WO2022145980A1 - 고효율 및 고순도의 엑소좀 분리방법 - Google Patents

고효율 및 고순도의 엑소좀 분리방법 Download PDF

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WO2022145980A1
WO2022145980A1 PCT/KR2021/020063 KR2021020063W WO2022145980A1 WO 2022145980 A1 WO2022145980 A1 WO 2022145980A1 KR 2021020063 W KR2021020063 W KR 2021020063W WO 2022145980 A1 WO2022145980 A1 WO 2022145980A1
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exosomes
exosome
buffer
protein
present
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PCT/KR2021/020063
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김정석
박달용
백병하
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주식회사 한국유니온 생명과학
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    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating exosomes, and more particularly, to a high-efficiency and high-purity exosome separation method comprising a protein step, an exosome aggregation step, an exosome binding step, and an exosome separation step.
  • Extracellular vesicle is a concept that includes exosomes, ectosomes, microvesicles, and apoptotic bodies released or secreted from cells.
  • exosomes are 30-300 It has a size of nm and is a bio-nanoparticle generated from multi vesicular bodies (MVB) in cells.
  • MVB multi vesicular bodies
  • exosomes play important roles in physiological responses (e.g. immune response, nerve function, stem cell maintenance function) and disease pathology (e.g. cancer, liver, heart, degenerative diseases, etc.).
  • Extracellular vesicles deliver various substances, including proteins and RNA, while secreted and absorbed during cell-to-cell exchange. If the extracellular vesicles do not proceed with this cell exchange process, various diseases can be induced, and interest is being focused on this.
  • Extracellular vesicles can be isolated relatively easily from various types of biofluids such as blood, cerebrospinal fluid, urine, amniotic fluid, breast milk, saliva, and semen. will include For example, oncosomes, which are extracellular vesicles derived from cancer cells, contain mRNA of genes that induce growth of cancer cells, and extracellular vesicles derived from antigen-presenting cells contain major histocompatibility complexes.
  • extracellular vesicles contain high concentrations of biomaterials such as cell-specific proteins and nucleotides, so they exist in about 0.01% of the total protein body in general biological fluids. Vesicles have the advantage of being relatively easy to detect.
  • the type of protein or nucleotide present in the extracellular vesicle is only a small part of the total, the material of the extracellular vesicle can represent the unique characteristics of the cell from which it is derived. It is useful, and research on it has been actively conducted recently.
  • the present inventors have established a method for isolating exosomes from a biological sample comprising a protein step, exosome aggregation step, exosome binding step, and exosome separation step, and the separation by the separation method
  • the present invention was completed by confirming that the exosomes were separated with high efficiency and high purity.
  • the present invention comprises the steps of (a) performing deproteinization on a biological sample;
  • the present invention provides a buffer composition for separating exosomes from a biological sample, comprising at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyetherimide (PEI) and dextran. do.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEI polyetherimide
  • dextran dextran
  • the present invention provides a kit for isolating exosomes from a biological sample, comprising a buffer containing at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyetherimide (PEI) and dextran.
  • a buffer containing at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyetherimide (PEI) and dextran comprising a buffer containing at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyetherimide (PEI) and dextran.
  • an aspect of the present invention comprises the steps of (a) performing deproteinization (Deproteinization) on a biological sample;
  • (E) provides a method of separating the exosomes from the biological sample, comprising the step of separating the washed exosomes through a neutralization reaction.
  • the first protein in step (a) may be performed in a syringe filter having a pore size of 0.2 to 1.0 ⁇ m.
  • the buffer of step (b) may include at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyetherimide (PEI), and dextran.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEI polyetherimide
  • dextran dextran
  • the concentration of polyethylene glycol (PEG) in the buffer of step (b) may be 0.5% (w/v) to 30% (w/v).
  • the concentration of PEI (Polyetherimide) in the buffer of step (b) may be 0.01% (w/v) to 10% (w/v).
  • the concentration of the dextran in the buffer of step (b) may be 0.01% (w/v) to 10% (w/v).
  • the buffer of step (b) may have a pH of 3.5 to 6.5.
  • the protein-friendly material or positive charge-friendly material of step (c) may be any one selected from the group consisting of polycarbonate, anodic aluminum oxide (AAO), cellulose membrane, and regenerative cellulose.
  • AAO anodic aluminum oxide
  • cellulose membrane cellulose membrane
  • regenerative cellulose regenerative cellulose
  • the neutralization reaction of step (e) is at least one selected from the group consisting of urea (Urea), monosodium phosphate (NaH 2 PO 4 ), and Tris-HCl (Tris hydrochloride). This can be done by processing the containing buffer.
  • urea Urea
  • monosodium phosphate NaH 2 PO 4
  • Tris-HCl Tris hydrochloride
  • the buffer in step (e) may have a pH of 7.0 to 9.0.
  • Another aspect provides a buffer composition for separating exosomes from a biological sample, comprising at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyetherimide (PEI) and dextran.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEI polyetherimide
  • kits for isolating exosomes from a biological sample including a buffer comprising at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyetherimide (PEI) and dextran.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEI polyetherimide
  • the exosome separation method according to the present invention is applicable to all samples such as body fluids and cell culture fluids, so it has the feature of being a versatile technique for samples. Since it is possible to separate the exosomes more than twice as high, it is possible to separate the exosomes with high efficiency and high purity. It is expected to be widely used.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the process of the exosome separation method according to the present invention.
  • Figure 2 is an exo-some isolated from a human urine sample by the exosome separation method according to the present invention (Example 1), except that a buffer of a different composition was used instead of Buffer 1 in the exosome aggregation step.
  • Exosomes isolated in the same way as 1 (Comparative Example 1: Using the buffer composition of a PEI-based existing commercially available exosome separation kit (System Biosciences), Comparative Example 2: PEG + PEI-based existing commercially available exosome separation kit (Invitrogen) buffer Composition using, Comparative Example 3: Using a PEG-based buffer, Comparative Example 4: Using a PEG + PEI-based buffer) is compared, Figure 2a is a comparison of size (size), Figure 2b is a comparison of the number of particles (particles) 2c is a comparison of surface charges (zeta-potential), and FIG. 2d is a comparison of electron microscope images.
  • Figure 3 shows the exosome separation results for each sample such as human serum, urine, cell culture solution.
  • FIG. 4 is a result of exosomal phenotype analysis of the exosomes isolated from the cell culture medium through flow cytometry, and FIG. 4a shows the phenotype of the exosomes (control) separated by ultracentrifugation (U / C), Figure 4b shows the phenotype of the exosomes isolated by the method of the present invention (Example 1).
  • FIG. 5 is a comparative example 4 ( PEG + PEI-based buffer), Figure 5a is a comparison of size (size), Figure 5b is a comparison of the number of particles (particles), Figure 5c is a comparison of surface charge (zeta-potential) .
  • Figure 6 is an exosome (control) separated by Ultracentrifugation (U / C) from a human cell culture medium (MSC culture media) sample, the exosome separated by the separation method of the present invention (Example 1), and the exosome aggregation step Exosomes isolated in the same manner as in Example 1, except that the buffer of the existing commercially available exosome separation kit was used instead of Buffer 1 (Comparative Example 1: Buffer composition of the existing commercially available PEI-based exosome separation kit (System Biosciences) Usage, Comparative Example 2: Western blot, a protein analysis test, was performed to confirm protein markers (CD63, CD81, CD9) of a PEG + PEI-based existing commercially available exosome isolation kit (Invitrogen) using the buffer composition).
  • Buffer 1 Buffer composition of the existing commercially available PEI-based exosome separation kit (System Biosciences) Usage
  • Comparative Example 2 Western blot, a protein analysis test, was performed to confirm protein markers (CD
  • the present inventors have established a method for separating exosomes comprising a protein step, exosome aggregation step, exosome binding step, and exosome separation step, confirming that the exosomes isolated by the separation method were separated with high efficiency and high purity Thus, the present invention was completed.
  • the present invention comprises the steps of (a) performing deproteinization on a biological sample; (b) aggregating the exosomes by treating the buffered sample with the protein sample; (c) binding the aggregated exosomes to a membrane made of a protein-friendly material or a positive charge-friendly material; (d) centrifuging and washing the membrane-bound exosomes; and (e) separating the washed exosomes through a neutralization reaction, providing a high-efficiency and high-purity exo-some separation method.
  • exosome refers to vesicles secreted from a cell and released into the extracellular space, and is a membrane-structured endoplasmic reticulum, which is divided into an inside and an outside, and the plasma membrane lipid of the cell ) and plasma membrane protein, nucleic acid, and cytoplasmic components, and may refer to a nano-sized endoplasmic reticulum having a smaller size than the original cell.
  • the exosome may bind to other cells and deliver membrane components, mRNAs, miRNAs, etc., and may act as an extracellular transporter mediating cell-cell communication by delivering these transporters to recipient cells.
