WO2001032908A1

WO2001032908A1 - Anticorps monoclonal, hybridome, immunoessai et necessaire a diagnostic

Info

Publication number: WO2001032908A1
Application number: PCT/JP2000/007554
Authority: WO
Inventors: Masahiko Wakasugi; Ritsuko Mochida; Haruhisa Hirata
Original assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2001-05-10
Also published as: EP1227159A1; TWI247809B; KR100756117B1; AU7960600A; DE60045870D1; EP1227159B1; CN1384886A; EP1227159A4; CN1195869C; KR20020059649A; US6849419B1; BR0015145A

Description

明細書

モノクローナル抗体、ハイプリドーマ、免疫学的測定法及び診断キット

技術分野

本発明は、ヘリコバクタ一 ' ピロリのカタラーゼを抗原とするモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ、免疫学的測定法及び診断キットに関する。

背景技術

へリコパクター ' ピロリ（H e l i c o b a c t e r p y l o r i ) はヒトの胃粘膜に見られる細菌である。ヘリコバクタ一 · ピロリへの感染率は、社会経済状態と密接に関連しており、発展途上国ほど感染率が高く、先進国ほど感染率が低くなる傾向がある。しかしながら、日本人の感染率は先進国の中でも際立つて高く、 4 0歳以上では 8 0%の人が感染しているとも言われている。近年、へリコパクター · ピロリが胃潰瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎、更には胃癌等のさまざまな胃、十二指腸疾患の原因となりうることが明らかにされてきた。

ヘリコパクター · ピロリを除菌することにより、これらの疾患に罹患する可能性を低減できることが明らかになったために、ヘリコバクタ一 · ピロリの除菌対象疾患について国際的な議論がなされ、現在では胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃悪性リンパ腫、早期胃癌切除後胃等が除菌の適応対象疾患として認知されている。ヘリコバクタ一 · ピロリの除菌療法が胃、十二指腸疾患の新しい治療法として認知されるのに伴い、我が国でも日本消化器病学会により治験ガイドラインが作成され、へリコパクター · ピロリ感染の存在診断と除菌判定法が示された（日本消化器病学会雑誌、 9 6卷、 1 9 9一 2 0 7、 1 9 9 9年）。上記治験ガイドラインでは、存在診断は侵襲的検査法である胃部生検組織の培養、鏡検、ゥレアーゼ試験にて行い、除菌判定は胃部生検組織の培養と鏡検及び非侵襲的検査法である尿素呼気試験を必須とすることが示されている。また、被験者が小児である等の特殊な場合、血中抗ヘリコパクター · ピロリ抗体検査と存在診断とを併用して判定を行うことが示されている。しかし、これらのへリコバクタ一 ' ピロリ感染の検査法には以下の問題点がある。侵襲的検査法は、胃内視鏡の挿入及び生検等により被験者が多大な苦痛を強いられることとなる。非侵襲的検査法では、被験者の苦痛は大幅に改善されるが、尿素呼気試験では、検査前の絶食が必要である。また、尿素呼気試験は、マススぺクトルや赤外分光高度計等の装置が必要であり、特定の施設でしか実施できず、コストも高くなるという欠点がある。抗体検査は、除菌後も血中抗体価が長期にわたり高値であるので、除菌判定には適さない。従ってこれらの検査に代わる、非侵襲的で且つへリコパクター · ピロリ感染を直接、特異的に精度良く検出できる検查方法が望まれている。

従来、消化管感染菌の直接検査法として消化管排泄物、特に糞便からの感染菌の選択培地を用いた分離培養が行われてきた。しかし、へリコパクター · ピロリに関しては数多くの試みにも拘らず、糞便から分離培養された報告はほとんどなレ、。その理由として、ヘリコバクタ一 ' ピロリは i n v i t r oで、低温、栄養欠乏、酸素欠乏等のように環境条件が悪化すると、通常のらせん状体から培養不能な球状体へ形態変化することから、下部消化管においても分離培養不能な球状体に変化していることが考えられる。

—方、抗原抗体反応に基づく免疫学的方法による糞便からのヘリコパクター - ピロリの直接検出に関して、ヘリコパクター · ピロリに対するポリクローナル抗体を用いたィムノアッセィにより糞便等の排泄物検体中のヘリコバクタ一 . ピロリを検出する方法が報告されている（J . C 1 i n. M i c r o b i o l . 、 3 3卷、 2 1 62— 2 1 65、 1 995年、特開平 1 0— 1 0 1 28号公報（特許第 3043 999号））。

しかし、ポリクローナル抗体は、一般に交差反応性があり、特異性が劣るうえ、抗血清のロット毎に抗体価や特異性が変動する欠点があるので、ポリクローナル抗体を用いた診断薬の製造は、本質的に品質管理が難しいという問題点がある。現実に、特許第 304399 9号の特許権者であるメリディアン社により製造されたポリクローナル抗体を用いた糞便中ヘリコパクター · ピロリ抗原検出キット「Hp SA」に関しては、偽陰性の出現や特異性の低さが問題となっている（M e d i c a l T r i b u n e, 4— 5、 1 99 9年 6月 3日号； Am. J . G a s t r o e n t e r o l . 、 94卷、 1830— 1 833、 1 999年）。これに対して、特開平 10— 101 28号公報には、へリコパクター ' ピロリは菌株の変異を起こすので、単一の抗原のみとしか反応できないモノクロ一ナル抗体は、へリコパクター · ピロリの検出には不適であり、逆に、多様な抗原ゃェピトープに対応し得る点で、ポリクローナル抗体の方がへリコパクター . ピロリの検出には適していると記載されている。発明の要約

本発明は、上記現状に鑑み、被験者に苦痛を与えず、特別の装置を必要とせずに、安価にへリコパクター . ピロリの感染が診断でき、更に、単一の抗体を用いることにより、交差反応性がなく特異性に優れ、ロット毎の変動がなく品質管理が容易であり、更に、単一のモノクローナル抗体を用いた場合でも優れた感度を有する診断方法を提供することを目的とするものである。

本発明は、へリコパクター ' ピロリのカタラーゼを抗原とするモノクローナル抗体である。

本発明は、また、へリコパクター ' ピロリのカタラーゼを抗原とするモノクロ —ナル抗体を産生するハイブリドーマである。

本発明のハイブリドーマは、 21 G 2 (FERM BP— 7336) 、 41 A 5 (F E RM B P— 733 7) 、又は、 82 B 9 (FERM B P— 733 8) であることが好ましい。

本発明のハイプリドーマにより産生されるモノクローナル抗体もまた、本発明の 1つである。

本発明のモノクローナル抗体の少なくとも 1種を用いて行う免疫学的測定法もまた、本発明の 1つである。

本発明の免疫学的測定法は、上記モノクローナル抗体のいずれか 1種を用いて行うことが好ましい。

本発明の免疫学的測定法は、へリコパクター ' ピロリへの感染を判定するために用いられることが好ましい。

本発明の免疫学的測定法は、検体が消化管排泄物であることが好ましい。本発明の免疫学的測定法は、 E L I S A法又はィムノクロマトグラフィー法によることが好ましい。

本発明のモノクローナル抗体の少なくとも 1種を含む診断キットもまた、本発明の 1つである。

本発明の診断キットは、上記モノクローナル抗体のいずれか 1種を含むことが好ましい。

本発明の診断キットは、へリコパクター · ピロリへの感染を判定するために用いられることが好ましい。

本発明の診断キットは、検体が消化管排泄物であることが好ましい。

本発明の診断キットは、 E L I S A法又はィムノクロマトグラフィー法によることが好ましい。

なお、本明細書において、力タラ一ゼとは、 S D S等の変性剤で変性 ·乖離され、立体構造がほどかれたサブュニッ卜に相当するタンパク質を含まないものである。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 9におけるァフィ二ティ一クロマトグラフィ一の溶出パターンを示した図である。

