 제공될 수 있다. 필요에 따라, 보존제, 안정화제, 완충제, 산화방지제 및/또는 기타 첨가제들도 포함될 수 있다.
개체에게 제공되는 것이 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 핵산 분자, 세포, 또는 본 발명에 따른 기타 약제학적으로 유용한 화합물이든 간에, 투여는 일반적으로 (경우에 따라) "예방적 유효량" 또는 "치료적 유효량" 또는 "유효량"으로 제공되는데, 이는 해당 개체에게 이익 (예컨대, 개선된 임상 결과; 질병과 관련된 증상의 경감 또는 완화; 증상의 발생 감소; 삶의 질 개선; 무병 상태 연장; 질병의 정도 감소; 질병 상태의 안정화; 질병 진행의 지연; 차도; 생존; 또는 통계적으로 유의미 방식으로 연장된 생존률)을 나타내기에 충분한 것이다. 실제 투여량, 투여 속도 및 투여 시간 경과는 치료할 대상의 성질과 중증도에 따라 달라질 것이다. 주사의 경우, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 예를 들어 사전 충전식 주사기로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적으로 허용가능한 조성물은, 이에 제한되지는 않지만, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하는 경구적으로 허용가능한 임의의 제형으로 경구 투여될 수도 있다. 경구용 정제의 경우, 통상적으로 사용되는 담체로는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제, 예컨대, 스테아린산마그네슘도 통상적으로 첨가된다. 캡슐 형태로의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제로는 락토스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 경구용 수성 현탁액이 필요한 경우, 활성 성분, 즉 상기 정의한 본 발명의 수송 탑재물 접합 분자를 유화제 및 현탁제와 혼합한다. 필요하다면, 특정 감미제, 풍미제 또는 착색제를 첨가할 수도 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은, 특히 치료의 표적이, 예컨대 피부 또는 임의의 다른 접근가능한 상피 조직의 질병을 비롯한 국소 적용으로 쉽게 접근가능한 부위 또는 장기를 포함하는 경우라면, 국소 투여될 수도 있다. 이러한 각 부위 또는 장기에 적절한 국소 제형들은 용이하게 제조된다. 국소 적용의 경우, 약제학적 조성물은 하나 이상의 담체에 현탁되거나 용해된, 본 발명의 약제학적 조성물, 특히 상기 정의한 그의 활성 성분을 함유하는 적절한 연고로 제형화될 수도 있다. 국소 투여를 위한 담체로는, 이에 제한되지는 않지만, 광유, 유동 파라핀, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화용 왁스 및 물을 포함한다. 다르게는, 약제학적 조성물은 적절한 로션 또는 크림으로 제형화될 수도 있다. 본 명세서의 내용에서, 적절한 담체는, 이에 제한되지는 않지만, 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물을 포함한다.
용량은 체중과 관련하여 나타낼 수 있다. 따라서, [g, mg 또는 다른 단위]/kg (또는 g, mg 등)으로 나타낸 용량은, 통상적으로 "체중"이라는 용어가 명시적으로 언급되어 있지 않더라도, "체중 kg (또는 g, mg 등) 당" [g, mg 또는 다른 단위]를 의미한다.
특정 실시형태에서, 1회 용량, 예컨대 일간, 주간 또는 월간 용량에서는, 약제학적 조성물 중 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 양은 1 g을 초과하지 않는다. 이러한 특정 실시형태에서, 상기 1회 용량은 500 mg, 250 mg, 100 mg 및 50 mg으로부터 선택된 용량을 초과하지 않는다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 조성물 또는 키트는 하기를 추가로 포함한다: (i) 폴리머라제 억제제로서, 임의로 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비어, 텔비부딘, 테노포비르, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 폴리머라제 억제제; (ii) 인터페론으로서, 임의로 IFN베타 및/또는 IFN알파를 포함하는 것인, 인터페론; (iii) 체크포인트 억제제로서, 임의로 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 체크포인트 억제제; (iv) 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제; 또는 (v) 상기 (i)-(iv) 중 임의의 조합. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기술된 조성물 또는 배합물을 포함하고, B형 간염 감염 및/또는 D형 간염 감염을 예방, 치료, 약화 및/또는 진단하기 위해 상기 성분에 대한 사용 설명서를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물 (예컨대, 항체, 항원 결합 단편, 숙주 세포, 핵산, 벡터 또는 약제학적 조성물)은 PD-1 억제제, 예를 들어 PD-1 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 피딜리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, MEDI0680 (구명칭은 AMP-514), AMP-224, BMS-936558 또는 이들의 임의의 조합과 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 PD-L1 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 BMS-936559, 더발루맙 (MEDI4736), 아테졸리주맙 (RG7446), 아벨루맙 (MSB0010718C), MPDL3280A 또는 이들의 임의의 조합과 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 LAG3 억제제, 예컨대 LAG525, IMP321, IMP701, 9H12, BMS-986016 또는 이들의 임의의 조합과 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 CTLA4의 억제제와 병용하여 사용된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 CTLA4 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 이필리무맙, 트레멜리무맙, CTLA4-Ig 융합 단백질 (예컨대, 아바타셉트, 벨라타셉트) 또는 이들의 임의의 조합과 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 B7-H3 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 에노블리투주맙 (MGA271), 376.96 또는 이들 모두와 병용하여 사용된다. B7-H3 항체 결합 단편은, 예를 들어 문헌 [Dangaj et al., Cancer Res. 73:4820, 2013]에 기술된 것과 같은 scFv 또는 이의 융합 단백질 뿐만 아니라, 미국 특허 9,574,000호 및 PCT 특허 공보 WO 201640724A1호 및 WO 2013/025779A1호에 기재된 것들일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 CD244의 억제제와 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 BLTA, HVEM, CD160의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합과 병용하여 사용된다. 항 CD-160 항체는, 예를 들어 PCT 공보 WO 2010/084158호에 설명되어 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 TIM3의 억제제와 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 Gal9의 억제제와 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 아데노신 신호전달의 억제제, 예컨대 유인체인 아데노신 수용체와 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 A2aR의 억제제와 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 KIR의 억제제, 예컨대 리릴루맙 (BMS-986015)과 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 억제성 사이토카인 (일반적으로, TGFβ 이외의 사이토카인) 또는 Treg 발달 또는 활성의 억제제와 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 IDO 억제제, 예컨대 레보-1-메틸 트립토판, 에파카도스타트 (INCB024360; Liu et al., Blood 115:3520-30, 2010), 엡셀렌 (Terentis et al. , Biochem. 49:591-600, 2010), 인독시모드, NLG919 (Mautino et al., American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; Apr 6-10, 2013), 1-메틸-트립토판 (1-MT)-티라-파자민 또는 이들의 임의의 조합과 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 아르기나제 억제제, 예컨대 N(오메가)-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME), N-오메가-하이드록시-노르-1-아르기닌 (노르-NOHA), L-NOHA, 2(S)-아미노-6-보로노헥산산 (ABH), S-(2-보로노에틸)-L-시스테인 (BEC) 또는 이들의 임의의 조합과 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 VISTA의 억제제, 예컨대 CA-170 (Curis, 미국 매사추세츠주 렉싱턴 소재)과 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 TIGIT의 억제제, 예컨대 COM902 (Compugen, 캐나다 온타리오주 토론토 소재), CD155의 억제제, 예컨대 COM701 (Compugen), 또는 이들 모두와 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 PVRIG, PVRL2 또는 이들 모두의 억제제와 병용하여 사용된다. 항-PVRIG 항체는, 예를 들어 PCT 공보 WO 2016/134333호에 설명되어 있다. 항-PVRL2 항체는, 예를 들어 PCT 공보 WO 2017/021526호에 설명되어 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 LAIR1 억제제와 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합과 병용하여 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 자극성 면역 체크포인트 분자의 활성을 증가시키는 제제 (즉, 작용제)와 병용하여 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 CD137 (4-1BB) 작용제 (예를 들어, 우렐루맙), CD134 (OX-40) 작용제 (예를 들어, MEDI6469, MEDI6383 또는 MEDI0562), 레날리도마이드, 포말리도마이드, CD27 작용제 (예를 들어, CDX-1127), CD28 작용제 (예를 들어, TGN1412, CD80 또는 CD86), CD40 작용제 (예를 들어, CP-870, 893, rhuCD40L 또는 SGN-40), CD122 작용제 (예를 들어, IL-2), GITR의 작용제 (예를 들어, PCT 특허 공보 WO 2016/054638호에 기재된 인간화된 단일클론 항체), ICOS (CD278)의 작용제 (예를 들어, GSK3359609, mAb 88.2, JTX-2011, Icos 145-1, Icos 314-8 또는 이들의 임의의 조합)과 병용하여 사용된다. 본원에 개시된 임의의 실시형태들에서, 방법은 전술한 것들 중 임의의 것을 포함하는 자극성 면역 체크포인트 분자의 하나 이상의 작용제를 단독으로 또는 임의의 조합으로 본 발명의 조성물과 함께 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은, 추가의 활성 성분과 동일한 약제학적 조성물 중에 존재할 수 있거나, 또는 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은 상기 제1 약제학적 조성물 중에 포함될 수 있고, 추가 활성 성분은 상기 제1 약제학적 조성물과는 다른 제2 약제학적 조성물 중에 포함될 수 있다.
용도
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편, 융합 단백질, 핵산, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물, 또는 키트의 (예컨대, 인간 대상체에서) (i) B형 간염 및/또는 D형 간염의 예방, 치료 또는 약화; 또는 (ii) B형 간염 및/또는 D형 간염의 진단에서의 사용 방법을 제공한다.
(예컨대, 시험관내, 생체외) 진단 방법은 항체, 항체 단편 (예컨대, 항원 결합 단편) 또는 융합 단백질을 샘플과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 샘플은 대상체, 예를 들어 비강, 누강, 침샘, 폐, 간, 췌장, 신장, 귀, 눈, 태반, 소화관, 심장, 난소, 뇌하수체, 부신, 갑상선, 뇌, 피부 또는 혈액에서 채취한 분리된 조직 샘플로부터 분리할 수 있다. 또한, 상기 진단 방법은 특히 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질과 샘플을 접촉시킨 후, 항원/항체 또는 항원/융합 단백질 복합체에 대한 검출을 포함할 수도 있다. 이러한 검출 단계는 일반적으로 벤치에서, 즉 인간 또는 동물의 신체와 접촉없이 수행한다. 검출 방법의 예들은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 ELISA (효소 결합 면역흡착 검정법)를 포함한다.