  • the exosomes separated by the above method are 100 to 200 nm, for example, 100 to 180 nm, 100 to 150 nm, 100 to 140 nm, 100 to 130 nm, 100 to 120 nm, 100 to 110 nm, 110 to 200 nm, 110 to 150 nm, 110 to It may have a diameter of 140 nm, 110 to 130 nm, or 110 to 120 nm.
  • exosome separation method refers to a method of separating exosomes contained in a sample, and any method of separating and purifying a small amount of exosomes secreted from cells to be widely used in therapeutics or diagnostics.
  • the term “high efficiency” means exhibiting excellent production efficiency with high accuracy for a short time in the separation of exosomes
  • the high-efficiency exosome separation method in the present invention means separating exosomes in high yield. do.
  • the term “high purity” means that the content of other impurities is lowered in the separation of the exosomes and the separation of the exosomes is excellent.
  • the term “biological sample” refers to a sample that can be analyzed biologically.
  • the biological sample is a tissue, blood, blood plasma, plasma, runny nose, saliva, urine, sputum, and lymph fluid isolated from an individual.
  • it may be a cell culture solution, preferably serum, urine, or cell culture solution, but is not limited thereto.
  • the subject may be a mammal, such as a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat.
  • the whole protein step is a step to remove high molecular weight or aggregated proteins in the sample, and in the present invention, the whole protein may be performed in a syringe filter having a pore size of 0.2 to 1.0 ⁇ m, but is limited thereto. it is not going to be
  • the pore size of the syringe filter is, for example, 0.2 to 0.9 ⁇ m, 0.2 to 0.8 ⁇ m, 0.4 to 1.0 ⁇ m, 0.4 to 0.9 ⁇ m, 0.4 to 0.8 ⁇ m, 0.5 to 1.0 ⁇ m, 0.5 to 0.9 ⁇ m, or 0.5 to It may be 0.8 ⁇ m. If the pore size is too small out of the above range, the inflow of the desired exosome may be blocked, and if it is too large outside the above range, the protein may not be smoothly performed and the purity and yield of the exosome may be reduced. .
  • the syringe filter of step (a) may be a membrane made of cellulose (cellulose), PVDF (Polyvinylidene Fluoride), or MCE (Mixed cellulose esters) material, but is not limited thereto, and in the art It may include all syringe filters made of materials commonly used for protein.
  • the exosome aggregation step is a step of aggregating the exosomes using a buffer and applying an electric charge to the surface of the exosomes, wherein the buffer in step (b) is PEG (Polyethylene glycol), PEI (Polyetherimide), and a group consisting of dextran It may include one or more selected from, and specifically, sodium chloride or PBS (Phosphate-buffered saline) solution may be prepared by mixing one or more selected from the group consisting of PEG, PEI, and dextran. have.
  • the dextran may be, for example, dextran sulfate or dextran acetate, but is not limited thereto.
  • the PEG may have a molecular weight of 100 to 10,000 Da, for example, 100 to 9,000 Da, 100 to 8,000 Da, 100 to 7,000 Da, 100 to 6,000 Da, 1,000 to 10,000 Da, 1,000 to 9,000 Da, 1,000 to 8,000 Da, 1,000 to 7,000 Da, 1,000 to 6,000 Da, 2,000 to 10,000 Da, 2,000 to 9,000 Da, 2,000 to 8,000 Da, 2,000 to 7,000 Da, 2,000 to 6,000 Da, 3,000 to 10,000 Da, 3,000 to 9,000 Da, 3,000 to 8,000 Da, 3,000 to 7,000 Da, 3,000 to 6,000 Da, 4,000 to 10,000 Da, 4,000 to 9,000 Da, 4,000 to 8,000 Da, 4,000 to 7,000 Da, 4,000 to 6,000 Da, 5,000 to 10,000 Da, 4,000 to 9,000 Da, 4,000 to 8,000 Da, 4,000 to 7,000 Da, 4,000 to 6,000 Da, 5,000 to 10,000 Da, 5,000 to 9,000 Da, 5,000 to 8,000 Da, 5,000 to 7,000 Da, 5,000 to 6,000 Da. If the molecular weight is too small outside the
  • the concentration of the PEG (polyethylene glycol) in the buffer is 0.5% (w/v) to 30% (w/v), for example, 0.5% (w/v) to 25% (w) /v), 0.5 % (w/v) to 20 % (w/v), 0.5 % (w/v) to 15 % (w/v), 0.5 % (w/v) to 10 % (w/v) ), 1.0 % (w/v) to 30 % (w/v), 1.0 % (w/v) to 25 % (w/v), 1.0 % (w/v) to 20 % (w/v), 1.0 % (w/v) to 15 % (w/v), 1.0 % (w/v) to 10 % (w/v), 3.0 % (w/v) to 30 % (w/v), 3.0 % (w/v) to 25 % (w/v), 3.0 % (w/v) to 20 % (w/v), 3.0 %
  • the concentration of the PEI (Polyetherimide) in the buffer is 0.01% (w/v) to 10% (w/v), for example, 0.01% (w/v) to 5% (w/v) v), 0.01 % (w/v) to 3 % (w/v), 0.01 % (w/v) to 1 % (w/v), 0.01 % (w/v) to 0.5 % (w/v) , 0.01 % (w/v) to 0.4 % (w/v), 0.05 % (w/v) to 10 % (w/v), 0.05 % (w/v) to 5 % (w/v), 0.05 % (w/v) to 3 % (w/v), 0.05 % (w/v) to 1 % (w/v), 0.05 % (w/v) to 0.5 % (w/v), 0.05 % ( w/v) to 0.4 % (w/v), 0.1 % (w/v) to
  • the concentration of the dextran in the buffer is 0.01% (w/v) to 10% (w/v), for example, 0.01% (w/v) to 5% (w/v) , 0.01 % (w/v) to 3 % (w/v), 0.01 % (w/v) to 1 % (w/v), 0.01 % (w/v) to 0.5 % (w/v), 0.01 % (w/v) to 0.4 % (w/v), 0.05 % (w/v) to 10 % (w/v), 0.05 % (w/v) to 5 % (w/v), 0.05 % ( w/v) to 3 % (w/v), 0.05 % (w/v) to 1 % (w/v), 0.05 % (w/v) to 0.5 % (w/v), 0.05 % (w/v) v) to 0.4 % (w/v), 0.1 % (w/v) to 10 % (w/v), 0.
  • step (b) If the buffer concentration in step (b) is too high or too low outside the above range, the exosome separation yield or purity may be reduced.
  • the buffer of step (b) may have a pH of 3.5 to 6.5, but is not limited thereto, for example, pH 3.5 to 6.0, pH 3.5 to 5.6, pH 4.5 to 6.5, pH 4.5 to 6.0, pH 4.5 to 5.6, pH 5.0 to 6.5, or pH 5.0 to 6.0.
  • the exosome binding step is a step of forming a membrane capable of specifically binding to the exosome, and may be performed for 1 to 5 minutes at room temperature using a protein-friendly material or a positive charge-friendly material, but is not limited thereto.
  • the protein-friendly material or the positive charge-friendly material may be any one selected from the group consisting of Polycarbonate, anodic aluminum oxide (AAO), Cellulose membrane, and Regenerative cellulose, preferably Polycarbonate or Regenerative cellulose.
  • AAO anodic aluminum oxide
  • Cellulose membrane preferably Cellulose membrane
  • Regenerative cellulose preferably Polycarbonate or Regenerative cellulose.
  • it is not limited thereto, and as a material capable of specifically binding to an exosome, it may include all those commonly used in the art.
  • the first centrifugation is 300 to 800 xg , for example 300 to 700 xg, 300 to 600 xg, 300 to 500 xg, 400 to 800 xg, 400 to 700 xg, 400 to 600 xg, 400 to 500 xg, 500 to 800 xg, 500 to 700 xg, Or 500 to 600 xg may be carried out at room temperature or 4 ° C.
  • the second centrifugation is 2,000 to 5,000 xg, for example, 2,000 to 4,000 xg, 2,000 to 3,000 xg, 2,000 to 2,500 xg , 2,200 to 5,000 xg, 2,200 to 4,000 xg, 2,200 to 3,000 xg, or 2,200 to 2,500 xg may be one carried out at room temperature or 4 °C for 5 to 20 minutes.
  • the exosome separation step is a step for separating the exosomes by neutralizing the buffer used in the (b) exosome aggregation step, wherein the neutralization is urea (Urea), monosodium phosphate (NaH 2 PO 4 ), and Tris-HCl (Tris hydrochloride) may be performed by treating a buffer containing at least one selected from the group consisting of, specifically, urea, monosodium phosphate (PBS (Phosphate-buffered saline) or saline solution) NaH 2 PO 4 ), and Tris-HCl may be prepared by mixing at least one selected from the group consisting of.
  • PBS Phosphate-buffered saline
  • Tris-HCl may be prepared by mixing at least one selected from the group consisting of.