図 2は、実施例 1 1におけるァフィ二ティ一クロマトグラフィーの溶出パターンを示した図である。発明の詳細な開示

以下に本発明を詳述する。

本発明のモノクローナル抗体は、ヘリコバクタ一 · ピロリのカタラーゼを抗原とするものである。

本発明のモノクローナル抗体は、本発明のハイブリドーマにより産生することができ、例えば、本発明のハイブリドーマを培養し、その培養液から得ることができる。しかしながら、本発明のモノクローナル抗体の製造方法としては特に限定されず、例えば、遺伝子工学的に得られたものであっても、へリコパクター - ピロリのカタラ一ゼと特異的に結合することができる限り本発明の範囲に含まれるものである。

本発明のハイブリドーマは、へリコパクター ' ピロリのカタラーゼを抗原とするモノクローナル抗体を産生するものであって、ヘリコパクター · ピロリで免疫した動物の脾細胞又はリンパ節細胞と、骨髄腫細胞とを融合して得られるものである。

本発明のハイブリドーマは、公知の細胞融合法により作製することができる。即ち、ヘリコパクター · ピロリを免疫原としてヒト以外の動物を免疫し、その脾細胞又はリンパ節細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイプリドーマを作製し、その中からヘリコバクタ一 · ピロリを認識するモノクロ一ナル抗体を産生するハイプリドーマを選択することにより本発明のハイプリドーマを得ることができる。上記免疫原としては、ヘリコパクター · ピロリの力タラ一ゼを含有するものであれば特に限定されず、例えば、へリコパクター · ピロリの菌株を適当な培地で培養して得られる培養物、らせん状体の菌体、球状体の菌体、これらの菌体の破砕物、溶解物、抽出物、これらを分画したもの等を挙げることができる。上記菌体は、死菌体であっても、生菌体であってもよい。

上記力タラ一ゼとしては特に限定されず、例えば、失活したもの、一部の立体構造が壊れているもの、一部が欠損したもの等であってもよいが、 4個のサブュニットを有するものが好ましく、 N a t i V eなものがより好ましい。

なお、本明細書において、 N a t i V eな酵素とは、ほぼ生理的な条件でとつている固有の構造を保持しているものを指し、全てのサブユニットを有し、かつ、活性を有しているものをいう。

上記免疫原のなかでも、球状体の菌体の破砕物が好ましい。へリコパクター ' ピロリは i n v i t r oでは低温、栄養欠乏、酸素欠乏等のように環境条件が悪化すると、通常のらせん状体から培養不能な球状体へ形態変化するので、消化管排泄物中においても分離培養不能な球状体に変化していると考えられる。また、ヘリコパクター · ピロリの菌体は下部消化管では破砕された状態であると考えられる。

上記免疫原として用いるヘリコバクタ一 · ピロリの菌株種としては特に限定されず、例えば、標準菌株である AT C C 43504株、 NCTC 1 1 638等を挙げることができ、更に感染者から採取した他の株であってもよい。上記免疫原として用いるへリコパクター · ピロリの遺伝子型も特に限定されず、例えば、 V a c Aや c a g Aを有していても有していなくてもよく、更に、 v a c Aが S 1 a、 S l b、 S 2のいずれの配列を有していてもよく、 m 1、 m 2のどちらの配列を有していてもよい。

本発明のハイプリドーマを作製するために用いる被免疫動物としては特に限定. されず、例えば、ャギ、ヒッジ、モルモット、マウス、ラット、ゥサギ等を挙げることができるが、なかでもマウスが好ましい。

上記被免疫動物を免疫する方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、マウスを免疫する場合、 1回に 1〜 1 00 g、好ましくは 50〜 1 00 の免疫用抗原を等容量（0. l mL) の生理食塩水及びフロイン卜の完全ァジュバント又は R I B Iアジュバントシステムで乳化して、上記被免疫動物の背部、腹部の皮下又は腹腔内に 2〜 3週毎に 3〜 6回接種する方法等を挙げることができる。

本発明においては、上記被免疫動物を免疫後、抗体価の高い個体を選び、最終免疫 3〜5 日後に脾臓又はリンパ節を摘出し、公知の細胞融合法に従って、融合促進剤の存在下で、これらの組織に含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることができる。

上記融合促進剤としては特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール (以下、 PEGという）や、センダイウィルス等を挙げることができるが、好ましくは PEGが用いられる。

上記骨髄腫細胞としては特に限定されず、例えば、 P 3U 1、 NS— 1、 P 3 X 63. A g 8. 653等のマウス由来の細胞； AG 1、 AG 2等のラット由来の細胞等を挙げることができる。

上記細胞融合法としては特に限定されず、例えば、脾細胞と骨髄腫細胞とを 1 ： 1〜： L 0 ： 1の比率で混合し、これに分子量 1， 000〜 6, 000の PE Gを 1 0〜80%の濃度で添加し、 20〜3 7。C、好ましくは 30〜3 7でで 3 〜 10分間ィンキュベ一トする方法等を挙げることができる。本発明において、ヘリコパクター · ピロリを認識するモノク口一ナル抗体を産生するハイプリドーマの選択は、例えば、ハイプリドーマのみが生育できる H A T培地等の選択培地で培養し、ハイプリドーマ培養上清中の抗体活性を固相酵素免疫測定法（EL I SA) 等の方法を用いて測定することにより行うことができる。更に、本発明において、ヘリコバクタ一 ' ピロリを認識するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマの樹立は、例えば、へリコパクター · ピロリを認識するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマに対し、限界希釈等の方法によりクロ一ユングを繰り返すことにより行うことができる。

本発明のハイブリドーマとしては、例えば、 2 1 G 2 (受託番号 FERM B P- 733 6) 4 1 A5 (受託番号 FERM B P - 733 7) 、及び、 82 B 9 (受託番号 FERM B P— 7338) を挙げることができる。これらのハイブリドーマは、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号）に 2οοο 年 1 0月 23 日付で寄託されている。本発明のモノクローナル抗体を大量に調製する方法としては特に限定されず、例えば、あらかじめプリスタンを投与したマウスの腹腔にハイブリド一マを移植して、回収した腹水から得る方法等を挙げることができる。腹水中の本発明のモノクローナル抗体は、プロティン Aやプロティン Gカラム等を使用する公知の方法等により精製することができる。

本発明のモノクローナル抗体は、カタラーゼを抗原とするものである。

上記カタラーゼとしてはェピトープが保持されているものであれば特に限定されず、例えば、失活したもの、一部の立体構造が壊れているもの、一部が欠損したもの等であってもよいが、 4個のサブユニットを有するものが好ましく、 Na t i v eなものがより好ましい。なお、上記カタラーゼは、変異等を有するものも含むものである。

上記カタラーゼを産生するヘリコパクター · ピロリの菌株種としては特に限定されない。

また、上記力タラ一ゼを産生するヘリコバクタ一 · ピロリの遺伝子型としても特に限定されず、例えば、 V a c Aや c a g Aを有していても有していなくてもよく、更に、 v a c Aが S 1 a、 S 1 b、 S 2のいずれの配列を有していてもよく、 ml、 m 2のどちらの配列を有していてもよい。

上記カタラーゼを産生するヘリコバクタ一 · ピロリの形態としては特に限定されず、例えば、らせん状体のヘリコバクタ一 · ピロリ、球状体のヘリコバクタ — - ピロリを挙げることができる。 . 本発明のモノクローナル抗体のクラス ·サブクラスとしては特に限定されず、 I g Gい I g G₂、 I gG₃、 I g G₄、 I gM、 I g E、 I gAい I gA₂、 I g Dのいずれであってもよく、また、 L鎖も特に限定されず、 λ鎖であっても、 κ鎖であってもよい。

