CN114288995B

CN114288995B - 一种尿液中糖基化蛋白和糖肽的富集材料及方法

Info

Publication number: CN114288995B
Application number: CN202111605224.1A
Authority: CN
Inventors: 郭可夫; 刘涛
Original assignee: Wuhan Chengqi Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Wuhan Chengqi Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2024-05-17
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: CN114288995A

Abstract

本申请涉及蛋白质或者多肽富集技术领域，公开了一种尿液中糖基化蛋白及糖肽的富集材料及方法。该富集材料包括由金属有机框架上及负载于所述金属有机框架上的配体构成，所述金属有机框架为Fe₃O₄/壳聚糖磁性复合纳米粒子，所述配体含有至少一个羧基。通过在外加磁场的作用下利用该富集材料对尿液蛋白的酶切产物进行离心富集，由于该富集材料具有众多亲水基团，基于相似相容原理可实现对亲水性糖蛋白/糖肽进行分离富集，且富集材料具有磁性内核，通过外加磁场可以减少离心时间，具有更高的选择性、灵敏度及富集效率。

Description

一种尿液中糖基化蛋白和糖肽的富集材料及方法

技术领域

本申请涉及蛋白质或者多肽富集技术领域，特别是一种尿液中糖基化蛋白和糖肽的富集材料及方法。

背景技术

蛋白质的糖基化修饰是最常见、最重要的翻译后修饰，在蛋白折叠、信号传导、分子识别及免疫应答等生物学过程中发挥着重要的作用，糖基化修饰的改变是在糖基酶催化下进行，产生不同的聚糖，这些糖主要分布于细胞表面和细胞外基质中，是细胞相互接触的第一关，因此疾病状态下糖链的改变较蛋白质更为显著，所以对糖蛋白组学的研究有助于探究癌症的发生机理，对于癌症的早期发现、防治具有重大意义，特别是在肿瘤细胞的侵袭和转移中起到十分重要的作用。因此，糖基化蛋白质作为一种重要的生物标志物候选物受到了科学界，和医学界越来越广泛的关注。蛋白质的糖基化类型主要有两种：一种是糖基片段通过氨原子链接在天冬酰胶(Asm)的侧链上的N-糖基化，另一种是糖基片段通过氧原子链接在丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)侧链上的O-糖基化。在临床医学领域，许多生物标志物及治疗的靶向目标是细胞外环境的糖蛋白，如癌症抗原CA-125、AFP和CA19-9等。

生物样本中糖蛋白/糖肽检测过程主要包括糖蛋白/糖肽的分离与富集、糖基化位点鉴定、糖链结构和数量分析等，其中由于样本的复杂和蛋白高丰度特性，因此对生物样品中糖基化蛋白进行选择性富集分离是糖蛋白组学研究的关键。目前常用的糖蛋白/糖肽富集方法主要有非化学键作用的亲和法(凝聚素亲和法和免疫法)、化学反应形成化学键的化学方法、利用分子体积大小的尺寸排阻法、利用糖基结构的亲水性的亲水色谱法和多种方法联合使用等。

血浆作为含有丰富的蛋白质含量的载体，一直是生物标志物筛选的首选对象，然而以血浆作为生物样品，其蛋白组成复杂程度高，丰度动态范围宽，会大大抑制低含量的糖基化蛋白的质谱信号，且糖蛋白中糖链结构的微观不均一性，更使糖蛋白的分离富集复杂化，导致低丰度生物标志物的鉴定及其困难。与常用于疾病标记物研究的血液样本相比，尿常规是医学检验“三大常规”项目之一，尿液可以无创，连续、大量获取。尿液是血液经过肾小球滤过、肾小管和集合管重吸收和排泄所产生的终末代谢产物，不少病变早期就可以出现在蛋白尿或者尿沉渣中，因此尿液蛋白质组不仅能够反映泌尿系统的功能状态，还能在一定程度上反映血液和整个机体的状态，更为重要的是，尿液蛋白质组的组成相对简单，有效避免了血液中多种高丰度蛋白对低丰度标志物蛋白检测带来的困难。据研究工作表明，尿液中已经鉴定出2500多种蛋白，为基于尿液的蛋白质生物标志物筛选奠定了基础。

然而蛋白质的糖基化本身丰度有限，尿液中糖基化修饰比例较低并具有高度微不均一性，在质谱分析易受高丰度非糖基化蛋白质、肽段的干扰，因此，要实现对尿液中糖蛋白/糖肽高灵敏度质谱鉴定必须对其进行高效、高选择性的富集。

