TWI247809B

TWI247809B - Test method, diagnosis kit and monoclonal antibody

Info

Publication number: TWI247809B
Application number: TW089122612A
Authority: TW
Inventors: Masahiko Wakasugi; Ritsuko Mochida; Haruhisa Hirata
Original assignee: Wakamoto Pharmaceutical Compan
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2006-01-21
Also published as: EP1227159A1; EP1227159A4; CN1384886A; KR100756117B1; DE60045870D1; WO2001032908A1; US6849419B1; EP1227159B1; KR20020059649A; CN1195869C; BR0015145A; AU7960600A

Description

1247809 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（（） [技術領域] 本發明係關於一種以幽門螺桿菌之過氧化氫酶爲抗原的單株抗體、產生該單株抗體之融合瘤、免疫學測定法、以及診斷套組。 [背景技術] 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)爲人類之胃黏膜中可觀察到之細菌。幽門螺桿菌之感染率與社會經濟狀態有密切關係，在趨勢上，愈低開發的國家感染率愈高、愈先進的國家則感染率愈低。但日本人之感染率在先進國家中特別的高，據說40歲以上有80%的人被感染。近幾年已明白幽門螺桿菌爲導致胃潰瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎’甚至胃癌等各種胃、十二指腸疾病之可能原因。因了解到藉由滅除幽門螺桿菌可減低以上之疾病罹患可能性，因此在國際上引發各種對幽門螺桿菌滅菌之對象疾病之議論；目前所認知的有胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃惡性淋巴瘤、早期胃癌切除等爲滅菌之適應對象疾病。隨著對幽門螺桿菌殺菌被認爲是胃、十二指腸疾病之新療法，日本之日本消化器官疾病學會亦完成”治療檢驗指導原則”，提出幽門螺桿菌感染之存在診斷與殺菌判定法( 曰本消化器官疾病學會雜誌，96卷，199-207，1999年）；上述治療檢驗指導原則中，存在判斷係進行侵襲性檢查法之胃部切片組織的培養、鏡檢、尿素酶試驗，殺菌判定，則進行胃部生體採樣組織的培養、鏡檢與非侵襲性檢查法之尿素呼氣試驗。又’受驗者爲幼童等特殊情況時，則將 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐1 " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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I «1-1 1 ^eJ ϋ ϋ -1 ·ϋ 1 I I 1247809 A7 B7 五、發明說明（>) 血中抗幽門螺桿菌抗體檢查及存在診斷倂用來進行判定。但此等幽門螺桿菌感染之檢查法有以下問題。侵襲性之檢查法，由於胃內視鏡的插入及生體採樣等將造成受驗者很大痛苦。非侵襲性之檢查法雖可大幅改善受驗者痛苦，但尿素呼氣試驗必須在檢查前禁食。又尿素呼氣試驗必須有質譜儀或紅外光分光光度計等裝置，有僅能在特定單位實施、花費也高之缺點。抗體檢查因殺菌後仍有一段長時間血中抗體效價很高，因此不適於判定殺菌；故能取代此等檢查，以非侵襲、且能對於幽門螺桿菌之感染可直接、專一、靈敏檢測出之方法被期待著。以往，消化道感染菌之直接檢查法，係使用來自消化道排泄物、特別是糞便的感染菌之選擇性培養基作分離培養。惟，雖然對幽門螺桿菌有極多試驗，卻幾乎沒有從糞便中分離培養之報告。其理由在於，當幽門螺桿菌在體外，如低溫、營養缺乏、氧氣缺乏等環境條件惡化時，會由平常之螺旋狀體形態轉變成不能被培養之球狀體，故幽門螺桿菌被認爲在下消化道亦變化成不能被培養之球狀體。另一方面，關於利用抗體抗原反應原理之免疫學方法直接檢測糞便中之幽門螺桿菌，已提出利用抗幽門螺桿菌之多株抗體，以免疫測定法檢測出糞便等之排泄物檢體中之幽門螺桿菌之方法a Clin. Microbiol.，33卷，2162-2165, 1995年，特開平10-10128號公報（日本專利第3013999號)) 〇但多株抗體一般會有交叉反應，專一性不佳，且有每 4 C請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

裝-----I--訂-----111 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（h ) 批抗血淸間之抗體效價及專一性會變動等缺點，故以多株抗體作爲診斷藥之製造，會有品質管理困難之問題點。實際上，關於日本專利第3043999號之專利權人邁利迪安公司所製造，以多株抗體檢測糞便中幽門螺桿菌抗原之檢驗套組「HpSA」，便有出現僞陰性及專一性低的問題 (Medical Tribune 4-5，1999 年 6 月 3 日號；Am· J. Gastroenterol·, 94 卷，1830-1833, 1999 年）相對於此，特開平10-10128號公報中則記載因幽門螺桿菌會產生菌體變異，故僅會和單一抗原反應之單一抗體並不適合用於對幽門螺桿菌之檢測，反之，基於能對應於多種抗原或抗原決定基之觀點，多株抗體較適於對幽門螺桿菌之檢測。 [發明之簡單說明] 鑒於上述情況，本發明係以提供1種診斷方法爲目的，能不帶給受驗者痛苦、不須特別裝置，且能廉價診斷幽門螺桿菌之感染；再者，因採單一之抗體，不會交叉反應，具優良專一性，無批次差異、品管容易；再者，於使用單一之單株抗體時亦具有極佳靈敏度。本發明係提供以幽門螺桿菌之過氧化氫酶爲抗原之單株抗體。本發明係提供用以產生以幽門螺桿菌之過氧化氫酶爲抗原之單株抗體的融合瘤。本發明之融合瘤，係以實施例1所記載之21G2、41G5 或82B9爲佳。 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公餐）裝------ (請先閱讀背面之注意事項#1填寫本頁)

1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（4) 本發明之融合瘤所產生之單株抗體亦爲本發明之一部份。使用本發明之至少1種單株抗體所進行之免疫學測定法亦爲本發明之一部份。本發明之免疫學測定法係，以上述任1種單株抗體來進ί了爲佳。本發明之免疫學測定法係，以用在判定幽門螺桿菌之感染爲佳。本發明之免疫學測定法係，以消化道排泄物作檢體爲佳。本發明之免疫學測定法係，以ELISA或免疫層析法爲佳。含有本發明中之單株抗體中至少1種之診斷套組亦爲本發明之一部份。本發明之診斷套組係，以含有上述任1種單株抗體爲佳。本發明之診斷套組係，以用在判定幽門螺桿菌之感染爲佳。本發明之診斷套組係，以消化道排泄物作檢體爲佳。本發明之診斷套組係，以採行固相酵素免疫測定法 (Enzymelinked immunosorbent assay，下稱 ELISA)或免疫層析法爲佳。又’本說明書中，所謂過氧化氫酶，不包含以十二院基硫酸鈉(Sodium dodecl sulphate,下稱SDS)等之變性劑加以 6 裝--------訂i (請先閱讀背面之注意事項#1填寫本頁)

參本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（y) 變性•解離、立體構造崩解成次單元之蛋白質。 [圖式之簡單說明] 圖1所示係在實施例9中親和性層析法之洗提模式圖〇圖2所示係在實施例11中親和性層析法之洗提模式圖〇 [發明之詳細說明] 以下對本發明做詳細介紹。本發明之單株抗體係以幽門螺桿菌之過氧化氫酶爲抗原。本發明之單株抗體可由本發明之融合瘤產生，例如，可培養本發明之融合瘤，從其培養液中取得。但，本發明的單株抗體製造方法並無特別的限定，例如，即使是利用遺傳工程所得到者，只要能和幽門螺桿菌之過氧化氫酶做專一性的結合者皆屬於本發明之範圍。本發明之融合瘤，係用來產生以幽門螺桿菌之過氧化氫酶爲抗原之單株抗體，係將藉幽門螺桿菌賦予免疫後之動物的脾臟細胞或淋巴節細胞與骨髓瘤細胞融合而得到。本發明之融合瘤可由一般周知的細胞融合法製得，即以幽門螺桿菌爲免疫原對人以外之動物予以免疫，以其脾臟細胞或淋巴節細胞與骨髓瘤細胞融合製成融合瘤，由其中選出可以產生單株抗體（能辨識幽門螺桿菌）之融合瘤，來得到本發明之融合瘤。上述之免疫原只要含有幽門螺桿菌之過氧化氫酶即可 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）裝--------訂i (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

