CN1839319A - 用于诊断视网膜血管病的包含醛缩酶的组合物以及应用它诊断的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种用于诊断视网膜血管病的包含醛缩酶蛋白质的组合物。此外，本发明还公开了一种用于诊断视网膜血管病的包含所述蛋白质的试剂盒，以及一种诊断视网膜血管病的方法，它包括，将血样与醛缩酶蛋白质接触，并且定量分析形成的抗原－抗体复合物。

Description

用于诊断视网膜血管病的包含醛缩酶的 组合物以及应用它诊断的方法
技术领域
本发明涉及用于诊断视网膜血管病的包含醛缩酶蛋白质的组合物，包含所述蛋白质的试剂盒，以及诊断视网膜血管病的方法，该方法包括，将血样与醛缩酶蛋白质接触，并且定量分析形成的抗原-抗体复合物。
背景技术
糖尿病是一种在微血管系统中引起损伤的复杂的代谢病。该疾病造成全身组织宽范围的障碍，而且是尤其影响眼睛的最重要的系统病(TH Lee和YG Choi，Diabetic Vascular Complications(糖尿病性血管并发症)，1993，Korea Medical Book Publisher，Seoul，Korea)。其中，糖尿病性视网膜病是最严重的并发症之一，而且正随着因生活标准的改善和医疗技术的进步导致的预期寿命的延长而变成日益重要的社会问题(Klein R.等，Arch Ophthalmol.，102，520-532，1984)。有两类糖尿病性视网膜病：非增生的糖尿病性视网膜病(NPDR)，其中，视网膜中由血管病引起的损伤都在视网膜内；以及增生的糖尿病性视网膜病(PDR)，其中，视网膜上生长的新血管渗透玻璃体(Green，见：Spencer WH，ed.，Ophthalmic Pathology：anatlas and textbook.4thed.，Philadelphia：WB Saunder；1124-1129，1996)。糖尿病性视网膜病视力缺损是由玻璃体出血和黄斑区中的牵引性视网膜脱离以及黄斑变性引起的，已知手术和激光治疗是有效的(Diabetic RetinopathyStudy Report Number 14，Int Ophthalmol Clin.，27，239-253，1987)。当在适当时期进行该处理时，能以最小的副作用预防视力丧失。因此，重要的是频繁地进行糖尿病性视网膜病的诊断以便确定外科手术的适当时间。
糖尿病性视网膜病是通过眼底摄影术检查眼底的特征性结构变化而诊断的，这通常是在眼科医院进行的。对于患有糖尿病而没有意识到视觉异常或者没有接受定期眼科检查的患者诊断早期糖尿病性视网膜病是困难的。所以，当病况进展过度而不能预防时，糖尿病患者通常接受手术治疗。
这样，需要寻找一种在其早期准确地诊断糖尿病性视网膜病的方法，但还没有报导过合适的方法。
基于该背景，本发明人发现了，在糖尿病性视网膜病患者中由于视网膜蛋白质暴露于免疫系统中而形成了自身抗体，但在正常情况下由于眼血管中存在血眼屏障，视网膜蛋白质没有暴露于免疫系统中。本发明人筛选了产生自身抗体的视网膜蛋白质，发现了可通过检测患者中醛缩酶蛋白质的自身抗体以高可靠性诊断视网膜血管病。
发明公开
因此，本发明一个目的是提供一种诊断视网膜血管病的组合物，它包含醛缩酶蛋白质。
本发明另一个目的是提供一种用于视网膜血管病的诊断盒，它包含醛缩酶蛋白质。
本发明的进一步目的是提供一种诊断视网膜血管病的方法，它包括，将生物样品与醛缩酶蛋白质接触，并且检测形成的抗原-自身抗体复合物。
附图简述
结合到本说明书中并且占本说明书一部分的附图阐述了本发明优选的实施方案，而且可与下列优选实施方案的详细描述一起描述了本发明的原理。
图1示出了应用人视网膜蛋白质的细胞溶胶部分和膜部分通过蛋白质印迹分析，筛选从正常受试验者、糖尿病患者、患有非增生的糖尿病性视网膜病的患者和患有增生的糖尿病性视网膜病的患者中获得的血清样品的结果。
图2示出了人视网膜蛋白质的二维(2-D)电泳结果。
图3a示出了已被分割成四片的图2的2-D电泳凝胶的蛋白质印迹法的结果，应用健康男性受试验者的血清；
图3b示出了已被分割成四片的图2的2-D电泳凝胶的蛋白质印迹法的结果，应用患有非增生的糖尿病性视网膜病的患者的血清；
图3c示出了已被分割成四片的图2的2-D电泳凝胶的蛋白质印迹法的结果，应用患有增生的糖尿病性视网膜病的患者的血清；
图4示出了应用肌酸激酶B，通过酶联免疫吸附测定法分析来自正常受试验者、糖尿病患者、患有非增生的糖尿病性视网膜病的患者和患有增生的糖尿病性视网膜病的患者的血清而诊断糖尿病性视网膜病的结果；
图5示出了应用醛缩酶，通过酶联免疫吸附测定法分析来自正常受试验者、糖尿病患者、患有非增生的糖尿病性视网膜病的患者和患有增生的糖尿病性视网膜病的患者的血清而诊断糖尿病性视网膜病的结果；以及