また、本発明のモノクロ一ナル抗体としてはヘリコバクタ一 · ピロリのカタラーゼと特異的に結合することができるものであれば特に限定されず、例えば、本発明のモノクローナル抗体の分解物である F (a b' ) ₂、 F a b' 、 F a bや、キメラ抗体であってもよい。

上述の、 2 1 G 2 (受託番号 FERM B P— 7336) 、 4 1 A 5 (受託番号 FERM B P— 733 7) 、及び、 8 2 B 9 (受託番号 FERM B P— 7 338) のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体（以下、それぞれモノク口一ナル抗体 2 1 G 2、モノクローナル抗体 4 1 A5、モノクロ一ナル抗体 8 2 B 9ともレ、う）は、ヘリコバクタ一 · ピロリの N a t i v eな力タラ一ゼを認識するものである。

本発明者らが、モノクローナル抗体 2 1 G 2、モノクローナル抗体 4 1 A 5、及び、モノクローナル抗体 82 B 9をそれぞれ用いてヘリコバクタ一 ' ピロリの菌体破砕物に対して抗体固定ァフィ二ティークロマトグラフィーを行ったところ、ヘリコパクター · ピロリの菌体破砕物に含まれていた 2 70 kD aの分子量を有するタンパク質が検出された。このタンパク質に対して SD S—ポリアクリルァミドゲル電気泳動を行ったところ 59 kD aの分子量を有する単一のバンドが検出された。また、このタンパク質の N末端のアミノ酸配列を調べたところへリコパクター · ピロリの力タラ一ゼのァミノ酸配列と一致した。ヘリコパクター · ピ口リのカタラーゼは 200 k D aの分子量を有し、 50 kD aの分子量を有するサブユニットが 4個集合した 4量体の構造を有することが知られている（J . G e n. M i c r o b i o l . ( 1 99 1 ) , 1 3 7, 5 7— 6 1) 。従って、以上の結果より、モノクローナル抗体 2 1 G 2、モノクローナル抗体 4 1 A 5 , 及び、モノクローナル抗体 82 B 9が検出したタンパク質は 4個のサブュニットを有するヘリコバクタ一 · ピロリの力タラ一ゼであると同定され、上記の各モノクローナル抗体は、 4個のサブュニットを有するカタラーゼを認識するものであることが明らかとなった。

上記抗体固定ァフィ二ティークロマトグラフィ一で検出されたカタラーゼの活性を測定したところ、活性を有しており、このカタラーゼがいわゆる N a t i v eな酵素であったことも判明した。

なお、モノクロ一ナル抗体 2 1 G 2、モノクロ一ナル抗体 4 1 A 5、及び、モノクロ一ナル抗体 82 B 9はいずれも、解離した力タラ一ゼのサブユニットとは反応しなかった。

ヘリコパクター . ピロリの菌体中の総タンパク質のうち力タラ一ゼの占める割合は、 J . G e n. M i c r o b i o l (1 99 1) ， 1 37, 5 7— 6 1に記載された力タラ一ゼの精製過程における比活性の上昇度から概算して、重量換算でたかだか 0. 5%である。

この点に鑑みると、モノクローナル抗体 2 1 G 2、モノクローナル抗体 4 1 A 5、及び、モノクローナル抗体 82 B 9力 4個のサブユニットを有する力タラーゼを認識するものであったということは驚くべきことであり、到底予見しえない事項であった。

カタラーゼは異なる種の間でも極めてよく保存されており、へリコパクター · ピロリの力タラ一ゼも他の細菌のカタラーゼと相同性が高いことが知られている ( J . B a c t e r i o l . (1 9 96) ， 1 78 (23) , 6960— 696 7) 。しかしながら、モノク口一ナル抗体 2 1 G 2、モノクロ一ナル抗体 4 1 A 5、及び、モノクローナル抗体 82 B 9は、実施例 3に示したとおり、ヘリコパクタ一 · ピロリ以外の細菌のカタラーゼとは全く反応しなかった。

また、ヘリコパクター · ピロリには多様な変異株が存在することが知られているカ（Mo l e c u l a r M i c r o b i o l o g y (1 996) , 20， 8 33 - 842) 、驚くべきことに、モノクローナル抗体 2 1 G 2、モノクローナル抗体 4 1Α5、及び、モノクローナル抗体 82 Β 9は、実施例 3に示したとおり、いずれのへリコパクター · ピロリに対しても良好に反応した。

本発明のモノクローナル抗体がヘリコパクター · ピロリの多様な変異株に対して良好に反応することに鑑みると、本発明のモノク口一ナル抗体が認識するェピト一プは変異株同士の力タラ一ゼの間で極めてよく保存されている部位であると思われる。

以下に詳述するように、本発明のモノクローナル抗体は、糞便を検体として、極めて高い精度でヘリコパクター · ピロリへの感染の有無を判定することができるものである。

モノクロ一ナル抗体 2 1 G 2、モノクローナル抗体 4 1 A 5、及び、モノクローナル抗体 82 B 9を用いて、糞便を検体として免疫学的測定を行ったところ、上記の各モノクローナル抗体はヘリコバクタ一 · ピロリに感染している被験者の糞便のみと反応した。これにより、へリコパクター ' ピロリに感染している被験者の糞便中には、 4個のサブュニットを有するヘリコバクタ一 · ピロリのカタラーゼが存在していることが明らかになった。糞便中に存在するヘリコパクター · ピロリのカタラーゼがサブユニットごとに解離したものではなく、 4個のサブュニットを保有するものであるということは今まで全く知られておらず、このことは、通常タンパク質は消化管中でタンパク質分解酵素により分解されてしまうことに鑑みても全く驚くべきことである。

また、ヘリコバクタ一 . ピロリの感染者の糞便を試料として、モノクローナル抗体 2 1 G 2を固定したカラムを作製し、ァフイエティ一クロマトグラフィーを行い、その溶出画分について、 EL I S Aと力タラ一ゼ活性測定を行ったところ、力タラーゼ活性と抗原性とは一致した。

以上のことから、ヘリコバクタ一 ' ピロリの感染者の糞便中には 4個のサブュニットを有し、カタラーゼ活性も有する N a t i V eなカタラーゼが含まれることがわかった。へリコパクター . ピロリのカタラーゼが消化管内で消化されずに、活性を有する Na t i V eな酵素として排出され、糞便中に存在していたということは全く予想できないことであった。

特開平 9一 3 22 772号公報及び I n f e c t . I mmu n. (1 9 9 7) , 65, 46 68-46 74にはヘリコパクター ' ピロリのカタラーゼを SDS— P A G Eにより変性 ·乖離させて得られた、ほどけたサブュニットに相当するタンパク質と反応するモノクローナル抗体が開示されている。しかしながら、これらのモノクローナル抗体が、 N a t i v eな、立体構造を保持し活性を有する力タラーゼと反応するか否か、また、糞便等の排泄物検体中のへリコバクタ一 · ピロリを検出することができるか否かは不明である。

これに対して、本発明のモノクローナル抗体は、採取が容易である糞便等の消化管排泄物中を検体として用いてヘリコパクター · ピロリへの感染の有無を認識することができるものである。

本発明のモノクロ一ナル抗体の用途としては特に限定されるものではないが、免疫学的測定法において、へリコパクター · ピロリへの感染の判定に用いることができる。

本発明の免疫学的測定法は、本発明のモノクロ一ナル抗体のうちの少なくとも 1種を用いて行うものであり、 1種のみを用いても実施することができるものである。

一般的に、免疫測定法に用いる抗体としては、特異性が低く、バックグラウンドが高いポリクロ一ナル抗体よりも、特異性が高く、バックグラウンドが低いこと力ゝら、感度に優れるモノクローナル抗体の方が好ましいとされている。

