CN1384886A - 单克隆抗体、杂交瘤、免疫测定法和诊断试剂盒 - Google Patents
单克隆抗体、杂交瘤、免疫测定法和诊断试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1384886A CN1384886A CN00815122A CN00815122A CN1384886A CN 1384886 A CN1384886 A CN 1384886A CN 00815122 A CN00815122 A CN 00815122A CN 00815122 A CN00815122 A CN 00815122A CN 1384886 A CN1384886 A CN 1384886A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- helicobacter pylori
- present
- antibody
- hybridoma
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/121—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Helicobacter (Campylobacter) (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56922—Campylobacter
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/908—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种诊断方法,通过它可经济的诊断幽门螺杆菌感染,而不对病人造成任何痛苦和借助任何特殊装置。由于在该方法中使用了一种抗体,可实现高度特异性,而不显示任何交叉反应性在批与批之间产生的差异,从而便于质量控制。而且可在使用简单的单克隆抗体的情况下也可实现高灵敏度。本发明还提供了一种以幽门螺杆菌过氧化氢酶为抗原的单克隆抗体。
Description
技术领域
本发明涉及识别作为抗原的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)过氧化氢酶的单克隆抗体,一种产生所述单克隆抗体的杂交瘤,一种免疫测定法和诊断试剂盒。
背景技术
幽门螺杆菌是一种在人胃粘膜中发现的细菌。幽门螺杆菌感染率与社会和经济因素密切相关,在发展中国家中较高,而在发达国家中较低。然而在发达国家中,日本的感染率特别高,甚至有报道80%的40至40岁以上的人被感染过。近年来,已揭示幽门螺杆菌可导致各种胃和十二指肠疾病,如胃溃疡、十二指肠溃疡、慢性胃炎和更严重的胃癌。
由于证实可通过根除幽门螺杆菌减少被这些疾病折磨的可能性,对根除幽门螺杆菌针对的疾病已进行了国际讨论。因此,目前认为这种根除所针对的疾病包括胃溃疡、十二指肠溃疡、恶性胃淋巴瘤、早期胃癌切除后的剩余胃。
鉴于幽门螺杆菌根除治疗是治疗胃和十二指肠疾病的一种新方法,日本胃肠道病学学会已提出了治疗试验的指导原则和诊断幽门螺杆菌感染发生,和判断细菌根除的方法(The Japanese Journal of Gastroenterology,vol.96,199-207,1999)。根据上述治疗试验的指导原则,指出对发生的诊断应基于侵袭性测试法,即培养胃部的活组织标本,显微镜检和尿素酶测试来进行,而对细菌根除的判断主要需要培养胃部的活组织标本,显微镜检和尿素呼气测试,它是非侵袭性试验。在特殊情况下,例如在儿科病人中,它指出这种判断应基于结合血液中的抗幽门螺杆菌抗体和发生性诊断进行。
然而这些幽门螺杆菌感染的测试法有下列问题。侵袭性测试法在胃镜插入和活组织检查时给病人带来很大的痛苦。对于非侵袭性测试法,病人中的疼痛感大大减少,但是尿素呼气测试需要在测试前禁食。另外,在进行尿素呼气测试时,需要质谱仪、红外分光光度计等仪器,因此测试仅能在特别的机构中进行,而导致的高成本也是个缺点。抗体测试不适合判断细菌的根除,因为血液中的抗体滴度在细菌根除后的很长一段时间内仍然维持在高水平。因此,期待一种非侵袭性测试法的到来,它能代替上述测试法,并可直接和特异性的以高准确度检测幽门螺杆菌感染。
在本领域内,采用选择培养基培养分离了来自消化道排泄物,特别是粪便的感染性细菌的培养物,作为消化道内感染性细菌的直接测试法。然而,对于幽门螺杆菌,虽然进行了大量试验,对于通过培养分离来自粪便的幽门螺杆菌几乎没有报道。可能的原因是该微生物在下消化道中已经经过转化,成为粒状体,不能通过培养分离,因为幽门螺杆菌在体外经过形态变化,从原来的螺旋形变成了球菌形,它无法在不理想的环境条件,如低温、营养缺陷和氧缺陷下培养。
另一方面,对于用基于抗原-抗体反应的免疫学方法直接从粪便中检测幽门螺杆菌,有一篇报道通过使用针对幽门螺杆菌的多克隆抗体检测排泄物标本,如粪便中的幽门螺杆菌(J.Clin.Microbiol.,vol.33,2162-2165,1995;日本专利公开出版物号平-10-10128(JP3043999))。
然而,多克隆抗体通常具有交叉反应性,在特异性上较差,另外,缺点还在于抗体滴度和特异性可以随抗血清的批次而变化。因此,问题在于使用多克隆抗体的诊断测试特别难于控制质量。事实上,对于检测粪便中幽门螺杆菌抗原的“HpSA”试剂盒(Meridian的产品,日本3043999号的专利人),和其中使用的多克隆抗体,已提出了遇到假阳性事件和低特异性的问题(Medical Tribune,4-5,1999年6月3日号;Am J.Gastroenterol.,94卷,1830-1833,1999)。
相反,在日本专利公开出版物号平-10-10128中描述了由于幽门螺杆菌易于变异,仅能与各抗原单独反应的单克隆抗体不适用于检测幽门螺杆菌,但是可与各种抗原或表位反应的多克隆抗体反而适合检测幽门螺杆菌。
发明简述
根据上述现有技术,本发明的目的是提供一种诊断方法,通过它可以低成本的诊断幽门螺杆菌感染,而且不对病人造成痛苦,也不需要特别的装置,而且由于使用了一种抗体,没有交叉反应性,特异性良好,在批与批之间没有变化,便于质量控制,而且当使用一种单克隆抗体时,也显示良好的灵敏度。
本发明提供了一种识别作为抗原的幽门螺杆菌过氧化氢酶的单克隆抗体。
本发明提供了一种杂交瘤,它产生识别作为抗原的幽门螺杆菌过氧化氢酶的单克隆抗体。
本发明的杂交瘤优选是21G2(FERM BP-7336)、41A5(FERM BP-7337)或82B9(FERM BP-7338)。
由本发明的杂交瘤产生的单克隆抗体构成了本发明的一个方面。
用至少一种本发明的单克隆抗体进行的免疫测定法构成了本发明的一个方面。
本发明的免疫测定法优选用任何一种上述提到的单克隆抗体进行。
本发明的免疫测定法优选用于判断幽门螺杆菌感染。
本发明的免疫测定法的标本优选是消化道排泄物。
本发明的免疫测定法优选用ELISA或免疫层析技术进行。
含有至少一种本发明的单克隆抗体的诊断试剂盒也构成了本发明的一个方面。
本发明的诊断试剂盒优选含有任何一种上述的单克隆抗体。
本发明的诊断试剂盒优选用于判断幽门螺杆菌感染。
本发明的诊断试剂盒标本优选是消化道排泄物。
本发明的诊断试剂盒优选用ELISA或免疫层析技术进行。
本文所称的过氧化氢酶不含有对应于通过变性剂,如SDS变性、分离或立体结构解旋后得到的亚基的那些蛋白质。
附图简述
图1说明了实施例9观察到的亲和层析柱的洗脱曲线。
图2说明了实施例11观察到的亲和层析的洗脱曲线。
发明详述
在下文中详细描述了本发明。
本发明的单克隆抗体识别幽门螺杆菌作为抗原。
本发明的单克隆抗体可通过本发明的杂交瘤产生,因此是可以从培养本发明的杂交瘤的培养液中获得的。然而,产生本发明的单克隆抗体的方法不受特别限制,但如果基因工程化的抗体如能与幽门螺杆菌过氧化氢酶特异性结合,它也在本发明的范围内。
本发明的杂交瘤产生识别幽门螺杆菌过氧化氢酶作为抗原的单克隆抗体,并可通过经幽门螺杆菌免疫的动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合获得。
本发明的杂交瘤可以用本领域已知的细胞融合技术产生。因此,用幽门螺杆菌作为免疫原免疫除了人以外的动物,将该动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合,产生杂交瘤,从其选出产生识别幽门螺杆菌的单克隆抗体的杂交瘤,从而获得了本发明的杂交瘤。
上述免疫原不受特别限制,但是可以是任何含有幽门螺杆菌过氧化氢酶的免疫原。因此例如可能提到通过在合适的培养基上培养幽门螺杆菌菌株,培养物可获得螺旋形的细胞、球形的细胞、破裂产物、裂解产物或这些细胞的抽提物及其片段。
上述过氧化氢酶不受特别限制,但可以是例如:灭活的、具有部分破坏的立体结构的、或部分缺失的。然而,优选具有四个亚基的,更优选天然的。
本文所用的术语“天然酶”指维持在近似生理条件下发现的固有结构,从而具有全部亚基和活性的酶。
在上述提到的免疫原中,优选球菌的破碎产物。因为在体外,幽门螺杆菌形态从原来的螺旋形变成球形,不能被培养,在低温、营养缺陷、氧缺陷等不良环境条件下不能被培养,因此认为它转化成球菌型,不能培养分离,在消化道排泄物中也一样。还认为幽门螺杆菌细胞在下消化道中以破碎形式存在。
用作上述免疫原的幽门螺杆菌菌株不受特别限制,但包括例如:ATCC 43504和NCTC 11638,它们是标准菌株,还包括其他从感染的病人分离的菌株。用作上述免疫原的幽门螺杆菌基因型不受特别限制。因此例如它可以具有或不具有vacA或cagA,另外,vacA可以具有序列S1a、S1b和S2任一,并具有序列m1和m2任一。
经免疫产生本发明的杂交瘤的动物不受特别限制,但包括例如:山羊、绵羊、豚鼠、小鼠、大鼠和家兔。在其中优选的是小鼠。