또한, 본 발명은, (a) B형 간염 및/또는 D형 간염의 예방, 치료 또는 약화를 위한 약제의 제조 또는 (b) B형 간염 및/또는 D형 간염의 진단에 있어서 (i) 본 발명에 따른 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 또는 이의 변이체 및 유도체, (ii) 본 발명에 따른 숙주 세포 (불멸화된 B 세포일 수 있음), (iii) 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터 또는 (iv) 본 발명의 약제학적 조성물의 용도도 제공한다.
또한, 본 발명은 B형 간염 및/또는 D형 간염의 예방 또는 치료용 약제로 사용하기 위한, 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질, 본 발명에 다른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물도 제공한다. 또한, 본 발명은 대상체의 치료 및/또는 대상체의 진단을 위한 약제의 제조에서 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질의 용도도 제공한다. 또한, 본 발명은 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 대상체 (예컨대, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법도 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 인간일 수 있다. 치료적 처치의 효능을 확인하는 한 방법은 해당 조성물의 투여 후 질병 증상을 모니터링하는 단계를 수반한다. 치료는 단회 용량 일정 또는 다회 용량 일정일 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 숙주 세포 (예컨대, 불멸화된 B 세포 클론, 또는 융합 단백질을 발현하는 T 세포, NK-T 세포 또는 NK 세포), 또는 약제학적 조성물은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 이러한 대상체는, 이에 제한되지는 않지만, 특히 B형 간염 및/또는 D형 간염에 걸릴 위험이 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체를 포함한다.
본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편, 융합 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 약제학적 조성물, 및 이들의 조합은 B형 간염 및/또는 D형 간염의 예방, 치료, 약화 및/또는 진단을 위한 키트에서도 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 B형 간염 감염 및/또는 D형 간염 감염을 예방, 치료, 약화 및/또는 진단하기 위해 상기 성분에 대한 사용 설명서를 추가로 포함한다. 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질에 결합할 수 있는 HBsAg의 항원 루프 영역의 에피토프는, 보호성 항-HBV 항체의 존재를 검출하거나 그 역가를 측정함으로써 해당 적용 절차의 효능을 모니터링하기 위해 키트에 사용될 수도 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물 또는 키트는 하기를 추가로 포함한다: (i) 폴리머라제 억제제로서, 임의로 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비어, 텔비부딘, 테노포비르, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 폴리머라제 억제제; (ii) 인터페론으로서, 임의로 IFN베타 및/또는 IFN알파를 포함하는 것인, 인터페론; (iii) 체크포인트 억제제로서, 임의로 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 체크포인트 억제제; (iv) 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제; 또는 (v) 상기 (viii)-(xii) 중 임의의 조합.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 만성 B형 간염 감염의 치료 또는 약화에 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은 (i) HBV 감염을 중화시키고, (ii) L-HBsAg (감염성 HBV 입자에 존재하는, 거대 HBV 외피 단백질)에 결합하여 HBV 바이러스의 확산을 방지하며, (iii) S-HBsAg에 결합하여 준바이러스 입자 (SVP)의 제거를 촉진하고/촉진하거나, (iv) 혈청전환, 즉 바이러스에 대한 활성 면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 특히 B형 간염으로 유발된 간부전을 이유로 간이식 후 B형 간염 (재)감염의 예방에도 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 면역화되지 않은 대상체에서 B형 간염의 방지/예방에 사용될 수도 있다. 이것은, 예를 들어 HBV에 (추정상) 우발적으로 노출된 경우이다 (노출후 예방법). "면역화되지 않은 대상체"라는 용어는, 백신 접종을 받은 적이 없어서 면역화되지 않은 대상체, 및 백신접종 후 면역 반응을 나타내지 않았던 (예컨대, 측정가능한 항-B형 간염 항체가 없는) 대상체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 혈액투석 환자에서 B형 간염의 예방에 사용된다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 신생아의 B형 간염 예방에 사용된다. 이러한 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 출생시 또는 출생후 가능한 빨리 투여될 수 있다. 상기 투여는 백신접종 후 혈청전환될 때까지 반복할 수 있다.
또한, 본 발명은 B형 간염 및/또는 D형 간염의 (예컨대, 시험관내, 생체외 또는 생체내) 진단에 있어서, 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질, 본 발명에 다른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 용도도 제공한다.
또한, 본 발명은, 분리된 혈액 샘플이 B형 간염 바이러스 및/또는 델타 간염 바이러스에 감염되었는지의 여부를 결정하는데 있어서, 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질, 본 발명에 다른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 용도도 제공된다.
상술한 바와 같이, 진단 방법은 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질을 샘플과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 샘플은 대상체, 예를 들어 비강, 누강, 침샘, 폐, 간, 췌장, 신장, 귀, 눈, 태반, 소화관, 심장, 난소, 뇌하수체, 부신, 갑상선, 뇌, 피부 또는 혈액에서 채취한 분리된 조직 샘플로부터 분리될 수 있다. 또한, 상기 진단 방법은 특히 항체, 항체 단편과 샘플을 접촉시킨 후, 항원/항체 복합체에 대한 검출을 포함할 수도 있다. 이러한 검출 단계는 일반적으로 벤치에서, 즉 인간 또는 동물의 신체와 접촉없이 수행한다. 검출 방법의 예들은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 ELISA (효소 결합 면역흡착 검정법)를 포함한다.
또한, 본 발명은 대상체에서 B형 간염 및/또는 D형 간염을 치료, 예방 및/또는 약화시키는 방법으로서, 상기 방법이 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법도 제공한다. 특정 실시형태에서, 방법은 하기들 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다: (vii) 폴리머라제 억제제로서, 임의로 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비어, 텔비부딘, 테노포비르, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 폴리머라제 억제제; (viii) 인터페론으로서, 임의로 IFN베타 및/또는 IFN알파를 포함하는 것인, 인터페론; (ix) 체크포인트 억제제로서, 임의로 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 체크포인트 억제제; (x) 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제; 또는 (xi) 상기 (vii)-(x) 중 임의의 조합.
일부 실시형태에서, B형 간염 감염은 만성 B형 간염 감염이다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 간이식을 받았던 적이 있다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 B형 간염에 면역화되어 있지 않다. 특정 실시형태에서, 상기 대상체는 신생아이다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 혈액투석을 받고 있거나 받았던 적이 있다.
또한, 본 발명은 간이식을 받았던 적이 있는 대상체에게 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 간이식을 받았던 적이 있는 대상체를 치료하는 방법도 제공한다.
또한, 본원에서는 항-B형 간염 및/또는 항-D형 간염 백신에서 정확한 입체구조형의 에피토프의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서, 상기 방법이 (i) 상기 백신을 본 발명의 어느 하나의 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 항원 및 항체를 포함하거나, 항원 및 항원 결합 단편을 포함하거나, 또는 항원 및 융합 단백질을 포함하는 복합체가 형성되었는지의 여부를 판단하는 단계를 포함하는 것인, 방법도 제공된다.
본원에 사용된 "백신"이라는 용어는, 일반적으로 적어도 하나 이상의 항원, 예컨대 면역원을 제공하는 예방적 또는 치료적 물질로 이해된다. 상기 항원 또는 면역원은 백신접종에 적합한 임의의 물질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 상기 항원 또는 면역원은 병원체, 예컨대 박테리아 입자, 바이러스 입자, 종양 (고체 또는 액체 종양 포함) 또는 기타 암 조직으로부터 유래될 수 있다. 상기 항원 또는 면역원은 신체의 후천성 면역반응 시스템을 자극하여 후천성 면역 반응을 제공한다. 특정 실시형태에서, "항원" 또는 "면역원"은 면역 시스템, 예컨대 후천성 면역반응 시스템에 의해 인식될 수 있고, 예컨대 후천성 면역 반응의 일부로서 항체 및/또는 항원 특이적 T 세포의 형성에 의해 항원 특이적 면역 반응을 유발시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항원은 MHC 복합체 (예컨대, MHC 클래스 I; MHC 클래스 II)에 의해 T 세포에 제시될 수 있는 펩타이드 또는 단백질일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 항원은 HBV 및/또는 HBD 항원; 예컨대, HBsAg 항원을 포함한다.
경우에 따라서는, 본원에 제공된 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 핵산, 세포, 조성물, 용도 및 방법의 요소들을 실시형태들 또는 실시예들과 관련하여 기재하거나 열거할 것이다. 그러나, 본원에 기술한 실시예들과 실시형태들을 다양한 방식으로 조합하여 추가적인 실시형태들을 만들 수 있음도 이해해야 할 것이다.
실시예
아래에, 본 발명의 다양한 실시형태들과 양태들을 예시하는 구체적인 실시예들을 제시한다. 그러나, 본 발명은 여기에 기술된 특정 실시형태들에 의해 범위가 한정되어서는 안된다.
실시예 1: 유전자 조작된 항체의 제조 및 시험
PCT 공보 WO 2017/060504호의 일부 HBC34 항체 변이체들을 분석하였더니, 경쇄 가변 영역의 40번 위치 (IMGT 넘버링)에서 쌍을 이루지 않고 있는 시스테인 아미노산이 있음이 밝혀졌는데, 이것이 잠재적인 장애를 의미한다. 임의의 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 쌍을 이루고 있지 않은 시스테인 잔기들은 잠재적으로 반응성이어서, 분자내 스크램블링 또는 분자간 이황화물 형성을 통해 응집을 유발할 수 있다. HBC34-V7의 변이체 (WO 2017/060504호)에 대하여, 경쇄 가변 영역의 40번 위치에 있는 시스테인 아미노산을 세린으로 치환 (이로써 "HBC34-V34" 생성) 또는 알라닌으로 치환 (이로써 "HBC34-V35" 생성)하는 유전자 조작을 실시하였다. 이러한 추가 변이체 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화되었으며, 항체들은 ExpiCHOTM 세포 (써모피셔) 중에서 IgG1 (g1m17, 1 동종형)으로 발현되었다. HBC34-V35의 VH 및 VL 도메인을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 103과 104에 제시되어 있다.