发明内容

本申请旨在提供一种尿液中糖蛋白及糖肽富集材料及方法，利用糖肽与富集材料的亲水、极性等一系列相互作用，实现糖肽的有效保留、富集和分离，富集效果不受糖型影响，具有较好的广谱性，并且可保持糖链结构完整，操作简单、与质谱兼容性好、易于实现在线分析。

为了实现上述技术目的，本申请具体采用了以下技术方案：

作为本申请的一个实施方案，提供了一种尿液中糖蛋白和糖肽的富集材料，所述富集材料包括由金属有机框架上及负载于所述金属有机框架上的配体构成，所述金属有机框架为Fe₃O₄/壳聚糖磁性复合纳米粒子，所述配体含有至少一个羧基。

所述配体为对苯二甲酸、5,5`-羰基二间苯二甲酸、3-羧基苯硼酸、4-羧基苯硼酸、2,5-嘧啶二羧酸或2,5-吡啶二羧酸。

在本申请上述实施方案中，采用Fe₃O₄/壳聚糖磁性复合纳米粒子作为载体，提供磁性高分子微球使其具有磁分离、引导、标记和固定的功能，同时作为内核提供稳定的支撑作用。另一方面壳聚糖是一种多糖衍生物，其分子链上存在丰富的羟基和氨基，羟基和氨基均属于亲水基团，在亲水基团的作用下使得Fe₃O₄/壳聚糖磁性复合纳米粒子具有较强的亲水性。与含有至少一个羧基的有机配体结合，羧基同为亲水基团，进一步提高了富集材料的亲水性能。

糖蛋白/糖肽中糖基片段具有丰富的亲水功能基团，例如多羟基结构(邻二醇)，因此，根据相似相容原理，采用本申请所述富集材料可以将样本中的亲水性糖蛋白/糖肽进行分离富集，所述富集材料的亲水性越强，糖蛋白/糖肽与其的结合越强，从而高效的实现对糖蛋白/糖肽的富集。同时富集材料中的氨基和羧基在酸性条件下可生成schiff碱，因schiff碱稳定性较差，可与糖蛋白/糖肽中糖基片段基团产生共轭作用，具有加强富集稳定性的作用。

所述Fe₃O₄/壳聚糖磁性复合纳米粒子通过在壳聚糖的乙酸溶液中加入改性Fe₃O₄溶胶和非离子表面活性剂混合液得到。

本申请通过对具有顺磁性的单分散Fe₃O₄粒子进行改性处理，得到表面带有负电荷的Fe₃O₄溶胶，与带有正电荷的壳聚糖分子在静电自组装作用下，形成Fe₃O₄粒子被壳聚糖包覆的核壳结构，顺磁性Fe₃O₄粒子作为内核对整个结构具有稳定的支撑作用，同时为富集材料提供磁性作用力，用于糖蛋白/糖肽富集时，可通过外加磁场实现分离，极大的提高了分离效率。

进一步的，所述改性Fe₃O₄通过将Fe₃O₄微粒在柠檬酸溶液中超声震荡得到Fe₃O₄纳米粒子溶胶。利用柠檬酸对Fe₃O₄纳米粒子表面进行改性处理，使其表面具有负电荷，便于与壳聚糖自组装形成核壳结构。

进一步的，所述非离子表面活性剂选自烷基多糖苷、壬基酚聚氧乙烯醚、司盘或吐温中至少一种。所述非离子表面活性剂与Fe₃O₄纳米粒子溶胶混合，用于防止Fe₃O₄纳米粒子的聚集沉降。

