KR101738117B1

KR101738117B1 - 엑소좀을 단리시키기 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR101738117B1
Application number: KR1020167024527A
Authority: KR
Inventors: 앨런 제이. 쉬로이트; 필립 이. 도프; 쉘리 피.엠. 퍼시
Original assignee: 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템; 페레그린 파마수티컬즈, 인크
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2015-02-27
Publication date: 2017-05-19
Also published as: CA2940823A1; CN106030304B; HK1224376A1; NZ723336A; AU2015222755B2; US9835626B2; CN106030304A; CA2940823C; US20150241431A1; IL247413A; JP2017509332A; EP3111212A1; EP3111212B1; AU2015222755A1; SG11201606702SA; KR20160115988A; JP6156962B2; WO2015131153A1

Abstract

종양- 및 바이러스-유래 엑소좀에 의해 예시되는 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀, 특히 질환 관련 및 포스파티딜세린(PS) 양성 세포외 미세소포를 단리시키기 위한 놀랍고 새로운 방법 및 조성물이 개시된다. 본 발명의 방법은 빠르고, 효율적이며 중요하게는, 거대 용적의 생물학적 유체와 함께 사용하기에 적합하고, 항원적으로 무결함인 세포외 미세소포 및 엑소좀을 생성한다. 상기 방법 및 조성물은 그들의 형태 또는 기능적 특성 또는 항원성을 손상시키는 일 없이 용액으로부터 다량의 세포외 미세소포, 특히 종양-유래 엑소좀을 단리시키는 아세트산염 완충제의 놀라운 용도를 기반으로 한다.

Description

엑소좀을 단리시키기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR ISOLATING EXOSOMES}

1. 관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2014년 2월 27일자로 출원된 공동 계류 중인 제1 미국 가출원 특허 제61/945,718호, 및 2014년 3월 26일자로 출원된 공동 계류 중인 미국 가출원 특허 제61/970,529호에 대한 우선권을 주장하며, 명세서, 청구범위 및 도면을 포함하는 이들 기초출원의 전체 개시내용은 본 명세서에서 포기없이 참고로 포함된다.

2. 본 발명의 기술분야

본 발명은 생명공학 분야, 및 구체적으로는 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀에 관한 것이다. 본 발명은 거대 용적의 생물학적 유체와 함께 사용하는데 특히 적합하고 항원적으로 무결함인 세포외 미세소포 및 엑소좀을 생성하는 질환 관련 및 포스파티딜세린(PS)-양성 세포외 미세소포, 예컨대 종양- 및 바이러스-유래 엑소좀, 특히 종양-유래 엑소좀을 단리시키기 위한 놀랍고 새로운 방법 및 조성물을 제공한다.

세포외 미세소포는 세포에 의해 방출 또는 분비되는 막 결합 구성성분의 부류이며, 엑소좀, 엑토좀, 마이크로입자 또는 미세소포 및 세포자멸사 소체 또는 수포를 포함한다(

; Simpson & Mathivanan, 2012). 이 부류의 세포외 미세소포 내에서, 엑소좀은 최근 몇 년에 주목되었다.

엑소좀은 전형적으로 40-50 내지 100 나노미터 크기의 막-유래 소수포로서 설명되며, 생체내 및 시험관내 세포에 의해 적극적으로 분비되는 것으로 알려져 있다. 그들은 안쪽으로 향하는 출아(budding) 및 엔도솜 막의 분할에 의해 후기 엔도솜으로부터 생성되어 체강내 소수포를 함유하는 다포성소체(multivesicular body: MVB)를 생성한다. 이들 엑소좀은 혈장막과 MVB의 융합 시 세포외 공간으로 방출된다. 그들은 세포의 혈장막으로부터 유래되고 엔도솜 막의 함입에 의해 형성되기 때문에, 분비된 엑소좀은 사이토졸-유래 수성 공간을 캡슐화하는 혈장막 및 엔도솜 단백질을 가진다.

세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀은, 예를 들어 상이한 세포 유형 사이의 정보를 수송하는 분자 전령으로서 작용함으로써 광범위한 중요한 생리학적 기능을 발휘한다. 예를 들어, 엑소좀은 공급원에 따라서 세포자멸사(Andreola et al., 2002; Huber et al., 2005; Kim et al., 2005), 전이(Parolini et al., 2009), angiogenesis (Kim et al., 2005; Iero et al., 2008), 종양 진행(Keller et al., 2009; Thery et al., 2002), 혈전증(Aharon & Brenner, 2009; Al Nedawi et　al., 2005) 및 T 세포를 면역 활성화로 향하게 하는 것에 의한 면역(Andre et al., 2004; Chaput et al., 2005) 또는 면역 억제(Szajnik et　al., 2010; Valenti et al., 2007; Wieckowski et al., 2009)에 영향을 미칠 수 있는 신호전달 경로에 참여하는, RNA 및 마이크로RNA를 포함하는 단백질, 지질 및 가용성 인자(Thery et　al., 2009)를 전달한다.

암 환자의 악성 흉수 및 말초혈액으로부터 그리고 시험관내에서 배양시킨 세포주 및 종양 세포의 상청액으로부터를 포함하는, 상이한 공급원으로부터의 세포외 미세소포 및 엑소좀 집단의 단리 및 정제에 대한 몇몇 기법이 기재되었다. 이들 방법은 특히 라이프 테크놀로리즈 코포레이션사(Life Technologies Corporation)로부터의 전체 엑소좀 단리 시약(미국 특허 제8,901,284호) 및 엑소퀵(ExoQuick)(상표명)(미국 특허 제2013/0337440　A1호); 및 정해진 기공 크기 막 상의 포획(Grant et al., 2011), 예컨대 전형적으로 연속해서 연결된 상이한 기공 크기의 2개의 필터를 사용하는 엑소미르(ExoMir)(상표명)(미국 특허 제2013/0052647　A1호)를 포함하는, 상이한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 이용하는, 초원심분리 단계(Thery et al., 2006); 친화도 크로마토그래피(Taylor & Gercel-Taylor, 2008); 중합체-매개 침전(Taylor et al., 2011)을 포함하는 분별 원심분리를 포함한다.

그러나, 이용가능한 기법은 두 중요한 사항의 단점에 의해 제한된다. 처음에, 일반적으로 세포외 미세소포 및 엑소좀 제조에 적용되는 바와 같이, 그들은 시간 소모적이고/이거나, 번거롭고/번거롭거나 비용이 들며, 처리될 수 있는 물질의 양에 의해 제한된다. 특히, 세포외 미세소포 및 엑소좀을 단리시키기 위해 현재 입수가능한 기법은 모두 연구 또는 사용을 위한 충분한 농도를 얻기 위해 용적의 상당한 감소를 필요로 한다. 엑소좀 단리를 이용하는 처리 전에 초원심분리를 이용하여 생물학적 매질을 농축시키는 전형적인 접근은 매우 시간 소모적이며, 전문화된 연구 설비를 필요로 한다.

둘째로, 현재의 기법은 그들이 종양-유래 세포외 미세소포 및 엑소좀에 적용되기 때문에 특히 제한된다. 예를 들어, 환자의 혈액이 렉틴-친화도 칼럼을 통해 펌핑되고 환자로 복귀되는 암 환자의 순환으로부터 엑소좀의 신체외 제거가 제안되었다(미국 특허 제8,288,172호). 또한 종양-유래 엑소좀은 HER2/neu와 같은 종양-특이적 단백질에 대한 항체로 코팅된 상자성 비드를 이용하여 정제될 수 있다는 것이 보고되었다(Koga et al., 2005). 특이적 엑소좀을 포획하기 위한 자기 비드를 이용하는 키트, 예컨대 엑소-플로우(상표명) 키트를 또한 이용가능하다. 상기 기재한 일반적 단점에 추가적으로, 이러한 방법 및 키트는 매우 제한적이며, 항체 결합에서 이용될 특정 엑소좀 표면 마커의 진보된 지식뿐만 아니라 바이오티닐화된 포획 항체의 제조 및 용도와 같은 프로토콜에서의 매우 상세한 기술적 단계를 둘 다 필요로 한다.

따라서, 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀, 특히 질환 관련 및 종양-유래 엑소좀을 단리시키는 새롭고 개선된 방법에 대한 필요가 당업계에 남아있다. 형태적으로 및 항원적으로 무결함 세포외 미세소포 및 엑소좀을 단리시키는 단순하고 비용효과적인 새로운 방법의 동정은 중요한 진보일 것이다. 실제로 필요한 것은 전문화된 실험 장비 없이 그리고 초기 초원심분리 단계에 대한 필요 없이 거대 용적의 생물학적 물질을 조절하도록 구비된 방법이며, 특히 질환 관련 및 종양-유래 엑소좀을 우선적으로 단리시키기 위해 사용될 수 있는 것이다.

본 발명은 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀, 특히 질환 관련 및 종양-유래 엑소좀을 포함하는 포스파티딜세린(PS) 양성 엑소좀을 단리시키는 새로운 방법 및 조성물을 제공함으로써 선행기술의 앞서 언급한 그리고 다른 필요를 처리하며, 이 방법은 거대 용적의 생물학적 유체와 함께 사용에 대해 빠르고, 효율적이며, 비용효과적이고 적합하다. 이들 방법은 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 용액으로부터 단리시키기 위한 아세트산염 완충제의 놀라운 용도에 기반한다. 본 발명은 시간소모적이고, 번거로우며 용량 제한적인 현재의 초원심분리 방법에 의해 제조되는 것과 구별하기 어려운 다량의 세포외 미세소포 및 엑소좀, 특히 항원적으로 무결함인 질환 관련 및 PS 양성 엑소좀, 예컨대 종양-유래 엑소좀을 단리시키는 능력을 제공한다.

본 발명은 표면 상에서, 전형적으로 비지질막 성분, 예컨대 막 단백질과 공동으로, 음으로 하전된 인지질 포스파티딜세린(PS)을 발현시키는 질환 관련, 바이러스- 및 종양-유래 엑소좀을 정제 또는 단리시키는데 특히 적합하다. 아세트산염 완충제는 놀랍게도 세포외 미세소포 및 엑소좀의 표면 전하를 중화시키고, 따라서 얻어진 세포외 미세소포 및 엑소좀의 형태적 또는 기능적 특성을 손상시키는 일 없이 용액으로부터 그들을 제거하는 한편, 그들이 "항원적으로 무결함"이 되도록, 그들의 본래의 항원 프로파일을 유지한다. 이러한 질환 관련 엑소좀은 숙주 세포가 PS를 외재화하게 야기하는 바이러스 또는 세포내 기생생물 또는 병원균에 의해 감염되는 세포로부터의 엑소좀을 포함하며, 바람직하게는 그들의 표면 상에서 상당한 양의 PS를 전형적으로 함유하는 종양-유래 엑소좀이다.

본 발명의 광범위하게 적용가능한 실시형태는 질환 관련 세포외 미세소포를 생물학적 유체로부터 단리시키는 방법이되, 질환 관련 세포외 미세소포는 표면 상에 음으로 하전된 포스파티딜세린을 가지며; 이러한 방법은 질환 관련 세포외 미세소포를 생물학적 유체로부터 침전시키는데 효과적인 pH 및 농도에서 생물학적 유체의 샘플을 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계 및 침전물로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 수집함으로써 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 단계를 포함한다.

이러한 방법은 바이러스-유래 세포외 미세소포를 생물학적 유체로부터 침전시키는데 효과적인 pH 및 농도에서 바이러스-유래 세포외 미세소포를 함유하는 생물학적 유체를 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계 및 침전물로부터 바이러스-유래 세포외 미세소포를 수집함으로써 바이러스-유래 세포외 미세소포를 단리시키는 단계를 포함하는, 바이러스-감염 세포로부터 세포외 미세소포를 단리시키기 위한 방법을 포함한다. 바이러스 방법은 바람직하게는 감염성 바이러스가 실질적으로 없는 세포외 바이러스-유래 미세소포를 단리시킨다.

본 발명의 방법은 종양-유래 세포외 미세소포를 생물학적 유체로부터 침전시키는데 효과적인 pH 및 농도에서 샘플을 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계 및 침전물로부터 종양-유래 세포외 미세소포를 수집함으로써 종양-유래 세포외 미세소포를 단리시키는 단계를 포함하는, 종양-유래 세포외 미세소포를 생물학적 유체로부터 단리시키기 위한 방법을 추가로 포함한다.

질환 관련 세포외 미세소포의 다른 예는 세포내 기생생물 또는 병원균으로 감염된 세포로부터 유래된 것이다.

앞서 언급한 방법에서, 질환 관련, 바이러스-유래 및 종양-유래 세포외 미세소포는 바람직하게는 질환 관련, 바이러스-유래 및 종양-유래 엑소좀이다. 바람직하게는, 질환 관련, 바이러스-유래 및 종양-유래 세포외 미세소포 및 엑소좀은 그들의 형태적 또는 기능적 특성 또는 세포 표면 항원을 실질적으로 손상시키는 일 없이 단리된다. 인간 세포외 미세소포, 예컨대 인간 종양 엑소좀은 본 발명에 의해 단리될 수 있다.

본 발명을 모든 질환 관련 세포외 미세소포, 예컨대 질환 관련 엑소좀에 적용함으로써, 포스파티딜세린은 바람직하게는 세포외 미세소포의 표면 상에서, 더 바람직하게는 비지질막 성분과 공동으로 존재할 것이되, 비지질막 성분은 막 단백질을 포함한다. 이와 관련하여, 아세트산염 완충제는 질환 관련 세포외 미세소포 상에서 포스파티딜세린의 표면 하전을 중화시키고, 이에 의해 질환 관련 세포외 미세소포를 생물학적 유체로부터 침전시키는 것으로 믿어진다.

따라서, 본 발명은 특히 질환 관련 및 정상 세포외 미세소포를 포함하는 세포외 미세소포의 혼합된 집단을 함유하는 생물학적 유체와 함께 사용하기 위한 방법을 제공하되, 상기 방법은 정상 세포외 미세소포와 대조적으로 혼합 집단으로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 선택적으로 침전시킨다. 이의 실시형태는 종양-유래 및 정상 엑소좀을 포함하는 엑소좀의 혼합된 집단을 함유하는 생물학적 유체와 함께 사용하기 위한 방법이되, 상기 방법은 정상 엑소좀과 대조적으로 혼합된 집단으로부터 종양-유래 엑소좀을 선택적으로 침전시킨다.

이러한 방법은 하기 단계들을 포함할 수 있다:

(a) 종양-유래 엑소좀 및 비-종양 엑소좀을 포함하는 엑소좀의 혼합된 집단을 함유하는 생물학적 유체를 얻는 단계;

(b) 생물학적 유체로부터 종양-유래 엑소좀(비-종양 엑소좀은 아님)을 선택적으로 침전시키는데 효과적인 pH 및 농도에서 생물학적 유체를 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계;

(c) 단계 (b)로부터의 침전물을 수집하는 단계로서; 상기 침전물은 종양-유래 엑소좀을 선택적으로 함유하는 단계; 및

(d) 거의 중성의 pH에서 실질적으로 무 아세트산염(acetate-free) 완충제 중의 침전물을 재현탁시킴으로써, 비-종양 엑소좀이 본질적으로 없는 종양-유래 엑소좀의 정제된 집단을 제공하는 단계.

더 상세하게는, 이들 실시형태는 하기 단계들을 포함할 수 있다:

(b) 생물학적 유체에 대한 제1 저속 원심분리를 수행하여 세포, 세포 파편 및 거대막 소수포가 본질적으로 없는 정제된 유체를 제공하는 단계;

(c) 선택적으로 침전된 종양-유래 엑소좀을 포함하지만, 침전된 비-종양 엑소좀은 실질적으로 없는 혼탁한 현탁액을 제공하는데 효과적인 pH 및 농도에서 그리고 효과적인 시간 동안 정제된 유체를 아세트산염 완충제와 함께 인큐베이션시키는 단계;

(d) 혼탁한 현탁액에 저속 원심분리를 실시하여 침전물 및 상청액을 제공하는 단계로서, 상기 침전물은 종양-유래 엑소좀을 선택적으로 포함하는 단계;

(e) 종양-유래 엑소좀을 포함하는 침전물을 수집하는 단계;

(f) 거의 중성의 pH에서 실질적으로 무 아세트산염 완충제 충에서 침전물을 재현탁시킴으로써, 종양-유래 엑소좀을 포함하고 본질적으로 비-종양 엑소좀이 없는 정제된 엑소좀 집단을 제공하는 단계; 및, 선택적으로

(g) 정제된 엑소좀 집단에 추가적인 원심분리를 실시하여 비-엑소좀 성분을 포함하는 펠렛을 제공하고, 상기 펠렛을 제거함으로써, 비-종양 엑소좀과 비-엑소좀 성분이 둘 다 실질적으로 없는 종양-유래 엑소좀의 본질적으로 순수한 조성물을 제공하는 단계.

본 발명은 세포외 미세소포의 혼합된 집단을 함유하는 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 효과적으로 분리시키기 때문에, 본 발명은 정상 세포외 미세소포를 함유하는 혈청의 존재 하에서 배양된 병에 걸린 세포 또는 종양 세포의 상청액으로부터 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포를 얻는 방법을 추가로 제공하되, 바람직하게는 질환 관련 또는 종양-유래 세포외 미세소포는 표면 상에 음으로 하전된 포스파티딜세린을 가진다. 이들 방법은 상청액으로부터 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포를 선택적으로 침전시키는데 효과적인 pH 및 농도에서 상청액을 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계 및 침전물을 수집함으로써 혈청 중의 정상 세포외 미세소포로부터의 실질적인 오염 없이 상청액으로부터 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포를 얻는 단계를 포함한다. 특정 예는 마우스 또는 인간 종양 세포가 소 또는 소 태아 혈청의 존재 하에 배양된다.

다른 분리된 실시형태는 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포가 실질적으로 없는 혈청을 준비하는 방법이되, 질환 관련 또는 종양-유래 세포외 미세소포는 표면("고갈된 혈청") 상에서 음으로 하전된 포스파티딜세린을 가지며; 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:

(a) 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포를 함유하는 것으로 의심되는 혈청을 얻는 단계;

(b) 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포를 혈청으로부터 침전시키기에 효과적인 pH 및 농도에서 혈청을 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계; 및

(c) 단계 (b)에서 형성된 침전물을 혈청으로부터 제거함으로써, 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포가 실질적으로 없는 혈청을 제공하는 단계로서, 침전물은 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포를 함유하는 단계.

이들 방법은 바이러스-감염 세포에 적용가능하며, 하기 단계들을 포함하는 감염성 바이러스 및 바이러스-감염 세포로부터 유래된 세포외 미세소포가 실질적으로 없는 혈액, 혈청 또는 혈장을 제조하기 위한(예컨대 혈액 수혈 전에 수행될 수 있음) 방법을 포함한다:

(a) 감염성 바이러스 및 바이러스-감염 세포로부터 유래된 세포외 미세소포를 함유하는 것으로 의심되는 혈액, 혈청 또는 혈장을 얻는 단계;

(b) 감염성 바이러스를 불활성화 또는 침전시키기 위한 그리고 세포외 미세소포를 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 침전시키기 위한 효과적인 pH 및 농도에서 혈액, 혈청 또는 혈장을 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계; 및

(c) 단계 (b)에서 형성된 침전물을 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 제거함으로써 감염성 바이러스 및 바이러스-감염 세포로부터 유래된 세포외 미세소포가 실질적으로 없는 혈액, 혈청 또는 혈장을 제거하는 단계로서, 침전물은 불활성화 또는 침전된 바이러스 및 침전된 세포외 미세소포를 함유하는 단계.

추가 실시형태에서, 본 발명은 정제된 생물학적 유체에서 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포를 검출하는 방법을 제공하되, 질환 관련 또는 종양 세포외 미세소포는 표면 상에 음으로 하전된 포스파티딜세린을 가진다. 이들 방법은 정제된 생물학적 유체로부터 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포를 선택적으로 침전시키는데 효과적인 pH 및 농도에서 정제된 생물학적 유체를 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계 및 얻어진 생물학적 유체에서 시각적으로 검출될 수 있다면, 혼탁도의 존재를 결정하는 단계를 포함하되; 얻어진 생물학적 유체 중의 혼탁도의 존재는 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포의 검출을 나타낸다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 표면 상에 음으로 하전된 포스파티딜세린을 갖는 질환 관련 세포외 미세소포의 존재를 특징으로 하는 적어도 제1 질환, 예컨대 암을 갖는 동물 또는 환자를 진단하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 환자로부터의 생물학적 유체에서 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포의 존재를 검출함으로써 제1 질환, 예컨대 암을 갖는 것으로 환자를 진단하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 질환 관련 또는 종양-유래 세포외 미세소포는 하기 단계들을 포함하는 방법에 의해 검출된다:

(a) 생물학적 유체로부터 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포를 선택적으로 침전시키는데 효과적인 pH 및 농도에서 생물학적 유체를 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계; 및

(b) 얻어진 생물학적 유체 중에서 침전물의 존재를 결정하는 단계로서; 얻어진 생물학적 유체 중의 침전물의 존재는 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포의 검출을 나타내는 단계; 및

(c) 선택적으로, 제1의 이러한 질환은 동정되거나 또는 제2의 이러한 질환과 구별되되, 예를 들어, 암은 동정되거나 또는 바이러스 감염과 구별되고, 제1 질환의 존재는 제1 질환의 추가적인 및/또는 독립적 바이오마커 또는 임상 징후, 예컨대 암의 추가적 및/또는 독립적 바이오마커 또는 임상 징후에 대해 시험함으로써 확인되는 단계.

