ES2319340T3 - Peptidos sinteticos que inhiben la actividad de il-6. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBEN NUEVOS PEPTIDOS DERIVADOS DE LA SUBUNIDAD GP80 DEL SISTEMA DEL RECEPTOR DE LA IL - 6, QUE INHIBEN LA ACTIVIDAD DE LA IL - 6.
Description
Péptidos sintéticos que inhiben la actividad de
IL-6.
La presente invención se encuentra de forma
general en el campo de los inhibidores de actividad de
Interleuquina-6 (IL-6). Más
específicamente, la presente invención atañe a nuevos péptidos que
son capaces de inhibir el crecimiento dependiente de
IL-6 de células de mieloma/plasmacitoma.
El sistema receptor para la
Interleuquina-6 (IL-6) está
compuesto por dos subunidades receptoras distintas designadas gp80
(IL-6R) y gp130 (revisado en Hirano y col., 1994).
Estas dos proteínas receptoras pertenecen a la superfamilia de
receptor de citoquina de Bazan (1990). La estructura tridimensional
del Receptor de Hormona de Crecimiento humana (hGHR), un miembro de
dicha familia, ha sido revelada mediante cristalografía (DeVos y
col., 1992), a partir de lo cual se han determinado los residuos que
interaccionan con el ligando y los que median en la interacción
entre las dos subunidades receptoras en sus dominios extracelulares.
El alineamiento de las secuencias de IL-6R y hGHR
en base al modelo de Bazan se muestra de forma esquemática en la
Figura 1. La IL-6 es una citoquina pleiotrópica que
presenta una serie de importantes actividades biológicas (véase
Revel, 1992, para una revisión). Además, la IL-6 ha
sido implicada en el crecimiento y progresión del mieloma múltiple
humano (Klein y col., 1990).
De hecho, la IL-6 es un factor
de crecimiento para células leucémicas de linfocitos B de Mieloma
Múltiple. Dichas células leucémicas también se denominan células de
plasmacitoma o de mieloma, ya que se derivan de linfocitos B
maduros o de células de plasma maduras. Cuando están fusionadas a
células B productoras de anticuerpos, estas células de mieloma o de
plasmacitoma se denominan células de hibridoma.
En vista del hecho de que la
IL-6 es un factor de crecimiento para dichas células
de plamacitoma o de mieloma, desde hace tiempo ha existido la
necesidad de obtener inhibidores de IL-6 específicos
que puedan usarse para bloquear el crecimiento mediado por
IL-6 o dependiente de IL-6 de dichas
células de plasmacitoma/mieloma, y proporcionar con ello un modo de
tratamiento para el Mieloma Múltiple, una enfermedad que afecta a un
número muy elevado de gente en todo el mundo. Con este fin, Grube y
Cochrane (1994) han descrito un péptido derivado de
IL-6R, denominado péptido 249-264
(es decir, un péptido que tiene los residuos de aminoácido desde el
residuo nº 249 hasta el residuo nº 264 de la secuencia de
aminoácidos de IL-6R), que es capaz de inhibir el
crecimiento de células B9 de plasmacitoma murino. El documento US
5.210.075 describe antagonistas de péptido de IL-6
que son modelados a partir de secuencias de aminoácidos presentes
en IL-6 ó en IL-6R. También se sabe
que la IL-6 desempeña un papel en la inhibición de
otras enfermedades tales como la osteoporosis y enfermedades
autoinmunes.
Hasta el momento no se han descrito ni los
péptidos específicos de la presente invención ni sus actividades
biológicas específicas, ni otras características tales como, por
ejemplo, su especificidad por determinados anticuerpos
monoclonales.
Por lo tanto, un objetivo de la presente
invención es proporcionar nuevos péptidos derivados de
IL-6R que sean capaces de inhibir el crecimiento
dependiente de IL-6 de células de mieloma humano o
de células de plasmacitoma murino, osteoporosis y enfermedades
autoinmunes.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar dichos nuevos péptidos que se caracterizan además por
sus epítopos lineales de definición dentro de la secuencia de
IL-6R, que son las posiciones de unión de
anticuerpos monoclonales (Mabs) que son capaces ellos mismos de
bloquear la actividad de IL-6.
Otro objetivo adicional de la invención es
proporcionar un proceso de síntesis química para la preparación de
los nuevos péptidos.
Otro objetivo adicional de la invención es
proporcionar composiciones farmacéuticas que contengan a los nuevos
péptidos.
La presente invención se basa en el
descubrimiento inesperado de que péptidos cortos dentro de la
molécula gp80 receptora de IL-6
(IL-6R) podrían definirse en virtud de su capacidad
para unirse a dos anticuerpos monoclonales (Mabs) diferentes que
son conocidos previamente por inhibir fuertemente la actividad de la
IL-6. Además, cuando se sintetizan químicamente, de
acuerdo con la presente invención, estos péptidos cuando se
añadieron a cultivos de células leucémicas sorprendentemente
mostraron se capaces de provocar la inhibición completa del
crecimiento de dichas células leucémicas (plasmacitoma/mieloma).