可用任何本领域已知的方法免疫上述要免疫的动物。在免疫小鼠中,例如,可能提到方法包括将1-100微克,优选50-100微克/剂的免疫抗原乳化在等体积(0.1毫升)生理盐水和弗氏完全佐剂,或RIBI佐剂系统中,将该乳液施给上述动物,在背侧或腹部位皮下免疫,或每隔2-3周腹膜内免疫3-6次。
在本发明的实践中,免疫上述动物后选择抗体滴度高的个体,最后一次加强免疫3-5日后切下它们每一只的脾脏或淋巴结,将这些组织中所含的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞通过本领域已知的细胞融合法,在融合促进剂存在下融合。
上述融合促进剂不受特别限制,但包括例如聚乙二醇(下文称为“PEG”),仙台病毒等。然而PEG是优选的。
上述骨髓瘤细胞不受特别限制,但包括例如小鼠衍生的细胞,例如P3U1、NS-1和P3x63.Ag8.653细胞;和大鼠衍生的细胞,例如AG1和AG2细胞。
上述细胞融合方法不受特别限制,但可以包括方法:以1∶1-10∶1之比混合脾细胞和骨髓瘤细胞,加入分子量为1,000-6,000的PEG至浓度10-80%,在20-37℃,优选30-37℃下孵育该混合物3-10分钟。
在本发明的实施中,产生识别幽门螺杆菌的单克隆抗体的杂交瘤的选择可通过例如在杂交瘤单独能生长的选择培养基(如HAT培养基)上培养杂交瘤,并用酶联免疫吸附分析(ELISA)法测定各杂交瘤培养上清液中的抗体活性来进行。另外,在本发明中,可通过限制性稀释等方法重复克隆产生识别幽门螺杆菌的单克隆抗体的杂交瘤,从而实现能产生识别幽门螺杆菌的单克隆抗体的杂交瘤的建立。
作为本发明的杂交瘤,提到例如21G2(保藏号FERM BP-7336)、41A5(保藏号FERM BP-7337)和82B9(保藏号FERM BP-7338)。这些杂交瘤于1999年8月14日被保藏在工业科学技术局,国立生命科学和人体技术研究所(1-3 Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,Japan)。
大量制备本发明的单克隆抗体的方法不受特别限制,方法可以是:例如将杂交瘤移植到预先施用降植烷的小鼠腹腔中,回收腹水并从其获得抗体。可通过本领域已知的方法,用蛋白A柱或蛋白G柱等纯化腹水中的单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体识别过氧化氢酶作为抗原。
上述过氧化氢酶不受特别限制,但可以是任何保留表位的。例如,可以是灭活的、具有部分破坏的立体结构的、或部分缺失得到的。然而,优选具有4个亚基的,更优选天然的。上述过氧化氢酶包括那些有一个突变的酶等。
产生上述过氧化氢酶的幽门螺杆菌菌株不受特别限制。
产生上述过氧化氢酶的幽门螺杆菌的基因型也不受特别限制。例如,它可以具有或不具有vacA或cagA,而且vacA可以是序列S1a、S1b和S2任一,并可具有序列m1和m2任一。
上述产生过氧化氢酶的幽门螺杆菌的形态不受特别限制,但包括例如:幽门螺杆菌的螺旋状形式和幽门螺杆菌的球菌形式。
本发明的单克隆抗体的家族和亚家族不受特别限制,但可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA1、IgA2和IgD任一。L链也不受特别限制,但可以是λ链或κ链。
本发明的单克隆抗体不受特别限制,但可以是任何能与幽门螺杆菌过氧化氢酶特异性结合的抗体。例如,可以是F(ab’)2、Fab’或Fab,它是本发明单克隆抗体的降解产物,或嵌合抗体。
上述杂交瘤株21G2(保藏号FERM BP-7336)、41A5(保藏号FERM BP-7337)和82B9(保藏号FERM BP-7338)分别产生单克隆抗体(下文有时分别称为“单克隆抗体21G2”、“单克隆抗体41A5”和“单克隆抗体82B9”),它们识别天然类型的幽门螺杆菌过氧化氢酶。
本发明人用单克隆抗体21G2、单克隆抗体41A5和单克隆抗体82B9分别对幽门螺杆菌细胞破碎产物进行了固定化抗体的亲和层析,随后检测到包含在幽门螺杆菌破碎产物中的分子量为270kDa的蛋白。在用SDS-聚丙烯酰胺凝胶对该蛋白电泳后,检测到分子量为59kDa的单一条带。测序后,该蛋白的N-末端氨基酸与幽门螺杆菌过氧化氢酶的氨基酸序列相符。已知幽门螺杆菌过氧化氢酶具有200kDa的分子量,并具有分子量各为50kDa的4个亚基的四聚体结构(J.Gen.Microbiol.(1991),137,57-61)。
因此基于上述结果,用单克隆抗体21G2、单克隆抗体41A5和单克隆抗体82B9检测到的蛋白质被鉴定为具有4个亚基的幽门螺杆菌过氧化氢酶,并揭示每一种上述抗体都识别具有4个亚基的过氧化氢酶。
过氧化氢酶活性试验揭示上述固定化抗体的亲和层析中检测到的过氧化氢酶具有活性,该过氧化氢酶是所谓的天然酶。
单克隆抗体21G2、单克隆抗体41A5和单克隆抗体82B9都不与解离得到的过氧化氢酶亚基反应。
粗略的根据纯化过氧化氢酶过程中比活力的增加计算,过氧化氢酶占幽门螺杆菌中全蛋白的比例最多是0.5%,如J.Gen.Microbiol.(1991),137,57-61所述。
根据该观点,令人惊奇而且出乎意料的发现单克隆抗体21G2、单克隆抗体41A5和单克隆抗体82B9可以识别具有4个亚基的过氧化氢酶。
过氧化氢酶在不同的生物中都是非常保守的,已知幽门螺杆菌过氧化氢酶与其他细菌过氧化氢酶种类也高度同源(J Bacteriol.(1996),178(23),6960-6967)。然而如实施例3中所示,单克隆抗体21G2、单克隆抗体41A5和单克隆抗体82B9完全不与除了幽门螺杆菌以外的其他细菌菌株衍生的过氧化氢酶反应。
虽然也已知存在各种幽门螺杆菌突变株(Molecular Microbiology(1996),20,833-842),单克隆抗体21G2、单克隆抗体41A5和单克隆抗体82B9令人惊奇的与所有幽门螺杆菌菌株反应良好,如实施例3所示。
根据本发明的单克隆抗体与各种幽门螺杆菌突变株反应良好的事实,被本发明的单克隆抗体识别的表位似乎是在突变株内的过氧化氢酶非常保守的位点。
在下文详述中,本发明的单克隆抗体可以用于以粪便作为样品来判断幽门螺杆菌感染的存在与否,准确率非常高。
用单克隆抗体21G2、单克隆抗体41A5和单克隆抗体82B9对粪便样品进行免疫测定。上述单克隆抗体都仅与感染有幽门螺杆菌的个体的粪便反应。因此,揭示了具有4个亚基的幽门螺杆菌过氧化氢酶存在于感染有幽门螺杆菌的个体粪便中。本领域尚未清楚存在于粪便中的幽门螺杆菌过氧化氢酶尚未解离成各个亚基,而维持4亚基状态。根据蛋白质通常被消化道中的蛋白酶消化的事实来看,这是非常令人惊讶的。
通过固定化单克隆抗体21G2制备了层析柱,将患有幽门螺杆菌的人粪便作为样品进行亲和层析,并用洗脱组分进行ELISA和过氧化氢酶活性测定。过氧化氢酶活性与抗原性一致。
根据上文,揭示了被幽门螺杆菌感染的人粪便中含有具有4个亚基和有过氧化氢酶活性的天然过氧化氢酶。十分出乎意料的是幽门螺杆菌过氧化氢酶在消化道中不被消化,而是以具有活性的天然酶形式被排泄,因此出现在粪便中。
在日本公开出版物号平-09-322772和Infect.Immun.(1997),65,4668-4674中,公开了单克隆抗体,它们与对应于通过SDS-PAGE变性和解离幽门螺杆菌过氧化氢酶获得的各解旋亚基的蛋白质反应。然而,不清楚这些单克隆抗体是否与维持立体结构并具有活性的天然过氧化氢酶反应,或是否能检测排泄物标本,如粪便中的幽门螺杆菌。
相反,本发明的单克隆抗体可以用消化道排泄物,如便于收集的粪便作为标本识别幽门螺杆菌感染的存在与否。
本发明的单克隆抗体的应用领域不受特别限制,但能用于免疫测定,用于判断幽门螺杆菌感染。
本发明的免疫测定法用至少一种本发明的单克隆抗体进行,方法可仅用一种抗体进行。
通常作为用于免疫测定方法的单克隆抗体,考虑灵敏度高超的单克隆抗体作为优选抗体,因为与特异性低而背景噪声高的多克隆抗体相比较,特异性高而背景噪声低。
然而已知幽门螺杆菌存在各种突变体。因此已考虑用一种单克隆抗体检测感染或存在非常困难。如日本公开出版物号平-10-10128所述,也有一种观点认为可以与各种抗原反应的多克隆抗体更适合检测具有各种抗原的细菌菌种的感染或存在。另外,已公开了(WO 00/26671)用多种多克隆抗体检测幽门螺杆菌的方法。然而,还未开发出任何用一种多克隆抗体检测幽门螺杆菌的方法。
相反,令人惊奇的是发现本发明的单克隆抗体能以非常高的准确率,用一种抗体检测幽门螺杆菌。
WO 00/26671中所述的单克隆抗体识别尿素酶、热休克蛋白、碱性过氧化氢酶还原酶、20kDa蛋白(3-脱氢激酶2型)、16.9kDa蛋白(亲核激活蛋白)和33.8kDa蛋白(果糖-二磷酸酶醛缩酶)作为抗原。完全未提到过氧化氢酶。WO 00/26671中所述的试验方法在检测灵敏度上不能令人满意。
作为本发明的免疫测定法,提到例如酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹、免疫层析等技术。上述各种免疫测定法可用于以竞争法或夹心法,用标记物标记的抗原或抗体测定靶抗原或抗体。
在上述各种免疫测定法中,ELISA和免疫层析技术是优选的。
上述竞争性方法基于例如:测试标本中幽门螺杆菌过氧化氢酶和已知量的标记的幽门螺杆菌过氧化氢酶与本发明的单克隆抗体定量竞争性结合反应。在上述特别提到的竞争性方法中,在含有幽门螺杆菌过氧化氢酶的标本溶液中加入预定量的固定在载体上的抗体和预定量的用标记剂标记的幽门螺杆菌过氧化氢酶。然后,测定保留在载体上的标记剂活性或未保留在载体上的标记剂活性。对此,优选几乎同时加入抗体和标记抗原。
上述夹心法包括例如:将幽门螺杆菌过氧化氢酶夹在本发明固定的单克隆抗体和用标记剂标记的本发明的单克隆抗体之间,然后加入针对标记物(例如酶)的底物等,显示颜色等,从而检测了标本中的幽门螺杆菌过氧化氢酶。
对于上述标记剂,提到放射性同位素(下文缩写成“RI”),例如125I、酶、酶底物、磷光物质、荧光物质、生物素和着色物质。在将这些标记剂与抗原或抗体结合中,可使用马来酰亚胺法[J.Biochem.(1976),79,233],活化生物素法[J.Am.Chem.Soc.(1978),100,3585]或疏水键法。