# 1247809 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（b) ，並無特別限定，例如，將幽門螺桿菌之菌株以適當培養基培養所得之培養物、螺旋狀菌體、球狀菌體、這些齒體的破碎物、溶解物、萃取物，或將其等分離者等；以上所提到之菌體，活菌或死菌皆可。上述之過氧化氫酶並無特別限定，例如，可爲已失活者、一部份的立體構造已損壞者、一部份欠缺者，但以含 4個次單位者爲佳，未經修飾者(Native)者更理想。另外，在本說明書中未經修飾之酵素乃指幾乎保持生理條件下所固有的構造者，且含有全部的次單位並具有活性者。上述之免疫原中以球狀菌體之破碎物爲佳。一般認爲，由於幽門螺桿菌在體外遇低溫、營養不足、氧氣不足等環境條件惡化下會由平常的螺旋體轉變爲無法培養之球狀體，故即使在消化道排泄物中亦會變化爲無法分離培養之球狀體。同時，一般認爲幽門螺桿菌之菌體在下消化道中處破碎之狀態。作爲上述免疫原所用之幽門螺桿菌菌株並無特別限定，例如，可舉出標準菌株ATCC43504株、NCTC11638等，亦可爲自感染患者所採得之其它菌株；作爲上述免疫原所用之幽門螺桿菌之基因型亦無特別限定，例如可具有或不具vacA或cagA，又vacA可具有Sla、Sib、S2中的任一序列，亦可具有ml、m2二者中的任一序列。爲製作本發明之融合瘤所使用的被免疫動物亦無特別限定，例如可爲山羊、羊、天竺鼠、小鼠、大鼠、兔子等 8 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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tSJ % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247809 A7 ___ B7_;__ 五、發明說明（1 ) ，但其中以小鼠爲佳。對上述被免疫動物進行免疫方法可使用一般周知之方法，例如，對小鼠進行免疫時，將1次1〜100μ§(較佳爲 50〜100μ2)之免疫用抗原以等體積(O.lmL)的生理食鹽水及 Freund之完全佐劑或RIBI佐劑系統加以乳化，對上述被免疫動物之背部、腹部之皮下或腹腔內每2〜3週接種3〜6次〇於本發明中，對上述被免疫動物進行免疫後，選出抗體效價高的個體，於最終免疫之3〜5日後將脾臟或淋巴節取出，依一般周知的細胞融合法，在融合促進劑存在的情況下，可將此等組織中所含之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合。作爲上述融合促進劑並無特別限定，可舉出例如聚乙二醇（以下稱PEG)或仙台病毒（Sendai Virus)等，但以 PEG較佳。上述骨髓瘤細胞並無特別限定，例如，可舉出P3U1、 NS]、P3x63.Ag8.653等來自小鼠的細胞，AG卜AG2等來自大鼠的細胞。上述細胞融合法並無特別限定，例如可舉出讓脾臟細胞與骨髓瘤細胞以1:1〜10:1的比例混合，以濃度10〜80%添加分子量1000〜6000之PEG，於20〜37t：(較佳爲30〜37。〇進行3〜10分鐘之溫育的方法等。於本發明中，用以產生可辨識幽門螺桿菌之單株抗體的融合瘤之選擇上，例如，可將其以僅可生長融合瘤之 9 本紙張尺度適用中關家標準（CNS)A4規格（21G X 297公釐) 裝------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

# 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247809 A7 __B7_ 五、發明說明（分） HAT培養基等的選擇性培養基進行培養後，對融合瘤培養上澄液中之抗體活性利用固相酵素免疫測定法(ELISA)等的方法來測定。再者，於本發明中，用以產生單株抗體(其可辨識幽門螺桿菌)之融合瘤之製作，例如，可對於用以產生單株抗體（其可辨識幽門螺桿菌）之融合瘤，以極限稀釋等的方法，進行反覆選殖而得。本發明中之融合瘤爲，例如，實施例1記載的21G2、 41A5 及 82B9 等。本發明之單株抗體之大量調製之方法並無特別限定，例如，可舉出對事先施予鯊肝油烷(pristane)之小鼠的腹腔內移殖融合瘤，由回收的腹水中取得的方法。腹水中之本發明之單株抗體可依據使用蛋白質A、蛋白質G管柱等一般周知的方法精製。本發明之單株抗體乃以過氧化氫酶爲抗原者。上述之過氧化氫酶只要保持有抗原決定基者，則無特別限定，例如，亦可爲已失活者、部份立體構造已毀壞者、部份欠缺者等，但以有4個次單元者爲佳，未經修飾者更理想；又，上述之過氧化氫酶亦可包含有變異者在內。產生上述過氧化氫酶之幽門螺桿菌菌株並無特別限定〇又，產生上述過氧化氫酶之幽門螺桿菌之基因型亦無特別限定’例如，可具有或不具vacA或cagA，又vacA可具有Sla、Sib、S2中的任~序列，亦可具有ml、m2二者中任一的序列。 10 本紙張ϋ適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) 裝--------訂i (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