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un péptido capaz de inhibir la actividad de
IL-6, en donde dicho péptido se caracteriza por
derivar de la subunidad gp80 (IL-6R) del sistema
receptor de IL-6, y por ser un epítopo lineal
reconocido por uno o más anticuerpos monoclonales (Mab) específicos
de IL-6R, con la condición de que dicho péptido no
pertenezca al grupo de péptidos que consiste en: (i) el péptido de
16 aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de los
residuos 249-264 de la molécula
IL-6R; (ii) el péptido de 14 aminoácidos que tiene
la secuencia de aminoácidos de los residuos 255-268
de la molécula IL-6R; (iii) el péptido de 6
aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos
249-254 de la molécula IL-6R; (iv)
el péptido de 10 aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos
de los residuos 259-268 de la molécula
IL-6R; y (v) el péptido de 10 aminoácidos que tiene
la secuencia de aminoácidos de los residuos 249-258
de la molécula IL-6R.
El péptido de la invención es un péptido en el
que dicho péptido define un epítopo lineal reconocido por uno o por
ambos Mabs, denominados en la presente memoria Mab 34.4 y Mab
50.6.
El péptido de la invención es un péptido
seleccionado entre uno cualquiera de los péptidos designados en la
presente memoria: (i) 1062 que tiene la secuencia entre la posición
247 y la posición 260 de la molécula IL-6R tal como
se muestra en la Figura 2; (ii) 1063 que tiene la secuencia entre la
posición 255 y la posición 270 de la molécula IL-6R
tal como se muestra en la Figura 2; y (iii) 1122 que tiene la
secuencia entre la posición 260 y la posición 269 de la molécula
IL-6R tal como se muestra en la Figura 2.
También se describe un péptido, o análogos
biológicamente activos del mismo, capaces de inhibir la actividad
de IL-6, en donde dicho péptido se caracteriza por
derivar de la subunidad gp80 (IL-6R) del sistema
receptor de IL-6, y por ser parte de toda la región
de IL-6R que está implicada en la unión a
IL-6, con la condición de que dicho péptido no
pertenezca al grupo de péptidos que consiste en: (i) el péptido de
16 aminoácidos que presenta la secuencia de aminoácidos de los
residuos 249-264 de la molécula
IL-6R; (ii) el péptido de 14 aminoácidos que
presenta la secuencia de aminoácidos de los residuos
255-268 de la molécula IL-6R; (iii)
el péptido de 6 aminoácidos que presenta la secuencia de aminoácidos
de los residuos 249-254 de la molécula
IL-6R; (iv) el péptido de 10 aminoácidos que
presenta la secuencia de aminoácidos de los residuos
259-268 de la molécula IL-6R; y (v)
el péptido de 16 aminoácidos que presenta la secuencia de
aminoácidos de los residuos 249-258 de la molécula
IL-6R.
Dicho péptido es seleccionado entre los péptidos
designados en la presente memoria: (a) 983 que presenta la
secuencia entre la posición 277 y la posición 299 de la molécula
IL-6R tal como se muestra en la Tabla 1; (b) 1064
que presenta la secuencia entre la posición 290 y la posición 300 de
la molécula IL-6R tal como se muestra en la Tabla
1; (c) 1067 que presenta la secuencia entre la posición 125 y la
posición 135 de la molécula IL-6R tal como se
muestra en la Tabla 1; y (d) un análogo de uno cualquiera de (a) -
(c) en donde uno o más aminoácidos han sido añadidos, borrados o
sustituidos por otro aminoácido.
La invención también proporciona una composición
farmacéutica que comprende como ingrediente activo al menos uno de
los péptidos de la invención, o mezclas de cualquiera de ellos, y un
vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las realizaciones de la composición farmacéutica
de la invención incluyen una composición farmacéutica para la
inhibición de IL-6 y una composición farmacéutica
para el tratamiento del Mieloma Múltiple, la osteoporosis y las
enfermedades autoinmunes.
Además, la presente invención también
proporciona el uso de los péptidos de la invención, o de mezclas de
cualquiera de ellos, para la preparación de cualquiera de las
anteriores composiciones farmacéuticas, o para la inhibición de
IL-6, o para el tratamiento del Mieloma Múltiple, la
osteoporosis y las enfermedades autoinmunes.
La siguiente descripción detallada de la
invención fija otros aspectos de la invención, o pueden surgir
directamente de la misma.
La Figura 1 muestra esquemáticamente una
comparación de parte de la secuencia de aminoácidos del dominio
extracelular de la molécula IL-6R con el del
Receptor de Hormona de Crecimiento humana (hGHR). El alineamiento de
las secuencias es acorde a Bazan (1990). La posición de los epítopos
correspondientes a Mab 34.4 y 50.6 se muestra mediante marcas en la
figura.
La Figura 2 muestra esquemáticamente un segmento
de la secuencia de aminoácidos de IL-6R en la que
los límites de los tres péptidos, denominados en la presente memoria
1086, 1062 y 1063, se representan mediante recuadros (parte superior
de la figura). La reacción de varios decapéptidos solapantes con
Mabs se presenta en la parte inferior de la figura, presentando los
decapéptidos secuencias contenidas en los péptidos 1086, 1062 y
1063. En dicha parte inferior, los números hacen referencia a la
posición de cada péptido sobre la rejilla de membrana (ensayo
spot-scan), y los símbolos "+" denotan la
intensidad relativa de las reacciones (resultados positivos), todo
según lo descrito en los Ejemplos 1-3.
