CN116376124A - 一种基于特定分子量壳聚糖快速分离富集外泌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于特定分子量壳聚糖快速分离富集外泌体的方法，属于医药技术领域。本发明将分子量＜50kDa的壳聚糖与磁性颗粒按照一定质量比，采用ECC交联得到了壳聚糖‑磁性颗粒，并将其用于外泌体的快速分离富集。本发明的基于特定分子量壳聚糖快速分离富集外泌体的方法，从健康人血清样品中富集得到了2133种外泌体蛋白，其中有1787种已被证实为外泌体蛋白、346种蛋白未被证实，说明用本发明所述制备壳聚糖‑磁性颗粒能更为有效的分离富集外泌体。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于特定分子量壳聚糖快速分离富集外泌体的方法，属于医药技术领域。
背景技术
外泌体是细胞由内体途径所分泌的平均直径为30-150nm的细胞外囊泡，具有双层脂质膜结构，膜表面带有负电荷，其内包裹脂质、蛋白质、核酸等多种生物活性物质，不仅在细胞间物质转换和信息传递等方面起着重要作用，而且在疾病诊断、预后预测也具有重大意义。此外，外泌体膜的磷脂双分子层结构能有效保护内容物，具有更高的稳定性；其内容物丰富，更易发现新型生物标志物；携带供体细胞信息，比传统的分子标志物更具有特异性；外泌体存在于人体几乎所有体液中等诸多特点，使得外泌体在液体活检中具有吸引力。
目前常用的外泌体提取方法主要包括：超速离心法、密度梯度离心法、超滤法和磁珠特异性捕获法等，但同时它们都存在各自的局限性，如通量低、操作繁琐、费时费力、成本较高以及外泌体纯度较低等，不能满足当前外泌体提取及检测的需求。因此，在现有外泌体提取方法的基础上，亟需寻找一种短耗时的高纯度外泌体提取方法。
壳聚糖是甲壳素经脱乙酰作用，脱去C2上的乙酰基而得到多糖，广泛应用于水和饮料处理、制药以及食品加工等方面；近年来研究学者发现壳聚糖富含大量带正电荷的氨基基团，使壳聚糖能够与外泌体带负电荷的质膜相互作用，形成外泌体-壳聚糖高分子量复合物，通过离心可以实现外泌体的分离，具有短耗时及高通量的特点。但利用壳聚糖分离富集小体积血清/血浆外泌体时，形成的外泌体-壳聚糖沉淀很难通过肉眼观察到，导致在PBS清洗沉淀过程中可能会造成外泌体的损失。如何提高壳聚糖分离富集外泌体的效率，降低外泌体损失，是该方法面临的一个难题。
发明内容
为了解决上述至少一个问题，本发明提供了一种基于特定分子量壳聚糖快速分离富集外泌体的方法，可以分离获得更多数目的外泌体蛋白。
发明人在研究过程中，发现有文献报道，壳聚糖可以固定在磁性颗粒上，以更好的去除水中Hg及Cd等重金属离子。但是壳聚糖-磁性颗粒是否能够同样富集外泌体，分离效果如何无法确定；壳聚糖-磁性颗粒的制备方法是否会对外泌体的分离富集效果产生影响也是不确定的，进一步地，不同的交联方法及二者比例制备的壳聚糖-磁性颗粒分离富集外泌体效果是否存在差异也无从获知。此外，甲壳素的分子量、脱乙酰化的时间及温度的不同会产生不同分子量的壳聚糖，不同分子量的壳聚糖在抗菌、保湿、载药及抗癌等功能上具有不同表现，而壳聚糖分子量的不同对外泌体的分离效果的影响也是问题。
为此，本发明首先制备了不同比例的壳聚糖及Fe3O4颗粒，发现以1:1的质量比制备的壳聚糖-磁性颗粒分离富集人血清外泌体效果最好；且与CuSO4及表氯醇(ECC)等交联方法相比较，ECC交联效果最佳；且基于此方法，利用蛋白质谱技术比较了不同分子量壳聚糖(＜50kDa，50-190kDa，>190kDa)分离的人血清来源外泌体，发现＜50kDa壳聚糖所鉴定到的外泌体蛋白数量最多，并与其他常用的外泌体分离手段比较，具有更好的外泌体富集效果。总而言之，本发明通过分析不同的壳聚糖及Fe3O4颗粒比例、交联方法及壳聚糖的分子量，确定以ECC进行交联，制备了一种壳聚糖-磁性颗粒，与现有方法相比较，能够更好的分离富集外泌体。
本发明的第一个目的是提供一种壳聚糖-磁性颗粒，所述壳聚糖-磁性颗粒是将分子量＜50kDa的壳聚糖与磁性颗粒按照1:2～4:1的质量比，采用ECC交联得到的。