  • the concentration of the urea (Urea) in the buffer of step (e) is 0.01 to 10 M, for example, 0.01 to 5 M, 0.01 to 3 M, 0.01 to 1 M, 0.01 to 0.7 M , 0.01 to 0.5 M, 0.1 to 10 M, 0.1 to 5 M, 0.1 to 3 M, 0.1 to 1 M, 0.1 to 0.7 M, 0.1 to 0.5 M, 0.2 to 10 M, 0.2 to 5 M, 0.2 to 3 M , 0.2 to 1 M, 0.2 to 0.7 M, or 0.2 to 0.5 M.
  • the concentration of the monosodium phosphate (NaH 2 PO 4 ) in the buffer of step (e) is 0.01 to 10 M, for example, 0.01 to 5 M, 0.01 to 3 M, 0.01 to 1 M , 0.01 to 0.7 M, 0.01 to 0.5 M, 0.05 to 10 M, 0.05 to 5 M, 0.05 to 3 M, 0.05 to 1 M, 0.05 to 0.7 M, 0.05 to 0.5 M, 0.1 to 10 M, 0.1 to 5 M , 0.1 to 3 M, 0.1 to 1 M, 0.1 to 0.7 M, 0.1 to 0.5 M, 0.2 to 10 M, 0.2 to 5 M, 0.2 to 3 M, 0.2 to 1 M, 0.2 to 0.7 M, or 0.2 to 0.5 may be M.
  • the concentration of Tris-HCl in the buffer of step (e) is 0.001 to 10 M, for example, 0.001 to 5 M, 0.001 to 1 M, 0.001 to 0.5 M, 0.001 to 0.1 M, 0.001 to 0.07 M, 0.005 to 10 M, 0.005 to 5 M, 0.005 to 1 M, 0.005 to 0.5 M, 0.005 to 0.1 M, 0.005 to 0.07 M, 0.01 to 10 M, 0.01 to 5 M, 0.01 to 1 M, 0.01 to 0.7 M, 0.01 to 0.5 M, 0.01 to 0.1 M, 0.01 to 0.07 M, 0.03 to 10 M, 0.03 to 5 M, 0.03 to 1 M, 0.03 to 0.7 M, 0.03 to 0.5 M, 0.03 to 0.1 M, or 0.03 to 0.07 M.
  • step (e) When the buffer concentration of step (e) is too high or too low outside the above range, the exosome separation yield or purity may be reduced.
  • the buffer in step (e) may have a pH of 7.0 to 9.0, but is not limited thereto, and may be, for example, a pH of 7.5 to 9.0, a pH of 7.5 to 8.0, or a pH of 8.0 to 9.0.
  • the present inventors confirmed that the exosomes isolated according to the separation method of the present invention exhibit high efficiency and excellent purity through Examples.
  • the size of the separation method of the present invention As a result of analyzing the size, number of particles, surface charge and electron microscope images of the exosomes separated by different methods and conditions to confirm the efficiency of the exosomes, the size of the separation method of the present invention It was confirmed that the exosome separated by Using the buffer composition of System Biosciences), Comparative Example 2: It was confirmed that the yield was about 2.5 to 7.5 times higher than that of the existing commercially available exosome separation kit (Invitrogen) based on PEG + PEI) (see Experimental Example 1) ).
  • the exosomes isolated by the separation method of the present invention can be separated with high efficiency and high purity, and can be used universally in various samples.
  • the isolated exosomes can be widely used in research on diagnosis or treatment methods that require high-purity exosomes.
  • Another aspect provides a buffer composition for separating exosomes from a biological sample, comprising at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyetherimide (PEI) and dextran.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEI polyetherimide
  • dextran dextran
  • the buffer is at least one selected from the group consisting of a PEG (Polyethylene glycol) solution, a PEI solution (Polyetherimide), and a dextran solution in physiological saline (NaCl, sodium chloride) or PBS (Phosphate-buffered saline) solution. It may be prepared by adding , and the buffer may have an effective concentration and pH for aggregating exosomes from a biological sample.
  • the buffer may have the concentration and pH of PEG, PEI, or dextran as described above.
  • kits for isolating exosomes from a biological sample including a buffer comprising at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyetherimide (PEI) and dextran.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEI polyetherimide
  • dextran dextran
  • the biological sample, the exosome, and the buffer are the same as described above.
  • the kit may further include one or more reagents used in the exosome separation method, for example, may further include an elution buffer for neutralization reaction.
  • Exosomes were isolated by the process as shown in FIG. 1 .
  • the separation method for each step is shown below.
  • protein reduction was performed.
  • human urine Urine
  • cell culture medium MSC culture media
  • Cellulose, PVDF (Polyvinylidene Fluoride), MCE (Mixed cellulose esters)-based membrane was used as a syringe filter used for protein, and the pore size of the syringe filter was 0.8 ⁇ m. was set up and protein was performed.
  • Buffer 1 was prepared and processed by mixing various solutions in order to aggregate the exosomes and apply an electric charge to the surface of the sample that became the protein in step (a).
  • Buffer 1 is a PEG solution (PEG 6000 (Polyethylene glycol MW 6,000)), a PEI solution (Polyetherimide), and a dextran solution (dextran) in a basic solution of physiological saline (NaCl, sodium chloride) or PBS (Phosphate-buffered saline).
  • step (b) The aggregate obtained in step (b) was added to a column equipped with a membrane specifically binding to exosomes, and reacted at room temperature for 1 to 5 minutes.
  • Polycarbonate or Regenerative cellulose which is a protein-friendly and positive charge-friendly material, was used as the material of the membrane.
  • exosomes bound to the membrane through step (c) were centrifuged for 1 minute at 500 x g at room temperature or 4° C. and washed with PBS or Saline washing buffer. After washing, centrifugation was performed at 2,500 ⁇ g at room temperature or 4° C. for 10 minutes.
  • an elution buffer was treated. Specifically, the elution buffer is mixed by adding urea solution, NaH 2 PO 4 solution, and Tris-HCl pH 5.9 solution to a basic solution of PBS or Saline so that the final concentrations are 0.4 M, 0.1 M, and 0.05 M, respectively. After that, it was prepared by adjusting the final pH to pH 8.0. This was treated with the supernatant obtained in step (d) to isolate the exosomes through neutralization. After separation of the exosomes, the final product was obtained by centrifugation at 2,500 x g at room temperature or 4 °C for 5 minutes.
  • the size, number of particles, and surface charge of PEG + PEI-based buffer prepared by adding 5 % (w/v), 0.5 % (w/v) and adjusting the final pH to 5.5 ⁇ 0.1) were measured using a particle size analyzer (particle analyzer, ParticleMatrix, Zetaview) was used, and electron microscope (JEM-2010, JEOL, Japan) images were taken.
  • a particle size analyzer particle analyzer, ParticleMatrix, Zetaview
  • the exosome separation method according to the present invention can be used for sample versatility, 10 ml each of serum and urine of a normal person as a clinical sample is used, and 10 ml of MSC culture media is used as a cell culture medium. After separating the exosomes according to the method of Example 1, the size, number of particles, and surface charge of the exosomes separated from each sample were analyzed with a particle size analyzer (ParticleMatrix, Zetaview).
  • a particle size analyzer particleMatrix, Zetaview
  • the phenotype of the exosomes (control) separated by ultracentrifugation (U/C) through flow cytometry (control) and the exosomes isolated by the separation method of the present invention (Example 1) were analyzed by flow cytometry (Flow cytometry, BD, FACSCantoII) did As a result, the phenotype of the exosomes isolated by ultracentrifugation did not show any specificity of the phenotype in the non-staining state as shown in FIG. 4a, but it was confirmed that CD63 was expressed in the result of staining the exosome marker. .
  • the phenotype of the exosomes isolated by the separation method of the present invention did not show a singularity of the phenotype in the non-staining state as shown in FIG. 4b, but in the result of staining the exosome marker, CD63 and CD81 was confirmed to be expressed.
  • Exosomes separated by ultracentrifugation (U / C) (control), exosomes isolated by the separation method of the present invention (Example 1), and the buffer of the existing commercially available exosome separation kit instead of Buffer 1 in the exosome aggregation step Exosomes isolated in the same manner as in Example 1 except that they were used (Comparative Example 1: Using a buffer composition of a PEI-based existing commercially available exosome separation kit (System Biosciences), Comparative Example 2: PEG + PEI-based existing commercially available exo Western blot, a protein analysis test, was performed to confirm protein markers of a moth isolation kit (using the buffer composition of Invitrogen).
  • the isolated exosomes were dissolved in a radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA).
  • the dissolved protein was quantified by BCA assay, and 5 ug of the protein was separated using a 10% SDS-PAGE gel and transferred to a 0.22- ⁇ m nitrocellulose (NC) membrane.
  • N 0.22- ⁇ m nitrocellulose
  • the antibodies used here are: Anti-CD63 (ab231975, Abcam), Anti-CD81 (ab79559, Abcam), Anti-CD9 (ab223052, Abcam), Anti- ⁇ -actin (A5441, Sigma). After washing with Tris-buffered saline and Tween 20 (Tris-buffered saline and Tween 20; TBST), secondary antibody was added to the membrane for 1 h at room temperature. The membrane was developed with western blot ECL solution (Supex) to acquire chemiluminescence images, and ⁇ -actin was used as an immunoblotting control.