La Figura 3 muestra gráficamente los efectos de
los péptidos 1062, 1063 y el péptido de control 903 (véase la Tabla
1) sobre el crecimiento de células B9 derivadas de plasmacitoma, que
son dependientes de la adición de IL-6. Se usó
IL-6 humana producida mediante CHO recombinante en
una concentración de 2,5 U/mL (es decir, 7,5 IU/mL), y se midió el
crecimiento después de 3 días. Los péptidos fueron añadidos en la
concentración indicada junto con la IL-6. Todo según
lo descrito en los Ejemplos 2 y 3.
La Figura 4 muestra gráficamente los efectos de
los péptidos 1062, 1063, 1067, 1086 y el péptido de control 903
(véase la Tabla 1) sobre el crecimiento de células B9 derivadas de
plasmacitoma, tal como se describe en el Ejemplo 3.
La Figura 5 muestra las secuencias y los efectos
de los péptidos 1062, 1063, 1122, 1118 y el péptido de control 903
sobre el crecimiento de células B9 derivadas de plasmacitoma, tal
como se describe en el Ejemplo 3.
La Figura 6 muestra gráficamente un modelo
tridimensional del complejo receptor de IL-6 que
comprende IL-6R, gp 130 y el ligando de
IL-6. Este modelo fue computado en base a los datos
cristalográficos de DeVos y col. (1992) para hGHR. La posición del
péptido 1063 se muestra mediante círculos rellenos, y la dirección
de las cadenas mediante flechas huecas. Parte de los péptidos 1062
se muestra mediante cuadrados huecos, y los péptidos 1086 mediante
elipses huecas. Todo según lo descrito en el Ejemplo 3.
La presente invención concierne en un aspecto a
nuevos péptidos que son capaces de inhibir la actividad de
IL-6, que se caracterizan por derivar de la
subunidad gp 80 (IL-6R) del sistema receptor de
IL-6, y por ser epítopos lineales reconocidos por
uno o más anticuerpos monoclonales (Mab) específicos de
IL-6R.
La IL-6 es un factor de
crecimiento para las células leucémicas linfocitos B del Mieloma
Múltiple, es decir, células de plasmacitoma o mieloma. De acuerdo
con la presente invención, los anteriores péptidos nuevos, al ser
péptidos cortos dentro de la molécula IL-6R, fueron
definidos por su capacidad para unirse a dos Mabs aislados y
caracterizados previamente (Novick y col., 1992) por ser Mabs que
inhiben fuertemente la actividad de IL-6. Estos
nuevos péptidos fueron sintetizados químicamente y añadidos a
cultivos de células leucémicas, y se observó que provocaban una
completa inhibición del crecimiento de dichas células de
plasmacitoma/mieloma.
Por tanto, los nuevos péptidos, o mezclas de dos
o más de dichos péptidos, de la invención pueden usarse de un modo
general para la inhibición de IL-6 y para la
inhibición de actividades celulares mediadas por
IL-6, cuando dichas actividades no sean deseadas.
Por ejemplo, los péptidos o las mezclas de los mismos de acuerdo
con la invención pueden usarse cuando la IL-6 se
produce intracelularmente en cantidades anormalmente grandes, o
cuando se administra IL-6 en grandes dosis, y en
ambas situaciones la IL-6 alcanza niveles demasiado
elevados para el cuerpo, dando lugar a efectos secundarios no
deseados. Alternativamente, los nuevos péptidos, de forma
individual o en mezclas de dos o más, pueden usarse específicamente
para el tratamiento de enfermedades tales como, por ejemplo, el
Mieloma Múltiple en humanos en los que el crecimiento de las células
cancerosas que constituyen esta enfermedad (células linfocito B
leucémicas) es dependiente de IL-6. En esta
solicitud, los nuevos péptidos de la invención antagonizan la unión
de IL-6 con su receptor o interfieren con la función
del sistema receptor que transluce, intracelularmente, señales
moleculares que conducen al crecimiento de células de mieloma.
Se describen péptidos que tienen entre
aproximadamente 4 y aproximadamente 25 residuos de aminoácido
derivados de la molécula IL-6R y que definen
epítopos lineales reconocidos por los Mabs
anti-IL-6R 34.4 y 50.6 (siendo
ambos Mabs inhibidores potentes de la actividad de
IL-6). De estos, los péptidos preferidos incluyen:
(a) un péptido que tiene al menos la secuencia de 10 aminoácidos
LRYRAERSKT desde la posición 255 a la posición 264 de la molécula
de IL-6R; (b) un péptido que tiene al menos la
secuencia de 10 aminoácidos YRAERSKTFT entre la posición 257 y la
posición 266 de la molécula de IL-6R; (c) un péptido
que tiene al menos la secuencia de 10 aminoácidos AERSKTFTTW entre
la posición 259 y la posición 268 de la molécula de
IL-6R; (d) un péptido que tiene al menos la
secuencia de 10 aminoácidos RSKTFTTWMV entre la posición 261 y la
posición 270 de la molécula de IL-6R; (e) un
péptido que tiene al menos la secuencia de 10 aminoácidos KTFTTWMVKD
entre la posición 263 y la posición 272 de la molécula de
IL-6R; (f) un péptido que tiene al menos la
secuencia de 10 aminoácidos SFYRLRFELR entre la posición 247 y la
posición 256 de la molécula de IL-6R; (g) un péptido
que tiene al menos la secuencia de 10 aminoácidos YRLRFELRYR entre
la posición 249 y la posición 258 de la molécula de
IL-6R; (h) un péptido que tiene al menos la
secuencia de 10 aminoácidos LRFELRYRAE entre la posición 251 y la posición 260 de la molécula de IL-6R.