在一种实施方式中，所述壳聚糖-磁性颗粒中，壳聚糖与磁性颗粒的质量比为1:2、1:1、2:1及4:1；优选地，为1:1。
在一种实施方式中，所述ECC交联，具体是向壳聚糖与Fe3O4颗粒的混合溶液中加入ECC，孵育，然后将混合液滴加到碱液中形成壳聚糖-磁性颗粒。
在一种实施方式中，所述ECC交联中，加入终浓度为0.04M的ECC。
在一种实施方式中，壳聚糖-磁性颗粒的制备具体是：在壳聚糖母液中按照壳聚糖与磁性颗粒的质量比为1:1加入Fe3O4颗粒，得到混合溶液，然后加入终浓度为0.04M的ECC，40℃条件下孵育3.5h，将混合液滴加到碱液中形成壳聚糖-磁性颗粒，用水清洗、干燥。
本发明的第二个目的是提供一种基于特定分子量壳聚糖快速分离富集外泌体的方法，所述方法包括利用本发明的壳聚糖-磁性颗粒。
在一种实施方式中，所述方法是非疾病的诊断和治疗方法。
在一种实施方式中，所述方法具体是：将离体的待处理样品预处理后，加入壳聚糖-磁性颗粒，孵育一段时间后，利用磁力吸附，并清洗外泌体-壳聚糖沉淀，然后重悬外泌体-壳聚糖沉淀。
在一种实施方式中，所述离体的待处理样品为离体的健康人体检血清样品。
在一种实施方式中，所述预处理是于4℃条件下3,000g离心15min去除细胞及细胞碎片，4℃条件下17,000g离心15min去除大体积颗粒。
在一种实施方式中，壳聚糖-磁性颗粒，是按照50μg/mL的壳聚糖终浓度加入。
在一种实施方式中，所述孵育是在室温条件下颠倒孵育1h。
在一种实施方式中，所述清洗是采用PBS清洗清洗2次以上。
在一种实施方式中，所述重悬是加入1×loadingbuffer重悬外泌体-壳聚糖沉淀。
本发明中，不同分子量的壳聚糖，分别可以通过NaOH降解甲壳素制备。
本发明的优点和效果
本发明通过免疫印迹及蛋白质谱方法，比较不同壳聚糖与磁性颗粒比例、交联方法及壳聚糖分子量制备的壳聚糖-磁性颗粒对人血清外泌体分离效果，进而筛选出一种优于现有手段的壳聚糖分离富集外泌体方法。
常规壳聚糖分离富集外泌体时，通过离心沉淀的壳聚糖-外泌体复合物，肉眼几乎不可见，清洗过程容易损失；本发明通过制备壳聚糖-磁性颗粒可以更好的实现壳聚糖-外泌体沉淀与溶液分离，省略掉离心步骤，避免外泌体的损失。
本发明的基于特定分子量壳聚糖快速分离富集外泌体的方法，从健康人血清样品中富集得到了2133种外泌体蛋白，其中有1787种已被证实为外泌体蛋白、346种蛋白未被证实，说明用本发明所述制备壳聚糖-磁性颗粒能更为有效的分离富集外泌体。
附图说明
图1为Westernblot检测不同壳聚糖及Fe3O4颗粒质量比例制备的壳聚糖-磁性颗粒分离富集人血清外泌体中标志蛋白含量的差异；
图2为Westernblot检测不同交联方法制备的壳聚糖-磁性颗粒分离富集人血清外泌体中标志蛋白含量的差异；
图3为Westernblot检测不同分子量壳聚糖制备的壳聚糖-磁性颗粒分离富集人血清外泌体中标志蛋白含量的差异；
图4为质谱鉴定不同分子量壳聚糖分离富集外泌体的蛋白种类的差异；
图5为50-190kDa壳聚糖分离富集外泌体蛋白的与EXOCARTA数据库中外泌体蛋白的比较；
图6为优化的壳聚糖-磁性颗粒与其他不同方法分离富集外泌体蛋白数目的差异。
具体实施方案
下面通过具体实施例对本发明所述制备壳聚糖-磁性颗粒实现外泌体快速分离富集过程进一步说明。以下实施案例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
实施例1：常规壳聚糖分离外泌体方法步骤
将壳聚糖(>190KD)溶解于1％的乙酸溶液中，配置成pH～3浓度为20mg/mL的母液；使用时用100mMNaOH溶液将母液稀释成为pH～7浓度为8mg/mL的工作液。选用健康人体检血清样品进行预处理：于4℃条件下3,000g离心15min去除细胞及细胞碎片，4℃条件下17,000g离心15min去除大体积颗粒；向50μL经过预处理的人血清中加入终浓度为50μg/mL的壳聚糖，室温下颠倒孵育1h，4℃条件下12,000g离心15min，外泌体沉淀用1mLPBS清洗3次，4℃条件下12,000g离心15min，用1×loadingbuffer重悬外泌体沉淀，沸水浴10min，12,000g离心5min，取上清进行westernblot检测。
