CN112813027A - 一种分离尿液中外泌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分离尿液中外泌体的方法。所述方法包括以下步骤：(1)将与磷酸基团有特异性相互作用的亲和色谱微球加入到尿液中混合孵育，离心收集沉淀；(2)向步骤(1)得到的沉淀中加入磷酸盐缓冲液进行竞争洗脱，离心取上清液，得到所述外泌体。本发明采用较高浓度的磷酸盐缓冲液洗脱与磷酸基团有特异性相互作用的亲和色谱微球上的外泌体，条件温和，有利于保持外泌体生物膜结构的完整性，提高了洗脱效率，实现了高效无损分离尿液中外泌体。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种分离尿液中外泌体的方法，尤其涉及一种高效无损分离尿液中外泌体的方法。
背景技术
外泌体是一种由细胞分泌的直径约为40～200nm的囊泡，其富含蛋白质、脂质、DNA及RNA等生物分子，是细胞间分子交换和信息传递的重要载体，且已被证实在肿瘤发生、发展、转移、血管新生和免疫逃逸等过程中发挥着重要作用。近年来，外泌体成为肿瘤领域的研究热点之一，从体液(如血液、尿液、脑脊液或唾液等)中分离出外泌体进行检测，为发展无创的肿瘤诊断方法及研究肿瘤的发生发展机制提供了崭新的研究思路。外泌体的体积小、密度低，对其进行分析和功能研究前，需从体液中对其进行富集分离。
如今已发展了多种基于外泌体尺寸、密度及免疫表型的提取方法，包括超速离心法、密度梯度离心法、体积排阻色谱、聚合物沉淀法和免疫亲和法等。超速离心法是提取外泌体的经典方法，通过超速离心对外泌体进行富集，但是需要依赖昂贵的设备投入，且过程费时，得到的外泌体易受杂蛋白的干扰，且反复的高速离心会导致外泌体破裂，引起成分丢失；密度梯度离心法是在超速离心法的基础上根据密度进一步纯化，虽然其提取的外泌体纯度较高，但是操作更为繁琐，离心耗时也更长；体积排阻色谱法基于尺寸特征实现外泌体的分离，但是其对样品体积有严格的限制且产量低，不适合处理大量样本；聚合物沉淀法是目前商品化提取试剂盒通常采用的策略，该方法操作简单，但提取的产物包含其它囊泡及大量的杂蛋白，纯度有限，且其中的聚合物难以去除，不利于下游分析；免疫亲和法特异性好，提取的外泌体纯度高，但是由于抗原抗体结合需要足够的作用时间，普遍存在操作耗时长、提取效率低的缺点，不利于普及使用。
Gao等(Fangyuan,Gao,Fenglong,Jiao et al.A novel strategy for facileserum exosome isolation based on specific interactions between phospholipidbilayers and TiO2.[J].Chemical Science,2019,10(6):1579-1588.)以及CN110551687A公开了利用与磷脂双分子层中的磷酸基团有特异性相互作用的金属亲和富集材料(TiO2及Ti-IMAC微球)来提取血清或血浆中外泌体的方法，所述方法在利用固定化金属亲和色谱微球富集外泌体后，采用高pH的碱性洗脱液(10％氨水溶液)洗脱外泌体，强碱性的洗脱条件适用于磷酸化肽段的洗脱，但是却不利于外泌体保持完整的生物膜结构，易造成外泌体的破裂，不利于后续的功能分析。
尿液作为重要的临床样本，被认为是研究多种疾病特别是泌尿系统疾病的理想来源。受现有外泌体提取方法的限制，现有的尿液外泌体研究往往需要大量的样本起始量(50～150mL)来满足相关的研究需求，这限制了尿液外泌体研究的快速发展和大规模的临床应用。目前仍然缺乏一种有效的方法能够同时实现尿液外泌体快速、高效且无损伤的提取。
CN105388055A公开了一种从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，所述方法依次包括：先对尿液样本进行冻干处理，再使用抽提试剂提取总外泌体，然后使用EpCAM抗体标记磁珠吸附，分离纯化出肿瘤细胞来源的外泌体，可对大量样品进行处理，但操作耗时长、提取效率低且成本高。
综上所述，提供一种有效的方法能够同时实现尿液中外泌体快速、高效且无损伤的提取，对于尿液中外泌体研究领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种分离尿液中外泌体的方法，所述方法不仅缩短了提取时间，而且提高了外泌体的提取效率和提取纯度，在尿液外泌体研究领域具有广阔的发展前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种分离尿液中外泌体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将与磷酸基团有特异性相互作用的亲和色谱微球加入到尿液中混合孵育，离心收集沉淀；
(2)向步骤(1)得到的沉淀中加入磷酸盐缓冲液进行竞争洗脱，离心取上清液，得到所述外泌体。