직접 항원 결합 ELISA를 사용하여 HBC34-V34 및 HBC34-V35가 항원에 결합하는 능력을 조사하였다. HBC34-V7을 비교기로 사용하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, HBC34-V34와 HBC34-V35는 모두 두 재조합 HBsAg 항원 ("adw", 상부 패널; "adr", 하부 패널)에 효과적으로 결합하였고, HBC34-V35는 모체 HBC34-V7과 매우 유사한 결합을 나타냈다.
상기 변이체 항체들에 대해서, 공지된 모든 HBsAg 유전자형들 ((A)-(J))에 대한 결합을 조사하였다. 간략히 설명하면, 인간 상피 세포 (Hep2 세포)들을 10개의 HBV 유전자형인 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J 각각의 HBsAg를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 일시적으로 형질감염된 투과성 세포들의 염색을 위해 모든 항체들을 다수의 농도에서 시험하였다. 형질감염시키고 2일 후, Hep2 세포들을 수거하여 고정시킨 후, HBC34 및 5개의 선택된 변이체로 면역염색하기 위해 사포닌으로 투과시켰다. HBC34-V7은 비교기로 포함시켰다. FlowJo 소프트웨어 (TreeStar)와 함께 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson) FACSCanto2TM (BD Biosciences)를 사용하여 형질감염된 세포들에 대한 항체의 결합을 분석하였다. 도 2a 내지 2j에 도시된 바와 같이, HBC34-V34와 HBC34-V35는 10개의 모든 HBV HBsAg 유전자형들을 인식하였다. HBC34-V35는 HBC34-V34보다 다소 강한 염색성을 나타내었다.
이러한 데이터는 항체 변이체인 HBC34-V34와 HBC34-V35가 HBC34-V7에 필적하는 수준으로 HBsAG를 광범위하게 인식하여 이에 결합한다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 2: 변형된 Fc 영역이 있는 항-HBsAg 항체는 항원에 효율적으로 결합한다
Fc 영역의 변형은 치료 항체에 이점을 제공할 수 있다. HBC34-V35는 야생형 Fc를 사용하거나, 또는 "MLNS" 돌연변이 (M428L/N434S)를 포함하는 Fc, 또는 "GAALIE" 돌연변이 (G239A/A330L/I332E)와 조합된 MLNS를 포함하는 Fc를 사용하여 IgG1로 발현시켰다. 각 작제물들을 2개의 개별 항원 결합 ELISA 실험에서 재조합 HBsAg (adw)에 대한 결합을 시험하였다. 3개 로트의 HBC34-v35 (야생형 Fc)를 시험하였다. 2개 로트의 HBC34-V35-MLNS 및 2개 로트의 HBC34-V35-MLNS-GAALIE를 시험하였다. HBC34v7 (1개 로트)을 비교기로서 시험하였다.
도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, 상기 도입된 Fc 돌연변이들은 HBC34-V35의 항원 결합 활성에 영향을 미치지 않았다. EC50 값은 다양한 작제물들과 두 실험들 간에 다소 편차가 있었으며, 일반적으로 낮았다.
HBsAg 유전자형 (A)-(J) 또는 HBsAg 변이체를 발현하는 EXPI293 세포에 대한, MLNS 또는 MLNS 및 GAALIE 돌연변이를 갖는 HBC34-V35의 결합을 평가하였다. 야생형 IgG1 Fc를 갖는 HBC34-V35를 비교기로서 사용하였다. HBsAg 유전자형에 대한 결합을 나타내는 데이터는 도 3c 내지 3h에 나타내었다. HBsAg 변이체에 대한 결합을 보여주는 데이터는 도 3i 내지 3r에 나타내었다.
실시예 3: 항체의 시험관내 중화 활성
HBC34, HBC34-V35, HBC34-V35-MLNS, HBC34-V35-MLNS-GAALIE의 중화 능력은, HBV에 감염된 NTCP를 발현하는 HepG2 세포 배양 상청액 중에서 HBsAg (A)와 HBeAg (B)의 수준을 측정하여 비교하였다. 데이터는 도 3s 내지 3v에 나타내었고, 두 독립적인 실험 중 한 실험의 평균±SD이다.
실시예 4: HDV 유사시스템에서 평가한 HBC34-V35 MLNS-GAALIE의 범유전자형 중화 능력
HBC34-V35-MLNS-GAALIE의 HBV 바이러스에 대한 중화 범위를 확인하기 위해서, 널리 유행한 8개의 인간 HBV 유전자형에 대해 HBC34-V35-MLNS-GAALIE를 사용하여 중화 분석을 수행하였다. 서로 다른 유전자형을 나타내는 HBV HBsAg를 발현하도록 유전자 조작된 D형 간염 바이러스 (HDV)를 이용하는 시험관내 시스템을 사용하였다. 간략히 설명하면, HBV와 HDV는 모두 동일한 외피 단백질을 공유하기 때문에, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과 NTCP를 통한 이들의 바이러스 진입 경로가 동일하고, HDV는 HBsAg 매개형 바이러스 진입을 연구하기 위한 모델 시스템으로 사용할 수 있다 (Tu 2018; Lempp 2016). 나아가, HDV를 서로 다른 HBV 유전자형의 HBsAg로 외피화/가성형태화한 후, 감염 연구에 사용할 수 있다 (Freitas 2014).
HBC34-V35-MLNS-GAALIE는 0.92 ng/mL (유전자형 C) 내지 2.34 ng/mL (유전자형 A) 범위의 유사한 EC50 값들로 시험된 모든 유전자형들에 대해 중화 능력을 나타내었다. 이러한 결과는 HBC34-V35-MLNS-GAALIE가 시험한 8개의 HBV 유전자형 모두에서 HBsAg를 운반하는 감염성 바이러스를 중화할 수 있음을 보여주는 것으로, HBC34-V35-MLNS-GAALIE의 생체내 범유전자형 중화 활성을 뒷받침하는 것이다 (도 4).
실시예 5: 생체내 모델에서 HB 항원의 제거 및 바이러스 진입 억제
인간 간세포를 이식한 면역 결핍 마우스를 사용하여 본 발명의 항-HBV 항체의 HBsAg 제거에 대한 효과를 시험하였다. 간략히 설명하면, 사전에 마우스 간세포를 효소적으로 파괴시킨 SCID 마우스에 1차 인간 간세포를 이식하였다. 상기 마우스는 T 세포와 B 세포가 결핍되어 있었다. 상기 모델은 진입, 확산, cccDNA 조절, 간세포 고유의 면역 반응 및 숙주 게놈으로의 바이러스 통합을 비롯하여 HBV 감염을 연구하는데 유용하다.
-28일째에 마우스당 1.0X107개의 바이러스 게놈으로 꼬리 정맥 주사를 통해 HBV 유전자형 C를 마우스에 접종하였다. HBV의 첫 측정 후 0일째의 치료. HBV에 감염된 마우스 (치료군 당 n=4)에게 PBS (대조군) 또는 HBC34-V35 (1, 5 또는 15 mg/kg i.p., 2x/주)를 투여하였다. 항원 결합 Fab 영역을 제외하고 항체를 쥐과류화시켰다.
연구를 진행하는 동안 내내 혈장과 혈청 샘플을 주기적으로 수집하여 바이러스 부하량, (PCR에 의한) HBV DNA 및 HB Ag (HBsAg, HBeAg, HBcrAg)를 측정하였다. 6주차에 마우스를 희생시켰다.
도 5 내지 8에 나타낸 것과 같이, 최고 용량의 HBC34-V35를 사용한 치료에서는 바이러스 부하량과 간세포로의 바이러스 진입이 감소되었다.
실시예 6: 시험관내 효과기 기능 연구
Fc가 변형된 HBC34 항체의 하기의 능력을 연구하기 위해 시험관내 연구를 수행하였다: (1) 인간 FcR 및 보체에 결합하는 능력; (2) FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIa를 활성화하는 능력; (3) ADCC를 촉진하고 인간 자연 살해 (NK) 세포를 활성화하는 능력. 사용된 시험 제품, 세포주 및 시약들은 하기 표 5 내지 7에 기재된 바와 같다. 본 실시예에서는 하기의 약어들이 사용된다: GLP = 우수 실험실 관리기준; ADCC = 항체 의존적 세포성 세포독성; ADCP = 항체 의존적 세포성 식균작용; Fc = 결정화가능 단편; HBsAg = B형 간염 표면 항원; mAb = 단일클론 항체; PBS = 인산염 완충 식염수; UHPL-SEC = 초고성능 액체 크기 배제 크로마토그래피; ATCC = 미국 세포균주은행; FcγRs = Fc 감마 수용체(들); CHO 세포 = 중국 햄스터 난소 세포; RLU = 상대 발광 단위; BLI = 생물층 간섭굴절측정법.
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실험 절차
인간 Fc 수용체에 대한 결합 측정
HBC34-V35-MLNS 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE의 인간 FcγR에 대한 결합을 Octet® 장비 (BLI, 생물층 간섭굴절측정계; ForteBio) 상에서 측정하였다. 간략히 설명하면, His 태그된 인간 FcγR [FcγRIIa 대립유전자 H131; FcγRIIa 대립유전자 R131; FcγRIIAa 대립유전자 F158; FcγRIIIa 대립유전자 V158; 및 FcγRIIb]을 2 ㎍/ml로 항-펜타-His 센서 상에 6분간 포획하였다. 다음으로, FcγR이 로딩된 센서를, (Fab 단편을 통해 인간 mAb를 가교하는데에) 특이적인 F(ab')₂단편인 1 ㎍/ml의 affiniPure F(ab')₂단편 염소 항-인간 IgG의 존재 하에 각각 2 ㎍/ml의 mAb를 함유하는 동역학 완충액 (pH 7.1)에 4분간 노출시킨 후, 추가로 4분간 동일한 완충액에서 해리 단계를 수행하였다 (플롯의 오른쪽 부분). 결합 및 해리 프로파일은 Octet® RED96 (ForteBio)을 사용하여 간섭 패턴의 변화로서 실시간으로 측정하였다. 용액 중 HBC34-V35-MLNS-GAALIE, HBC34-V35-MLNS, 또는 HBC34-V35의 고정화시킨 인간 FcRn에 대한 결합은 pH=6.0 또는 pH=7.4에서 Octet에 의해 실시간으로 측정하였다.