secuencia de 10 aminoácidos LRFELRYRAE entre la posición 251 y la posición 260 de la molécula de IL-6R.
Además, los anteriores péptidos preferidos
también incluyen cualquiera de los péptidos aquí designados: (i)
1062 que tiene la secuencia entre la posición 247 y la posición 260
de la molécula de IL-6R tal como se muestra en la
Figura 2; (ii) 1063 que tiene la secuencia entre la posición 255 y
la posición 270 de la molécula de IL-6R tal como se
muestra en la Figura 2; (iii) 1086 que tiene la secuencia entre la
posición 226 y la posición 245 de la molécula de
IL-6R tal como se muestra en la Figura 2; (iv) 1085
que tiene la secuencia entre la posición 234 y la posición 245 de
la molécula de IL-6R tal como se muestra en la
Figura 2; y (v) 1122 que tiene la secuencia entre la posición 260 y
la posición 269 de la molécula de IL-6R tal como se
muestra en la Figura 2.
Además, cabe destacar que de acuerdo con la
presente invención, el uso de Mabs para definir, aislar y
caracterizar péptidos que representan epítopos lineales reconocidos
por los Mabs sobre la molécula de IL-6R, proporciona
un nuevo modo de definir y aislar péptidos que están implicados
directamente en la función de la proteína IL-6R,
por ejemplo péptidos tales como los de la invención, que pueden
interferir con la función de dicha proteína, es decir, inhibir la
actividad de IL-6 (que está mediada por
IL-6R). Este uso de Mabs es sorprendentemente
significativo en vista de las observaciones anteriores acerca de que
la unión de Mabs a proteínas se debe a menudo al reconocimiento de
una configuración dentro de la proteína, y más raramente al
reconocimiento de un segmento lineal de la secuencia de aminoácidos
de la proteína.
También se describen nuevos péptidos que son
capaces de inhibir la actividad de IL-6, que se
caracterizan por derivar de la subunidad gp80
(IL-6R) del sistema receptor de
IL-6, y por ser una parte o toda la región del
IL-6R que está implicada en la unión a
IL-6.
Por tanto, estos otros nuevos péptidos, aunque
no están definidos ni son aislados por ser epítopos lineales
reconocidos por Mabs conocidos, representan sin embargo péptidos que
antagonizan la unión de IL-6 con su receptor, o que
interfirieren con la función del sistema receptor que transluce,
intracelularmente, señales moleculares que conducen al crecimiento
de células dependientes de IL-6, por ejemplo,
células de mieloma. Por consiguiente, estos péptidos pueden usarse
del mismo modo que los mostrados anteriormente, es decir, para la
inhibición de la actividad de IL-6 en general,
cuando dicha inhibición sea deseada, o específicamente para la
inhibición de células cancerosas dependientes de
IL-6 tales como las del Mieloma Múltiples en
humanos.
De estos otros nuevos péptidos, los péptidos
preferidos incluyen: (a) 983 que tiene la secuencia entre la
posición 277 y la posición 299 de la molécula de
IL-6R tal como se muestra en la Tabla 1; (b) 1064
que tiene la secuencia entre la posición 290 y la posición 300 de
la molécula de IL-6R tal como se muestra en la Tabla
1; (c) 1067 que tiene la secuencia entre la posición 125 y la
posición 135 de la molécula de IL-6R tal como se
muestra en la Tabla 1.
También se describen análogos biológicamente
activos de cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente.
Los análogos adecuados son aquellos que mantienen la capacidad para
inhibir actividad de IL-6 antagonizando la unión de
IL-6 a su receptor, o interfiriendo en la función
del sistema receptor que transluce, intracelularmente, señales
moleculares que conducen al crecimiento de células dependientes de
IL-6, tales como, por ejemplo, células de mieloma.
Entre estos análogos adecuados también se incluyen análogos que
mantienen los residuos de aminoácidos esenciales de los epítopos
lineales reconocidos por los Mabs 34.4 y 50.6. Dichos análogos son
aquellos que tienen al menos un residuo de aminoácido añadido,
eliminado o sustituido por otro aminoácido cuando se comparan con
la secuencia de aminoácidos de péptido a partir de la cual se ha
generado la secuencia de aminoácidos del
análogo.
análogo.