实施例2：以不同壳聚糖与Fe3O4颗粒质量比制备的壳聚糖-磁性颗粒，westernblot比较其富集人血清外泌体效果差异
取实施例1中制备的20mg/mL壳聚糖母液，按照壳聚糖：Fe3O4颗粒＝1:2、1:1、2:1及4:1的质量比加入Fe3O4颗粒，室温下搅拌2h，将壳聚糖与Fe3O4颗粒的混合溶液加到10mL注射器中，通过注射器针头将混合液滴加到3MNaOH溶液中，收集形成的壳聚糖-磁性颗粒，用水清洗壳聚糖-磁性颗粒直至pH为中性，40℃条件下烘干壳聚糖-磁性颗粒备用。
按照50μg/mL的壳聚糖终浓度，向实施例1中经预处理后的50μL人血清中添加上述不同的壳聚糖-磁性颗粒，室温条件下颠倒孵育1h，利用磁力吸附以1mLPBS清洗外泌体-壳聚糖沉淀3次，向沉淀中加入1×loadingbuffer重悬外泌体-壳聚糖沉淀，沸水浴煮沸10min，取上清进行westernblot检测外泌体中标志物的含量。
如图1所示，第1泳道为血清的阳性对照，第2-5泳道为不同比例制备的壳聚糖-磁性颗粒富集的外泌体，CD63及TSG101为外泌体的标志物，其含量的多少表示外泌体含量的高低，而APOB为血清中存在而外泌体中不存在的阴性标志物。可见实验组中，以1:1质量比制备的壳聚糖-磁性颗粒富集的外泌体含量最多，不含血清中杂蛋白的污染。因此，后续实施例中均以1:1质量比制备壳聚糖-磁性颗粒。
实施例3：以不同交联方法制备壳聚糖-磁性颗粒
在制备壳聚糖-磁性颗粒过程中，进行交联可以增强磁性颗粒及壳聚糖二者的稳定性。
CuSO4交联法：在实施例2中制备壳聚糖-磁性颗粒过程中，向壳聚糖与Fe3O4颗粒(1:1的质量比)的混合溶液中按照CuSO4：氨基糖苷单元＝1.5:1的比例加入CuSO4，于室温下孵育24h，将混合溶液通过注射器向碱液中滴加形成磁性颗粒，后续步骤如实施例2所述。
ECC交联法：在实施例2中制备壳聚糖-磁性颗粒过程中，向壳聚糖与Fe3O4颗粒的混合溶液中加入终浓度为0.04M的表氯醇(epichlorohydrin，ECC)，40℃条件下孵育3.5h，将混合液滴加到碱液中形成磁性颗粒，后续步骤如实施例2所述。
如图2所示，第1-3泳道为不经过交联的及通过CuSO4及ECC交联的壳聚糖-磁性颗粒分离富集的外泌体，可见ECC交联的壳聚糖-磁性颗粒分离富集的外泌体效果最好，不含血清中杂蛋白的污染。因此，后续实施例中均以ECC交联方式制备壳聚糖-磁性颗粒。
实施例4：不同分子量壳聚糖对人血清来源外泌体的分离富集
不同分子量壳聚糖由几丁质进一步制备而成。30g几丁质加入至300mL的50％NaOH溶液中，在100℃条件下搅拌加热6小时，得到产物用蒸馏水冲洗至pH为中性，于65℃温度下干燥24h获得。将上述制备的壳聚糖5g溶解于95mL5％的乙酸溶液中，于50℃温度下加热2h，24h及120h，冷却至室温，5000rpm离心20min，上清液中加入4NNaOH溶液至pH为中性，过滤得到沉淀用蒸馏水清洗，于50℃温度下干燥，分别获得<50kDa，50-190kDa及>190kDa的壳聚糖。
根据实施例2及实施例3所述方法，以1:1质量比及ECC交联方法，将分子量＜50kDa，50-190kDa，>190kDa的壳聚糖制备成为壳聚糖-磁性颗粒。取实施例1中经预处理后的健康人血清样品50μL，按照壳聚糖终浓度为50μg/mL比例，加入上述三种壳聚糖-磁性颗粒，室温旋转孵育1h，利用磁力吸附以1mLPBS清洗外泌体-壳聚糖沉淀3次。如进行westernblot实验，则向沉淀中加入1×loadingbuffer重悬外泌体-壳聚糖沉淀，沸水浴煮沸10min，取上清进行westernblot检测外泌体中标志物的含量；如进行蛋白质谱检测，向沉淀中加入8M尿素50mMNH4HCO3溶液进行重悬，测定蛋白浓度，待蛋白质谱后续实验。