본 발명의 추가적인 양상은 표면 상에 음으로 하전된 포스파티딜세린을 갖는 질환 관련 세포외 미세소포의 양을 특징으로 하는 제1 질환을 갖는 환자의 질환 부담을 모니터링하기 위한, 예컨대 암 환자의 종양-부담을 모니터링하기 위한 방법이다. 이들 방법은 환자로부터의 생물학적 유체에서 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포의 양을 측정하는 단계를 포함하되; 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포의 양은 하기 단계들을 포함하는 방법에 의해 측정된다:

(b) 침전물에서 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포의 양을 측정하는 단계.

예를 들어, 암 환자의 종양-부담을 모니터링하는 방법은:

(a) 복수의 시점에 환자로부터의 일련의 생물학적 유체 샘플을 얻는 단계;

(b) 하기 단계 (i) 및 (ii)를 포함하는 방법에 의해 일련의 생물학적 유체 샘플에서 종양-유래 세포외 미세소포의 양을 측정하는 단계:

(i) 일련의 생물학적 유체 샘플로부터 종양-유래 세포외 미세소포를 선택적으로 침전시키는데 효과적인 pH 및 농도에서 일련의 생물학적 유체 샘플을 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계; 및

(ii) 침전물 중에서 종양-유래 세포외 미세소포의 양을 측정하는 단계를 포함하되;

종양-유래 세포외 미세소포 양의 증가는 증가된 종양-부담을 나타내고, 종양-유래 세포외 미세소포 양의 감소는 감소된 종양-부담을 나타낸다.

추가 실시형태에서, 본 발명은 표면 상에 음으로 하전된 포스파티딜세린을 갖는 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포를 생물학적 유체로부터 침전시킴으로써 진단에서 사용하는데 효과적인 pH 및 농도를 지니는 아세트산염 완충제, 및 아세트산염 완충제의 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 표면 상에 음으로 하전된 포스파티딜세린을 갖는 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포를 생물학적 유체로부터 침전시킴으로써 요법에서 사용하는데 효과적인 pH 및 농도를 지니는 아세트산염 완충제, 및 아세트산염 완충제의 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 실시형태는 생물학적 유체로부터 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포를 단리시키기 위한 키트이되, 질환 관련 세포외 미세소포는 표면 상에 음으로 하전된 포스파티딜세린을 가진다. 이러한 키트는 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포를 생물학적 유체로부터 침전시키는데 효과적인 pH 및 농도에서 아세트산염 완충제를 포함하며; 바람직하게는 추가로 사용을 위한 설명서를 포함한다. 이러한 키트는 또한 질환 관련 세포외 미세소포, 바람직하게는 엑소좀에서 하나 이상의 바이오마커를 동정 또는 정량화함에 있어서 사용하기 위한; 및/또는 특정 질환을 동정하거나 또는 질환 간을 구별하기 위한 하나 이상의 추가적인 및/또는 독립적인 바이오마커를 동정하거나 또는 정량화하는데 사용하기 위한 적어도 제1의 시약을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 모든 방법, 조성물 및 키트에서, 아세트산염 완충제는 질환 관련, 바람직하게는 종양-유래, 세포외 미세소포, 예컨대 생물학적 유체로부터의 엑소좀을 선택적으로 침전시키는데 효과적인 pH 및 농도이다. 이들은 pH가 약 4.25 내지 약 5.25이고; 더 바람직하게는, pH가 약 4.5 내지 약 5.0이며; 가장 바람직하게는, pH가 약 4.75인 아세트산염 완충제; 및 생물학적 유체 샘플 중의 최종 농도가 약 0.05M 내지 약 0.25M; 더 바람직하게는, 약 0.05M 내지 약 0.1M인 아세트산염 완충제를 포함한다.

아세트산나트륨과 아세트산칼륨 둘 다, 및 이들의 혼합물을 포함하는 아세트산염 완충제가 효과적이다. 특정 실시형태에서, 아세트산염 완충제는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체를 제외한 용적이 본질적으로 없다. 예시적인 바람직한 실시형태는 pH 약 4.75 및 샘플 중의 최종 농도 약 0.1M을 갖는 아세트산나트륨 완충제이다.

다음의 도면은 본 명세서의 부분을 형성하며, 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하는 것으로 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 구체적 실시형태의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면 중 하나 이상을 참고로 하여 더 양호하게 이해될 수 있다. 미국 특허 또는 출원은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)을 지니는 미국 특허 또는 특허 출원의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 지불 시 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1a, 도 1b 및 도 1c. 종양 엑소좀 단리의 염 및 pH 의존도를 도시한 도면. 도 1a 및 도 1b, 사전 정제시킨 K1735 상청액의 4.5㎖ 분취액을 표시한 바와 같은 10X 농축 완충제의 1/10 용적(0.5㎖)과 혼합하였다(●, 0.5M; ○, 0.367M; ■, 0.233M; □, 0.1M; +, 0.05M). 상청액을 60분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시키고 10분 동안 5,000g에서 원심분리시켰다. 이어서, 펠렛을 가용화시키고 나서, 그들의 초기 용적으로 다시 만들고, 단백질을 브래드포드 분석(Bradford assay)에 의해 평가하였다. 도 1c, K1735 상청액(우측) 또는 셀라인(CELLine) 플라스크의 상부 챔버로부터 수집한 대조군 배지(좌측)를 1.0M 아세트산염 pH 4.75의 1/10 용적과 혼합하고 나서, 얼음 상에서 5분 인큐베이션시킨 후에 촬영하였다.
도 2a 및 도 2b. 종양 엑소좀 단리의 온도 의존도를 도시한 도면. 도 2a, 0.1㎖의 1M 아세트산Na을 0.9㎖의 사전 정제한 K1735 상청액과 빠르게 혼합하고 나서, 표시한 온도에서 인큐베이션시킨 한편(■, 0℃; ○, 20℃; ●, 37℃), 동시에 혼탁도를 모니터링하였다. 화살표는 0℃ 및 37℃에서 인큐베이션시킨 샘플을 각각 37℃ 및 0℃로 옮겼을 때를 나타낸다. 도 2b, 아세트산염/엑소좀 혼합물을 도 2a에서와 같이 제조하였다. 분취액을 OD의 측정을 위해 2배 희석시키고, 남아있는 상청액을 10분 동안 5,000g에서 원심분리시켰다. 침전시킨 단백질을 브래드포드 분석에 의해 정량화하였다.
도 3a 및 도 3b. 세포 상청액 및 소모된 배지로부터의 종양 엑소좀의 차별적 단리를 도시한 도면. 셀라인 플라스크 하부(●, 세포) 및 상부(○, 배지) 챔버로부터의 분취액을 사전 정제하고, 표시한 pH에서 1.0M 아세트산염의 1/10 용적과 혼합하였다. 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 혼탁도(도 3a)를 600㎚에서 그리고 재용해시킨 원심분리(5,000g; 10분) 펠렛 중의 단백질(도 3b)에서 평가하였다.
도 4a 및 도 4b. 아세트산염은 종양 엑소좀의 침전을 야기하는 것을 도시한 도면. 도 4a, 침전은 pH가 아닌 아세트산염에 기인한다. 정제된 조직 배양 상청액을 4℃에서 1시간 동안 표시한 완충제(글리신 HCl, 시트르산염, 아세트산염 및 대조군)의 1.0M 용액의 1/10과 혼합하였다. 이어서, 상청액을 5,000g에서 15분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 수집하고 나서, 100,000g에서 1시간 동안 원심분리시키고, 펠렛 중의 단백질 농도를 브래드포드 분석에 의해 결정하였다. 도 4b, 침전은 반대 이온이 아니라 아세트산염에 기인한다. 4T1 유방 암종 세포로부터의 조직 배양 상청액(하부, 관 2 및 4) 또는 배지(상부, 관 1 및 3)를 약 pH 4.75에서 10X 아세트산나트륨(관 1 및 2) 또는 10X 아세트산칼륨(관 3 및 4)의 1/10 용적과 별도로 혼합하고 나서, 30분 동안 두었다.
도 5a 및 도 5b. 아세트산염 대 100,000g 초원심분리를 이용하여 단리시킨 종양 엑소좀의 비교 수율을 도시한 도면. 50㎖의 사전 정제한 세포 상청액을 아세트산염과 함께 60분 인큐베이션 후에 100,000g에서 1시간 동안 또는 5,000g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 펠렛을 HBS 중에서 재현탁시켰다. 알릭스(alix) 항체로 염색한 엑소좀의 유동 분석(도 5a; 아이소타입 대조군, 검정색(좌) 선; 100,000g, 적색(중간) 선; 아세트산염, 청색(우) 선) 및 아넥신 5(도 5b; Ca² ⁺ 없음, 검정색(가장 좌측) 선; 100,000g, 적색선; 아세트산염, 청색선)를 나타낸다(적색선에 대한 곡선은 청색선에 대한 곡선의 좌 및 우측으로 연장된다).
도 6. 종양 엑소좀의 특성규명을 도시한 도면. 100,000g 초원심분리에 의해 또는 아세트산염을 이용하여 정제된 음성-염색 흑색종-유래 엑소좀을 투과형 전자현미경에 의해 시각화하였다.
도 7a, 도 7b 및 도 7c. 정상 및 종양 엑소좀 중의 PS의 막 분포를 도시한 도면. 도 7a, 동일한 환자로부터 얻은 정상 중피세포로부터 그리고 난소 암종 세포로부터 유래된 엑소좀을 FITC-아넥신 V 라텍스 비드에 결합하고 나서, FACS 분석을 실시하였다. 적색선(좌), 정상 중피세포-유래 엑소좀; 청색선(우), 난소 암종-유래 엑소좀. 도 7b, 4T1 유방 암종 세포로부터 유래된 엑소좀은 음성 대조군(적색선, 좌)으로서의 BSA에 비해 PS 양성(청색선, 우)이다. 도 7c, B16 흑색종 세포로부터 유래된 엑소좀은 음성 대조군으로서 BSA(적색선, 좌)에 비해, PS 양성이다(청색선, 우).
도 8. 아세트산염 완충제는 순수한 인지질 리포좀을 침전시키지 않음을 도시한 도면. 포스파티딜콜린(PC) 또는 PC/PS 혼합물(2:1 비)로부터 제조된 형광-표지 리포좀의 제제를 5,000g에서 5분 동안 원심분리시켜 임의의 거대 침전가능한 리포좀을 제거하였다. 상청액을 제거하고 나서, 각각의 제제로부터의 0.4㎖를 2개의 관에 분취하였다. 0.5㎖의 PBS를 각각의 관에 첨가한 다음, 0.1㎖의 PBS 또는 아세트산염 완충제(1.0M; pH 5.7)를 각각 첨가하였다. 관을 혼합하고 나서, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 교반시키고 나서, 0.1㎖ 분취액을 제거하여 총 형광을 결정하였다. 이어서, 각각의 관을 5,000g에서 5분 동안 원심분리시키고 나서, 상청액으로부터의 0.1㎖ 분취액을 제거하여 잔여(비침전) 형광을 결정하였다.
도 9a 및 도 9b. 엑소좀의 혼합물로부터의 PS 양성 엑소좀의 선택적 단리를 도시한 도면. 도 9a, 출발 물질의 특성규명. 좌측 패널, 양성 및 음성 대조군: 알데하이드-활성화 라텍스 비드(검정색(우) 선) 및 BSA-차단 라텍스 비드(적색(좌) 선)에 공유 결합된 아넥신 5. 우측 패널, 알데하이드-활성화 라텍스 비드에 결합되고 1mM Ca² ⁺의 존재 하에 FITC-아넥신 5로 표지된 엑소좀: 4T1 유방 암종 세포로부터의 PS 양성 엑소좀(검정색(우) 선) 및 상대 세포로부터의 PS 음성 엑소좀(적색(좌) 선). 도 9b, 엑소좀 집단 및 혼합물의 FACS 분석. 적색 형광(N-Rho-PE) 표지, PS-음성 엑소좀 및 녹색 형광(N-NBD-PE) 표지된, PS-양성 엑소좀을 알데하이드-활성화 라텍스 비드에 결합시키고, FACS에 의해 분석하였다. 상부 행, 엑소좀에 아세트산염 침전을 실시하지 않음(대조군); 하부 행, 가용화된 아세트산염-침전 엑소좀(아세트산염). 좌측 열, PS 음성 엑소좀 집단(Rho PS ve); 중간 열, PS 양성 엑소좀 집단(NBD PS+ve); 동일한 양의 PS 양성 및 PS 음성 엑소좀(Rho PS ve NBD PS+ve)의 혼합물.
도 10A, 도 10B 및 도 10C. 바이러스-감염 세포 및 바이러스 배양물로부터 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀의 단리를 도시한 도면. 베로(Vero) 세포의 별도의 집단을 모의 감염시키거나(음성 대조군; 도 10A) 또는 SV40(도 10B) 또는 HSV-1(도 10C) 바이러스로 감염시켰다. 모의, SV40 또는 HSV-1 감염을 채취하고 나서, 1.0 M 아세트산나트륨, pH 4.75의 1/10 용적과 혼합함으로써 아세트산염 침전을 실시하였다. 아세트산염 침전 후 원심분리관을 도시하고, 모의 감염(도 10A)과 대조적으로 SV40(도 10B) 및 HSV-1(도 10C) 감염으로부터의 시각적 펠렛을 명확하게 도시한다.
도 11A, 도 11B 및 도 11C. 도 11A, 도 11B 및 도 11C. 바이러스-감염 세포로부터 단리시킨 세포외 미세소포 및 엑소좀의 FACS 분석. 베로 세포의 별도 집단을 모의 감염시키거나(베로, 음성 대조군) 또는 SV40(SV40) 또는 HSV-1 바이러스로 감염시키고 나서, 채취하고, 아세트산염 침전을 실시하고, 임의의 펠렛을 재현탁시켰다. HSV-1 감염으로부터의 재현탁 펠렛에 피콜(Ficoll)(등록상표) 구배 분리를 실시하여, 두 분획(HSV F5 및 HSV F15)을 수득하였다. 모의(베로), SV40 및 HSV F5 및 HSV F15 물질로부터의 샘플을 라텍스 비드에 결합시키고 나서, FACS에 의해 분석하여 SV40 또는 HSV 1에 특이적인 바이러스 항원(도 11A); 엑소좀의 마커인 CD63(도 11B); 및 아넥신 V에 의해 검출되는 PS를 검출하였다. 결과를 모의 감염(베로)에 비교하여 제시한다.

지난 십년은 엑소좀과 같은 세포외 미세소포와 관련된 연수 및 간행물 수의 기하급수적 증가가 있었다. 이들 연구는 그들의 단리방법으로부터 암진단에서 특정 세포외 미세소포, 특히 엑소좀의 이용 및 면역 반응을 매개하는 그들의 능력까지의 범위에 있다. 세포외 미세소포의 방출은 원핵생물과 진핵생물 둘 다에서 생기며, 넓은 범위의 생리적 및 병리적 반응에서 중요하다.

A. 세포외 미세소포

세포외 미세소포는 부류로서 엑소좀, 엑소좀-유사 소수포, 엑토좀(직접적으로 혈장막으로부터의 소수포의 출아로부터 초래됨), 마이크로입자, 미세소포, 쉐딩 미세소포(shedding microvesicle: SMV), 나노입자 및 심지어(거대한) 세포자멸사 수포 또는 소체(세포사로부터 초래됨) 또는 막입자를 포함하는 세포-유래 및 세포-분비 미세소포인데, 이러한 용어들은 당업계에서 상호호환적으로 사용되기 때문이다(

; Simpson & Mathivanan, 2012).

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "세포외 미세소포"는 세포외 미세소포가 유래된 샘플 공급원에 기반한 용어를 포함하여, 과거에 명명을 위해 사용한 용어로서 언급되는 세포외 미세소포를 포함한다. 특히 종양-유래 엑소좀에 적용되는 용어 텍소좀(tex) 및 온코좀(oncosome)뿐만 아니라 특정 유형의 암세포, 예컨대 프로스타좀(prostasome)으로 칭해지는 전립선암 세포-유래 엑소좀을 반영하는 용어가 사용되었고 본 명세서에 포함된다. 추가로, 수지상 세포로부터 단리된 엑소좀은 덱소좀(dex)으로 칭해졌고, 다른 명명법, 예컨대 에피디디모좀(epididimosome), 아르고좀(argosome), 프로미니노좀(promininosome), 프로스타좀(prostasome) 및 아르케오좀(archeosome)이 사용되었다(Simpson & Mathivanan, 2012).

각각의 앞서 언급한 독립체 및 이들의 혼합물 및 불순물 제제는 용어 "세포외 미세소포" 내에 포함된다. 사실, 세포 및 조직의 세포외 환경은 동시에 존재하는 상이한 유형의 세포외 미세소포를 함유할 것이기 때문에, 세포외 미세소포의 혼합물은 본 발명의 중요한 부분이다. 그렇더라도, 다른 유형의 세포외 미세소포와 별도로 특정 유형의 세포외 미세소포를 동정하기 위한 다양한 기법 및 마커가 존재하기 때문에, 따라서 본 발명은 특정 유형의 세포외 미세소포의 실질적으로 순수한 제제를 포함한다.

오래된 용어가 본 명세서에 포함되지만, 그렇더라도 일반적 합의에 의해 개선된 점점 더 표준화된 명명법을 이용하여 "세포외 미세소포"를 정의하는 것이 바람직하다. 세포외 미세소포의 명명은 바람직하게는 막 소수포가 세포외 세포외 미세환경으로 방출되는 3가지 공지된 메커니즘: 다포성소체의 외포작용 융합으로 "엑소좀"을 생성; 혈장막으로부터 직접적으로 소수포를 출아하여 "엑토좀"을 생성; 및 "세포자멸사 수포"를 야기하는 세포사를 고려한다.

최근에, 세포외 미세소포는 2가지 주요 유형: 그 자체로 "MV" 및 "엑소좀"으로 함께 불리는 미세소포 또는 마이크로입자를 갖는 것으로 기재되었다. 미세소포, 마이크로입자 또는 MV는 종종 활성화- 또는 세포자멸사-유도 미세소포 또는 마이크로입자로서 기재된다. 제3 유형의 세포외 미세소포는 세포자멸사 수포, 소체 및 관련된 독립체이다.

세포외 미세소포의 생물 발생설은 본질적으로 이하에 더 상세하게 기재하는 바와 같은 미세소포/MV 및 세포자멸사 소체로부터의 "엑소좀"을 구별한다. 또한 문헌[

]의 표 1 참조.

세포외 미세소포의 분야에서 사용되는 바와 같은 용어 "마이크로입자"는 또한 본 명세서에 포함되지만, 용어로서 덜 바람직한데, "입자"는 소포성 구조보다는 고체 미립자 구조를 시사하기 때문이다. 따라서, 표기 "미세소포"는 막-제한 구조를 나타냄에 있어서 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 내피 세포- 및 혈소판-유래 마이크로입자는 본 명세서에 포함되는 "내피 마이크로입자(EMP)" 및 "혈소판 마이크로입자(PMP)"로서 기재되었는데, 용어 세포외 미세소포 내에 총괄적으로 속하는 모든 미세소포, 소포성 구조 및 막 소수포이기 때문이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "미세소포" 및 "MV"는 전형적으로 혈액 혈장 중에서 직경이 약 100㎚ 내지 약 1,000㎚, 또는 약 100㎚ 내지 약 400㎚인 인지질 이중층으로 둘러싸인 더 거대한 세포외막 소수포 또는 구조를 의미한다. 미세소포/MV는 혈장막의 출아 또는 수포형성에 의해 조절된 방출에 의해 형성된다.

세포외 미세소포 부류 내에서, 중요한 성분은 바람직하게는 직경이 약 40 내지 50㎚ 내지 약 100㎚인 것으로 기재되어 있고, 막성 소수포, 즉, 외포작용 융합 또는 다포성소체의 "외포작용"(MVB)으로부터 초래되는 식균 작용 유래의 인지질 이중층에 의해 둘러싸인 소수포인 "엑소좀" 그 자체이다(

; Simpson & Mathivanan, 2012). 덜 통상적이지만, 포함되는 용어는 또한 "수포화(vesiculation)" 및 "트로고사이토시스(trogocytosis)"이다.

언급한 바와 같이 세포외 미세소포의 생물발생설은 본질적으로 MV 및 세포자멸사 소체로부터의 "엑소좀"과 구별된다. 엑소좀은 생체내 및 시험관내에서 구성적으로 그리고 유도 시 둘 다에서 세포에 의해 적극적으로 분비되며, 엔도좀 막으로부터의 내강 내로 안쪽으로 향하는 출아("함입") 및 출아의 절단에 의해 후기 엔도좀으로부터 생성되어 체강내 소수포를 함유하는 MVB를 생성한다. 엑소좀은 MVB의 혈장막과의 융합 시 세포외 공간으로 방출된다(예를 들어, 문헌[Simons & Raposo, 2009]의 도 2; 및 문헌[Schorey & Bhatnagar, 2008]의 도 1 참조). 엑소좀은 세포 혈장막으로부터 유래되고, 엔도좀 막의 함입에 의해 형성되기 때문에, 분비된 엑소좀은 사이토졸-유래 수성 공간을 캡슐화하는 혈장막 및 엔도좀 또는 엔도좀 단백질을 가진다.