对于上述提到的酶,提到例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。对于用于该场合的底物,可选择适合该场合所用的酶的底物,提到例如:ABTS、鲁米诺-H2O2、o-苯二胺-H2O2(针对过氧化物酶)、磷酸对硝基苯酯、磷酸甲基繖形酯、3-(2’-螺环金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷(针对碱性磷酸酶)、对硝基苯基-β-D-半乳糖(针对β-半乳糖苷酶)。
可在4-40℃反应1分钟-18小时,然后测定结果显示的颜色或荧光、磷光或显色量,进行上述试验。另外,可使用所谓的速率试验,它在4-40℃范围内保温进行。
用市售的Bolton-Hunter试剂可方便的进行对上述抗原或抗体的放射性标记。例如,可通过将Bolton-Hunter试剂加到溶液中(该溶剂是通过将抗原或抗体溶于0.1M碳酸氢钠水溶液中制备的),然后经过1-2小时,用G-25脱盐柱等除去未反应的Bolton-Hunter试剂部分。
另外,可使用氯亚明T法、碘原法等,方便的进行125I放射性标记。
如上述磷光物质,可提到例如异鲁米诺和吖啶酯,如上述荧光物质,可提到例如荧光素和罗丹明。就此,可方便的使用活化酯法或异氰酸酯法(“酶免疫测定技术”,Igaku Shoin1987年出版)进行标记。对于上述着色物质,可提到例如着色乳胶颗粒和胶体金。
为了用上述竞争性方法进行本发明的免疫测定法,在本发明的单克隆抗体通过已知方法物理或化学结合的固相中加入含有未知量的幽门螺杆菌过氧化氢酶标本,使反应进行。同时,加入用标记剂标记的预定量的幽门螺杆菌过氧化氢酶,使反应进行。
在用上述夹心法实施本发明的免疫测定法中,将本发明中的单克隆抗体通过已知方法物理或化学结合于固相上加入含有未知量的幽门螺杆菌过氧化氢酶的标本中,使反应进行。然后,加入用标记剂标记的本发明的单克隆抗体,使反应进行。
然后在两种情况下,如需要充分洗涤固相,测量与标记试剂结合的活性。当上述标记剂是RI时,用孔计数器或液相闪烁计数器进行测定。当标记剂是酶时,加入底物,在染色后用比色和荧光测定酶活性。当标记剂是荧光物质、磷光物质或着色物质时,可分别通过本领域已知的方法进行测量。
本发明的免疫测定法使用本发明的单克隆抗体,因此具有杰出的特性,即可识别存在于幽门螺杆菌过氧化氢酶中的表位,而没有由于交叉反应而错误检测其他物质,因此可进行特异性非常高的测定。
为了实施本发明的免疫测定法,可使用本发明的诊断试剂盒。本发明的诊断试剂盒含有至少一种本发明的单克隆抗体,并可只含一种单克隆抗体。要用于本发明诊断试剂盒的本发明的单克隆抗体不受特别限制,但可以是任何识别幽门螺杆菌过氧化氢酶的单克隆抗体,还可以是本发明的单克隆抗体的分解产物,如F(ab’)2、Fab’、Fab等。
本发明的诊断试剂盒可用免疫学方法检测幽门螺杆菌细胞或幽门螺杆菌过氧化氢酶,因此可以判断幽门螺杆菌的感染。
在本发明的诊断试剂盒中,本发明的单克隆抗体可预先固定在固相上,本发明的单克隆抗体还可以用上述标记剂标记。
用于本发明的诊断试剂盒的固相不受特别限制,但包括例如聚合物,如聚苯乙烯、玻璃珠、磁性颗粒、微量滴定板、免疫层析用滤纸、玻璃滤器或其他不溶性载体。
本发明的诊断试剂盒还可含有其他组件。
上述其他组件不受特别限制,但包括例如标记用的酶、其底物、放射性同位素、磷光物质、荧光物质、着色物质、缓冲液和培养皿,以及上述提到的成分。
虽然本发明的诊断试剂盒的形式不受特别限制,但含有本发明的诊断试剂盒所有组分的整合形诊断试剂盒是优选的,以快速、简单和方便的进行诊断。
上述整合型诊断试剂盒不受特别限制,但可以是盒型、芯型等。
作为上述盒型的实施例,可提到例如:一种具体实施方式,包括:使用免疫层析技术,一种反应盒、其中所含的膜、本发明的单克隆抗体一端固定在所述膜上(下游侧),固定在对侧端(上游侧)的膜上的显色溶液,含有针对上述标记剂并安排在显色溶液附近,在其下游侧的底物的衬垫,和含有用上述标记剂标记的单克隆抗体,安置在膜中间的衬垫上。
在使用上文举例所述的具有盒型实施方式的诊断试剂盒中,将标本涂在含有用上述标记物标记的本发明的单克隆抗体的衬垫上,然后使标本中所含的幽门螺杆菌过氧化氢酶和本发明的用标记剂标记的单克隆抗体进行结合产物,通过转移在本发明单克隆抗体固定的位置形成的结合产物,使上文提到的显色溶液显色,在该位置固定有本发明的单克隆抗体,形成幽门螺杆菌过氧化氢酶、用标记剂标记的单克隆抗体和固定化的单克隆抗体形成复合物。然后,上述标记试剂与上述底物反应以显示颜色等。测定显示的颜色等,从而进行幽门螺杆菌感染的判断。
对于用足量显色溶液稀释标本,并将得到的溶液滴到膜上的实施例而言,不需要预先将显色溶剂置于膜上。当用着色乳胶颗粒等着色物质作为上述标记物时,不需要底物,可根据着色物质的显色来判断本发明的单克隆抗体固定的位点是否形成上述复合物。
例如,对于用上述竞争性方法进行反应的上述芯型实施方式,可以提到具有多个孔的芯等,它们是整体形成的,包括(a)含有本发明单克隆抗体的孔,(b)含有液体试剂的孔(如缓冲溶液),该液体试剂中含有上述标记试剂标记的幽门螺杆菌,和(c)含有液体试剂(如缓冲溶液)的孔,该液体试剂含有针对上述标记试剂的底物,为了用夹心法实施反应,提到一种芯等,具有多个整体形成的孔,包括(a)含有不溶性载体的孔,在载体上固定有本发明的单克隆抗体,(b)含有液体试剂(如缓冲溶液)的孔,该试剂含有用上述标记试剂标记的单克隆抗体,和(c)含有液体试剂(如缓冲液)的孔,含有针对上述标记剂的底物。
在使用例如上述本发明的芯型诊断试剂盒中,反应和试验通常与进行竞争法或夹心法使用的相同方式进行。
本发明的诊断试剂盒可以是用于实施上述竞争性方法或上述夹心法的试剂盒。然而优选的是使用夹心法的试剂盒。上述夹心法具有优点,即灵敏度高,需要的反应时间短,准确率高。用上述免疫层析技术,可以制备一种试剂盒,它使得测试方法方便而简单,而且用它可以简单的通过肉眼观察判断结果。当以ELISA技术使用上述夹心法时,酶反应产物的形成由试验目标物质的量决定,因此可建立一种系统,可方便的通过显色等,以肉眼观察确定幽门螺杆菌感染阳性。
本发明诊断试剂盒所用的标本不受特别限制,但包括例如:胃内容物、胃洗液和消化道排泄物。然而消化道排泄物如粪便是优选的,因为它们可以方便的收集,而不对个体带来任何负担。
本发明的诊断试剂盒可以在细菌根除治疗前用于检测感染的存在与否,和/或在细菌根除治疗后判断成功或失败。
因为本发明的诊断试剂盒使用单克隆抗体,具有高水平的检测灵敏度,不产生假阴性或假阳性问题,在批与批之间没有任何差异。
根据本发明,用单克隆抗体识别幽门螺杆菌过氧化氢酶作为抗原,可消除存在于样品中的其它物质的影响,从而可以非常高的灵敏度和特异性检测幽门螺杆菌的存在。由于已建立了产生针对幽门螺杆菌的单克隆抗体的杂交瘤,现在可以几乎半永久性的产生同一单克隆抗体。使用本发明的单克隆抗体的诊断试剂盒可用消化道分泌物作为标本,因此可简单方便有效的检测幽门螺杆菌感染,而不对病人造成任何痛苦。另外,在仅使用一种单克隆抗体的情况下,使用本发明的单克隆抗体的诊断试剂盒可稳定的获得非常高的准确率,而在批与批之间没有任何差异,因此可以总是特异性的和高度准确的检测幽门螺杆菌感染。上述诊断试剂盒易于进行测定,对于医药护理的部门是非常有用的。
实施本发明的最佳模式
下列实施例和测试实施例更详细的说明的本发明。然而它们不是为了限制本
发明的范围。
实施例1
[单克隆抗体制备]
(1)幽门螺杆菌球菌型细胞悬液的制备(免疫原)
在补充有5%去纤维蛋白马血的脑心滴注琼脂培养基(Difco的产品)上分步划线培养幽门螺杆菌(ATCC 43504)。平板在微氧环境中37℃培养3-4天,然后在无氧环境下37℃培养7天,导致细胞变成球形。用白金环等刮下各菌落,悬浮在磷酸缓冲的生理盐水(PBS)中。10,000xg4℃离心10分钟,收集幽门螺杆菌,悬浮在0.5%甲醛中,使悬液在4℃保持4天灭活。然后,用悬浮在PBS中,然后在10,000xg4℃离心10分钟,然后悬浮在PBS中的方法重复三次,洗涤细胞。
(2)幽门螺杆菌球形细胞破碎产物的制备(免疫原)
用超声破碎器(Seiko Denshi Kogyo,7250型)在3.50%工作循环强度下超声10分钟,打碎(1)中获得的细胞。
(3)免疫和细胞融合
如(1)或(2)制备的等量免疫原(幽门螺杆菌球形细胞悬液或幽门螺杆菌细胞的破碎产物)与弗氏完全佐剂混合,得到油状乳液。将该乳液以0.2毫升的剂量皮下施给BALB/cA小鼠(CLEA Japan的产品,6周龄雄性)的背部位点。第一次免疫7天或14天后增强免疫,然后在细胞融合前3天,腹膜内施用0.2毫升上述免疫原。最后一次增强3天后,从各小鼠上切下脾脏细胞,与骨髓瘤细胞(P3x63.Ag8.653株,RCB 0146,Riken Gene Bank)以10∶1混合,用50%聚乙二醇4000融合。在HAT培养基(Gibco的产品)上选择性培养杂交瘤。
(4)杂交瘤选择
在融合后第12天,用ELISA法测定各培养上清液中的抗体活性。各取200微升的融合细胞的培养上清液加到96孔ELISA板(Coaster的产品)的孔中,其中每孔固定有10微克/毫升的免疫原的孔中,反应在37℃进行1小时,然后用含0.05%Tween 20的PBS(洗液)洗涤,在各孔中加入200微升过氧化物酶标记的抗-小鼠IgG(Cappel产品,1∶20,000)。反应在37℃进行1小时后,用上述洗液洗涤板。然后在各孔中加入200微升底物溶液(0.1M o-苯二胺和0.012%过氧化氢水溶液),使反应在室温下进行15分钟。然后,在各孔中加入50微升3.5N硫酸终止酶反应,测量492纳米的吸光度。选择产生与上述免疫原反应的抗体,并收获吸光度不低于0.15的杂交瘤克隆。用限制稀释法对各克隆进行两次克隆。克隆后的杂交瘤移植到BALB/cA小鼠中,结果发现32个杂交瘤克隆产生各种可作为腹水回收的单克隆抗体。