实施例5：不同分子量壳聚糖分离外泌体的免疫印迹检测
实施例4所述的方法，以1:1质量比及ECC交联方法，将分子量<50kDa，50-190kDa及>190kDa的壳聚糖制备成三种壳聚糖-磁性颗粒，并以此富集血清外泌体，进行免疫沉淀检测。
向外泌体沉淀中加入1×loadingbuffer，沸水浴10min，取上清液进行SDS-PAGE分离，PVDF转膜，3％牛血清白蛋白封闭，4℃杂交外泌体标志蛋白CD63(abcam；ab68418)及TSG101(abcam；ab125011)及APOB(SantaCruz；sc-393636)抗体过夜，37℃杂交辣根过氧化物酶标记二抗，加入ECL发光液，对PVDF膜进行显影。
如图3所示，第1-4泳道分别为血清的阳性对照、分子量<50Kd、50-190Kd及>190Kd壳聚糖-磁性颗粒富集的外泌体，可见<50Kd壳聚糖-磁性颗粒对外泌体的富集效果最好，不含血清中杂蛋白的污染。
实施例6：不同分子量壳聚糖分离外泌体的质谱检测
选取实施例4制备的外泌体进行酶解、除盐及质谱检测。
(1)外泌体蛋白酶解：向不同分子量壳聚糖分离的壳聚糖-外泌体沉淀中加入8M尿素50mM碳酸氢铵溶液进行重悬；加入终浓度为5mM二硫苏糖醇，37℃孵育1小时；加入终浓度为15mM碘乙酰胺，25℃避光孵育0.5小时；加入终浓度为2.5mM二硫苏糖醇,37℃孵育10min；溶液经超纯水稀释2倍，按照(100:1，w/w)比例加入测序级胰蛋白酶(Promega；V511A)，37℃振荡2小时；溶液经超纯水再稀释4倍，按照(100:1，w/w)比例加入测序级胰蛋白酶，37℃振荡反应过夜；向溶液中加入终浓度1％TFA，震荡，pH试纸测定，确保pH<2；样品经13000g离心15min，取上清。
(2)外泌体肽段除盐：
平衡：向OasisHLB(Waters；WAT106202)固相萃取柱中依次加入1mL100％ACN溶液，1mL50％ACN/0.1％TFA溶液，1mL0.1％TFA溶液，弃流穿液；
上样：向固相萃取柱HLB中加入经胰蛋白酶酶切后的肽段溶液，收集流穿液，反复上样三次，以保证肽段与HLB柱充分结合；
淋洗：加入1mL0.1％TFA溶液，弃流穿液，重复3次；
洗脱：加入200μL60％ACN/0.1％TFA溶液，收集洗脱液，重复2次，合并洗脱液；
(3)质谱检测：向冻干的外泌体肽段中加入0.1％甲酸溶液溶解，用OrbitrapExploris480液相-质谱联用技术进行检测，利用MaxQuant软件进行质谱数据的检索。
(4)数据分析：通过对不同分子量壳聚糖分离外泌体中鉴定的蛋白质种类进行比较，如图4所示，质谱检测发现，<50kD、50-190kD及>190kD三种分子量壳聚糖分离的外泌体蛋白数目分别为2133、2084及1992，其中<50kD壳聚糖分离的外泌体蛋白质种类最多；进一步分析发现，共1858种外泌体蛋白在上述三种外泌体中均被鉴定到，仅在<50kD壳聚糖分离外泌体中鉴定的蛋白有79种。综上，通过蛋白质谱检测发现壳聚糖分离的外泌体中含有丰富的外泌体蛋白，且<50kD壳聚糖分离的外泌体蛋白质种类最多。
实施例7：<50kD壳聚糖分离外泌体的蛋白种类与外泌体蛋白数据库比较
在实施例6中获得的外泌体蛋白质数据基础上，将<50kD壳聚糖分离的外泌体蛋白与EXOCARTA外泌体蛋白数据库进行比较。如图5所示，<50kD壳聚糖分离的外泌体蛋白中有1787种已被证实为外泌体蛋白，346种蛋白未被证实。说明<50kD壳聚糖分离的外泌体纯度较纯，鉴定的蛋白大多数均为已报道的外泌体蛋白，少量的蛋白未见报道，可能是新发现的外泌体蛋白。
实施例8：壳聚糖法与其他外泌体分离方法的比较
利用质谱技术比较本发明所述壳聚糖-磁性颗粒方法(SC)与多种外泌体分离方法，如超速离心法，聚乙二醇法及抗体亲和捕获法富集血清外泌体中鉴定蛋白数目的差异。
(1)超速离心法(UC)：取实施例1中经过预处理后健康人血清50μL，110,000g4℃超速离心2h，小心去除上清，收集沉淀。使用200μLPBS重悬沉淀，BCA法定量蛋白浓度。