# 1247809 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（1 ) 產生上述過氧化氫酶之幽門螺桿菌之形態並無特別限定，例如，可舉出螺旋狀體之幽門螺桿菌、球狀體之幽門螺桿菌等。本發明之單株抗體之種類、子類並無特別限定，可爲 IgGi、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgAi、IgA2、IgD 中任一種；又L鏈亦無特別限定，可爲λ鏈或κ鏈。又，本發明之單株抗體只要和幽門螺桿菌之過氧化氫酶能夠進行專一性的結合，則無特別限定，例如，可爲本發明之單株抗體之分解物F(ab>、Fab'、Fab，或嵌合（ chimera)抗原。上述之21G2、41A5及82B9之融合瘤所產生之單株抗體(以下分別以單株抗體21G2、單株抗體41A5、單株抗體 82B9稱之)係能辨識幽門螺桿菌之未經修飾之過氧化氫酶者。本發明者等分別以單株抗體21G2、單株抗體41A5、單株抗體82B9對幽門螺桿菌之菌體破碎物進行抗體固定親和性層析(affinity chromotagraphy)之結果，檢測出幽門螺桿菌之菌體破碎物中所含有之分子量270kDa之蛋白質。對此蛋白質進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳之結果，具有分子量 59kDa之單一區帶被檢測出。又，檢驗此蛋白質之N端(N-teminal)之胺基酸序列之結果，與幽門螺桿菌之過氧化氫酶之胺基酸序列一致。幽門螺桿菌之過氧化氫酶已知爲具有200kDa之分子量，且爲具有由4個分子量50kDa之次單元所組成之四元體構造(J.Gen. Microbiol· (1991)，137,57-61) 11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝訂i # 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1247809 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（β) Ο 因此，依據以上結果，單株抗體21G2、單株抗體 41Α5、單株抗體82Β9所檢測出之蛋白質被鑑定其爲具有4 個次單元之幽門螺桿菌的過氧化氫酶，上述之各單株抗體爲能辨識具有4個次單元之幽門螺桿菌的過氧化氫酶者的事實於是被解明。對以上述抗體固定親合性層析法所檢測出之過氧化氫酶測定其活性結果，發現不但具有活性，且此過氧化氫酶爲所|胃未經修飾之酵素。又，單株抗體21G2、單株抗體41Α5、單株抗體82Β9 任一者都不會和解離後之過氧化氫酶之次單元反應。幽門螺桿菌之菌體之總蛋白質中過氧化氫酶所占之比例，依據 J· Gen Microbiol. (1991)，137, 57-61 所記載之過氧化氫酶精製過程之比活性之上昇度來估算，經重量換算’ 最多爲0.5%。以此點觀之，單株抗體21G2、單株抗體41A5、單株抗體82B9可辨識具有4個次單元之過氧化氫酶之事實的確令人驚訝，且爲以往所無法預見的事。已知過氧化氫酶在異種間亦極妥善地被保存著，而幽門螺桿菌之過氧化氫酶也與其他細菌之過氧化氫酶有高度同質性(J· Bacteriol. (1996)，178(23)，6960-6967)。但，單株一〆一， —一、•- 抗體21G2、單株抗體41A5、單株抗體82B9，如賣施例3 ) 中所示，與幽門螺桿菌以外之細菌之過氧化氫酶完全不會/ ............................................ ·, . ................ ινι —一… … 反應一。 … ........— 12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） l· 11111---11^"裝---— 訂—— — — — — — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1247809 A7 B7 五、發明說明（il ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 又雖已知幽門螺桿菌存在有多種變異株（Molecular Microbiology(1996)，20, 833-842)，但驚人的是，單株抗體 21G2、單株抗體41A5、單株抗體82B9，如實施例3中所示，對任一之幽門螺桿菌都有良好反應。鑒於本發明之單株抗體對幽門螺桿菌之多種變異株都有良好反應之事實，可想成本發明之單株抗體所辨識之抗原決定基，係能良好地保存於變異株等的過氧化氫酶間之部位。依下所述，本發明之單株抗體乃以糞便爲檢體，可以極高精確度判定是否感染幽門螺桿菌。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製利用單株抗體21G2、單株抗體41A5、單株抗體82B9 ，以糞便爲檢體進行免疫學測定，結果上述各單株抗體僅會與感染幽門螺桿菌之受驗者之糞便反應。依此點，感染幽門螺桿菌之受驗者之糞便中很顯然地存在有具有4個次單元之幽門螺桿菌之過氧化氫酶。糞便中存在之幽門螺桿菌之過氧化氫酶並非解離爲各別之次單元，而是保有4個次單元之事實至今完全未被發現，有鑑於通常蛋白質在消化道中會被蛋白質分解酵素所分解，可知上述發現的確相當驚人。又，以感染幽門螺桿菌之受驗者之糞便爲試樣，製作固定有單株抗體21G2之管柱進行親合性層析’對其洗提成分進行固相酵素免疫測定法及過氧化氫酶測定’結果過氧化氫酶活性與抗原性一致。由以上可知，感染幽門螺桿菌者之糞便中含有：具4 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（丨)）之多株抗體爲適合；又，雖揭示有倂用複數之單株抗體，檢測幽門螺桿菌之方法(WOOO/26671)，但以單一之單株抗體檢測幽門螺桿菌之方法至今尙未被開發出。相對的，驚人的是本發明之單株抗體僅利用1種單株抗體便能以極佳靈敏度檢測幽門螺桿菌。又，WOOO/26671所記載之單株抗體係以：尿素、熱刺激蛋白質（heatshock protein)、鹼性氫過氧化酶-還原酶、 20kDa之蛋白質(3·去氫酶2型）、16.9kDa蛋白質(嗜中性活性化蛋白質)及33.8kDa蛋白質(果糖-雙磷酸酶—醛縮酶 (fructose-bisphosphatase-aldolase)爲抗原’關於過氧化氫酶完全未提及。又，WOOO/26671所記載之測定方法之檢測靈敏度亦不夠。本發明之免疫學測定法，可舉出例如酵素免疫測定法 (EIA)、固相酵素免疫測定法(ELISA)、放射線免疫測定法 (RIA)、螢光免疫測定法(FIA)、西方印漬法(Western Blot)法、免疫層析法法等；上述各種免疫學測定法係依據競爭法或三明治法(sandwich)，能使用經標識劑所標識之抗原或抗體以測定對象之抗原或抗體者。上述各種免疫學測定法中以ELISA法以及免疫層析法爲佳。上述競爭法，例如檢體中之幽門螺桿菌之過氧化氫酶與已知量之已標識之幽門螺桿菌之過氧化氫酶兩者，對本發明之單株抗體結合量之競爭反應。上述例示之競爭法中，係在含幽門螺桿菌之過氧化氫酶之檢體液中加入保持在 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) ' ' -----------裝-------—訂-----1--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（，呼）載體上的定量抗體’接著加入已用標識劑來標識之定量之幽門螺桿菌之過氧化氫酶。之後，對保持在載體上之標識劑或未保持在載體上之標識劑進行活性測定。此時，將抗體與已標識之抗原大約同時添加爲佳。上述三明治法’例如，藉由已固相化之本發明之單株抗體、已用標識劑標識之本發明之單株抗體，將檢體中之幽門螺桿菌之過氧化氫酶包夾，其藉由加入對於酵素等標識劑之基質使成色’來檢測檢體中之幽門螺桿菌之過氧化氫酶。上述標識劑，可舉出例如[等之放射性同位素(以下以RI稱之）、酵素、酵素基質、發光物質、螢光物質、生物素(Biotin)、著色物質等。在此等標識劑與抗原或抗體之結合上，係利用順丁燦二醯亞胺法（j· Biochem.(1976)，79, 233)、活性化生物素法(j· Am. Chem. Soc. (1978)，100, 3585) 、疏水結合法等。上述酵素，可舉出例如，過氧化酶、鹼性磷酸酶、β_ 半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等。此時所用基質，以選用適於所選之酵素者爲佳，可舉出例如ABTS、氨基苯二醯肼 -過氧化氫、鄰苯二胺-過氧化氫（過氧化酶用）、對硝基苯磷酸酯、甲基傘形酮基磷酸酯、3-（2'-螺三環葵烷）一 4 —甲氧基一 4 — (3”一磷醯氧代）一苯基—1，2—二氧十六院( 鹼性磷酸酶用）、對硝苯基—β- D-半乳糖、甲基傘形酮基一 β —D—半乳糖(β—半乳糖苷酶用)等。上述之測定，可藉由在4〜40°C反應1分鐘〜18小時， 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------!_ 丨裝丨!訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1247809 A7 _ B7_ 五、發明說明（Lf) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 測定所產生之成色、螢光量、發光量、或著色量來進行’ 其他也可採用在4〜40°C之範圍內一邊加溫一邊反應(即所謂速率法）。對上述抗原或抗體之放射標識可用市售之Bolton Hunter試藥而可輕易進行。例如，對溶解於〇·1Μ碳酸氫鈉水溶液中之抗原或抗體溶液加入Bolton Hunter試藥’經 1〜2小時後可用G- 25之脫氯管柱等將未反應之Bolton Hunter試藥去除來實施。其他亦可採用氯胺T法或碘化物法輕易進行I125之放射標識。上述發光物質，可舉出例如異氨基苯二醯肼、吖啶酯等；上述螢光物質，可舉出例如螢光素、若丹明等。此時，標識方法可藉由採用活性化酯法或異氰酸法來輕易地進行（「酵素免疫測定法」，醫學書院，1987年）；作爲上述著色劑，可舉出例如著色膠乳粒子、金凝膠等。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明之免疫學測定法以上述之競爭法實施時，例如，將含有未知量之幽門螺桿菌之過氧化氫酶之檢體加入以一般周知之方法物理性或化學性的結合有本發明之單株抗體之固相中進行反應。又，同時加入一定量之已用標識劑標識之幽門螺桿菌之過氧化氫酶進行反應。本發明之免疫學測定法以上述之三明治法實施時，例如，將含有未知量之幽門螺桿菌之過氧化氫酶的檢體加入以一般周知之方法物理性或化學性的結合有本發明之單株抗體之固相中進行反應。之後，加入已用標識劑標識之本 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（（t) 發明之單株抗體進行反應。接著，任一方法中，必要時將固相充分洗淨後，測定結合在固相上之標識劑的活性。前述標識劑爲RI時，以井區計數器或液體閃爍計數器測定；標識劑爲酵素時，加入基質放置後，利用比色法或螢光法測定酵素活性。即使標識劑爲螢光物質、發光物質、著色物質，其分別仍依據一般周知之方法測定之。本發明之免疫學測定法因採用本發明之單株抗體，因此對幽門螺桿菌之過氧化氫酶上特定存在之抗原決定基可加以辨識，不會因交叉反應而誤檢測出其他之物質，具有可達專一性極高測定之極佳特色。爲實施本發明之免疫學測定法，可使用本發明之診斷套組。本發明之診斷套組含有最少1種本發明之單株抗體，亦可僅含1種單株抗體。本發明之診斷套組中使用之單株抗體只要可辨識幽門螺桿菌之過氧化氫酶即可，並無特別限定，亦可爲本發明之單株抗體之分解物F(aiy)2、FaV 、Fab 等。本發明之診斷套組能以免疫學方式檢測出幽門螺桿菌之菌體或幽門螺桿菌之過氧化氫酶之存在，對幽門螺桿菌之感染加以判定。本發明之診斷套組，可將本發明之單株抗體事先固相化、亦可將本發明之單株抗體事先以前述之標識劑標識者〇本發明之診斷套組所使用之固相並無特別限定，例如 18 i — — — — — — — — — --— — — — — — ^--— — — — — — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（丨"]) ，聚苯乙烯等之聚合物、玻璃珠、磁性粒子、微量盤、免疫層析用濾紙、玻璃濾器等之不溶性載體。本發明之診斷套組尙有其他之成份亦可。上述之其他成份並無特別限定，例如，可舉出標識用之酵素、其基質、放射性同位素、發光物質、螢光物質、著色物質、緩衝液、培養基等，此等可使用前所述者。本發明之診斷套組之形態並無特別限定，但爲求迅速且簡便之診斷，以將本發明之診斷套組之構成成份一體化之一體型之診斷套組爲佳。上述之一體型之診斷套組並無特別限定，可舉出例如扁盒型、卡匣型等。上述之扁盒型之態樣，可舉出例如利用免疫層析法，於反應盒內收容膜，在此膜之一端（下流測)讓本發明之單株抗體固相化’在膜上之另一^端（上流測)裝盛展開液，於其附近之下流測配置已添加有標識劑之基質的墊，於膜之中間部份配置上述已添加有用標識劑標識之本發明之單株抗體的墊。採用具有上述扁盒型之態樣的診斷套組時，係在添加有經標識劑標識之本發明之單株抗體的墊上加入檢體，令檢體所含之幽門螺桿菌之過氧化氫酶與經標識劑標識之本發明之單株抗體形成結合體後’以上述產開液使其展開’ 將所形成之結合體移往本發明之單株抗體固相化之處，在該處幽門螺桿菌之過氧化氫酶、經上述標識劑標識之本發明之單株抗體、以及固相化之本發明之單株抗體會形成複 19 ----I----11^^· ^ I------if--------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本買> 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（/<f) 合體。接著，上述標識劑與上述基質會反應、發色。利用感測此發色能判定幽門螺桿菌之感染。採用將檢體以足夠量之展開液稀釋後滴在膜上的態樣時，可不須事先裝盛展開液於膜上。又，採用著色膠乳粒子之著色物質作爲上述標識劑時，不需要基質，本發明之單株抗體之固相化之處是否形成上述複合體，係依據著色物質是否著色來判斷。在上述卡匣型之態樣上，例如，反應爲上述競爭法時，可舉出備有複數之井區之卡匣，其係由(a)收容本發明之單株抗體之井區、（b)含有以上述標識劑所標識之幽門螺桿菌的液體試藥(例如緩衝液)之井區、（c)含有上述標識劑之基質的液體試藥(例如緩衝液)之井區，所一體化形成之卡匣等；當反應爲三明治法時，則爲備有複數之井區之卡匣，其係由（a)收容本發明之單株抗體已固相化之不溶性載體之井區、（b)含有以上述標識劑所標識之本發明之單株抗體的液體試藥(例如緩衝液)之井區、（c)含有上述標識劑之基質的液體試藥(例如緩衝液）之井區，所一體化形成之卡匣〇採用上述舉例之卡匣型之本發明之診斷套組時，通常以競爭法與三明治法皆可實施反應及測定。本發明之診斷套組可實施上述競爭法與上述三明治法之任一方法，但以實施上述之三明治法較佳。上述之三明治法具靈敏度高、反應時間短、精確度高等好處。在上述之三明治法上若使用免疫層析法時，則可以製作出試驗操 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----— 丨 — 裝------- 訂— — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（q) 作既簡便、結果判定亦可以目視輕易進行之套件。又，上述之三明治法若採ELISA法時，由於會取決於測定對象物質之量而產生酵素反應生成物，當幽門螺桿菌之感染爲陽性時，可輕易地設定以目視確認成色等之系統。本發明之診斷套組所採用之檢體並無特別限定，例如，可舉出胃內容物、胃洗淨液、消化道排泄物等；考慮採取容易、對受驗者之負擔少之觀點，則以糞便等之消化道排泄物爲佳。本發明之診斷套組可用於調查殺菌治療前是否有感染，也可用於判定殺菌治療後是否成功。本發明之診斷套組因採用單株抗體，沒有批次差異、檢測靈敏度亦高，且不會產生僞陰性或僞陽性之問題。依據本發明，藉由使用以幽門螺桿菌之過氧化氫酶爲抗原的單株抗體，可排除檢體中受到其他物質之影響，因此可以極高靈敏度、具專一性的方式檢測幽門螺桿菌之存在。又，利用建立相對於幽門螺桿菌之過氧化氫酶之產生單株抗體的融合瘤，可半永久性的製造同一之單株抗體。診斷套組採用本發明之單株抗體時，因可將消化道排泄物作爲檢體，不會帶給受驗者痛苦，可簡便且有效檢測幽門螺桿菌之感染。又，診斷套組採用本發明之單株抗體時，即使使用僅有1種之單株抗體也可呈現極佳精確度、無批次差異、具安定性，因此可始終專一且高精確地檢測幽門螺桿菌之感染；又，上述診斷套組測定簡便，適於用在醫療現場。 21 尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）丨丨丨丨—丨·! · I ----I I ^0 — — — — — — — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_ 五、發明說明 [用以實施發明之最佳形態] 以下舉實施例及試驗例對本發明作更詳細說明，但本發明並不僅限定於此。實施例1 [單株抗體之製作] ⑴幽門螺桿菌球狀菌體懸濁液(免疫原)之調製於已添加5%馬脫纖血之腦心浸劑洋菜培養基(迪富可 :Difco公司製造)上以幽門螺桿菌(ATCC43504)劃出條狀的線。將此培養皿培養在37°C微好氧環境下3〜4天後，進一步於37°C厭氧環境下溫育7日使其球狀化。所得之菌落以白金耳等刮取，接著讓其懸濁於磷酸緩衝生理食鹽液(PBS) 中。於4°C下以lOOOOxg離心分離10分鐘後，讓幽門螺桿菌之菌體懸濁於0.5%之福馬林中，在4°C下放置4日去其活性。其後，懸濁於PBS中，在4°C下反覆進行3次 lOOOOxg之離心分離10分鐘的操作，將上述菌體洗淨後，懸濁於PBS中。 ⑵幽門螺桿菌球狀菌體破碎物(免疫原)之調製將(1)所得之菌體懸濁液以超音波破碎機(精工電子工業公司製造Model 7250)，在輸出3、50%負載循環之條件下超音波處理10分鐘，將菌體破碎。 ⑶免疫及細胞融合將（1)、（2)中所調製之免疫原（幽門螺桿菌球狀菌體懸濁液或幽門螺桿菌球狀菌體破碎物)與Freund之完全佐劑（卡路碧歐卡姆公司製造）等量混合，成爲油乳狀。將其對 22 本i張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) — — — — — — — — — — -----訂·丨丨！--I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247809 A7 _ _—_B7___ 五、發明說明（:x\) BALB/cA小鼠（日本可雷亞公司製6週歲，雌)之皮下每次施予0.2mL，於初次免疫後第7日與第14日進行追加免疫( 每次0.2mL)，並於細胞融合3日前將上述免疫原〇.2mL施予腹腔內。自最終免疫進行後第3日摘取小鼠脾臟細胞’ 與骨髓瘤細胞(P3x63.Ag8.653株、RCB0146，理硏基因銀行 )以10:1之比例混合後，接著以50%PEG4000進行融合後，以HAT培養基(吉布可公司製造)進行融合瘤之選擇性培養〇 (4)融合瘤之選擇細胞融合後第12日以ELISA測定培養上澄液中之抗體活性。於將免疫原1〇μ2/πι1固相化之96孔ELISA板(克斯達公司製造)之各孔內添加融合細胞之培養上澄液200μ1 後，於37°C下反應1小時，接著以含0.05%吐溫(Tween)20 之PBS(洗淨液)洗淨之，加入過氧化酶標識抗小鼠IgG (卡培爾公司製，1:20000)20(^L。於37°C下反應1小時後，以上述洗淨液洗淨。洗淨後，於各孔中加入20(^L基質液 (0.1M對苯二胺與0.012%過氧化氫水溶液），於室溫反應 15分鐘。反應後，於各孔中加入50μί之3.5N硫酸，讓酵素反應停止，測定492nm下之吸光値。選取吸光値在0.15 以上、會產生與上述免疫原反應之抗體的融合瘤選殖體。對各選殖體以極限稀釋法進行2次選殖。將選殖後之融合瘤移殖到BALB/cA小鼠，結果產生可作爲腹水回收之單株抗體的融合瘤有32個選殖體。實施例2 23 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) " " -------I! t I! til--111 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明 [利用三明治ELISA專一辨識消化道排泄物中之幽門螺桿菌的單株抗體之選擇] ⑴單株抗體固相化板之製作將32個選殖體之腹水各imL以PBS作2倍稀釋，滴入飽和硫酸銨2mL後，於4°C下放置4小時。之後，以 3000rpm，離心20分鐘，沉渣浮游於PBS2mL中進行透析。將此等之單株抗體以下面方法於96孔ELISA板固相化。即’將各單株抗體稀釋至5pg/mL後，對96孔ELISA板之各孔各加入0.2mL，下放置一夜後，以PBS洗淨。洗淨後，各井區中各加入0.25mL之1%脫脂奶一 PBS，於4°C 下放置1小時以進行掩蓋。掩蓋後，以上述洗淨液洗淨。 ⑵生物素標識單株抗體之製作將(1)所調製之32個選殖體之單株抗體3mg與生物素基-N-經基號拍醯亞胺酯（雜因美特公司製造）iOmg混合，於0.1M碳酸氫鈉(pH 8)中，室溫下攪拌3小時來反應。反應液以PBS 5L於4°C進行透析一夜後，得到生物素標識單株抗體。 (3)能專一辨識消化道排泄物中之幽門螺桿菌的單株抗體之選擇將利用尿素呼氣試驗判定爲幽門螺桿菌陽性者與陰性者各1名之糞便檢體各250mg懸濁於0.1%脫脂奶— pBS 0.5mL後，以3000rpm離心分離1〇分鐘，收集上澄液作爲糞便萃取液，對糞便萃取液各取0.2mL加入(1)所調製出之 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------裝- ----I--訂---I I I I-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __B7 _ 五、發明說明（^) 各單株抗體固相化板之各孔中。於37°C放置1小時後，以上述洗淨液洗淨5次，接著加入(2)所調製之各生物素標識單株抗體各0.2mL。於37°C放置1小時後，以上述洗淨液洗淨之，加入過氧化酶標識抗生物素蛋白〇.2mL(賽美德公司製造）。於37°C放置1小時後，以上述洗淨液洗淨，於各孔中各加入0.2mL基質液(0.1M鄰苯二胺及0.012%過氧化氫水溶液），於室溫反應10分鐘。反應後，對各孔中加入 3.5N硫酸50μί讓酵素反應停止，測定於492nm之吸光値。如表1所示，3種單株抗體21G2、41A5、82B9單獨或組合而成之三明治ELISA，對幽門螺桿菌感染者之糞便檢體具高反應性。表1 單株抗體之組合吸3 m__ 固相化 sai 標識陽性者陰性者__ 21G2 21G2 3.3 0.043 21G2 41A5 >3.5 0.075 21G2 82B9 >3.5 0.067 , 41A5 21G2 3.3 0.10 — 41A5 41A5 >3.5 0.080 41A5 82B9 >3.5 0.035 82B9 82B9 >3.5 0.071 82B9 21G2 3.3 0.066 82B9 41A5 >3.5 0.064 25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —1 ·1 -^1 ϋ ϋ I Hi met 1_1 I— Met I BiBi ^1· —li ϋ I I ϋ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（以）再者，依據免疫球蛋白分型小鼠（和光純藥工業製造) 調查各單株抗體之免疫球蛋白亞類，結果3個選殖體均爲 Ig^，而L鏈爲kSL。實施例3 [菌株間反應性之比較及與其他菌種之反應性] ⑴幽門螺桿菌菌體懸濁液之調製於添加5%馬脫纖血之腦心浸劑洋菜培養基以幽門螺桿菌（ATCC 43504 ;東海大學醫院臨床分離株No. 130及 No.112、兵庫醫科大學臨床分離株No.526 、No.4484、