实施例2
[用夹心ELISA选择特异性识别消化道排泄物中的幽门螺杆菌的单克隆抗体]
(1)单克隆抗体固定化的平板的制备
用PBS两倍稀释32个克隆的腹水,每份各1毫升,滴加2毫升饱和硫酸铵,使混合物在4℃放置4小时。然后3000rpm离心混合物20分钟,将沉淀悬浮在2毫升PBS中并透析。将这些单克隆抗体以下列方法固定在96孔ELISA平板中。也就是将各单克隆抗体稀释到5微克/毫升,在96-孔板的各孔中加入0.2毫升稀释物。4℃放置过夜后,用PBS洗涤平板,然后在各孔中加入0.25毫升1%脱脂牛奶-PBS,使平板在4℃放置1小时,用于封闭。然后,用上述洗液洗涤平板。
(2)生物素标记的单克隆抗体的制备
将(1)中制备的32个克隆的单克隆抗体的各3毫克部分与10毫克N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯(Zymed的产品)混合,反应在0.1M碳酸氢钠(pH8)中进行,室温搅拌3小时。反应混合物对5升PBS4℃透析过夜,得到生物素标记的单克隆抗体。
(3)特异性识别消化道分泌物中的幽门螺杆菌的单克隆抗体选择
将用尿素呼气测试判断幽门螺杆菌阳性和幽门螺杆菌阴性的人各250毫克粪便悬浮在0.5毫升0.1%脱脂牛奶-PBS中,各混合物3,000rpm离心10分钟,然后用如此分离的上清液作为粪便抽提物。在如(1)所述制备的,固定有单克隆抗体的板的各孔中加入各0.2毫升的粪便抽提物。37℃放置1小时后,用5份上述洗液洗涤平板,加入(2)中制备的各0.2毫升生物素标记的单克隆抗体。37℃放置1小时后,用上述洗液洗涤平板,加入0.2毫升过氧化物酶标记的链霉亲和素(Zymed的产品)。37℃放置1小时后,用上述洗液洗涤平板,在各孔中加入0.2毫升底物溶液(0.1M o-苯二胺和0.012%过氧化氢水溶液),反应在室温下进行10分钟。然后,加入50微升3.5N硫酸终止酶反应,测量492纳米的吸光度。如表1所示,发现单独或组合使用三种单克隆抗体21G2、41A5和82B9的夹心ELISA显示针对感染后幽门螺杆菌的病人的粪便标本具有高度反应性。
表1
单克隆抗体组合 | 吸光度 | ||
固定化的 | 标记 | 阳性病人 | 阴性病人 |
21G2 | 21G2 | 3.3 | 0.043 |
21G2 | 41A5 | >3.5 | 0.075 |
21G2 | 82B9 | >3.5 | 0.067 |
41A5 | 41A5 | 3.3 | 0.10 |
41A5 | 21G2 | >3.5 | 0.080 |
41A5 | 82B9 | >3.5 | 0.035 |
82B9 | 82B9 | >3.5 | 0.071 |
82B9 | 21G2 | 3.3 | 0.066 |
82B9 | 41A5 | >3.5 | 0.064 |
产生各单克隆抗体的杂交瘤已被保藏在工业科学技术局,国立生命科学和人体技术研究所(1-3 Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,Japan),名称为杂交瘤21G2(FERM BP-7336)、杂交瘤41A5(FERM BP-7337)和杂交瘤82B9(FERMBP-7338)。用免疫球蛋白配型试剂盒小鼠(Wako Pure Chemical Industries)检查各单克隆抗体的免疫球蛋白,结果发现所有三种克隆属于具有κ型L链的IgG1。
实施例3
[菌株间反应性比较和与其它种类细菌的反应性]
(1)幽门螺杆菌细胞悬液的制备
在补充有5%去纤维蛋白马血的脑心滴注琼脂培养基上分步划线培养各种幽门螺杆菌菌株(ATCC 43504;Tokai大学医院临床分离物号130和112;Hyogo医学院临床分离物号526、4484、5017、5025、5049、5142、5287、5308、5314和5330)。平板在微氧环境中37℃培养3-4天,得到螺旋形细胞菌落,或在无氧环境下37℃培养7天,导致细胞变成球形。用白金环等刮下各菌落,悬浮在PBS中。10,000xg4℃离心10分钟,收集细胞,悬浮在0.5%甲醛中,使悬液在4℃保持4天灭活。然后,用悬浮在PBS中,然后在10,000xg4℃离心10分钟,然后悬浮在PBS中的方法重复三次,洗涤细胞。如此获得了幽门螺杆菌螺旋细胞悬液和球菌细胞悬液。
(2)人肠杆菌和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)细胞悬液的制备
用下文提到的方法培养可从人粪便中获得的典型菌株,即两种肠杆菌普通拟杆菌(Bacteroide vulgatus)和大肠杆菌,以及螺旋细菌空肠弯曲杆菌从获得的菌落中(1)中所述的相同方法制备各细胞悬液。因此,在补充有5%去纤维蛋白马血的BL琼脂培养基(Nissui Pharmaceutical的产品)37℃需氧培养普通拟杆菌(IFO14291)2天。大肠杆菌(ATCC25922)在脑心滴注琼脂培养基上37℃培养1天。空肠弯曲杆菌(80068,Tokai大学医院临床分离物)在补充有5%去纤维蛋白马血的脑心滴注琼脂培养基上37℃培养2天。
(3)其它螺杆菌细胞悬液的制备
猫螺杆菌(Heliobater felis)(ATCC 49179)和肝螺杆菌(Heliobaterhepaticus)(ATCC 51448)在补充有5%去纤维蛋白马血的脑心滴注琼脂培养基上用(1)中的相同方法培养,并且以(1)中的相同方法从如此获得的螺旋细胞菌落获得了螺旋形细胞的悬液。
(4)细胞破碎产物的制备
用超声粉碎机(Seiko Denshi Kogyo,7250型)在3.50%工作循环强度下超声打碎细胞。
(5)夹心ELISA
用实施例2(3)(单克隆抗体41A5固定化平板:生物素标记的单克隆抗体82B9、单克隆抗体21G2固定化平板:生物素标记的单克隆抗体41A5,单克隆抗体21G2-固定化平板:生物素标记的单克隆抗体82B9、单克隆抗体21G2-固定化平板:生物素标记的单克隆抗体21G2和Meridian’s产品HpSA)对(4)获得的各细胞破碎产物(0.2毫升;蛋白浓度10微克/毫升)。结果如表2所示。
表2
吸光度 | ||||||
抗体 | 固定化的单克隆抗体 | 21G2 | 41A5 | 21G2 | 21G2 | HpSA |
标记的单克隆抗体 | 41A5 | 82B9 | 82B9 | 21G2 | ||
抗原 | 幽门螺杆菌ATCC 43504螺旋形细胞 | >3.5 | >3.5 | >3.5 | >3.5 | >3.5 |
幽门螺杆菌ATCC 43504球形细胞 | >3.5 | >3.5 | >3.5 | - | - | |
幽门螺杆菌130号螺旋形细胞 | >3.5 | >3.5 | >3.5 | - | - | |
幽门螺杆菌130号球形细胞 | >3.5 | >3.5 | >3.5 | - | - | |
幽门螺杆菌112号螺旋形细胞 | >3.5 | >3.5 | >3.5 | - | - | |
幽门螺杆菌112号球形细胞 | >3.5 | >3.5 | >3.5 | - | - | |
幽门螺杆菌526号螺旋形细胞 | - | - | - | >3.5 | - | |
幽门螺杆菌4484号螺旋形细胞 | - | - | - | >3.5 | - | |
幽门螺杆菌5017号螺旋形细胞 | - | - | - | >3.5 | - | |
幽门螺杆菌5025号螺旋形细胞 | - | - | - | >3.5 | - | |
幽门螺杆菌5049号螺旋形细胞 | - | - | - | >3.5 | - | |
幽门螺杆菌5142号螺旋形细胞 | - | - | - | >3.5 | - | |
幽门螺杆菌5287号螺旋形细胞 | - | - | - | >3.5 | - | |
幽门螺杆菌5308号螺旋形细胞 | - | - | - | >3.5 | - | |
幽门螺杆菌5314号螺旋形细胞 | - | - | - | >3.5 | - | |
幽门螺杆菌5330号螺旋形细胞 | - | - | - | >3.5 | - | |
普通拟杆菌IFO 14291 | 0.066 | 0.066 | 0.058 | - | - | |
大肠杆菌ATCC 25922 | 0.056 | 0.055 | 0.050 | - | - | |
空肠弯曲杆菌80068 | 0.079 | 0.057 | 0.062 | - | - | |
猫螺杆菌ATCC 49179螺旋形细胞 | 0.066 | 0.051 | 0.055 | 0.014 | 1.63 | |
肝螺杆菌ATCC 51448螺旋形细胞 | 0.059 | 0.049 | 0.061 | 0.016 | 0.13 |
如表2所示,发现单克隆抗体21G2、41A5和82B9显示针对各种幽门螺杆菌的螺旋细胞和球形细胞的高度反应性。另一方面,它们完全不和普通拟杆菌。大肠杆菌、猫螺杆菌或肝螺杆菌反应。相反,Meridian的HpSA还显示针对猫螺杆菌和肝螺杆菌的反应性。
实施例4
[用夹心ELISA在粪便标本中检测幽门螺杆菌(1)]
分别将用尿素呼气测试判断为幽门螺杆菌阳性的三个人和判断为阴性的三个人的粪便标本(各250毫克)悬浮在0.5毫升0.1%脱脂牛奶-PBS中,用实施例2(3)的相同方法测试各标本。还用相同的粪便标本用Meridian的HpSA根据标出的方法进行测试,测量450纳米处的吸光度。表3显示了尿素呼气测试的各吸光度值。
表3
单克隆抗体组合 | 吸光度(单用尿素呼出空气测试,每mil) | ||||||
固定的 | 标记 | 1号 | 2号 | 3号 | 4号 | 5号 | 6号 |
21G2 | 21G2 | 0.041 | 0.043 | 0.043 | 3.3 | 2.8 | 2.1 |
21G2 | 41A5 | 0.092 | 0.079 | 0.075 | >3.5 | >3.5 | 2.4 |