图6示出了应用醛缩酶，通过酶联免疫吸附测定法分析来自例如通过外科手术成功地治疗的糖尿病性视网膜病患者、以及患有进行性糖尿病性视网膜病的患者的血清而诊断糖尿病性视网膜病的结果。
实施本发明的最佳方式
一方面，本发明提供了一种诊断视网膜血管病的组合物，它包含醛缩酶。
如本文应用的术语“诊断”表示检测致病状态的存在或性质。就本发明的目的来说，“诊断”表示检测视网膜血管病。
如本文应用的术语“视网膜血管病”表示其中视网膜蛋白质暴露于眼血管的所有疾病。视网膜血管病(其中，在血液内产生针对视网膜蛋白质的自身抗体)可通过检测这类自身抗体的产生而诊断。在本发明中，视网膜血管病是通过检测针对醛缩酶蛋白质的自身抗体的形成来诊断的。所以，就本发明的目的来说，视网膜血管病包括产生针对醛缩酶的自身抗体的所有视网膜血管病。视网膜血管病的非限制性实例包括糖尿病性视网膜病、与年龄相关的黄斑变性和视网膜水肿。最优选的实例是糖尿病性视网膜病。抵抗醛缩酶C的自身抗体的检测能有效地诊断非增生的和增生的糖尿病性视网膜病这两者。
如本文应用的术语“自身抗体”表示这种抗体：与免疫系统内抵抗外源性抗原而产生的抗体不同，它是抵抗内源性或天然的底物而产生的。就本发明的目的来说，自身抗体表示视网膜血管病中抵抗暴露的视网膜蛋白质而产生的自身抗体。下表2中描述了产生自身抗体的视网膜蛋白质。这些自身抗体通常是不可检测的或者至多以可忽视的水平在正常个体或糖尿病患者中检测到，但在例如糖尿病性视网膜病这样的视网膜血管疾病中增大到显著的水平。
本发明人通过一维和二维蛋白质印迹法发现了，表2中列出的视网膜蛋白质是发生诸如糖尿病性视网膜病这样的疾病时产生自身抗体的蛋白质，而且发现了，可通过检测针对这些蛋白质的自身抗体而成功地诊断视网膜血管病。
当应用表2中列出的蛋白质通过酶联免疫吸附测定法分析糖尿病患者的血样时，能通过检测抗醛缩酶C的自身抗体有意义地诊断视网膜血管病。如本文应用的术语“意义”表示这样的诊断结果，它们具有得自准确结果的高有效性，以及在重复测定时提供恒定结果的高可靠性。
将醛缩酶蛋白质用作抗原以便检测包括血浆、血清和血液的生物样品中存在的抗醛缩酶C的自身抗体。
醛缩酶，本文应用的作为本发明中与抗醛缩酶C的自身抗体的免疫复合物的抗原，包括醛缩酶A、醛缩酶B和醛缩酶C。
有三种醛缩酶同工酶，即，醛缩酶A、B和C，而且这些同工酶表现不同的组织分布。醛缩酶A主要在肌肉和红细胞内被表达，醛缩酶B主要在肝、肾和小肠内被表达，而醛缩酶C则主要在脑和神经组织内被表达。醛缩酶A、B和C之间的氨基酸序列存在很高的同源性，而且已知在它们的总体折叠和活性部位结构中，同工酶A、B和C的结构几乎是相同的(Arakaki等，Protein Sci.，2004年12月，13(12)3077～3084)。还有，已知动物种类(例如人、大鼠、小鼠等)之间醛缩酶是高度同源的。考虑到所述复合物中的抗原和抗体之间的相互作用是通过由蛋白质的氨基酸序列确定的蛋白质结构来决定的，本领域技术人员将容易理解，醛缩酶A和B以及醛缩酶C都能与醛缩酶C的自身抗体结合。
因此，可用作本发明的自身抗体检测用抗原的醛缩酶蛋白质可以是醛缩酶A、醛缩酶B或醛缩酶C，它来源于包括人、山羊、母牛、猴、绵羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠的动物，只要它与自身抗体结合并形成抗原-自身抗体复合物即可。由于针对醛缩酶A和B的自身抗体不在视网膜血管病中形成，所以当醛缩酶A或醛缩酶B被用作检测抗原时，交叉反应性不是关注的原因。在下文将描述的实施例4和5中，当将从兔肌肉分离的醛缩酶(Sigma，A2714)用作检测自身抗体的抗原时，将患有增生的和非增生的糖尿病性视网膜病的患者与正常受试验者和仅仅患有糖尿病的患者区别开来。
此外，本文用作抗原的醛缩酶包括醛缩酶变体，它们的实例是氨基酸序列变体。如本文应用的术语“氨基酸序列变体”表示具有一条包含一个或多个与天然氨基酸序列不同的氨基酸残基的序列，而且可能是天然产生的或人工产生的。氨基酸序列的改变包括通过缺失、插入、保守的或非保守的置换或其组合产生的变体。优选的是具有70％或更高的同源性的变体。
如本文应用的术语“同源性”表示与野生型氨基酸序列相比的序列相似性的程度。可通过手工或应用可商购的程序进行同源性评价。应用可商购的计算机程序，两条或更多条序列之间的同源性可以百分数(％)表示。本发明包括具有与编码野生型醛缩酶的氨基酸序列的70％或更高、更优选具有80％或更高、甚至更优选90％或更高的同源性的氨基酸序列。
醛缩酶变体是一种发挥与天然蛋白质相同的生物活性的功能等同物，或者优选是对自身抗体具有增强的结合亲和性或结合特异性的变体。
此外，用作针对醛缩酶C的自身抗体(抗-醛缩酶C自身抗体)的抗原的醛缩酶包括前述醛缩酶的抗原片段。
如本文应用的术语“抗原片段”表示含有一个或多个能特异性地与抗体(具体是抗-醛缩酶C自身抗体)的抗原结合位点结合的表位的片段。详细说来，抗原片段是醛缩酶A、醛缩酶B、醛缩酶C或其变体的片段，它包括一个或多个表位。对片段的长度没有特别限制，只要它充当特异性地结合自身抗体的抗原即可。
醛缩酶可通过本领域普遍已知的各种方法获得，包括从天然源提取和纯化，应用固相肽合成技术的化学合成，以及无细胞的蛋白质合成。还有，可利用基因重组技术从动物细胞或微生物分离和纯化重组蛋白质。当应用基因重组技术时，可通过下列方法获得醛缩酶：将编码醛缩酶蛋白质的核酸插入合适的表达载体，用该载体转化宿主细胞并培养转化体而表达醛缩酶，然后从所述宿主细胞回收表达的醛缩酶。可通过一般的生化分离技术来分离和纯化醛缩酶，例如，用蛋白质沉淀剂处理(盐析)，离心，超声处理，超滤，透析，各种色谱技术，包括分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸收色谱法、离子交换色谱法和亲和色谱法。通常，利用两种或多种组合的技术以便分离高度纯化的蛋白质。
用作本发明的抗-醛缩酶C自身抗体的抗原的醛缩酶的详细实例包括：具有序列号1的氨基酸序列的人醛缩酶A(基因库NP_908932，NP_908930)、具有序列号2的氨基酸序列的人醛缩酶B(基因库NP_000026，CAI14615)和具有序列号3的氨基酸序列的人醛缩酶C(基因库AAP35652，NP_00515)。
另一方面，本发明涉及一种诊断视网膜血管病的试剂盒，它包含醛缩酶。
用来通过测定生物样品中抗-醛缩酶C自身抗体的水平而诊断视网膜血管病的试剂盒，包含用作与抗-醛缩酶C自身抗体反应的抗原的醛缩酶蛋白质。
抗原-抗体复合物形成可通过免疫技术检测，例如蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、放射免疫扩散、奥脱洛尼免疫扩散(ouchterlony immunodiffusion)、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析、补体结合分析、免疫荧光法、FACS和蛋白质碎片，但本发明不限于这些实例。
除了与自身抗体特异性地结合的醛缩酶以外，本发明用于诊断视网膜血管病的试剂盒还可包括常用于免疫分析领域中的工具、试剂等。这些工具/试剂包括但不限于：合适的载体、能产生可检测到的信号的标记物质、加溶剂、洗涤剂、缓冲剂和稳定剂。当所述标记物质是酶时，所述试剂盒可含有能测定酶活性的底物和反应终止剂。本发明的诊断盒可呈微量培养板、浸量尺器具(dip-stick device)、免疫层析检测条、径向分配免疫测定装置、流通式装置等的型式。另外，本发明的诊断盒可含有正性和负性标准对比物。
优选地，所述诊断盒是一种酶联免疫吸附测定诊断盒。酶联免疫吸附测定包括多种酶联免疫吸附测定法，包括一种酶联免疫吸附测定法，它利用识别与固定在固态载体上的抗原形成复合物的捕捉抗体的次级标记抗体；以及夹心式酶联免疫吸附测定法，其中，这样检测与固定在固态载体上的抗体结合的捕捉抗原，即，首先添加一种抗原特异性抗体，然后添加结合该抗原特异性抗体的次级标记抗体。更优选地，抗原-抗体复合物形成是通过这种酶联免疫吸附测定法检测的：其中，使血清样品与固定在固态载体上的抗体反应，再通过添加与抗原特异性抗体结合的次级标记抗体而检测形成的抗原-抗体复合物，接着酶促展开。
前述酶联免疫吸附测定诊断盒可能包括一种次级抗体结合，它与醛缩酶C的自身抗体结合。用检测标记标记的次级抗体优选是抗-人免疫球蛋白G或抗-人免疫球蛋白M抗体。所述次级抗体起检测抗体的作用。由于次级抗体具有一个检测标记，自身抗体的量可通过测定所述检测标记的信号大小来确定。
所述检测标记可选自下组物质：酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒、氧化还原分子和放射性同位素，但本发明不限于这些实例。可作为检测标记得到的酶的实例包括但不限于：β-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、尿素酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡糖氧化酶、己糖激酶和鸟苷二磷酸酶(GDPase)、RNA酶(RNase)、葡糖氧化酶和荧光素酶、果糖磷酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶和β-内酰胺酶(β-latamase)。荧光物质的实例包括但不限于：荧光生、异硫氰酸盐、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛(o-phthaldehyde)和荧光胺(fluorescamin)。配体的实例包括但不限于生物素衍生物。发光物质的实例包括但不限于：吖啶酯、荧光素和荧光素酶。微粒的实例包括但不限于胶态金和有色胶乳。氧化还原分子的实例包括但不限于：二茂铁、钌络合物、viologen、醌、Ti离子、Cs离子、二酰亚胺、1，4-苯醌、氢醌、K4W(CN)8、[Os(bpy)3]2+、[RU(bpy)3]2+和[MO(CN)8]4-。放射性同位素的实例包括但不限于：3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