No.5017、No.5025、No.5049、No.5142、No.5287、No.5308 、1^〇.5314及^^〇.5330)劃出條狀的線。將此培養皿於37°(：下進行3〜4日微好氧性培養所得之螺旋狀體之菌落、或進一步於37°C厭氧性環境下放置7日所得球狀體之菌落，以白金耳等刮取，懸濁於PBS中。於4°C下lOOOOXg離心分離 10分鐘，所得之菌體懸濁於0.5%福馬林中，於4°C放置4 日去其活性。之後，懸濁於PBS中，在下反覆進行3 次以lOOOOxg離心分離10分鐘的操作，將菌體洗淨後，再度懸濁於PBS中，得到幽門螺桿菌螺旋狀菌體懸濁液及幽門螺桿菌球狀菌體懸濁液。 ⑵人腸內菌及空腸彎曲桿菌之菌體懸濁液之調製自人糞中分離之代表性腸內菌巴魯嘎塔斯(vulgatus)類桿菌、大腸埃希氏菌之2菌種及屬於螺旋狀菌之空腸彎曲桿菌利用下法培養，所得之菌落以與（1 )相同之方法調製各菌之菌體懸濁液。即，巴魯嘎塔斯類桿菌（IF014291 26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）裝！ — 訂· — 1 — — — — — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（^) )係於添加有5%馬脫纖血之BL洋菜培養基（日水製藥公司製造）上’ 37°C下進行2日厭氧培養。大腸埃希氏菌（ ATCC25922)係以腦心浸劑洋菜培養基，37°C下進行1曰好氧培養。空腸彎曲桿菌(8068東海大學醫院臨床分離株) 係以添加有5%馬脫纖血之腦心浸劑洋菜培養基，37°C下進行2日微好氧培養。 ⑶其他幽門螺桿菌屬之菌體懸著液調製貓屬（felis)幽門螺桿菌（ATCC49179)及海帕提卡斯 (hepatiscus)幽門螺桿菌(ATCC51448)係在添加5%馬脫纖血之腦心浸劑洋菜培養基上與（1)同樣地培養，自所得之螺旋狀菌之菌落以與(1)同樣方式得到菌體懸著液。 ⑷菌體破碎物之調製對（1)、（2)、（3)中所得之各菌體懸濁液以超音波破碎機 (精工電子工業公司製造Model 7250)，在輸出3、50%負載循環之條件下超音波處理10分鐘，將菌體破碎。

⑸三明治ELISA 對(4)中所得菌體破碎物(蛋白質濃度1〇μ2/ιηυ各0.2mL 以實施例2(3)之方法進行三明治ELISA (單株抗體41A5固相化之板:生物素標識單株抗體82B9、單株抗體21G2固相化之板:生物素標識單株抗體41A5、單株抗體21G2固相化之板：生物素標識單株抗體82B9、單株抗體21G2固相化之板：生物素標識單株抗體21G2、以及美麗德安公司製造 HpSA)。結果如表2所示。 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） --------^ 1111111 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（/!〇) 表2 吸光値抗固相化單株抗體 21G2 41A5 21G2 21G2 HpSA 體標識單株抗體 41A5 82B9 82B9 21G2 幽門螺桿菌 ATCC4350螺旋狀體 >3.5 >3.5 >3.5 >3.5 >3.5 幽門螺桿菌 ATCC4350球狀體 >3.5 >3.5 >3.5 — — 幽門螺桿菌 No.130螺旋狀體 >3.5 >3.5 >3.5 — — 幽門螺桿菌 No.130球狀體 >3.5 >3.5 >3.5 — — 抗幽門螺桿菌 No.112螺旋狀體 >3.5 >3.5 >3.5 — — 原幽門螺桿菌 No.112球狀體 >3.5 >3.5 >3.5 一 — 幽門螺桿菌 No.526螺旋狀體一 — — >3.5 — 幽門螺桿菌 No.4484螺旋狀體 — — — >3.5 — 幽門螺桿菌 No.5017螺旋狀體 — — — >3.5 — 幽門螺桿菌 No.5025螺旋狀體 _ — 一 >3.5 — 幽門螺桿菌 No.5049螺旋狀體一 _ — >3.5 _ 幽門螺桿菌 No.5142螺旋狀體 — — — >3.5 — 幽門螺桿菌 No.5287螺旋狀體 — _ — >3.5 — 幽門螺桿菌 No.5308螺旋狀體 — _ — >3.5 — 幽門螺桿菌 No.5314螺旋狀體 — — — >3.5 — 幽門螺桿菌 No.5330螺旋狀體 — — — >3.5 — 巴魯嘎塔斯類桿菌 IFO 14291 0.066 0.066 0.058 — — 大腸埃希氏菌 ATCC 25922 0.056 0.055 0.050 — — 28 ------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1247809 五 A7 B7 發明說明（/)) 空腸彎曲桿菌 80068 0.079 0.057 0.062 — — 貓屬螺桿菌 ATCC49179螺旋狀體 0.066 0.051 0.055 0.014 1.63 貓屬螺桿菌 ATCC51448螺旋狀體 0.059 0.049 0.061 0.016 0.13 如表2所示可知單株抗體21G2、41A5、82B9對於幽門螺桿菌之各菌株之螺旋狀菌體、球狀菌體具有高反應性。另一方面，對巴魯嘎塔斯類桿菌、大腸埃希氏菌、空腸彎曲桿菌、貓屬螺桿菌及海帕提卡斯螺桿菌則完全不反應。此外，美麗迪安公司製造HpSA則對貓屬螺桿菌及海帕提卡斯螺桿菌具反應性。實施例4 [以三明治ELISA對糞便檢體中幽門螺桿菌之檢測(1)] 將利用尿素呼氣試驗判定之結果，爲幽門螺桿菌陽性、陰性之各3名所提供之糞便檢體各250mg懸濁於0.1%脫脂奶—PBS 0.5mL後，依實施例2⑶之同樣操作進行試驗。又，對同樣糞便檢體使用美麗迪安公司製造之HpSA ELISA ，依照操作方法進行試驗，測定450nm之吸光値。各吸光値及尿素呼氣試驗結果如表3所示。 -----------1·裝---------訂---------# (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表3 單株抗> 體之組合吸光値(僅尿素呼氣試驗，每毫升）固相化標識 No.l No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 21G2 21G2 0.041 0.043 0.043 3.3 2.8 2.1 21G2 41A5 0.092 0.079 0.075 >3.5 >3.5 2.4 21G2 82B9 0.071 0.052 0.067 >3.5 >3.5 3.2 29 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247809 五、發明說明（β) A7 _____JB7 41A5 41A5 0.17 0.17 0.10 3.3 >3.5 0.84 41A5 21G2 0.077 0.073 0.080 >3.5 >3.5 1.8 41A5 82B9 0.029 0.053 0.035 >3.5 >3.5 2.2 82B9 82B9 0.12 0.086 0.071 >3.5 >3.5 2.3 82B9 21G2 0.063 0.082 0.066 3.3 >3.5 1.1 82B9 41A5 0.079 0.077 0.064 >3.5 >3.5 >3.5 HpSA 0.077 0.028 0.025 1.8 2.5 1.8 尿素呼氣試驗 (1.0) (0.6) (0.9) (17) (26) (17) 可知由尿素呼氣試驗結果呈陽性之受驗者(No.4、5、 6)所提供之糞便檢體較陰性檢體(No.l、2、3)有明顯之高吸光値。實施例5 [以三明治ELISA對糞便檢體中幽門螺桿菌之檢測(2)] ⑴單株抗體之調製將融合瘤21G2移殖到BALB/cA小鼠所回收之腹水 5mL，以PBS作2倍稀釋，滴入飽和硫酸銨10mL，4°C下放置4小時。之後，以3000rpm離心分離20分鐘，沉渣溶解於PBS lmL後，對PBS進行透析。 ⑵單株抗體固相化板之製作將（1)所調製之單株抗體21G2溶液以下面方法於96孔 ELISA板固相化。以PBS將抗體濃度稀釋至5pg/mL後，於96孔ELISA板之各孔各加入〇.2mL，4°C下放置一夜後，以PBS洗淨。 ⑶過氧化酶標識單株抗體之製作 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---!!丨裝· —----訂·！ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1247809 A7 B7 五、發明說明) 採順丁烯二醯亞胺法（石田榮治著，生物化學實驗法 27，酵素標識法Ρ·51，1991年學會出版中心)進行過氧化酶標識單株抗體之製作。將(1)所調製之單株抗體5mg與S-乙醯基锍基丁二酸酑（阿魯得立吉公司製造)0.6mg混合，在 0.1M磷酸緩衝液(pH 6.5)0.5mL中、30°C下反應30分鐘。於反應液中加入0.1M EDTA 20μί、0.1M三鹽酸緩衝液 (pH7.0)0.1mL、1Μ 羥基胺 0.1mL(pH7.0)，於 30〇C下 5 分鐘放置後，以lOOOOrpm離心分離10分鐘得其上澄液。上澄液以濕式離心分級機30(Centriclone)(阿米康公司製造)超過濾、去除試藥後，置換於5mMEDTA-0.1M磷酸緩衝液 (ρΡί6.5)1ιηΙ，得到導入硫醇基之單株抗體。將過氧化酶(西洋山荡菜東洋紡公司製造)5mg及Ν-琥珀醯亞胺基一 4一（N -順丁烯二醯亞胺甲基）—環己烷一 1一碳酸酯一（ICN生藥公司製造)lmg混合，於0.1M磷酸緩衝液（pH 7.0)0.5mL中、3(TC下反應1小時。將反應液以 lOOOOrpm離心分離5分鐘得其上澄液。將上澄液以濕式離心分級機超過濾，去除試藥後，置換於0.1M磷酸緩衝液 (pH7.0)lmL中，得到導入順丁烯二醯亞胺基之過氧化酶。將上述導入硫醇基之單株抗體與導入順丁烯二醯亞胺基之過氧化酶以莫耳比1:5混合，室溫下反應30分鐘。反應液以砂費里(Sephacryl)-S300HR管柱之凝膠過濾管柱(直徑26X長870mm，0.1M磷酸緩衝液(pH6.5))裝載，收集含有過氧化酶標識單株抗體之級分。 ⑷以三明治ELISA法對糞便檢體中幽門螺桿菌之檢測 31 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) * 9 ! !丨丨丨訂·！！ ί - · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247809 A7 B7 五、發明說明（p) 將利用尿素呼氣試驗判定爲幽門螺桿菌陽性者與陰性