인간 보체 단백질 C1q에 대한 결합 측정
HBC34-V35-MLNS 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE의 인간 보체에 대한 결합을 Octet® 장비 (BLI, 생물층 간섭굴절측정계; ForteBio) 상에서 측정하였다. 간략히 설명하면, 항-인간 Fab (CH1 특이적) 센서를 사용하여, Fab 단편을 통해, HBC34-V35-MLNS 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE mAb의 전장 IgG1을 10 ㎍/ml로 10분간 포획하였다. 이후, IgG가 로딩된 센서를, 3 ㎍/ml의 정제된 인간 C1q를 포함하는 동역학 완충액 (pH 7.1)에 4분간 노출시킨 다음 (플롯의 왼쪽 부분), 동일한 완충액에서 추가로 4분간 해리 단계를 수행하였다 (플롯의 오른쪽 부분). 결합 및 해리 프로파일은 Octet® RED96 (ForteBio)을 사용하여 간섭 패턴의 변화로서 실시간으로 측정하였다.
전혈로부터 인간 NK 세포의 제조
제조업체의 지침에 따라 MACSxpress® NK 분리 키트를 사용하여 EDTA 전혈에서 NK 세포를 새로 분리하였다. 간략히 설명하면, 항응고된 혈액을 50 ml 튜브 중에서 15 ml의 NK 분리 혼합제와 혼합하고, 분당 약 12회전하는 회전자를 사용하여 실온에서 5분간 항온배양하였다. 그런 다음, 상기 튜브를 MACSxpress® 분리기의 자기장에 15분간 방치하였다. 상기 자성으로 표지된 세포들은 튜브의 벽에 부착되고 응집된 적혈구들은 바닥으로 침전된다. 이후, 상기 튜브가 MACSxpress® 분리기 안에 있는 동안 상청액에서 표적 NK 세포들을 수집하였다. NK 세포들을 원심분리하고, 증류수로 처리하여 잔류 적혈구들을 제거하고, 다시 원심분리하여 마지막으로 AIM-V 배지 중에 재현탁시켰다.
항체 의존성 NK 세포 사멸의 측정
MAb를 AIM-V 배지 중에서 100 ㎍/ml에서 0.001 ㎍/ml로 10배 단계 희석하였다. 표적 세포들 (PLC/PRF/5; MacNab, et al., British Journal of Cancer, 34(5), 1976)를 둥근 바닥 384-웰 플레이트에 23 ㎕의 웰당 7.5×103개의 세포로 첨가한 후, 단계 희석된 항체들을 각 웰에 첨가하고 (웰당 23 ㎕), 상기 항체/세포 혼합물을 실온에서 10분간 항온배양하였다. 항온배양 후, 인간 NK 세포를 23 ㎕의 웰당 7.5×104개의 세포 밀도로 첨가하여, 10:1의 효과기 대 표적 비율을 얻었다. 최대 용해율 (표적 세포와 23 ㎕의 3% Triton x-100 포함) 및 자발적 용해율 (항체 없이 표적 세포와 효과기 세포 포함)을 측정하는데 사용했던 대조군 웰도 포함시켰다. 플레이트들을 5% CO2로 37℃에서 4시간 동안 항온배양하였다. 세포 사멸은 제조업체의 지침에 따라 LDH 검출 키트를 사용하여 젖산 탈수소효소 (LDH) 방출을 측정하여 판단하였다. 간략히 설명하면, 플레이트를 400xg로 4분간 원심분리하고, 35 ㎕의 상청액을 평탄한 384-웰 플레이트로 옮겼다. LDH 시약을 준비하고 각 웰에 35 ㎕를 첨가하였다. 동역학 프로토콜을 사용하여, 490 nm 및 650 nm에서의 흡광도를 8분 동안 매 2분마다 한 번씩 측정하였다. 특이적 용해율은 아래 공식을 적용하여 측정하였다: (특이적 방출 - 자발적 방출) / (최대 방출 - 자발적 방출)×100.
항체 의존성 NK 세포 활성화의 측정
NK 세포의 활성화는 동형접합성의 고친화성 (V158 대립유전자) 및 저친화성 (F158 대립유전자) FcγRIIIa를 발현시키기 위해 사전전에 유전자형이 분석된 두 기증자로부터 갓 분리한 세포들을 사용하여 시험하였다. mAb의 단계 희석액 (AIM-V 배지 중에서 100 ㎍/ml에서 0.0001 ㎍/ml로 10배 단계 희석)을 NK 세포와 함께 4시간 동안 항온배양하였다. NK 세포의 활성화는, NK 세포 활성에 대한 기능적 마커로서 항-CD107a mAb (항-CD107 PE, BioLegend®, 1/35로 희석하여 사용)로 NK 세포를 염색하여, 유세포분석법에 의해 측정하였다.
인간 FcγRIIIa의 항체 의존성 활성화의 측정
HBC34-V35-MLNS 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE를 ADCC 분석 완충액에서 5 ㎍/ml에서 0.076 ㎍/ml로 4배 단계 희석하였다. 표적 항원 (Engerix B의 HBsAg, 글락소 스미스클라인)을 백색의 평판 바닥 96-웰 플레이트에 25 ㎕ 중 0.6 ㎍/ml로 첨가한 후, 단계 희석된 항체들을 각 웰에 첨가하고 (웰당 25 ㎕), 상기 항체/세포 혼합물을 실온에서 10분간 항온배양하였다. ADCC 생물검정을 위한 효과기 세포를 해동하여 25 ㎕의 웰당 7.5×104개의 세포 밀도로 첨가하였다 (최종 HBsAg 농도는 0.2 ㎍/ml였음). 플레이트의 항체 독립적 활성화 (HBsAg 및 효과기 세포를 포함하지만 항체는 포함하지 않음) 및 자발적 발광도 (ADCC 분석 완충액만 포함하는 웰)을 측정하는데 사용했던 대조군 웰들도 포함시켰다. 플레이트들을 5% CO2로 37℃에서 24시간 동안 항온배양하였다. 본 생물검정에서 인간 FcγRIIIa (V158 또는 F158 변이체)의 활성화는 루시페라제 리포터 유전자의 NFAT 매개형 발현을 유도한다. 제조업체의 지침에 따라 Bio-Glo-TM 루시퍼라제 분석 시약을 사용하여 광도계로 발광도를 측정하였다. 데이터 (즉, 특이적 FcγRIIIa 활성화)는 하기 공식을 사용하여 백그라운드에 대한 상대 발광 단위 (RLU)의 평균으로 나타낸다: (mAb의 농도 x에서의 RLU - 백그라운드의 RLU).
인간 FcγRIIa의 항체 의존성 활성화의 측정
HBC34-V35-MLNS 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE를 ADCP 분석 완충액에서 50 ㎍/ml에서 0.00013 ㎍/ml로 5배 단계 희석하였다. 표적 항원 (Engerix B의 HBsAg)을 백색의 평판 바닥 96-웰 플레이트에 25 ㎕ 중 0.6 또는 6 ㎍/ml로 첨가한 후, 단계 희석된 항체들을 각 웰에 첨가하고 (웰당 25 ㎕), 상기 항원/항체를 실온에서 25분간 항온배양하였다. FcγRIIa 활성화 생물검정을 위한 효과기 세포를 해동하여 25 ㎕의 웰당 50.0×104개의 세포 밀도로 첨가하였다 (최종 HBsAg 농도는 0.2 또는 2 ㎍/ml였음). 플레이트의 항체 독립적 활성화 (HBsAg 및 효과기 세포를 포함하지만 항체는 포함하지 않음) 및 자발적 발광도 (ADCP 분석 완충액만 포함하는 웰)을 측정하는데 사용했던 대조군 웰들도 포함시켰다. 플레이트들을 5% CO2로 37℃에서 23시간 동안 항온배양하였다. 본 생물검정에서 인간 FcγRIIa (H131 변이체)의 활성화는 루시페라제 리포터 유전자의 NFAT 매개형 발현을 유도한다. 제조업체의 지침에 따라 Bio-Glo-TM 루시퍼라제 분석 시약을 사용하여 광도계로 발광도를 측정하였다. 데이터 (즉, 특이적 FcγRIIa 활성화)는 하기 공식을 사용하여 백그라운드에 대한 상대 발광 단위 (RLU)의 평균으로 나타낸다: (mAb의 농도 x에서의 RLU - 백그라운드의 RLU).
인간 FcγRIIb의 항체 의존성 활성화의 측정
HBC34-V35-MLNS 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE를 ADCP 분석 완충액에서 100 ㎍/ml에서 0.00026 ㎍/ml로 5배 단계 희석하였다. 표적 항원 (Engerix B의 HBsAg)을 백색의 평판 바닥 96-웰 플레이트에 25 ㎕ 중 3 ㎍/ml로 첨가한 후, 단계 희석된 항체들을 각 웰에 첨가하고 (웰당 25 ㎕), 상기 항원/항체를 실온에서 15분간 항온배양하였다. FcγRIIb 활성화 생물검정을 위한 효과기 세포를 해동하여 25 ㎕의 웰당 75.0×104개의 세포 밀도로 첨가하였다 (최종 HBsAg 농도는 1 ㎍/ml였음). 플레이트의 항체 독립적 활성화 (HBsAg 및 효과기 세포를 포함하지만 항체는 포함하지 않음) 및 자발적 발광도 (ADCP 분석 완충액만 포함하는 웰)을 측정하는데 사용했던 대조군 웰들도 포함시켰다. 플레이트들을 5% CO2로 37℃에서 20시간 동안 항온배양하였다. 본 생물검정에서 인간 FcγRIIb의 활성화는 루시페라제 리포터 유전자의 NFAT 매개형 발현을 유도한다. 제조업체의 지침에 따라 Bio-Glo-TM 루시퍼라제 분석 시약을 사용하여 광도계로 발광도를 측정하였다. 데이터 (즉, 특이적 FcγRIIb 활성화)는 하기 공식을 사용하여 백그라운드에 대한 상대 발광 단위 (RLU)의 평균으로 나타낸다: (mAb의 농도 x에서의 RLU - 백그라운드의 RLU).
