RU1787160C - Способ получени иммуноглобулинового конъюгата - Google Patents

Abstract

Изобретение касаетс  нуклеозидов, в частности получени  иммуноглобулинового конъюгата ф-лы-KJLJ :оссн2сн2ососн2 Jh) О AN обладающего противоопухолевой активностью , что может быть использовано в медицине . Цель - создание нового более активного соединени  указанного класса. Синтез ведут реакцией раствора соединени  ф-лы Ш2 ОССН2СН2ОСОСН2 tЈj) | О N те НО F в диметилформамиде с антителом 007 В при рН 8,6 в водном боратном буфере при соотношении 20,7 моль нуклеозида на моль антитела и температуре 19-20°С в течение 3 ч с последующим выделением полученного конъюгата гель-фильтрацией. Новый конъю- гат обеспечивает более, чем в 2 раза выше известного, ингйбирование роста опухоли при низких нетоксических дозах (до 97% при дозе 2,5-5 мг/кг на 14-ый день после инокулировани ). 2 табл. (Л С

Description

Изобретение относитс  к биологически активным соединени м, а именно к способу получени  нового иммуноглобулинового конъюгата общей формулы I....

гчп2

OCCHjCHjOCOCHj 5

UoV

который обладает противоопухолевой активностью .

Известен способ получени  дифторнук- леозидов, который заключаетс  в раскрытии лактона, получаемого гидролизом алкилово- го эфира 3-диоксоланил-2,2-дигидро-3-гид- роксипропионовой кислоты.

Однако данные соединени  обладают относительно невысокой ингибирующей способностью к некоторым опухол м.

Цель изобретени  - получение нового биологически активного соединени , облах1

со VJ

CN О

ы

дающего повышенной противоопухолевой активностью.

Поставленна  цель достигаетс  конъю- гированием дифторнуклеозида с антителом 007 В при определенных значени х рН, температуры , временного интервала и соотношени  реагентов.

П р и м е р 1. 5 -0-(3-карбокси-1-оксоп- ропил)-2 -диокси-2 , 2 -дифторцитидин.

Сухой Т -диокси-2 , 2 гдифторцитидин (311 мг) добавл ют в сухой этанол и полученную смесь нагревают с обратным холодильником . В течение 0,5 ч част ми добавл ют  нтарный ангидрид (2,5 г) и полученную смесь нагревают с обратным холодильником еще в течение 0,5 ч. Полученную смесь концентрируют в вакууме и полученный в результате продукт пропускают через колонку с силикагелем и провод т злюйрова- ние смес ми 5, 20 и 50% метанола в хлористом метилене. Желаемый продукт . выдел ют из фракции 50% метанола в хлористом метилене, котора  содержит 148 мг материала. Полученный продукт объедин ют с продуктом из аналогичных экспериментов , в результате чего получают всего 253 мг вещества. Это вещество перенос т в 8 мл 0,01 моль раствора ацетата аммони , рН системы устанавливают равным 8,6 с помощью гидроксида аммони  и полученный раствор пропускают через свежеприготовленную колонку с моно-Q анионообмен- ной смолой (фармаци  Инк.). Желаемые фракции объедин ют, замораживают и лиофилизуют . Остаток раствор ют в дистиллированной воде, замораживают и несколько раз лиофилизуют, после чего раствор ют в смеси метанола и бензола, вымораживают и лиофилмзируют, в результате чего получают 60 мг целевого продукта. Спектр протонного ЯМР соответствует структуре желаемого продукта: б7,68, дублет , 1Н/С6, CH-N/j б 6,24, триплет, 1Н/С1, 0-CRH-/; 6,13, дублет, 1Н-С5, .Н-/: д 4,78, синглет, 4 обменивающихс  протона (-ОН, -NH); д 4,2-4,7, муль- типлет, 4 протона (протоны сахара в положени х СЗ , С41 , С51); б 2,60 и 2,73, дублет триплетов, 4 протона (сукцинатные .протоны - СНаСНа-).

П р и м е р 2. Св зывание 5 -0-(3-карбок- си-1-оксопропил)-2 -дезокси-2 ,2 -дифтор- цитидина с антителом 007 В.

25 мг образца (0,069 ммоль) продукта, полученного по примеру 1, раствор ют в смеси бензола и метанола, замораживают и лиофилизуют в общей сложности три раза. Остаток раствор ют в 1 мл сухого диметил- формамида и 4 мл свежедистиллированного.

тетрагидрофурана. Смесь охлаждают до 4°С и добавл ют один эквивалент (0,069 ммоль, 151 микролитр) N-метилморфолина в тетра- гидрофуране. Через 10 мин добавл ют один

эквивалент (0,069 ммоль, 177 микролитов) пробы изобутилхлорформиата в тетрагидро- фуране. После перемешивани  в течение 20 мин при 4°С добавл ли один эквивалент (0,069 ммоль, 248 микролитров) М-оксисукцинимида .- Перемешивание продолжают 20 мин при 4°С и 3 ч при комнатной температуре . Раствор концентрируют в вакууме и оставл ют на ночь в вакууме,

Активированный сложный эфир, полученный на предыдущем этапе (31,7 мг, 0,069 ммоль, 460 г/моль, максимальное теоретическое значение), раствор ют в 4,18 мл сухого диметилформамида. Антитело 007В получают субклонированием

линии клеток, продуцирующих опубликованное антитело KS1/4 и отбором вариантных гибридных клонов, которые продуцируют только релевантное lgG2a моноклональное антитело KS1/4, а не неродственный белок lgG1. Такие клоны выращивают в клеточной культуре традиционными методами, чтобы получить антитело 007 В. 500 миллиграммов антитела 007 В (мол. вес 150000, 500 мг 3,33 х моль) в

боратном буфере с рН 8,6 помещают в колбы с круглым дном и добавл ют раствор активированного сложного эфира в течение 10 мин, реакционную смесь перемешивают 3 ч в темноте, устанавливают рН 7,4 однонормальной хлористоводородной кислотой и центрифугируют в течение 10 мин при 2000 оборотах в минуту. Насадочный слой раздел ют пополам и каждую часть помещают в колонку с биогелем Р-6 и элюируют

физиологическим раствором, стабилизированным фосфатным буфером (PBS) при рН 7,4. Св занные пики собирают в три фракции от каждой части. Одинаковые фракции смешивают от двух погонов. Объединенные вторые фракции концентрируют до трех мл, разбавл ют с помощью PBS и получают раствор с концентрацией 25,44 мг/мл в общем объеме 13,29 мл. Выделенный белок составил 338 мг (67,6% выход белка) и

мол рное отношение нуклеозида к белку составило 4:1. Продукт стерилизуют и используют в дальнейших экспериментах.

Ингибирование P3-VCLA аденокарци- номы у самцов голых мышей определ ли

стандартными способами. Заражение мышей осуществл ли в нулевой день, испытуемые соединени  (нуклеозид по примеру 1 и конъюгат по примеру 2) вводили внутривенно на 2, 4 и Одень, а оценку результатов

Ингибирование P3-VCLA аденокарциномы у голых мышей

Дозу вводили внутривенно на 2,4 и 8 день, Инокулирование клеток в день 0; оценка - в день 14 и 21. Дозу в примере 2 рассчитывали в мг/кг родственного нуклеозида

Таблица 2

Продолжение табл.2