者各10名之糞便檢體各250mg懸濁於0.1%脫脂奶-PBS 0.5mL中，以3000rpm、離心分離10分鐘，收集上澄液作爲糞便萃取液。將糞便萃取液50μί與(3)中所調製之過氧化酶標識單株抗體50μί添加於上述單株抗體固相化板之各孔中。於25°C放置1小時後，以洗淨液(0.05%吐溫20-PBS) 洗淨5次，然後於各孔中各加入O.lmL基質液(四甲基苯+ 過氧化氫，BioFX公司製），於室溫下反應10分鐘。反應後，於各孔中加入1N硫酸5(^L讓酵素反應停止，測定於

450nm-630nm之吸光値。又，對同樣之糞便檢體以HpSA 試驗，測定於450nm-630nm之吸光値，結果如表4所示。表4 檢體號碼尿素呼氣試驗 21G2三明治ELISA HpSA 判定*1 (每毫升）判定*2 (吸光値）判定*3 (吸光値） 1 +(17) +(1.89) +(1.30) 2 +(11) +(1.19) +(1.57) 3 +(40) +(1.52) +(1.64) 4 +(40) +(1.24) +(2.13) 5 +(25) +(0.46) +(2.11) 6 +(34) +(0.79) +(1.37) 7 +(49) +(1.38) +(1.60) 8 +(50) +(3.13) +(2.18) 9 +(19) +(0.36) +(0.76) 10 +(40) +(2.43) +(1.97) 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) η 9 裝-------—訂 --------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247809 五、發明說明（巧1 ) A7 B7 11 塞 -(0.05) -(0.01) 12 • -(0.02) -(<0.01) 13 - -(0.04) -(<0.01) 14 - -(0.09) -(0.01) 15 -(0.02) -(<0.01) 16 • -(0.03) +(0.27) 17 晒 -(0.02) -(<0.01) 18 -(0.04) -(0.01) 19 - -(0.05) +(0.23) 20 - -(0.01) -(0.02) *1:+陽性(>5每毫升）一陰性 *2: +陽性(>〇.1)-陰性 *3: +陽性(>〇·!)—陰性如表4所示，單獨使用單株抗體21G2之三明治ELISA 對幽門螺桿菌感染者之糞便檢體具高反應性，且與尿素呼氣試驗判定結果完全一致。另一方面，在HpSA則2檢體( 檢體號碼16、19)呈現不一致(僞陽性）。實施例6 [以免疫層析法對糞便檢體中幽門螺桿菌之檢測] ⑴抗體固相化支持體之製作爲將抗幽門螺桿菌抗體與抗兔IgG抗體製作成以線狀的方式固相化之抗體固相化支持體，乃將硝基纖維素片(華特曼公司製造)裁成5mmX20mm，使用BiojetQ3000(拜爾特 33 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •* 丨裝！--！訂·！ ---- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247809 A7 B7 五、發明說明 :Biodot公司製造），於其下端10mm之位置處塗佈單株抗體21G2之溶液、15mm之位置處塗佈抗兔子IgG或羊多株抗體(卡培爾：Cappel公司製造）。於室溫乾燥2小時後，以1%脫脂奶(迪富可公司製）一 0.1%吐溫20-PBS浸漬10分鐘，接著進行掩蓋。其後充份乾燥。著色膠乳粒子標識物之調製 a. 紅色膠乳粒子標識抗幽門螺桿菌抗體於紅色膠乳粒子分散液(PL-Latex、10%、450nm、聚合物試驗室：Polymer Laboratories公司製）300 //L中加入 PBS1.2mL，以13000rpm離心分離5分鐘。於沉渣中加入單株抗體21G2溶液(5mg/mL)lmL，經充份混合，於室溫反應 1小時。爲去除未反應之單株抗體，以13000rpm離心分離 5分鐘，讓沉渣懸濁於PBS 1.5mL中，再次離心分離。加入1%脫脂奶lmL，於室溫反應1小時，然後覆蓋之。之後，讓沉渣懸濁於含有1%脫脂奶一 0.01%迭氮化鈉之PBS 1.5mL 中。