인간 간암 세포주 PLC/PRF/5에 대한 항체 결합의 측정
PLC/PRF/5 세포를 37℃에서 5분간 트립신 처리하고, 7 ml의 증식 배지 중으로 옮기고, 400xg, 4분, 4℃로 원심분리하고, PBS 중에서 4℃로 광범위하게 세척하였다. 일부 세포들은 4% 포름알데히드로 고정시키고 (4℃에서 20분); 나머지 세포들은 고정시킨 후, 투과 완충액으로 투과시켰다 (4℃에서 20분). 세포 펠릿을 2.64 ml의 세척 완충액 (세포 고정) 또는 투과 완충액 (세포 고정 및 투과) (표 7) 중에 재현탁하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 웰당 200 ㎕로 (웰당 100,000개의 세포에 해당)에 투입하였다. 상기 플레이트를 400g, 4분, 4℃로 원심분리하였다. 10 ㎍/ml의 최종 농도에서 시작하는 시험 항체들의 1:5 5-포인트 단계 희석액을 세포 함유 웰에 첨가하고 얼음 위에서 30분간 항온배양하였다. 세척 완충액 (세포 고정) 또는 투과 완충액 (세포 고정 및 투과) 중에서 4℃, 400xg, 4분으로 2회 세척 후, 웰당 Alexa Fluor®647 표지된 2차 항체 (표 7) 50 ㎕를 세포에 첨가하고 얼음 위에서 20분간 항온배양하였다. 세포들을 세척 완충액 (세포 고정) 또는 투과 완충액 (세포 고정 및 투과)으로 2회 더 세척하고, 웰당 200 ㎕의 세척 완충액 (세포 고정) 또는 투과 완충액 (세포 고정 및 투과) 중에 재현탁시킨 후, 신호 (MFI, 평균 형광 강도)를 세포형광측정기 (BD FACSCantoTM II)로 정량하였다.
결과
생체내 HBV를 중화하는데 있어 직접적인 항바이러스 기전이 중요하다. 면역 세포 상에서 Fc 영역과 Fc 감마 수용체(FcγR)의 상호작용에 의해 매개되는 간접적인 Fc 의존성 작용 기전도 생체내 효능 및 내인성 면역 반응을 매개하는데 중요한 기여를 할 수 있다. FcγR 의존성 기전은, FcγR에 대한 결합 뿐만 아니라 인간 FcγR의 항체 의존성 활성화를 측정함으로써 시험관 내에서 평가할 수 있다 (Hsieh, Y.-T., et al., Journal of Immunological Methods, 441(C), 56-66. doi.org/10.1016/j.jim.2016.12.002). FcRn과 보체에 결합하는 항체의 능력은 다른 관심대상 요인이다.
한 세트의 실험에서, HBC34-V35-MLNS 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE를, 생물층 간섭굴절측정계 (BLI Octet® System, ForteBio)를 사용하여, 이들의 인간 FcγR의 전체 세트 (FcγRIIIa V158 및 F158 대립유전자, FcγRIIa H131 및 R131 대립유전자 및 FcγRIIb)에 결합하는 능력을 함께 비교하였다. 도 9a 내지 9e에 도시된 바와 같이, MLNS-GAALIE 돌연변이를 포함하는 Fc는 FcγR과의 상호작용을 변형시켰고; 특히, MLNS만을 포함하는 Fc와는 대조적으로 상기 두 돌연변이를 모두 포함하는 Fc는 FcγRIIIa 및 FcγRIIa에 대한 결합이 향상되었고, FcγRIIb에 대한 결합이 감소되었다.
도 9f에 나타난 바와 같이, MLNS Fc 돌연변이를 포함하는 항체는, 야생형 Fc를 갖는 항체에 비해 pH 6.0에서 FcRn에 대한 결합이 증가하였으나, pH 7.4에서 FcRn에 대한 결합은 거의 또는 전혀 측정할 수 없었는데, 이는 야생형 Fc를 갖는 항체와 유사한 것이다.
또한, 생물층 간섭굴절측정계에 의해 측정된 바와 같이, C1q에 대한 HBC34-V35-MLNS-GAALIE의 결합도 제거되었다 (도 10).
HBC34-V35-MLNS 및 HBC34-V35-MLNS-GAALIE도 세포 기반 리포터 생물검정을 사용하여 이들의 인간 FcγRIIIa 및 FcγRIIa를 활성화하는 능력에 대해 시험하였다. 이러한 분석은 NFAT 매개형 루시페라제 리포터로 유전자 조작된 주르캇 세포를 활용하여 인간 FcγR의 활성화를 나타내었다. HBC34-V35-MLNS가 HBsAg의 존재 하에 인간 FcγRIIIa 및 FcγRIIa를 제대로 활성화하지 않거나 활성화하지 못했던 반면, HBC34-V35-MLNS-GAALIE는 시험된 모든 FcγR에 대해 용량 의존적 활성화를 나타냈다 (도 11a, 11b, 12a-12b). HBC34-V35-MLNS-GAALIE는 100 ㎍/ml에서 시험했을 경우에도 FcγRIIb를 활성화하지 않았다 (도 13a-13b).
이형접합성의 고친화성 (V158) 및 저친화성 (F158) FcγRIIIa (F/V)를 발현하기 위해 사전에 유전자형을 분석한 한 기증자의 인간 말초혈 단핵 세포에서 분리된 자연 살해 세포 (NK)를 사용하여 ADCC 활성도 측정하였다. 분리된 NK 세포를 사용하여 HBC34-V35; HBC34-V35-MLNS; HBC34-V35-MLNS-GAALIE; 또는 다른 mAb (17.1.41, HBsAg의 항원 루프 상의 또 다른 에피토프를 표적으로 삼음; 문헌 [Eren, R., et al., Hepatology, doi.org/10.1053/jhep.2000.9632]; [Galun, E., et al., Hepatology, doi.org/10.1053/jhep.2002.31867] 참조)에 노출시 간암 세포주 PLC/PR/5의 사멸을 측정하였다. HBsAg 특이적 mAb인 HBC34-V35, HBC34-V35-MLNS, HBC34-V35-MLNS-GAALIE 및 17.1.41의 존재 하에 사멸은 관찰되지 않았다 (도 14a). PLC/PR/5 세포의 항체 의존성 사멸이 관찰되지 않은 것은 이러한 세포들의 표면에서 HBsAg의 발현 부족과 관련이 있지 않을까 싶은데 (도 14b), 임의의 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이것이 NK 세포에 의한 사멸을 초래하기에 충분하지 않을 수 있었다. 그와는 대조적으로, PLC/PR/5 세포를 고정 및 투과시켰던 경우에는 HBC34v35 및 17.1.41에서 높은 수준의 HBsAg가 검출되었는데, 이는 대부분의 HBsAg가 세포 내에서 또는 분비된 형태 (즉, 준바이러스 입자)로 발견되었음을 의미한다 (도 14b).
HBC34v35-MLNS 또는 HBC34-V35-MLNS-GAALIE 및 HBsAg의 존재 하에, 1차 인간 NK 세포 (V/F)의 활성화 역시 항-CD107a mAb를 사용하여 조사하였다. 데이터는 도 15a 및 15b에 나타내었다.
이러한 시험관내 데이터들은 GAALIE Fc 돌연변이를 포함하는 본 발명의 HBV 특이적 결합 단백질이, 비-GAALIE Fc 모체 항체보다 더 효과적으로 저친화성 활성화 FcγRIIa 및 FcγRIIIa에 결합하여 이를 활성화시킨다는 것을 보여주는 것이다. GAALIE 함유 결합 단백질 역시 저친화도의 억제성 FcγRIIb에 결합하거나 이를 활성화시키지 않는다. GAALIE 함유 결합 단백질도 C1q에 결합하지 않는다. 또한, GAALIE 함유 결합 단백질은 간암 세포에서 ADCC를 촉진하지는 않지만, 가용성 HBsAg의 존재 하에 인간 NK 세포는 활성화시킨다. MLNS 돌연변이의 도입은 pH 6.0에서 FcRn에 대한 결합을 증대시킨다.
실시예 7: HBC34-V35-MLNS-GAALIE와 Pol/RT 억제제 간의 약물-약물 상호작용에 대한 시험관내 연구
HBC34-V35-MLNS-GAALIE와 HBV pol/RT 억제제인 엔테카비어 (ETV)의 가능한 조합 효과를 확인하기 위해 시험관내 연구를 수행하였다. 체커보드 형식으로 HepG2.2.15 세포 중에서 HBC34-V35-MLNS-GAALIE 및 ETV를 사용하여 시험관내 조합 효과를 측정하였다. HBsAg 및 HBV DNA 수준을 판독치로 사용하고, 데이터를 MacSynergy II (uab.edu/medicine/peds/macsynergy)를 사용하여 조합 효과에 대해 분석하였다. 정규화를 위해, 처리하지 않은 HepG2.2.15 세포에서 얻은 값을 양성 대조군으로 사용하는 한편, 조직 배양 배지를 음성 대조군으로 사용하였다. 보고에는 99% 신뢰도의 시너지 플롯을 사용하였다. 데이터는 도 16에 나타내었다. 두 판독치에 대한 시너지 플롯은 시험관 내에서 HBC34-V35-MLNS-GAALIE와 ETV의 부가적 효과를 보여준다. 특히, 길항작용은 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 임상적 환경에서 HBC34-V35-MLNS-GAALIE와 조합된 뉴클레오시드 유사체의 사용을 뒷받침하고 있는 것이다.
