ES2652508T3 - Composiciones de antagonistas de VEGF y sus usos - Google Patents

Abstract

Un oligómero antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que comprende: una pluralidad de monómeros enlazados operativamente uno con otro, en donde cada uno de los monómeros comprende el segundo dominio de unión a VEGF (D2) de tirosina quinasa-1 similar a FMS (FLT-1), y en donde la pluralidad de monómeros están enlazados uno con otro a través de un polietilenglicol (PEG).

Description

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introducir y expresar una molécula o vector de ácido nucleico de la presente divulgación, que incluye la presente invención.

Un huésped de la presente divulgación, que incluye la presente invención, puede ser procariótico o eucariótico. Huéspedes procariotas adecuados incluyen, por ejemplo, E. coli, tales como E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI y E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, tales como Bacillus subtilis y Streptomyces. Células eucariotas adecuadas incluyen levaduras y otros hongos, células de insectos, células vegetales, células humanas y animales, que incluyen células de mamífero tales como líneas de hibridoma, células COS, células NSO y células CHO.

La divulgación también incluye métodos para producir un oligómero antagonista de VEGF, comprendiendo el método: cultivar una célula huésped; y recuperar una pluralidad de monómeros de dicha célula huésped, en donde cada uno de los monómeros comprende el segundo dominio de unión a VEGF (D2) de tirosina quinasa-1 similar a FMS (FLT-1).

Dependiendo del sistema de expresión y del huésped seleccionado, las moléculas monoméricas se producen cultivando células huéspedes transformadas por un vector de expresión descrito anteriormente, con lo cual se expresa la proteína. La proteína expresada se aisló después de las células huéspedes y se purificó. Si el sistema de expresión secreta la proteína en el medio de crecimiento, el producto puede purificarse directamente de los medios. Si no se secreta, se puede aislar de los lisados celulares. La selección de las condiciones de crecimiento apropiadas y los métodos de recuperación están dentro de los conocimientos de la técnica. Por ejemplo, una vez expresado, el producto puede aislarse y purificarse por cualquier número de técnicas, bien conocidas en la técnica. Una proteína

(p. ej., monómero) de la presente divulgación, obtenida como se ha descrito anteriormente, puede aislarse del interior o exterior (p. ej., medio) de las células o huéspedes, y purificarse como una proteína homogénea sustancialmente pura. El método para el aislamiento y la purificación de proteínas no está limitado a método específico alguno. De hecho, se puede utilizar cualquier método estándar. Por ejemplo, cromatografía en columna, filtración, ultrafiltración, precipitación salina, precipitación con disolvente, extracción con disolvente, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis en punto isoeléctrico, diálisis y recristalización pueden seleccionarse y combinarse apropiadamente para aislar y purificar la proteína.

Para la cromatografía, por ejemplo, pueden utilizarse cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de adsorción y similares (comp. Daniel R. Marshak et al. (1996) Strategies for Protein Purification and Characterization: A laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Estas cromatografías pueden realizarse por cromatografía líquida tal como HPLC y FPLC. Por lo tanto, la presente divulgación, que incluye la presente invención, proporciona proteínas altamente purificadas producidas mediante los métodos anteriores.

La divulgación, que incluye la invención, también proporciona una composición farmacéutica que comprende el oligómero, ácido nucleico, vector o célula huésped de esta divulgación, que incluye la invención, y uno o más soportes farmacéuticamente aceptables. "Soportes farmacéuticamente aceptables" incluyen cualquier excipiente que no sea tóxico para la célula o mamífero que se exponga a los mismos a las dosificaciones y concentraciones empleadas. La composición farmacéutica puede incluir uno o agentes terapéuticos adicionales.

Soportes farmacéuticamente aceptables incluyen disolventes, medios de dispersión, tampones, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes humectantes, conservantes, insecticidas, agentes quelantes, antioxidantes, agentes isotónicos y agentes que retrasan la absorción.

Soportes farmacéuticamente aceptables incluyen agua; solución salina; solución salina tamponada con fosfato; dextrosa; glicerol; alcoholes tales como etanol e isopropanol; fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; EDTA; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS; agentes isotónicos tales como azúcares, polialcoholes tales como manitol y sorbitol, y cloruro de sodio; así como sus combinaciones. Agentes antibacterianos y antifúngicos incluyen parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico y timerosal.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación, que incluyen la invención, pueden formularse de una diversidad de formas, que incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (p. ej., soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. En algunos casos, que incluyen en algunas realizaciones, las composiciones están en forma de soluciones inyectables o infundibles. La composición está en una forma adecuada para la administración oral, intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, parenteral, transmucosal, transdérmica o tópica. La composición se puede formular como una composición de liberación inmediata, controlada, extendida o retardada.

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intravenosa. La composición de la divulgación, que incluye la invención, puede administrarse por inyección intramuscular o subcutánea. En algunos casos, que incluyen algunas realizaciones, la composición de la divulgación, que incluye la invención, puede administrarse por vía oral. Tal como se utiliza en esta memoria, una "composición" se refiere a cualquier composición que contiene una cantidad farmacéuticamente eficaz de un oligómero antagonista de VEGF.