En virtud de las anteriores características de
los análogos, dichos análogos pueden ser usados por tanto del mismo
modo que los nuevos péptidos descritos en la presente memoria, es
decir, como inhibidores de la actividad de IL-6 en
general, o como agentes para el tratamiento de crecimientos
celulares cancerosos dependientes de IL-6, por
ejemplo el Mieloma Múltiple.
Los péptidos y los análogos descritos en la
presente invención pueden prepararse mediante cualquier
procedimiento bien conocido en la técnica, en particular, mediante
los procedimientos de síntesis química bien establecidos utilizando
sintetizadores de péptidos automatizados seguido de una purificación
cromatográfica (véase el Ejemplo 2).
También se describen composiciones farmacéuticas
que contienen como ingrediente activo cualquiera de los anteriores
péptidos nuevos, análogos o mezclas de dos o más péptidos o
análogos, así como cualquiera de los vehículos, diluyentes o
excipientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos.
Estas composiciones farmacéuticas pueden
formularse para cualquier forma de administración deseada, por
ejemplo, para administración intravenosa, intraperitoneal u oral.
Por consiguiente, la elección de diluyente, vehículo o excipiente se
hará de acuerdo con el modo de administración deseado.
El modo real de administración y la formulación
óptima para la misma serán determinados por los especialistas.
Asimismo, la dosis para la administración y por tanto la
concentración de ingrediente activo en cada forma de dosis de
acuerdo con su modo de administración, también serán decididas por
los especialistas. Sin embargo, a este respecto se considera que
una forma de dosis adecuadamente eficaz, para cualquier ruta de
administración, será aquella que dé como resultado una
concentración en el organismo de aproximadamente
50-100 \muM de los péptidos, análogos o mezclas de
los mismos, después de la administración.
Las composiciones farmacéuticas descritas en la
presente memoria pueden usarse para la inhibición de
IL-6 cuando dicho tratamiento esté indicado, como
se ha mencionado anteriormente para los casos en los que los
niveles de IL-6 son anormalmente elevados, o pueden
usarse específicamente para tratar dichas enfermedades en las que
el tejido enfermo es dependiente de IL-6, por
ejemplo, en el Mieloma Múltiple, en el que las células de mieloma
que constituyen el crecimiento maligno son dependientes de
IL-6. La presente invención se describirá a
continuación con más detalle a través de los siguientes Ejemplos no
limitantes, y de las figuras anexas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos monoclonales 34.4 y 50.6,
preparados y caracterizados previamente por un grupo que incluye
uno de los presentes inventores, demostraron ser capaces de inhibir
la unión de IL-6 a la subunidad gp80 del receptor
de IL-6 (IL-6R), y por consiguiente
inhibir la unión de IL-6 a células humanas y su
actividad biológica (Novick y col., 1992).
Los dos anticuerpos 34.4 y 50.6 se estudiaron de
acuerdo con la presente invención para determinar su capacidad para
reconocer péptidos lineales de dominio extracelular de
IL-6R. Para este fin se sintetizó una serie de 96
decapéptidos, que abarca los residuos 123-322 de la
secuencia de IL-6R, usando procedimientos de
síntesis química estándares (véase también el Ejemplo 2). Cada
péptido consecutivo fue desplazado 2 aminoácidos respecto al
péptido previo, dando lugar a una biblioteca anidada solapada (véase
la secuencia de IL-6R de la Figura 1, y algunos de
los péptidos mostrados en la Figura 2). Se hizo reaccionar una
membrana que portaba los 96 péptidos con Mab 34.4 (18 \mug/mL) y
se tiñó con un anticuerpo secundario conjugado a
\beta-galactosidasa (anticuerpo de
inmunoglobulina anti-ratón). Se observaron dos
series de manchas positivas en \beta-galactosidasa
sobre la membrana, una correspondiente a los residuos
223-240 y otra a los residuos
241-272. Se llevó a cabo un experimento similar
usando un anticuerpo secundario conjugado a peroxidada de rábano, y
la detección se potenció mediante quimioluminiscencia (kit ECL,
Amersham Radiochemicals, R.U.). Este método de detección es más
cuantitativo y permitió la comparación de la intensidad de reacción
entre el anticuerpo y los diversos péptidos. Se observó una fuerte
reacción con 4 manchas de péptidos (67, 68, 69 y 70),
correspondientes a los aminoácidos 255-264,
257-266, 259-268 y
261-270. Estos resultados se muestran en la Figura
2, que representa esquemáticamente un segmento de la secuencia de
aminoácidos de IL-6R en la que los límites de los
tres péptidos designados en la presente memoria 1086, 1062 y 1063
se muestran en recuadros (parte superior de la figura), y que
también muestra los resultados de reacción de los diversos
decapéptidos solapados contenidos en los péptidos 1086, 1062 y 1063
con Mabs (parte inferior de la figura). En estos resultados de
reacción, los números se refieren a la posición de cada péptido
sobre la rejilla de la membrana (ensayo spot-scan) y
los símbolos "+" denotan la extensión de la reacción (+++ =
reacción muy fuerte; ++ = reacción fuerte; y + = reacción
ligeramente fuerte). Por tanto, a partir de estos resultados,
parece que el núcleo del epítopo de Mab 34.4 es RSKT
(261-264), pero probablemente se extiende a más
residuos alrededor de este núcleo.