在进一步的方面，本发明涉及一种诊断视网膜血管病的方法，它包括，使生物样品与醛缩酶接触，并且检测形成的抗原-自身抗体复合物。
利用该方法，可以诊断怀疑患有视网膜血管病例如糖尿病性视网膜病的患者，从而通过将该患者的样品中抗原-自身抗体复合物的水平与对照者中的那些比较来确定该患者实际上是否患有所述疾病。
其中检测抗-醛缩酶自身抗体的生物样品包括但不限于：血液、血清和血浆。
如本文应用的术语“抗原-自身抗体复合物”表示抗-醛缩酶C自身抗体和醛缩酶抗原的结合产物。形成的抗原-抗体复合物的量可利用与自身抗体反应的次级抗体来定量地测定。
例如，诊断视网膜血管病的方法包括下列步骤：
1)使生物样品与醛缩酶接触而形成抗原-自身抗体复合物；2)将该复合物与针对自身抗体的次级标记抗体一起保温；以及3)测定所述次级标记抗体的信号大小。
这里，可通过评价绝对的(例如μg/ml)或相对的(例如信号的相对强度)差异来诊断视网膜血管病以确定对比物和目标样品之间是否存在形成的抗原-自身抗体复合物的水平的显著差异。
用来形成抗原-自身抗体复合物的抗原可包括前述醛缩酶同工酶，其变体或片段及其抗独特型抗体。如本文应用的术语“抗独特型抗体”表示识别可变区(即，抗体的独特型区)的抗体。就本发明的目的来说，抗独特型抗体是针对抗-醛缩酶C自身抗体的抗体。
通过如下实施例可获得对本发明的更好理解，给出这些实施例是为了阐述而不能认为是限制本发明。
实施例1：应用蛋白质印迹法对针对人视网膜蛋白质的自身抗体的分析人视网膜蛋白质的分离
从人眼(由Shinchon Severance Hospital，Seoul，Korea提供)切除视网膜并用生理盐水漂洗数次。利用ProteoPrep UniversalExtraction Kit(Sigma S2813)获得彼此分离的细胞溶胶部分和膜部分，并且应用Pierce BCA Protein Assay Kit 23227(Pierce，USA)测定两部分的视网膜蛋白质浓度。
应用视网膜蛋白质通过蛋白质印迹分析筛选来自正常受试验者和患者的血清
如下述通过蛋白质印迹法检验抗-视网膜自身抗体的存在。将30μg总的视网膜蛋白质在12％丙烯酰胺凝胶上进行电泳操作，再转移到硝化纤维素膜上。将所述印迹与来自正常受试验者、糖尿病患者(DM)、患有非增生的糖尿病性视网膜病(NPDR)的患者和患有增生的糖尿病性视网膜病(PDR)的患者的血清样品(由Shinchon SeveranceHospital，Seoul，Korea提供)中所含的抗体一起保温，然后与作为次级抗体的用过氧化物酶(KOMA Biotech Inc.，Korea)标记的抗-人免疫球蛋白G(IgG)抗体一起保温。将结果归纳于下表1中，还给出于图1中。
                                            表1
  细胞溶胶部分   膜部分
  IgG重链号   MW(kDa)   对比物   正常受试验者   DM   NPDR   PDR   对比物   DM   NPDR   PDR
  1   56.1   +   +   +   +   +   +
  2   53.4   ++   +   +
  3   44.4   +   +   +++   ++   +
  4   63.5   +
  5   58.9   +   +
  6   40.7   +
  7   79.2   +   +
  8   65.0   +   +   +   +
  9   49.6   +   ++   +   +
  10   26.1   +   +
  11   73.6   +++
在表1中，“DM”表示糖尿病患者，“NPDR”表示患有非增生的糖尿病性视网膜病的患者，而“PDR”表示患有增生的糖尿病性视网膜病的患者。符号“+”表示蛋白质印迹中出现一个正带，而该符号的数量表示该带的强度。
实施例2：人视网膜蛋白质的2-D凝胶电泳和蛋白质印迹
2-D凝胶电泳
应用二维(2-D)电泳，即一种利用蛋白质的两个不同性质的逐步分离方法来分离视网膜蛋白质。首先，通过对蛋白质施加电刺激使蛋白质按pH(pH 3～10梯度)迁移。其次，使蛋白质按分子量在丙烯酰胺凝胶(8～18％梯度)上迁移。以50mA/凝胶的电流进行第一维凝胶电泳(按pH的蛋白质迁移)达12小时，再在聚丙烯酰胺凝胶上以50mA/凝胶的电流进行第二维凝胶电泳(按分子量的蛋白质迁移)达6小时。用染料考马斯亮蓝-250将这样迁移的蛋白质染色，还通过银染色分析。根据上述方法制备了总计四块凝胶。对凝胶之一估测了蛋白质分布，正常受试验者具有在2-D凝胶上的该蛋白质分布，结果给出于图2中。图2中的数字表示下表2的斑点号。将余下的三块凝胶分别切割成四片并进行蛋白质印迹法分析。
蛋白质印迹法
对2-D电泳凝胶进行蛋白质印迹法分析以鉴定抗-视网膜自身抗体。根据与实施例1中相同的方法，应用正常受试验者、患有非增生的糖尿病性视网膜病的患者和患有增生的糖尿病性视网膜病的患者的血清进行蛋白质印迹法分析。结果给出于图3a、3b和3c中。
为了研究正常受试验者和患有糖尿病性视网膜病的患者之间血清抗体的差异，利用图像分析软件Phoretix(Nonlinear dynamics，Great Britain)分析2-D凝胶图像。利用MALDI-TOF质谱分析法，通过比较所述两组分析了从2-D电泳凝胶获得的斑点。结果，发现在患有糖尿病性视网膜病的患者血清中存在针对下表2中列出的视网膜蛋白质的自身抗体。将关于患有糖尿病性视网膜病的患者中出现的自身抗体的抗原性蛋白质归纳于下表2中。
                        表2
  斑点号   蛋白质名称
  1   α-烯醇化酶(非神经烯醇化酶)
  2   蛋白质KIAA0193
  3   未命名的蛋白质产物甲状腺激素结合蛋白质前体
  4   肌酸激酶-B
  5   DDAH1蛋白质
  6   乳酸脱氢酶B
  7   加帽蛋白质(肌动蛋白丝)肌z-系，β
  8   类二氢嘧啶酶2
  9   2-磷酸丙酮酸-水合酶α-烯醇化酶
  10   醛缩酶C
  11   甘油醛-3-磷酸脱氢酶
  12   磷酸甘油酸激酶1(引物识别蛋白质2(PRP2))
  13   乳酸脱氢酶A
  14   碳酸酐酶II
  15   葡糖苷酶IIβ-亚单位
  16   HS24/P52
  17   钙网蛋白
  18   微管蛋白β-4q链
  19   β-微管蛋白
  20   鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，β-4
  21   鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，β多肽1
  22   前列腺结合蛋白；磷脂酰乙醇胺结合蛋白
实施例3：应用肌酸激酶B通过酶联免疫吸附测定法诊断糖尿病性视网膜病
考查应用肌酸激酶B的酶联免疫吸附测定法以确定它是否有效地区分来自患有糖尿病性视网膜病的患者的血清与来自正常受试验者和只患有糖尿病的患者的血清。
应用来自三名正常受试验者、十名没有患糖尿病性视网膜病的糖尿病患者和二十名患糖尿病性视网膜病的患者的血清(由ShinchonSeverance Hospital，Seoul，Korea提供)进行了酶联免疫吸附测定。
首先，在室温下用100μl以10μg/ml溶于涂布缓冲液(50mMNaHCO3，pH 9.0)的肌酸激酶B(Sigma，C6638)涂布96孔EIA板的每个孔(每孔1μg蛋白质)达1hr。用400μl PBST(磷酸盐缓冲盐水，0.05％Tween 20)洗涤板的每个孔两次(每次洗涤10min)后，用封闭液1％BSA(牛血清白蛋白)的PBS溶液处理。然后，往每孔添加100μl用PBST稀释的患者血清，接着保温1hr。用PBS洗涤五次后，使每孔与100μl用过氧化物酶(KOMA Biotech Inc.，Korea)标记的抗-人IgG抗体稀溶液反应1hr。用PBS洗涤三次后，使每孔与100μl的含1mg/ml OPD(邻苯二胺二盐酸盐)和0.03％H2O2的0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 4.9)在室温下反应30min。用100μl 3M硫酸终止反应。用酶联免疫吸附测定读出器测定了450nm处的吸光度。图4中给出了结果。
结果，对正常受试验者来说平均吸光度值是0.04，对只患糖尿病的患者是0.05，对患有非增生的糖尿病性视网膜病的患者是0.08，以及对患有增生的糖尿病性视网膜病的患者是0.08。
患有非增生的和增生的糖尿病性视网膜病的患者的血清中抗-肌酸激酶B自身抗体的水平高于正常受试验者和只患糖尿病的患者的水平，而且利用肌酸激酶B作为抗原有效地检测了抗-肌酸激酶B自身抗体。
实施例4：应用醛缩酶通过酶联免疫吸附测定法诊断糖尿病性视网膜病
应用醛缩酶作为抗原通过酶联免疫吸附测定法检测针对醛缩酶C的自身抗体而诊断了糖尿病性视网膜病。该实施例中应用的醛缩酶抗原是可商购的，而且得自兔肌肉。
应用来自三名正常受试验者、十名没有患糖尿病性视网膜病的糖尿病患者和二十名患糖尿病性视网膜病的患者的血清(由ShinchonSeverance Hospital，Seoul，Korea提供)进行了酶联免疫吸附测定。首先，在室温下用100μl以10μg/ml溶于涂布缓冲液(50mM NaHCO3，pH 9.0)的醛缩酶(Sigma，A2714)涂布96孔EIA板的每个孔(每孔1μg蛋白质)达1hr。用400μl PBST洗涤板的每个孔两次(每次洗涤10min)后，用封闭液1％BSA的PBS溶液处理。然后，往每孔添加100μl用PBST稀释的患者血清，接着保温1hr。用PBS洗涤五次后，使每孔与100μl用过氧化物酶(KOMA Biotech Inc.，Korea)标记的抗-人IgG抗体稀溶液反应1hr。用PBS洗涤三次后，使每孔与100μl的含1mg/ml OPD和0.03％H2O2的0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 4.9)在室温下反应30min。用100μl 3M硫酸终止反应。用酶联免疫吸附测定读出器测定450nm处的吸光度。图5中给出了结果。
结果，对正常受试验者来说平均吸光度值是0.78，对只患糖尿病的患者是0.84，对患有非增生的糖尿病性视网膜病的患者是0.98，而且对患有增生的糖尿病性视网膜病的患者是1.0。利用正常受试验者的血清作空白，与来自只患糖尿病的患者和正常受试验者的血清样品相比，来自患有糖尿病性视网膜病(增生的和非增生的)的患者的血清样品表现出大于约3的增大的吸光度差异。
这些结果说明了，可应用醛缩酶作为抗原通过检测针对醛缩酶C的自身抗体的血清水平的增大来诊断糖尿病性视网膜病。
实施例5：应用醛缩酶通过酶联免疫吸附测定法评估治疗后的糖尿病性视网膜病
通过酶联免疫吸附测定法评估了已接受了诸如外科手术这样的治疗的糖尿病性视网膜病患者的治疗后结果。应用来自六名患进行性糖尿病性视网膜病的患者和十一名已经治疗(例如通过外科手术)过糖尿病性视网膜病的患者的血清(由Shinchon Severance Hospital，Seoul，Korea提供)进行了酶联免疫吸附测定。
根据与实施例4中相同的方法进行了酶联免疫吸附测定。测定了450nm处的吸光度，图6中给出了结果。结果，对于通过例如外科手术成功地治疗后的糖尿病性视网膜病患者来说，平均吸光度值是0.112，而对于尽管治疗过仍在发展糖尿病性视网膜病的患者是0.451，所以显示大于约3的吸光度差异。
发现了成功地治疗后的糖尿病性视网膜病患者中抗-醛缩酶C自身抗体的血清水平降低了。这些结果表明，针对醛缩酶C的自身抗体的检测导致有效地分析患有糖尿病性视网膜病的患者的治疗后结果。
由于本说明书中公开的实施例和附图中示出的结构不代表本发明的全部技术实质而只是本发明最优选的实施方案，所以本领域技术人员应懂得，在申请本发明之时，能替代它们的各种等同物和修饰都是可能的。
工业适用性
本发明的诊断视网膜血管病的组合物、含有它的试剂盒和应用它的分析方法能简单而迅速地诊断视网膜血管病。此外，由于本方法应用了免疫技术，它提供了与常规试验方法相比优异的准确性和精确性，而且是非常节省成本的。
                       序列表
<110>KUHNIL PHARM.CO.，LTD
<120>用于诊断视网膜血管病的包含醛缩酶的组合物以及应用它诊断的方法
<150>KR10-2004-0052385
<151>2004-07-06
<160>3
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>364
<212>PRT
<213>人
<400>1
Met Pro Tyr Gln Tyr Pro Ala Leu Thr Pro Glu Gln Lys Lys Glu Leu
1                 5                  10                  15
Ser Asp Ile Ala His Arg Ile Val Ala Pro Gly Lys Gly Ile Leu Ala
             20                  25                  30
Ala Asp Glu Ser Thr Gly Ser Ile Ala Lys Arg Leu Gln Ser Ile Gly
         35                  40                  45
Thr Glu Asn Thr Glu Glu Asn Arg Arg Phe Tyr Arg Gln Leu Leu Leu
     50                  55                  60
Thr Ala Asp Asp Arg Val Asn Pro Cys Ile Gly Gly Val Ile Leu Phe
 65                  70                  75                  80
His Glu Thr Leu Tyr Gln Lys Ala Asp Asp Gly Arg Pro Phe Pro Gln
                 85                  90                  95
Val Ile Lys Ser Lys Gly Gly Val Val Gly Ile Lys Val Asp Lys Gly
            100                 105                 110
Val Val Pro Leu Ala Gly Thr Asn Gly Glu Thr Thr Thr Gln Gly Leu
        115                 120                 125
Asp Gly Leu Ser Glu Arg Cys Ala Gln Tyr Lys Lys Asp Gly Ala Asp
    130                 135                 140
Phe Ala Lys Trp Arg Cys Val Leu Lys Ile Gly Glu His Thr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Ala Leu Ala Ile Met Glu Asn Ala Asn Val Leu Ala Arg Tyr Ala Ser
                165                 170                 175
Ile Cys Gln Gln Asn Gly Ile Val Pro Ile Val Glu Pro Glu Ile Leu
            180                 185                 190
Pro Asp Gly Asp His Asp Leu Lys Arg Cys Gln Tyr Val Thr Glu Lys
        195                 200                 205
Val Leu Ala Ala Val Tyr Lys Ala Leu Ser Asp His His Ile Tyr Leu
    210                 215                 220
Glu Gly Thr Leu Leu Lys Pro Asn Met Val Thr Pro Gly His Ala Cys
225                 230                 235                 240
Thr Gln Lys Phe Ser His Glu Glu Ile Ala Met Ala Thr Val Thr Ala
                245                 250                 255
Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Ala Val Thr Gly Ile Thr Phe Leu Ser
            260                 265                 270
Gly Gly Gln Ser Glu Glu Glu Ala Ser Ile Asn Leu Asn Ala Ile Asn
        275                 280                 285
Lys Cys Pro Leu Leu Lys Pro Trp Ala Leu Thr Phe Ser Tyr Gly Arg
    290                 295                 300
Ala Leu Gln Ala Ser Ala Leu Lys Ala Trp Gly Gly Lys Lys Glu Asn
305                 310                 315                 320
Leu Lys Ala Ala Gln Glu Glu Tyr Val Lys Arg Ala Leu Ala Asn Ser
                325                 330                 335
Leu Ala Cys Gln Gly Lys Tyr Thr Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala
            340                 345                 350
Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser Asn His Ala Tyr
        355                 360
<210>2
<211>364
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Ala His Arg Phe Pro Ala Leu Thr Gln Glu Gln Lys Lys Glu Leu
  1               5                  10                  15
Ser Glu Ile Ala Gln Ser Ile Val Ala Asn Gly Lys Gly Ile Leu Ala
             20                  25                  30
Ala Asp Glu Ser Val Gly Thr Met Gly Asn Arg Leu Gln Arg Ile Lys
         35                  40                  45
Val Glu Asn Thr Glu Glu Asn Arg Arg Gln Phe Arg Glu Ile Leu Phe
     50                  55                  60
Ser Val Asp Ser Ser Ile Asn Gln Ser Ile Gly Gly Val Ile Leu Phe
65                  70                  75                  80
His Glu Thr Leu Tyr Gln Lys Asp Ser Gln Gly Lys Leu Phe Arg Asn
                 85                  90                  95
Ile Leu Lys Glu Lys Gly Ile Val Val Gly Ile Lys Leu Asp Gln Gly
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Gly Ala Pro Leu Ala Gly Thr Asn Lys Glu Thr Thr Ile Gln Gly Leu
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Ser Leu Ala Ile Gln Glu Asn Ala Asn Ala Leu Ala Arg Tyr Ala Ser
                165                 170                 175
Ile Cys Gln Gln Asn Gly Leu Val Pro Ile Val Glu Pro Glu Val Ile
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Pro Asp Gly Asp His Asp Leu Glu His Cys Gln Tyr Val Thr Glu Lys
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Claims (10)

1.一种诊断视网膜血管病的组合物，它包含醛缩酶。
2.权利要求1的组合物，其中，所述醛缩酶是醛缩酶A、醛缩酶B、醛缩酶C、它的70％同源变体或其抗原片段。
3.权利要求1的组合物，其中，所述视网膜血管病选自下组疾病：糖尿病性视网膜病、视网膜水肿以及与年龄相关的黄斑变性。
4.一种诊断视网膜血管病的试剂盒，它包含醛缩酶。
5.权利要求4的试剂盒，其中，所述醛缩酶是醛缩酶A、醛缩酶B、醛缩酶C、它的70％同源变体或其抗原片段。
6.权利要求5的试剂盒，它进一步包含标记的抗-人免疫球蛋白G或M抗体蛋白质。
7.一种诊断视网膜血管病的方法，它包括，将生物样品与醛缩酶接触，并且检测形成的抗原-自身抗体复合物。
8.权利要求7的方法，其中，所述醛缩酶是醛缩酶A、醛缩酶B、醛缩酶C、它的70％同源变体或其抗原片段。
9.权利要求7的方法，其中，所述生物样品是血液、血浆或血清。
10.权利要求7的方法，它进一步包括，添加一种标记的抗-人免疫球蛋白G或M抗体蛋白质。
CNA2005800000212A 2004-07-06 2005-03-14 用于诊断视网膜血管病的包含醛缩酶的组合物以及应用它诊断的方法 Pending CN1839319A (zh)

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