엑소좀은 모 세포의 특성을 반영하는 넓은 범위의 사이토졸 및 막 성분을 혼입한다. 예를 들어, 엑소좀의 내강은 종양형성의 검출 및 특이적 종양 유형의 동정 을 위해 판독될 수 있는 질환의 데이터 신호를 발현하는 RNA 및 miRNA를 포함하는 세포 사이토졸로부터 갇힌 다양한 성분을 함유한다(Taylor & Gercel-Taylor, 2008; Taylor et al., 2011; Rabinowits et al., 2009; Skog et al., 2008). 엑소좀 막은 종양-유래 엑소좀의 경우에 모 세포의 혈장막으로부터의 항원을 포함하는 MHC 클래스 I 및 II(Iero et al., 2008), 열충격 단백질 70, Th1-매개 면역 반응 및 다수의 세포 표면 성분을 상향조절하는 Hsp 70(Cho et al., 2009)을 함유한다. 이들 관찰은 종양 엑소좀이 암치료를 위한 면역치료제로서 사용될 수 있었다는 것을 시사한다. 사실, 최근의 임상 시험은 종양 엑소좀에 의한 "면역화"가 최소의 부작용을 가지며, 잘 용인되고, 특이적 세포독성 T 세포 반응을 유발한다는 것을 나타내었다(Escudier et al., 2005; Dai et al., 2008).

엑소좀 표면 막이 그들의 모 세포의 혈장막을 반영하기 때문에, 병에 걸린 또는 비정상 세포로부터의 엑소좀은 정상 세포로부터의 엑소좀과 대조적으로 그들의 표면 상에 포스파티딜세린(PS)을 갖는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명은 표면 상에 노출된 PS를 갖는 질환 관련 엑소좀, 바람직하게는 표면 상에 노출된 PS가 비지질막 성분과 공동으로 및/또는 밀접하게 또는 작동적으로 공동으로 및/또는 매우 밀접하게, 바람직하게는 막 단백질과 공동으로 및/또는 밀접하게 또는 작동적으로 공동으로 및/또는 매우 밀접하게 존재하는 질환 관련 엑소좀을 단리시킴에 있어서 유리하게 사용될 수 있다. 이하에 더 상세하게 기재되는 바와 같이, 이러한 질환 관련 엑소좀은 숙주 세포가 PS를 외재화되도록 야기하는 바이러스 또는 세포내 기생생물로 감염된 세포로부터의 엑소좀을 포함하며, 바람직하게는 전형적으로 표면 상에 상당한 양의 PS를 함유하는 종양-유래 엑소좀이다.

엑소좀과 공통 유래를 갖는 "엑소좀-유사 소수포"는 전형적으로 그들을 엑소좀과 구별하는 크기 및 침강 특성을 갖는 것으로 기재되며, 특히 지질 뗏목(lipid raft) 마이크로도메인을 결여하는 것으로 기재된다.

본 명세서에서 사용되는 "엑토좀"은 전형적으로 호중구- 또는 단핵구-유래 미세소포이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "막 입자"(MP)는 전형적으로 직경이 약 50 내지 80㎚이고, 혈장막으로부터 유래된다. "세포외 막성 구조"는 또한, 예를 들어, 괴저성 사멸로부터의 선형 또는 폴딩된 막 단편뿐만 아니라 분비된 리소좀 및 나노튜브를 포함하는 다른 세포 공급원으로부터의 막성 구조를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "세포자멸사 수포 또는 소체"는 전형적으로 직경이 약 1 내지 5㎛이며, 세포자멸사를 겪고 있는 세포, 즉, 병에 걸린, 원치않는 및/또는 비정상 세포의 수포로서 방출된다. 그들은 PS 외재화를 특징으로 하며, 단편화된 DNA를 함유할 수 있다.

B. 아세트산염 침전의 정제 기법 및 이점

광대한 연구에도 불구하고, 세포외 미세소포에 대한 빠르게 생겨나는 연구 분야는 기술적으로 어려운 것으로 남아있는 것으로 문헌에서 널리 받아들여지고 있다. 예를 들어, 문헌[

]은 이러한 물질의 단리와 관련된 어려움을 포함하는, 세포외 미세소포 제제 및 측정과 관련된 주된 시험감염 및 문제 및 곤란함을 검토한다.

세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀의 정제를 위해 본래 기재되고 가장 널리 사용되는 방법은 세포 및 세포 파편을 제거하는 상승적 원심분리 단계, 다음에 세포외 미세소포 및 엑소좀을 펠렛화하기 위한 100,000g에서의 초원심분리 단계를 수반한다(Thery et al., 2006). 다른 기법은 한정된 기공-크기 막을 통한 여과(Grant et al., 2011), PEG(예를 들어, 미국 특허 제8,901,284호 및 미국 특허 제2013/0337440 A1호)를 포함하는 중합체 기반 침전(Taylor et al., 2011), 및 ELISA 플레이스 상의 트래핑(Logozzi et al., 2009) 또는 항체-코팅 비드(Clayton et al., 2001)를 포함한다. 고도로 전문화된 방법 및 키트는 종양-특이적 단백질, 예컨대 HER2/neu(Koga et al., 2005), 또는 다른 엑소좀 표면 마커(예를 들어, 엑소-플로우(Exo-Flow)(상표명) 키트)에 대해 항체로 코팅된 자기 비드를 이용하여 종양-유래 엑소좀을 정제하는데 이용될 수 있다.

대부분의 해당 방법은 거대 용적의 물질을 수용할 수 있지만, 그들은 힘들고, 매우 시간 소모적이며 전문화된 연구 장비가 필요하기 때문에 실행이 제한된다. 대다수의 연구는 거대 용적의 조직 배양 상청액으로부터 엑소좀의 단리를 필요로 하기 때문에, 연구를 위한 충분한 농도를 얻는데 필요한 용적의 상당한 감소는 모든 현재의 기법을 제한한다.

따라서 본 발명자들은 배양 상청액 및 생물학적 유체로부터 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀, 특히 질환 관련 및 종양-유래 엑소좀의 정제 또는 단리를 위한 새로운 방법을 조사하는 것을 추구하였다. 그들은 아세트산염 완충제의 놀라운 용도에 기반한 새롭고 유리한 기법을 개발하였다(실시예 I 및 실시예 II). 이전의 방법과 대조적으로, 본 발명은 빠르고 효율적인 단리 절차를 제공하여 초원심분리에 의해 얻어지는 것과 구별되지 않는 엑소좀을 수득한다. 중요하게는, 새로운 방법은 매우 거대 용적의 물질을 용이하게 수용하며, 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀의 정제는 전문화된 장비없이 최소 비용으로 달성될 수 있다.

세포외 미세소포는 원핵생물과 진핵생물 둘 다에 존재하고 모든 진화에 걸쳐있기 때문에(

), 본 발명은 원핵생물, 진핵생물, 박테리아, 진균, 효모, 무척추동물, 척추동물, 파충류, 어류, 곤충, 식물 또는 설치류 및 영장류와 같은 포유류를 포함하는 동물로부터의 임의의 생물학적 유체와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 유체는 닭 혈청, 마우스 혈청, 래트 혈청, 토끼 혈청, 염소 혈청, 새끼양 혈청, 양 혈청, 말 혈청, 돼지 혈청, 소 혈청(소태아 혈청) 및 인간 혈청일 수 있다. 생물학적 유체의 바람직한 예는 각각 뮤린, 소 또는 인간인 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 준비하기 위해 사용되는 바와 같은 뮤린, 소 또는 인간 생물학적 유체이다.

적합한 생물학적 유체(또는 생체유체)의 예는 생물학적 조직 샘플로부터의 세포 배양 상청액, 전혈, 혈청, 혈장, 복수액, 뇌 및 뇌척수액, 골수 흡입물, 기관지-폐포 세척물, 소변, 정액, 질액, 점액, 타액, 객담 및 정제된 용해물이다. 모유, 눈물, 땀, 관절 또는 활액, 양수, 여포액 및 대변 또는 배설액이 또한 사용될 수 있다. 생물학적 유체는 갓 만들어졌거나 또는 사전에 냉동된 다음, 해동될 수 있다.

본 발명과 함께 사용하기 위한 바람직한 생물학적 유체는 세포 배양 상청액, 혈청, 혈장 및 복수액이다. 세포 배양 상청액 및 조건화된 배지에 대해, 감작된 세포를 포함하는 세포 또는 세포의 집단은 세포에 의한 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 방출 및/또는 분비시키는 조건 하에서 배양된다.

특정 실시형태에서, 생물학적 유체는 "정제된" 생물학적 유체, 예컨대 정제된 세포 배양 상청액일 것이며, 저속 원심분리가 이미 실시되었다는 것을 의미한다. 그러나, 다른 실시형태에서, 생물학적 유체는 아세트산염 완충제와 접촉 전에 본 발명의 부분으로서 세포, 세포 파편 및 거대막 소수포를 제거하기 위해 저속 원심분리를 실시할 수 있다.

생물학적 유체는 이하에 상세하게 기재하는 바와 같이, 병에 걸린 세포 또는 조직으로부터 얻을 수 있다. 암에 대해, 고형 종양 및 암종을 포함하는 임의의 악성 종양이 사용될 수 있으며, 예시적인 종양은 폐, 유방, 난소, 위, 췌장, 후두, 식도, 고환, 간, 귀밑샘, 담도, 결장, 직장, 자궁경부, 자궁, 자궁내막, 신장, 방광, 전립선, 갑상선, 편평세포암종, 선암종, 소세포 암종, 흑색종, 신경교종, 교아종, 신경아세포종 등의 암종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 예로부터, 흑색종, 직장결장암, 폐암, 췌장암, 간암, 전립선암, 유방암 및 난소암으로부터의 샘플이 통상적으로 사용된다.

생물학적 유체 샘플이 아세트산염 완충제과 접촉되어 침전물을 형성한 후에(침전물은 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 함유함), 침전물은 바람직하게는 저속 원심분리에 의해 수집된다. 원한다면, 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀의 단리된 집단은 추가로 원심분리되어 임의의 오염 성분을 제거하고, 이에 의해 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀의 본질적으로 순수한 조성물을 제공할 수 있다.

단리된 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀은 바람직하게는 세척되어 잔여 배지를 제거하고, 추가로 바람직하게는 약 중성의 pH, 생리학적 pH(예컨대 약 pH 7.35 내지 7.45) 및/또는 임의의 표준 실험실 pH 예컨대 pH 7.5 또는 7.6 등에서 무 아세트산염 완충제 중에서 재현탁 시 "재가용화"된다.

본 발명의 방법은 유리하게는 생물학적 유체, 예컨대 배양 상청액으로부터 실질적인 양의 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 회수할 수 있고, 예를 들어, 배양 상청액으로부터 본질적으로 모든 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 회수하는 것을 포함하여, 배양 상청액으로부터 적어도 거의 절반의 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 회수할 수 있다.

이런 단순하고 비용 효과적인 방법은 제한되지 않은 양의 배양 상청액으로부터 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀의 수율을 상당히 증가시킨다. 이 기법에 의해 단리된 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀은 또한 직접적 초원심분리에 의해 회수되는 것과 구별가능하지 않고(실시예 III) 실질적으로 항원성으로 무결함인(예를 들어, 실시예 III 및 실시예 XIII) 것으로 나타난다. 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀, 특히 종양-유래 엑소좀의 통상적인 특징을 고려하면, 종에 걸쳐, 본 발명은 기탁된 종양 세포주로부터(예를 들어, 실시예 IV) 그리고 뮤린 및 다른 설치류, 소 및 인간 공급원으로부터 유래된 세포 및 유체로부터(예를 들어, 실시예 V에 나타낸 바와 같음)를 포함하는 넓은 범위의 공급원으로부터의 세포 및 유체로부터 엑소좀을 단리시키기 위해 사용될 수 있다.

필수적인 것으로 믿어지지는 않지만, 특히 실시예 IV의 ATCC(등록상표) 기탁 종양 세포주와 함께 사용되는 바와 같은 실시예 I 및 실시예 IV의 프로토콜은 정량적 기준 실시예로서를 포함하여, 본 발명과 비교를 위한 기준 실시예로서 사용될 수 있다.

세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 단리시키기 위한 아세트산염 완충제의 현재의 사용은 세포외 미세소포 및 엑소좀의 표면 상에, 특히 질환 관련 엑소좀, 예컨대 종양-유래 엑소좀 상에 존재하는 음으로 하전된 인지질, 포스파티딜세린(PS)을 수반하는 "하전 중화"에 의해 작용하는 것으로 믿어진다(Keller et al., 2009; Taylor et al., 2011; Grant et al., 2011). 본 리포좀 연구에 의해 나타내는 바와 같이(실시예 VIII), 아세트산염의 동일한 사용은 그들의 표면 상에서 PS에 의할 때조차, 지질 소수포를 단독으로 침전시키지 않는다. 따라서, PS는 소수포 단리를 위해 필요하지만 충분하지 않으며, 본 발명은 질환 관련 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 단리시키는데 효과적인 것으로 믿어지는데, 그들이 비지질막 성분, 특히 막 단백질과 공동으로 그들의 표면 상에 PS를 가지기 때문이다.

세포외 미세소포, 예를 들어, 엑소좀의 막 표면은 그들이 유래된 세포의 혈장막을 반영한다. PS는 건강한 또는 정상 세포의 내부에서 유지되기 때문에, 정상 세포로부터 유래된 세포외 미세소포는 PS 음성이다. 예를 들어, 문헌[Connor et al. (2010)]은 대다수의 순환하는 혈소판-유래 세포외 미세소포가 아넥신 X에 결합하지 못하고 따라서 PS 음성이라는 것을 보고하였다. 대조적으로, 질환 및/또는 세포 활성화의 다양한 상태에서, PS는 세포 외부에 노출되고, 따라서 병에 걸리거나, 감염되거나, 과도하게 활성화되거나 또는 달리 비정상적인 세포로부터 유래된 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀은 이하에 더 상세하게 기재되는 바와 같이 PS 양성이다.

본 발명을 성공적으로 실행하기 위해 아세트산염-기반 엑소좀 침전 및 단리를 초래하는 정확한 메커니즘을 이해하는 것은 필요하지 않다. 그럼에도 불구하고, 다음의 관찰 및 통찰이 제공된다. 메커니즘은 등전점에서의 침전 때문에 나타나지 않는데, HCl 또는 시트르산염을 이용하여 용액을 산성화시켰을 때 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀은 침전되지 않기 때문이다. 흥미롭게도, 지난 40년에 걸친 문헌을 검토하면, 본 발명자들은 적혈구 아포단백질의 재조합에 의해 형성된 소수포의 침전이(Zwaal & van Deenen, 1970) 음으로 하전된 포스파티드산 또는 PS의 존재에 의존한다는 것을 주목하였다. 따라서, 본 발명자들은 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀의 침전 및 단리를 초래하는 원칙적 메커니즘이 증가된 응집 및 수반되는 침전을 초래하는 소수성 상호작용을 촉진시키는 소수포 또는 엑소좀 수화층의 아세트산염-매개 제거인 것을 믿는다. 바람직한 pH 범위(4.25 내지 5.25, 바람직하게는 4.5 내지 5.0, 최적은 4.75)의 측면 중 하나에 대한 침전의 감소는 수화층을 강화하는 증가된 양성 또는 음성 표면 전하에 기인할 가능성이 있으며, 이에 의해 동일한 정도의 침전에 영향을 미치도록 염을 감소시키는 것을 필요하게 만든다.

아세트산염 완충제의 놀라운 용도에 추가적으로, 특히 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀, 특히 형태적으로 무결함인 세포외 미세소포 및 엑소좀을 효과적으로 단리시키기 위한 pH 범위 약 4 내지 약 6의 임의의 완충제의 사용은 엑소좀을 완전히 용해하기 위한 이 pH 범위에서 완충제의 사용에 관한 문헌에서의 정보와 대조적으로 실행된다(미국 특허 제8,530,228호의 용해 용액 1 및 2). 그럼에도 불구하고, 본 발명은 다른 기법에 의해 제조되는 엑소좀과 구별되지 않는 형태적으로 무결함인 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀의 제조를 제공한다.

알릭스 및 hsp70 항체를 이용하는 유세포분석, EM, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의한 초원심분리된 세포외 미세소포 및 엑소좀 집단에 대한 산성화의 비교는 집단이 둘 다 서로 구별되지 않는다는 것을 나타낸다. K1735 흑색종 세포로부터의 아세트산염-침전 엑소좀 집단에서 α2 마크로글로불린(약 160kDa에서의 밴드)의 증가가 있었지만, 이는 본 발명의 제한이 아니다. 첫째로, 외래 단백질 침전은 공급원 세포의 유형에 의존할 가능성이 있으며, α2-마크로글로불린은 일부 흑색종 및 육종 세포에 의해 생성되는 것으로 알려져 있다(Morgan, 1984; Bizik et al., 1986). 사실, α2-마크로글로불린은 B16 흑색종 또는 TRAMP 전립선 암종 세포로부터 유래된 세포외 미세소포 및 엑소좀에서 검출가능하지 않다(실시예 IV). 둘째로, 일부 외래 단백질 침전은 핵산 기반 엑소좀 진단 분석을 방해하지 않지만, 면역치료 사용 전에 바람직한 해당 외래 단백질은 어쨌든 용이하게 제거될 수 있다. 이 경우에, 일단 거대 용적의 배양 상청액이 아세트산염을 지니는 처리할 수 있는 용적으로 감소되지만, 재가용화된 침전물의 100,000g 원심분리는 임의의 오염 단백질을 용이하게 제거할 수 있다.

예비 연구는 또한 아세트산염 완충제가 전체 인간 혈액으로부터 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 단리시키기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타낸다(실시예 VI). 공지된 양의 정제된 종양-유래 엑소좀을 섞은 전혈을 이용하여, 아세트산염 침전은 응고된 혈청 샘플 및 EGTA-혈장 각각으로부터 첨가된 엑소좀의 약 40% 내지 약 100%를 회수하였다. 회수된 단백질 양의 차이가 있으며, 이는 혈장 샘플 내 피브리노겐의 침전에 기인하는 것으로 믿어진다. 임의의 이러한 피브리노겐은, 예를 들어 56℃에서 3분 동안 사전인큐베이션에 의해 용이하게 제거될 수 있다(Millar et al., 1971; Marx et al., 2008). 사실, 이 단계는 아세트산염 침전 샘플 내 외래 단백질의 수준을 혈청 샘플에 대해 얻은 것과 비슷한 수준으로 감소시키며, 본질적으로 엑소좀의 손실은 없다. 상기 논의한 바와 같이, 엑소좀 제제 내 일부 외인성 단백질의 존재는 전사체 분석에 대해 임의의 문제를 가져서는 안 된다. 면역원으로서 또는 다른 요법에서 사용을 위해, 일단 용적이 아세트산염을 지니는 관리가능한 용적으로 감소되었다면, 비엑소좀 단백질은 초원심분리에 의해 용이하게 제거될 수 있다.

본 발명의 중요한 양상은 정상 세포 및 유체로부터의 세포외 미세소포 및 엑소좀과 대조적으로 질환 관련 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀, 특히 바이러스- 및 종양-유래 세포외 미세소포 및 엑소좀을 침전시키기 위한 특이성이다(실시예 VII 및 실시예 IX). 이는 실행적 실험 연구를 위해 그리고 진단 시험 및 키트를 위해 중요성을 가진다.

본 발명의 특이성은 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀의 특정 집단이 다른 성분이 "실질적으로 없이" 제조되는 다수의 실시형태를 야기한다. 예를 들어, 비-질환 관련 세포외 미세소포 또는 엑소좀, 예를 들어, 정상 세포가 실질적으로 없는 질환 관련 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀; 비-종양-유래 세포외 미세소포 또는 엑소좀, 예를 들어, 정상세포가 실질적으로 없는 종양-유래 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀; 비-바이러스-유래 세포외 미세소포 또는 엑소좀, 예를 들어, 정상 세포가 실질적으로 없는 바이러스-유래 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀; 질환 관련, 종양-유래 및/또는 바이러스-유래 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀이 실질적으로 없는 유체, 예컨대 혈청; 감염성 바이러스 및 세포외 미세소포, 예컨대 바이러스-감염 세포로부터 유래된 엑소좀이 실질적으로 없는 유체, 예컨대 혈청; 감염성 바이러스가 실질적으로 없는 바이러스-유래 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀; 비-질환 관련, 비-종양-유래 및/또는 비-바이러스-유래 세포외 미세소포 또는 엑소좀 및 비-엑소좀 성분 또는 오염물질이 실질적으로 없는 질환 관련, 종양-유래 및/또는 바이러스-유래 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀.

모든 이러한 내용에서, 다른 인용된 성분(들)이 "실질적으로 없는" 및 "본질적으로 없는" 성분은, 다른 인용된 성분(들)이, 예를 들어, 이러한 다른 인용된 성분(들)에 대한 표준 정량적 또는 바람직하게는 기능성 분석에서 측정되는 바와 같은 검출가능한 효과를 포함하는 조성물에 대한 물질 효과가 본질적으로 없도록, 다른 인용된 성분(들)이 충분히 없는 조성물을 의미하기 위해 사용된다. 즉, 다른 인용 성분(들)은 조성물의 기능을 물질적으로 또는 심지어 측정가능하게 방해하지 않거나, 또 다르게는, 예를 들어 조성물의 활성 성분의 표준 정량적 또는 바람직하게는 기능성 분석에서 측정되는 바와 같은 임의의 뜻밖의 반응, 특성 또는 결함을 야기한다.

실질적으로 무 아세트산염(즉, 실질적으로 아세트산염이 없는) 완충제, 세포가 본질적으로 없는 그리고 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체를 제외한 용적이 본질적으로 없는의 용어에 있어서 "실질적으로 없는"과 "본질적으로 없는"은 유사한 의미로 여겨진다.

예를 들어, 실험실에서 대부분의 세포에 대한 표준 성장 배지가 동물 혈청, 예컨대 소 혈청 또는 소 태아 혈청을 포함하기 때문에, 배지 중의 혈청은 해당 동물 공급원으로부터 전형적으로 다량의 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 함유할 것이다. 해당 배지-유래 세포외 미세소포 및 엑소좀은 배양 세포에 의해 분비되는 세포외 미세소포 및 엑소좀을 분석하는 것을 목적으로 하는 연구를 방해할 수 있다. 이 문제를 처리하기 위한 선택사항은 배지/혈청으로부터 엑소좀을 고갈시키는 여분의 단계를 포함하고, 엑소좀-고갈 성장 상청액, 예컨대 엑소좀-고갈 소 태아 혈청(예를 들어, 엑소-FBS(상표명))을 사용하는 것이다.

그러나, 본 발명은 정상 세포(소위 "정상" 세포외 미세소포 및 "정상" 엑소좀)로부터 유래된 세포외 미세소포 및 엑소좀과 별도로 종양-유래 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 단리시키는 능력을 제공하기 때문에, 배양된 종양 세포로부터 직접적으로 종양-유래 세포외 미세소포, 예컨대 종양-유래 엑소좀을 단리시키기 위해 본 발명을 이용할 때 이러한 힘들고/힘들거나 비용이 드는 절차는 더 이상 필요하지 않다.

추가로, 본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 정상 세포외 미세소포 및 엑소좀으로부터 종양-유래 세포외 미세소포, 예컨대 종양-유래 엑소좀을 분리시키는 능력은 종양-유래 세포외 미세소포 및 엑소좀의 존재에 대해 인간 환자로부터의 시험 유체에 대한 것을 포함하는 진단 시험 및 키트에 대해 중요성을 가진다. 이와 관련하여, 종양-유래 세포외 미세소포, 예컨대 종양-유래 엑소좀을 침전시키기 위한 단순한 시험은 의사의 방문에서 일상적으로 얻어지는 혈액 샘플에 대해 수행된 일련의 시험에 추가될 수 있었다. 이어서, 이러한 시험에서 초기 양성은 다음에 환자의 추가적인 임상 평가와 함께 침전된 종양-유래 세포외 미세소포, 예컨대 종양-유래 엑소좀의 추가 분석, 특히 바이오마커, 예컨대 RNA, 마이크로 RNA, DNA 또는 단백질 바이오마커를 시험하는 것이 이어진다.

단리된 세포외 미세소포, 예컨대 종양-유래 엑소좀을 추가로 분석하기 위해, 예를 들어, 문헌[

]에 기재된 바와 같은 넓은 범위의 바이오마커가 공지되어 있으며, 이 중 임의의 하나 이상은 본 발명의 부분으로서 평가될 수 있다. 예로서, 엑소좀 바이오마커는 알릭스 및 hsp70, CD63 및 카베올린-1(Logozzi et al., 2009), CD81 및 CD82를 포함한다. 분석된 바이오마커는 비-엑소좀, 예컨대 종양 또는 바이러스 마커일 수 있다. 바이오마커는 임의의 수단, 예컨대 전기영동 분리, 면역단리, 크로마토그래피 또는 이들의 조합에 의해 단리될 수 있고, MALDI MS 및 면역분석, 예컨대 웨스턴 블롯, 효소결합 면역분석(ELISA), 방사면역측정법(RIA) 또는 경쟁적 결합 분석을 포함하는 임의의 수단, 예컨대 면역분석, 질량분석법 또는 이들의 조합에 의해 정량화된다.

단리된 세포외 미세소포, 예컨대 종양-유래 엑소좀의 추가적인 분석에 대해,과학적 연구 및/또는 임상 진단을 위한 것이든 예방 목적을 위한 것이든, 단리된 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀은 그들이 "항체-결합 형태"로 그들의 본래의 표면 마커 및 항원을 실질적으로 보유하도록 실질적으로 "항원적으로 무결함"이라는 특정 이점이 있다. 게다가, 실질적으로 항원적으로 무결함인 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀은 새로운 치료적 항체, 예컨대 인간화된 또는 인간 항체를 얻기 위해 실험 동물을 면역화하는 것을 포함하는 항체를 생성하기 위해 면역화에서 사용될 수 있는데, 항체는 세포외 미세소포 또는 엑소좀 상에서 유지된 보존된 항원 또는 마커, 특히 종양 또는 바이러스 항원 또는 마커를 인식한다.

그러나, 단리된 세포외 미세소포 및 엑소좀의 내부에 대해, 단리 방법의 상대적으로 낮은 pH는 또한 소수포의 내부를 산성화할 가능성이 있다. 따라서, 예를 들어, RT PCR에 의한 핵산 바이오마커의 분석을 위해, 세포외 미세소포 및 엑소좀은 적어도 분석 전에, 더 바람직하게는 단리 후 및/또는 임의의 저장 또는 냉동 전에 시기 적절한 방식으로 중성 pH, 생리적 pH(예컨대 약 pH 7.35 내지 7.45) 또는 임의의 표준 실험실 pH(예를 들어, 약 pH 7.5 또는 7.6)로 회복되는 것이 바람직하다. 약 7.0 내지 약 pH 7.6의 pH에서 무 아세트산염 완충제 중에서 단리된 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 재현탁시키는 것은 어쨌든 바람직하지만, 핵산 분석을 위해 더 중요한 것으로 믿어진다.

C. 아세트산염 완충제

실시예 I 및 도 1a 및 도 1b에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 단리시키는 "염석" 또는 침전 방법은 아세트산염 완충제의 전체 범위에 걸쳐 효과적이다. 특히, "아세트산염 완충제"는 그들의 바로 그 특성에 의해 약 pH 3.7 내지 약 pH 5.8의 pH 범위를 가지며, 예컨대 약 pH 3.75 내지 약 pH 5.75의 pH 범위를 갖거나, 또는 약 pH 3.7 내지 약 pH 5.6의 pH 범위를 갖는 것을 주목한다.

예를 들어, 특히 아세트산나트륨에 관해, 잘 공지된 재료, 예컨대 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)(등록상표)의 버퍼 레퍼런스 센터(Buffer Reference Center)는 아세트산나트륨-아세트산 완충제 용액이 약 pH 3.7 내지 약 pH 5.6의 유용한 pH 범위를 가진다는 것을 나타낸다(또한 문헌[Dawson, 1986] 참조). 이하의 완충제 표는 아세트산나트륨 3수화물, CH3COONa

3H₂O, 분자량 136.09를 기재하며, 여기서 0.2M-용액은 27.22 g/ℓ를 함유하고, x㎖ 0.2M-NaOAc와 y㎖ 0.2M-HOAc는 혼합된다.

본 발명은 아세트산염 완충제의 범위에 의한, 예를 들어, 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 아세트산나트륨, 아세트산칼륨(예를 들어, 실시예 II 및 도 4b 참조) 및 아세트산암모늄 및 이들의 혼합물과 함께 사용에 적합하며, 아세트산나트륨 및 아세트산칼륨이 바람직하고, 아세트산나트륨이 특히 바람직하다. 해당되는 다른 아세트산염 완충제, 예컨대 아세트산칼륨 및 아세트산암모늄은 또한 약 pH 3.7 내지 약 pH 5.8의 일반적 pH에 있으며, 예컨대 약 pH 3.75 내지 약 pH 5.75의 pH를 갖거나 또는 약 pH 3.7 내지 약 pH 5.6의 pH를 가진다.

실시예 I 및 도 1a 및 도 1b에서 나타내는 바와 같이, 염 및 pH 조건의 전체 범위는 세포외 미세소포, 예컨대 종양-유래 엑소좀을 침전시키는데 효과적이고, 단백질의 의미있는 범위는 모든 시험 조건으로부터 회복된다. 예를 들어, 도 1a에서 데이터 지점에 곡선을 적합화시킴으로써, pH 3.75 내지 pH 5.75, 및 0.05M 내지 0.5M의 아세트산염 완충제가 효과적이라는 것을 알 수 있다. 실제 데이터 지점은 0.05M 내지 0.5M의 전체 농도 범위에 걸쳐 pH 4.14, pH 4.39, pH 4.64, pH 4.89, pH 5.14 및 pH 5.64에서 효과적인 침전이 일어났다는 것을 나타낸다(도 1a). 효과적인 침전은 또한 시험한 각각의 농도, 즉, 0.05M, 0.1M, 0.233M, 0.367M a및 0.5M에서 일어났다(도 1a). 데이터 지점에 곡선을 적합화함으로써, 각각의 농도에 대한 pH 최적은 다음과 같이 결정될 수 있다: 0.05M에서 pH 4.65; 0.1M에서 pH 4.75; 0.233M에서 pH 4.80; 0.367M에서 pH 4.77; 및 0.5M에서 pH 4.78(도 1b).

그러나, 아세트산염 완충제가 효과적인 pH 및 농도의 전체 범위에 걸쳐있음에도 불구하고, 특정 바람직한 범위가 선택될 수 있다. 도 1a에서 나타내는 바와 같이, 본 발명은 약 pH 4.14 내지 약 pH 5.25 또는 약 4.25 내지 약 5.25의 pH, 바람직하게는 약 4.5 내지 약 5.0의 pH 및 약 0.05M 내지 약 0.25M, 예컨대 0.05M, 0.1M 및 0.233M의 농도를 갖는 아세트산염 완충제를 이용하는 것이 효과적이며, 약 0.05M 내지 약 0.1M의 농도가 바람직하다. 예를 들어, 0.1M 아세트산염을 이용하는 pH 4.75로의 조직 배양 상청액의 적정은 사실상 모든 엑소좀의 즉각적인 침전을 초래하는 것으로 본 명세서에서 나타난다.

따라서 본 발명은 pH가 약 4.14, 4.25, 4.3, 4.39, 4.35, 4.4, 4.45, 4.5, 4.55, 4.6, 4.64, 4.65, 4.7, 4.75, 4.8, 4.85, 4.89, 4.9, 4.95, 5.0, 5.05, 5.1, 5.14, 5.15, 5.2, 5.25, 5.64 또는 약 5.75이고; 더 바람직하게는, pH가 약 4.5, 4.55, 4.6, 4.65, 4.7, 4.75, 4.8, 4.85, 4.9, 4.95 또는 5.0이며; 가장 바람직하게는, pH가 약 4.65, 4.7, 4.75, 4.8 또는 4.85인 아세트산염 완충제의 사용을 포함한다.

따라서 본 발명은 약 0.01M, 0.02M, 0.03M, 0.04M, 0.05M, 0.06M, 0.07M, 0.08M, 0.09M, 0.10M, 0.11M, 0.12M, 0.13M, 0.14M, 0.15M, 0.16M, 0.17M, 0.18M, 0.19M, 0.20M, 0.21M, 0.22M, 0.23M, 0.233M, 0.24M, 0.25M, 0.26M, 0.27M, 0.28M, 0.29M, 0.30M; 0.31M, 0.32M, 0.33M, 0.34M, 0.35M, 0.36M, 0.367M, 0.37M, 0.38M, 0.39M, 0.40M, 0.41M, 0.42M, 0.43M, 0.44M, 0.45M, 0.46M, 0.47M, 0.48M, 0.49M, 0.50M, 0.51M, 0.52M, 0.53M, 0.54M 또는 0.55M의 농도에서; 더 바람직하게는 약 0.05M, 0.06M, 0.07M, 0.08M, 0.09M, 0.10M, 0.11M, 0.12M, 0.13M, 0.14M, 0.15M, 0.16M, 0.17M, 0.18M, 0.19M, 0.20M, 0.21M, 0.22M, 0.23M, 0.233M, 0.24M 또는 0.25M의 농도에서; 훨씬 더 바람직하게는, 약 0.05M, 0.06M, 0.07M, 0.08M, 0.09M 또는 0.10M의 농도에서 아세트산염 완충제의 사용을 포함한다.

도 1a와 동일한 데이터의 공간채움(또는 3D) 모델로부터, 약 pH 4.14 내지 약 pH 5.25, 약 pH 4.14 내지 약 pH 5.0, 약 pH 4.39 내지 약 pH 5.4, 약 pH 4.39 내지 약 pH 5.25 및 약 pH 4.39 내지 약 pH 5.14의 pH 범위, 및 약 0.05M 내지 0.25M, 약 0.05M 내지 0.233M 및 약 0.05M 내지 0.15M의 농도가 바람직하며; 약 pH 4.5 내지 약 pH 5.4, 약 pH 4.5 내지 약 pH 5.25 및 약 pH 4.5 내지 약 pH 5.0의 pH 범위, 및 약 0.05M 내지 0.233M, 약 0.05M 내지 0.15M 및 약 0.05M 내지 0.1M의 농도가 특히 바람직하다.

따라서 훨씬 더 바람직한 범위는 약 pH 4.5 내지 약 pH 5.25, 또는 약 pH 4.5 내지 약 pH 5.0, 및 약 0.05M 내지 0.15M, 또는 약 0.05M 내지 0.1M의 농도이다.

임의의 pH 범위 또는 수는 임의의 농도 범위 또는 수와 조합될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시형태 내에서, 아세트산염 완충제는 약 4.25 내지 약 5.25의 pH 및 약 0.05M 내지 약 0.25M의 샘플 중의 최종 농도를 가질 수 있으며; 더 바람직하게는, 아세트산염 완충제는 약 4.5 내지 약 5.0의 pH 및 약 0.05M 내지 약 0.1M의 샘플 중의 최종 농도를 가진다. 현재 가장 바람직한 실시형태는 약 0.1M의 농도 및 약 4.75의 pH에서 아세트산나트륨 완충제의 사용이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "농도"의 논의 전체적으로, 효과적인 농도는, 전형적으로, 10X 농축된 아세트산염 완충제의 1/10 용적이 생물학적 유체의 샘플에 첨가되도록 생물학적 유체의 샘플 중의 "최종 농도"로서 제시된다. 예를 들어, 1.0M 아세트산염 완충제의 1/10 용적은 0.1M의 샘플 중의 최종 농도를 제공하도록 첨가된다.

특정 실시형태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 아세트산염 완충제는 바람직하게는 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 덱스트란, 예컨대 황산덱스트란 및 아세트산덱스트란; 및 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐 알코올, 폴리비닐아세테이트 또는 폴리비닐 설페이트를 제외한 용적이 본질적으로 없을 것이다.

D. 질환에서 포스파티딜세린 노출

종양으로부터 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀의 단리는 본 발명의 중요한 양상이다. 종양-유래 세포외 미세소포 및 엑소좀에 추가로, 해당 조성물은 유래 세포의 세포외 미세소포 및 엑소좀을 반영하기 때문에, 본 발명을 이용하여 단리될 수 있는 PS 양성 세포외 미세소포 및 엑소좀의 다른 공급원은 넓은 범위의 병원균으로 감염된 세포로부터의 세포외 미세소포 및 엑소좀이다.

예를 들어, 세포내 기생생물, 예컨대 기생성 원생동물, 레이쉬마니아 아마조넨시스(Leishmania amazonensis)(Zandbergen et al., 2006; Wanderley et al., 2009; Wanderley et　al., 2013), 말라리아를 야기하는 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum)(Eda & Sherman, 2002; Pattanapanyasat et　al., 2010; 미국 특허 제7,262,167호) 및 트립파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi) 기생성 원생동물(DaMatta et al., 2007)은 모두 PS 노출을 야기한다. 마찬가지로, 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)와 같이(Seabra et al., 2004) 주혈흡충(Schistosoma) 기생성 편형동물은 또한 PS를 노출한다(van der Kleij et al., 2002).

PS 노출은 또한 세포내 박테리아 병원균, 예컨대 흑사병 및 야토병을 각각 야기하는 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis) 및 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)(Lonsdale et al., 2011)에 의한 감염 후 외부 세포 표면 상에서 나타났다. 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)는 또한 감염 숙주 세포로부터 외면 PS를 지니는 막 유래 소수포의 방출을 촉진시킨다(Czuczman et al., 2014). 유사하게, 수막염-야기 병원균인 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)로 감염된 내피 세포는 세포 표면에 대해 PS 전좌를 나타내었다(Schubert-Unkmeir et al., 2007). 대식세포에서 세포내로 복제하는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 의한 감염은 결핵결절 병변에서 호중구의 PS 외재화와 관련된다(Francis et al., 2014). 마찬가지로, 선택적 세포내 기생충인 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila)는 인간 단핵구에서 PS 외재화를 유도한다(

)..

따라서, 상기 상술한 선택적 세포내 기생생물에 대해 통상적인 PS 외재화는 다른 이러한 병원균, 예컨대 살모넬라(Salmonella) 및 브루셀라(Brucella)에 대해 일어날 가능성이 있다. 이는 또한 절대 세포내 기생생물, 예컨대 클라미디아 종(Chlamydia spp.)에 의한 감염에 대해 기록되었으며, 이때 PS 외재화는 발병에 중요하고, 감염된 상피, 내피, 과립구 및 단핵구 세포 상에서 나타났다(Goth & Stephens, 2001).

사실, 숙주 세포 상의 PS 외재화는 현재 다양한 박테리아 및 병원균에 의한 감염에 대한 반응에서 일반적으로 인식되는 현상이다(Wandler et al., 2010). 이는 추가로 위 상피 세포를 침입하는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)를 포함하고(Petersen & Krogfelt, 2003), 해당 세포와의 직접 접촉 시, 숙주 혈장막의 외층(outer leaflet)에 대한 PS의 외재화를 유도한다(Murata-Kamiya et al., 2010).

숙주 세포가 PS를 외재화하도록 야기하는 두드러진 병원균은 바이러스이다(예를 들어, 미국 특허 제7,790,159호; 미국 특허 제7,906,115호; 문헌[Soares et al., 2008; Mercer and Helenius, 2008; Moody et al., 2010; Morizono et al., 2011; Meertens et al., 2012; Best, 2013; Bhattacharyya et al., 2013; Jemielity et al., 2013; Moller-Tank & Maury, 2014]). 사실, 외피가 있는 바이러스 유입 및 감염의 인핸서로서 PS 및 PS 수용체의 역할은 현재 잘 기록되어 있다(예를 들어, 문헌[Moller-Tank & Maury, 2014]의 표 1; 및 또한 본 명세서의 실시예 X 참조). 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀과 바이러스 감염 사이의 관계는 또한 최근 수년간 점점 더 명확하게 되었고(Meckes & Raab-Traub, 2011; Sims et al., 2014), 또한 넓은 범위의 바이러스에 적용된다(예를 들어, 문헌[Walker et al., 2009; Meckes et al., 2010; Izquierdo-Useros et al., 2010; Meckes & Raab-Traub, 2011]).

게다가, PS, 바이러스와 PS 양성 바이러스-유래 세포외 미세소포 사이의 관계는 외피가 있는 바이러스로 제한되지 않지만, 비-외피 바이러스로 연장된다(Clayson, et al., 1989; Chen et al., 2015). 특히, "PS 지질 소수포"를 보여주고, PS 소수포가 장내 바이러스의 효율적인 일괄적 전염을 가능하게 한다는 것을 나타내는 데이터를 수반하는 문헌[Chen et al., 2015]에 의한 세포 논문의 커버 페이지 상의 도면을 참고한다.

본 발명은 감염성 바이러스가 본질적으로 없는 것으로 나타난(실시예 XII), 바이러스-감염 세포 및 바이러스 배양물로부터의 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀(실시예 XI 및 실시예 XIII; 도 10A, 도 10B 및 도 10C)을 단리시키기 위해 성공적으로 사용되었다. 함께, 해당 데이터는 외피 바이러스(예를 들어, HSV 1)와 비외피 바이러스(예를 들어, SV40) 둘 다로 감염된 세포로부터의 본질적으로 비감염성, PS 양성, 세포외 미세소포의 단리를 나타낸다.

이것으로 구속되지 않고, 다음의 설명은 세포외 미세소포를 외피와 비외피 바이러스 둘 다로부터 침전시킴에 있어서 본 발명을 사용하는 이유를 설명한다. 모든 바이러스는 새로운 숙주 세포의 성공적인 감염을 보장하기 위해 숙주 세포로부터 성숙 비리온의 시기 적절한 배출을 조정한다. 외피 바이러스는 다음의 숙주 세포를 지니는 자손 비리온의 효율적인 유입을 매개하는 바이러스 단백질을 포매하기 위해 숙주 세포 혈장막을 이용한다. PS는 바이러스 방출 전에 바이러스 감염 세포의 외부 상에서 발견되고, 외피 바이러스는 숙주 세포를 나갈 때 바이러스 외피 내로 PS를 혼입한다(예를 들어, 실시예 X).

외피를 그들의 성숙 비리온 내로 혼입하지 않는 바이러스는 다른 메커니즘에 의해 숙주 세포를 이탈한다. 비외피 바이러스가 세포로부터의 새로운 비리온을 방출하기 위해 사용하는 일부 전략은 세포의 용해를 포함하는데, 이는 감염된 세포(T 세포 또는 대식세포)에 대한 숙주 면역 반응에 의해 직접적을 또는 숙주 세포 단백질 합성 또는 세포 구조 상에서 직접적으로 바이러스의 활성에 기인하여 야기될 수 있다. 세포 용해를 유도하기 위해 세포 구조를 변경하는 바이러스의 예는 아데노바이러스이다. 아데노바이러스는 필라멘트 네트워크 및 단백질 합성을 파괴함으로써 세포의 구조적 완전함을 변경시키는 감염 동안 몇몇 단백질을 늦게 발현시킨다(Flint, 2000). 일부 비외피 바이러스는 임의의 세포변성 효과 없이 비파괴적 메커니즘을 통해 그들의 자손 바이러스를 방출할 수 있다. 폴리오바이러스는 세포 용해를 빠르게(약 8시간) 유도하지만, 이는 또한 새로운 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 PS 지질 소수포에서 세포로부터 방출된다. PS-소수포에서 폴리오바이러스 입자는 PS-소수포로부터 제거된 바이러스 입자보다 헬라 세포 및 1차 대식세포를 감염시키는데 있어서 그리고 용량 의존적 방식으로 감염된 세포로부터의 소수포를 저해한 아넥신 V로 소수포를 차단함에 있어서 더 효율적인데, 이는 PS 지질이 폴리오바이러스 감염에 대한 보조인자라는 것을 시사한다. 폴리오바이러스에 추가로, 콕사키바이러스 B3 및 리노바이러스 입자는 또한 PS 지질 소수포 내로 방출되는데(Chen et al., 2015), 이는 세포의 용해 없이 성숙 입자를 선택적으로 방출시키는 장내 바이러스에 의해 이용되는 공통 메커니즘을 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 SV40에 대해, SV40은 또한 PS-지질 소수포의 상기 유형에서 세포로부터 방출될 가능성이 있다. 이는 공개되지는 않았지만, SV40 입자는 세포변성효과의 유도 전에 세포로부터 발출된 것으로 발견될 수 있다는 것이 보고되었다(Clayson et al., 989). 또한, SV40 비리온은 감염 후 48시간에 세포질의 매끄러운 소수포에서 관찰되었고, SV40 입자의 방출은 지질막을 가로질러 양이온 수송을 차단함으로써 세포내 단백질 수송을 차단하는 나트륨 이온통로구인 모네신에 의해 저해되었다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 단리시키기 위한 아세트산염 완충제의 사용은 비지질막 성분, 특히 막 단백질과 공동으로 표면 PS를 수반하는 것으로 믿어지고, 엑소좀 및 바이러스는 동일한 크기 범위인 것으로 믿어지기 때문에(예를 들어, 문헌[

]), 본 발명은 아세트산염 완충제를 이용하여 바이러스를 단리시키는 방법 및 조성물을 포함한다. pH가 약 5.25 내지 약 4.25(약 4.75의 pH를 포함함)인 완충제의 사용이 상대적으로 낮은 pH에 기인하여 바이러스를 불활성화할 가능성이 있기 때문에, 감염성 바이러스를 단리시키기 위한 방법은 현재 제안되지 않는다. 오히려, 예를 들어, 항원-유형 및 관련된 분석의 특성규명에서 사용에 적합한 비감염성 바이러스를 단리시키는데 더 적합하다. 가능하게는, 상기 방법은 감염성 바이러스, 특히 효과적인 pH 범위의 더 높은 끝에서 사용될 때, 더 구체적으로는, 고수율이 필요 또는 요망되지 않는 경우에, 감염성 바이러스를 단리시키기 위해 여전히 사용될 수 있다. 다르게는, 상기 제시한 바와 같이, 본 발명의 방법 및 조성물은 바이러스로부터 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 단리시키는데 더 적합하되, 감염성 바이러스가 실질적으로 없는 바이러스의 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 단리시키는데 적합하다는 것이 본 발명의 이점이다.

숙주 세포가 PS를 노출시키고/시키거나 PS 양성 세포외 미세소포 및 엑소좀이 보고된 몇몇 다른 질환 및 장애가 공지되어 있다. 예를 들어, 겸상적혈구증 및 겸상적혈구빈혈에서, 적혈구의 30 내지 40%는 건강한 사람에서의 단지 약 1%와 대조적으로 조기 노화되며 PS 양성("겸상 적혈구")이다. PS 양성 겸상 적혈구는 순환에 남아있고, 내피에 접착되며, 그들의 노출된 PS는 응고 진행을 초래하는 응집 캐스케이드의 개시를 위한 플랫폼으로서 작용한다(Kennedy et al., 2015).

PS 양성 세포외 미세소포는 또한 죽상경화반으로부터 방출된다(Mallat et al., 1999). 1형 당뇨병과 2형 당뇨병 환자는 둘 다 아넥신 V-양성인 것으로 나타났기 때문에 PS 양성 세포외 미세소포를 가진다(Sabatier et al., 2002). 알츠하이머병에서, 뇌 엑소좀은 PS 및 질환의 병원성 제제인 아밀로이드 β 펩타이드(Aβ)를 함유한다(Yuyama et al., 2012). PS 양성 세포외 미세소포는 또한 패혈증에 연루되며, 그들은 패혈증-유도 미세혈관 기능저하 및 면역억제의 마커 및 매개체이다(Souza et al., 2015). 따라서 본 발명은 모든 이러한 질환 및 장애로부터 PS 양성 세포외 미세소포를 단리시키는데 적용될 수 있다.

* * *

본 발명의 바람직한 실시형태를 입증하기 위해 다음의 실시예를 포함한다. 다음의 실시예에 개시된 기법은 본 발명의 실행에서 잘 작용하는 것으로 본 발명자에 의해 발견된 기법을 나타내며, 따라서 그의 실행을 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어, 다수의 변화가 개시된 구체적 실시형태에서 이루어질 수 있고, 또한 본 발명의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 비슷하거나 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 인식하여야 한다.

실시예 I

아세트산염 완충제를 이용하는 종양-유래 엑소좀의 단리

본 실시예는 아세트산염 완충제를 이용하여 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀, 특히 종양-유래 엑소좀을 단리시키는 유리한 방법을 나타낸다.

A. 물질 및 방법

다음의 물질 및 방법은 실시예 I, 실시예 II 및 실시예 III에서 보고된 결과에 대해 적절하다.

1. 조직 배양

K1735P 뮤린 흑색종(종양) 세포(텍사스주 휴스턴에 소재한 I.J. Fidler, M.D. 앤더슨 암 센터(Anderson Cancer Center)에 의해 제공되지만, 널리 입수가능)를 L 글루타민(2mM), 피루브산Na(1mM), 페니실린(100U/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖), 비필수 아미노산 및 소 태아 혈청(10%)으로 보충한 최소 필수 배지(MEM)에서 배양시켰다. 세포(15㎖ 배지에서 약 25 x 10⁶개)를 상부 챔버에서 250㎖ 배지를 수용한 셀라인 AD 1000 플라스크(인테그라 바이오사이언시즈 아게(Integra Biosciences AG))의 하부 챔버에 파종시켰다(Mitchell et al., 2008). 조건화한 배지(약 15㎖)를 매주 하부 챔버로부터 수집하였다. 15㎖의 인산염-완충 식염수로 구획을 1회 세척하고 나서, 조건화한 배지와 합하였다. 이어서, 새로운 배지를 하부 챔버에 첨가하였다. 약 100㎖ 소모 배지를 새로운 배지로 대체함으로써 상부 챔버를 매주 보충하였다. 매주 수집물에 아세트산염 완충제 침전 프로토콜을 실시하고, 전형적으로 조건화된 배지의 정제된 엑소좀/㎖의 75 내지 125㎍을 수득하였다(이하의 결과 참조).

2. 종양-유래 엑소좀의 단리

초원심분리 - 세포 조건화 배지에서 500g에서 30분 동안, 다음에 12,000g에서 추가 30분 동안 순차적 원심분리에 의해 세포, 세포 파편 및 거대막 소수포를 정제하였다. 100,000g에서 1시간 동안 초원심분리 후에 엑소좀을 맑은 상청액으로부터 엑소좀을 수집하였다. 펠렛을 약 2㎖ HEPES-식염수(HBS; NaCl 150mM, HEPES 20mM, EGTA 2mM, pH 7.6) 중에서 재현탁시켰다. BCA 단백질 분석에 의해 엑소좀 양을 추정하였다.

아세트산염 완충제 침전 프로토콜(표준) - 세포 조건화 배지를 순차적 원심분리에 의해 세포, 세포 파편 및 거대막 소수포를 정제하였다. 세포 조건화 배지를 500g에서 30분 동안(또는 250g에서 10분 동안) 원심분리시키고, 상청액을 수집하고, 이어서, 12,000g 내지 13,000g으로 추가 30분 동안 원심분리시켰다. 이들 단계는 정제 또는 정화된 상청액을 제공한다. 수 중의 1.0M 아세트산나트륨 용액을 준비하고 나서, 빙초산을 이용하여 pH 4.75로 적정하고 나서, 이 아세트산Na 완충제의 1/10 용적을 정제한 상청액과 혼합하고, 얼음 상에서 30 내지 60분 동안 두었다. 전형적으로, 이어서, 혼합물을 (이것은 선택적이지만) 37℃로 추가 5분 동안 옮겼다. 얻어진 혼탁한 현탁액을 10분 동안 2,000g 내지 5,000g에서, 전형적으로 5,000g에서 원심분리시키고, 상청액을 버리고 나서, 얻어진 펠렛을 0.1M 아세트산Na 완충제로 1회 세척하였다. 재현탁한 펠렛을 다시 약 2,000g에서 10분 동안 원심분리시키고 나서, 무 아세트산염 완충제의 예로서 헤페스-완충 식염수(HBS) 또는 트리스-완충 식염수(TBS) 중에서 최종 펠렛을 "가용화시켰다". 선택적으로, 임의의 남아있는 불용성 물질을 약 2,000g에서 10분 동안 원심분리에 의해 제거하고/하거나 또한 추가 정제를 추가적인 침전 회차에 의해 달성하였다. 정제한 엑소좀을 4℃에서 저장하였다.

3. 유세포 분석

0.5㎖ PBS 중의 종양 엑소좀(10㎍ 단백질)을 5㎕의 4μM 알데하이드-활성화 라텍스 비드(4% w/v)(인비트로젠(Invitrogen))와 4℃에서 밤새 혼합하였다. 이어서, 비드를 0.5㎖의 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 1시간 동안 첨가한 다음, 0.1㎖의 100mM 글리신을 추가 1시간 동안 첨가함으로써 차단시켰다. 이어서, 비드를 세척하고 나서, PBS 중에서 재현탁시켰다. 항체는 아이소타입 대조군으로서 토끼 항-알릭스(sc-99010; 산타 크루즈(Santa Cruz)) 및 토끼 항-튜불린(sc-5546; Santa Cruz)을 포함한 다음에, CY3-표지 당나귀 항-토끼 Ig를 첨가하였다. 1차 항체를 비드와 함께 얼음 상에서 인큐베이션시키고, 2회 세척하고 나서, 추가 1시간 동안 표지한 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 비드를 다시 세척하고 나서, 분석하였다. 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC)-아넥신 5(BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 제조업자에 의해 기재된 바와 같이 사용하였다. 샘플은 BSA-차단 비드 및 엑소좀-비드를 포함하였고, Ca² ⁺(1mM)의 존재 및 부재 하에서 아넥신 5와 함께 인큐베이션시켰다.

4. 전자 현미경

단리시킨 엑소좀을 문헌[Thery et al., 2006]에 의해 기재된 것으로부터 약간 변형한 절차를 이용하여 투과형 전자현미경에 의한 시험을 위해 준비하였다. 간략하게, 25㎕의 엑소좀 현탁액을 파라필름 상에 두고 탄소-코팅 그리드를 현탁시키고, 현탁액 상에서 1분 동안 페이스 다운시켰다. 이어서, 그리드를 1분 동안 각각 물 위에서 3회의 순차적 통과에 의해 세척시켰다. 이어서, 그리드를 1분 동안 25㎕ 점적의 2% 아세트산우라닐 상에 배치시킴으로써 염색하였고, 상기 기재한 바와 같이 수 중에서 다시 세척하였다. 과량의 물을 여과지 상에 블롯팅함으로써 제거하였다. 이어서, 그리드를 수 분 동안 공기 건조시켰다. 샘플을 JEOL 1200 EX 전자 현미경으로 시험하였다.

5. 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅

엑소좀을 5% β-머캅토에탄올을 함유하는 동일 용적의 램나이(Laemmli) 샘플 완충제(바이오-래드(Bio-Rad)) 중에서 95℃에서 5분 동안 용해시켰다. 분취액(20㎍ 단백질)에 복제 '레디 캐스트(Ready Cast)' 10% 아크릴아마이드 겔(바이오-래드)을 통해 전기영동을 실시하였다. 하나의 겔을 쿠마씨 블루로 염색하고 나서, 복제물을 밤새 4℃에서 PVDF 막에 옮겼다. 막을 1% 트윈-20을 함유하는 TRIS-완충 식염수(TBS) 중에서 5% 무지방 우유로 차단시켰다. 표시한 1차 항체(항-알릭스, 항-hsp70; 산타 크루즈)를 1시간 동안 첨가한 후에 TBS로 3회 세척하였다. 항체 결합을 적절한 HRP-컨쥬게이팅된 2차 항체를 이용하여 평가하고 나서 향상된 화학발광에 의해 시각화하였다.

B. pH 및 농도 범위

종양 세포 배양을 고도로 효율적인 셀라인 AD 조직 배양 시스템에서 확립하였다(Mitchell et al., 2008). 상청액을 하부의 세포-함유 챔버로부터 되찾아오고 나서, 무결함 세포 및 세포 파편을 500g 및 12,000g에서 각각 원심분리에 의해 제거하였다. 이어서, 맑은 상청액의 적은(4.5㎖) 분취액을 아세트산을 이용하여 표시한 pH로 적정한 증가된 10X 아세트산염 농도의 1/10 용적과 혼합하였다.

도 1a 및 도 1b는 이 범위의 아세트산염 완충제에 걸친 종양-유래 엑소좀의 효과적인 단리를 나타낸다. 염 및 pH 조건의 전체 범위는 종양 엑소좀 침전에 있어서 효과적이며, 의미있는 수준의 단백질이 모든 시험 조건으로부터 회수된다는 것을 알 수 있다. 또한 이 연구를 넓은 범위의 비교 데이터를 용이하게 제공하도록 설계하였고, 수율을 최적화하는 임의의 시도를 설계하지 않았음을 주목하여야 한다. 효과적인 조건의 범위 하에서, 침전은 본질적으로 즉각적이며 분명히 가시적이었다(예를 들어, 도 1c에서 나타낸 바와 같이 0.1M 아세트산염으로 pH 4.75를 이용함).

데이터 지점에 곡선을 적합화함으로써, 염 및 pH 조건의 전체 범위에 걸쳐 아세트산염 완충제는 pH 3.75 내지 pH 5.75, 및 0.05M 내지 0.5M을 포함하는 종양 엑소좀을 침전시키는데 효과적이라는 것을 도 1a로부터 알 수 있다. 실제 데이터 지점은 0.05M 내지 0.5M의 전체 농도 범위에 걸쳐, 효과적인 침전이 pH 4.14, pH 4.39, pH 4.64, pH 4.89, pH 5.14 및 pH 5.64에서 일어났다는 것을 나타낸다(도 1a). 효과적인 침전은 또한 시험한 각각의 농도, 즉, 0.05M, 0.1M, 0.233M, 0.367M 및 0.5M에서 일어났다(도 1a). 데이터 지점에 곡선을 적합화함으로써, 각각의 농도에 대한 pH 최적을 다음과 같이 결정할 수 있다: 0.05M에서 pH 4.65; 0.1M에서 pH 4.75; 0.233M에서 pH 4.80; 0.367M에서 pH 4.77; 및 0.5M에서 pH 4.78(도 1b).

그러나, 아세트산염 완충제가 효과적인 pH 및 농도의 전체 범위에 걸쳐있음에도 불구하고, 이 "염석" 또는 침전 방법은 pH와 염 농도 둘 다에 의해 영향을 받았다. 도 1a은 약 pH 4.14 내지 약 pH 5.25 또는 약 pH 4.25 내지 약 pH 5.25, 및 더 구체적으로는, 약 pH 4.5 내지 약 pH 5.0의 범위, 그리고 약 0.05M 내지 0.25M, 더 구체적으로는 약 0.05M 내지 0.1M의 아세트산염 농도가 가장 효과적이라는 것을 나타낸다. 이들 동일한 데이터의 공간채움(또는 3D) 모델을 이용하여, 약 pH 4.14 내지 약 pH 5.25, 약 pH 4.14 내지 약 pH 5.0, 약 pH 4.39 내지 약 pH 5.4, 약 pH 4.39 내지 약 pH 5.25 및 약 pH 4.39 내지 약 pH 5.14의 범위, 그리고 약 0.05M 내지 0.25M, 약 0.05M 내지 0.233M 및 약 0.05M 내지 0.15M의 농도, 및 더 구체적으로는, 약 pH 4.5 내지 약 pH 5.4, 약 pH 4.5 내지 약 pH 5.25 및 약 pH 4.5 내지 약 pH 5.0, 및 약 0.05M 내지 0.233M, 약 0.05M 내지 0.15M 및 약 0.05M 내지 0.1M의 농도가 가장 효과적이다.

도 1a 및 동일 데이터의 공간채움 모델로부터, 바람직한 범위는 약 pH 4.5 내지 약 pH 5.25, 또는 약 pH 4.5 내지 약 pH 5.0, 및 약 0.05M 내지 0.15M, 또는 약 0.05M 내지 0.1M의 농도이다. 이들 효과적인 범위 내에서, 0.1M 아세트산염을 이용하는 이들 연구에서의 최대 침전은 약 pH 4.75에서 일어났다. 따라서 이를 이하의 조건을 포함하여 장래의 연구에 대한 편리한 표준 조건으로서 선택하였고, 후속 실시예에서 보고한다.

C. 수율

약 25 x 10⁶개의 K1735P 세포로 시작하여, 조건화 배지의 제1 수집 전에 2주 동안 상기 기재한 조건 하에서 배양하고, 상기 기재한 바와 같은 아세트산염 침전을 수행하여(그리고 pH 4.75에서 0.1M 아세트산나트륨을 이용), 조건화된 배지의 ㎖ 당 75 내지 125㎍의 정제된 엑소좀의 수율을 얻었다. 상기 기재한 바와 같이, 배양물에서 이들 세포를 유지하고 소모된 배지를 새로운 배지로 보충하는 것은 소위 "완전히 포화된" 세포 조건화 배지의 일정한 공급원을 제공하고(이어서, 알려지지 않은 수의 세포로부터일지라도), 이것으로부터 약 75 내지 125㎍/㎖, 및 전형적으로 약 100 내지 125㎍/㎖의 정제된 엑소좀을 아세트산염 완충제 침전 프로토콜을 이용하여 매주 얻을 수 있다.

주목한 바와 같이, 도 1a 및 도 1b의 데이터를 조건의 비교를 나타내기 위해(전형적인 수율을 도시하기 위한 목적은 아님) 작은 샘플로부터 생성하였다. 덜 농축된 작은 샘플과 대조적으로 완전히 포화된 배지를 이용할 때 수율%는 증가된다는 것을 관찰하였다.

실시예 II

종양 엑소좀 단리의 장래의 특성규명

이 실시예는 질환 관련 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀에 대한 단리 방법을 추가로 특성규명하며, 종양 엑소좀에 대한 기법에서 아세트산염 완충제의 중요성을 강조한다.

A. 온도 독립성

본 연구는 종양 엑소좀 침전이 본질적으로 온도-독립적이라는 것을 나타낸다. 그러나, 온도의 효과를 분석하는 것은 혼탁도의 연구가 온도-의존적이라는 것을 나타내었다.

아세트산염의 첨가 시 혼탁도의 즉각적인 온도-의존적 증가가 일어났으며, 이어서, 안정되기 시작하였다. 계속된 인큐베이션은 0℃ 내지 20℃에서 보통의 약 2배 속도의 증가를 나타내었다. 그러나, 20℃로부터 37℃로 온도를 증가시켰을 때 상당한 속도의 차이는 관찰되지 않았다(도 2a). 흥미롭게도, 일단 반응이 0℃에서 안정 상태를 유지한다면, 37℃로 온도를 증가시키는 것은 37℃에서 전체 기간 동안 인큐베이션시킨 샘플의 수준에 접근한 수준으로 혼탁도의 즉각적인 증가를 야기하였다(도 2a). 대조적으로, 37℃에서 인큐베이션시킨 샘플 온도의 감소는 효과가 없었다(도 2a).

혼탁도와 관계없이, 펠렛화된 침전물에서 단백질의 양은 본질적으로 동일하였고(도 2b), 종양 엑소좀 침전은 온도-독립적이고, 더 큰 응집물이 고온에서 형성되었다는 것을 나타낸다.

B. pH 의존

종양-유래 엑소좀 침전의 pH 의존을 추가로 평가하기 위해, 소모 배지 및 동일한 인테그라(Integra) 플라스크로부터의 정제 세포 상청액을 0.1M 아세트산Na 완충제 중에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 혼탁도를 600㎚에서 평가하고 나서, 침전된 단백질(엑소좀)을 브래드포드 분석에 의해 평가하였다.

도 3a 및 도 3b에서 나타낸 바와 같이, pH-의존적 혼탁도(도 3a) 및 침전된 단백질(도 3b)을 상청액을 이용하여 얻은 반면, 대조군 배지에 의해 본질적으로 혼탁도 또는 침전물은 관찰되지 않았다. 효과적인 pH 범위 내에서, 이 연구에서 상청액으로부터의 최대 혼탁도 및 침전된 단백질을 약 pH 4.75에서 다시 얻었다.

C. 침전은 아세트산염(pH는 아님)에 의존적이다

종양-유래 엑소좀을 침전시킴에 있어서 pH 그 자체보다는 아세트산염의 중요성을 이들 산성화 연구에 의해 나타낸다. 침전이 아세트산염의 존재(단지 산성화는 아님)에 의존적인 것을 발견하였는데, 침전은 글리신 HCl 또는 시트르산염을 이용하여 산성화한 상청액에 의해 일어나지 않았기 때문이다(도 4a).

D. 침전은 아세트산염(반대이온은 아님)에 의존적이다

종양 엑소좀 침전이 아세트산염의 존재에 의존하지만, 표준 아세트산나트륨은 다른 아세트산염 완충제, 예컨대 아세트산칼륨 또는 아세트산암모늄으로 치환될 수 있다. 반대 이온의 무관함은 이들 통제 연구에 의해 나타나지만, 이때 아세트산칼륨의 침전은 아세트산나트륨에 의한 침전과 동일한 것으로 나타난다.

4T1 유방 암종 세포를 셀라인 AD 조직 배양 시스템에서 배양시켰다. 상청액을 하부의 세포-함유 챔버로부터 되찾아오고 나서, 배지를 상부 챔버로부터 얻었고, 이를 투석막을 통해 하부 세포 챔버로부터 분리시켰다. 하부 챔버로부터의 동일한 용적의 상청액 샘플 및 상부 챔버로부터의 배지를 약 pH 4.75에서 10X 아세트산나트륨 또는 10X 아세트산칼륨의 1/10 용적과 별도로 혼합하고 나서, 30분 동안 두었다.

도 4b는 아세트산칼륨이 아세트산나트륨의 사용과 구별되지 않는다는 것을 나타낸다. 이들 두 아세트산염 완충제를 이용하여, 하부 챔버로부터의 상청액으로부터 엑소좀의 침전은 분명히 가시적이며, 동등하였다. 예상한 바와 같이, 상부 챔버로부터의 배지로부터의 침전은 아세트산염 완충제 중 하나를 이용하여 관찰하였는데, 엑소좀은 하부 세포 챔버에서 유지되고, 이는 투석막을 통과하기에 너무 크기 때문이다. 분명히 가시적인 혼탁한 현탁액을 원심분리시키고, 아세트산칼륨과 아세트산나트륨 간을 뚜렷하게 구별할 수 없는 엑소좀의 펠렛을 생성하였다.

실시예 III

동등한 수율의 형태가 입증된 종양 엑소좀

본 실시예는 아세트산염 방법이 더 용이하고 더 빠르지만, 아세트산염 완충제을 이용하여 단리시킨 질환 관련 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀의 수율은 전형적인 초원심분리 방법으로부터의 수율과 동일하다는 것을 나타낸다. 종양-엑소좀에 의해 예시하는 바와 같이 아세트산염-정제 엑소좀은 또한 전통적인 초원심분리에 의해 제조되는 것 및 항원적으로 무결함인 것과 형태적으로 구별되지 않는 것으로 나타난다.

A. 동등한 수율

아세트산염 단리에 의해 그리고 전통적인 100,000g 초원심분리에 의해 얻은 종양 엑소좀의 상대적 수율은 집단 둘 다에서 알릭스 및 PS를 평가함으로써 정량화하였다. Cy3-표지 알릭스 항체를 이용하는 알릭스의 유세포분석(도 5a) 및 FITC-표지 아넥신 5를 이용하는 PS(도 5b)는 두 방법 모두 유사한 양의 엑소좀을 수득하였다는 것을 시사하였다.

아세트산염 단리를 이용하고 전통적인 100,000g 초원심분리를 이용하여 얻은 단백질의 수율을 직접 비교함에 있어서, K1735 상청액의 동일한 분취액을 방법 둘 다에 의해 단리시켰다. 추가로, 100,000g 초원심분리 및 아세트산염 프로토콜로부터의 상청액에 (용액을 pH 7.5로 만든 후에) 아세트산염 pH 4.75 및 초원심분리에 의한 추가적인 회차의 단리를 각각 실시하였다.

아세트산염 프로토클을 이용한 단백질 수율은 초원심분리 방법보다 약 2배 더 높았다(167.0㎍/㎖ 대 88.1㎍/㎖). 추가적인 단백질을 중화 아세트산염 상청액의 초원심분리 후에 회수할 수 없었는데, 이는 사실상 모든 엑소좀이 아세트산염에 의해 침전되었다는 것을 시사한다. 반면에, 100,000g 초원심분리 상청액의 아세트산염 처리는 추가적인 533㎍의 단백질(39.5㎍/㎖)을 회수하였는데, 이는 아세트산염이 비특이적으로 침전된 비엑소좀 단백질을 가질 수 있었다는 것을 시사한다. 아세트산염 침전 및 100,000g 침전으로부터 회수한 엑소좀의 SDS-PAGE는 아세트산염 레인의 상부의 추가적인 밴드를 제외하고 유사한 단백질 패턴을 나타내었다. 질량 분광학 분석은 아세트산염 샘플에서 이 상부 밴드(약 160 kDa)가 일부 흑색종 세포에 의해 분비된 것으로 알려진 단백질인 α2-마크로글로불린라는 것을 나타내었다(Morgan et al., 1984).

B16 흑색종 또는 TRAMP 전립선 암종 세포로부터 엑소좀을 정제하기 위해 아세트산염 침전을 이용하는 별도의 연구에서, α2-마크로글로불린은 얻어진 엑소좀에서 검출가능하지 않았다(실시예 IV).

엑소좀의 침전과 관련없는 산-의존적 공동침전의 결과일 가능성이 있는 K1735 세포로부터의 아세트산염-침전 엑소좀에서 더 고농도의 α2-마크로글로불린에 관해, 이는 일단 100,000g이라면 중화된 아세트산염-침전 엑소좀을 세척함으로써 용이하게 제거될 수 있다. 사실, 세척된 엑소좀의 SDS-PAGE는 대부분의 α2-마크로글로불린이 제거되었다는 것을 나타내었다.

B. 형태적으로 구별되지 않는 엑소좀

아세트산염을 이용하고 전통적인 초원심분리에 의해 정제한 종양 엑소좀을 전자현미경에 의해, 그리고 특징적 엑소좀-관련 마커에 대한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 아세트산염을 이용하여 회수한 엑소좀은 초원심분리에 의해 수집한 엑소좀과 형태적으로 구별되지 않는다는 것을 결정하였다. 집단은 둘 다 동일한 크기의 소수포를 함유하였고, 내강 공간을 둘러싸는 전형적인 이중층 막을 가졌다(도 6).

웨스턴 블롯 분석은 제제가 둘 다 엑소좀 마커 알릭스 및 hsp70을 함유하였다는 것을 확인하였다. 따라서 웨스턴 블롯에서 항체에 대한 결합은 단리된 엑소좀이 항원적으로 무결함이 된다는 것을 나타낸다.

실시예 IV

기탁된 종양 세포주로부터의 엑소좀 단리

이 실시예에서, 질환 관련 세포외 미세소포, 특히 종양 엑소좀을 추가적인 종양 세포주로부터 정제하기 위해 아세트산염 침전을 사용하였다. 이들은 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection: ATCC(등록상표))에 의해 기탁된 종양 세포주를 포함하며, 따라서 비교 연구를 위한 표준으로서 용이하게 입수가능하다.

4T1 유방 암종 세포는 ATCC로부터 CRL-2539(상표명)로서 입수가능하다. B16 흑색종 세포는 ATCC로부터 B16-F0(ATCC(등록상표) CRL-6322(상표명)), B16-F1(CRL-6323(상표명)) 및 B16-F10(CRL-6475(상표명))으로서 입수가능하다. 유전자이식 마우스 전립선 암종 세포인 TRAMP 세포는 ATCC로부터 CRL-2730(상표명), CRL-2731(상표명) 및 CRL-2732(상표명)로서 입수가능하다. C4 세포는 LNCaP 세포주로부터의 안드로겐-민감성 인간 전립선 선암종 세포이며(Wu et al., 1994), 널리 이용가능하다.

4T1, B16 및 TRAMP 세포(각각 ATCC로부터 얻음), 및 C4 세포를 L-글루타민(2mM), 피루브산Na(1mM), 페니실린(100 U/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖), 비필수 아미노산 및 소태아 혈청(10%)으로 보충한 최소 필수 배지(MEM)에서 별도로 배양시켰다. 15㎖ 배지에서 각각의 세포 유형(4T1, B16, TRAMP 및 C4)의 약 25 x 10⁶개를 상부 챔버에서 250㎖ 배지를 수용한 셀라인 AD 1000 플라스크(인테그라 바이오사이언시즈 아게)의 하부 챔버에 파종시켰다(제0일)(Mitchell et al., 2008). 파종 후 2주에 시작해서, 조건화한 배지(약 15㎖)를 매주 하부 챔버로부터 수집하였고, 이후 수집을 매주 계속하였다. 각각의 시점에, 15㎖의 인산염-완충 식염수로 구획을 1회 세척하고 나서, 조건화한 배지와 합하였다. 이어서, 새로운 배지를 하부 챔버에 첨가하였다. 약 100㎖ 소모 배지를 새로운 배지로 대체함으로써 상부 챔버를 매주 보충하였다.

순차적 원심분리에 의해 수집한 조건화 배지(PBS 세척과 합하였을 때 총 약 30㎖)는 세포, 세포 파편 및 거대 막 소수포를 정제하였다. 즉, 세포 조건화 배지를 500g에서 30분 동안(또는 250g에서 10분 동안) 처음 원심분리시키고 나서, 상청액을 수집하였고; 이어서, 상청액을 12,000g 내지 13,000g에서 추가 30분 동안 원심분리시켰다. 이들 단계는 정제 또는 정화된 상청액을 제공한다.

상기 조건 하에서 약 25 x 10⁶개의 4T1, B16, TRAMP, C4(또는 K1735P) 세포를 배양함으로써, 배양의 약 2주 후에 및/또는 이후에 1주 간격으로 (PBS 세척물과 합했을 때) 약 30㎖의 전체 조건화 배지를 수집하고 나서, 약 30 내지 60분 동안 얼음 상에서 아세트산나트륨 완충제(1.0M; pH 4.75)의 1/10 용적과 혼합함으로써 정제된 상청액을 침전시키고, 2,000g 내지 5,000g에서 10분 동안 1회 또는 2회 원심분리시켜서, 본 발명은 약 75 내지 125㎍/㎖의 단백질 농도를 지니는 실질적으로 정제된 엑소좀 집단을 제공한다.

이 프로토콜을 K1735P, 4T1, B16, TRAMP 및 C4 종양 세포 상에서 성공적으로 사용하였다. 이러한 세포로부터 정제한 종양 엑소좀을 또한 FACS에 의해 분석하였고, 실시예 VII 및 실시예 IX에서 상세하게 기재한 바와 같이 포스파티딜세린에 대해 양성인 것으로 나타났다.

적어도 4T1, B16 및 TRAMP 세포가 ATCC에 의해 기탁되었기 때문에, 따라서 기재한 프로토콜을 이용하는 비교 연구에 대한 표준으로서 이들 세포를 사용할 수 있다. B16 및 TRAMP 세포로부터 종양 엑소좀을 정제하기 위해 아세트산염 침전을 이용함에 있어서, α2 마크로글로불린은 얻어진 엑소좀에서 검출되지 않았다(K1735 세포와 대조적). B16 및 TRAMP 세포는 ATCC에 의해 기탁되고, 아세트산염 침전 방법의 사용은 외래의 또는 오염 단백질이 본질적으로 없는 정제된 엑소좀을 초래하기 때문에, B16 및 TRAMP 세포는 본 발명의 아세트산염 침전 방법을 이용하는 비교 연구에 대한 참고 실시예 또는 표준으로서 특히 유용한 것으로 고려된다.

실시예 V

인간 종양 엑소좀의 단리

본 실시예는 아세트산염 완충제의 사용이 인간 환자로부터 인간 질환 관련 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀, 특히 종양-유래 엑소좀을 단리시키는데 효과적이라는 것을 확인하는 데이터를 제공한다.

A. 조직 배양물로부터의 인간 종양 엑소좀

엑소좀을 인간 종양 세포로부터 얻은 조직 배양 상청액으로부터 단리시켰다. 복수액으로부터 단리시킨 인간 난소 암종 세포를 셀라인 AD1000 플라스크의 하부 세포 챔버에서 배양시켰다. 하부 세포-함유 구획으로부터의 조건화된 배지를 매주 수집하였다. 엑소좀-함유 배지는 500g 및 12,000g에서 순차적 원심분리에 의해 각각 세포, 세포 파편 및 거대막 소수포를 정제하였다. 아세트산Na 완충제(1.0M; pH 4.75)의 1/10 용적을 정제한 상청액과 혼합하고 나서, 30 내지 60분 동안 얼음 상에 두었고, 이어서, 37℃로 추가 5분 동안 옮겼다. 혼탁한 현탁액을 10분 동안 5,000g에서 원심분리하고 나서, 얻어진 펠렛을 0.1M 아세트산Na 완충제로 1회 세척하였다. 현탁액을 다시 원심분리시키고 나서, pH 7.5에서 2mM EGTA를 함유하는 헤페스-완충 식염수 중에서 펠렛을 "가용화시켰다". 정제된 엑소좀을 4℃에서 저장하였다.

B. 환자로부터의 인간 종양 엑소좀

또한 난소 암종을 지니는 인간 환자로부터 얻은 복수액으로부터 엑소좀을 단리시켰다. 복수액(~500㎖까지)을 500g 및 12,000g에서 원심분리시켜 세포 및 세포 파면을 제거하였다. 아세트산Na 완충제(1.0 M; pH 4.75)의 1/10 용적을 30분 내지 1시간 동안 빙냉한 정제 복수액에 첨가하였다. 침전된 엑소좀을 원심분리(5,000g에서 15분 동안)에 의해 수집하였다. 공여체에 따라서, 수율은 30 내지 50㎍/㎖ 유체의 범위였다.

실시예 VI

혈액 샘플로부터의 종양 엑소좀 단리

본 실시예는 아세트산염 완충제의 사용이 또한 종양 엑소좀을 단리시킴으로써 예시하는 바와 같이, 인간 전혈로부터 질환 관련 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀의 단리에 적용할 수 있다는 것을 나타낸다.

EDTA 중에서 수집한 2.5㎖의 인간 전혈을 1.0㎎/㎖로 0.5㎖의 정제된 종양 엑소좀과 혼합하였다(총 0.5㎎). 이어서, 혈액을 원심분리시키고, 혈장을 수집하였다. 혈장의 절반을 얼음 상에서 유지하였고, 나머지 절반을 56℃로 3분 동안 가열하여 피브리노겐을 침전시켰다. 샘플을 둘 다 500g에서 10분 동안 원심분리시키고, 상청액을 수집하였다. 아세트산Na 완충제(pH 4.75에서 1.0M)의 1/10 용적을 첨가하였다. 0℃에서 60분 동안 샘플을 인큐베이션시킨 후에, 샘플을 500g에서 15분 동안 원심분리시키고 나서, 펠렛 중의 엑소좀을 pH 7.5에서 2mM EGTA를 함유하는 헤페스-완충 식염수에서 가용화시키고, 단백질을 정량하였다.

500㎍ 종양 엑소좀을 섞은 전혈로부터의 엑소좀 회수의 이 연구에서, 전체 혈장으로부터의 총 단백질 회수는 340㎍이었고, 이는 종양 엑소좀 및 아세트산염-침전 피브리노겐을 포함한다. 가열한 무 피브리노겐 혈장으로부터의 총 단백질 회수는 201㎍이며, 이는 전체 수정된 종양 엑소좀 회수를 나타낸다. 이는 종양 엑소좀의 약 40%가 회수된다는 것을 나타낸다(엑소좀을 섞은 500㎍으로부터 201㎍).

다른 연구에서, 정제된 엑소좀을 무 세포 혈장에 직접 첨가하고, 상기 기재한 프로토콜을 반복하였지만, 260㎍의 정제된 종양 엑소좀을 첨가하였다. 전혈로부터의 단백질 회수는 405㎍이었고, 이는 종양 엑소좀 및 아세트산염-침전 피브리노겐을 포함한다. 가열된, 무 피브리노겐 혈장으로부터의 단백질 회수는 본질적으로 100% 종양 엑소좀 회수를 나타내었다(실제 값은 288㎍ 단백질이며, 이는 초기 연구에 대한 실험 오차 내이고/이거나 추가적인 혈장 단백질의 침전을 나타낼 수 있었음).

이들 연구는 회수한 단백질 양의 차이가 혈장 샘플 내 피브리노겐의 침전에 크게 기인한다는 것을 나타낸다. 사실, 사전인큐베이션 단계에 의한 피브리노겐의 제거(56℃에서 3분 동안; Millar et al., 1971; Marx et al., 2008)는 아세트산염 침전 샘플에서 외래 단백질 수준을 엑소좀의 손실이 본질적으로 없는 혈청 샘플에 대해 얻은 수준과 비슷한 수준으로 감소시켰다. α2 마크로글로불린에 대해 실시예 III에서 논의한 바와 같이, 일단 용적이 아세트산을 지니는 처리가능한 용적으로 감소된다면, 종양 엑소좀 제제에서 임의의 외래 단백질은 초원심분리에 의해 용이하게 제거될 수 있다.

실시예 VII

종양 유래 엑소좀의 선택적 단리

이 실시예는 정상 세포로부터의 엑소좀과 대조적으로 종양-유래 엑소좀에 의해 예시한 바와 같이, 질환 관련 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 침전시키기 위한 아세트산염 완충제의 특이성을 나타낸다. 이는 실험 기법에서의 중요한 새로운 용도 및 진단 시험 및 키트를 제공한다.

인간 환자로부터 얻은 난소 암종(종양) 세포 및 동일한 환자로부터의 정상 중피세포를 조직 배양에서 유지하였다. 이 초기 연구에서, 엑소좀을 1시간 동안 100,000g에서 1 단계의 초원심분리에 의해 각각의 조직 배양 상청액으로부터 회수하였다. 초원심분리 펠렛은 스핀단운 엑소좀 및 잔여 조직 배양 배지를 함유하였다.

초원심분리 펠렛을 식염수 중에서 재현탁시키고, 단백질을 브래드포드 분석에 의해 정량화하였다. 각각의 재현탁한 물질로부터의 분취액을 특이적 PS 마커인 FITC-표지 아넥신 5를 이용하는 FACS 분석에 의해 엑소좀 표면 상의 포스파티딜세린(PS)의 존재를 평가하기 위해 따로 두었다. 이어서, 각각의 재현탁 물질로부터의 별개의 분취액을 0℃에서 1시간 동안 아세트산염 완충제(0.1M, pH 4.75)로 처리하였다. 아세트산염-침전 펠렛을 식염수 중에서 초기 용적으로 재현탁시키고, 단백질을 다시 브래드포드 분석에 의해 정량화하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.

종양 및 정상 세포로부터의 엑소좀의 아세트산염 침전
세포의 공급원	아세트산염 처리 후 회수( % )
난소 암종 세포	38.7
정상 중피세포	1.4

표 1에 나타낸 바와 같이, 아세트산염 완충제는 난소 암종 세포로부터 종양-유래 엑소좀을 특이적으로 침전시키며, 사실상 정상 세포로부터의 엑소좀은 회수되지 않는다. 또한 하나의 초원심분리 단계만을 이 초기 연구에서 사용하였기 때문에, 엑소좀 현탁액은 잔여 조직 배지를 함유하였다는 것을 주목하여야 한다. 아세트산염 침전 프로토콜은 종양 엑소좀-특이적이기 때문에, 난소 암종 세포에 제시된 회수%는 과소평가된다.

따로 둔 분취액을 이용하여, 정상 중피세포로부터의 그리고 난소 암종 세포로부터의 상청액의 초원심분리에 의해 얻은 엑소좀을 FITC-아넥신 V 라텍스 비드에 결합하고 나서, 엑소좀 표면 상에서 PS의 존재를 평가하기 위해 FACS 분석을 실시하였다. 예측한 바와 같이, 종양-유래 엑소좀은 그들의 표면 상에서 PS를 가지며, 이는 도 7a에서 좌측으로 향한 적색선(정상 중피세포-유래 엑소좀)에 비교하여 우측으로 향한 청색선(난소 암종-유래 엑소좀)의 이동에 의해 나타난다.

관련된 연구에서, 아세트산염 침전을 이용하여 4T1 유방 암종 세포 및 B16 흑색종 세포로부터 정제한 엑소좀에 또한 FACS 분석을 실시하여 표면 PS를 검출하였다. 도 7b 및 도 7c에서 나타낸 바와 같이, 각각 4T1과 B16 세포 둘 다로부터의 정제된 엑소좀은 확실히 PS 양성이다.

따라서 본 연구는 아세트산염 완충제가 종양-유래 엑소좀의 표면 상에 존재하는 음으로 하전된 PS를 수반하는 하전 중화를 통해 작용한다는 본 발명자들의 추론을 입증하는데, 해당 엑소좀이 그들이 유래된 PS-양성 종양 세포를 반영하기 때문이다. 정상 세포에서, PS는 혈장막의 내층에서 유지되며, 따라서, PS는 정상 세포로부터 유래된 엑소좀의 표면이 대체로 없다.

실시예 VIII

PS-양성 엑소좀의 선택적 단리

본 실시예는 PS 양성 세포외 미세소포 및 엑소좀, 예컨대 질환 관련 및 종양-유래 세포외 미세소포 및 엑소좀을 침전시킴에 있어서 아세트산염 완충제의 특이성은 엑소좀에 적용되지만 PS 양성 리포좀에 대해서는 적용되지 않는다는 것을 나타낸다.

첫 번째 연구에서, 종양-유래 엑소좀에 의해 성공적으로 사용한 아세트산염 단리 방법을 순수한 포스파티딜세린 및 포스파티딜콜린으로부터 생성된 PS 양성 리포좀에 적용하였다. 앞의 실시예에서 나타낸 바와 같이, 아세트산염 완충제는 표면 상에 PS를 갖는 종양-유래 엑소좀을 침전시키는데 효과적이다. 대조적으로, 표면 상에 PS를 갖는 리포좀의 동등한 샘플에 동일한 방법을 적용하는 것은 임의의 시각적으로-검출가능한 침전을 생성하지 않았다.

두 번째 연구에서, PS 음성 및 PS 양성 리포좀 집단을 형광 지질로 표지하여, 침전된 임의의 양의 리포좀이 정량화되게 하였다. 이 연구는 아세트산염 완충제가 PS 양성일 때조차 임의의 의미있는 양의 인지지 리포좀을 침전시키지 않는다는 것을 확인하였다.

이 두 번째 연구에서, 형광 리포좀의 두 집단을 제조하였다; 포스파티딜콜린(PC)으로부터의 하나 및 포스파티딜콜린과 포스파티딜세린 혼합물(PC/PS)로부터의 다른 하나. 1㎎의 포스파티딜콜린을 0.1㎍의 형광 성분인 N-로다민-포스파티딜에탄올아민(N-rho-PE)과 CHCl₃ 중에서 혼합함으로써 PC 리포좀을 제조하였다. 용매를 증발시키고, 건조 지질을 1.0㎖의 PBS 중에서 20℃에서 30분 동안 재수화시켰다. 수화시킨 지질 혼합물을 교반시키고, 이어서, 초음파처리하여 작은 단일 라멜라 소수포를 수득하였다. 출발 물질을 0.1㎍의 N-rho-PE와 함께 CHCl₃ 중에서 0.66㎎의 PC 및 0.33㎎의 다이올레오일포스파티딜세린(32㏖%)과 혼합한 것을 제외하고 PC/PS 리포좀을 동일한 기법에 의해 제조하였다.

별개의 PC 및 PC/PS 리포좀 제제를 5,000g에서 5분 동안 원심분리시켜 임의의 거대한 침전가능한 리포좀을 제거하였다. 상청액을 제거하고 나서, 각각의 제제로부터의 0.4㎖를 2개의 관에 분취하였다. 0.5㎖의 PBS를 각각의 관에 첨가한 다음, 0.1㎖의 PBS 또는 아세트산염 완충제(1.0M; pH 5.7)를 각각 첨가하였다. 관을 혼합하고 나서, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 교반시키고 나서, 0.1㎖ 분취액을 제거하여 총 형광을 결정하였다. 이어서, 각각의 관을 5,000g에서 5분 동안 원심분리시키고, 상청액으로부터의 0.1㎖ 분취액을 제거하여 잔여(비-침전) 형광을 결정하였다.

결과를 도 8에서 도시하는데, 이는 아세트산염 완충제가 실질적인 양의 PS를 함유할 때조차 인지질 리포좀을 침전시키지 않았음을 나타낸다.

종합하면, 본 실시예의 데이터는 PS가 필요하지만 아세트산염 완충제가 인지질 소수포를 침전시키는데는 충분하지 않다는 것을 나타내며, 이는 PS 양성 미세소포 및 엑소좀, 특히 질환 관련 및 종양-유래 미세소포 및 엑소좀을 단리시키기 위한 특이성이 독특한 미세소포/엑소좀 조성물을 지니는 아세트산염 완충제의 상호작용에서 기인한다는 것을 시사하며, 이때, PS는 비지질막 성분, 특히 막 단백질과 공동으로 표면 상에서 발현된다. 이는 합성 지질 소수포보다는 세포-유래 및/또는 세포-분비 미세소포가 되는 것으로서 미세소포 및 엑소좀의 이해를 뒷받침한다.

실시예 IX

혼합물로부터의 PS-양성 종양 엑소좀의 분리

본 실시예는 세포외 미세소포와 엑소좀을 함유하는 샘플로부터 종양-유래 엑소좀에 의해 예시되는 바와 같이, PS 양성 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 선택적으로 단리시키는 아세트산염 침전 방법의 능력을 강조한다. 이는 또한 종양-유래 엑소좀을 침전시키는 아세트산염 완충제의 특이성이 엑소좀 외막층 상에서 PS의 발현에 의존적이라는 것을 나타낸다.

PS 양성 엑소좀은 PS-발현 4T1 유방 암종 세포 및 상대 세포로부터의 PS-음성 엑소좀으로부터 얻었다. 엑소좀은 원심분리에 의해 정제하였고, FITC-아넥신을 이용하는 FACS 분석에 의해 PS 양성 또는 PS-음성이 되는 것을 확인하였다(도 9a).

도 9a의 좌측 패널은 알데하이드-활성화된 라텍스 비드(양성 대조군) 및 BSA-차단된 라텍스 비드(음성 대조군)에 공유 결합된 아넥신 5의 형태로 양성 및 음성 대조군을 나타낸다. 도 9a의 우측 패널에서 나타내는 바와 같이, 상이한 엑소좀 집단을 라텍스 비드에 결합하고 나서, FITC-아넥신 5로 표지하고, 4T1 유방 암종 세포로부터의 PS 양성 엑소좀은 아넥신 5 비드의 양성 대조군을 반영하는 반면, PS-음성 엑소좀은 BSA 대조군의 프로파일을 반영하는데, 이는 그들이 확실히 PS-음성이라는 것을 나타낸다.

추가 초원심분리 후에, PS-음성 엑소좀 집단을 N-로다민-포스파티딜에탄올아민(N-Rho-PE, 적색 형광)으로 표지하였고, PS-양성 엑소좀 집단을 N-NBD-포스파티딜에탄올아민(N-NBD-PE, 녹색 형광)으로 표지하였다. 집단을 둘 다 원심분리시켜 잔여 비혼입 프로브를 제거하고, FACS 분석을 위해 샘플을 따로 두었다.

이어서, 별도로 각각의 엑소좀 집단 그리고 PS 음성과 PS 양성 엑소좀 둘 다의 혼합된 집단을 얼음 상에서 1시간 동안 1M 아세트산염(pH 4.75)의 1/10 용적과 함께 인큐베이션시켰다. 현탁액을 2,000g에서 5분 동안 원심분리시키고, 인산염 완충 식염수 중에서 재용해시키고 나서, FACS 분석을 위해 알데하이드 라텍스 비드에 결합시켰다(도 9b).

도 9b는 아세트산염 처리 전에 개개 및 혼합된 집단의 강한 형광 강도를 나타낸다(상부 행). 즉, PS-음성 엑소좀은 강한 적색 형광을 나타내고(상부 좌측 패널의 상부 좌측 코너), PS-양성 엑소좀은 강한 녹색 형광을 나타내며(상부 중간 패널의 하부 우측 코너) 엑소좀의 혼합된 집단은 적색과 녹색 형광 둘 다에서의 이동과 함께 이중-양성이다(상부 우측 패널의 상부 우측 코너). 그러나, 아세트산염 침전 후에, PS 양성 엑소좀 집단 만이 회수되었다(도 9b, 하부 행). 침전 후에 적색의 PS 음성 집단이 없었고(하부 좌측 패널에서 적색 형광 없음), 즉, 아세트산염에서 침전되지 않는 반면, 녹색의 PS 집단은 아세트산염 침전물(하부 중간 패널에서 강한 녹색 형광)로부터 회수되었다는 것을 알 수 있다. 매우 의미있게도, PS-양성 엑소좀만이 혼합된 제제로부터 회수되었다(대응하는 상부 우측 패널에서 보이는 적색 형광 없이 하부 우측 패널에서 강한 녹색 형광).

따라서 이들 데이터는 종양 엑소좀의 아세트산염-매개 침전이 엑소좀 표면에서 PS의 발현에 의존적이라는 것을 명확하게 입증한다.

실시예 X

바이러스에서의 포스파티딜세린 발현 및 중요성

앞의 실시예는 포스파티딜세린(PS)의 존재가 정상 엑소좀과 대조적으로 종양-유래 세포외 미세소포 및 엑소좀을 선택적으로 단리시키는 아세트산염 완충제의 사용에서 중요한 구별 인자라는 것을 나타낸다. 본 실시예는 본 발명자 및 동료로부터의 데이터를 요약하며, 이는 정상 세포의 표면에서 없는 PS가 바이러스-감염 세포 및 바이러스에 노출되고 바이러스 감염에서 중요한 역할을 한다는 것을 입증한다.

비리온 및 바이러스-감염 세포의 표면 상에서 PS의 존재를 입증하는데 사용하는 방법은 유세포분석/FACS 분석, ELISA, 비드 고갈, 면역금표지법, PCR(RT-PCR 및 Q RT-PCR을 포함함) 및 면역형광 현미경(표 2A 및 표 2B)이었다. 이들 방법은 이하에 제시하는 바와 같이 수행하였다.

PS(이하에 "PS 표적화 항체"로서 지칭함)에 결합하거나 표적화하는 항체를 이용함에 있어서), 두 범주의 항체를 이용가능하다: PS에 직접적으로 결합하는 것(예를 들어, 문헌[Ran et al., 2002]의 9D2 항체) 및 항체, PS에 간접적으로, 즉, 혈청 단백질 및 PS가 함께 단단히 결합된 복합체를 형성하는 경우, 혈청 단백질, 예컨대 β₂-당단백질 I(예를 들어, 문헌[Huang et al., 2005]의 3G4 항체)을 통해 결합하는 것. 다음의 연구에서, 모든 결합 단계를 혈청(또는 혈청 단백질을 사용할 수 있음)의 존재하에 수행하여 간접적 결합 항체를 포함하는 PS 표적화 항체의 유형 둘 다의 효과적인 결합을 보장하였다.

A. 유세포분석 / FACS 분석

허용된 세포를 바이러스로 감염시키고, 감염 후 결정된 시간에 세포를 PS 표적화 항체(1차 항체)와 함께 인큐베이션시킨 다음, 2차 항체가 형광, 예컨대 FITC 또는 텍사스 레드(Texas Red)에 컨쥬게이팅된 경우, 1차 항체를 검출하기 위한 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 폼알데하이드로 고정시키고 나서, 유세포분석기로 분석하여 감염된 세포에 대한 1차 항체의 결합에 기인하는 형광사건을 검출하였다. 바이러스로 감염되지 않은 세포를 음성 대조군으로서 사용하여 바이러스 감염과 관련되지 않은 임의의 배경 PS 외재화를 결정하였다.

B. ELISA(에볼라 제외)

PS 표적화 항체(1차 항체)를 폴리스타이렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고 나서, 소 혈청 알부민 또는 비-가열 불활성화 인간 혈청 중 하나로 차단시켜 플레이트 상의 비특이적 결합 부위를 차단하고, 이어서, 광범위하게 세척하였다. 바이러스의 희석물을 플레이트에 첨가하고 나서, 실온에서 3시간 동안 결합시켰다. 이어서, 플레이트를 세척하고 나서, 항체 코팅 플레이트에 부착된 바이러스를 바이오틴-컨쥬게이팅된 바이러스 단백질-특이적 항체를 첨가함으로써 검출하고, 세척한 다음, 스트렙타비딘-겨자무과산화효소로 세척하였다. 바이러스 단백질 수준에 대응하는 과산화효소 활성의 정량화를 분광광도계를 비색적으로 이용하여 수행하고 나서, 대조군 표준과 비교하였다.

C. ELISA(에볼라)

생 에볼라 자이레 바이러스(바이러스주 ME718; EBOV)를 폴리스타이렌 마이크로플레이트 상에 코팅하였다. PS 표적화 항체(인간 IgG)의 희석을 EBOV-코팅 플레이트에 첨가하고 나서, 1 내지 2시간 동안 37℃에서 결합시켰다. 이어서, 결합된 PS 표적화 항체를 HRP-컨쥬게이팅된, 염소 항-인간 IgG를 첨가함으로써 검출하였다. 결합된 PS 표적화 항체 수준에 대응하는 과산화효소 활성의 정량화를 분광광도계를 비색적으로 이용하여 수행하고 나서, 아이소타입-매칭 대조군 항체와 비교하였다.

D. 비드 고갈

항-마우스 또는 항-인간 항체로 코팅한 자기 비드를 세척하고, 이어서, 마우스 또는 인간 PS 표적화 항체와 함께 각각 인큐베이션시켰다. 이어서, 코팅된 자기 비드를 정제된 바이러스와 함께 인큐베이션시켰다. 자기 비드를 제거하고 나서, 용액 중의 남아있는 플라크 형성 단위를 허용 세포 상의 표준 플라크 분석 절차에 의해 결정하였다.

E. 면역금 표지

감염 세포의 상청액으로부터의 비리온을 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전에 의해 침전시키고 수크로스 쿠션 상에서 초원심분리에 의해 단리시켰다. 6㎚ 금 입자에 컨쥬게이팅된 PS 표적화 항체 및 10㎚ 금 입자에 컨쥬게이팅된 바이러스-특이적 항체와 함께 입자를 인큐베이션시킴으로써 고정된 바이러스에 대한 PS 표적화 항체에 의한 결합을 결정하였다. 크기를 맞춘 금 입자 둘 다에 대해 양성인 바이러스 입자를 시각화하기 위해 투과형 전자현미경으로 샘플을 처리하였다.

F. PCR , RT- PCR , Q RT- PCR

PS 표적화 항체를 폴리스타이렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고 나서, 소 혈청 알부민 및 비-가열 불활성화 인간 혈청을 첨가하여 플레이트 상의 비-특이적 결합 부위를 차단하고, 이어서, 광범위하게 세척하였다. 바이러스의 희석물을 첨가하고 나서, 실온에서 3시간 동안 결합시켰다. 이어서, 플레이트를 세척하고 나서, 항체-코팅된 플레이트에 부착된 바이러스로부터의 바이러스 핵산(DNA 또는 RNA)을 단리시키고 정제하였다. 바이러스-특이적 서열 프라이머를 이용하여 PCR/RT-PCR, Q RT-PCR을 통해 바이러스 게놈 정량화를 수행하였다.

G. 면역형광 현미경법

유리 커버슬립에 부착된 세포를 바이러스로 감염시키고, 살아있는 세포를 PS 표적화 또는 대조군 항체와 함께 인큐베이션시킴으로써 감염된 세포에 대한 PS 표적화 또는 대조군 항체의 결합을 수행한 다음, 완충제로 세척함으로써 비결합항체를 제거하였다. 바이오틴-컨쥬게이팅된 2차 항체와 함께 인큐베이션한 다음, FITC-컨쥬게이팅된 스트렙타비딘과 함께 인큐베이션함으로써 PS 표적화 및 대조군 항체의 국소화를 결정하였다. 이어서, 세포를 트리톤 X-100을 이용하여 투과시키고, 바이러스 입자를 알렉사-594(적색)와 컨쥬게이팅된 바이러스-특이적 항체를 이용하여 검출하였다. 핵 염색(DAPI)을 이용하여 커버슬립을 장착하고 나서, 슬라이드를 각각의 형광 신호에 대해 공초점 현미경에 의해 검사하였다.

상기 방법을 사용하여 표 2A 및 표 2B에 제시한 바와 같은 넓은 범위의 바이러스과로부터의 바이러스 및 바이러스-감염 세포의 표면 상의 PS 존재를 입증하였다. 추가로, 바이러스 및 바이러스-감염 세포 상의 이러한 PS 노출이 단지 우연적이지 않고, 바이러스 감염에서 중요한 역할을 한다는 것을 입증하기 위해 본 발명자 및 동료로부터의 데이터를 표 2C 및 표 2D에 제시하였다. 이를 시험관내와 생체내 둘 다에서 다양한 바이러스 패밀리로부터의 감염을 저해하기 위한 PS 표적화 항체의 용도로서 나타낸다.

실시예 XI

아세트산염 완충제를 이용하는 바이러스 미세소포의 단리

본 실시예는 아세트산염 완충제를 이용하여 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 단리시키는 방법이 또한 바이러스-감염 세포 및 바이러스 배양물로부터 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀을 침전시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다.

약 2.5 x 10⁸개의 베로 세포를 바이러스 감염 배지(DMEM, 항생제 및 항진균제를 지니는 2% 소 태아 혈청)에서 배양시키고, 3개의 집단으로 균일하게 나누었다(각각의 집단에 대해 총 1,000㎖ 배지, 각각의 집단에 대해 약 25개의 T225 플라스크에 분산시킴). 2일에 약 2배가 된 후에, 제1 세포 집단을 음성 대조군으로 모의감염시키고; 제2 세포 집단을 0.1 감염다중도(MOI)에서 유인원 액포형성 바이러스 40(SV40) 바이러스주 Pa-57, LN L1412A로 감염시키고; 제3 세포 집단을 0.05 MOI에서 단순 포진 바이러스-1(HSV-1) 바이러스주 F, LN H1411B로 감염시켰다. SV40은 폴리오마바이러스과의 비외피 바이러스이며, HSV 1은 헤르페스바이러스과의 외피 바이러스이다.

모의, SV40 및 HSV-1 감염을 감염 후 제4일, 제7일 및 제3일에 각각 채취하였다. 세포 및 세포 파편을 저속 원심분리(1,000g에서 30분 동안)에 의해 처음 제거하고 나서, 거대 입자를 12,000g에서 30분 동안 추가 원심분리에 의해 해당 상청액으로부터 제거하였다. 각각의 감염으로부터의 상청액의 분취액을 감염성 바이러스를 정량화하기 위해 떼로 두었다.

모의, SV40 및 HSV-1 감염으로부터의 각각의 정제한 상청액을 별도로 아세트산나트륨(1.0 M; pH 4.75)의 1/10 용적과 혼합하고 나서, 60분 동안 얼음 상에 두고, 이어서, 12,000g에서 30분 동안 원심분리시켰다. 모의, SV40 및 HSV-1 상청액을 각각 별도로 유지하고, 1M NaOH를 이용하여 중화시켰다. 모의, SV40 및 HSV-1 감염으로부터의 임의의 아세트산염-침전 펠렛을 재현택 완충제(10mM 트리스, pH 7.5, 115 mM NaCl, 1mM EGTA)의 약 2㎖의 최종 용적 중에서 별도로 재현탁시키고, 산성이 완전히 중화되도록 처리하였다(필요하다면, 추가적인 현탁액 및 원심분리 단계를 포함함). 상청액의 분취액 및 이들 아세트산염 침전으로부터의 재현탁된 펠렉을 감염성 바이러스를 정량화하기 위해 따로 두었다.

모의, SV40 및 HSV-1 감염에 적용한 아세트산염 침전으로부터의 시각적 결과를 도 10A, 도 10B 및 도 10C에 각각 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 모의 감염으로부터 펠렛은 거의 보이지 않았지만(도 10A), 아세트산염 침전 프로토콜은 SV40(도 10B)과 HSV-1(도 10C) 감염 둘 다로부터 상당한 시각적 펠렛을 생성하였다.

실시예 XII

단리된 바이러스 미세소포는 대체로 무 바이러스이다

이 실시예는 바이러스-감염 세포 및 바이러스 배양물로부터 아세트산염 침전에 의해 얻은 세포외 미세소포, 예컨대 엑소좀이 본질적으로 감염성 바이러스가 없다는 것을 나타낸다.

앞의 실시예의 연구에서, 아세트산염 침전 전에 감염성 SV40 및 HSV-1 바이러스의 양 및 아세트산염 침전 후에 상청액 및 펠렛에 남아있는 감염성 바이러스의 양을 감염성을 시험하는 TCID₅₀ 분석을 이용하여 정량화하였다. TCID₅₀은 감염성 바이러스 역가의 측정이다. 이 종말점 희석 분석은 접종한 조직 배양 세포(이 경우에, 베로 세포)의 50%에서 세포변성효과를 생성하는데 필요한 바이러스의 양을 정량화한다. TCID₅₀과 플라크-형성 단위(PFU) 사이의 이론적 관계는 1 TCID₅₀이 0.69 PFU라는 것이다. 결과를 표 3에 제시한다.

아세트산염 침전을 이용하는 감염성 바이러스의 실질적 제거
샘플	IU /㎖, TCID ₅₀	용적(㎖)	총 IU , TCID ₅₀
아세트산염 전의 SV40	5.8x10⁸	1,000	5.8x10¹¹
아세트산염 상청액 전의 SV40	2x10⁶	1,000	2x10⁹
SV40 아세트산염 펠렛	1x10⁸	1.5	1.5x10⁸
아세트산염 전의 HSV-1	5x10⁷	1,000	5x10¹⁰
아세트산염 상청액 전의 HSV-1	1x10⁶	1,000	1x10⁹
HSV-1 아세트산염 펠렛	3.16x10⁷	2.0	6.32x10⁷

표 3에 나타낸 바와 같이, 1,000㎖의 SV40-함유 배지는 총 5.8x10¹¹개의 IU 바이러스를 가진다는 것을 알 수 있다. 아세트산염 침전을 실시한 후에, 합합 상청액과 펠렛 중의 바이러스 양은 2.15x10⁹개였는데, 이는 5.7785x10¹¹ IU의 SV40 바이러스가 절차 동안 제거 및/또는 불활성화되었다는 것을 나타낸다. 따라서, 99.63%의 감염성 SV40 바이러스를 아세트산염 침전 동안 제거 및/또는 불활성화시켰다. 본래의 출발 물질 중에서 0.028% 감염성 SV40 바이러스만이 펠렛 중에 존재하도록, 아세트산염 침전 후에 남아있는 0.37% 감염성 SV40 바이러스 중에서 92.5%는 상청액 중에 있다.

유사하게, HSV-1에 대해 표 3에 나타낸 바와 같이, 1,000㎖의 HSV-1-함유 배지는 총 5.8x10¹⁰개의 IU 바이러스를 가졌다. 아세트산염 침전을 실시한 후에, 합한 상청액과 펠렛 중의 바이러스의 양은 1.063x10⁹개였고, 이는 5.694x10¹⁰ IU의 HSV-1 바이러스가 절차 동안 제거 및/또는 불활성화되었음을 나타낸다. 이 경우에, 감염성 HSV-1 바이러스의 98.17%가 아세트산염 침전 동안 제거 및/또는 불활성화되었다. 본래의 출발 물질 중에서 0.11% 감염성 HSV-1 바이러스만이 펠렛 중에 존재하도록, 아세트산염 침전 후에 남아있는 1.83% 감염성 HSV-1 바이러스 중에서, 93.7%가 상청액에 있다.

아세트산염 침전 방법을 통해 바이러스-유래 엑소좀 및/또는 미세소포를 준비할 목적으로, 따라서 도 10B 및 도 10C에서 관찰한 상당한 크기의 펠렛은 둘 다감염성 바이러스가 본질적으로 없는 것이 유리하다.

실시예 XIII

단리된 바이러스 미세소포의 추가적인 특성규명

본 실시예는 아세트산염 침전을 이용하여 단리된 바이러스-유래 세포외 미세소포 및 엑소좀의 사전 특성규명의 결과를 보고한다.

A. 구배 정제

상이한 용어를 이용함에도 불구하고, 문헌[Szilagyi and Cunningham (1991)]은 현재 바이러스-유래 엑소좀 또는 미세소포로 칭해지는 비감염성의 HSV-1 막으로 둘러싸인 입자의 존재를 보고하였다. HSV-1의 5 내지 15% 피콜(Ficoll)(등록상표) 구배 정제를 이용하여, 그들은 2개 밴드의 입자를 관찰하였다: 뾰족한 하부 밴드 및 더 분산된 상부 밴드(문헌[Szilagyi and Cunningham, 1991]의 도 1 참조). 하부 밴드(중질 또는 H 입자로 칭함)는 거의 배타적으로 HSV-1 비리온을 함유하는 것으로 보고된 반면, 0.1 내지 0.5% 감염성 H 입자로 교차 오염될지라도 상부 밴드는 주로 비감염성의 막으로 둘러싸인 입자(경질 또는 L 입자로 칭함)를 함유하는 것으로 언급되었다(문헌[Szilagyi and Cunningham, 1991]의 표 1 참조). L 입자는 외관이 비리온과 유사한 것으로 보고되었지만, 바이러스 뉴클레오캡시드를 결여하였고, 감염성은 아니었다. 이는 현재 바이러스-유래 미세소포 또는 엑소좀으로 칭해지는 이들 "L 입자"이다.

일반적으로, 다음의 문헌[Szilagyi and Cunningham (1991)] 기법, HSV-1 감염의 아세트산염 침전으로부터의 재현탁 펠렛의 샘플을 5 내지 15% 피콜(등록상표) 구배에 적용하였다. 재현탁된 펠렛 물질을 변형 배지에서 현탁시킨 5 내지 15% 피콜(등록상표) 400의 35㎖ 사전형성 구배로 층층이 놓고, 26,000g에서 2시간 동안 4℃에서 원심분리시켰다. 15% 분획(F15)의 상부에서 하나의 밴드와 함께 5% 피콜 분획(F5)의 상부에서 하나의 밴드의 존재를 관찰하였고, 둘 다 눈으로 볼 수 있었다. 이들은 본 연구의 F15 밴드가 더 분산되었다는 것을 제외하고 문헌[Szilagyi and Cunningham (1991)]에 의해 보고된 경질(F5) 및 중질(F15) 밴드와 유사하다.

주사기 상의 바늘로 관 측면을 천공함으로써 두 밴드의 물질을 별도로 제거하였다. 상기 기재한 것과 동일한 TCID₅₀ 분석을 이용하여 감염성 바이러스를 정량화하기 위해 분취액을 취하였다. 피콜(등록상표) 구배로 장입한 감염성 바이러스 중에서, 약 0.2%만을 경질의, F5 분획으로부터 회수하였다.

B. FACS 분석

이어서, 모의 및 SV40 감염의 아세트산염 침전으로부터의 재현탁된 펠렛의 샘플, 및 HSV-1 아세트산염 침전의 피콜(등록상표) 분리로부터의 두 분획(F5 및 F15)에 FACS 분석을 실시하였다. 상이한 분획(각각 15㎍ 단백질)을 라텍스 비드에 결합시키고, 다음의 검출제를 이용하여 FACS에 의해 분석하였다.

SV40 바이러스 항원에 대해, 주요 캡시드 단백질인 SV40 VP1에 대한 토끼 다클론성 항체를 사용하였고; HSV 1 바이러스 항원에 대해, 비리온(H)과 소위 L 입자 둘 다에 존재하는 것으로 알려진 표면 당단백질인 HSV gB에 대한 마우스 단클론성 항체를 사용하였다. 형광 프로브 알로피코시아닌(APC)에 컨쥬게이팅된 항-토끼 및 항-마우스 항체를 사용하여 SV40 및 HSV-1 항체를 각각 검출하였다. 피코에리트린(PE)에 컨쥬게이팅된 항-CD63 항체를 사용하여 미세소포 또는 엑소좀을 검출하였는데, CD63은 엑소좀 중에 존재하는 막-관련 단백질이기 때문이다. FITC에 컨쥬게이팅된 아넥신 V를 사용하여 PS를 검출하였다. 음성 대조군은 PE 또는 APC에 컨쥬게이팅된 BSA-라텍스 비드 및 아이소타입 대조군 항체를 포함하였다.

모의 감염(표지된 베로), SV40 감염 및 HSV-1 감염으로부터의 F5 및 F15 분획으로부터의 아세트산염 펠렛의 FACS 분석으로부터의 비교 결과를 도 11A, 도 11B 및 도 11C에 나타낸다. 도 11A로부터, 아세트산염 침전 샘플은 그들의 각각의 바이러스 항원(HSV gB 및 SV40 VP1)에 대해 양성으로 남아있다는 것을 알 수 있다. 모의 감염으로부터 결정한 배경에 비교하여, 각각의 SV40 및 HSV-1 아세트산염 침전물은 또한 엑소좀 마커인 CD63(도 11B) 및 아넥신 V 결합에 대해 나타낸 바와 같은 PS(도 11C)에 대해 양성이다. 중질(F15) 및 경질(F5) 밴드로 추가로 분획화되는 HSV-1 재현탁 아세트산염 펠렛에 대해, CD63과 PS를 둘 다 문헌(Szilagyi and Cunningham, 1991)에서 보고된 L 입자와 매칭되는 F5 분획에서 동정하였다.

종합하면, 따라서 이들 데이터는 외피와 비외피 바이러스 둘 다로 감염된 세포로부터 본질적으로 비감염성, PS 양성, 세포외 미세소포 및 엑소좀의 단리와 일치된다.

* * *

본 명세서에 개시되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시형태에 관해 기재되었지만, 본 발명의 개념, 정신 및 범주로부터 벗어나는 일 없이 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법 및 본 명세서에 기재된 방법의 단계들에서 또는 방법의 단계들의 순서에 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 명확할 것이다. 더 구체적으로는, 화학적으로 그리고 생리적으로 관련된 특정 제제는 본 명세서에 기재된 제제로 대체될 수 있지만, 동일 또는 유사한 결과가 달성될 수 있다는 것은 명확할 것이다. 당업자에게 명확한 모든 이러한 대체물 및 변형은 첨부하는 청구범위에 의해 정의되는 바와 같이 본 발명의 정신, 범주 및 개념 내인 것으로 여겨진다.

참고문헌

다음의 참고문헌은 그들이 본 명세서에 제시된 것에 대한 예시적 절차 또는 다른 상세한 설명을 제공하는 정도로 본 명세서에 참고로 구체적으로 포함된다.

미국 특허 출원 공개 제2013/0052647 A1호

미국 특허 출원 공개 제2013/0337440 A1호

미국 특허 제7,262,167호

미국 특허 제7,790,159호

미국 특허 제7,906,115호;

미국 특허 제8,288,172호

미국 특허 제8,530,228호

미국 특허 제8,901,284호

Claims

생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법으로서,
상기 질환 관련 세포외 미세소포는 표면 상에 음으로 하전된 포스파티딜세린을 가지고;
상기 방법은 상기 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포의 침전물을 형성하는데 효과적인 pH 및 농도에서 상기 생물학적 유체의 샘플을 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계 및 상기 침전물로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 수집함으로써 상기 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 단계를 포함하는, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 아세트산염 완충제는 상기 질환 관련 세포외 미세소포 상에서 상기 포스파티딜세린의 상기 표면 전하를 중화시킴으로써, 상기 질환 관련 세포외 미세소포를 상기 생물학적 유체로부터 침전시키는, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생물학적 유체는 질환 관련 및 정상 세포외 미세소포를 포함하는 세포외 미세소포의 혼합된 집단을 함유하되, 상기 방법은 상기 정상 세포외 미세소포와 대조적으로, 상기 질환 관련 세포외 미세소포를 상기 혼합된 집단으로부터 선택적으로 침전시키는, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 질환 관련 세포외 미세소포는 그들의 형태 또는 기능적 특성 또는 세포 표면 항원을 손상시키는 일 없이 단리되는, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 질환-관련 세포외 미세소포는,
(a) 엑소좀이거나;
(b) 바이러스-감염 세포로부터 유래되거나;
(c) 종양-유래 세포외 미세소포이거나;
(d) 종양-유래 엑소좀이거나; 또는
(e) 인간 세포외 미세소포
인, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법.
제5항에 있어서, 상기 질환 관련 세포외 미세소포는 종양-유래 세포외 미세소포이되, 상기 종양-유래 세포외 미세소포는 흑색종, 결장직장암, 폐암, 췌장암, 간암, 전립선암, 유방암 또는 난소암으로부터 유래된, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아세트산염 완충제는,
(a) pH가 4.25 내지 5.25이거나;
(b) 상기 샘플 중의 최종 농도가 0.05M 내지 0.25M이거나;
(c) pH가 4.25 내지 5.25이고, 상기 샘플 중의 최종 농도는 0.05M 내지 0.25M이거나;
(d) 아세트산나트륨 또는 아세트산칼륨을 포함하거나;
(e) 중합체를 제외한 용적이 없거나; 또는
(f) 폴리에틸렌 글리콜이 없는, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법.
제7항에 있어서, 상기 아세트산염 완충제는,
(a) pH가 4.75이거나;
(b) 1.0M 아세트산염 완충제의 1/10 용적으로서 상기 샘플에 첨가되거나; 또는
(c) pH가 4.75이고 상기 샘플 중의 최종 농도는 0.1M인, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생물학적 유체는,
(a) 뮤린, 소 또는 인간 생물학적 유체;
(b) 세포 배양 상청액, 전혈, 혈청, 혈장, 복수액, 뇌척수액, 골수 흡입물, 기관지-폐포 세척물, 소변, 정액, 질액, 점액, 타액, 객담 또는 생물학적 조직 샘플로부터 정제된 용해물;
(c) 이미 저속 원심분리를 실시한 정제된 세포 배양 상청액;
(d) 비-종양 세포외 미세소포를 함유하는 혈청의 존재 하에 배양된 종양 세포로부터 얻은 세포 배양 상청액;
(e) 비-인간 혈청의 존재 하에 배양된 인간 종양 세포로부터 얻은 세포 배양 상청액; 또는
(f) 소 또는 소 태아 혈청의 존재 하에 배양한 마우스 또는 인간 종양 세포로부터 얻은 세포 배양 상청액인, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 단계를 더 포함하는, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법:
(a) 상기 생물학적 유체에 저속 원심분리를 실시하여 상기 아세트산염 완충제와의 접촉 전에 세포, 세포 파편 및 거대막 소수포를 제거하는 단계;
(b) 상기 아세트산염 완충제와의 접촉 후에 상기 질환 관련 세포외 미세소포를 함유하는 상기 침전물을 저속 원심분리에 의해 수집하는 단계;
(c) 중성의 pH에서 무 아세트산염 완충제 중에서 상기 질환 관련 세포외 미세소포를 함유하는 상기 수집된 침전물을 재현탁시켜 질환 관련 세포외 미세소포의 단리된 집단을 제공하는 단계; 또는
(d) 질환 관련 세포외 미세소포의 상기 단리된 집단을 원심분리하여 오염 성분을 제거함으로써, 질환 관련 세포외 미세소포의 순수한 조성물을 제공하는 단계.
제5항에 있어서, 상기 질환-관련 세포외 미세소포는 종양-유래 엑소좀이고, 상기 방법은 하기 단계들을 포함하는, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법:
(a)종양-유래 엑소좀 및 비-종양 엑소좀을 포함하는 엑소좀의 혼합된 집단을 함유하는 생물학적 유체를 얻는 단계;
(b)종양-유래 엑소좀(비-종양 엑소좀은 아님)을 상기 생물학적 유체로부터 선택적으로 침전시키는데 효과적인 pH 및 농도에서 상기 생물학적 유체를 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계;
(c)단계 (b)로부터의 침전물을 수집하는 단계로서, 상기 침전물은 상기 종양-유래 엑소좀을 선택적으로 함유하는, 상기 침전물을 수집하는 단계; 및
(d)중성의 pH에서 무 아세트산염 완충제 중에서 상기 침전물을 재현탁시킴으로써, 비-종양 엑소좀이 없는 종양-유래 엑소좀의 정제된 집단을 제공하는 단계.
제11항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함하는, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법:
(a)종양-유래 엑소좀 및 비-종양 엑소좀을 포함하는 엑소좀의 혼합된 집단을 함유하는 생물학적 유체를 얻는 단계;
(b)상기 생물학적 유체에 대해 제1 저속 원심분리를 수행하여 세포, 세포 파편 및 거대막 소수포가 없는 정제된 유체를 제공하는 단계;
(c)선택적으로 침전된 종양-유래 엑소좀을 포함하지만, 침전된 비-종양 엑소좀은 없는 혼탁한 현탁액을 제공하는데 효과적인 pH 및 농도에서 그리고 효과적인 시간 동안 상기 정제된 유체를 아세트산염 완충제와 함께 인큐베이션하는 단계;
(d)상기 혼탁한 현탁액에 저속 원심분리를 실시하여 침전물 및 상청액을 제공하는 단계로서, 상기 침전물은 상기 종양-유래 엑소좀을 선택적으로 포함하는, 침전물 및 상청액을 제공하는 단계;
(e)상기 종양-유래 엑소좀을 포함하는 상기 침전물을 수집하는 단계; 및
(f)중성 pH에서 무 아세트산염 완충제 중에서 상기 침전물을 재현탁시킴으로써, 종양-유래 엑소좀을 포함하고 비-종양 엑소좀이 없는 정제된 엑소좀 집단을 제공하는 단계.
제12항에 있어서, 상기 방법은 상기 정제된 엑소좀 집단에 추가 원심분리를 실시하여 비-엑소좀 성분을 포함하는 펠렛을 제공하고 상기 펠렛을 제거함으로써, 비-종양 엑소좀과 비-엑소좀 성분이 둘 다 없는 종양-유래 엑소좀의 순수한 조성물을 제공하는 단계를 더 포함하는 것인, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 질환 관련 세포외 미세소포 중의 적어도 제1 바이오마커를 동정하거나 또는 정량화하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포를 단리시키는 방법.
질환 관련 세포외 미세소포가 없는 혈청을 제조하는 방법으로서,
상기 질환 관련 세포외 미세소포는 표면 상에 음으로 하전된 포스파티딜세린을 가지며;
상기 방법은 하기 단계들을 포함하는, 질환 관련 세포외 미세소포가 없는 혈청을 제조하는 방법:
(a)질환 관련 세포외 미세소포를 함유하는 것으로 의심되는 혈청을 얻는 단계;
(b)질환 관련 세포외 미세소포를 상기 혈청으로부터 침전시키는데 효과적인 pH 및 농도에서 상기 혈청을 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계; 및
(c)단계 (b)에서 형성된 침전물을 상기 혈청으로부터 제거하는 단계로서, 상기 침전물은 상기 질환 관련 세포외 미세소포를 함유함으로써, 질환 관련 세포외 미세소포가 없는 혈청을 제공하는, 상기 제거하는 단계.
하기 단계들을 포함하는, 감염성 바이러스 및 바이러스-감염 세포로부터 유래된 세포외 미세소포가 없는 혈액, 혈청 또는 혈장을 제조하는 방법:
(a)감염성 바이러스 및 바이러스-감염 세포로부터 유래된 세포외 미세소포를 함유하는 것으로 의심되는 혈액, 혈청 또는 혈장을 얻는 단계;
(b)상기 감염성 바이러스를 불활성화 또는 침전시키기 위한 그리고 상기 세포외 미세소포를 상기 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 침전시키기 위한 효과적인 pH 및 농도에서 상기 혈액, 혈청 또는 혈장을 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계; 및
(c)단계 (b)에서 형성된 침전물을 상기 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 제거하는 단계로서, 상기 침전물은 상기 불활성화 또는 침전된 바이러스 및 상기 침전된 세포외 미세소포를 함유함으로써, 감염성 바이러스 및 바이러스-감염 세포로부터 유래된 세포외 미세소포가 없는 혈액, 혈청 또는 혈장을 제공하는, 침전물을 제거하는 단계.
제16항에 있어서, 상기 방법은 수혈 전에 수행되는, 감염성 바이러스 및 바이러스-감염 세포로부터 유래된 세포외 미세소포가 없는 혈액, 혈청 또는 혈장을 제조하는 방법.
정제된 생물학적 유체에서 질환 관련 세포외 미세소포를 검출하는 방법으로서,
상기 질환 관련 세포외 미세소포는 표면 상에 음으로 하전된 포스파티딜세린을 가지며;
상기 방법은 상기 정제된 생물학적 유체로부터 질환 관련 세포외 미세소포의 침전물을 선택적으로 형성하는데 효과적인 pH 및 농도에서 상기 정제된 생물학적 유체를 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계 및 상기 생물학적 유체에서 혼탁도의 존재를 결정하는 단계를 포함하되,
상기 생물학적 유체 중의 혼탁도의 존재는 질환 관련 세포외 미세소포의 검출을 나타내는, 정제된 생물학적 유체에서 질환 관련 세포외 미세소포를 검출하는 방법.
표면 상에 음으로 하전된 포스파티딜세린을 갖는 질환 관련 세포외 미세소포의 존재를 특징으로 하는 제1 질환을 갖는 환자의 지시자로서 환자의 생물학적 유체 중 질환 관련 세포외 미세소포의 존재를 사용하는 방법으로서,
상기 방법은 상기 환자로부터의 생물학적 유체 중에서 상기 질환 관련 세포외 미세소포의 존재를 검출하는 단계를 포함하되,
상기 질환 관련 세포외 미세소포는 하기 단계들을 포함하는 방법에 의해 검출되는 것인, 제1 질환을 갖는 환자의 지시자로서 환자의 생물학적 유체 중 질환 관련 세포외 미세소포의 존재를 사용하는 방법:
(a)상기 생물학적 유체로부터 상기 질환 관련 세포외 미세소포의 침전물을 선택적으로 형성하는데 효과적인 pH 및 농도에서 상기 생물학적 유체를 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계; 및
(b)상기 생물학적 유체에서 상기 침전물의 존재를 결정하는 단계로서, 상기 생물학적 유체 중의 상기 침전물의 존재는 상기 질환 관련 세포외 미세소포의 검출을 나타내는 단계.
표면 상에 음으로 하전된 포스파티딜세린을 갖는 질환 관련 세포외 미세소포의 양을 특징으로 하는 제1 질환을 갖는 환자의 질환 부담을 모니터링하는 방법으로서,
상기 환자로부터의 생물학적 유체에서 상기 질환 관련 세포외 미세소포의 양을 측정하는 단계를 포함하되;
상기 질환 관련 세포외 미세소포의 양은 하기 단계들을 포함하는 방법에 의해 측정되는, 제1 질환을 갖는 환자의 질환 부담을 모니터링하는 방법:
(a)상기 생물학적 유체로부터 상기 질환 관련 세포외 미세소포의 침전물을 선택적으로 형성하는데 효과적인 pH 및 농도에서 상기 생물학적 유체를 아세트산염 완충제와 접촉시키는 단계; 및
(b)상기 침전물 중의 상기 질환 관련 세포외 미세소포의 양을 측정하는 단계.
제19항 또는 제20항에 있어서,
(a) 상기 제1 질환의 정체는 상기 제1 질환의 바이오마커 또는 임상징후에 대해 시험함으로써 확인되거나;
(b) 상기 제1 질환은 바이러스 감염이거나; 또는
(c) 상기 제1 질환은 암이되, 상기 질환 관련 세포외 미세소포는 종양-유래 엑소좀인, 방법.
제21항에 있어서, 상기 제1 질환은 암이고, 상기 종양-유래 엑소좀의 양은 복수의 시점에 상기 환자로부터 얻은 일련의 생물학적 유체 샘플에서 측정되되; 종양-유래 엑소좀 양의 증가는 증가된 종양-부담을 나타내고, 상기 종양-유래 엑소좀 양의 감소는 감소된 종양-부담을 나타내는, 방법.
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