실시예 8: 인간 단일클론 항체 HBC24의 동정 및 특성분석
항-HBV 인간 단일클론 항체는 문헌 [Traggiai E. et al., 2004, Nat Med 10(8): 871-5]에 기술된 것과 유사한 방식으로 인간 환자로부터 분리하였다. 항체는 가변영역과 그 안의 상보성 결정영역 (CDR)의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 결정하는 것에 의해 특성화하여 "HBC24"로 명명하였다. 따라서, HBC24는 표 3에서 상기 나타낸 CDR, VH 및 VL 서열을 갖는 IgG1형 완전 인간 단일클론 항체이다. HBC24의 VH 및 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열들을 표 4에 제시하였다.
실시예 9: HBC24의 생식세포계열 변이체 제조 및 기능 시험
HBC24를 생식세포계열 서열과 관련하여 가변 영역에서 체세포 돌연변이의 존재에 대해 분석하였다. 확인된 체세포 돌연변이는 생식세포계열 서열로 되돌아가 HBC24 변이체를 생성한다. HBC24 및 변이체를, 본원에 기술된 분석을 사용하여 HBV 및 HBD 혈청형의 (시험관내) 결합 및 (시험관내; 생체내) 중화에 대해 시험한다.
실시예 10: HBC24 및 변이체에 대한 Fc 변형의 도입
두 Fc 단량체 모두에 MLNS와 GAALIE 돌연변이를 포함하는 추가의 HBC24 변이체를 제조한다. 선택된 변이체들의 HC 아미노산 서열은 서열 121 및 122에 제공하였다. 변이체들을 하기에 대해 검사한다: (1) 항원에 대한 시험관내 결합; (2) 본원에 기재된 분석을 사용한 HBV 혈청형의 시험관내 중화.
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상술한 다양한 실시형태들을 조합하여 추가의 실시형태를 제공할 수도 있다. 본 명세서에서 인용되고/되거나 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 필요하다면, 본 실시형태의 양태들을 다양한 특허, 출원 및 간행물들의 개념을 사용하도록 변형하여 추가의 실시형태들을 제공할 수도 있다.
미국 가출원 62/782,274호 (2018년 12월 19일 출원)와 미국 가출원 62/860,085호 (2019년 6월 11일 출원)는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
상기 상세한 설명을 감안하여 본원 실시형태들에 상기 변형 및 다른 변형들이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용된 용어들은 해당 청구범위를 명세서와 청구범위에 개시된 특정 실시형태들로 한정하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 이러한 청구범위에게 부여된 전체 균등물의 범위와 함께 가능한 모든 실시형태들을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 발명에 의해 한정되지 않는다.
<110> Humabs BioMed SA Corti, Davide <120> ANTIBODIES THAT NEUTRALIZE HEPATITIS B VIRUS AND USES THEREOF <130> 930485.402WO <140> PCT <141> 2019-12-18 <150> US 62/860,085 <151> 2019-06-11 <150> US 62/782,274 <151> 2018-12-19 <160> 139 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Hepatitus B virus <220> <221> VARIANT <222> (1)...(11) <223> Xaa = any amino acid <400> 1 Xaa Xaa Xaa Thr Cys Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Hepatitus B Virus <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = P, T or S, <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = C or S, <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = R, K, D or I, <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = M or T <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = T, A or I <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = T, P or L <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa = Q, H or L. <400> 2 Xaa Xaa Xaa Thr Cys Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 226 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <223> S domain of HBsAg (GenBank acc. no. 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Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34wt CDRH2 <400> 66 Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys 1 5 <210> 67 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-V31, HBC34-V32 and HBC34-V33 VH <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Leu Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Trp Ser Gly Asn Ser Gly 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ccaactctgg gaataccgca acactgacta tctctggaac ccaggcaatg 240 gacgaggcag cttacttttg ccagacttgg gattcaacta ctgtcgtgtt cggcggcgga 300 actagactga ctgtcctg 318 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 wt CDRH1 codon optimized <400> 72 gggaggatct tcaggagctt ctac 24 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 wt CDRH2 codon optimized <400> 73 atcaaccagg acggatctga aaag 24 <210> 74 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 wt CDRH3 codon optimized <400> 74 gccgcttggt ctggcaacag cggcgggatg gatgtc 36 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 wt CDRL1 codon optimized <400> 75 aaactgggca acaagaac 18 <210> 76 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 wt CDRL2 codon optimized <400> 76 gaggtcaag 9 <210> 77 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 wt CDRL2 long codon optimized <400> 77 gtcatctacg aggtcaagta tcggcca 27 <210> 78 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34 wt CDRL3 codon optimized <400> 78 cagacttggg attcaactac tgtcgtg 27 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker sequence <400> 79 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <400> 80 Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys 1 5 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <400> 81 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro 1 5 <210> 82 <211> 25 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <223> discontinuous epitope mimic <221> VARIANT <222> 2, 21, 24 <223> Cysteine coupled to acetamidomethyl <400> 82 Cys Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Cys Ser Thr Thr 1 5 10 15 Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Cys 20 25 <210> 83 <211> 28 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <223> discontinuous epitope mimic <221> VARIANT <222> 4,6, 24, 27 <223> Cys is coupled to acetamidomethyl <400> 83 Cys Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Cys 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Cys 20 25 <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <223> looped epitope mimic <221> VARIANT <222> 13, 16 <223> cys is coupled to acetamidomethyl <400> 84 Cys Gly Gly Gly Cys Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys 1 5 10 15 Cys <210> 85 <211> 11 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 85 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys 1 5 10 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <400> 86 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Cys 1 5 10 15 <210> 87 <211> 14 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <400> 87 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe 1 5 10 <210> 88 <211> 5 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <221> VARIANT <222> (1)...(5) <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 88 Pro Cys Arg Xaa Cys 1 5 <210> 89 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34-V35 VL <400> 89 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ccgtgaaggc tggcgtggag 480 acaacaaccc ctagcaagca gtctaacaat aagtacgccg cttccagcta tctgtctctg 540 acaccagagc agtggaagtc ccaccgctct tattcctgcc aggtgaccca tgagggcagc 600 accgtggaga agacagtggc ccccaccgag tgttct 636 <210> 137 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens IgG1 <220> <223> WT hIgG1 Fc <400> 137 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 138 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HBC34, HBC34v7, HBC34v23, HBC34v34, HBC34v35, HBC34_C40S, HBC34_C40A, HBC34v23_C40S, HBC34v23_C40A HC with GAALIE mutation in hIgG1 Fc <400> 138 Glu Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Leu Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Trp Ser Gly Asn Ser Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 139 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric hinge sequence <400> 139 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro

Claims (92)

  1. 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    (i) 서열번호 41에 따른 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
    (ii) 서열번호 59, 89 또는 90 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)으로서, 단, IMGT 넘버링에 따른 VL의 40번 위치에 있는 아미노산이 시스테인은 아닌 것인, 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 HBsAg의 항원 루프 영역에 결합하여 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스에 의한 감염을 중화시키는 것인, 상기 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 VH가 서열번호 41에 따른 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 포함하고/포함하거나;
    (i) 상기 VL이 서열번호 59, 89 또는 90 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 VL의 40번 위치의 아미노산이 알라닌인 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 VL의 40번 위치의 아미노산이 세린인 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 VL의 40번 위치의 아미노산이 글리신인 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 서열번호 각각에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (i) 서열번호 34-36, 37, 38 및 40;
    (ii) 서열번호 34, 66, 36, 37, 38 및 40;
    (iii) 서열번호 34-36, 37, 39 및 40;
    (iv) 서열번호 34, 66, 36, 37, 39 및 40;
    (v) 서열번호 34-36, 37, 38 및 58;
    (vi) 서열번호 34, 66, 36, 37, 38 및 58;
    (vii) 서열번호 34-36, 37, 39 및 58; 또는
    (vii) 서열번호 34, 66, 36, 37, 39 및 58.
  7. 제1항 내지 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VL이 서열번호 89에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항, 제2항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VL이 서열번호 90에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH가 서열번호 41에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제3항, 제6항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH가 서열번호 41에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 상기 VL이 서열번호 89에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항, 제2항, 제4항, 제6항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH가 서열번호 41에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 상기 VL이 서열번호 90에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    (i) 서열번호 95에 따른 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
    (i) 서열번호 96에 따른 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)를 포함하고;
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 HBsAg의 항원 루프 영역에 결합하여 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스에 의한 감염을 중화시키는 것인, 상기 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서,
    (i) 상기 VH가 서열번호 95에 따른 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 포함하고/포함하거나;
    (i) 상기 VL이 서열번호 96에 따른 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 서열번호 97 내지 102에 따른 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 인간 항체, 단일클론 항체, 정제된 항체, 단쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 다중 특이적 항체 또는 항원 결합 단편인 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 Fc 모이어티를 포함하는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  19. 제18항에 있어서, 상기 Fc 모이어티가, 돌연변이를 포함하고 있지 않은 기준 Fc 모이어티와 비교하였을 때, FcRn에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 Fc 모이어티가, 돌연변이를 포함하고 있지 않은 기준 Fc 모이어티와 비교하였을 때, FcγR, 바람직하게는 FcγRIIA 또는 FcγRIIIA에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 모이어티가 IgG 동형이거나 IgG 동형으로부터 유래된 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcRn에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이가 M428L; N434S; N434H; N434A; N434S; M252Y; S254T; T256E; T250Q; P257I; Q311I; D376V; T307A; E380A; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 제22항에 있어서, 상기 FcRn에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이가 하기를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (i) M428L/N434S;
    (ii) M252Y/S254T/T256E;
    (iii) T250Q/M428L;
    (iv) P257I/Q311I;
    (v) P257I/N434H;
    (vi) D376V/N434H;
    (vii) T307A/E380A/N434A; 또는
    (viii) 상기 (i)-(vii) 중 임의의 조합.