b. 藍色膠乳粒子標識抗兔子抗體IgG c. 採藍色膠乳粒子分散液(PL-Latex、10%、450nm、高分子試驗室公司製造)及兔子IgG(0.5mg/mL，卡培爾公司製造），以相同於上述之操作調製出藍色膠乳粒子標識兔子IgG。著色膠乳粒子標識物將上述2種類之著色膠乳粒子標識抗體等量混合，取 lOpL使含浸於本力世（註冊商標）不織布(旭化成公司製造 )5mmX5mm中，通風車乞燥之。 34 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝丨------ 訂·------1 >^^1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247809 A7 B7 五、發明說明（>') ⑶免疫層析試驗片之製作自抗體固相化支持體之下端迄2.5mm之位置重疊著色膠乳標識物。再者，於著色膠乳粒子標識物上，讓受檢液浸漬用載體(3MM克里斯特福•華特曼公司製)重疊於自下端迄2.5mm之位置。又，自抗體固相化支持體之上端迄 2mm之位置重疊吸水性載體(3MM克里斯特福•華特曼公司製），最後以透明貼布在貼附固定於上部成爲免疫層析試驗片。 ⑷糞便檢體中幽門螺桿菌之檢測用實施例4中記載之6名受驗者(陽性、陰性各3名) 之糞便試驗。取各糞便O.lg懸濁於0.1%BSA—0.05%吐溫 20-PBS lmL中。以3000rpm離心分離1分鐘除去夾雜物，將上澄液50μί滴入(3)所製作之免疫層析試驗片之受檢液浸漬用載體部。於10分鐘後判定抗幽門螺桿菌抗體固相化部位是否出現紅線。其結果係，陰性檢體全部無法確認紅線，陽性檢體全部可確認紅線。又，因全部檢體都可確認藍線，此試驗爲成功。實施例7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) [以膠乳凝集法對糞便檢體中幽門螺桿菌之檢測] ⑴膠乳粒子標識抗幽門螺桿菌抗體之調製於白色膠乳粒子分散液(PL-Latex，10%，440nm，聚合物試驗室公司造製)0.1mL中加入PBS 0.4mL，以13000rpm 離心分離5分鐘。於沉渣中加入PBS 0.5mL及單株抗體 21G2溶液（lmg/mL)0.5mL，充份混合，於室溫反應一晚。 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1247809 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明04) 爲去除未反應之單株抗體，以13000rpm離心分離1〇分鐘，讓沉渣懸濁於PBS lmL中，再度進行離心分離。之後，以13000rpm離心分離5分鐘，讓沉渣懸濁於含有1%脫脂奶—0.01迭氮化鈉之PBS lmL中。 (2)糞便檢體中幽門螺桿菌之檢測使用實施例4中所記載6名受驗者(陽性、陰性各3名 )之糞便進行試驗。取各糞便〇.lg，懸濁於含有〇.1%BSA~-0.05%吐溫20的PBS lmL中。以3000rpm離心分離1分鐘去除夾雜物，得到上澄液。將此糞便懸濁上澄液5〇μί及 (1)中所調製之膠乳粒子標識抗幽門螺桿菌抗體50μί滴入膠乳凝集盤上，以滑動轉子(榮硏化學公司製造)混合。5分鐘後，以目測判定是否有凝集。其結果係，陰性檢體全部無法確認凝集，陽性檢體全部可確認凝集。實施例8 [以凝膠過濾法測定糞便中抗原之分子量] 讓由幽門螺桿菌陽性者(表3之Νο.4、Νο.5)所提供之糞便檢體20g懸濁於冰冷之PBS 100mL中。以1〇〇〇〇χ2離心分離10分鐘，刮除殘渣，進一步以90000xg離心分離30 分鐘，得到上澄液。將此上澄液1.5mL使用於充塡有 Sephacryl-S300HR(法魯馬系亞公司製造）之凝膠過濾管柱 (1.5x140cm，0.1M 磷酸緩衝液，ρΗ6·5)，每隔 1.5mL 加以級分。分子量標記物可使用甲狀腺球蛋白、鐵蛋白、過氧化氫酶、牛血淸白蛋白及類細胞色素C。以實施例2(3)中記載之三明治ELISA(單株抗體41A5固相化板、生物素標 36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

·- in I I I ^^1 |_1 1_ in iB_i i^i i__i n-i 11 I I 1247809 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（if) 識單株抗體82B9及單株抗體21G2固相化板、生物素標識單株抗體41A5)來檢測各成分之抗原。其結果係，糞便中之幽門螺桿菌專一抗原之分子量爲270kDa。實施例9 [抗原之鑑定] (1)抗原之精製根據阿馬夏姆法魯馬系亞生技公司之親和性層析手冊所記載之方法，製作出讓單株抗體82B9於CNBr-活性化 Sepharose 4B(阿馬夏姆法魯馬系亞生技公司）上固定化之管柱(lOmL)。將幽門螺桿菌（ATCC 43504)菌體以超音波破碎後，將藉超離心分離得到之上澄液（蛋白質濃度 4mg/mL)5mL裝載於此管柱。於室溫下靜置2小時後，以 PBS 120mL(流速約2mL/min)洗淨管柱，接著以0.2M甘胺酸HC1緩衝液(pH3.0)130mL洗提。洗淨、洗提皆以每次 10mL來分次進行，並測定280nm之吸光度及抗原性。抗原性之測定係以實施例2記載之三明治ELISA(固相化21G2、標識82B9)進行。其結果如圖1所示，僅洗提成分(成分 No.14〜17)可確認抗原性。 ⑵精製抗原之純度及分子量讓洗提成分(Νο.14)50μί與等量之樣本緩衝液(2%SDS 一 5%锍基乙醇)混合，於100°C煮沸5分鐘。使用此溶液 2(^L進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(4〜20%丙烯醯胺凝膠 )。分子量標記物爲磷酸酶b、牛血淸白蛋白、卵白蛋白、碳酸脫氫酶、大豆胰蛋白酶抑制劑及α-乳蛋白；於電泳後 37 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *" 裝·！--丨訂_|丨丨！丨丨- 1247809 A7 B7 五、發明說明，以銀染色劑ΚΑΝΤΟ III對凝膠染色。其結果，精製抗原呈現單一區帶，其分子量爲mua。又，對洗提成分 (No.14) lmL以實施例6所記載之同樣方法進行Sephacryl-S300HR之凝膠過濾。關於所得之成分，以三明治ELISA 測定其抗原性，結果本精製之抗原之分子量爲270kDa，與糞便中抗原爲相同。 ⑶精製抗原之胺基末端側胺基酸序列之決定用洗提成分(Ν〇.14)300μί，藉HP G1005A蛋白質定序系統（日本修雷特•帕克得公司製造)決定精製抗原之胺基末端側胺基酸序列。自胺基末端起8個殘基之序列爲Met 一 Val —Asn — Lys —Asp —Val_Lys — Gin。此序列與幽門螺桿菌之過氧化氫酶之胺基末端起之序列完全一致（J. Bacteriol. (1996)，178, 6960-6967)。 ⑷精製抗原之過氧化氫酶活性與紫外可見吸收光譜之測定因精製抗原之胺基末端側胺基酸序列與過氧化氫酶一致，故測定各成分之過氧化氫酶活性。使用含llmM之過氧化氫之PBS爲反應液。各成分以PBS稀釋100倍後’取 5(^L添加於反應液2mL中讓反應開始。反應係於室溫下進行。隨時測定240nm之吸光度，求出1分鐘之間減少之吸光度。以PBS爲空白對照。其結果如圖1所示，抗原成分中係檢測出過氧化氫酶活性。爲確認過氧化氫酶所含之血紅素，乃測定洗提成分 No.14之紫外可見吸收光譜。其結果發現407及277nm具有極大吸收。此値與幽門螺桿菌之過氧化氫酶之文獻値 38 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