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Abstract

본 발명은 엑소좀 분리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 제단백 단계, 엑소좀 응집 단계, 엑소좀 결합 단계 및 엑소좀 분리 단계를 포함하는 고효율 및 고순도의 엑소좀 분리방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 엑소좀 분리방법은 체액 및 세포 배양액 등 모든 시료에 적용이 가능하여 시료 범용성 기술이라는 특징이 있으며, 엑소좀 분리에 있어 총 소요시간이 40분 이내로 시간 단축이 효과적이며, Ultracentrifugation 대비 25배 이상의 엑소좀의 분리가 가능하여 고효율 및 고순도로 엑소좀을 분리할 수 있는바, 본 발명의 분리방법 및 상기 방법에 의해 분리된 엑소좀은 고순도 엑소좀을 필요로 하는 진단이나 치료방법 연구에 널리 활용이 가능할 것으로 기대된다.

Description

고효율 및 고순도의 엑소좀 분리방법
본 발명은 엑소좀 분리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 제단백 단계, 엑소좀 응집 단계, 엑소좀 결합 단계 및 엑소좀 분리 단계를 포함하는 고효율 및 고순도의 엑소좀 분리방법에 관한 것이다.
세포외 소포(extracellular vesicle)는 세포에서 방출 또는 분비되는 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 미세소포(microvesicle) 및 세포자멸사 소체(apoptotic body)를 포함한 개념으로 그중 엑소좀은 30-300 nm의 크기를 가지며 세포 내 다소포체(Multi vesicular bodies; MVB)로부터 생성되는 생체 나노 입자이다. 엑소좀은 크기는 작지만, 생리 반응 (e.g. 면역 반응, 신경 기능, 줄기 세포 유지 기능)과 질병 병리 (e.g. 암, 간, 심장, 퇴행성 질환 등)에 중요한 역할을 한다.
세포외 소포는 세포 간 교류 과정에서 분비 및 흡수되면서, 단백질이나 RNA를 포함한 다양한 물질을 전달한다. 세포외 소포가 이러한 세포 교류과정을 진행하지 못하면 다양한 질병이 유발될 수 있어, 이에 대한 관심이 집중되고 있다. 세포외 소포는 혈액, 뇌척수액, 소변, 양수, 모유, 침, 정액 같은 여러 종류의 다양한 생체액(biofluid)에서 비교적 쉽게 분리할 수 있으며, 유래되는 세포나 세포 내 소기관에 따라 다양한 뉴클레오타이드 또는 표지단백질을 포함하게 된다. 예를 들어 암세포에서 유래된 세포외 소포인 온코좀은 암세포의 성장을 유도하는 유전자의 mRNA를, 항원제시세포(antigen-presenting cell)에서 유래된 세포외 소포는 주조직적합 복합체를 포함한다. 이처럼 세포외 소포는 세포특이적인 단백질이나 뉴클레오티드 같은 생체물질이 고농도로 농축되어 포함된 상태이므로 일반 생체액에선 전체 단백질체의 0.01% 정도로 존재하여 통상적인 분석방법으로는 검출이 어려운 단백질이나 뉴클레오티드도 세포외 소포에선 비교적 쉽게 검출이 가능한 장점이 있다. 아울러 비록 세포외 소포에 존재하는 단백질이나 뉴클레오티드의 종류가 전체의 극히 일부이긴 하나 세포외 소포의 물질은 자신이 유래한 세포의 고유의 특성을 나타낼 수 있으므로 엑소좀 분석은 특정 질환의 진단 목적으로 매우 유용하며, 이에 대한 연구가 최근 활발히 이루어지고 있다.
엑소좀을 이용한 진단이나 치료방법 연구에서는 순도 높은 엑소좀을 얻는 것이 중요하다. 엑소좀의 분리와 관련하여 대한민국 공개특허 제10-2016-0115988호를 포함하여 다양한 방법이 연구되어 오고 있다. 이의 예로는 초원심분리(ultracentrifuge), 밀도 원심분리(density centrifuge), 컬럼(column)의 이용, PEG 침전(PEG precipitation), 크로마토그래피(chromatography), 면역-자기분리(immuno-magnetic separation, IMS) 및 음향 정제(acoustic separation, acoustic purification) 등이 있다. 그 중에서도 초원심분리를 이용한 엑소좀 분리방법은 그동안 가장 많이 사용되는 방법이었으나, 특수한 장비가 필요하고, 시간이 많이 소요되는 반면, 얻을 수 있는 EV 수율은 낮고 손상되는 경우가 잦기 때문에, 이를 개선하면서도 수율을 높이고 고순도의 엑소좀을 분리할 수 있는 방법이 필요한 실정이다.
상기와 같은 필요에 의해, 본 발명자들은 제단백 단계, 엑소좀 응집 단계, 엑소좀 결합 단계 및 엑소좀 분리 단계를 포함하는 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 방법을 확립하였으며, 상기 분리방법에 의해 분리된 엑소좀이 고효율 및 고순도로 분리되었다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 (a) 생물학적 시료에 제단백(Deproteinization)을 수행하는 단계;
(b) 상기 제단백된 시료에 버퍼를 처리하여 엑소좀을 응집시키는 단계;
(c) 상기 응집된 엑소좀을 단백질 친화적 재질 또는 양전하 친화적 재질의 막에 결합시키는 단계;
(d) 상기 막에 결합된 엑소좀을 원심분리 및 세척하는 단계; 및
(e) 상기 세척된 엑소좀을 중화반응을 통해 분리하는 단계를 포함하는, 고효율 및 고순도의 엑소좀 분리방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 PEG(Polyethylene glycol), PEI(Polyetherimide) 및 덱스트란(dextran)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하기 위한 버퍼 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 PEG(Polyethylene glycol), PEI(Polyetherimide) 및 덱스트란(dextran)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 버퍼를 포함하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하기 위한 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 (a) 생물학적 시료에 제단백(Deproteinization)을 수행하는 단계;
(b) 상기 제단백된 시료에 버퍼를 처리하여 엑소좀을 응집시키는 단계;
(c) 상기 응집된 엑소좀을 단백질 친화적 재질 또는 양전하 친화적 재질의 막에 결합시키는 단계;
(d) 상기 막에 결합된 엑소좀을 원심분리 및 세척하는 단계; 및
(e) 상기 세척된 엑소좀을 중화반응을 통해 분리하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 (a)단계의 제단백은 포어 사이즈(pore size) 0.2 내지 1.0 ㎛의 실린지 필터(Syringe filter)에서 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (b)단계의 버퍼는 PEG(Polyethylene glycol), PEI(Polyetherimide), 및 덱스트란(dextran)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계의 버퍼에서 상기 PEG(Polyethylene glycol)의 농도는 0.5 %(w/v) 내지 30 % (w/v)인 것일 수 잇다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계의 버퍼에서 상기 PEI(Polyetherimide)의 농도는 0.01 %(w/v) 내지 10 % (w/v)인 것일 수 잇다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계의 버퍼에서 상기 덱스트란의 농도는 0.01 %(w/v) 내지 10 % (w/v)인 것일 수 잇다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b)단계의 버퍼는 pH가 3.5 내지 6.5인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c)단계의 단백질 친화적 재질 또는 양전하 친화적 재질은 Polycarbonate, anodic aluminum oxide (AAO), Cellulose membrane 및 Regenerative cellulose로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (e)단계의 중화 반응은 요소(Urea), 모노나트륨 인산염(NaH2PO4), 및 Tris-HCl(Tris hydrochloride)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 버퍼를 처리하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (e)단계의 버퍼는 pH 7.0 내지 9.0인 것일 수 있다.
다른 양상은 PEG(Polyethylene glycol), PEI(Polyetherimide) 및 덱스트란(dextran)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하기 위한 버퍼 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 PEG(Polyethylene glycol), PEI(Polyetherimide) 및 덱스트란(dextran)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 버퍼를 포함하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 엑소좀 분리방법은 체액 및 세포 배양액 등 모든 시료에 적용이 가능하여 시료 범용성 기술이라는 특징이 있으며, 엑소좀 분리에 있어 총 소요시간이 40분 이내로 시간 단축이 효과적이며, Ultracentrifugation 대비 25배 이상의 엑소좀의 분리가 가능하여 고효율 및 고순도로 엑소좀을 분리할 수 있는 바, 본 발명의 분리방법 및 상기 방법에 의해 분리된 엑소좀은 고순도 엑소좀을 필요로 하는 진단이나 치료방법 연구에 널리 활용이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 엑소좀 분리방법의 공정 모식도를 나타낸 것이다.
도 2 는 인간 소변(urine) 시료로부터 본 발명에 따른 엑소좀 분리방법으로 분리한 엑소좀 (실시예 1), 엑소좀 응집 단계에서 Buffer 1 대신 상이한 조성의 버퍼를 사용한 점을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 분리한 엑소좀 (비교예 1: PEI 기반 기존 시판품 엑소좀 분리 키트(System Biosciences)의 버퍼 조성 사용, 비교예 2: PEG + PEI 기반 기존 시판품 엑소좀 분리 키트 (Invitrogen)의 버퍼 조성 사용, 비교예 3: PEG 기반 버퍼 사용, 비교예 4: PEG + PEI 기반 버퍼 사용)을 비교한 것으로, 도 2a는 크기(size)를 비교한 것이고, 도 2b는 입자수(particles)를 비교한 것이고, 도 2c는 표면전하를 비교한 것이고(zeta-potential), 도 2d는 전자현미경 이미지를 비교한 것이다.
도 3은 인간 혈청, 소변, 세포배양액 등 시료별 엑소좀 분리 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 유세포 분석을 통해 세포배양액으로부터 분리된 엑소좀의 표현형을 분석(Exosomal Phenotype analysis)한 결과로서, 도 4a는 Ultracentrifugation(U/C) 으로 분리한 엑소좀(대조군)의 표현형을 나타낸 것이고, 도 4b는 본 발명에 방법에 의해 분리된 엑소좀(실시예 1)의 표현형을 나타낸 것이다.
도 5는 인간 소변 (Urine) 시료로부터 본 발명에 따른 방법으로 엑소좀을 분리함에 있어, 엑소좀 응집 단계의 PEG + PEI + dextran 기반 버퍼의 농도별 변화에 따른 엑소좀 분리 효율을 비교예 4(PEG + PEI 기반 버퍼)와 비교한 것으로, 도 5a는 크기(size)를 비교한 것이고, 도 5b는 입자수(particles)를 비교한 것이고, 도 5c는 표면전하 (zeta-potential)를 비교한 것이다.
도 6은 인간 세포 배양액(MSC culture media) 시료로부터 Ultracentrifugation(U/C)로 분리한 엑소좀(대조군), 본 발명의 분리방법에 의해 분리된 엑소좀(실시예 1), 및 엑소좀 응집 단계에서 Buffer 1 대신 기존 시판품 엑소좀 분리 키트의 버퍼를 사용한 점을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 분리된 엑소좀 (비교예 1: PEI 기반 기존 시판품 엑소좀 분리 키트(System Biosciences)의 버퍼 조성 사용, 비교예 2: PEG + PEI 기반 기존 시판품 엑소좀 분리 키트 (Invitrogen)의 버퍼 조성 사용)의 단백질 마커 (CD63, CD81, CD9)를 확인하기 위하여 단백질 분석실험인 웨스턴 블랏을 수행한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 제단백 단계, 엑소좀 응집 단계, 엑소좀 결합 단계 및 엑소좀 분리 단계를 포함하는 엑소좀 분리 방법을 확립하였으며, 상기 분리방법에 의해 분리된 엑소좀이 고효율 및 고순도로 분리되었다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 (a) 생물학적 시료에 제단백(Deproteinization)을 수행하는 단계; (b) 상기 제단백된 시료에 버퍼를 처리하여 엑소좀을 응집시키는 단계; (c) 상기 응집된 엑소좀을 단백질 친화적 재질 또는 양전하 친화적 재질의 막에 결합시키는 단계; (d) 상기 막에 결합된 엑소좀을 원심분리 및 세척하는 단계; 및 (e) 상기 세척된 엑소좀을 중화반응을 통해 분리하는 단계를 포함하는, 고효율 및 고순도의 엑소좀 분리방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “엑소좀”이란 세포에서 분비되어 세포 외 공간으로 방출된 소포체(vesicles)를 의미하는 것으로서, 막 구조 소포체로 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질(plasma membrane lipid)과 세포막 단백질(plasma membrane protein), 핵산(nucleic acid), 및 세포질 성분 등을 가지고 있고, 원래 세포보다 크기가 작은 나노 크기의 소포체를 의미할 수 있다. 상기 엑소좀은 다른 세포에 결합하여 막 구성요소, mRNAs, miRNAs 등을 전달해 주고, 이들 전달 물질을 수용 세포에 전달해 줌으로써 세포-세포 간 소통을 매개하는 세포 외 전달체로 작용하는 것일 수 있다.
상기 방법으로 분리된 엑소좀은 100 내지 200nm, 예를 들어, 100 내지 180nm, 100 내지 150nm, 100 내지 140nm, 100 내지 130nm, 100 내지 120nm, 100 내지 110nm, 110 내지 200nm, 110 내지 150nm, 110 내지 140nm, 110 내지 130nm, 또는 110 내지 120nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “엑소좀 분리방법”이란 시료 내에 포함된 엑소좀을 분리하는 방법으로서, 세포에서 분비되는 소량의 엑소좀을, 치료제나 진단 등에 폭넓게 활용하기 위해 분리하고 정제하는 모든 방법을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “고효율”이란 엑소좀 분리에 있어서 짧은 시간동안 정확도가 높은 우수한 생산효율을 나타내는 것을 의미하며, 본 발명에서 고효율 엑소좀 분리방법은 높은 수율로 엑소좀을 분리하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “고순도”란 엑소좀 분리에 있어서 다른 불순물의 함량을 낮추고 엑소좀의 분리가 우수하게 나타나는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “생물학적 시료”란 생물학적으로 분석이 가능한 검체물로서 본 발명에서 생물학적 시료는 개체로부터 분리된 조직, 혈액, 혈정, 혈장, 콧물, 타액, 뇨 (urine), 객담, 림프액 또는 세포 배양액일 수 있으며, 바람직하게는 혈청, 뇨(urine) 또는 세포 배양액일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 개체는 포유 동물, 예를 들어, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.
이하, 본 발명의 엑소좀 분리방법에 대해 각 단계별로 세분화하여 구체적으로 설명하기로 한다.
[(a)단계 : 제단백(Deproteinization) 단계]
제단백 단계는 시료 내 높은 분자량 또는 응집된 단백질을 제거하는 단계로서, 본 발명에서 제단백은 포어 사이즈(pore size) 0.2 내지 1.0 ㎛의 실린지 필터(Syringe filter)에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실린지 필터의 포어 사이즈는 예를 들어, 0.2 내지 0.9 ㎛, 0.2 내지 0.8 ㎛, 0.4 내지 1.0 ㎛, 0.4 내지 0.9 ㎛, 0.4 내지 0.8 ㎛, 0.5 내지 1.0 ㎛, 0.5 내지 0.9 ㎛, 또는 0.5 내지 0.8 ㎛일 수 있다. 상기 포어 사이즈가 상기 범위를 벗어나 너무 작을 경우, 목적하는 엑소좀의 유입이 차단될 수 있으며, 상기 범위를 벗어나 너무 클 경우, 제단백이 원활히 수행되지 않아 엑소좀 순도 및 수율이 저하되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계의 실린지 필터는 셀룰로오즈 (cellulose), PVDF(Polyvinylidene Fluoride), MCE(Mixed cellulose esters) 재질로 구성된 막일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당해 기술분야에서 제단백을 위해 통상적으로 사용되는 재질의 실린지 필터를 모두 포함할 수 있다.
[(b)단계 : 엑소좀 응집 단계(Exosome precipitation)]
엑소좀 응집 단계는 버퍼를 사용하여 엑소좀을 응집시키고 엑소좀 표면에 전하를 부여하는 단계로서, 상기 (b) 단계의 버퍼는 PEG(Polyethylene glycol), PEI(Polyetherimide), 및 덱스트란으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로, 염화나트륨 (Sodium chloride) 또는 PBS (Phosphate-buffered saline) 용액에 PEG, PEI, 및 덱스트란으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 혼합하여 제조되는 것일 수 있다. 상기 덱스트란은 예를 들어, dextran sulfate 또는 dextran acetate일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일구체예에 있어서, 상기 PEG는 분자량이 100 내지 10,000 Da일 수 있으며, 예를 들어, 100 내지 9,000 Da, 100 내지 8,000 Da, 100 내지 7,000 Da, 100 내지 6,000 Da, 1,000 내지 10,000 Da, 1,000 내지 9,000 Da, 1,000 내지 8,000 Da, 1,000 내지 7,000 Da, 1,000 내지 6,000 Da, 2,000 내지 10,000 Da, 2,000 내지 9,000 Da, 2,000 내지 8,000 Da, 2,000 내지 7,000 Da, 2,000 내지 6,000 Da, 3,000 내지 10,000 Da, 3,000 내지 9,000 Da, 3,000 내지 8,000 Da, 3,000 내지 7,000 Da, 3,000 내지 6,000 Da, 4,000 내지 10,000 Da, 4,000 내지 9,000 Da, 4,000 내지 8,000 Da, 4,000 내지 7,000 Da, 4,000 내지 6,000 Da, 5,000 내지 10,000 Da, 5,000 내지 9,000 Da, 5,000 내지 8,000 Da, 5,000 내지 7,000 Da, 5,000 내지 6,000 Da일 수 있다. 상기 분자량이 상기 범위를 벗어나 너무 작을 경우, 엑소좀 응집력이 감소할 수 있으며, 상기 범위를 벗어나 너무 클 경우 엑소좀의 과응집을 초래하여 침전이 발생할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 버퍼에서 상기 PEG(Polyethylene glycol)의 농도는 0.5 %(w/v) 내지 30 % (w/v), 예를 들어, 0.5 %(w/v) 내지 25 % (w/v), 0.5 %(w/v) 내지 20 % (w/v), 0.5 %(w/v) 내지 15 % (w/v), 0.5 %(w/v) 내지 10 % (w/v), 1.0 %(w/v) 내지 30 % (w/v), 1.0 %(w/v) 내지 25 % (w/v), 1.0 %(w/v) 내지 20 % (w/v), 1.0 %(w/v) 내지 15 % (w/v), 1.0 %(w/v) 내지 10 % (w/v), 3.0 %(w/v) 내지 30 % (w/v), 3.0 %(w/v) 내지 25 % (w/v), 3.0 %(w/v) 내지 20 % (w/v), 3.0 %(w/v) 내지 15 % (w/v), 3.0 %(w/v) 내지 10 % (w/v), 5.0 %(w/v) 내지 30 % (w/v), 5.0 %(w/v) 내지 25 % (w/v), 5.0 %(w/v) 내지 20 % (w/v), 5.0 %(w/v) 내지 15 % (w/v), 또는 5.0 %(w/v) 내지 10 % (w/v)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 버퍼에서 상기 PEI(Polyetherimide)의 농도는 0.01 %(w/v) 내지 10 % (w/v), 예를 들어, 0.01 %(w/v) 내지 5 % (w/v), 0.01 %(w/v) 내지 3 % (w/v), 0.01 %(w/v) 내지 1 % (w/v), 0.01 %(w/v) 내지 0.5 % (w/v), 0.01 %(w/v) 내지 0.4 % (w/v), 0.05 %(w/v) 내지 10 % (w/v), 0.05 %(w/v) 내지 5 % (w/v), 0.05 %(w/v) 내지 3 % (w/v), 0.05 %(w/v) 내지 1 % (w/v), 0.05 %(w/v) 내지 0.5 % (w/v), 0.05 %(w/v) 내지 0.4 % (w/v), 0.1 %(w/v) 내지 10 % (w/v), 0.1 %(w/v) 내지 5 % (w/v), 0.1 %(w/v) 내지 3 % (w/v), 0.1 %(w/v) 내지 1 % (w/v), 0.1 %(w/v) 내지 0.5 % (w/v), 0.1 %(w/v) 내지 0.4 % (w/v), 0.2 %(w/v) 내지 10 % (w/v), 0.2 %(w/v) 내지 5 % (w/v), 0.2 %(w/v) 내지 3 % (w/v), 0.2 %(w/v) 내지 1 % (w/v), 0.2 %(w/v) 내지 0.5 % (w/v),또는 0.2 %(w/v) 내지 0.4 % (w/v)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 버퍼에서 상기 덱스트란의 농도는 0.01 %(w/v) 내지 10 % (w/v), 예를 들어, 0.01 %(w/v) 내지 5 % (w/v), 0.01 %(w/v) 내지 3 % (w/v), 0.01 %(w/v) 내지 1 % (w/v), 0.01 %(w/v) 내지 0.5 % (w/v), 0.01 %(w/v) 내지 0.4 % (w/v), 0.05 %(w/v) 내지 10 % (w/v), 0.05 %(w/v) 내지 5 % (w/v), 0.05 %(w/v) 내지 3 % (w/v), 0.05 %(w/v) 내지 1 % (w/v), 0.05 %(w/v) 내지 0.5 % (w/v), 0.05 %(w/v) 내지 0.4 % (w/v), 0.1 %(w/v) 내지 10 % (w/v), 0.1 %(w/v) 내지 5 % (w/v), 0.1 %(w/v) 내지 3 % (w/v), 0.1 %(w/v) 내지 1 % (w/v), 0.1 %(w/v) 내지 0.5 % (w/v), 0.1 %(w/v) 내지 0.4 % (w/v), 0.2 %(w/v) 내지 10 % (w/v), 0.2 %(w/v) 내지 5 % (w/v), 0.2 %(w/v) 내지 3 % (w/v), 0.2 %(w/v) 내지 1 % (w/v), 0.2 %(w/v) 내지 0.5 % (w/v),또는 0.2 %(w/v) 내지 0.4 % (w/v)일 수 있다.
상기 (b)단계의 버퍼 농도가 상기 범위를 벗어나 너무 높거나 너무 낮을 경우, 엑소좀 분리 수율 또는 순도가 저하될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (b) 단계의 버퍼는 pH가 3.5 내지 6.5일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, pH 3.5 내지 6.0, pH 3.5 내지 5.6, pH 4.5 내지 6.5, pH 4.5 내지 6.0, pH 4.5 내지 5.6, pH 5.0 내지 6.5, 또는 pH 5.0 내지 6.0일 수 있다.
[(c)단계 : 엑소좀 결합 단계(Affinity membrane column)]
엑소좀 결합 단계는 엑소좀에 특이적으로 결합할 수 있는 막을 형성하는 단계로서, 단백질 친화적 재질 또는 양전하 친화적 재질을 사용하여 실온에서 1 내지 5분간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 단백질 친화적 재질 또는 양전하 친화적 재질은 Polycarbonate, anodic aluminum oxide (AAO), Cellulose membrane, 및 Regenerative cellulose로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 Polycarbonate 또는 Regenerative cellulose일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 엑소좀에 특이적으로 결합할 수 있는 재질로서 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것을 모두 포함할 수 있다.
[(d)단계 : 원심분리 및 세척 단계]
상기 막에 결합된 엑소좀을 1차 원심분리후 2X 내지 5X 농도의 식염수 또는 PBS로 세척하고, 세척된 엑소좀을 2차 원심분리하여 농축시키는 단계로서, 상기 1차 원심분리는 300 내지 800 xg, 예를 들어, 300 내지 700 xg, 300 내지 600 xg, 300 내지 500 xg, 400 내지 800 xg, 400 내지 700 xg, 400 내지 600 xg, 400 내지 500 xg, 500 내지 800 xg, 500 내지 700 xg, 또는 500 내지 600 xg로 실온 또는 4℃에서 1 내지 5분간 수행되는 것일 수 있으며, 상기 2차 원심 분리는 2,000 내지 5,000 xg, 예를 들어, 2,000 내지 4,000 xg, 2,000 내지 3,000 xg, 2,000 내지 2,500 xg, 2,200 내지 5,000 xg, 2,200 내지 4,000 xg, 2,200 내지 3,000 xg, 또는 2,200 내지 2,500 xg으로 실온 또는 4℃에서 5 내지 20분간 수행되는 것일 수 있다.
[(e)단계 : 엑소좀 분리 단계(exosome elusion)]
엑소좀 분리단계는 상기 (b) 엑소좀 응집 단계에서 사용한 버퍼를 중화시켜 엑소좀을 분리하기 위한 단계로서, 상기 중화는 요소(Urea), 모노나트륨 인산염(NaH2PO4), 및 Tris-HCl(Tris hydrochloride)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 버퍼를 처리하여 수행될 수 있으며, 구체적으로, PBS (Phosphate-buffered saline) 또는 식염수 (saline) 용액에 요소(Urea), 모노나트륨 인산염 (NaH2PO4), 및 Tris-HCl으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 혼합하여 제조되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (e) 단계의 버퍼에서 상기 요소(Urea)의 농도는 0.01 내지 10 M, 예를 들어, 0.01 내지 5 M, 0.01 내지 3 M, 0.01 내지 1 M, 0.01 내지 0.7 M, 0.01 내지 0.5 M, 0.1 내지 10 M, 0.1 내지 5 M, 0.1 내지 3 M, 0.1 내지 1 M, 0.1 내지 0.7 M, 0.1 내지 0.5 M, 0.2 내지 10 M, 0.2 내지 5 M, 0.2 내지 3 M, 0.2 내지 1 M, 0.2 내지 0.7 M, 또는 0.2 내지 0.5 M일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (e) 단계의 버퍼에서 상기 모노나트륨 인산염(NaH2PO4)의 농도는 0.01 내지 10 M, 예를 들어, 0.01 내지 5 M, 0.01 내지 3 M, 0.01 내지 1 M, 0.01 내지 0.7 M, 0.01 내지 0.5 M, 0.05 내지 10 M, 0.05 내지 5 M, 0.05 내지 3 M, 0.05 내지 1 M, 0.05 내지 0.7 M, 0.05 내지 0.5 M, 0.1 내지 10 M, 0.1 내지 5 M, 0.1 내지 3 M, 0.1 내지 1 M, 0.1 내지 0.7 M, 0.1 내지 0.5 M, 0.2 내지 10 M, 0.2 내지 5 M, 0.2 내지 3 M, 0.2 내지 1 M, 0.2 내지 0.7 M, 또는 0.2 내지 0.5 M일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (e) 단계의 버퍼에서 상기 Tris-HCl의 농도는 0.001 내지 10 M, 예를 들어, 0.001 내지 5 M, 0.001 내지 1 M, 0.001 내지 0.5 M, 0.001 내지 0.1 M, 0.001 내지 0.07 M, 0.005 내지 10 M, 0.005 내지 5 M, 0.005 내지 1 M, 0.005 내지 0.5 M, 0.005 내지 0.1 M, 0.005 내지 0.07 M, 0.01 내지 10 M, 0.01 내지 5 M, 0.01 내지 1 M, 0.01 내지 0.7 M, 0.01 내지 0.5 M, 0.01 내지 0.1 M, 0.01 내지 0.07 M, 0.03 내지 10 M, 0.03 내지 5 M, 0.03 내지 1 M, 0.03 내지 0.7 M, 0.03 내지 0.5 M, 0.03 내지 0.1 M, 또는 0.03 내지 0.07 M 일 수 있다.
상기 (e)단계의 버퍼 농도가 상기 범위를 벗어나 너무 높거나 너무 낮을 경우, 엑소좀 분리 수율 또는 순도가 저하될 수 있다.
상기 (e) 단계의 버퍼는 pH 7.0 내지 9.0일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, pH 7.5 내지 9.0, pH 7.5 내지 8.0, 또는 pH 8.0 내지 9.0일 수 있다.
본 발명자들은 실시예를 통해 본 발명의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀이 높은 효율 및 우수한 순도를 나타내는 것을 확인하였다.
구체적으로 본 발명의 일실시예에서는 엑소좀의 효율을 확인하기 위해 상이한 방법 및 조건으로 분리된 엑소좀의 크기, 입자수, 표면 전하 및 전자현미경 이미지를 분석한 결과, 크기에서는 본 발명의 분리방법에 의해 분리된 엑소좀이 가장 작은 사이즈를 나타내는 것을 확인하였으며, 입자수에서는 가장 농도가 높게 나타나 대조군 (ultracentrifugation)에 비해 약 25배, 비교군 (비교예 1: PEI 기반 기존 시판품 엑소좀 분리 키트(System Biosciences)의 버퍼 조성 사용, 비교예 2: PEG + PEI 기반 기존 시판품 엑소좀 분리 키트 (Invitrogen)의 버퍼 조성 사용)에 비해서는 약 2.5~7.5 배 이상의 수율을 나타내는 것을 확인하였다(실험예 1 참조).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 엑소좀 분리방법이 시료 범용성으로 사용이 가능한지 확인하기 위해, 정상인의 혈청(Serum), 소변(Urine), 세포 배양액에서 각각 엑소좀을 분리한 후, 각 시료에서 분리된 엑소좀의 크기, 입자수, 표면 전하를 분석한 결과, 모든 시료에서 효과적으로 엑소좀이 분리된 것을 확인하였다(실험예 2 참조).
상기 실시예의 결과로부터 본 발명의 분리방법에 의해 분리된 엑소좀은 고효율 및 고순도로 분리가 가능하며, 다양한 시료에서 범용적으로 사용할 수 있음을 확인하였는바, 본 발명의 분리방법 및 상기 방법에 의해 분리된 엑소좀은 고순도 엑소좀을 필요로 하는 진단이나 치료방법 연구에 널리 활용할 수 있다.
다른 양상은 PEG(Polyethylene glycol), PEI(Polyetherimide) 및 덱스트란(dextran)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하기 위한 버퍼 조성물을 제공한다. 상기 조성물에 있어서, 생물학적 시료, 엑소좀, 버퍼에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 버퍼는 생리식염수 (NaCl, Sodium chloride) 또는 PBS (Phosphate-buffered saline) 용액에 PEG(Polyethylene glycol) 용액, PEI 용액 (Polyetherimide), 및 dextran 용액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 첨가하여 제조되는 것일 수 있으며, 상기 버퍼는 생물학적 시료로부터 엑소좀을 응집시키기에 효과적인 농도 및 pH를 갖는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 버퍼는 전술한 바와 같은 PEG, PEI, 또는 덱스트란의 농도 및 pH를 갖는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 PEG(Polyethylene glycol), PEI(Polyetherimide) 및 덱스트란(dextran)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 버퍼를 포함하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트에 있어서, 생물학적 시료, 엑소좀, 버퍼에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 키트는 상기 엑소좀 분리 방법에 사용되는 하나 이상의 시약을 더 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 중화반응을 위한 용출 버퍼 등을 더 포함하는 것일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 엑소좀 분리 방법
도 1에 나타낸 바와 같은 공정으로 엑소좀을 분리하였다. 하기에 각 단계별 분리 방법을 나타내었다.
1-1. (a)단계 : 제단백(Deproteinization) 단계
샘플에 포함되어 있는 높은 분자량의 단백질 또는 응집 단백질을 제거하기 위해, 제단백을 수행하였다. 샘플로는 인간의 소변(Urine) 또는 세포 배양액(MSC culture media)을 이용하였다. 제단백에 사용되는 실린지 필터(syringe filter)로 셀룰로오즈 (cellulose), PVDF(Polyvinylidene Fluoride), MCE(Mixed cellulose esters)기반 membrane을 사용하였으며, 실린지 필터의 포어 사이즈(Pore size)는 0.8 ㎛로 설정하고 제단백을 수행하였다.
1-2. (b)단계 : 엑소좀 응집 단계(Exosome precipitation)
상기 (a)단계에서 제단백이 된 샘플을 대상으로 엑소좀을 응집시키고 표면에 전하를 부여하기 위해 다양한 용액을 혼합한 Buffer 1을 제조하여 처리하였다. 구체적으로, Buffer 1은 생리식염수 (NaCl, Sodium chloride) 또는 PBS (Phosphate-buffered saline)의 기본 용액에 PEG 용액 (PEG 6000 (Polyethylene glycol MW 6,000)), PEI 용액 (Polyetherimide), 및 dextran 용액 (dextran sulfate)을 각각 최종 농도가 10 % (w/v), 0.25 % (w/v), 0.15 % (w/v), 0.5 % (w/v)가 되도록 첨가하여 혼합한 후, 최종 pH가 pH 5.5 ± 0.1가 되도록 조절하여 제조하였다. 이를 상기 (a) 단계에서 제단백된 샘플에 처리하여 엑소좀 응집물을 수득하였다.
1-3. (c)단계 : 엑소좀 결합 단계(Affinity membrane column)
상기 (b) 단계에서 수득된 응집물을 엑소좀에 특이적으로 결합하는 막이 장착된 컬럼에 추가하고 실온에서 1 내지 5분 간 반응시켰다. 상기 막의 재질로는 단백질에 친화적이면서 양전하 친화적 재질인 Polycarbonate 또는 Regenerative cellulose을 사용하였다.
1-4. (d)단계 : 원심분리 및 세척 단계
상기 (c)단계를 통해 막에 결합시킨 엑소좀을 실온 또는 4℃에서 500 xg으로 1분 동안 원심분리를 하고 PBS 또는 Saline 세척 용액(washing buffer)을 이용하여 세척하였다. 세척 후 실온 또는 4 ℃에서 2,500 xg으로 10분 동안 원심분리하였다.
1-5. (e)단계 : 엑소좀 분리 단계(exosome elusion)
상기 (b)단계에서 처리된 Buffer 1의 중화반응을 이용한 엑소좀의 분리를 위해, 용출 버퍼를 처리하였다. 구체적으로, 용출 버퍼는 PBS 또는 Saline의 기본 용액에 요소 (urea) 용액, NaH2PO4 용액, 및 Tris-HCl pH 5.9 용액을 각각 최종 농도가 0.4 M, 0.1M, 0.05 M가 되도록 첨가하여 혼합한 후, 최종 pH가 pH 8.0이 되도록 조절하여 제조하였다. 이를 상기 (d) 단계에서 수득된 상등액에 처리하여 중화를 통해 엑소좀을 분리하였다. 엑소좀 분리 후 실온 또는 4 ℃에서 2,500 xg으로 5분 동안 원심분리하여 최종산물을 수득하였다.
실험예 1. 분리된 엑소좀의 효율 비교
본 발명의 분리방법에 의해 분리된 엑소좀의 효율을 확인하기 위해, Ultracentrifugation(U/C)으로 분리한 엑소좀(대조군), 본 발명의 분리방법으로 분리한 엑소좀(실시예 1), 엑소좀 응집 단계에서 Buffer 1 대신 상이한 조성의 버퍼를 사용한 점을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 분리한 엑소좀 (비교예 1: PEI 기반 기존 시판 엑소좀 분리 키트(System Biosciences)의 버퍼 조성 사용, 비교예 2: PEG + PEI 기반 기존 시판 엑소좀 분리 키트 (Invitrogen)의 버퍼 조성 사용, 비교예 3: 생리식염수 또는 PBS의 기본 용액에 PEG 용액 (PEG 6000)을 최종 농도가 10 % (w/v)가 되도록 첨가한 후 최종 pH가 5.5 ± 0.1가 되도록 조절하여 제조한 PEG 기반 버퍼 사용, 비교예 4: 생리식염수 또는 PBS의 기본 용액에 PEG 용액 (PEG 6000) 및 PEI 용액 을 각각 최종 농도가 5 % (w/v), 0.5 % (w/v)가 되도록 첨가한 후 최종 pH가 5.5 ± 0.1가 되도록 조절하여 제조한 PEG + PEI 기반 버퍼 사용)의 크기, 입자수, 표면 전하를 입도분석기 (particle analyzer, ParticleMatrix, Zetaview)를 통해 분석하였고, 전자현미경 (JEM-2010, JEOL, Japan) 이미지를 촬영하였다.
그 결과, 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이 크기에서는 본 발명의 분리방법에 의해 분리된 엑소좀이 가장 작은 사이즈를 나타내는 것을 확인하였으며, 입자수에서는 가장 농도가 높게 나타나 대조군 (U/C, ultracentrifugation)에 비해 약 25배, 기존 PEI 기반 시판 엑소좀 분리 키트(System Biosciences)와 동일한 조성의 버퍼를 사용한 비교예 1에 비해 약 2.5 배, 기존 PEG + PEI 기반 시판 엑소좀 분리 키트(Invitrogen)와 동일한 조성의 버퍼를 사용한 비교예 2에 비해서는 약 7.5 배 이상의 수율을 나타내었고, PEG 기반의 버퍼를 사용한 비교예 3, PEG + PEI 기반의 다른 버퍼를 사용한 비교예 4에 비해서도 현저히 향상된 수율을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 도 2c에 나타낸 바와 같이 표면 전하에 있어서도 가장 낮은 전하값을 나타내는 것을 확인하였으며, 전자현미경 이미지 분석결과 도 2d에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 분리방법으로 분리된 엑소좀이 가장 순도가 높게 나타나는 것을 확인하였다.
실험예 2. 시료에 따른 엑소좀 분리 확인
본 발명에 따른 엑소좀 분리방법이 시료 범용성으로 사용이 가능한지 확인하기 위해, 임상시료로서 정상인의 혈청(Serum), 소변(Urine)을 각 10ml씩 사용하고, 세포 배양액으로서 MSC culture media를 10ml 사용하여 실시예 1의 방법에 따라 엑소좀을 분리한 후, 각 시료에서 분리된 엑소좀의 크기, 입자수, 표면 전하를 입도분석기(ParticleMatrix, Zetaview)로 분석하였다.
시료 Size(nm) Zeta-potential(mV) Particles/ml
혈청(Serum) 103.3 -34.1 9.0 x 1010
소변(Urine) 111.0 -27.7 5.7 x 1010
세포 배양액
(Cell culture media)		 120.8 -24.3 1.7 x1011
그 결과, 도 3 및 상기 [표 1]에 나타낸 바와 같이 모든 시료에서 효과적으로 엑소좀이 분리된 것을 확인하였다.
상기 결과는 본 발명에 따른 분리방법이 다양한 시료에서 엑소좀을 분리하는데 사용할 수 있음을 시사한다.
실험예 3. 분리된 엑소좀의 표현형 확인
유세포분석을 통해 Ultracentrifugation(U/C)로 분리한 엑소좀(대조군)과 본 발명의 분리방법에 의해 분리된 엑소좀(실시예 1)의 표현형을 유세포분석(Flow cytometry, BD, FACSCantoII)으로 분석하였다. 그 결과, Ultracentrifugation으로 분리한 엑소좀의 표현형은 도 4a에 나타낸 바와 같이 염색하지 않은 상태(Non-staining)에서는 표현형의 특이점이 나타나지 않았으나, 엑소좀 마커를 염색한 결과에서는 CD63을 발현하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 분리방법에 의해 분리된 엑소좀의 표현형은 도 4b에 나타낸 바와 같이 염색하지 않은 상태(Non-staining)에서는 표현형의 특이점이 나타나지 않았으나, 엑소좀 마커를 염색한 결과에서는 CD63 및 CD81을 발현하는 것을 확인하였다.
실험예 4. 엑소좀 분리 버퍼의 농도별 분리 효율 확인
상기 실험예 1에서 PEG + PEI + dextran 기반의 buffer 1을 사용한 본 발명의 엑소좀 분리 방법이 우수한 엑소좀 분리 효율을 나타냄을 확인한 것을 바탕으로, buffer 1의 농도 변화에 따른 크기, 입자수, 표면 전하를 입도분석기 (particle analyzer, ParticleMatrix, Zetaview)를 통해 분석하였다.
그 결과, 도 5a 내지 5c에 나타난 바와 같이, dextran의 농도가 0.01%(w/v) 내지 0.4 %(w/v)인 범위에서 특히 엑소좀 크기가 가장 작고, 입자수에서는 가장 농도가 높게 나타나 현저한 수율을 나타내었으며, 표면 전하에 있어서도 가장 낮은 전하값을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, PEG + PEI 기반의 버퍼를 사용한 비교예 4와 비교시, 실시예 2 및 3은 비교예 4에 비해 PEI의 함량이 현저하게 감소되었음에도 불구하고 dextran을 특정 함량으로 포함함에 따라 분리 효율이 현저하게 향상되는 것을 확인하였다.
실험예 5. 분리된 엑소좀의 마커 확인
Ultracentrifugation(U/C)로 분리한 엑소좀(대조군), 본 발명의 분리방법에 의해 분리된 엑소좀(실시예 1), 및 엑소좀 응집 단계에서 Buffer 1 대신 기존 시판품 엑소좀 분리 키트의 버퍼를 사용한 점을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 분리된 엑소좀 (비교예 1: PEI 기반 기존 시판품 엑소좀 분리 키트(System Biosciences)의 버퍼 조성 사용, 비교예 2: PEG + PEI 기반 기존 시판품 엑소좀 분리 키트 (Invitrogen)의 버퍼 조성 사용)의 단백질 마커를 확인하기 위하여 단백질 분석실험인 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로, 분리된 엑소좀들을 방사면역침전 분석 완충액(radioimmunoprecipitation assay buffer; RIPA)으로 용해시켰다. 용해시킨 단백질은 BCA assay를 통하여 정량을 하고, 단백질 5 ug을 10 % SDS-PAGE 겔을 사용하여 분리하고 0.22-μm 나이트로셀룰로오스(nitrocellulose; NC) 막으로 옮겼다. 막은 5 % 탈지 우유 블로킹 완충액에서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음 4℃에서 1차 항체 (1:1000 dilution, 3% bovine serum albumin 용액)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 이 때 사용된 항체는 다음과 같다: Anti-CD63 (ab231975, Abcam), Anti-CD81 (ab79559, Abcam), Anti-CD9 (ab223052, Abcam), Anti-β-actin (A5441, Sigma). Tris-완충 식염수 및 Tween 20(Tris-buffered saline and Tween 20; TBST)으로 세척한 후, 2차 항체를 실온에서 1 시간 동안 막에 첨가하였다. 막은 웨스턴 블랏 ECL 용액(Supex)으로 전개하여 화학발광이미지를 획득하였고, β-actin은 면역블로팅 대조군으로 사용되었다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 분리 방법에 의해 분리된 엑소좀의 경우, 대조군이나 비교예 1, 2에 비해 엑소좀의 단백질 마커가 선명하게 나타나는 것을 확인하였으며, 이는 본 발명의 분리 방법을 통하여 고효율 및 고순도로 엑소좀이 분리될 수 있음을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (10)

  1. (a) 생물학적 시료에 제단백(Deproteinization)을 수행하는 단계;
    (b) 상기 제단백된 시료에 버퍼를 처리하여 엑소좀을 응집시키는 단계;
    (c) 상기 응집된 엑소좀을 단백질 친화적 재질 또는 양전하 친화적 재질의 막에 결합시키는 단계;
    (d) 상기 막에 결합된 엑소좀을 원심분리 및 세척하는 단계; 및
    (e) 상기 세척된 엑소좀을 중화반응을 통해 분리하는 단계;를 포함하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계의 제단백은 포어 사이즈(pore size) 0.2 내지 1.0 ㎛의 실린지 필터(Syringe filter)에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계의 버퍼는 PEG(Polyethylene glycol), PEI(Polyetherimide) 및 덱스트란(dextran)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 PEG(Polyethylene glycol)의 농도는 0.5 %(w/v) 내지 30 % (w/v)인 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 PEI(Polyetherimide)의 농도는 0.01 %(w/v) 내지 10 % (w/v)인 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 덱스트란의 농도는 0.01 %(w/v) 내지 10 % (w/v)인 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계 의 버퍼는 pH가 3.5 내지 6.5인 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c)단계의 단백질 친화적 재질 또는 양전하 친화적 재질은 Polycarbonate, anodic aluminum oxide (AAO), Cellulose membrane, 및 Regenerative cellulose로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (e)단계의 중화반응은 요소(Urea), 모노나트륨 인산염(NaH2PO4), 및 Tris-HCl(Tris hydrochloride)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 버퍼를 처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (e)단계의 버퍼는 pH 7.0 내지 9.0인 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
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