  24. 제23항에 있어서, 상기 FcRn에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이가 M428L/N434S를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcRn에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이가 S239D; I332E; A330L; G236A; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
  26. 제25항에 있어서, 상기 FcγR에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이가 하기를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (i) S239D/I332E;
    (ii) S239D/A330L/I332E;
    (iii) G236A/S239D/I332E; 또는
    (iv) G236A/A330L/I332E.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 FcγR에 대한 결합을 향상시키는 돌연변이가 G236A/A330L/I332E를 포함하거나 이로 이루어지고, 임의로는 S239D를 포함하지 않는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 모이어티가 아미노산 치환 돌연변이 M428L; N434S; G236A; A330L; 및 I332E를 포함하고, 임의로는 S239D를 포함하지 않는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  29. 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    (i) 서열번호 41에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
    (i) 서열번호 89에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고;
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 HBsAg의 항원 루프 영역에 결합하여 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스에 의한 감염을 중화시키는 것인, 상기 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  30. 제29항에 있어서, Fc 모이어티를 추가로 포함하는 것인, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  31. 제30항에 있어서, 상기 Fc 모이어티가 IgG 동형으로부터 유래되고, M428L 및 N434S 치환 돌연변이를 포함하는 것인, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 Fc 모이어티가 IgG 동형으로부터 유래되고, G236A, A330L 및 I332E 치환 돌연변이를 포함하고, 임의로는 S239D 돌연변이를 포함하지 않는 것인, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  33. 제32항에 있어서, 상기 Fc 모이어티가 M428L, N434S, G236A, A330L 및 I332E 치환 돌연변이를 포함하는 것인, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  34. 제1항 내지 제11항 및 제15항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 91 또는 138에 따른 중쇄 (HC) 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  35. 제1항 내지 제11항 및 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 92에 따른 중쇄 (HC) 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  36. 제1항 내지 제3항, 제6항, 제7항, 제9항, 제10항 및 제15항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 93에 따른 경쇄 (LC) 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  37. 제1항, 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제11항 및 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 94에 따른 경쇄 (LC) 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  38. 제34항 또는 제36항에 있어서, 서열번호 91에 따른 HC 아미노산 서열 및 서열번호 93에 따른 LC 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  39. 제35항 또는 제37항에 있어서, 서열번호 92에 따른 HC 아미노산 서열 및 서열번호 94에 따른 LC 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  40. 제34항 또는 제37항에 있어서, 서열번호 91에 따른 HC 아미노산 서열 및 서열번호 94에 따른 LC 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  41. 제35항 또는 제36항에 있어서, 서열번호 92에 따른 HC 아미노산 서열 및 서열번호 93에 따른 LC 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  42. 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    (i) 서열번호 91에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC); 및
    (i) 서열번호 93에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (LC)를 포함하고;
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 HBsAg의 항원 루프 영역에 결합하여 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스에 의한 감염을 중화시키는 것인, 상기 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 HBsAg 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 유전자형의 HBsAg에 결합할 수 있는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 HBV에 감염된 포유동물에서 HBV DNA의 혈청 농도를 감소시킬 수 있는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 HBV에 감염된 포유동물에서 HBsAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 HBV에 감염된 포유동물에서 HBeAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 HBV에 감염된 포유동물에서 HBcrAg의 혈청 농도를 감소시킬 수 있는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  48. 융합 단백질로서,
    (i) 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 성분;
    (ii) 막횡단 도메인; 및
    (iii) 효과기 도메인 또는 이의 기능적 변이체 또는 일부를 포함하고, 임의로는 보조자극 단백질 또는 이의 기능적 변이체 또는 일부에서 유래한 신호전달 도메인을 포함하는, 세포내 성분을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  49. 제48항에 있어서, 상기 항원 결합 단편이 가변 중쇄 (VH) 도메인 및/또는 가변 경쇄 (VL) 도메인을 포함하는 scFv를 포함하는 것인, 융합 단백질.
  50. 제49항에 있어서, 상기 scFv가 펩타이드 링커를 포함하는 것인, 융합 단백질.
  51. 제50항에 있어서, 상기 scFv가 VL-링커-VH 배향을 갖는 것인, 융합 단백질.
  52. 제50항에 있어서, 상기 scFv가 VH-링커-VL 배향을 갖는 것인, 융합 단백질.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막횡단 도메인이 CD4, CD8, CD27 또는 CD28 유래의 막횡단 도메인을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 성분이 CD3ζ의 효과기 도메인을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 성분이 4-1BB (CD137), CD28, OX40, (CD134), ICOS (CD278), CD27, CD2, CD5, ICAM-1 (CD54), LFA-1 (CD11a/CD18), GITR, CD30, CD40, BAFF-R, HVEM, LIGHT, MKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 중 1개 또는 2개의 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 것인, 융합 단백질.
  56. 제48항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 것인, 융합 단백질.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 항체, 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  58. 제57항에 있어서, 상기 항체, 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 서열번호 103 내지 110 및 130 내지 136 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  60. 제59항에 있어서, 서열번호 103에 따른 VH-코딩 뉴클레오타이드 서열, 및 서열번호 105에 따른 VL-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  61. 제59항에 있어서, 서열번호 103에 따른 VH-코딩 뉴클레오타이드 서열, 및 서열번호 104에 따른 VL-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  62. 제54항에 있어서, 서열번호 108에 따른 VH-코딩 뉴클레오타이드 서열, 및 서열번호 109에 따른 VL-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  63. 서열번호 103에 따른 VH-코딩 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 110에 따른 VL-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 코딩된 항체 또는 항원 결합 단편이 HBsAg의 항원 루프 영역에 결합하여 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스 감염을 중화시키는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  64. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  65. 제64항에 있어서, 상기 벡터가 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터인 것인, 벡터.
  66. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항의 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  67. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
    (i) 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편;
    (ii) 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질;
    (ii) 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드;
    (iv) 제64항 또는 제65항에 따른 벡터;
    (v) 제66항의 숙주 세포; 또는
    (vi) 상기 (i)-(v) 중 임의의 조합.
  68. 제67항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  69. 키트로서,
    (a) (i) 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편;
    (ii) 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질;
    (ii) 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드;
    (iv) 제64항 또는 제65항에 따른 벡터;
    (v) 제66항의 숙주 세포;
    (vi) 제67항 또는 제68항의 약제학적 조성물; 또는
    (vii) 상기 (i)-(vi) 중 임의의 조합으로부터 선택되는 성분; 및
    (b) B형 간염 감염 및/또는 D형 간염 감염을 예방, 치료, 약화 및/또는 진단하기 위한 상기 성분의 사용 설명서를 포함하는 것인, 키트.
  70. 제67항 또는 제68항의 조성물, 또는 제69항의 키트로서, 하기를 추가로 포함하는 것인, 조성물 또는 키트:
    (i) 폴리머라제 억제제로서, 임의로 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비어, 텔비부딘, 테노포비르, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 폴리머라제 억제제;
    (ii) 인터페론으로서, 임의로 IFN베타 및/또는 IFN알파를 포함하는 것인, 인터페론;
    (iii) 체크포인트 억제제로서, 임의로 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 체크포인트 억제제;
    (iv) 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제; 또는
    (v) 상기 (i)-(iv) 중 임의의 조합.
  71. 제70항에 있어서, 상기 폴리머라제 억제제가 라미부딘을 포함하는 것인, 조성물 또는 키트.
  72. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 제조 방법으로서, 상기 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 제조하기에 충분한 조건 및 시간 하에 제66항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  73. 대상체에서 B형 간염 감염 및/또는 D형 간염 감염을 예방, 치료, 약화 및/또는 진단하기 위한 의약의 제조에서의 (i) 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편; (ii) 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항의 융합 단백질; (iii) 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드; (iv) 제64항 또는 제65항의 벡터; (v) 제66항의 숙주 세포; 및/또는 (vi) 제67항 또는 제68항의 약제학적 조성물의 용도.
  74. 대상체에서 B형 간염 및/또는 D형 간염 감염을 치료, 예방 및/또는 약화시키는 방법으로서, 상기 방법이 치료적 유효량의 (i) 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편; (ii) 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항의 융합 단백질; (iii) 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드; (iv) 제64항 또는 제65항의 벡터; (v) 제66항의 숙주 세포; 및/또는 (vi) 제67항 또는 제68항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  75. 제74항에 있어서, (vii) 폴리머라제 억제제로서, 임의로 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비어, 텔비부딘, 테노포비르, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 폴리머라제 억제제; (viii) 인터페론으로서, 임의로 IFN베타 및/또는 IFN알파를 포함하는 것인, 인터페론; (ix) 체크포인트 억제제로서, 임의로 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 체크포인트 억제제; (x) 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제; 또는 (xi) 상기 (vii)-(x) 중 임의의 조합 중 하나 이상을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 상기 B형 간염 감염이 만성 B형 간염 감염인 것인, 방법.
  77. 제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 간 이식을 받았던 적이 있는 것인, 방법.
  78. 제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 B형 간염에 대해 면역화되지 않은 것인, 방법.
  79. 제74항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 신생아인 것인, 방법.
  80. 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 혈액투석을 받고 있거나 받았던 적이 있는 것인, 방법.
  81. B형 간염 및/또는 D형 간염 감염의 시험관내 진단 방법으로서, 상기 방법이
    (i) 대상체의 샘플을 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편 또는 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항의 융합 단백질과 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 항원 및 항체를 포함하거나, 항원 및 항원 결합 단편을 포함하는 복합체를 검출하거나, 또는 항원 및 융합 단백질을 포함하는 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 샘플이 대상체로부터 분리된 혈액을 포함하는 것인, 방법.