所述Fe₃O₄/壳聚糖磁性复合纳米粒子与有机配体通过静电自组装形成富集材料。采用亲水功能化的有机配体，使得所得到富集材料具有亲水的孔道环境。

进一步的，所述静电自组装指壳聚糖中氨基与有机配体中的羧基静电吸附。静电结合的富集材料制备方法简单，产品纯度高。

作为本申请的另一实施方案，提供了所述富集材料的制备方法，包括：

在有机溶剂中使磁性氧化Fe₃O₄/壳聚糖磁性复合纳米粒子与有机配体混合进行自组装，磁分离获得目标产物。

本申请将静电吸附自组装制备得到的富集材料溶液，置于外磁场作用下进行磁场处理，从而达到强化分离富集材料，得到的产物纯度高，无杂质，且具有洁净、节能的特点。

进一步的，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇或乙酸乙酯中之一种或多种。

作为本申请的再一实施方案，提供了一种尿液中糖蛋白及糖肽的富集方法，通过在外加磁场的作用下利用所述富集材料对尿液蛋白的酶切产物进行离心富集。

进一步的，取富集材料与尿液蛋白酶切产物在缓冲液中孵育，在外加磁场作用下获取富集材料，置于含有N-糖苷酶F的氨水中水浴加热。

进一步的，所述尿液蛋白酶切产物通过FASP酶解获得。

进一步的，所述水浴加热条件为45℃～50℃。

进一步的，所述缓冲液为：80％ACN，15％去离子水，5％FA。

作为本申请的又一实施方案，所述富集材料在糖基化蛋白在糖蛋白捕获中的应用也在保护范围内。

所述富集材料与糖蛋白/糖肽中糖基片段的亲水基团基于相似相容原理，可以将糖蛋白/糖肽提取到富集材料上，在经过洗脱即可实现糖蛋白/糖肽的分离。

本发明的有益效果为：

1)由于尿液中糖基化蛋白的丰度有限，易受高丰度非糖基化蛋白质、肽段的干扰，本发明提供了一种富集尿液中糖蛋白和糖肽的富集材料，该富集材料以金属氧化物和壳聚糖形成核壳结构，具有稳定的结构，其壳聚糖分子链上具有丰富的亲水基团，且通过与含有亲水基团的有机配体结合，使得内核和配体均具有亲水能力，相比现有主要通过提高配体的亲水能力的金属有机框架材料，其亲水能力得到的极大的提升，基于相似相容原理，提高了对亲水性糖肽的结合能力，实现了在对低丰度糖基化蛋白的富集。

2)传统富集剂通常需要告诉离心，往往耗时长，且在提取过程中会导致样品的丢失。本申请富集材料以金属氧化Fe₃O₄纳米粒子为作为内核，Fe₃O₄纳米粒子具有良好的顺磁性，通过外加磁场可以减少离心时间，具有更高的选择性、灵敏度及富集效率。

3)本申请Fe₃O₄/壳聚糖磁性复合纳米粒子和富集材料均采用分子自组装技术制备，通过有机溶剂，具有沉积过程和膜结构分子级控制的优点，且简便易行，无须特殊装置，产品纯度高。

附图说明

图1是实施例3～5制备富集材料的热重分析图；

图2是实施例4制备富集材料的磁滞回线图；

图3是未经富集的IgG肽段质谱图；

图4是经富集材料富集后IgG肽段质谱图；

图5是未富集的IgG和BSA混合质谱图；

图6是富集后的IgG和BSA混合质谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本申请的一个具体实施方式中，一种尿液中糖蛋白和糖肽的富集材料，该富集材料包括由金属有机框架及负载于所述金属有机框架上的配体构成，该金属有机框架为Fe₃O₄/壳聚糖的磁性复合纳米粒子，其中壳聚糖包覆与Fe₃O₄纳米粒子表面形成核壳结构；配体为含有至少一个羧基的有机配体，该有机配体选自对苯二甲酸、5,5`-羰基二间苯二甲酸、3-羧基苯硼酸、4-羧基苯硼酸、2,5-嘧啶二羧酸或2,5-吡啶二羧酸中之一种，该配体的羧基与壳聚糖的氨基通过静电作用吸附。

本实施方式中金属有机框架Fe₃O₄/壳聚糖可以通过静电自组装或静电纺丝的方法制备得到。

优选的，采用静电自组装的方法制备金属有机框架Fe₃O₄/壳聚糖的过程如下：

将Fe₃O₄粉末与柠檬酸溶液混合，经超声震荡和漩涡震荡后，取Fe₃O₄悬浮液加入装有双蒸水的试管中，超声震荡获得Fe₃O₄纳米粒子溶胶。将非离子表面活性剂加入到Fe₃O₄纳米粒子溶胶中充分混合，然后将混合液加入壳聚糖溶液中，旋涡震荡后静置于室温环境中，最终产物为澄清透明的Fe₃O₄/壳聚糖复合纳米颗粒溶胶。其中，非离子表面活性剂选自烷基多糖苷、壬基酚聚氧乙烯醚、司盘或吐温中至少一种。

优选的，采用静电纺丝的方法制备金属有机框架Fe₃O₄/壳聚糖的过程如下：

将壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮加入乙醇和甲酸的混合溶液中，超声振荡后，冷却得混合溶液，继续机械搅拌至完全溶胀，作为壳层纺丝液；将Fe₃O₄和聚乙烯吡咯烷酮的混合物在搅拌下加入无水乙醇溶液中，搅拌至完全溶胀，作为芯层纺丝液；用注射器分别抽取上述壳层和芯层纺丝液，使用同轴静电纺丝技术制备复合纳米纤维膜，将收集到的纳米纤维膜真空干燥；将干燥之后的复合纳米纤维膜溶于乙酸溶液中，于室温下搅拌，即得Fe₃O₄/壳聚糖复合纳米颗粒溶胶。

在本实施方式中，本申请富集材料通过Fe₃O₄/壳聚糖磁性复合纳米粒子与有机配体通过静电自组装形成。

具体的，将Fe₃O₄/壳聚糖磁性复合纳米粒子悬于有机溶剂中，然后加入有机配体溶液，室温搅拌自组装。经磁吸附分离、洗涤后，真空干燥后得到富集材料。有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇或乙酸乙酯中之一种或多种。

在本申请的另一具体实施方式中，一种尿液中糖蛋白及糖肽的富集方法，通过在外加磁场的作用下利用所述富集材料对尿液蛋白的酶切产物进行离心富集。

优选的，取磁性富集材料置于bindingbuffer(80％ACN，15％去离子水，5％FA)中清洗，加入尿液蛋白酶切肽段孵育，室温涡旋，在外加磁场作用下，吸去上清液，用bindingbuffer漂洗，置于含有N-糖苷酶F的氨水中45℃～50℃条件下水浴加热，反应液洗脱后取洗脱液浓缩干燥备用。

优选的，还可以取富集材料溶于bindingbuffer(80％ACN，15％去离子水，5％FA)，加入尿蛋白酶解肽段孵育，bindingbuffer清洗3次，用洗脱液(30％ACN，0.1％TFA，69.9％H₂O)洗脱，热干收集的洗脱液，去离子水复溶后加入N-糖苷酶F，脱盐后进行质谱检测。

优选的，上述酶切肽段采用超滤辅助样品制备：

将尿蛋白置于超滤管中加入UA溶解尿蛋白，加DTT混匀置于37℃烘箱变性，离心去除DTT后加UA震荡并离心，加入IAA室温避光静置还原烷基化，离心除去IAA，加入NH₄HCO₃震荡病离心；更换新超滤管加入NH₄HCO₃，按1:100加入胰蛋白酶，37℃培养箱中酶切，再按1:100添加胰蛋白酶，超滤管封口反应；将反应液用去离子水清洗，于45℃浓缩后保存备用。

优选的，上述尿液中蛋白提取过程为：

将人尿液4℃离心取上清，加入到高速离心管中并加入3倍体积的预冷丙酮，在-20℃放置沉淀。取沉淀的蛋白到离心管中，加UA溶解，涡旋，超声，离心取上清进行FASP酶解。

下面结合具体的应用实例对本申请上述实施方式进行说明。

实施例1

本实施例记载了金属有机框架Fe₃O₄/壳聚糖的制备方法。

称量2mgFe₃O₄粉末倒有剩有4ml柠檬酸溶液的试管中，超声震荡5h，然后漩涡震荡1min，用移液枪吸取1mlFe₃O₄悬浮液加入装有4ml双蒸水的试管中，超声震荡1h，获得Fe₃O₄纳米粒子溶胶。吸取250μl壬基酚聚氧乙烯醚加入到1mlFe₃O₄纳米粒子溶胶中，轻微震荡使两者充分混合，然后将混合液加热到1ml质量浓度为0.8mg/ml的壳聚糖溶液中，旋涡震荡4s后静置于室温环境中，最终产物为澄清透明的Fe₃O₄/壳聚糖复合纳米颗粒溶胶。

其中，壬基酚聚氧乙烯醚还可替换为烷基多糖苷、司盘或吐温。

实施例2

本实施例记载了金属有机框架Fe₃O₄/壳聚糖的制备方法。

量取9ml无水乙醇、1ml甲酸置于烧杯中，将装有溶剂的烧杯放在冰水中冷却；称量0.9g聚乙烯吡咯烷酮、0.1g壳聚糖粉末在搅拌下慢慢加到溶剂中，继续搅拌1h至完全溶胀；将烧杯放在水浴中，在回流冷凝下慢慢加热至80℃，振荡24h至完全溶解，聚合物溶液呈透明状，作为壳层纺丝液。

量取10ml无水乙醇置于烧杯中，将装有溶剂的烧杯放在冰水中冷却；称量1gPVP/Fe₃O₄(PVP和Fe₃O₄的质量比为9:1)溶于无水乙醇中，在搅拌下慢慢加到溶剂中，强力机械搅拌1h至完全溶胀，作为芯层纺丝液。

溶液配制好后，用注射器分别抽取5ml的纺丝液，固定在静电纺丝装置上，在流速为0.5ml/h，电压为12kV，接收距离为15cm条件下进行电纺，将收集到的膜50℃干燥2天备用。将干燥之后的复合纳米纤维膜溶于乙酸溶液中，于室温下搅拌，即得金属有机框架Fe₃O₄/壳聚糖。

实施例3

本实施例记载了尿液中糖蛋白/糖肽富集材料的制备方法。

将5g磁性金属有机框架Fe₃O₄/壳聚糖悬于30mL异丙醇中搅拌均匀，机械搅拌下逐滴加入对苯二甲酸溶液20mL，室温持续自组装反应3h，将反应液倒入离心管中，在外加磁场的条件进行离心，用N,N-二甲基甲酰胺和无水乙醇交替洗涤3次、真空干燥后得到目标产物。

实施例4

本实施例记载了尿液中糖蛋白/糖肽富集材料的制备方法。

将3g磁性金属有机框架Fe₃O₄/壳聚糖悬于25mL乙醇中搅拌均匀，机械搅拌下逐滴加入对2,5-嘧啶二羧酸溶液15mL，室温持续自组装反应3h，将反应液倒入离心管中，在外加磁场的条件进行离心，用N,N-二甲基甲酰胺和无水乙醇交替洗涤3次、真空干燥后得到目标产物。

实施例5

本实施例记载了尿液中糖蛋白/糖肽富集材料的制备方法。

将2g磁性金属有机框架Fe₃O₄/壳聚糖悬于20mL乙酸乙酯中搅拌均匀，机械搅拌下逐滴加入5,5`-羰基二间苯二甲酸溶液10mL，室温持续自组装反应3h，将反应液倒入离心管中，在外加磁场的条件进行离心，用N,N-二甲基甲酰胺和无水乙醇交替洗涤3次、真空干燥后得到目标产物。

实施例6磁性能研究

为了探究实施例3～5获得的富集材料的磁性能，本实验例采用STA449CJupiter型热重分析(TGA)仪对3～5获得的富集材料在氮气保护下从35℃升温到300℃的重量损失。结果如图1所示，通过热重分析数据计算得出实施例3～5富集材料的质量百分含量(磁含量)分别约为75％，79％，77％，说明实施例3～5富集材料均具有较好的磁性能，有助于提高后续蛋白分离速率。

采用ModelBHV-525型振动样品磁强计(VSM)分别检测了实施例4获得的富集材料在-18000到18000Oe范围内的磁滞回线(见图2)，说明实施例3～5获得的富集材料都具有超顺磁性，且实施例3～5获得的富集材料磁饱和强度分别为87emu/g，90emu/g，88emu/g。

实施例7

使用标准糖蛋白IgG酶解后的肽段，评价实施例3～5富集材料在N-糖肽HILIC富集和质谱鉴定中应用的可能性。

1)标准蛋白富集

将1mgIgG进行FASP酶解。将蛋白转移至30KD超滤管中，14000g离心10min，然后加入200μL的UA(8M尿素，0.1MTris-HCl，溶液PH＝8.5)14000g离心10min，重复3次；然后加入终浓度为10mM的DTT，37℃烘箱变性4h；14000g离心10min除去DTT，加UA重复离心清洗2次；加入200μL50mMIAA，室温避光40min，还原烷基化；14000g离心10min除去IAA，加200μL50mMNH4HCO3溶液14000g离心10min，重复清洗5次，更换新的套管，加入200μL50mMNH4HCO3溶液，按1:50加入胰蛋白酶，37℃培养箱酶切16h，收集肽段，热干待用。

取1mg富集材料溶于1mLbindingbuffer(80％ACN，15％去离子水，5％FA)，活化10min。取20μL填料分别与IgG肽段(1μg)，IgG肽段与BSA肽段混合液(0.02μg：2μg)，孵育30min；离心，弃上清，加入100μLbindingbuffer清洗3次；使用洗脱液(30％ACN，0.1％TFA，69.9％H₂O)洗脱2-16-第2章新型亲水材料的合成及其在人尿液蛋白质N-糖链肽富集中的应用次。热干收集的洗脱液，复溶后加入100UPNGaseF酶，37℃水浴16h；将样本脱盐MALDI-TOFMS置于样品靶上，加入基质进行质谱分析。

2)人尿蛋白富集

将人尿液12000g，4℃离心20分钟取上清，取10ml加入到高速离心管中并加入3倍体积的预冷丙酮，于-20℃放置沉淀4h。取沉淀的蛋白到离心管中，加UA溶解，涡旋，超声，14000g离心10min取上清进行FASP酶解。

取富集材料1mg溶于60μlbindingbuffer(80％ACN，15％去离子水，5％FA)，各加入40μg人尿蛋白酶解肽段孵育1h，bindingbuffer清洗3次，用洗脱液(30％ACN，0.1％TFA，69.9％H₂O)洗脱2次。热干收集的洗脱液，25mMNH₄HCO₃ ¹⁸O重水复溶后加入100UPNGaseF酶PNGaseF酶切糖，脱盐后进行质谱检测。

结果如图3所示，在未经富集的IgG肽段谱中，可观察到大量的非糖肽，而且信号强度较高，仅鉴定到数信号强度较低的完成N-糖肽。如图4所示，经富集材料富集后，绝大部分非糖肽被有效除去，可鉴定到不同糖型高信噪比的完整N-糖肽，数量和信号强度均得到明显提高。

为了进一步提高富集难度并且更加真实的模拟实际生物样本的复杂程度，将IgG和BSA按质量比1:100混合，再使用富集材料进行富集。

图5和6为IgG和BSA按1:100混合后直接进行MALDI-TOF-MS分析的图谱。未富集前谱图中全部是高丰度的非糖肽信号，检测不到任何N-糖基化肽段(图5)，而富集后绝大部分非糖肽被有效去除，能够检测到多条完整N-糖肽(图6)，这近一步证明了富集材料材料对糖肽富集的高效性。

实施例8

使用本申请亲水富集材料，采用实施例7中相同方法，对正常人尿蛋白酶解产物中的N-糖肽进行HILIC富集。

表1 N-连接内源性糖肽的鉴定数据

三个批次不同的富集材料分别富集并质谱鉴定1036个、953个和937个N-糖基化位点，选择性分别为81％、82％和79％，合计鉴定1246个N-糖基化位点，对应783个N-糖蛋白。与文献报道的949个N-糖基化位点相比，鉴定规模提高31.3％。其中84.6％的N-糖基化位点和83.7％的N-糖蛋白至少在两次实验中重复富集鉴定，说明该材料具有较好的制备稳定性和富集重现性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种尿液中糖蛋白及糖肽富集材料的制备方法，其特征在于，在有机溶剂中使磁性氧化Fe₃O₄/壳聚糖磁性复合纳米粒子与有机配体混合进行自组装，磁分离获得所述富集材料；

所述有机配体负载于所述Fe₃O₄/壳聚糖磁性复合纳米粒子上；所述有机配体为对苯二甲酸、5,5`羰基二间苯二甲酸、3-羧基苯硼酸、4-羧基苯硼酸、2,5-嘧啶二羧酸或2,5-吡啶二羧酸；

所述Fe₃O₄/壳聚糖磁性复合纳米粒子通过在壳聚糖的乙酸溶液中加入改性Fe₃O₄溶胶和非离子表面活性剂混合液得到，所述改性Fe₃O₄溶胶通过将Fe₃O₄微粒在柠檬酸溶液中超声震荡得到。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂选自烷基多糖苷、壬基酚聚氧乙烯醚、司盘或吐温中至少一种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇或乙酸乙酯中之一种或多种。

4.一种尿液中糖蛋白及糖肽的富集方法，其特征在于，在外加磁场的作用下，利用权利要求1制备方法得到的富集材料对尿液蛋白的酶切产物进行离心富集。

5.根据权利要求4所述的一种尿液中糖蛋白及糖肽的富集方法，其特征在于，取富集材料与尿液蛋白酶切产物在缓冲液中孵育，在外加磁场作用下获取富集材料，置于含有 N-糖苷酶F的氨水中水浴加热。

6.根据权利要求5所述的一种尿液中糖蛋白及糖肽的富集方法，其特征在于，所述水浴加热条件为45℃~50℃。