本发明中，采用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Solution，PBS)作为洗脱液洗脱与磷酸基团有特异性相互作用的亲和色谱微球上的外泌体，条件温和，有利于保持外泌体生物膜结构的完整性，提高了外泌体洗脱效率。
优选地，步骤(2)所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1～0.3M，包括但不限于0.15M、0.2M或0.25M。
优选地，步骤(2)所述磷酸盐缓冲液的pH为6.8～7.8，包括但不限于6.9、7.0、7.2、7.3、7.4或7.5。
本发明中，基于高浓度磷酸根对与磷酸基团有特异性相互作用的亲和色谱微球具有竞争吸附作用的原理，采用浓度为0.1～0.3M的磷酸盐缓冲液在中性条件下对吸附于亲和色谱微球的外泌体进行完整洗脱，条件温和，有效避免了极端的pH条件对外泌体的形态和生物活性的影响，且提取后的外泌体无需使用超滤管进行多次溶液替换，减小了产率损失，提高了提取效率，尤其适用于尿液样本中低浓度外泌体的提取。
优选地，在步骤(1)之前还包括对亲和色谱微球进行洗涤的步骤，优选为使用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)洗涤亲和色谱微球，离心收集所述亲和色谱微球。
本发明中，采用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液洗涤微球，能够避免磷酸基团对亲和色谱微球富集效能的影响，从而提高了外泌体的提取效率。
优选地，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的浓度为20～55mM，包括但不限于22mM、25mM、28mM、35mM、40mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、52mM或54mM。
优选地，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的pH为6.8～7.8，包括但不限于6.9、7.0、7.2、7.3、7.4或7.5。
优选地，所述离心的离心力为1500～2500×g，包括但不限于1600×g、1700×g、1800×g、2000×g、2200×g或2400×g。
优选地，所述离心的时间为1～3min。
优选地，所述洗涤的次数为2～4次。
优选地，在步骤(1)之前还包括对尿液进行预处理的步骤。
优选地，所述预处理包括对尿液进行离心、浓缩并过滤的步骤。
优选地，所述离心的离心力为1500～3000×g，包括但不限于1600×g、1700×g、1800×g、2000×g、2200×g、2400×g、2600×g或2800×g。
优选地，所述离心的时间为8～15min，包括但不限于9min、10min、11min、12min或14min。
优选地，所述浓缩为采用超滤离心管进行超滤浓缩。
优选地，所述超滤离心管的截留分子量为30KD～50KD。
优选地，所述过滤的滤器为0.20～0.25μm针式过滤器。
优选地，在步骤(2)之前还包括对步骤(1)得到的沉淀进行洗涤的步骤，优选为向步骤(1)得到的沉淀中加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液并混合，离心收集沉淀。
本发明中，采用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液对步骤(1)得到的沉淀(吸附有外泌体的亲和色谱微球)进行洗涤，能够去除非特异性结合在微球表面的蛋白质，且不会促进亲和色谱微球和外泌体的分离，提高了外泌体的纯度，降低了外泌体损失。
优选地，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的浓度为20～55mM，包括但不限于22mM、24mM、26mM、28mM、35mM、38mM、40mM、44mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、52mM或54mM。
优选地，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的pH为6.8～7.8，包括但不限于6.9、7.0、7.2、7.4、7.5或7.6。
优选地，所述混合后还包括振荡的步骤。
优选地，所述振荡的温度为8～15℃，包括但不限于9℃、10℃、11℃、12℃、或14℃。
优选地，所述振荡的时间为3～7min，包括但不限于4min、5min或6min。
优选地，所述离心的离心力为4500～5500×g，包括但不限于4600×g、4800×g、4900×g、5000×g、5200×g或5400×g。
优选地，所述离心的时间为1～5min，包括但不限于2min、3min或4min。
优选地，所述洗涤重复1～2次。