  83. 항-B형 간염 및/또는 항-D형 간염 백신에서 정확한 입체구조형의 에피토프의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서, 상기 방법이
    (i) 상기 백신을
    (a) 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는
    (b) 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항의 융합 단백질과 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 항원 및 항체를 포함하거나, 항원 및 항원 결합 단편을 포함하거나, 또는 항원 및 융합 단백질을 포함하는 복합체가 형성되었는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  84. 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    (i) 서열번호 34에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 35 또는 66에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 서열번호 36에 따른 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH);
    (ii) 서열번호 37에 따른 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 38 또는 39에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 서열번호 58 또는 40에 따른 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 및
    (iii) G236A/A330L/I332E를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  85. 제84항에 있어서, 상기 Fc 모이어티가 S239D를 포함하고 있지 않는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 상기 Fc 모이어티가 M428L/N434S를 추가로 포함하는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  87. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH가 서열번호 41 또는 67 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 상기 VL이 서열번호 42, 59, 65, 89, 90 및 111 내지 120 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  88. 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    (i) 서열번호 97에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 98에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 서열번호 99에 따른 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH);
    (ii) 서열번호 100에 따른 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 100에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 서열번호 102에 따른 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 및
    (iii) G236A/A330L/I332E를 포함하는 Fc 모이어티를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  89. 제88항에 있어서, 상기 Fc 모이어티가 S239D를 포함하고 있지 않는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 Fc 모이어티가 M428L/N434S를 추가로 포함하는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  91. 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH가 서열번호 95에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 상기 VL이 서열번호 96에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  92. 제1항 내지 제47항 및 제84항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이
    (i) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 기준 폴리펩타이드와 비교하였을 때, 인간 FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA 또는 양자 모두에 대한 결합을 향상시켰고 (여기서, 상기 인간 FcγRIIA는 임의로 H131 또는 R131이고/이거나, 상기 인간 FcγRIIIA는 임의로 F158 또는 V158임);
    (ii) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 기준 폴리펩타이드와 비교하였을 때, 인간 FcγRIIB에 대한 결합을 감소시켰으며;
    (iii) 인간 FcγRIIB에 결합하지 않고;
    (iv) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 기준 폴리펩타이드와 비교하였을 때, 인간 C1q에 대한 결합을 감소시켰으며;
    (v) 인간 C1q에 결합하지 않고;
    (vi) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 기준 폴리펩타이드보다 더 큰 정도로 FcγRIIA, 인간 FcγRIIIA 또는 양자 모두를 활성화시키며 (여기서, 상기 인간 FcγRIIA는 임의로 H131 또는 R131이고/이거나, 상기 인간 FcγRIIIA는 임의로 F158 또는 V158임);
    (vii) 인간 FcγRIIB를 활성화시키지 않고;
    (viii) G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 기준 폴리펩타이드보다 더 큰 정도로 HBsAg의 존재 하에 인간 자연 살해 (NK) 세포를 활성화시키며 (여기서, 상기 기준 폴리펩타이드는 임의로 HB Ag, 임의로 HBsAg에 결합하는 항체임);
    (ix) 약 12.75 ng/mL 내지 약 19.9 ng/mL, 또는 약 12.75 ng/mL 내지 약 12.84 ng/mL, 또는 약 12.79 ng/mL, 또는 약 16.22 ng/mL 내지 약 19.9 ng/mL, 또는 약 17.97 ng/mL의 HBsAg EC50을 가지고/가지거나, (b) 약 10.78 ng/mL 내지 약 13.72 ng/mL, 또는 약 10.78 ng/mL 내지 약 10.93 ng/mL, 또는 약 10.85 ng/mL, 또는 약 11.59 ng/mL 내지 약 13.72 ng/mL, 또는 약 12.61 ng/mL의 HBeAg EC50을 가지며 (여기서, 상기 HBV는 임의로 HBV 유전자형 D이고, 상기 EC50은 HepG2 세포에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 투여 후 7일째에 NTCP를 과발현하고 HBV에 감염된 HepG2 세포에 의해 분비된, HBsAg 또는 HBeAg를 각각 측정하여 시험관내에서 임의로 측정됨);
    (x) 약 10.43 ng/mL 내지 약 22.41 ng/mL, 또는 약 13.81 ng/mL 내지 약 16.56 ng/mL, 또는 약 15.12 ng/mL, 또는 약 12.24 ng/mL 내지 약 22.41 ng/mL, 또는 약 16.56 ng/mL, 또는 약 10.43 ng/mL 내지 약 20.08 ng/mL, 또는 약 14.47 ng/mL의 HBsAg EC50을 가지고/가지거나, (b) 약 10.39 ng/mL 내지 약 13.99 ng/mL, 또는 약 10.63 ng/mL 내지 약 10.66 ng/mL, 또는 약 10.64 ng/mL, 또는 약 10.39 ng/mL 내지 약 10.60 ng/mL, 또는 약 10.49 ng/mL, 또는 약 13.25 ng/mL 내지 약 13.99 ng/mL, 또는 약 13.61 ng/mL의 HBeAg EC50을 가지며 (여기서, 상기 HBV는 임의로 HBV 유전자형 D이고, 상기 EC50은 HepG2 세포에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 투여 후 7일째에 NTCP를 과발현하고 HBV에 감염된 HepG2 세포에 의해 분비된, HBsAg 또는 HBeAg를 각각 측정하여 시험관내에서 임의로 측정됨);
    (xi) HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 HBsAg 변이체에 결합할 수 있으며;
    (xii) HBsAg에 결합하고 G236A/A330L/I332E를 포함하지 않는 Fc 모이어티를 포함하는 기준 항체 또는 항원 결합 단편과 비교하였을 때, HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 HBsAg 변이체에 대한 결합을 향상시켰고/향상시켰거나;
    (a) 약 2.34 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 A의 HBV; (b) 약 2.22 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 B의 HBV; (c) 약 0.92 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 C의 HBV; (d) 약 1.10 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 D의 HBV; (e) 약 1.12 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 E의 HBV; (f) 약 1.93 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 F의 HBV; (g) 약 1.43 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 G의 HBV; 및/또는 (h) 약 1.93 ng/mL의 EC50을 갖는 유전자형 H의 HBV를 중화할 수 있는 것인 (여기서, 상기 EC50은 HBV 유전자형의 HBsAg를 발현하도록 유전자 조작된 재조합 HDV를 사용하여 임의로 측정됨), 항체 또는 항원 결합 단편.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2022002231A (es) * 2019-08-29 2022-03-22 Vir Biotechnology Inc Composiciones de anticuerpos y metodos para tratar la infeccion por el virus de la hepatitis b.
KR20230042023A (ko) 2020-06-24 2023-03-27 비르 바이오테크놀로지, 인코포레이티드 조작된 b형 간염 바이러스 중화 항체 및 이의 용도
CN116583273A (zh) * 2020-10-14 2023-08-11 维里迪安治疗公司 用于治疗甲状腺眼病的组合物和方法
JP2023545520A (ja) 2020-10-14 2023-10-30 ビリジアン セラピューティクス， インコーポレイテッド 甲状腺眼疾患を治療するための組成物及び方法
US20240092872A1 (en) * 2021-01-26 2024-03-21 Vir Biotechnology, Inc. Compositions and methods for treating hepatitis b virus infection
WO2023225598A2 (en) * 2022-05-19 2023-11-23 Vir Biotechnology, Inc. Compositions and methods for treating hepatitis b virus (hbv) infection and hbv-associated diseases
WO2023225599A2 (en) * 2022-05-19 2023-11-23 Vir Biotechnology, Inc. Compositions and methods for treating hepatitis d virus (hdv) infection and associated diseases
WO2023230439A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Vir Biotechnology, Inc. Fc-engineered hepatitis b virus neutralizing antibodies and uses thereof

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3766162A (en) 1971-08-24 1973-10-16 Hoffmann La Roche Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4233402A (en) 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4831175A (en) 1986-09-05 1989-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
MY133346A (en) 1999-03-01 2007-11-30 Biogen Inc Kit for radiolabeling ligands with yttrium-90
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
WO2001025454A2 (en) 1999-10-04 2001-04-12 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes in the presence of nitrogen
AU2004215125B2 (en) 2003-02-26 2011-01-06 Institute For Research In Biomedicine Monoclonal antibody production by EBV transformation of B cells
EP1641827A2 (en) 2003-06-27 2006-04-05 Biogen Idec MA Inc. Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions
US8802820B2 (en) * 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
NZ581395A (en) 2007-05-14 2012-08-31 Biogen Idec Inc Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
WO2010046775A2 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Institute For Research In Biomedicine Methods for producing antibodies from plasma cells
EP2210903A1 (en) 2009-01-21 2010-07-28 Monoclonal Antibodies Therapeutics Anti-CD160 monoclonal antibodies and uses thereof
AR076770A1 (es) * 2009-05-13 2011-07-06 Genzyme Corp Inmunoglobulinas humanas anti-cd52
AU2012296613B2 (en) 2011-08-15 2016-05-12 Amplimmune, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and their uses
GB201216649D0 (en) * 2012-09-18 2012-10-31 Univ Birmingham Agents and methods
WO2014100483A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Amplimmune, Inc. Anti-human b7-h4 antibodies and their uses
TWI681969B (zh) * 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
CN106804108B (zh) 2014-09-12 2021-08-10 基因泰克公司 抗-b7-h4抗体及免疫缀合物
AU2015327781A1 (en) 2014-10-03 2017-04-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR) antibodies and methods of use thereof
EP3295951B1 (en) 2015-02-19 2020-04-22 Compugen Ltd. Anti-pvrig antibodies and methods of use
KR20170140180A (ko) * 2015-02-24 2017-12-20 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 면역원, 항체 및 그 용도
JO3620B1 (ar) 2015-08-05 2020-08-27 Amgen Res Munich Gmbh مثبطات نقطة فحص مناعية للاستخدام في علاج سرطانات محمولة عبر الدم
WO2017059878A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 Humabs Biomed Sa Antibodies that potently neutralize hepatitis b virus and uses thereof
EA201891186A1 (ru) * 2015-12-15 2018-12-28 Джилид Сайэнс, Инк. Антитела, нейтрализующие вирус иммунодефицита человека
KR20200003915A (ko) * 2017-05-10 2020-01-10 알바후나 테라퓨틱스, 에스.엘. 높은 이중 ＨＩＶ 항바이러스 활성과 면역조절 활성을 갖는 Ｆｃ-융합 단백질 유도체

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