De un modo similar, la biblioteca de 96 péptidos
de IL-6R también fue evaluada con Mab 50.6 con el
método de detección ECL. Las manchas 64 y 65 reaccionaron muy
fuertemente, lo que indica que la secuencia 251-258
es el epítopo central para este segundo anticuerpo neutralizante
(Figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
La región de la secuencia de
IL-6R a la que se unen los Mab neutralizantes 34.4 y
50.6 fue determinada como se ha indicado antes (Figura 2). Los
péptidos indicados 1062 (residuos 257-260 de
IL-6R), 1063 (255-270) y 1086 (226
y 245) se obtuvieron mediante síntesis en fase sólida con un
sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA).
La pureza de los péptidos se verificó mediante Cromatografía Líquida
de Alta Resolución de Fase Inversa (RP-HPLC) en una
columna C8 Aquapore (Brownlee).
Estos péptidos purificados fueron evaluados a
continuación para determinar su capacidad para interferir con la
acción de la IL-6 sobre las células. El concepto era
que, puesto que los anticuerpos que bloquean la actividad de
IL-6 se unen a secuencias de epítopo dentro de estos
péptidos, es probable que dichas secuencias sean importantes para
determinadas interacciones proteína-proteína dentro
del complejo receptor. Por lo tanto, estos péptidos podrían imitar
por sí mismos dichas interacciones e interferir con los contactos
proteína-proteína normales necesarios para la
función del sistema receptor.
Para evaluar la actividad biológica de los
péptidos como inhibidores de la acción de IL-6
contra el crecimiento de células de plasmacitoma, se usó una línea
celular de hibridoma B9 cuyo crecimiento es dependiente de
IL-6 (Helle y col., 1988). Se cultivaron células B9
en suspensión en medio de crecimiento RPMI 1640 (Biolabs Ltd.,
Israel) con un 10% de suero fetal de ternero desactivado
térmicamente y 4 U/mL de IL-6. La
IL-6 recombinante humana de células de Ovario de
Hámster Chino (CHO) fue una preparación pura tal como se ha descrito
(Novick y col., 1989) que se valoró en células de plasmacitoma
T1165 y dio un resultado de 5x10^{6} unidades/mg
(correspondientes a 1,5x10^{7} unidades Internacionales/mg). Las
unidades usadas son unidades T1165 (1 unidad = 3 unidades
Internacionales).
Antes del ensayo, las células B9 fueron lavadas
e incubadas durante 5 horas en medio de crecimiento sin
IL-6. Las células fueron centrifugadas,
resuspendidas en medio de crecimiento con 2,5 unidades/mL (es decir,
7,5 IU/mL) de IL-6 y sembradas en una microplaca de
96 pocillos (Nunc, Dinamarca) con una concentración de 50.000
células en un volumen final de 0,2 mL por pocillo. Se incluyeron 25
\muL de disolución de agua con una concentración apropiada de
péptido en el volumen final de cada pocillo, es decir, los péptidos
se añadieron en concentraciones que oscilan entre 62,5 \mug/mL y
250 \mug/mL (así como un control con 0 \mug/mL) junto con
IL-6. Después de 3 días de cultivo a 37ºC, se
añadió una disolución de Azul de Alamar (Biosource, Camarillo, CA) a
una concentración de 20 \mug/mL por pocillo y después de mezclar
se continuó con la incubación durante 3 horas. Se midió para cada
pocillo la absorbancia óptica a una longitud de onda de 530 nm, tal
como especifica el fabricante. La absorbancia es directamente
proporcional al número de células vivas en el pocillo, verificado a
través de los experimentos de calibración con entre 50.000 y
10^{6} células B9 (correspondiendo una OD530 de 0,25 a 5x10^{5}
células B9 en las condiciones experimentales presentes). Los
resultados fueron expresados como la diferencia entre la densidad
celular final con IL-6 y sin IL-6.
La diferencia dependiente de IL-6 en la ausencia de
péptido fue definida como un crecimiento del 100%.
\newpage
Los resultados de los anteriores experimentos se
muestran en la Figura 4, que presenta gráficamente los efectos de
los péptidos 1062, 1063 y el péptido de control (véase más adelante
y en la Tabla 1) sobre el crecimiento dependiente de
IL-6 de las células B9 derivadas de plasmacitoma.
Como es evidente a partir de estos resultados, la adición de
concentraciones crecientes de péptido 1063 (255-270)
dio como resultado una inhibición dependiente de la dosis del
crecimiento de las células B9. A la mayor dosis la inhibición del
crecimiento fue del 99%. También se obtuvo una inhibición completa
con el péptido 1062 (275-260), pero con una curva de
dosis diferente. Por el contrario, el péptido de control 903 (con
una secuencia no relacionada, tal como se muestra en la Tabla 1 a
continuación), no inhibió el crecimiento dependiente de
IL-6 de las células B9. Por lo tanto, los dos
péptidos 1062 y 1063 correspondientes a los epítopos de núcleo de
los Mabs neutralizantes 34.4 y 50.6 son inhibidores específicos
potentes del crecimiento dependiente de IL-6 de
células derivadas de plasmacitoma.