(2)聚乙二醇沉淀法(PEG)：向实施例1中经过预处理后健康人血清加入1倍体积的PEG储备液，充分混匀，置于反转摇床4℃孵育过夜，16,400g4℃离心1h，弃上清。用200μLPBS重悬沉淀，BCA法定量外泌体蛋白浓度。
(3)抗体亲和捕获法(IC)：向PEG沉淀法纯化的外泌体中加入anti-CD9/CD81/CD63磁珠(20μL/mL)，置于反转摇床4℃孵育过夜。使用磁力架收集吸附有外泌体的磁珠，弃去上清液；用PBS洗涤磁珠三次。使用Na2CO3/NaHCO3溶液洗脱磁珠，并置于摇床震荡10min，将外泌体从磁珠上充分释放。立即用1mol/LHCl中和，并通过10kD超滤管以PBS置换溶液。BCA法定量蛋白浓度。
将上述方法分离的外泌体按照实例6方法进行蛋白酶解、除盐、质谱检测及数据分析。如图6所示，PEG沉淀法鉴定的外泌体蛋白数目最少，抗体亲和捕获法及超速离心法次之，鉴定外泌体蛋白数目最多的是本发明的壳聚糖方法，进一步说明利用本发明所述制备壳聚糖-磁性颗粒能更为有效的分离富集外泌体。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种壳聚糖-磁性颗粒，其特征在于，所述壳聚糖-磁性颗粒是将分子量＜50kDa的壳聚糖与磁性颗粒按照1:2～4:1的质量比，采用ECC交联得到的。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖-磁性颗粒，其特征在于，所述壳聚糖-磁性颗粒中，壳聚糖与磁性颗粒的质量比为1:2、1:1、2:1或者4:1。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖-磁性颗粒，其特征在于，所述壳聚糖-磁性颗粒中，壳聚糖与磁性颗粒的质量比为1:1。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖-磁性颗粒，其特征在于，所述ECC交联，具体是向壳聚糖与Fe3O4颗粒的混合溶液中加入ECC，孵育，然后将混合液滴加到碱液中形成壳聚糖-磁性颗粒。
5.根据权利要求1所述的壳聚糖-磁性颗粒，其特征在于，所述ECC交联中，加入终浓度为0.04M的ECC。
6.一种基于特定分子量壳聚糖快速分离富集外泌体的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1-5任一所述的壳聚糖-磁性颗粒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是非疾病的诊断和治疗为目的的方法。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：将离体的待处理样品预处理后，加入壳聚糖-磁性颗粒，孵育一段时间后，利用磁力吸附，并清洗外泌体-壳聚糖沉淀，然后重悬外泌体-壳聚糖沉淀。
9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，壳聚糖-磁性颗粒，是按照50μg/mL的壳聚糖终浓度加入。
10.权利要求1-5任一所述的壳聚糖-磁性颗粒的应用。
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| CN112877274A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-06-01 | 南京大学 | 一种细胞外囊泡磁性印迹材料及其制备方法与应用 |
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2023
- 2023-03-01 CN CN202310181694.2A patent/CN116376124A/zh active Pending
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