21G2 | 82B9 | 0.071 | 0.052 | 0.067 | >3.5 | >3.5 | 3.2 |
41A5 | 41A5 | 0.17 | 0.17 | 0.10 | 3.3 | >3.5 | 0.84 |
41A5 | 21G2 | 0.077 | 0.073 | 0.080 | >3.5 | >3.5 | 1.8 |
41A5 | 82B9 | 0.029 | 0.053 | 0.035 | >3.5 | >3.5 | 2.2 |
82B9 | 82B9 | 0.12 | 0.086 | 0.071 | >3.5 | >3.5 | 2.3 |
82B9 | 21G2 | 0.063 | 0.082 | 0.066 | 3.3 | >3.5 | 1.1 |
82B9 | 41A5 | 0.079 | 0.077 | 0.064 | >3.5 | >3.5 | >3.5 |
HpSA | 0.077 | 0.028 | 0.025 | 1.8 | 2.5 | 1.8 | |
尿素呼气空气测试 | (1.0) | (0.6) | (0.9) | (17) | (26) | (17) |
发现尿素呼气测试结果阳性的个人(4、5、6号)提供的粪便标本与阴性标本(1、2、3号)比较,吸光度明显高。
实施例5
[用夹心ELISA法在粪便标本中检测幽门螺杆菌(2)]
将从移植了杂交瘤21G2的BALB/cA小鼠收集的腹水(5毫升)2倍稀释于PBS,滴加10毫升饱和硫酸铵,使混合物4℃放置4小时。然后3,000rpm离心混合物20分钟,将沉淀溶于10毫升PBS,用PBS透析溶液。
(2)单克隆抗体固定化平板制备
将(1)中制备的单克隆抗体21G2溶液以下面的方法固定在96-孔ELISA板上。将抗体用PBS稀释到浓度为5微克/毫升,将稀释液以每份0.2毫升加到96-孔ELISA平板的孔中,然后4℃放置过夜,用PBS洗涤板。
(3)过氧化物酶标记的单克隆抗体的制备
用马来酰亚胺法(Eiji Ishikawa:“生物化学实验”,卷27,Enzyme labelingtechnologies,1991年Gakkai Shuppan Center出版)制备了过氧化物酶标记的单克隆抗体。将(1)中制备的单克隆抗体(5毫克)与0.6毫克S-乙酰巯基琥珀酸酐(Aldrich的产品)混合,使反应在0.5毫升0.1M的磷酸缓冲液(pH6.5)中30℃反应30分钟。在反应混合物中加入20微升0.1M EDTA、0.1毫升Tris盐酸缓冲液(pH7.0)和0.1毫升1M羟胺(pH7.0),使混合物在30℃放置5分钟,然后10,000rpm离心5分钟得到上清液。用Centricon30(Amicon的产品)进行超滤,除去试剂,用1毫升5mM EDTA-0.1M磷酸缓冲液(pH6.5)置换溶剂,然后得到引入硫醇基团的单克隆抗体。
将过氧化物酶(5毫克,辣根,Toyobo的产物)与1毫升4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺(ICN Biochemicals的产品)混合,然后反应在0.5毫升0.1M的磷酸缓冲液(pH7.0)中30℃进行1小时。10,000rpm离心反应混合物5分钟,得到上清液。用Centricon 30超滤得到上清液,除去试剂,然后用1毫升0.1M的磷酸缓冲液(pH7.0)对上清液超滤,获得了引入马来酰亚胺基团的过氧化物酶。
将上述引入硫醇基团的单克隆抗体和引入马来酰亚胺基团的过氧化物酶以摩尔比1∶5混合,使反应在室温进行30分钟。使反应混合物经过凝胶过滤柱(Sephacryl-S 300 HR柱;直径26×长度870毫米,0.1M磷酸缓冲液(pH6.5)),收集了含有过氧化物酶标记的单克隆抗体的组分。
(4)用夹心ELISA法在粪便标本中检测幽门螺杆菌
将用尿素呼气测试判断为阳性的10个病人和判断为阴性的10个病人的粪便标本(各250毫克)悬浮在0.5毫升0.1%脱脂牛奶-PBS中,各混合物在3,000rpm离心10分钟,用如此获得的上清液作为粪便抽提物。将(3)中制备的各50微升粪便抽提物和50微升过氧化物酶-标记的单克隆抗体加到上述单克隆抗体固定的平板各孔中。25℃放置1小时后,用5份洗液(0.05%Tween 20-PBS)洗涤板,在各孔中加入0.1毫升底物底物溶液(四甲基二氨基联苯+过氧化氢,BioFX的产品),使反应在室温下进行10分钟。然后,在各孔中加入500微升1N硫酸终止反应,测量吸光度(450纳米-630纳米)。用HpSA测试同一粪便标本,测量吸光度(450纳米-630纳米)。结果如表4所示。
表4
标本号 | 尿素呼出空气测试 | 21G2夹心ELISA | HpSA |
判断*1(每mil) | 判断*2(吸光度) | 判断*3(吸光度) | |
1 | +(17) | +(1.89) | +(1.30) |
2 | +(11) | +(1.19) | +(1.57) |
3 | +(40) | +(1.52) | +(1.64) |
4 | +(40) | +(1.24) | +(2.13) |
5 | +(25) | +(0.46) | +(2.11) |
6 | +(34) | +(0.79) | +(1.37) |
7 | +(49) | +(1.38) | +(1.60) |
8 | +(50) | +(3.13) | +(2.18) |
9 | +(19) | +(0.36) | +(0.76) |
10 | +(40) | +(2.43) | +(1.97) |
11 | - | -(0.05) | -(0.01) |
12 | - | -(0.02) | -(<0.01) |
13 | - | -(0.04) | -(<0.01) |
14 | - | -(0.09) | -(<0.01) |
15 | - | -(0.02) | -(<0.01) |
16 | - | -(0.03) | +(0.27) |
17 | - | -(0.02) | -(<0.01) |
18 | - | -(0.04) | -(0.01) |
19 | - | -(0.05) | +(0.23) |
20 | - | -(0.01) | -(0.02) |
*1:+阳性(>5每mil)、-阴性
*2:+阳性(>0.1)、-阴性
*3:+阳性(>0.1)、-阴性
如表4所示,用单克隆抗体21G2的夹心ELISA法显示被幽门螺杆菌感染的人的粪便标本与尿素呼气测试的结果确实相符。另一方面,HpSA有两个标本(标本号16和19)不符合(假阳性)。
实施例6
[用免疫色谱图检测粪便标本中的幽门螺杆菌]
(1)抗体-固定的载体制备
为了制备用抗-幽门螺杆菌单克隆抗体和家兔IgG抗体依次固定在其上的抗体固定的载体上,将硝基纤维素片(Whatman的产品)切成5毫米×20毫米,用BiojetQ3000(Biodot的产品)将单克隆抗体21G2溶液点在离底边10毫米处的位置,将山羊抗兔IgG单克隆抗体(Cappel的产品)涂在离底边15毫米处。室温干燥2小时后,各片用1%脱脂牛奶(Difco的产品)-0.1%Tween-PBS浸润10分钟封闭各片,然后充分干燥。
(2)着色乳胶颗粒-标记的产品的制备
a.红色乳胶颗粒标记的抗幽门螺杆菌抗体
在300微升红色乳胶颗粒分散体(PL-Latex,10%,450纳米,PolymerLaboratories)加入PBS(1.2毫升),混合物13,000rpm离心5分钟。在沉淀中加入1毫升单克隆抗体21G2(5毫克/毫升)溶液,充分混合后,反应在室温下进行1小时。为了除去未反应的单克隆抗体部分,13,000rpm离心5分钟,将沉淀悬浮在1.5毫升PBS中,上清液再次离心。加入1毫升脱脂牛奶封闭,反应在室温下进行1小时。然后,离心在13,000rpm进行5分钟,将沉淀悬浮在含有1%脱脂牛奶-0.01%叠氮化钠的1.5毫升PBS中。
b.蓝色乳胶颗粒-标记的家兔IgG
用蓝色乳胶颗粒分散体(PL-Latex,10%,450纳米,Polymer Laboratories的产品)和家兔IgG(0.5毫克/毫升,Cappel的产品)根据上述的相同步骤制备。
c.着色颗粒标记的产物
混合等量的上述两种着色的乳胶颗粒-标记的抗体,用10微升混合物浸润5毫米×5毫米的Bemliese(注册商标)片,然后风干。
(3)免疫层析测试片的制备
将着色乳胶颗粒标记的产物点在抗体固定的载体上,离底边2.5毫米的位置。另外,将为了浸润测试溶液的载体再放在着色乳胶-标记的产物上,离底边2,5毫米的位置。将吸收水的载体(3M Chr,Whatman的产品)放在抗体-固定的载体上,从上离底边2毫米,最后,覆盖一层透明粘胶带固定所有成员,得到免疫层析图的测试片。
(4)粪便标本中幽门螺杆菌的检测
用6个病人(3个阳性,3个阴性)的粪便如实施例4所述进行测试。取各粪便标本的0.1克份,悬浮在1毫升0.1%BSA-0.05%Tween 20-PBS。3,000rpm离心1分钟除去杂质,在(3)中制备的免疫层析测试片上的一个位点滴加50微升上清液,以浸润测试溶液。10分钟后,判断是否在抗-幽门螺杆菌单克隆抗体的固定位点出现红线。结果对于每一个阴性标本应该观察不到红线,而对于所有阳性病人可肯定红线。对于所有的标本都确定的蓝线。测试因此是成功的。
实施例7
[用乳胶凝集法检测粪便标本中的幽门螺杆菌]
(1)乳胶颗粒标记的抗幽门螺杆菌抗体的制备
在0.1毫升白色乳胶颗粒分散体(PL-Latex,10%,440纳米,PolymerLaboratories)中加入PBS(0.4毫升),13,000rpm离心混合物5分钟。在沉淀中加入0.5毫升PBS和0.5毫升单克隆抗体21G2溶液(1毫克/毫升),充分混合后,使反应在室温下进行过夜。为了除去单克隆抗体的未反应部分,13,000rpm离心10分钟,将沉淀悬浮在1毫升PBS中,再次离心悬浮液。加入1毫升1%脱脂牛奶进行封闭,反应在室温下进行1小时。然后,在13,000rpm下离心5分钟,将沉淀悬浮在1毫升含有1%脱脂牛奶-0.01%叠氮化钠的PBS中。