优选地，所述与磷酸基团有特异性相互作用的亲和色谱微球包括Ti-IMAC固定化亲和色谱微球，优选为CEA-Ti-IMAC微球。
本发明中，尿液样本中的外泌体浓度相较于其他体液中的外泌体浓度更低，个体差异性大，尿液中丰富的粘蛋白Tamm-Horsfall容易形成蛋白聚合物(polymerization)从而干扰外泌体的提取，本发明的外泌体提取方法实现了高效无损的分离尿液中外泌体的效果。
优选地，步骤(1)所述孵育在振荡条件下进行。
优选地，步骤(1)所述孵育的温度为8～15℃，包括但不限于9℃、10℃、11℃、12℃、13℃或14℃。
优选地，步骤(1)所述孵育的时间为15～60min，包括但不限于16min、17min、18min、19min、20min、25min、30min、35min、45min、48min、50min、54min或56min。
优选地，步骤(1)所述离心的离心力为4500～5500×g，包括但不限于4600×g、4700×g、4800×g、4900×g、5000×g、5200×g或5400×g。
优选地，步骤(1)所述离心的时间为1～5min，包括但不限于2min、3min或4min。
优选地，步骤(2)所述混合后还包括振荡的步骤。
优选地，所述振荡的温度为8～15℃，包括但不限于9℃、10℃或11℃。
优选地，所述振荡的时间为10～20min，包括但不限于11min、12min、14min、15min、17min或18min。
优选地，步骤(2)所述离心的离心力为12000～17000×g，包括但不限于13000×g、14000×g、15000×g或16000×g。
优选地，步骤(2)所述离心的时间为3～7min，包括但不限于4min、5min或6min。
优选地，步骤(2)所述离心的温度为4～10℃，包括但不限于5℃、6℃、7℃或9℃。
优选地，步骤(2)重复1～2次。
作为优选的技术方案，所述尿液中外泌体的分离方法包括以下步骤：
(1)于1500～3000×g的离心力下对尿液进行离心8～15min去除细胞碎片，采用截留分子量为30KD～50KD的超滤离心管对离心上清液进行超滤浓缩，并使用0.20～0.25μm的针式过滤器过滤浓缩液，得到预处理的尿液；
采用浓度为20～55mM、pH为6.8～7.8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液洗涤Ti-IMAC固定化亲和色谱微球2～4次，并于1500～2500×g离心1～3min，收集所述Ti-IMAC固定化亲和色谱微球；
(2)将步骤(1)得到的预处理的尿液和Ti-IMAC固定化亲和色谱微球混合，8～12℃振荡孵育处理15～60min，于4500～5500×g离心1～5min并弃掉上清液，收集沉淀；
(3)向步骤(2)得到的沉淀中加入浓度为20～55mM、pH为6.8～7.8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液并混合，于8～15℃振荡3～7min，于4500～5500×g离心1～5min并弃掉上清液，收集沉淀，重复1～2次，去除微球表面的非特异性吸附蛋白；
(4)向步骤(3)得到的沉淀中加入浓度为0.1～0.3M、pH为6.8～7.8的磷酸盐缓冲液进行竞争洗脱，8～15℃振荡10～20min，于4～10℃、12000～17000×g离心3～7min，取上清液，重复1～2次，得到所述外泌体。
本发明中，首先采用经HEPES缓冲液洗涤的与磷酸基团有特异性相互作用的亲和色谱微球吸附尿液中的外泌体，随后进一步采用HEPES缓冲液洗涤微球-外泌体复合物，去除非特异性吸附蛋白，再以0.1～0.3M中性磷酸盐缓冲液作为洗脱液从微球上洗脱外泌体，各步骤协同配合，实现了温和富集尿液中外泌体的效果，有效避免了极端pH条件对外泌体的形态和生物活性的影响，提高了外泌体的提取效率和提取纯度，尤其适用于尿液中低浓度外泌体的富集。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用浓度为0.1～0.3M的磷酸盐缓冲液在中性条件下洗脱吸附于与磷酸基团有特异性相互作用的亲和色谱微球上的外泌体，条件温和，有效避免了极端的pH条件对外泌体的形态和生物活性的影响，有利于保持外泌体生物膜结构的完整性，减小了产率损失，提高了提取效率；
(2)本发明采用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液对吸附有外泌体的与磷酸基团有特异性相互作用的亲和色谱微球进行洗涤，能够去除非特异性结合在微球表面的蛋白质，且不会促进与磷酸基团有特异性相互作用的亲和色谱微球和外泌体分离，提高了外泌体的纯度，降低了外泌体的损失；
(3)本发明的分离尿液中外泌体的方法各步骤相互配合，条件温和，实现了高效无损分离尿液中外泌体，得到的外泌体中粒径为40～200nm的颗粒占总提取颗粒的百分比为99.92％，提取的外泌体平均浓度为5.5×108个/mL尿液，外泌体的核酸阳性率均值为88.0％，在外泌体应用领域具有广阔的发展前景。
附图说明
图1为外泌体粒径分布情况，其中，(a)为对比例1-①结果，(b)为对比例1-②结果，(c)为对比例2-①结果；(d)为对比例2-②结果，(e)为实施例1-①结果，(f)为实施例1-②结果，粒径分布以“中位数±标准偏差”的方式表示，“％of all”表示粒径落在40～200nm区间的颗粒占总提取颗粒的百分比；
图2为外泌体的核酸阳性率，其中，(a)为对比例1-①结果，(b)为对比例1-②结果，(c)为对比例2-①结果；(d)为对比例2-②结果；(e)为实施例1-①结果，(f)为实施例1-②结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明实施例中，CAE-Ti-IMAC微球购自百灵威科技有限公司(产品编号：2749380)；配制HEPES缓冲液所需的HEPES(化学名：4-羟乙基哌嗪乙磺酸)购自Sigma；配制磷酸盐缓冲液(PBS)所需的氯化钠和氯化钾购自Sigma，十二水合磷酸氢二钠和无水磷酸二氢钾购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1
本实施例对尿液中外泌体进行提取，包括如下步骤：
(1)将15mL尿液样本于2000×g离心10min去除细胞碎片，取上清液，采用截留分子量为30KD的超滤离心管(
Ultra-15 30K，Millipore)进行超滤浓缩，采用0.2μm针筒过滤器(
Membrance，Pall)过滤浓缩后的尿液，得到预处理尿液；
取5mg CAE-Ti-IMAC微球，使用500μL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES，50mM，pH＝7.5)洗涤3次，2000×g离心1min，收集CAE-Ti-IMAC微球；
(2)将步骤(1)得到的CAE-Ti-IMAC微球和预处理尿液混合均匀，于10℃振荡孵育20min，5000×g离心3min，弃掉上清液，收集沉淀；
(3)向步骤(2)得到的沉淀中加入500μL HEPES缓冲液(50mM，pH＝7.5)重悬沉淀，于10℃充分振荡5min，5000×g离心3min，弃掉上清液，收集沉淀，重复1次，去除微球表面的非特异性吸附蛋白；
(4)向步骤(3)得到的沉淀中加入100μL PBS缓冲液(0.3M，pH＝7.5)，重悬沉淀，于10℃充分振荡15min，于4℃、15000×g离心5min，收集含外泌体的上清液，此步骤重复2次，合并两次上清液，得到外泌体。
对比例1
本对比例采用超速离心法提取尿液中外泌体，包括如下步骤：
(1)将15mL尿液样本于300×g离心10min；
(2)取步骤(1)上清液，于2000×g离心10min；
(3)取步骤(2)上清液，于10000×g离心60min；
(4)取步骤(3)上清液，于100000×g超速离心70min，弃掉上清液，收集沉淀；
(5)采用10mL的PBS缓冲液将步骤(4)的沉淀重悬，振荡，于100000×g超速离心70min，弃掉上清液，收集沉淀；
(6)采用10mL的PBS缓冲液将步骤(5)的沉淀重悬，振荡，于100000×g超速离心70min，弃掉上清液，收集沉淀，得到外泌体。
对比例2
本对比例提取尿液中外泌体，包括如下步骤：
(1)将15mL尿液样本于2000×g离心10min去除细胞碎片，取上清液，采用截留分子量为30KD的超滤离心管(
Ultra-15 30K，Millipore)对上清液进行超滤浓缩，采用0.2μm针筒过滤器(
Membrance，Pall)过滤浓缩后的尿液，得到预处理尿液。
取5mg CAE-Ti-IMAC微球，并使用500μL PBS缓冲液(pH＝7.5)洗涤3次，500×g离心1min，弃掉上清，收集CAE-Ti-IMAC微球；
(2)将步骤(1)得到的CAE-Ti-IMAC微球和预处理尿液混合，于4℃旋转混匀10min，5000×g离心3min，弃掉上清液，收集沉淀；
(3)使用500μL PBS缓冲液洗涤步骤(2)得到的沉淀3次，去除非特异性结合的蛋白质，500×g离心3min，收集沉淀；
(4)向步骤(3)得到的沉淀中加入100μL体积分数为10％的氨水，4℃旋转反应10min，10000×g离心5min，收集含外泌体的上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液快速转入30KD的超滤管中，用PBS缓冲液置换氨水3次，每次加入300μL的PBS缓冲液，4℃、10000×g离心5min，最后倒扣，10000×g离心5min，得到外泌体。
以下试验例采用纳米流式检测仪(NanoFCM，厦门福流生物技术有限公司)对实施例1、对比例1和对比例2制备的外泌体的粒径分布、浓度和纯度进行表征分析，每个实施例和对比例均进行2次技术重复(以①、②表示)，并对两次得到的样品均进行检测。
试验例1外泌体的粒径分布