Los métodos de tratamiento descritos en esta memoria pueden utilizarse para tratar a cualquier mamífero adecuado, incluyendo primates, tales como monos y seres humanos, caballos, vacas, gatos, perros, conejos y roedores tales como ratas y ratones. En un caso, o una realización, el mamífero a tratar es ser humano.

Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar más completamente las realizaciones preferidas de la invención. Sin embargo, no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del amplio alcance de la invención.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

FORMA OLIGOMERIZADA DEL DOMINIO DE UNIÓN A VEGF DE FLT-1

Para superar problemas de estabilidad, la divulgación, que incluye la invención, es una forma oligomerizada, que incluye una forma dimerizada de D2, el dominio de unión a VEGF de tirosina quinasa-1 similar a fms (Flt-1) para proporcionar antagonismo de VEGF para tratar el dolor crónico y trastornos de permeabilidad/angiogénesis vascular. Esta construcción supera los problemas de estabilidad de proteínas inherentes a los procedimientos de formulación de liberación sostenida y permite un uso eficaz como un agente terapéutico estable y eficaz para los trastornos crónicos, cuyas manifestaciones fisiopatológicas son impulsadas principalmente por VEGF.

Se desea una mayor potencia, una PK más prolongada o una mejor orientación/biodistribución para la diferenciación del producto en el campo del antagonista de VEGF saturado. Un enfoque potencialmente útil sería oligomerizar el dominio VEGFR D2 en un PEG multi-brazos para obtener una unión a VEGF de alta afinidad, al tiempo que proporciona propiedades de PK mejoradas mediante el uso del PEG enlazado. El PM del dominio D2 es solo 12.3 kDa. El concepto se ilustra en la Figura 1.

Los nucleótidos con la secuencia de Kozak y la secuencia del péptido señal se sintetizaron y se introdujeron por clonación Gateway en el vector pCEP4(-E+1)DEST y se transfectaron en células HEK293-EBNA para la expresión. La proteína se purificó sobre una columna de afinidad HPC4 Ab y se caracterizó por SDS-PAGE, unión a VEGF de Biacore y por PEGilación.

Mediante análisis Western, tal como se muestra en la Figura 3, el producto parecía ser predominantemente una sola banda (Figura 3c). Ocasionalmente, apareció una banda de PM más alto tras la manipulación de la muestra, posiblemente debida a la oxidación (Figura 3a). La proteína D2-Cys se unía a VEGF inmovilizado sobre una superficie Biacore (Figura 3b, 5 μg/ml de proteína en HBS-EP). La afinidad es menor que sFLT01 (D2-9Gly-Fc), debido principalmente a una velocidad de desaceleración más lenta que la esperada por la falta de afinidad en la forma monomérica. Para someter a ensayo la presencia de una cisteína reactiva, la muestra D2-Cys se trató brevemente con perlas de TCEP y luego se hizo reaccionar con PEG de maleimida (PEG 100 μM, 2 horas a temperatura ambiente). La transferencia Western utilizando HPC4 Ab mostró, además de D2 que no había reaccionado, la presencia de un solo producto de PM mayor, lo que indica que la proteína se puede monoPEGilar con diversos tamaños de PEGs, presumiblemente a través de la Cys libre en su extremo C. Para determinar si el dominio D2 podría formar estructuras oligoméricas en un PEG de maleimida de 20 kDa de 4 brazos, se trataron 23 ug de la construcción D2-Cys purificado en tampón de elución de columna HPC4 con TCEP inmovilizado, se dejó oxidar al aire durante 30' y luego se hizo reaccionar a razón de 0,33 mol de PEG por cada mol de D2 durante la noche a 25°C. La SDS PAGE mostró la presencia de un producto de ~ 60kDa (PM aparente) que migraba cerca del producto obtenido con un PEG lineal de 20 kDa, así como bandas débiles que tenían movilidades consistentes con D2 múltiple en cada PEG de 4 brazos (Figura 4a). En un segundo experimento, la reducción inicial y el acoplamiento se realizaron en una muestra primero concentrada por ultrafiltración de Amicon. Esto mostró el consumo de casi todos los D2-cys con cantidades aproximadamente equimolares de productos que migran a ~ 60 kDa y ~80 kDa, presumiblemente D2-PEG y (D2)2-PEG (panel central inferior -se muestran las asignaciones provisionales de cada especie). El análisis Biacore se realizó a continuación en los productos de reacción en bruto. El sensograma normalizado para un chip de VEGF inmovilizado de bajo nivel se muestra en la Figura 4b. Estos datos muestran la presencia de un componente de mayor afinidad en los productos de reacción de PEGilación en comparación con D2.

EJEMPLO 2

DIMERIZACIÓN DEL DOMINIO DE UNIÓN A VEGF DE FLT-1

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