(2)粪便标本中幽门螺杆菌的检测
用实施例4中所述的6个病人(3个阳性和3个阴性)的粪便进行测试。各取0.1克份的粪便标本,悬浮在含有0.1%BSA-0.05%Tween 20的1毫升PBS中。3,000rpm离心1分钟除去杂质,获得上清液。将50微升份的该粪便悬液的上清液和50微升(1)中制备的乳胶颗粒标记的抗-幽门螺杆菌滴加到乳胶聚集板上,用玻片转子混合(Eiken Chemical的产品)。5分钟后,肉眼观察判断聚集的出现与否。结果,在任何阴性标本中未观察到聚集,而在所有阳性标本中确定聚集。
实施例8
[用凝胶过滤确定粪便中抗原的分子量]
将20克幽门螺杆菌阳性人群(表3中的4号和5号)的粪便标本悬浮在100毫升冰冻PBS中。10,000xg离心10分钟,丢弃沉淀,再次90,000xg离心30分钟,得到上清液。将1.5毫升该上清液加到装填有Sephacryl-S300HR(Pharmacia的产品)(1.5×140厘米,0.1M磷酸缓冲液,pH6.5)的凝胶过滤柱上,收集1.5毫升组分。所用的分子量标记是甲状腺球蛋白、铁蛋白、过氧化氢酶、牛血清白蛋白和细胞色素c。用实施例2(3)中提到的夹心ELISA法检测各抗原组分(单克隆抗体41A5固定的平板,生物素标记的单克隆抗体82B9、和单克隆抗体21G2固定的平板与生物素标记的单克隆抗体41A5)。结果发现粪便中幽门螺杆菌特异性抗原具有270kDa的分子量。
实施例9
[抗原鉴定]
(1)抗原纯化
将单克隆抗体82B9根据Amersham Pharmacia Biotech的亲和层析手册固定在CNBr-活化的Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech)上,制备柱(10毫升)。超声破碎幽门螺杆菌(ATCC43504)细胞,进行超声,将获得的5毫升上清液加到柱上。室温放置2小时后,用120毫升PBS洗涤柱(流速约2毫升/分钟),用130毫升0.2M甘氨酸HCl缓冲液(pH3.0)洗脱。分别收集洗涤物和洗脱液作为10组分,测量各组分的吸光度和抗原性。用实施例2所述的夹心ELISA(固定的21G2和作为标记的82B9)测定抗原性。如图1所示,确定了各洗脱组分(组分号14-17)中的抗原性。
(2)纯化的抗原的纯度和分子量
将洗脱组分(14号,50微升)与等量的样品缓冲液(2%SDS-5%巯基乙醇)混合,100℃煮沸混合物5分钟。对20微升份的该溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(4-20%丙烯酰胺凝胶)。所用的分子量标记是磷酸化酶b、牛血清白蛋白、卵清白蛋白、羧酸脱氢酶、大豆胰蛋白酶抑制蛋白和α-乳白蛋白。电泳后,用KANTOII(Kanto Chemical)银染料染色凝胶。结果,纯化的抗原得到单一条带,其分子量是59kDa。另外,1毫升洗脱组分(14号)在Sephacryl-S300HR上用实施例6所述的相同方法进行凝胶过滤。用夹心ELISA测试获得的组分的抗原性,结果,发现该纯化抗原具有270kDa的分子量,与粪便中发现的抗原相同。
(3)纯化抗原的氨基酸-末端序列测定
用300微升洗脱组分(14号),用HP G1005A蛋白测序系统(Hewlett-Packard的产品)测定纯化蛋白的氨基末端氨基酸序列。发现氨基酸末端的8个残基序列是Met-Val-Asn-Lys-Asp-Val-Lys-Gln。该序列与幽门螺杆菌过氧化氢酶的氨基末端序列完全一致(J.Bacteriol.(1996),178,6060-6976)。
(4)纯化抗原的过氧化氢酶活性和紫外可见的吸收光谱测定
由于纯化抗原的氨基末端氨基酸序列与过氧化氢酶的完全相同,测试了各组分的过氧化氢酶活性。所用的反应溶液是含11mM过氧化氢的PBS。用PBS稀释各组分100倍,将50微升稀释物加到2毫升反应溶液中,开始反应。反应在室温下进行。每隔一段时间测量240纳米处的吸光度,确定每分钟吸光度的下降。用PBS作为空白。结果,在抗原组分中检查到过氧化物酶活性,如图1所示。
为了鉴定过氧化氢酶所含的,测量了14号洗脱组分的紫外可见光谱。结果,在407和277纳米处观察到吸收最大值。这些值和幽门螺杆菌过氧化氢酶的文献值非常相似(405纳米和280纳米,J.Gen.Microbiol.(1991)137,57-61)。
(5)纯化抗原的保存稳定性
用含0.1%BSA的PBS将洗脱组分(14号)稀释到1.4微升/毫升,将溶液保存在25℃一周。保存后,用实施例5所述的夹心ELISA测定纯化的抗原的抗原性,并用(4)所述的方法测定过氧化氢酶活性。当与冰冻储藏在-80℃的纯化抗原比较时,25℃储藏后抗原性没有变化。然而,过氧化氢酶活性显示显著下降,剩余的活性不大于5%。
实施例10
[粪便中的抗原亚基与抗-幽门螺杆菌单克隆抗体的反应性]
为了估计抗幽门螺杆菌单克隆抗体与粪便中抗原亚基的反应性,将实施例8中描述的各幽门螺杆菌阳性病人的粪便悬液的50微升上清液如实施例9(2)所述进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。作为对照,用相同的方法还电泳了50微升实施例9的纯化抗原(洗脱组分号14)。电泳后,用蛋白质印迹技术将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜浸润在1%脱脂牛奶中1小时,以封闭,然后与单克隆抗体21G2或82B9反应1小时。用5份0.05%Tween 20-PBS洗涤硝酸纤维素膜,然后与过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体反应。用5份0.05%的20-PBS洗涤硝酸纤维素膜,然后加入底物溶液(过氧化物+3,3’-二氨基联苯胺),保温10分钟。从粪便抗原和纯化的抗原迁移得到的各泳道用任何单克隆抗体没有显示任何由于抗原性的显色反应。为了确定不能检测亚基分子抗原性的原因,用斑点印迹技术测定是否分离成亚基的处理导致抗原性的改变。因此,将用1%SDS分离处理前后的5微升份标本滴入硝酸纤维素膜。风干后,测定硝酸纤维素膜上蛋白质吸附的蛋白质。结果,发现粪便抗原和纯化的抗原在1%SDS分解处理后抗原性显著下降。因此提出本发明的单克隆抗体不能识别过氧化氢酶的亚基,即初级结构表位,但识别更天然的高级结构作为表位。
实施例11
[粪便中抗原的纯化]
(1)粪便中抗原的分子量
将具有最高幽门螺杆菌抗原水平的阳性个体(表4中的标本号8)提供的粪便(165克)悬浮在PBS(粪便重量的4倍)中,离心悬液(7,000xg,30分钟)得到上清液,再次超离心(30,000rpm,30分钟)得到上清液。在680毫升上清液中加入硫酸铵(165克),达40%饱和度,搅拌混合物,用离心除去得到的沉淀(7,000rpm,30分钟)。在750毫升上清液中加入硫酸铵(214克)达80%饱和度,搅拌混合物,离心收集得到的沉淀(7,000rpm,30分钟)。将沉淀悬浮在PBS中,针对10升蒸馏水透析。在Sephacryl-S300HR柱上以实施例6的相同方法对2毫升份的透析液(82毫升)进行凝胶过滤。用夹心ELISA,以实施例5的相同方法检测获得组分的抗原性。发现粪便抗原的分子量是270kDa,与实施例8的两个阳性病人的粪便抗原和实施例9所述的纯化的抗原的分子量相同。
(2)粪便中抗原的纯化
将40毫升(1)中所述的透析液用10mM磷酸缓冲液(pH7.0)稀释到100毫升,将稀释液加到装填了阳离子交换树脂CM-Sephadex C-50(Amersham PharmaciaBiotech)的柱(1×2.5厘米)上,用同一缓冲液平衡。用10毫升相同的缓冲液洗涤后,用10毫升PBS进行洗脱。用含有0.1%脱脂牛奶的PBS各稀释流出、洗涤和洗脱组分320倍,然后用实施例5所述的夹心ELISA测定抗原性。在洗脱组分中发现抗原性。
将单克隆抗体21G2根据Amersham Pharmacia Biotech的亲和层析手册所述的方法固定在CNBr-活化的Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech)上,制备柱(2×3厘米)。室温放置2小时后,用50毫升PBS洗涤柱,然后用0.2M甘氨酸HCl缓冲液(pH3.0)洗脱,收集10毫升组分。分别用含有0.1%脱脂牛奶的PBS稀释各组分10倍,用实施例5所述的夹心ELISA测定稀释液的抗原性。用实施例9所述的方法测定过氧化氢酶活性。结果,如图2所示,观察到开始洗脱后(用箭头表示)立即收集的洗脱组分(组分号7和8)中的抗原性。发现过氧化氢酶活性与抗原性一致。根据上文,该发现该粪便标本可用于获得具有4个亚基的天然抗原和4个亚基。
工业应用性
具有上面的总结的发明可提供能识别特异性存在于幽门螺杆菌过氧化氢酶中的表位的单克隆抗体。另外,通过使用本发明的单克隆抗体,可以非常专一的识别幽门螺杆菌。已成功的建立了产生识别幽门螺杆菌过氧化氢酶的杂交瘤系,因此可以半永久的产生相同的单克隆抗体。使用本发明的单克隆抗体的诊断试剂盒可用消化道排泄物作为标本,能简单有效的检测幽门螺杆菌感染,而不对病人造成痛苦。甚至当仅使用一种单克隆抗体时,本发明的诊断试剂盒也显示非常好的精确性,没有显示出批与批之间的差异,是稳定的,而且总是能专一而非常准确的检测幽门螺杆菌感染。
Claims (16)
1.一种单克隆抗体,其特征在于,该单克隆抗体识别幽门螺杆菌过氧化氢酶作为抗原。
2.一种杂交瘤,其特征在于,该杂交瘤产生识别幽门螺杆菌过氧化氢酶作为抗原的单克隆抗体。
3.如权利要2所述的杂交瘤,其特征在于,该杂交瘤是21G2:FERM BP-7336、41A5:FERM BP-7337或82B9:FERM BP-7338。
4.一种权利要求2或3所述的杂交瘤产生的单克隆抗体。
5.一种免疫测定法,其特征在于,该方法是用至少一种权利要求1或4所述的单克隆抗体进行的。
6.如权利要求5所述的免疫测定法,其特征在于,该方法是用权利要求1或4所述的任何一种单克隆抗体进行的。
7.如权利要求5或6所述的免疫测定法,其特征在于,用该免疫测定法判断幽门螺杆菌的感染。
8.如权利要求5-7任一所述的免疫测定法,其特征在于,标本是消化道排泄物。
9.如权利要求5-8任一所述的免疫测定法,其特征在于,所述测定法用ELISA技术进行。
10.如权利要求5-8任一所述的免疫测定法,其特征在于,所述测定法用免疫层析技术进行。
11.一种试剂盒,其特征在于,该试剂盒含有至少一种权利要求1-4所述的单克隆抗体。
12.如权利要求11所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒含有权利要求1-4所述的任何一种单克隆抗体。
13.如权利要求11或12所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于判断幽门螺杆菌感染。
14.如权利要求11-13任一所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述标本是消化道排泄物。
15.如权利要求11-14任一所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒采用ELISA技术。
16.如权利要求11-14任一所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒采用免疫层析技术。
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP308475/1999 | 1999-10-29 | ||
JP308475/99 | 1999-10-29 | ||
JP30847599 | 1999-10-29 | ||
JP52377/2000 | 2000-02-28 | ||
JP52377/00 | 2000-02-28 | ||
JP2000052377 | 2000-02-28 | ||
JP2000244414 | 2000-08-11 | ||
JP244414/2000 | 2000-08-11 | ||
JP244414/00 | 2000-08-11 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1384886A true CN1384886A (zh) | 2002-12-11 |
CN1195869C CN1195869C (zh) | 2005-04-06 |
Family
ID=27338971
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB008151229A Expired - Fee Related CN1195869C (zh) | 1999-10-29 | 2000-10-27 | 单克隆抗体、杂交瘤、免疫测定法和诊断试剂盒 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6849419B1 (zh) |
EP (1) | EP1227159B1 (zh) |
KR (1) | KR100756117B1 (zh) |
CN (1) | CN1195869C (zh) |
AU (1) | AU7960600A (zh) |
BR (1) | BR0015145A (zh) |
DE (1) | DE60045870D1 (zh) |
TW (1) | TWI247809B (zh) |
WO (1) | WO2001032908A1 (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102565391A (zh) * | 2011-12-23 | 2012-07-11 | 王滔 | 胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法 |
CN106370500A (zh) * | 2016-08-26 | 2017-02-01 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 一种粪便中脂溶性代谢产物的提取分离方法 |
CN111499751A (zh) * | 2020-05-06 | 2020-08-07 | 云南省农业科学院园艺作物研究所 | 一种用于检测白菜过氧化氢酶的单克隆抗体及其应用 |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE434185T1 (de) * | 2000-05-18 | 2009-07-15 | Meridian Bioscience Inc | Immunoassay für h. pylori in fäkalienproben mit hilfe von gattungsspezifischen antikörpern |
DE10043161A1 (de) * | 2000-09-01 | 2002-03-14 | Connex Ges Zur Optimierung Von | Lösung zur Aufbereitung von Stuhlproben für diagnostische Zwecke |
US20100081927A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological facilitation systems and methods |
US20100081915A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, Alimited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological facilitation systems and methods |
US20100081916A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware. | Histological facilitation systems and methods |
US20100081926A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological facilitation systems and methods |
US20100081924A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological facilitation systems and methods |
US20100081928A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological Facilitation systems and methods |
JP2014515757A (ja) * | 2011-04-21 | 2014-07-03 | ボード オブ スーパーバイザーズ オブ ルイジアナ ステイト ユニバーシティ アンド アグリカルチュラル アンド メカニカル カレッジ | 真菌感染症のペプチド及び結合型ワクチン |
US20140234337A1 (en) | 2011-08-19 | 2014-08-21 | Immortal Spirit Limited | Antibody and antibody-containing composition |
WO2015151128A1 (en) * | 2014-04-04 | 2015-10-08 | Over S.R.L. | Method for rapid detection of infection from caga positive helicobacter pylori and diagnostic kit therefor |
CN106802345B (zh) * | 2017-01-13 | 2018-03-27 | 广州华弘生物科技有限公司 | 一种幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒 |
CN107290527A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-10-24 | 南京医科大学第附属医院 | 用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条及其制备方法 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4132527A (en) * | 1974-01-09 | 1979-01-02 | Shionogi & Co., Ltd. | Diagnostic compositions, diagnosing instruments, and methods of manufacturing same |
JPS60240497A (ja) | 1984-05-16 | 1985-11-29 | 凸版印刷株式会社 | 製本針金綴不良検査装置 |
US5030717A (en) * | 1986-09-17 | 1991-07-09 | Scripps Clinic And Research Foundation | Antibodies which catalyze hydrolysis of ester bonds |
US5171529A (en) * | 1992-01-24 | 1992-12-15 | Robert Schreiber | Occult blood testing device |
FR2719998B1 (fr) * | 1994-04-08 | 1996-09-27 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Composition immunisante anti-hélicobacter pylori à base de catalase. |
AUPM612494A0 (en) * | 1994-06-08 | 1994-06-30 | Csl Limited | Treatment or prevention of helicobacter infection |
SG90030A1 (en) * | 1994-10-05 | 2002-07-23 | Microcarb Inc | Methods for producing enhanced antigenic helocobacter sp. and vaccines comprising same |
DE69636320T2 (de) * | 1995-06-02 | 2007-07-26 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Helicobacter Polypeptide, deren Herstellung und Verwendung |
US5716791A (en) | 1996-05-09 | 1998-02-10 | Meridian Diagnostics, Inc. | Immunoassay for H. pylori in fecal specimens |
WO1998006853A1 (en) * | 1996-08-15 | 1998-02-19 | Csl Limited | Treatment and prevention of helicobacter infection |
US5702911A (en) * | 1996-08-15 | 1997-12-30 | Chek-Med Systems, Inc. | Diagnostic test composition |
ES2270638T3 (es) | 1998-10-29 | 2007-04-01 | Dakocytomation Denmark A/S | Deteccion de microorganismos acido-resistentes en las heces. |
EP1232392B2 (de) * | 1999-10-12 | 2014-04-02 | Oxoid (Ely) Limited | Verbessertes verfahren zum nachweis von säure-resistenten bakterien der gattung helicobacter im stuhl |
AUPQ347199A0 (en) * | 1999-10-15 | 1999-11-11 | Csl Limited | Novel polypeptide fragments |
-
2000
- 2000-10-27 AU AU79606/00A patent/AU7960600A/en not_active Abandoned
- 2000-10-27 US US10/111,650 patent/US6849419B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-27 TW TW089122612A patent/TWI247809B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-10-27 KR KR1020027005400A patent/KR100756117B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-10-27 DE DE60045870T patent/DE60045870D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-27 WO PCT/JP2000/007554 patent/WO2001032908A1/ja active Application Filing
- 2000-10-27 BR BR0015145-9A patent/BR0015145A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-10-27 EP EP00970144A patent/EP1227159B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-27 CN CNB008151229A patent/CN1195869C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102565391A (zh) * | 2011-12-23 | 2012-07-11 | 王滔 | 胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法 |
CN106370500A (zh) * | 2016-08-26 | 2017-02-01 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 一种粪便中脂溶性代谢产物的提取分离方法 |
CN111499751A (zh) * | 2020-05-06 | 2020-08-07 | 云南省农业科学院园艺作物研究所 | 一种用于检测白菜过氧化氢酶的单克隆抗体及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1227159B1 (en) | 2011-04-20 |
DE60045870D1 (de) | 2011-06-01 |
BR0015145A (pt) | 2002-07-16 |
KR100756117B1 (ko) | 2007-09-05 |
WO2001032908A1 (fr) | 2001-05-10 |
US6849419B1 (en) | 2005-02-01 |
KR20020059649A (ko) | 2002-07-13 |
CN1195869C (zh) | 2005-04-06 |
TWI247809B (en) | 2006-01-21 |
EP1227159A1 (en) | 2002-07-31 |
AU7960600A (en) | 2001-05-14 |
EP1227159A4 (en) | 2004-12-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1195869C (zh) | 单克隆抗体、杂交瘤、免疫测定法和诊断试剂盒 | |
CN1867828A (zh) | 脂连蛋白多聚体的分离测定方法 | |
CN1505759A (zh) | 念珠菌的检测 | |
CN1697972A (zh) | 检测阴道分泌物中羊水的装置和方法 | |
JP3673522B2 (ja) | 抗アネキシンvモノクローナル抗体並びにその利用及びそれを産生するハイブリドーマ細胞系 | |
CN1811443A (zh) | 一种检测19-去甲睾酮的方法及其专用酶联免疫试剂盒 | |
CN1144047C (zh) | 检测或确定丙型肝炎病毒核心蛋白的方法及其中应用的用于检测或确定的试剂 | |
CN1871518A (zh) | 丙型肝炎病毒的检测方法 | |
CN1056186C (zh) | 一种对人体过氧化锰歧化酶的单克隆抗体,其制备方法及其应用 | |
CN1687134A (zh) | 幽门螺杆菌HpaA和ureB单克隆抗体、免疫测定法和诊断试剂盒 | |
CN1585900A (zh) | 检测与胰腺胰岛细胞抗原分子和/或胰岛素反应的自身抗体 | |
CN1766618A (zh) | 检测青霉素g的酶联免疫试剂盒及其方法 | |
CN1839319A (zh) | 用于诊断视网膜血管病的包含醛缩酶的组合物以及应用它诊断的方法 | |
CN1732261A (zh) | 用于诊断肝脏疾病的标志蛋白质以及使用该蛋白质诊断肝脏疾病的方法 | |
CN1811437A (zh) | 一种检测磺胺喹噁啉的方法及其专用酶联免疫试剂盒 | |
EP0685739A1 (en) | Method of detecting DAF molecules in feces | |
CN1766632A (zh) | 一种检测动物源性食品中氟喹酮类药物的酶联免疫试剂盒 | |
CN1766626A (zh) | 检测雌二醇的酶联免疫试剂盒及方法 | |
CN1195229C (zh) | 一种检测孕激素受体水平的生物试剂及免疫组化方法 | |
CN1427258A (zh) | 人尿中低密度脂蛋白含量酶联免疫吸附试验试剂盒及制备方法 | |
CN1544942A (zh) | 人多囊蛋白-1定量检测试剂盒 | |
CN1082187C (zh) | 一种检测雌激素受体水平的生物试剂及免疫组化方法 | |
CN1216074C (zh) | 日本血吸虫虫卵抗原模拟肽及其筛选 | |
CN100335502C (zh) | 外淋巴瘘的检测方法 | |
JP3504633B2 (ja) | ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定する検査方法及び検査試薬 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20050406 Termination date: 20161027 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |