JP5014126B2 - 網膜血管疾患診断用組成物及びキットならびに網膜血管疾患で生成された抗体を分析する方法 - Google Patents
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Description
（技術分野）
本発明は、糖尿病及び網膜血管疾患診断用組成物、該タンパク質を含む網膜血管疾患診断用キット、これをコーディングする遺伝子及びこれを用いて糖尿病及び／または網膜血管疾患で生成された抗体を分析する方法に関する。
本発明は、糖尿病及び網膜血管疾患診断用組成物、該タンパク質を含む網膜血管疾患診断用キット、これをコーディングする遺伝子及びこれを用いて糖尿病及び／または網膜血管疾患で生成された抗体を分析する方法に関する。
（背景技術）
一般に、糖尿病は微細血管系に病変を起こす複雑な代謝性疾患である。これは、全身の組織に広範囲にわたる障害を引き起し、特に目に影響を及ぼす全身疾患のうち最も重要な一つである（リ・テヒ、チェ・ヨンギル、糖尿病性血管合併症、ソウル、高麗医学、１９９３）。その中、糖尿網膜症は最もひどい合併症に属し、生活水準の向上と治療水準の発展によって糖尿病患者の寿命と有病期間が長くなるに従って重要な問題となってきた（Ｋｌｅｉｎ Ｒ． ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、１０２、５２０−５３２、１９８４）。糖尿網膜症は、血管障害による網膜の病変が網膜内に限られている非増殖性糖尿網膜症（ｎｏｎ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｒｅｔｉｏｎｓｉｓ、ＮＰＤＲ）と、網膜から硝子体腔へ新生血管組職が浸透していく増殖性糖尿網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｒｅｔｉｏｎｓｉｓ、ＰＤＲ）とに区分する（Ｇｒｅｅｎ、Ｉｎ：Ｓｐｅｎｃｅｒ ＷＨ、ｅｄ．、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ａｎ ａｔｌａｓ ａｎｄ ｔｅｘｔｂｏｏｋ．４ｔｈ ｅｄ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒ；１１２４−１１２９、１９９６）。糖尿網膜症による視力低下は、増殖性糖尿網膜症における硝子体の出血、黄斑の牽引網膜剥離とともに黄斑変症のためであるが、これに対して手術治療とともにレーザー治療の効用性が広く知られている（Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ Ｓｔｕｄｙ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ １４、Ｉｎｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｃｌｉｎ．、２７、２３９−２５３、１９８７）。このような治療は適切な段階において施すことで、副作用を最小化しながら視力喪失を前もって防止することができる。したがって、糖尿網膜症の診断は適切な手術時期を確保するため、頻繁に検査を通じて行われなければならない。
一般に、糖尿病は微細血管系に病変を起こす複雑な代謝性疾患である。これは、全身の組織に広範囲にわたる障害を引き起し、特に目に影響を及ぼす全身疾患のうち最も重要な一つである（リ・テヒ、チェ・ヨンギル、糖尿病性血管合併症、ソウル、高麗医学、１９９３）。その中、糖尿網膜症は最もひどい合併症に属し、生活水準の向上と治療水準の発展によって糖尿病患者の寿命と有病期間が長くなるに従って重要な問題となってきた（Ｋｌｅｉｎ Ｒ． ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、１０２、５２０−５３２、１９８４）。糖尿網膜症は、血管障害による網膜の病変が網膜内に限られている非増殖性糖尿網膜症（ｎｏｎ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｒｅｔｉｏｎｓｉｓ、ＮＰＤＲ）と、網膜から硝子体腔へ新生血管組職が浸透していく増殖性糖尿網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｒｅｔｉｏｎｓｉｓ、ＰＤＲ）とに区分する（Ｇｒｅｅｎ、Ｉｎ：Ｓｐｅｎｃｅｒ ＷＨ、ｅｄ．、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ａｎ ａｔｌａｓ ａｎｄ ｔｅｘｔｂｏｏｋ．４ｔｈ ｅｄ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒ；１１２４−１１２９、１９９６）。糖尿網膜症による視力低下は、増殖性糖尿網膜症における硝子体の出血、黄斑の牽引網膜剥離とともに黄斑変症のためであるが、これに対して手術治療とともにレーザー治療の効用性が広く知られている（Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ Ｓｔｕｄｙ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ １４、Ｉｎｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｃｌｉｎ．、２７、２３９−２５３、１９８７）。このような治療は適切な段階において施すことで、副作用を最小化しながら視力喪失を前もって防止することができる。したがって、糖尿網膜症の診断は適切な手術時期を確保するため、頻繁に検査を通じて行われなければならない。
糖尿病の診断は、小便または血液中の糖の量を測定することで行われるが、食事等によってその量の変化があり、病気の進行を診断するには無理がある。
糖尿網膜症の診断は、眼底における特徴的な構造変化を観察して行われるが、現在までの診断方法としては、眼科で行われる眼底撮影による検査だけが可能である。したがって、糖尿病患者が自覚症状で視力の異常を感じることなく、定期的な眼科検査を受けない状況においては、早期診断は不可能である。これによって、早期の診断が難しく、予防及び手術時期を逃す場合が多い。
（発明の開示）
したがって、本発明の目的は前記問題点を解決するために案出されたものであって、本発明は配列番号１ないし２２のアミノ酸配列に記載されたタンパク質から構成された群より選択された１つ以上のタンパク質またはその切片を含む糖尿病診断用組成物を提供する。
したがって、本発明の目的は前記問題点を解決するために案出されたものであって、本発明は配列番号１ないし２２のアミノ酸配列に記載されたタンパク質から構成された群より選択された１つ以上のタンパク質またはその切片を含む糖尿病診断用組成物を提供する。
また、本発明は配列番号１ないし９及び配列番号１１ないし２２のアミノ酸配列に記載されたタンパク質から構成された群より選択された１つ以上のタンパク質またはその切片を含む血管疾患診断用組成物を提供する。
本発明の組成物は、配列番号４のアミノ酸配列に記載されたタンパク質またはその切片を含むことが望ましい。
本発明において、前記網膜血管疾患は糖尿網膜症、網膜浮腫または老人性黄斑変性を含むが、これに限定されない。
さらに、本発明は本発明のタンパク質またはその切片を含む糖尿病または網膜血管疾患診断用キットを提供する。
また、本発明は本発明のタンパク質またはその切片を含む網膜血管疾患診断用キットを提供する。本発明においては、前記キットは標識された抗免疫グロブリンＧ抗体タンパク質をさらに含むことが望ましい。
また、本発明は配列番号１ないし９及び配列番号１１ないし２２のアミノ酸配列に記載されたタンパク質から構成された群より選択された１つ以上のタンパク質を血液と接触させる段階を含む、網膜血管疾患で生成された抗体を分析する方法を提供する。本発明の方法において、前記抗体を分析する方法は標識された抗免疫グロブリンＧ抗体タンパク質を添加する段階をさらに含むことが望ましい。
以下、本発明を説明する。
本発明は、前述した必要性を満たす糖尿病あるいは網膜血管疾患診断用タンパク質及びその切片、これを含む網膜血管疾患診断用キット、これをコーディングする遺伝子並びにこれを用いて網膜血管疾患で生成された抗体を分析する方法を提供するものである。
前記目的を達成するため、糖尿病または疾患診断用タンパク質及びその切片、これを含む診断用キット、これをコーディングする遺伝子並びにこれを用いて網膜血管疾患で生成された抗体を分析する方法を提供する。
前記目的を達成するため、糖尿病または疾患診断用タンパク質及びその切片、これを含む診断用キット、これをコーディングする遺伝子並びにこれを用いて網膜血管疾患で生成された抗体を分析する方法を提供する。
本発明者らは、眼球内の血管に血液−眼膜（ｂｌｏｏｄ−ｏｃｕｌａｒ ｂａｒｒｉｅｒ）が存在し、これによって網膜のタンパク質は正常な状況では免疫系に露出しないが、糖尿病のような血管の疾患においては網膜タンパク質が免疫系に露出して自己抗体（ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ）が生成できることを確認した。本発明者らは、このような自己抗体を用いて血液から網膜血管疾患を診断し易くするための診断用タンパク質及びその切片、これを含むキット、これをコーディングする遺伝子並びにこれを用いて糖尿病で生成された抗体を分析する方法に想到した。
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明の一態様は、前記目的を達成するための配列番号１ないし９及び１１ないし２２のアミノ酸配列でなる網膜血管疾患診断用タンパク質及びその切片を提供する。本発明者らは、本発明のタンパク質及びその切片が網膜血管疾患を持った患者の網膜血管から流出されて血液で自己抗体を誘導し、この自己抗体の増加が本発明のタンパク質及びその切片を用いて測定できることに想到した。
本発明者らは、１次元及び２次元ウエスタン免疫ブロット法（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）の実験を施して前記事実を確認した。また、自己抗体を生成できる多くのタンパク質のうち一部を用いた酵素リンク免疫学的分析法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、以下「ＥＬＩＳＡ」とする）で実際患者の血液に対する評価実験を行った結果、本発明が網膜血管疾患を効果的に診断することができることを確認した。
前記タンパク質は人間のみならず、動物のタンパク質も含まれる。
本発明タンパク質のアミノ酸配列において、タンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内でアミノ酸の置換、付加または欠失が可能であり、目的によってタンパク質の一部だけが用いられることもできる。そのような変形されたアミノ酸配列もまた本発明の範囲に含まれる。よって、本発明は網膜血管疾患タンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。実質的に同じポリペプチドとは、８０％以上、望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有するものなどを意味する。
本発明によって診断が可能な疾患は、糖尿病及び糖尿網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、老人性黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、網膜浮腫などのように眼球内の血管に網膜タンパク質が露出した疾患が望ましく、特に糖尿網膜症がさらに望ましいが、これに限定されることではない。
本発明の他の態様は、前記タンパク質またはその切片を含む診断用キットを提供する。本発明のキットは前記タンパク質またはその切片を含むＥＬＩＳＡ方法に利用できるキットであり、当業者に公知の様々な添加剤が本発明のキットに含まれることができる。望ましくは、本発明のキットは前記タンパク質またはその切片が付着したウェルプレートを含む。
また望ましくは、本発明の診断用キットは前記タンパク質またはその切片によって患者の血液内で生成された自己抗体に結合することができる抗抗体タンパク質を含み、さらに望ましくは、前記抗抗体タンパク質は吸光度を測定するための標識を含んでいる。前記標識としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ビオチンなどのように当業者に公知の、ＥＬＩＳＡ方法に利用できる様々な酵素で標識されることができる。
本発明のさらに他の態様は、配列番号１ないし９及び１１ないし２２のアミノ酸配列からなる糖尿疾患診断用タンパク質をコーディングする遺伝子を提供する。コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）によって、または前記タンパク質を発現させようとする生物で選好されるコドンを考慮して、本発明の遺伝子はコーディング領域から発現する、目的とする糖尿性疾患診断用タンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内で、コーディング領域に多様な変形ができ、コーディング領域を除いた部分においても、遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内で多様な変形または修飾が可能であり、そのような変形遺伝子もまた本発明の範囲に含まれる。よって、本発明は前記タンパク質をコーディングする遺伝子と実質的に同じ塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む。実質的に同じポリヌクレオチドとは、８０％以上、望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の塩基配列相同性を有するものなどを意味する。
本発明のさらに他の態様は、前記診断用タンパク質を採取された血液と接触させる段階を含む、糖尿性疾患で生成された抗体を分析する方法を提供する。望ましくは、前記抗体を分析する方法は標識された抗抗体タンパク質を添加する段階をさらに含み、より望ましくは前記抗抗体タンパク質は抗免疫グロブリンＧ抗体タンパク質である。
また、前記抗体を分析する方法の標識は吸光度を用いることが望ましく、この標識としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ビオチンなどのように当業者に公知の、ＥＬＩＳＡ方法に利用できる様々な酵素が含まれることができる。
（図面の簡単な説明）
図１は、ヒト網膜タンパク質に対する正常人、糖尿患者、非増殖性糖尿網膜症患者、増殖性糖尿網膜症患者の細胞質分画及び膜分画に対する血清ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）の結果である。
図１は、ヒト網膜タンパク質に対する正常人、糖尿患者、非増殖性糖尿網膜症患者、増殖性糖尿網膜症患者の細胞質分画及び膜分画に対する血清ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）の結果である。
図２は、ヒト網膜タンパク質に対する２次元電気泳動の結果である。
図３は、図２の電気泳動したゲルを健康な男性の血清を用いて４部分に分け、ウエスタンブロットした結果である。
図４は、図２の電気泳動したゲルを非増殖性糖尿網膜症患者の血清を用いて４部分に分け、ウエスタンブロットした結果である。
図５は、図２の電気泳動したゲルを増殖性糖尿網膜症患者の血清を用いて４部分に分け、ウエスタンブロットした結果である。
図６は、クレアチンキナーゼ（ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）Ｂを用いた正常人、糖尿患者、非増殖性糖尿網膜症患者、増殖性糖尿網膜症患者の血清に対するＥＬＩＳＡ診断の結果である。
図７は、アルドラーゼＣ（ａｌｄｏｌａｓｅＣ）を用いた正常人、糖尿患者、非増殖性糖尿網膜症患者、増殖性糖尿網膜症患者の血清に対するＥＬＩＳＡ診断の結果である。
（発明を実施するための最良の形態）
以下、本発明を実施例に挙げてより詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を具体的に例示するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
以下、本発明を実施例に挙げてより詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を具体的に例示するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
（実施例１：ウエスタンブロットを利用したヒト網膜タンパク質に対する自己抗体分析）
＜ヒト網膜タンパク質の分離＞
眼球から網膜だけを引き剥がした後、食塩水で数回拭き取った。ＰｒｏｔｅｏＰｒｅｐ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ Ｓ２８１３）を用いて細胞質分画（ｃｙｔｏｓｏｌ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と膜分画（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を分離した後、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ２３２２７（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）を用いて定量した。
＜ヒト網膜タンパク質の分離＞
眼球から網膜だけを引き剥がした後、食塩水で数回拭き取った。ＰｒｏｔｅｏＰｒｅｐ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ Ｓ２８１３）を用いて細胞質分画（ｃｙｔｏｓｏｌ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と膜分画（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を分離した後、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ２３２２７（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）を用いて定量した。
＜正常人及び患者血清に対する網膜タンパク質ウエスタンブロッティング＞
網膜タンパク質３０μｇを１２％アクリルアミド・ゲルで電気泳動してからニトロセルロース膜に移した後、正常人、糖尿患者、非増殖性糖尿網膜症患者及び増殖性糖尿網膜症患者の血清を用いてブロッティングし、自己抗体の存在を確認した。その結果を図１及び表１にまとめて示した。
網膜タンパク質３０μｇを１２％アクリルアミド・ゲルで電気泳動してからニトロセルロース膜に移した後、正常人、糖尿患者、非増殖性糖尿網膜症患者及び増殖性糖尿網膜症患者の血清を用いてブロッティングし、自己抗体の存在を確認した。その結果を図１及び表１にまとめて示した。
表１において、ＤＭは糖尿患者、ＮＰＤＲは非増殖性糖尿網膜症患者、ＰＤＲは増殖性糖尿網膜症患者を意味する。＋は陽性バンドが現われたことを意味し、その数はバンドの強度を示す。
（実施例２：ヒト網膜タンパク質の２次元ゲルウエスタンブロッティング）
＜２次元ゲル電気泳動＞
網膜タンパク質を２種の異なる特性を利用する段階的分離法である２次元電気泳動で分離した。第１過程はタンパク質に電気的刺激を加えてタンパク質要素が有するｐＨによるタンパク質移動（ｐＨ３〜１０）、第２過程はタンパク質が有するそれぞれの分子量によってアクリルアミド・ゲル（８〜１８％）上でタンパク質の移動を行った。１次元電気移動（ｐＨによるタンパク質移動）は、ゲル当り５０ｍＡの電流で１２時間移動させ、２次元電気移動（分子量によるタンパク質移動）はポリアクリルアミド上でゲル当り５０ｍＡで６時間電気移動させた。このように移動したタンパク質をＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ−２５０染料及び銀染色法で染色して存在を確認した。このようなゲルは同じ方法で４枚が作られ、１枚は正常人が持っているタンパク質の２次元ゲル上の分布を確認し、残りの３枚はそれぞれ４部分に切ってウエスタン免疫ブロッティングに使われた。その結果を図２に示した。図２に表示された数字は後述する表２のスポット番号を示す。
＜２次元ゲル電気泳動＞
網膜タンパク質を２種の異なる特性を利用する段階的分離法である２次元電気泳動で分離した。第１過程はタンパク質に電気的刺激を加えてタンパク質要素が有するｐＨによるタンパク質移動（ｐＨ３〜１０）、第２過程はタンパク質が有するそれぞれの分子量によってアクリルアミド・ゲル（８〜１８％）上でタンパク質の移動を行った。１次元電気移動（ｐＨによるタンパク質移動）は、ゲル当り５０ｍＡの電流で１２時間移動させ、２次元電気移動（分子量によるタンパク質移動）はポリアクリルアミド上でゲル当り５０ｍＡで６時間電気移動させた。このように移動したタンパク質をＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ−２５０染料及び銀染色法で染色して存在を確認した。このようなゲルは同じ方法で４枚が作られ、１枚は正常人が持っているタンパク質の２次元ゲル上の分布を確認し、残りの３枚はそれぞれ４部分に切ってウエスタン免疫ブロッティングに使われた。その結果を図２に示した。図２に表示された数字は後述する表２のスポット番号を示す。
＜ウエスタン免疫ブロット＞
２次元ゲル電気泳動されたゲルを正常人、非増殖性糖尿網膜症患者及び増殖性糖尿網膜症患者の血清を用いてブロッティングし、自己抗体の位置を確認した。その結果をそれぞれ図３、図４及び図５に示した。
２次元ゲル電気泳動されたゲルを正常人、非増殖性糖尿網膜症患者及び増殖性糖尿網膜症患者の血清を用いてブロッティングし、自己抗体の位置を確認した。その結果をそれぞれ図３、図４及び図５に示した。
正常人が持っている抗体と糖尿網膜症患者の血液内抗体との差をコンピューターでイメージ分析ソフトウェアのＰｈｏｒｅｔｉｘ（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ、英国）を用いて分析した。この２つの群間の分析結果を２次元ゲルに代入して得たスポット（ｓｐｏｔ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて分析し、糖尿網膜症患者の血液に表２のタンパク質に対する自己抗体が形成されることを確認した。糖尿網膜症患者から現われる自己抗体に対する抗原タンパク質を表２にまとめて示した。
（実施例３：クレアチンキナーゼＢを利用したＥＬＩＳＡ方法による糖尿網膜症の診断）
クレアチンキナーゼＢを利用してＥＬＩＳＡ方法で糖尿患者のうちの糖尿網膜症患者の血清を識別できるか否かを調べるため、本実験を行った。病院から得た３人の正常人、１０人の糖尿網膜症のない糖尿患者、２０人の糖尿網膜症患者の血清を使用した。まず、ＥＩＡ９６穴プレートに各ウェル（ｗｅｌｌ）当りコーティングバッファ（５０ ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ ９.０）に１０μｇ／ｍｌの濃度に溶解されたクレアチンキナーゼＢ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ６６３８）１００μｌ（各ウェル当り１μｇのタンパク質）を常温で１時間反応させてコーティングし、４００μｌのＰＢＳＴ（ｐｈｏｓｐａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回それぞれ１０分間洗浄した後、１％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＰＢＳで後コーティングした。ＰＢＳＴで希釈された患者の血清１００μｌを入れて１時間反応させた後、ＰＢＳで５回洗浄してペルオキシダーゼで標識された抗ヒトイミノグロブリンＧ抗体（ＫＯＭＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、韓国）を希釈して１００μｌを入れて１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回洗浄した後１ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）及び０.０３％ Ｈ２Ｏ２が含有された０.１Ｍリン酸クエン酸塩バッファ（ｐＨ ４.９）１００μｌを入れて室温で３０分反応させてから、３Ｍ硫酸１００μｌを入れて反応を停止させてＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図６に示した。ＥＬＩＳＡ測定結果、正常人の抗血清内クレアチンキナーゼＢの平均値は、正常の場合０.０４、糖尿のみの患者の場合０.０６、糖尿網膜症のうち非増殖性患者の場合０.０８、増殖性の場合０.０８であった。この結果から、非増殖性と増殖性糖尿網膜症患者の血清内抗クレアチンキナーゼＢの量が増加していることが確認できた。
クレアチンキナーゼＢを利用してＥＬＩＳＡ方法で糖尿患者のうちの糖尿網膜症患者の血清を識別できるか否かを調べるため、本実験を行った。病院から得た３人の正常人、１０人の糖尿網膜症のない糖尿患者、２０人の糖尿網膜症患者の血清を使用した。まず、ＥＩＡ９６穴プレートに各ウェル（ｗｅｌｌ）当りコーティングバッファ（５０ ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ ９.０）に１０μｇ／ｍｌの濃度に溶解されたクレアチンキナーゼＢ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ６６３８）１００μｌ（各ウェル当り１μｇのタンパク質）を常温で１時間反応させてコーティングし、４００μｌのＰＢＳＴ（ｐｈｏｓｐａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回それぞれ１０分間洗浄した後、１％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＰＢＳで後コーティングした。ＰＢＳＴで希釈された患者の血清１００μｌを入れて１時間反応させた後、ＰＢＳで５回洗浄してペルオキシダーゼで標識された抗ヒトイミノグロブリンＧ抗体（ＫＯＭＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、韓国）を希釈して１００μｌを入れて１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回洗浄した後１ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）及び０.０３％ Ｈ２Ｏ２が含有された０.１Ｍリン酸クエン酸塩バッファ（ｐＨ ４.９）１００μｌを入れて室温で３０分反応させてから、３Ｍ硫酸１００μｌを入れて反応を停止させてＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図６に示した。ＥＬＩＳＡ測定結果、正常人の抗血清内クレアチンキナーゼＢの平均値は、正常の場合０.０４、糖尿のみの患者の場合０.０６、糖尿網膜症のうち非増殖性患者の場合０.０８、増殖性の場合０.０８であった。この結果から、非増殖性と増殖性糖尿網膜症患者の血清内抗クレアチンキナーゼＢの量が増加していることが確認できた。
（実施例４：クレアチンキナーゼＢを利用したＥＬＩＳＡ方法による糖尿病の診断）
さらに、病院から得た３０の正常人、６０人の糖尿患者の血清を使用し、実施例３と同様にＥＬＩＳＡ方法によって表３のような結果を得た。このような結果はクレアチンキナーゼＢを利用して糖尿病を診断できることを示す。
さらに、病院から得た３０の正常人、６０人の糖尿患者の血清を使用し、実施例３と同様にＥＬＩＳＡ方法によって表３のような結果を得た。このような結果はクレアチンキナーゼＢを利用して糖尿病を診断できることを示す。
（実施例５：アルドラーゼＣを利用したＥＬＩＳＡ方法による糖尿網膜症の診断）
アルドラーゼＣを利用してＥＬＩＳＡ方法で糖尿患者のうち糖尿網膜症患者の血清を識別できるか否かを調べるため、本研究を行った。病院から得た３人の正常人、１０人の糖尿網膜症のない糖尿患者、２０人の糖尿網膜症患者の血清を使用した。まず、ＥＩＡ９６穴プレートに各ウェル当りコーティングバッファ（５０ ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ ９.０）に１０μｇ／ｍｌの濃度に溶解されたアルドラーゼＣ（Ｓｉｇｍａ、Ａ２７１４）１００μｌ（各ウェル当り１μｇのタンパク質）を常温で１時間反応させてコーティングし、４００μｌのＰＢＳＴで２回それぞれ１０分間洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで後コーティングした。ＰＢＳＴバッファで希釈された患者の血清１００μｌを入れて１時間反応させた後、ＰＢＳで５回洗浄してペルオキシダーゼで標識された抗ヒトイミノグロブリンＧ抗体（ＫＯＭＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、韓国）を希釈して１００μｌを入れて１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回洗浄した後１ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤ及び０.０３％ Ｈ２Ｏ２が含有された０.１Ｍリン酸クエン酸塩バッファ（ｐＨ ４.９）１００μｌを入れて室温で３０分反応させてから、３Ｍ硫酸１００μｌを入れて反応を停止させてＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図７に示した。ＥＬＩＳＡ測定結果、正常人の血清内抗アルドラーゼＣ抗体の平均値は、正常の場合０.７８、糖尿のみの患者の場合０.８４、糖尿網膜症のうち非増殖性患者の場合０.９８、増殖性の場合１.０であった。この結果から、非増殖性と増殖性糖尿網膜症患者の血清内抗アルドラーゼＣ抗体の量が増加していることが確認できた。
アルドラーゼＣを利用してＥＬＩＳＡ方法で糖尿患者のうち糖尿網膜症患者の血清を識別できるか否かを調べるため、本研究を行った。病院から得た３人の正常人、１０人の糖尿網膜症のない糖尿患者、２０人の糖尿網膜症患者の血清を使用した。まず、ＥＩＡ９６穴プレートに各ウェル当りコーティングバッファ（５０ ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ ９.０）に１０μｇ／ｍｌの濃度に溶解されたアルドラーゼＣ（Ｓｉｇｍａ、Ａ２７１４）１００μｌ（各ウェル当り１μｇのタンパク質）を常温で１時間反応させてコーティングし、４００μｌのＰＢＳＴで２回それぞれ１０分間洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで後コーティングした。ＰＢＳＴバッファで希釈された患者の血清１００μｌを入れて１時間反応させた後、ＰＢＳで５回洗浄してペルオキシダーゼで標識された抗ヒトイミノグロブリンＧ抗体（ＫＯＭＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、韓国）を希釈して１００μｌを入れて１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回洗浄した後１ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤ及び０.０３％ Ｈ２Ｏ２が含有された０.１Ｍリン酸クエン酸塩バッファ（ｐＨ ４.９）１００μｌを入れて室温で３０分反応させてから、３Ｍ硫酸１００μｌを入れて反応を停止させてＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図７に示した。ＥＬＩＳＡ測定結果、正常人の血清内抗アルドラーゼＣ抗体の平均値は、正常の場合０.７８、糖尿のみの患者の場合０.８４、糖尿網膜症のうち非増殖性患者の場合０.９８、増殖性の場合１.０であった。この結果から、非増殖性と増殖性糖尿網膜症患者の血清内抗アルドラーゼＣ抗体の量が増加していることが確認できた。
実施例３及び実施例５の結果から分かるように、正常人と比べて前記抗クレアチンキナーゼＢ及び抗アルドラーゼＣの量が、抗クレアチンキナーゼＢの場合、正常人対比５０％ずつ増加したが、抗アルドラーゼＣの場合はそれぞれ２５％、２８％増加した。
このような場合、増加した血清を持った患者は糖尿網膜症があることを確認できる。
（実施例６：アルドラーゼＣを利用したＥＬＩＳＡ方法による糖尿病の診断）
さらに、病院から得た３０の正常人、６０人の糖尿患者の血清を使用して実施例５と同様にＥＬＩＳＡ方法によって表４のような結果を得た。このような結果はアルドラーゼＣを利用して糖尿病を診断できることを示す。
さらに、病院から得た３０の正常人、６０人の糖尿患者の血清を使用して実施例５と同様にＥＬＩＳＡ方法によって表４のような結果を得た。このような結果はアルドラーゼＣを利用して糖尿病を診断できることを示す。
＜産業上の利用可能性＞
本発明の糖尿及び血管疾患診断用タンパク質、これを含むキット及びこれを利用した分析方法を使用し、前記疾患を簡単かつ迅速に診断できるだけでなく、従来の検査方法と比べて免疫学的方法を使うため、正確性及び精密性に優れる。また、本発明の糖尿及び血管疾患診断用キット及びこれを利用した分析方法は非常に経済的である。
本発明の糖尿及び血管疾患診断用タンパク質、これを含むキット及びこれを利用した分析方法を使用し、前記疾患を簡単かつ迅速に診断できるだけでなく、従来の検査方法と比べて免疫学的方法を使うため、正確性及び精密性に優れる。また、本発明の糖尿及び血管疾患診断用キット及びこれを利用した分析方法は非常に経済的である。
Claims (6)
- 配列番号１０のアミノ酸配列に記載されたタンパク質またはその切片を含む、眼球内の血管に網膜タンパク質が露出した網膜血管疾患診断用組成物。
- 前記網膜血管疾患は糖尿網膜症、網膜浮腫及び老人性黄斑変性からなる群より選択された疾患であることを特徴とする請求項１に記載の網膜血管疾患診断用組成物。
- 配列番号１０のアミノ酸配列に記載されたタンパク質またはその切片を含む、眼球内の血管に網膜タンパク質が露出した網膜血管疾患診断用キット。
- 前記キットは標識された抗免疫グロブリンＧ抗体タンパク質をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載のキット。
- 配列番号１０のアミノ酸配列に記載されたタンパク質を血液と接触させる段階を含む、眼球内の血管に網膜タンパク質が露出した網膜血管疾患で生成された抗体を分析する方法。
- 前記抗体を分析する方法は標識された抗免疫グロブリンＧ抗体タンパク質を添加する段階をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の網膜血管疾患で生成された抗体を分析する方法。
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