ί*· a ϋ ϋ —i I ϋ ϋ I 一so, ϋ ϋ ϋ ·ϋ ϋ I I I 經濟部智慧財產局員工消費令作社印製 1247809 A7 B7 五、發明說明〇"]) (405 及 280nm，J. Gen.Microbiol. (1991)，137, 57-61)大致一致〇 ⑸精製抗原之保存安定性將含0.1%BSA之PBS所稀釋之溶液之洗提成分(Νο·14) 成爲1.4pg/mL，於25°C下保存1週。對保存後之精製抗原之抗原性以實施例5所記載三明治ELISA法、對過氧化氫酶之活性以(4)所記載之方法分別測定。與在-80°C下凍結保存之精製抗原比較，結果抗原性於25°C下保存幾乎沒有變化。但過氧化氫酶之活性則顯著失活，活性殘存率在5%以下。實施例10 [抗幽門螺桿菌單株抗體與糞便中抗原之次單元之間的反應性] 爲測定抗幽門螺桿菌單株抗體及糞便中抗原之次單元之間的反應性，乃採用實施例8所記載幽門螺桿菌陽性者糞便懸濁液之上澄液5(^L，進行實施例9(2)所記載之SDS -聚丙烯醯胺凝膠電泳。爲對照起見實施例9之精製抗原（洗提成分Νο·14)50μί亦同樣地進行電泳。電泳之後’以西方印漬法將蛋白質轉錄於硝基纖維素膜。此硝基纖維素膜以1%脫脂奶液浸漬1小時後，與單株抗體21G2或82Β9反應1小時。此硝基纖維素膜以0.05%吐溫20-PBS洗淨5 次後，與過氧化酶標識抗小鼠IgG抗體反應。雖硝基纖維素膜以0.05%吐溫20-PBS洗淨5次後，加入基質液(過氧化氫+ 3,3'-二胺基聯苯胺)溫育10分鐘，惟糞便抗原、 39 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Ψ 鬌 I 11 ·ϋ ϋ I Ban I Hi i^i -I 1_1 I I I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 I紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247809 A7 B7 五、發明說明〇&) 精製抗原二者電泳之後之區帶不論採用任一單株抗體都沒有發現有來自抗原性之成色。爲解明於次單元分子中未發現抗原性之原因，以墨點印漬法調查次單元之抗原性是否因解離處理而改變。將以1%SDS進行解離處理前後之檢體分別滴入5pL於硝基纖維素膜’加以風乾。以與上述相同方法調查於硝基纖維素膜上所吸附之蛋白質的抗原性，結果發現糞便抗原、精製抗原二者經解離處理後抗原性皆顯著變低。由此顯示本發明之單株抗體並非辨識過氧化氫酶之次單元（即一次構造上之抗原決定基），而是以未經修飾之高次構造作爲辨識之抗原決定基。實施例11 [糞便中抗原之精製] ⑴糞便中抗原之分子量讓糞便中幽門螺桿菌抗原顯示最高値之陽性者(表4之檢體號碼8)所提供之糞便165g懸濁於4倍量之PBS中，經離心分離（7000rpm，30分鐘），所得上澄液再以超離心分離 (30000rpm，30分鐘），得到上澄液。於上澄液680mL中加入硫胺165g攪拌以成爲40%飽和，產生之沉澱以離心分離 (7000i:pm，30分鐘）去除。於上澄液750mL·中加入硫胺 214g攪拌以成爲80%飽和，產生之沉澱以離心分離 (7000rpm，30分鐘）回收。讓沉澱懸濁於PBS中，相對於 10L之蒸餾水進行透析。取透析內液82mL中之2mL用與實施例6相同之方法以Sephacryl-S300 HR管柱進行凝膠過濾。針對所得之成分以與實施例5相同之方法，利用三明 40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -_1 n «^1 I tr 1_ 1_1 11 ·_ϋ I ·_1 I ^1· ttt —Mi tt 1 ϋ i^i I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1247809 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（Ί ) 治ELISA調查抗原性，結果本糞便中抗原之分子量爲 270kDa，與實施例8所記載之陽性者2名之糞便中抗原及實施例9所記載之精製抗原之分子量相同。 ⑵糞便中抗原之精製將（1)之透析內液40mL以10mM磷酸緩衝液(PH7.0)稀釋至lOOmL後，裝載於以相同緩衝液平衡化之陽離子交換樹脂CM-SephadexC — 50 (阿馬夏姆法魯馬系亞生技公司製造）之管柱（1x2.5cm)。以同緩衝液10mL洗淨後，以 PBSlOmL洗提之。將整個管柱洗淨、洗提之各成分以含 0.1%脫脂奶之PBS稀釋成320倍後，依實施例5所記載之三明治ELISA法測定其抗原性。抗原性在洗提成分中被發依據阿馬夏姆法魯馬系亞生技公司之親和性層析法手冊所記載之方法，製作出讓單株抗體21G2於CNBr-活性化之Sepharose 4B (阿馬夏姆法魯馬系亞生技公司製造)固定化之管柱(2x3cm)。讓上述洗提成分6mL裝載於單株抗體固定化管柱，於室溫靜置2小時。以PBS50mL洗淨之後，以0.2M甘胺酸HC1緩衝液(pH3.0)洗提之，以每10mL來分次進行。將各成分以含0.1%脫脂奶之PBS稀釋10倍後，依實施例5所記載之三明治ELISA法測定抗原性。又，以實施例9所記載之方法測定過氧化氫酶之活性。其結果如圖2所示，確認箭頭所指之洗提開始後不久之洗提成分(成分No· 7〜8)具抗原性，過氧化氫酶之活性亦與抗原性一致。由以上可知糞便中含具有4個次單元且具過氧化氫酶活 41 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) * - 1^^裝--------訂--------- # [247809 A7 — ____Β7___ 五、發明說明（Ρ) 性之未經修飾抗原。 [產業上之可利用性] 由於本發明具上述之構成，故可提供一種可辨識於幽門螺桿菌過氧化氫酶中專一存在之抗原決定基的單株抗體，再者，若使用本發明之單株抗體，可極專一地辨識幽門螺桿菌。又，因已成功地建立辨識幽門螺桿菌之過氧化氫酶的單株抗體產生融合瘤，乃可半永久地製造同一單株抗體。採用本發明之單株抗體的檢驗套組，可將消化道排泄物當作檢體，不會帶給受驗者苦楚，且可既簡便又有效地檢測幽門螺桿菌之感染。此外’採用本發明之單株抗體的檢驗套組係，即使僅採用1種之單株抗體時，亦呈現極佳精確度、無批次差異、具安定性、始終可專一且高精確度地檢測幽門螺桿菌之感染。 ---------------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims

1247809 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍依據免疫層析法。 9·一種單株抗體，係針對幽門螺桿菌之具有四個次單元且未經修飾的過氧化氫酶；其特徵在於，與幽門螺桿菌以外之細菌之過氧化氫酶不會反應、但與幽門螺桿菌之過氧化氫酶會產生專一性反應，且該單株抗體爲IgGl，L鏈爲/c型。 10·如申請專利範圍第9項之單株抗體，係由21G2、 41A5或是82B9之融合瘤所產生者。請先閲讀背 © I Λ 訂 # 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐)