SU1069628A3 - Способ получени коньюгата - Google Patents

Abstract

СПОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЬЮГАТА на основе.иммуноглобулина или его фрагмента, ковалентно св занного с 1.-5 группами формулы

Description

Изобретение относитс  к способам получени  нового коньюгата на основ иммуноглобулина, обладающего против раковой активностью. Известна реакци  ацилировани  пе тидов аэидамикислот 111 , Цель изобретени  - получение нового иммуноглобулинового коньюгата, обладай цего ценными, противораковыми сврйстёами. Поставленна  цель лостигаетс  тем, что согласно способу, основанно на реакции получени  коньюгата на о нове иммуноглобулина IgG или его фрагмента, ковалентно св занного с 1-5 группами формулы ОН -C2ll5 I 0 0СНз иммуноглобулин IgG или его фрагмент подвергают взаимодействию с соответ ствуюдим мол рным количеством азида дезацетилвинбластиновой кислоты при рН 8,5-9,5 и 5-25 С. При проведении реакции раствор азида в подход щем растворителе, таком как-диоксан, медленно по капл м добавл ют к буферному раствору иммуноглобулина, например в 0,35 Mr боратном буфере при рН 9. Коньюгат выдел ют методом гелевой фильтрации и хран т в насыщенном растворе суль фата аммони , который можно легко Вернуть в исходное состо ние путем диализа с помощью боратного буфера, или его можно сохранить в холодильнике при или в ,замороженном сое тойнии, например при - . В результате происходит образование ковалентной св зи между одной или более винса-фрагментами и свободным аминогруппами иммуноглобулиновой мо лекулы, например аминогруппами лизи новых остатков. Число присоединенны фрагментов зависит от концентрации реагентов и продолжительности реакции , однако обычно оно составл ет величину пор дка 1,2-5. Азидный реагент может быть легко получен из винбластина, сульфата винбластина или из дезацетилвинблас тина путем предпочтительного ги раз нолиза с -эфира с последующим диазо тированием. Гидразинолиз винбластин при умеренных температурах в растворе метанола протекает с образованием преимущественно моногидразида, и реакци  такого продукта при с сол ной кислотой и нитритом натри  в подход щем водном растворителе дает желаемый азид дезацетилвинбластиновой кислоты. Указанный азид может быть получен при температурах ниже согласно указанному и без выделени  азида,рН устанавливают равным 9 и добавл ют смешивакмцийс  с водой растворитель, например такой как диоксан. Затем добавл ют иммуноглобулин в боратном буфере, имеющем рН 9, и температуре реакционной смеси дают повышатьс  до комнатной. Избыток азнда разрушают разбавленнымаммиаком, и коньюгат очищают гель-фильтрацией, они могут находит применение в лечении животных , а также в контрольных и аналитических экспериментах. В качестве исходных иммуноглобулинов могут служить следунвдие вещества: IgG коз и овец, иммунизированных карционоэмбрионным -антигеном, IgG острой лимфобластической лейкемической антисыворотки кроликов, IgG из антисыворотки различных приматов, предназначенной против ост рой лимфобластической лейкемии, острой миелобластической лейкемии, хронической лимфобластической лейкемии и хронической гранулоцитоксической лейкемии, }IgG коз и овец, иммунизированных веществом, вызывакидим рак легких; моноклональный IgG из гибридомассы мышей-, секретирующей античеловеческие карцкномные антитела; -моноклональны. IgG из гибридомассы мышей, секретирующей античеловеческие меланомные антитела; моноклональный IgG,гибридомассы мышей, -секретирун ций антитела, реагирующие с клеткс1ми человеческой лейкемии ; моноклональный IgG гибридомассы мышей, секретирун ций антитела, реагирующие с человеческими нейробластомными клетками; моноклональный.IgGгибридомассы мышей, секретирующий антитела, реагирующие с человеческими грудными раковыми антителами: моноклональный IgG гибридомассы мышей, секретирующий антитела, реагирующие с  ичниковыми раковыми ; клетк:ами человека; моноклональный IgG гибридомассы машей, секретирукщий антитела, реагирую1цие с остеосаркомными раковыми Клетками людей. Как указывалось,Предлагаекий коньюгат может бытьтакже получен с помощью иммуноглобулиновых фрагментов , таких как ГаВ, ГаВ или Г(аВ)2 или IgM мономер, полученный из антитела , например путем протеолитического энзимного расщеплени . Такие вещества и методы их получени  хорошо известны. Коньюгаты, получаемые по предлагаемому способу, могут найти применение в лечениираковых опухолей, Коньюгаты эффективны в широком диапазоне доз и могут примен тьс  дл  лечени  взрослых пациентов в дозе 1-10 мг/кг (виденсиновый фрагмент ), обычно в интервале 3-9 мг/кг П р и м е р 1. Получение овечьего виндесин-антикарциноэмбрионного антигенного коньюгата. Гидрайид дезацетилвинбластиновой кислоты (6 мг) раствор ют в IN растворе НС1 (340 мл) и полученный раствор охлаждают до 4°С. 60 мкл водного раствора нитрита натри, имеющего концентрацию 10 мг/мл,, добавл ют к полученной бмеси и ее перемешивают при 4с. Через 5 мин при интенсивном перемешивании добавл ют IN раствор NaOH (300 мл) и диоксан (120 мл), после чего внос т 280 мл раствора овечьего антикарциноэмбригенного антигена , имеющего концентрацию 21,3 мг/мл. в среде боратного буфера с. концентрацией 0,34 М-при рН 8,6. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2ч. поддержива  рН 9 с использованием б,,IN раствора NaOH. Избыток азида разрушают путем добавлени  IN раств -ра аммиака (60 мл) при перемешивании в течение часа. Полученный продукт выдел ют методом гель-фильтрации на колонке размерами 1к25,5 см (20 мп.) с: био-гелем Р-6, уравновешенным фос фатным буферным физиологическим рас вором. Исключенный пик собирают (2,66 мл) и определ ют в нем содержание протеина по методу Лоури и со держание виндесина методом разностной спектроскопии. Полученный таким Образом коньюгат содер)р1т 4,6 моль . ви.нденсина на моль IgG. Пример 2. Получение мьлдино го винденсин-моноклонального антикарцйоноэмбрионного антигенного коньюгата. Гидраэид дезацетилвинбластиновой кислоты (10 ME) раствор ют вIN сол  ной кислоте (0,56 мл) и полученный раствор охлаждают до 4с. 100 мкл paqTBd a нитрита натри  с концентрацией 10 мг/мл добавл ют к реакцион«НОЙ смеси и последнюю, перемешивают при 4°С. Через 5 мин при интенсивном перемешивании дЬбавл ют IN раствор едкого натра (0,5 мл) и диоксан (0,2 мл), после чего добавл ют 0,5 м раствора мьпииного моноклонального антикарционо-эмбрионного антигена, имеющего концентрацию 15,6 мг/мл в растворе 0,34 боратного буфера при рН 8,6. Полученную смесь перемешивают при комнатной -температуре в течение 2 ч, поддержива  при этом рН 9 путем добавлени  О,IN раствора едкого натра. Избыток азида разрушают добавлением IN раствора гидроокиси аммони  (0,1 мл) и перемешиванием еще в течение часа. Продукт реакции выдел ют методом гель-фильтрации на колонне размерами 1л27 см (21 мл) с био-гелем Р-6, уравновешенным фосфатным буферным физиологическим раствором . Исключенный пик собирают (4,07 мл) и определ ют содержание в нем протеина и виндесина методом спектроскопии при 270 и 280 нм..Полученный таким образом коньюгат содержит 2,1 моль виндесина на моль IgG. Пример 3. Получение кроличьего виндесин-противомышиного IgG коньюгата. Гидразид деаацетилвинбластиновой кислоты (12 мг) раствор ют в IN сол ной кислоте (0,67 мл) и полученный раствор охлаждают до 4С. Добавл ю 120 мкм раствора нитрита натри  с концентрацией 10 мг/мл и реакционную смесь перемешивают при . Через 5 мин при интенсивном перемешивании добавл ют IN раствор едкого натра (0,6) и диоксан (0,24 мл), после чего добавл ют 1,0 мл раствора кроличьего антимышиного IgG с концентрацией 11,7 мг/мл в 0,34 М растворе боратного буфера при рН 8.6. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, поддержива  при этом рН 9 с использованием О,IN раствора едкого натра. Избыток азида разрушают добавлением IN раствора гидроокиси аммони  (0,12 мл) и перемешиванием в течение часа. Продукт реакции выдел ют методом гельфильтрации на колонке размерами 1,526 см (46 мл) с био-гелем Р-6, уравновешенным, фосфатным буферным физиологическим раствором. Исключенный пик собирают (6,22 мл) и определ ют в нем содержание протеина и виндесина методом спектроскопии при 270 и 280 нм. Полученный таким образом коньюгат содержит 3,2 моль виндесина на моль IgG. Пример 4. Препарат клеток, выращенных в культуральной среде, переливают в тарелки с микротитрованной культурой, содержащей 10 клеток на стенку. После укоренени  клеток в течение 24 ч отогнутые стенки обрабатывают различными концентраци ми коньюгата или контрольным соединением . Через 6 дн. культивировани  число клеток, наход щихс  на стенках, оценивают непосредственным подсчетом с использованием видового анализатора , присоединенного к микроскопу.

Семейство аденокарционных клеток толстой кишки человека обрабатывают виндесином, св занным с моноклональньом антикарцинозмбрионным антигеном

Концентраци 

Число клеток в расчете : на стейку через б дн. коньюгирован (среднее значение + ного вещества (виндесин,мкг/мл) стандартное отклонение), 4 повторени 

в Кюл рном соотношении, равном 2,1 моль виндесина на моль IgG (коньюгат примера 2), и цитостатический эффект измер ют путем подсчета клеток.

Результаты опытов приведены в таблице.

%, по отнс пению к контролю

1б,3±4,8-10

13,8±2,5-10

12,6±1,9--10

10,,9-10

1,94:0,6-10

100

84,6

77,4

66,7

11,9

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА на основе.иммуноглобулина или его фрагмента, ковалентно связанного с 1-5 группами формулы отличающийся тем, что иммуноглобулин 3gG или его фрагмент подвергают взаимодействию с соответствующим молярным количеством азида дезацетилвинбластиновой кислоты при pH 8,5-9,5 и температуре 5-25°С.