外泌体是由细胞分泌的直径约为40～200nm的囊泡，本试验例统计40～200nm区间内的颗粒占总提取颗粒的百分比(在图中以“％of all”表示)，判断总提取颗粒中外泌体的含量，百分比越高表明总提取颗粒中外泌体含量越高。
外泌体粒径分布结果如图1所示，实施例1和对比例1、2所提取的外泌体的粒径分布基本类似，所提取的尿液外泌体粒径以50～70nm为中心，大多数分布在40～120nm的区间内。实施例1采用HEPES处理的CAE-Ti-IMAC微球对外泌体进行富集，并使用磷酸盐缓冲液在温和条件下进行洗脱，得到的外泌体的粒径分布在40～200nm区间的颗粒占总提取颗粒的百分比最高，为99.92％(取两次技术重复平均值)；对比例1采用经典的超速离心法通过多次离心对外泌体进行富集，步骤繁琐，操作费时，且得到的外泌体的粒径分布于40～200nm区间的颗粒占总提取颗粒的百分比较实施例1低；对比例2使用氨水在碱性条件下进行洗脱，得到的外泌体粒径分布相对松散，其在180～200nm的粒径区域有少许颗粒分布，且其粒径分布于40～200nm区间的颗粒占总提取颗粒的百分比最低。综合上述表明本发明的方法能够有效避免提取过程中外泌体破裂、变性，从而能够提高提取效率。
试验例2外泌体的浓度
外泌体浓度结果如表1所示，实施例1提取的外泌体的数量和浓度分别为8.2×109个和5.5×108个/mL尿液(取两次技术重复平均值)，对比例1提取的外泌体的数量和浓度分别为1.9×108个和1.3×107个/mL尿液，对比例2提取的外泌体的数量和浓度分别为2.3×106个和1.6×105个/mL尿液，表明本发明的方法能够更高效地提取外泌体。
表1
| 实验组 | 外泌体总个数(15mL尿液) | 提取浓度(个/mL尿液) |
| 实施例1-① | 8.6×10<sup>9</sup> | 5.7×10<sup>8</sup> |
| 实施例1-② | 7.9×10<sup>9</sup> | 5.3×10<sup>8</sup> |
| 对比例1-① | 1.6×10<sup>8</sup> | 1.1×10<sup>7</sup> |
| 对比例1-② | 2.2×10<sup>8</sup> | 1.5×10<sup>7</sup> |
| 对比例2-① | 2.3×10<sup>6</sup> | 1.5×10<sup>5</sup> |
| 对比例2-② | 2.4×10<sup>6</sup> | 1.6×10<sup>5</sup> |
试验例3外泌体的纯度
对外泌体进行SYTO 9核酸染色后进行荧光分析，根据核酸阳性率的结果表征提取的外泌体的纯度，核酸阳性率越低，表明所提取的外泌体中不含核酸的颗粒体及蛋白聚合物的含量越高，即外泌体的纯度相对越低，而核酸阳性率越高，则外泌体的纯度相对越高。
如图2所示，实施例1提取的外泌体的核酸阳性率为88.0％(取两次技术重复平均值)，而对比例1和对比例2提取的外泌体的阳性率分别为58.6％和73.0％，表明本发明的方法能够有效提高外泌体的纯度。
综上所述，本发明的分离尿液中外泌体的方法，采用与磷酸基团有特异性相互作用的亲和色谱微球吸附尿液中的外泌体，使用HEPEs缓冲液洗涤微球以去除非特异性吸附的杂蛋白，最后用高浓度的磷酸盐缓冲液竞争洗脱外泌体，洗脱条件温和，有利于保持外泌体完整的生物膜结构，以便于后继的功能分析，并进一步提高了外泌体的提取效率。以相同的尿液样本为起始量，发展的提取方法所提取的外泌体数量相比经典的超速离心法有显著提高，且提取的外泌体的纯度更高，实现了高效无损分离尿液中外泌体。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种分离尿液中外泌体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将与磷酸基团有特异性相互作用的亲和色谱微球加入到尿液中混合孵育，离心收集沉淀；
(2)向步骤(1)得到的沉淀中加入磷酸盐缓冲液进行竞争洗脱，离心取上清液，得到所述外泌体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1～0.3M；
优选地，步骤(2)所述磷酸盐缓冲液的pH为6.8～7.8。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括对亲和色谱微球进行洗涤的步骤，优选为使用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液洗涤亲和色谱微球，离心收集所述亲和色谱微球；
优选地，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的浓度为20～55mM；
优选地，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的pH为6.8～7.8；
优选地，所述离心的离心力为1500～2500×g；
优选地，所述离心的时间为1～3min；
优选地，所述洗涤的次数为2～4次。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括对尿液进行预处理的步骤；
优选地，所述预处理包括对尿液进行离心、浓缩并过滤的步骤；
优选地，所述离心的离心力为1500～3000×g；
优选地，所述离心的时间为8～15min；
优选地，所述浓缩为采用超滤离心管进行超滤浓缩；
优选地，所述超滤离心管的截留分子量为30KD～50KD；
优选地，所述过滤的滤器为0.20～0.25μm针式过滤器。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(2)之前还包括对步骤(1)得到的沉淀进行洗涤的步骤，优选为向步骤(1)得到的沉淀中加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液并混合，离心收集沉淀；
优选地，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的浓度为20～55mM；
优选地，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的pH为6.8～7.8；
优选地，所述混合后还包括振荡的步骤；
优选地，所述振荡的温度为8～15℃；
优选地，所述振荡的时间为3～7min；
优选地，所述离心的离心力为4500～5500×g；
优选地，所述离心的时间为1～5min；
优选地，所述洗涤重复1～2次。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述与磷酸基团有特异性相互作用的固定化亲和色谱微球包括Ti-IMAC固定化亲和色谱微球。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述孵育在振荡条件下进行；
优选地，步骤(1)所述孵育的温度为8～15℃；
优选地，步骤(1)所述孵育的时间为15～60min；
优选地，步骤(1)所述离心的离心力为4500～5500×g；
优选地，步骤(1)所述离心的时间为1～5min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述混合后还包括振荡的步骤；
优选地，所述振荡的温度为8～15℃；
优选地，所述振荡的时间为10～20min。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述离心的离心力为12000～17000×g；
优选地，步骤(2)所述离心的时间为3～7min；
优选地，步骤(2)所述离心的温度为4～10℃；
优选地，步骤(2)重复1～2次。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)于1500～3000×g的离心力下对尿液进行离心8～15min去除细胞碎片，采用截留分子量为30KD～50KD的超滤离心管对离心上清液进行超滤浓缩，并使用0.20～0.25μm的针式过滤器过滤浓缩液，得到预处理的尿液；
采用浓度为20～55mM、pH为6.8～7.8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液洗涤Ti-IMAC固定化亲和色谱微球2～4次，并于1500～2500×g离心1～3min，收集所述Ti-IMAC固定化亲和色谱微球；
(2)将步骤(1)得到的预处理的尿液和Ti-IMAC固定化亲和色谱微球混合，8～15℃振荡孵育处理15～60min，于4500～5500×g离心1～5min并弃掉上清液，收集沉淀；
(3)向步骤(2)得到的沉淀中加入浓度为20～55mM、pH为6.8～7.8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液并混合，于8～15℃振荡3～7min，于4500～5500×g离心1～5min并弃掉上清液，收集沉淀，重复1～2次，去除微球表面的非特异性吸附蛋白；
(4)向步骤(3)得到的沉淀中加入浓度为0.1～0.3M、pH为6.8～7.8的磷酸盐缓冲液进行竞争洗脱，8～15℃振荡10～20min，于4～10℃、12000～17000×g离心3～7min，取上清液，重复1～2次，得到所述外泌体。
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| CN114323851A (zh) * | 2021-12-24 | 2022-04-12 | 多莱泌生物科技(武汉)有限公司 | 一种基于超滤和亲和层析技术分离血清血浆中外泌体方法 |
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|---|---|
| CN112813027B (zh) | 2023-05-05 |
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