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\vskip1.000000\baselineskip
La actividad del péptido 1063
(255-270, epítopo de Mab 34.4) se evaluó en 5
experimentos separados y la inhibición en las tres dosis
estadísticamente muy significativa (ver Tabla 2 a continuación). La
comparación directa del péptido 1063 con el péptido de control 903
mostró una inhibición altamente significativa del crecimiento
dependiente de IL-6 de las células B9 derivadas de
plasmacitoma, incluso cuando se usó péptido 1063 a la mitad de
concentración del péptido de control (véase la leyenda de la Tabla 2
mostrada a continuación).
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Análisis estadístico de 5 experimentos usando
dos ensayos t de Student enlazados en comparación con el experimento
sin péptido. La comparación de crecimiento de células B9 con péptido
1063 y 125 \mug/mL de péptido de control 903 a 250 \mug/mL fue
altamente significativa con un valor de p=0,004.
Se prepararon cinco péptidos tal como se ha
indicado anteriormente (Ejemplo 2) correspondientes a diferentes
regiones de la secuencia de IL-6R (véase la Tabla 1
anterior). Los péptidos 983 y 1064 corresponden a una región
homóloga a aquella en la que el hGHR está implicado en la unión de
ligando (Figura 1; DeVos y col., 1992) y que contiene la estructura
RAQEEF que muestra unión a IL-6 (Martin y col.,
1994). El péptido 1067 también corresponde a una región que en la
molécula de hGHR está implicada en la unión de ligando (Figura 1).
El péptido 1086 corresponde a una región de la cual se ha demostrado
que interactúa con gp130 (Savino y col., 1994) y está cerca del
epítopo de Mab 34.4 y 50.6 (Figura 2). Estos péptidos fueron
evaluados para determinar su efecto sobre el crecimiento
dependiente de IL-6 de las células B9 derivadas de
plasmacitoma, como en el Ejemplo 2.
Una comparación del crecimiento dependiente de
IL-6 residual (véase la Tabla 3 mostrada a
continuación) demuestra que los péptidos solapados 983 y 1064 no
fueron activos en comparación con el péptido 1063
(255-270). El péptido 1067 mostró algo de
actividad, pero inferior a la del péptido 1063. En una serie de
cuatro experimentos, el crecimiento residual en presencia del
péptido 1067 fue del 62% \pm 43, y no fue estadísticamente
significativo. Sin embargo, el péptido 1086
(226-245) mostró actividad, aunque inferior a la de
los péptidos 1062 y 1063. La Figura 4 muestra gráficamente los
efectos de los péptidos 1062, 1063, 1067 y 1086, en comparación unos
con otros y con el péptido de control 903, sobre el crecimiento de
células B9 derivadas de plasmacitoma. Los resultados mostrados son
las medias de 4 experimentos.
La Figura 5 muestra de nuevo las secuencias de
los péptidos anteriormente mencionados 1062 y 1063, y su efecto
sobre el crecimiento de células B9 derivadas de plasmacitoma, así
como el de los péptidos 1118 y 1122, que presentan un efecto bajo y
un efecto fuerte, respectivamente, y el de dos péptidos relacionados
que han demostrado ser
inactivos.
inactivos.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo un modelo tridimensional de la
molécula de IL-6R en base a las coordenadas
cristalográficas de hGHR. Esto se muestra esquemáticamente en la
Figura 5, que es un modelo tridimensional del complejo de
IL-6R que comprende IL-6R, gp130 y
el ligando de IL-6. Este modelo fue computado en
base a los datos cristalográficos de DeVos (1992) para el hGHR. Se
indica la posición de los diferentes péptidos evaluados. El péptido
1063 (255-270, marcado mediante círculos rellenos)
no parece interactuar con el ligando de IL-6. El
péptido 1062 (247-260, marcado mediante cuadrados
huecos en la región que precede a su solapamiento con el péptido
1063) contiene residuos alrededor de la posición 247 que podrían
interactuar con IL-6. El péptido 1086
(226-245, marcado mediante elipses huecas) contiene
un lazo que interactúa con gp130. Es sabido que el gp130 dimeriza
como resultado de la unión de IL-6 e
IL-6R (Hirano y col., 1994), y el
IL-6R puede dimerizar de forma similar para formar
un complejo hexamérico. La construcción de un modelo de ordenador de
este complejo hexamérico mediante un ensamblaje simétrico de dos de
los complejos triméricos mostrados en la Figura 5, reveló que el
péptido 1063 y parte del 1062 están entrelazados en una segunda
interacción del IL-6R y gp130. Por lo tanto, las
regiones comunes a los péptidos activos, en particular el péptido
1063 que es el inhibidor más activo de IL-6, parece
interferir con las interacciones entre IL-6R y gp130
para formar el complejo hexamérico, y por tanto inhibir la función
del complejo receptor
de IL-6.
de IL-6.
\newpage
El mieloma múltiple es una leucemia de células
de plasma en la que la IL-6 es considerada un factor
promotor del crecimiento (Klein y col., 1990). Por lo tanto, tenía
interés determinar si los péptidos derivados de los epítopos de Mab
34.4 y 50.6, o de otros epítopos, inhibirían el crecimiento de
dichas células tumorales. La línea celular XG-1 ha
sido establecida a partir de un paciente con mieloma múltiple (Klein
y col., 1990) y el crecimiento de dichas células es dependiente de
la adición de IL-6. Se establecieron cultivos de
células XG-1 en placas Costar de 6 pocillos, en un
volumen final de 1 mL. Las células fueron cultivadas con o sin
IL-6 (0,2 U/mL, es decir 0,6 IU/mL) durante 3 días,
y a continuación fueron pulsadas con timidina marcada con tritio
durante 2 horas. La incorporación de timidina radioactiva se usó
como medida de la replicación y crecimiento de ADN. Tal como se
indica a continuación en la Tabla 4, el crecimiento dependiente de
IL-6 se vio fuertemente reducido (en un 85%) por la
adición de 100 \mug/mL de péptido 1062, y se redujo en más de un
55% con el péptido 1063. Por el contrario, el péptido 1064 sólo
produjo un pequeño efecto inhibidor. También se encontró que el
péptido 1067 era activo en la inhibición del crecimiento de estas
células de mieloma humano (véase la Tabla 4 presentada a
continuación).
Por lo tanto, los péptidos de
IL-6R son capaces de inhibir la función del complejo
receptor de IL-6 humano en células tumorales
humanas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En vista de los resultados presentados en la
presente memoria (Ejemplos 1-4), se realizó una
comparación entre los mismos ("Presente invención") y los
resultados publicados anteriormente concernientes a los péptidos
descritos por Cochrane (Grube y Cochrane, 1994, "Técnica
anterior"). Este análisis comparativo se presenta a continuación
en la Tabla 5. Cabe destacar que Cochrane presentó como activo en
células B9 derivadas de linfocitoma únicamente al péptido
249-264 (Y249-T264), mientras que
los demás péptidos descritos por Cochrane fueron evaluados en
células HepG2 para determinar su efecto sobre la secreción de
fibrinógeno. Por el contrario, los péptidos de la presente
invención 1062 (247-260), 1063
(255-270), 1086 (226-245) y 1122
(260-269), todos diferentes a los de Cochrane
(aunque con algún solapamiento en el caso de 1062 y 1063), han
demostrado ser activos con células B9. Además, los péptidos 1062 y
1063 inhiben las células XG-1 de mieloma humano.
Adicionalmente, los péptidos más similares (aunque siguen siendo
diferentes) de la presente invención de la de Cochrane, a saber
1063 (255-270) y 255-268,
respectivamente, también son diferentes en actividad. El péptido de
la presente invención, 1063 (L255-V270) ha
demostrado, de acuerdo con la presente invención, ser activo en
células B9 mientras que el de Cochrane (255-268),
evaluado en células HepG2, fue inactivo.
Finalmente, los péptidos preparados y
caracterizados de acuerdo con la presente invención han sido
aislados mediante el procedimiento inicial de mapeado de epítopos
usando los Mabs 34.4 y 50.6 preparados previamente. Por el
contrario, Cochrane preparó los péptidos mediante síntesis aleatoria
de diferentes péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
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superantagonist human IL-6. EMBO J.
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Claims (8)
1. Un péptido capaz de inhibir la actividad de
IL-6, péptido que es seleccionado del grupo que
consiste en:
- (a)
- SFYRLRFELRYRAE, que tiene la secuencia entre las posiciones 247 y 260 de la molécula de IL-6R de la Figura 2;
- (b)
- LRYRAERSKTFTTWMW, que tiene la secuencia entre las posiciones 255 y 270 de la molécula de IL-6R de la Figura 2; y
- (c)
- ERSKTFTTWM, que tiene la secuencia entre las posiciones 260 y 269 de la molécula de IL-6R de la Figura 2.
2. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
1, que es SFYRLRFELRYRAE y que tiene la secuencia entre las
posiciones 247 y 260 de la molécula de IL-6R de la
Figura 2.
3. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
1, que es LRYRAERSKTFTTWMW y que tiene la secuencia entre las
posiciones 255 y 270 de la molécula de IL-6R de la
Figura 2.
4. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
1, que es ERSKTFTTWM y que tiene la secuencia entre las posiciones
260 y 269 de la molécula de IL-6R de la Figura
2.
5. Una composición farmacéutica que comprende
como ingrediente activo un péptido, o una mezcla de dos o más
péptidos, de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo,
diluyente o continente farmacéuticamente aceptable.
6. El uso de un péptido o de una mezcla de dos o
más péptidos de la reivindicación 1, para la preparación de una
composición farmacéutica para el tratamiento del mieloma múltiple,
la osteoporosis y enfermedades autoinmunes.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
el que la composición farmacéutica se prepara para el tratamiento de
mieloma múltiple.
8. El uso de un péptido o de una mezcla de dos o
más péptidos de la reivindicación 1, para la preparación de una
composición farmacéutica para la inhibición de la actividad de
IL-6.
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