しかしながら、ヘリコバクタ一 · ピロリには多様な変異株が存在することが知られており、このため、単一のモノクローナル抗体を用いては感染や存在を検出することが極めて困難であると考えられていた。特開平 1 0— 1 0 1 2 8号公報に記載のように、多様な抗原を有する細菌への感染や、その細菌の存在を検出するためには、多様な抗原に対応しうるポリクロ一ナル抗体の方が適しているという見解もあり、また、複数のモノクローナル抗体を併用してへリコパクター · ピロリを検出する方法は開示されている（WO 0 0 Z 2 6 6 7 1 ) 力；、単一のモノクローナル抗体を用いてへリコパクター . ピロリを検出する方法は今まで開発されてはいなかった。

これに対して、驚くべきことに、本発明のモノクローナル抗体は、 1種の抗体のみを用いることにより極めて優れた精度でヘリコバクタ一 · ピロリを検出することができるものであった。なお、 WO 00/266 7 1に記載されているモノクローナル抗体は、ゥレア一、熱ショックタンパク質、アルカリヒドロペルォキシダ一ゼーレダクターゼ、 20 kD aのタンパク質（3—デヒドロキナーゼ 2型）、 1 6. 9 k D aタンパク質（好中球活性化タンパク質）、及び、 33. 8 kD aタンパク質（フルクト —スービスホスファターゼ一アルドラ一ゼ）を抗原とするものであり、カタラーゼに関しては全く触れられていない。また、 WO 00ノ266 7 1に記載されている測定方法の検出感度は充分なものではなかった。

本発明の免疫学的測定法としては、例えば、酵素免疫測定法（E I A) 、固相酵素免疫測定法（EL I SA) 、放射線免疫測定法（R I A) 、蛍光免疫測定法 (F I A) 、ウェスタンブロット法、ィムノクロマトグラフィー法等を挙げることができる。上記の各種免疫学的測定法は、競合法やサンドイッチ法等により、標識剤で標識された抗原又は抗体を用い、目的とする抗原又は抗体を測定することができるものである。

上記の各種免疫学的測定法のなかでも、 EL I S A法及びィムノクロマトダラフィ一法が好ましい。

上記競合法は、例えば、検体中のへリコパクター ' ピロリのカタラーゼと、既知の量の標識されたヘリコバクタ一 · ピロリの力タラ一ゼとの、本発明のモノクローナル抗体に対する結合の量的な競合反応によるものである。上記で例示した競合法においては、ヘリコバクタ一 . ピロリのカタラーゼを含む検体液に、担体上に保持された一定量の抗体を加え、更に標識剤で標識した一定量のへリコパクター · ピロリのカタラ一ゼを加える。その後、担体上に保持された標識剤又は担体上に保持されなかった標識剤の活性を測定する。この際、抗体と標識された抗原の添加はほぼ同時に行うことが好ましい。

上記サンドイッチ法は、例えば、固相化された本発明のモノクローナル抗体と、標識剤で標識された本発明のモノクローナル抗体とで、検体中のへリコバクタ一 · ピロリのカタラーゼをサンドイッチするものであり、酵素等の標識剤に対する基質等を加え発色等させることにより、検体中のヘリコバクタ一 · ピロリのカタラ一ゼを検出するものである。

上記標識剤としては、 ¹²⁵ I等の放射性同位元素（以下、 R I と記す）、酵素、酵素基質、発光物質、蛍光物質、ピオチン、着色物質等を挙げることができる。これら標識剤と抗原又は抗体との結合には、マレイミド法 [ J . B i o c h e m. ( 1 9 7 6 ) , 7 9 , 2 3 3 ] 、活性化ピオチン法 [ J . Am. C h e m. S o c . ( 1 9 7 8) ， 1 0 0， 3 5 8 5 ] 、疎水結合法等が用いられる。

上記酵素としては、例えば、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、 /3 —ガラクトシダ一ゼ、グルコースォキシダ一ゼ等を挙げることができる。この際用いる基質としては、選択した酵素に適したものを選べばよく、例えば、 AB T S、ノレミノ一ルー H₂0₂、 o—フエ二レンジァミン一 H₂0₂ (ペルォキシダーゼ用）、 p—ニトロフエ二ノレホスフェート、メチ /レゥンベリフェリノレホスフエ一ト、 3— ( 2'—スピロアダマンタン）一 4—メトキシ一 4一（3 "—ホスホリルォキシ）フエニル一 1， 2—ジォキセタン（アルカリホスファターゼ用）、 p— 二ト口フエニル一 β—Ό—ガラクト一ス、メチルゥンベリフェリルー β— Ό—ガラクトース（/3—ガラクトシダーゼ用）等を挙げることができる。

上記測定は、 4〜4 (TCで 1分〜 1 8時間反応させ、生じた発色、蛍光量、発光量又は着色量を測定することにより行うことができ、他にも、 4〜4 0 の範囲で加温しながら行ういわゆるレート法を採用してもよい。

上記抗原又は抗体への放射標識は、市販されているボルトンハンター試薬により容易に行うことができる。例えば、 0. 1 M炭酸水素ナトリウム水溶液に溶かした抗原又は抗体溶液にボルトンハンター試薬を加え 1〜 2時間後に、 G— 2 5 の脱塩力ラム等を用いて未反応のボルトンハンター試薬を除去することにより実施することができる。

この他、クロラミン Τ法やョードジン法等を採用することにより容易に¹²⁵ I による放射標識を行うことができる。

上記発光物質としては、例えば、イソルミノールゃァクリジンエステル等を挙げることができ、上記蛍光物質としては、例えば、フルォレセインやローダミン等を挙げることができる。この際、標識の方法は活性化エステル法やイソシァネ一ト法を採用することにより容易に行うことができる（「酵素免疫測定法」医学書院、 1 9 8 7年）。上記着色物質としては、例えば、着色ラテックス粒子、金コロイド等を挙げることができる。本発明の免疫学的測定法として、上記競合法を実施するには、例えば、未知量のヘリコパクター . ピロリのカタラーゼを含有する検体を、公知の手段で物理的又は化学的に本発明のモノクローナル抗体を結合させた固相に加えて反応させる。また、同時に標識剤で標識したヘリコバクタ一 . ピロリのカタラーゼの一定量を加えて反応させる。

本発明の免疫学的測定法として、上記サンドイッチ法を実施するには、例えば、未知量のヘリコパクター · ピロリのカタラーゼを含有する検体を、公知の手段で物理的又は化学的に本発明のモノクローナル抗体を結合させた固相に加えて反応させる。その後標識剤で標識した本発明のモノクローナル抗体を加えて反応させる。

次いで、いずれの方法においても、必要な場合には固相をよく洗浄した後で、固相上に結合している標識剤の活性を測定する。上記標識剤が R Iである場合、ゥエル ·カウンター又は液体シンチレーション .カウンタ一を用いて測定する。標識剤が酵素である場合、基質を加えて放置し、比色法又は蛍光法により酵素活性を測定する。標識剤が蛍光物質、発光物質、着色物質であっても、それぞれ公知の方法に従って測定する。

本発明の免疫学的測定法は、本発明のモノクローナル抗体を用いるものであるので、ヘリコバクタ一 . ピロリのカタラーゼに特異的に存在するェピトープを認識することができ、他の物質を、交差反応を原因として誤って検出してしまうことがなく、特異性が極めて高い測定を行うことができるという極めて優れた特色を有する。

本発明の免疫学的測定法を実施するために本発明の診断キットを用いることができる。本発明の診断キットは、本発明のモノクローナル抗体の少なくとも 1種を含むものであり、 1種のみのモノクロ一ナル抗体を含むものであってもよい。本発明の診断キットにおいて用いられる本発明のモノクローナル抗体としては、ヘリコパクター · ピロリのカタラーゼを認識するものであれば特に限定されず、本発明のモノクローナル抗体の分解物である F ( a b ' ) ₂、 F a b ' 、 F a b 等であってもよレ、。

本発明の診断キットは、ヘリコパクター · ピロリの菌体又はヘリコパクター · ピロリの力タラ一ゼの存在を免疫学的に検出することができ、ヘリコパクター · ピロリへの感染を判定するものである。

本発明の診断キットでは、本発明のモノクローナル抗体はあらかじめ固相化されていてもよく、また、本発明のモノクローナル抗体はあらかじめ上記標識剤で標識されていてもよい。

本発明の診断キットにおいて用いる固相としては特に限定されず、例えば、ポリスチレン等のポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、ィムノクロマトグラフィ一用濾紙、グラスフィルタ一等の不溶性担体を挙げることがでさる。

本発明の診断キットは、更に他の成分を含んでいてもよい。

上記他の成分としては特に限定されず、例えば、標識に用いる酵素、その基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質、緩衝液、プレート等を挙げることができ、これらとしては上記に掲げたものを用いることができる。

本発明の診断キットの形態としては特に限定されないが、迅速かつ簡便に診断を行うためには本発明の診断キットの構成成分が一体となった一体型の診断キットであることが好ましい。

上記一体型の診断キットとしては特に限定されず、例えば、カセット型、カートリッジ型等を挙げることができる。

上記カセット型の態様としては、例えば、ィムノクロマトグラフィー法を用レ、、反応カセット内にメンブレンが収納されており、そのメンブレン上の一端（下流側）には本発明のモノクローナル抗体が固相化されており、メンブレン上の逆の —端（上流側）には、展開液が装着されており、その近傍の下流側には、上記標識剤の基質が添加されたパッドが配置されており、メンブレンの中間部には上記標識剤で標識された本発明のモノクローナル抗体が添加されたパッドが配置されている態様等を挙げることができる。

上記に例示したカセット型の態様を有する診断キットを使用する場合、上記標識剤で標識された本発明のモノクローナル抗体が添加されたパッド上に検体を添加し、検体に含まれるヘリコパクター · ピロリのカタラーゼと上記標識剤で標識された本発明のモノクローナル抗体との結合体を形成させた後、上記展開液を展開させると、形成された結合体は本発明のモノクローナル抗体が固相化されている箇所まで移送され、そこでヘリコパクター · ピロリのカタラーゼと上記標識剤で標識された本発明のモノクローナル抗体と固相化された本発明のモノクローナル抗体との複合体が形成される。次いで、上記標識剤と上記基質が反応し、発色等する。この発色等を感知することによって、ヘリコバクタ一 ' ピロリへの感染を判定することができる。

検体を充分な量の展開液で希釈してからメンブレン上に滴下する態様を採用する場合は、あらかじめメンブレン上に展開液を装着しておかなくともよい。また、上記標識剤として着色ラテックス粒子等の着色物質を用いる場合は、基質は不要であり、本発明のモノクローナル抗体が固相化されている箇所で上記複合体が形成されたか否かは、着色物質による着色により判断される。

上記カートリッジ型の態様としては、例えば、反応が上記競合法である場合には、複数のゥエルを有するカートリッジであり、（a ) 本発明のモノクローナル抗体が収納されたゥエル、（b ) 上記標識剤で標識されたへリコパクター · ピロリ等を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納されたゥエル、（c ) 上記標識剤の基質を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納されたゥエル、が一体的に形成されてなる力一トリッジ等を挙げることができ、反応がサンドィツチ法である場合には、複数のゥエルを有するカートリッジであり、（a ) 本発明のモノクローナル抗体が固相化された不溶性担体が収納されたゥエル、（b ) 上記標識剤で標識された本発明のモノクローナル抗体を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納されたゥエル、（c ) 上記標識剤の基質を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納されたゥエル、がー体的に形成されてなるカートリッジ等を挙げることができる。

上記に例示したカートリッジ型の本発明の診断キットを使用する場合は、通常、競合法やサンドイッチ法を実施する際と同様に、反応及び測定を行うことができる。

本発明の診断キットは、上記競合法と上記サンドイッチ法のいずれの方法を実施するものであってもよいが、上記サンドィツチ法を実施するものであることが好ましい。上記サンドイッチ法は、感度が高く、反応時間が短くてすみ、精度に優れるという利点を有する。上記サンドィツチ法としてィムノクロマトグラフィ —法を用いると、試験操作が簡便で、結果の判定も目視で容易に行うことのできるキットを作製することができる。また、 E L I S Aとして上記サンドイッチ法を用いると、測定対象物質の量に依存して酵素反応生成物が生じるので、へリコバクタ一 · ピロリへの感染が陽性である場合の発色等を目視で確認できるような系の設定が容易である。

本発明の診断キットに用いる検体としては特に限定されず、例えば、胃内容物、胃洗浄液、消化管排泄物等を挙げることができるが、採取が容易で被験者への負担が少なレ、点で糞便等の消化管排泄物が好ましい。

本発明の診断キットは、除菌治療前に感染の有無を調べるために用いてもよく、除菌治療後にその成否の判定を行うために用いてもよい。

本発明の診断キットは、モノクローナル抗体を用いるため口ット毎の差がなく、検出感度が高く、偽陰性や偽陽性の問題を生じない。

本発明によれば、へリコパクター · ピロリのカタラーゼを抗原とするモノク口ーナル抗体を用いることによって、検体中の他の物質による影饗を排除できるので、極めて高感度かつ特異的に、へリコパクター · ピロリの存在を検出することができる。また、へリコパクター ' ピロリのカタラーゼに対するモノクローナル抗体産生ハイプリドーマが樹立されたことにより、同一のモノクローナル抗体を半永久的に製造することが可能となる。本発明のモノクロ一ナル抗体を用いた診断キットは、消化管排泄物を検体とすることができるので、被験者に苦痛を与えることなく、簡便かつ効率よくヘリコパクター · ピロリ感染を検出することができる。また、本発明のモノクローナル抗体を用いた診断キットは、 1種のみのモノクローナル抗体を用いる場合であっても、極めて優れた精度を呈し、ロット毎の差がなく、安定しているので、常に特異的かつ精度良くへリコパクター ' ピロリ感染を検出することができる。また、上記診断キットは、測定が簡便であり、医療現場で非常に有用である。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例、試験例を挙げ、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。実施例 1

[モノクローナル抗体の作製]

(1) へリコパクター · ピロリ球状菌体懸濁液（免疫原）の調製

5%馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュ一ジョン寒天培地（ディフコ社製）上にへリコパクター · ピロリ（ATCC 43504) を筋状に画線した。このプレートを 37で微好気性環境下にて 3〜4日培養後、更に 37で嫌気性環境下にて 7日間インキュベートし、球状化させた。得られたコロニーを白金耳等でかきとり、リン酸緩衝生理食塩液（PB S) に懸濁した。 4でにて、 1000 0 X gで 10分間遠心分離したヘリコバクタ一 · ピロリの菌体を 0. 5 %ホルマリンに懸濁し、 4 °Cにて 4日間放置して不活化した。その後、 PB Sに懸濁し、 4°Cにて、 10000 X gで 10分間遠心分離する操作を 3回繰り返し、上記菌体を洗浄した後、 PB Sに懸濁した。

(2) ヘリコバクタ一· ピロリ球状菌体破砕物（免疫原）の調製

(1) で得られた菌体懸濁液を、超音波破砕機（セイコー電子工業社製、 Mo d e l 7250) を用いて、 o u t p u t 3、 50% d u t y c y c 1 eの条件にて 10分間超音波処理して菌体を破砕した。

(3) 免疫及び細胞融合

(1) 、（2) にて調製した免疫原（へリコパクター · ピロリ球状菌体懸濁液又はヘリコパクター · ピロリ球状菌体破砕物）と F r e u n dのコンプリートァジュバント（カルビオケム社製）を当量混合し、オイルェマルジヨンとした。これを BALBZcAマウス（日本クレア社製、 6週齢、雌）の背部皮下に 0. 2 mLずつ投与した。初回免疫後 7日目と 14日目に追加免疫を行い、更に細胞融合 3日前に上記免疫原を 0. 2 mLずつ腹腔内に投与した。最終免疫から 3日目のマウス脾細胞を摘出し、骨髄腫細胞（P 3 x 63. A g 8. 653株、 RCB 0146、理研ジーンバンク）と 10 ： 1の割合で混合し、 50%ポリエチレングリコール 4 0 0 0を用いて融合した後、 HAT培地（ギブコ社製）によりハイプリドーマを選択培養した。

(4) ハイブリドーマの選択

細胞融合後 1 2日目に培養上清中の抗体活性を E L I S Aにより測定した。免疫原 1 0 μ gZmLを固相化した 9 6穴 E L I S Aプレート（コースター社製）の各穴に融合細胞の培養上清液 2 0 0 /X Lを添加し、 3 7°Cで 1時間反応後、 0. 0 5 %Tw e e n 2 0入り P B S (洗浄液）で洗浄し、ペルォキシダ一ゼ標識抗マウス I g G (C a p p e 1社製、 1 : 2 0 0 0 0) 2 0 0 β Lを添加した。 3 7°Cで 1時間反応後、上記洗浄液で洗浄した。洗浄後、基質液（0. 1 M o - フエ二レンジァミンと 0. 0 1 2 %過酸化水素水）を各穴に 2 0 0 Lずつ添加し、室温で 1 5分反応させた。反応後、各穴に 3. 5 N硫酸を 5 0 Lずつ添加し酵素反応を停止し、 4 9 2 n mにおける吸光値を測定した。吸光値が 0. 1 5 以上を示した、上記免疫原に反応する抗体を産生するハイプリドーマクローンを選択した。各クローンを限界希釈法により 2回クローニングを行った。クロー二ング後のハイプリドーマを BA L BZ c Aマウスに移植した結果、腹水として回収できるモノクロ一ナル抗体を産生したハイブリドーマは 3 2クローンであった。実施例 2

[サンドィツチ E L I S Aによる消化管排泄物中のヘリコパクター · ピロリを特異的に認識するモノクローナル抗体の選択]

( 1 ) モノクローナル抗体固相化プレートの作製

3 2クローンの腹水各 l mLを P B Sで 2倍に希釈し、飽和硫酸アンモニゥム 2mLを滴下して 4でで 4時間放置した。その後、 3 0 0 0 r p m、 2 0分間遠心分離し、沈查を P B S 2mLに浮遊し透析を行った。これらのモノクローナル抗体を以下の方法により 9 6穴 E L I S Aプレートに固相化した。即ち、各モノクロ一ナル抗体を 5 μ gZmLに希釈した後、 9 6穴 E L I S Aプレートの各穴に 0. 2 mL加え、 4でで一夜放置した後、 P B Sで洗浄した。洗浄後、 1 %スキムミルク一P B Sを各穴に 0. 2 5 mL加え、 4 tで 1時間放置してマスキングを行った。マスキング後、上記洗浄液で洗浄した。

(2) ビォチン標識モノクローナル抗体の作製

( 1 ) にて調製した 3 2クローンのモノクローナル抗体 3 m gとビォチニル一 N—ヒドロキシサクシニミドエステル（ザィメッド社製） l Omgを混合し、 0. 1M炭酸水素ナトリウム（pH8) 中、室温で、 3時間攪拌しながら反応させた。反応液を P B S 5 Lに対して 4 °Cで一夜透析し、ピオチン標識モノクローナル抗体を得た。 (3) 消化管排泄物中のへリコパクター · ピロリを特異的に認識するモノクロ一ナル抗体の選択

尿素呼気試験によりヘリコバクタ一 · ピロリ陽性者及び陰性者と判定された各 1名の糞便検体 25 Omgを 0. 1%スキムミルク一 PB S 0. 5mLに懸濁後、 3000 r pmで 1 0分間遠心分離した上清を集め、糞便抽出液とした。糞便抽出液 0. 2mLを（1) にて調製した各モノクローナル抗体固相化プレートの各穴に添加した。 3 7 °Cで 1時間放置後、上記洗浄液にて 5回洗浄し、（2) にて調製した各ピオチン標識モノクローナル抗体 0. 2 mLを添加した。 3 7 C で 1時間放置後、上記洗浄液にて洗浄し、ペルォキシダ一ゼ標識アビジン 0. 2 mL (ザィメッド社製）を添加した。 3 7でで 1時間放置後、上記洗浄液にて洗浄後、基質液（0. 1M o—フエ二レンジァミンと 0 · 0 1 2%過酸化水素水）を各穴に 0. 2mLずつ添加し、室温で 1 0分反応させた。反応後、各穴に 3. 5 N硫酸を 50 μ Lずつ添加し酵素反応を停止し、 49 2 nmにおける吸光値を測定した。表 1に示した通り、 3種のモノクローナル抗体 2 1 G 2、 4 1 A 5、 8 2 B 9を単独又は組合わせたサンドィツチ E L I S Aは、ヘリコバクタ — · ピロリ感染者の糞便検体に対して高い反応性を示すことがわかった。モノクローナル抗体の組み合わせ吸光値

固 L=J □ Iし隔件若陰性

21 Gク 21G2 3.3 0.043

21G2 41A5 >3. 5 0.075

21G2 82B9 >3.5 0.06フ

41 A5 41 A5 3.3 0. 10

41 A5 21G2 >3.5 0.080

41 A5 82B9 >3.5 0.035

82B9 82B9 >3.5 0.071

82B9 21G2 3.3 0.066

82B9 41A5 >3.5 0.064

各モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマはそれぞれハイプリドーマ 2 1 G 2 (F ER B P- 7336) 、ハイブリドーマ 41 A 5 (F ERM B P— 7337) 、及び、ハイブリドーマ 82 B 9 (F ERM B P— 7338) として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。なお、各モノクローナル抗体のィムノグロブリンサブクラスをィムノグロブリンタイピングキットマウス（和光純薬工業社製）により調べた結果、 3クローン共 I gG₅で、 L鎖は典型であった。実施例 3

[菌株による反応性の比較及び他菌種との反応性]

(1) へリコパクター ' ピロリ菌体懸濁液の調製

5 %馬脱繊血を添加したブレインハートインヒユージョン寒天培地上にヘリコパクター ' ピロリ（ATCC 43504 ；東海大学病院臨床分離株 No. 130、及び、 No. 1 1 2 ;兵庫医科大学臨床分離株 N o . 526、 No. 4484,' No. 50 1 7、 No. 5025、 No. 5049、 No. 5 142、 No. 5 287、 No. 5308、 No. 53 14、及び、 No. 5330) を筋状に画線した。このプレートを 37°Cで 3〜4日間微好気性培養して得られたらせん状菌のコロニ一、又は、更に 37 °Cで嫌気性環境下にて 7日間放置して得られた球状菌のコロニ一を白金耳等でかきとり、 PB Sに懸濁した。 4°Cにて、 1000 0 X gで 10分間遠心分離した菌体を 0. 5%ホルマリンに懸濁し、 4Tにて 4 日間放置して不活化した。その後、 PB Sに懸濁し、 4でにて、 l O O O O X g で 10分間遠心分離する操作を 3回繰り返し、菌体を洗浄した後、再度、 PB S に懸濁し、へリコパクター . ピロリらせん状菌体懸濁液及び球状菌体懸濁液を得た。

(2) ヒト腸内菌及びキャンピロバクタ一 · ジェジュ二の菌体懸濁液の調製ヒト糞便から分離される代表的な腸内菌バクテロイデス ·ブルガタス、ェシェリヒア ' コリの 2菌種及びらせん状菌であるキャンピロパクター .ジェジュニを以下の方法で培養し、得られたコロニーから（1) と同様の方法により各菌の菌体懸濁液を調製した。即ち、バクテロイデス ·ブルガタス（ I FO 1429 1) は 5 %馬脱繊血を添加した B L寒天培地（日水製薬社製）上で 3 7 °Cで 2日間、嫌気培養した。ェシェリヒア ' コリ（ATCC 25 9 22) はブレインハ一トインヒユージョン寒天培地上で、 3 7でで1 日間、好気培養した。キャンピロバクター ·ジェジュニ（80068 東海大学病院臨床分離株）は 5%馬脱繊血を添加したブレインハ一トインヒュ一ジョン寒天培地上で 37°Cで 2 日間微好気培養した。

(3) 他のへリコバクタ一属の菌体懸濁液調製

へリコパクター . フェリス（ATCC49 1 79) とへリコバクタ一 'へパティカス（ATCC 5 1 448) とを 5 %馬脱繊血を添加したブレインハートインヒユージョン寒天培地上で（1) と同様に培養して、得られたらせん状菌のコ口二一から（1) と同様にしてらせん状菌体懸濁液を得た。

(4) 菌体破砕物の調製

(1) 、（2) 及び（3) で得られた各菌体懸濁液を、超音波破砕機（セィコ —電子工業社製、 Mo d e l 7250) を用いて、 o u t p u t 3 , 50% d u t y c y c 1 eの条件にて 1 0分間超音波処理して菌体を破砕した。 (5) サンドイッチ E L I S A

(4) で得られた各菌体破碎物（タンパク質濃度 1 0 μ gZmL) 0. 2mL をそれぞれ、実施例 2 (3) の方法によりサンドイッチ E L I S A (モノクロ一ナル抗体 4 1 A 5固相化プレート：ピオチン標識モノクローナル抗体 82 B 9、モノクロ一ナル抗体 2 1 G 2固相化プレート：ビォチン標識モノクローナル抗体 4 1 A5、モノクローナル抗体 2 1 G 2固相化プレート：ビォチン標識モノクローナル抗体 82 B 9、モノクローナル抗体 2 1 G 2固相化プレート：ピオチン標識モノクローナル抗体 2 1 G 2、及び、メリディアン社製 Hp SA) を行った。結果を表 2に示した。

表 2に示した通り、モノクローナル抗体 2 1 G 2、 4 1 A5、 82 B 9は、へリコパクター · ピロリの各菌株のらせん状菌体、球状菌体に対して高い反応性を示すことがわかった。一方、パクテロイデス ·ブルガタス、ェシエリヒア . コリ、キャンピロパクター . ジェジュ二、へリコパクター ' フェリス、及び、ヘリコノくクタ一 ·へパティカスに対しては全く反応しなかった。一方、メリディアン社製

Hp SAは、へリコパクター ' フェリス、及び、へリコパクター 'へパティカスに対して反応性を示した。実施例 4

[サンドイッチ E L I S Aによる糞便検体中ヘリコパクター ' ピロリの検出 (1) ]

尿素呼気試験の結果、へリコパクター ' ピロリ陽性、陰性であったそれぞれ 3 名より提供された糞便検体 25 Omgを 0. 1 %スキムミルク一 PB S 0. 5 mLに懸濁し、実施例 2 (3) と同様の操作にて試験した。また、同じ糞便検体をメリディアン社製の Hp S A EL I S Aを用いて操作方法に従って試験し、 450 nmの吸光値を測定した。それぞれの吸光値及び尿素呼気試験結果を表 3 に示した。

t>

cn t>

o O CJl

尿素呼気試験結果が陽性であった被験者（No. 4、 5、 6) より提供された糞便検体は、陰性検体（No. 1、 2、 3) に比べて著しく高い吸光値を示すことがわかった。実施例 5

[サンドイッチ E L I S Aによる糞便検体中へリコバクタ一 · ピロリの検出 (2) ]

( 1 ) モノクローナル抗体の調製

ハイブリドーマ 21 G 2を BALB/c Aマウスに移植して回収した腹水 5m 1を P B Sで 2倍に希釈し、飽和硫酸アンモニゥム 1 OmLを滴下して 4°C、 4 時間放置した。その後、 3000 r pm、 20分間遠心分離し、沈渣を PB S 1 OmLに溶解した後、 P B Sに対して透析を行った。

(2) モノクローナル抗体固相化プレートの作製

(1) で調製したモノクローナル抗体 21 G 2溶液を以下の方法により 96穴

EL I S Aプレートに固相化した。 PB Sにて抗体濃度 5 μ g/mLに希釈した後、 96穴 EL I S Aプレートの各穴に 0. 2mL加え、 4で、一夜放置した後、 P B Sで洗浄した。 (3) ペルォキシダーゼ標識モノクローナル抗体作製

マレイミド法（石川栄治著、生物化学実験法 27、酵素標識法、 p. 5 1、 1 99 1年、学会出版センター）を用いてペルォキシダーゼ標識モノクローナル抗体を作製した。（1) で調製したモノクローナル抗体 5 m gと S— a c e t y l me r c a p t o s u c c i n i c a nh y d r i d e 、,/レトリツテ社製) 0. 6 mgを混合し、 0. 1Mリン酸緩衝液（pH6. 5) 0. 5mL中、 3 0 で、 30分間反応させた。反応液に 0. 1MEDTA20 // L、 0. 1Mトリス塩酸緩衝液（pH7. 0) 0. lmL、 1M ヒドロキシルァミン（ p H 7. 0) 0. lmLを加えて、 30で、 5分間放置後、 10000 r pm、 5分間遠心分離して上清を得た。上清をセントリコン 30 (am i c o n社製）で限外ろ過して、試薬を除去した後、 5mMEDTA— 0. 1 Mリン酸緩衝液（pH6. 5) lmLに置換し、チオール基導入モノクローナル抗体を得た。

ペルォキシダーゼ（西洋ヮサビ、東洋紡社製） 5mgと N— s u c c i n i m i d y l— 4— (N— ma 1 e i m i d ome t h y i ) — e y e 1 o h e x a n e— 1— c a r b o x y l a t e— ( I C N B i ome d i c a l s社製) lmgを混合し、 0. 1Mリン酸緩衝液（pH7. 0) 0. 5mL中、 30tで、 1時間反応させた。反応液を 1 0000 r pm、 5分間遠心分離して上清を得た。上清をセントリコン 30で限外ろ過して、試薬を除去した後、 0. 1Mリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1 mLに置換し、マレイミド基導入ペルォキシダーゼを得た。上記のチオール基導入モノクローナル抗体とマレイミド基導入ペルォキシダーゼをモル比 1 ： 5で混合し、室温で 30分間反応させた。反応液を S e p h a c r y 1— S 300HRカラムのゲル濾過カラム（直径 26 X長さ 8 70 mm、 0. 1Mリン酸緩衝液（pH6. 5) ) に負荷し、ペルォキシダ一ゼ標識モノクロ一ナル抗体を含む画分を集めた。

(4) サンドイッチ E L I S Aによる糞便検体中ヘリコパクター · ピロリの検出尿素呼気試験によりヘリコパクター · ピロリ陽性者及び陰性者と判定された各 10名の糞便検体 25 Omgを 0. 1%スキムミルク一 PB S 0. 5mLに懸濁後、 3000 r pm、 1 0分間遠心分離した上清を集め、糞便抽出液とした。糞便抽出液 50 /z L及び（3) で作製したペルォキシダーゼ標識モノクローナル抗体 50 μ Lを上記モノク口一ナル抗体固相化プレートの各穴に添加した。 2 5 、 1時間放置後、洗浄液（0. 05%ツイ一ン 20— PB S) にて 5回洗浄後、基質液（テトラメチルベンチジン +過酸化水素、 B i o FX社製） 0. lm Lを各穴に添加し、室温で 1 0分反応させた。反応後、各穴に 1 N硫酸を 50 μ Lずつ添加し酵素反応を停止し、吸光値（450 nm— 630 nm) を測定した。また、同じ糞便検体を、 Hp S Aを用いて試験し、吸光値（450 nm— 630 nm) を測定した。結果を表 4に示した。表 4

表 4に示した通り、モノクローナル抗体 2 1 G 2を単独で用いたサンドイッチ EL I S Aは、へリコパクター . ピロリ感染者の糞便検体に対して高い反応性を示し、尿素呼気試験による判定結果と完全に一致した。一方、 Hp S Aでは 2検体（検体番号 1 6、 1 9) が不一致（偽陽性）であった。

実施例 6

[ィムノクロマトグラフィ一法による糞便中ヘリコバクタ一 ' ピロリの検出] (1) 抗体固相化支持体の作製

抗ヘリコパクター . ピロリモノクロ一ナル抗体及び抗ゥサギ I g G抗体を線状に固相化した抗体固相化支持体を作製するために、ニトロセルロースシート（ヮットマン社製）を 5 mmX 2 Ommに裁断し、その下端より 1 0 mmの位置にモノクローナル抗体 2 1 G 2の溶液、 1 5 mmの位置に抗ゥサギ I gGャギポリク口一ナル抗体（C a p p e 1社製）の溶液をバイオジェット Q 3000 (B i o d o t社製）を用いて塗布した。室温で 2時間乾燥後、 1%スキムミルク（D i f c o社製）一0. 1%ツイ一ン 20— PB Sに 1 0分浸漬しマスキングを行つた。その後、充分に乾燥した。

(2) 着色ラテックス粒子標識物の調製

a . 赤色ラテックス粒子標識抗へリコバクタ一 · ピロリ抗体

赤色ラテックス粒子分散液（P L— L a t e x、 1 0%、 450 n m、 P o l yme r L a b o r a t o r i e s社製） 300 Lに P B S 1. 2 m Lをカロえ、 1 3000 r pm、 5分間遠心分離を行った。沈渣にモノクローナル抗体 2 1 G 2溶液（5mg/mL) l mLを加え、充分混和して、室温、 1時間反応を行った。未反応のモノクローナル抗体を除去するため、 1 3000 r pm、 5分間遠心分離を行い、沈渣を PB S 1. 5mLに懸濁し、再度遠心分離を行った。 1 %スキムミルク 1 mLを加え、室温、 1時間反応させてマスキングを行った。その後、 1 3000 r pm、 5分間遠心分離を行い、沈渣を 1 %スキムミルク一 0. 0 1 %アジ化ナトリウムを含む P B S 1. 5 mLに懸濁した。 b. 青色ラテックス粒子標識ゥサギ I gG

青色ラテックス粒子分散液（P L— L a t e x、 1 0%、 450 n m、 P o l y m e r L a b o r a t o r i e s社製）及びゥサギ I gG (0. 5 m g/m L、 C a p p e l社製）を用いて上記と同様な操作で青色ラテックス粒子標識ゥサギ I gGを調製した。 c 着色ラテックス粒子標識物

上記 2種類の着色ラテックス粒子標識抗体を等量混和し、ベンリーゼ（商標登録）不織布（旭化成社製） 5mmX 5 mmに 1 0 μ L含浸させ、通風乾燥した。 (3) ィムノクロマトグラフィー試験片の作製

抗体固相化支持体の下端から 2. 5 mmの位置まで着色ラテックス標識物を重ねた。更に、着色ラテックス標識物上に被検液浸漬用担体（3 MM Ch r、ヮットマン社製）を下端から 2. 5mmの位置まで重ねた。また、抗体固相化支持体の上端から 2 mmの位置まで吸水性担体（ 3 MM Ch r、ワットマン社製）を重ね、最後に透明なテープを上部に貼り固定してィムノクロマトグラフィー試' 験片とした。

(4) 糞便検体中へリコパクター · ピロリの検出

実施例 4に記載した 6名（陽性、陰性各 3名）の糞便を用いて試験した。各糞便 0. l gを採取し、 0. 1 %B SA— 0. 05%ツイ一ン 20— PB S lmL に懸濁した。 3000 r pm、 1分間遠心分離して夾雑物を除去し、上清 50 /X Lを（3) で作製したィムノクロマトグラフィー試験片の被検液浸漬用担体部に滴下した。 10分後に抗へリコパクター ' ピロリモノクローナル抗体固相化部位に現れる赤いラインの有無を判定した。その結果、陰性検体では全例赤いラインは確認できず、陽性検体では全例赤いラインが確認できた。なお、青ラインは全検体で確認されたので、試験は成功であった。実施例 7

[ラテックス凝集法による糞便中ヘリコパクター · ピロリの検出]

(1) ラテックス粒子標識抗ヘリコパクター · ピロリ抗体の調製

白色ラテックス粒子分散液（P L— L a t e x、 1 0%、 440 n m、 P o l yme r L a b o r a t o r i e s社製） 0. lmLに PB S O. 4mLをカロえ、 1 3000 r pm、 5分間遠心分離を行った。沈渣に P B S 0. 5mL及びモノクローナル抗体 2 1 G 2溶液（ 1 m gZmL) 0. 5mLを加え、充分混和して、室温、ー晚反応を行った。未反応のモノクローナル抗体を除去するため、 1 3000 r pm、 1 0分間遠心分離を行い、沈渣を P B S 1 mLに懸濁し、再度遠心分離を行った。 1 %スキムミルク lmLを加え、室温、 1時間反応させてマスキングを行った。その後、 1 3000 r pm、 5分間遠心分離を行い、沈渣を 1%スキムミルク一 0. 0 1 %アジ化ナトリゥム含有 PB S l mLに懸濁した。 (2) 糞便検体中ヘリコパクター · ピロリの検出

実施例 4に記載した 6名（陽性、陰性各 3名）の糞便を用いて試験した。各糞便 0. l gを採取し、 0. 1⁰/₀B SA— 0. 05%ツイーン 20含有 PB S lm Lに懸濁した。 3000 r pm、 1分間遠心分離して夾雑物を除去し、上清を得た。この糞便懸濁液上清 50 μ L及び（1) で調製したラテックス粒子標識抗へリコパクター . ピロリ抗体 50 μ Lをラテックス凝集盤上に滴下し、スライド口一ター（栄研化学社製）を用いて混和した。 5分後に凝集の有無を目視判定した。その結果、陰性検体では全例凝集は確認できず、陽性検体では全例凝集が確認できた。実施例 8

[ゲル濾過法による糞便中抗原の分子量測定]

へリコパクター · ピロリ陽性者（表 3の Ν ο . 4及び No. 5) より提供された糞便検体 20 gを氷冷した PB S 1 0 OmLに懸濁した。 l O O O O X gで 1 0分間遠心分離し、残渣を取り除き、更に 90000 X gで 30分間遠心分離を行い、上清を得た。この上清 1. 5mLを S e p h a c r y l — S 3 00HR (フアルマシア社製）を充填したゲル濾過カラム（1. 5 X 1 40 cm、 0. 1 Mリン酸緩衝液、 pH6. 5) に適用し、 1. 5 mLごとに分画した。分子量マ一力一には、チログロブリン、フェリチン、カタラーゼ、牛血清アルブミン及びチトクローム cを使用した。実施例 2 (3) に記載したサンドイッチ E L I S A (モノクローナル抗体 4 1 A 5固相化プレート、ビォチン標識モノクロ一ナル抗体 82 B 9、及び、モノクローナル抗体 2 1 G 2固相化プレート、ピオチン標識モノクローナル抗体 4 1 A5) により各画分の抗原を検出した。その結果、糞便中のヘリコパクター . ピロリ特異的抗原の分子量は、 2 70 kD aであることがわかった。実施例 9 [抗原の同定]

( 1) 抗原の精製

アマシャムフアルマシアバイオテク社ァフィ二ティークロマトグラフィ一ハンドブックに記載の方法により、モノクローナル抗体 8 2 B 9を、 CNB r—活性ィ匕 S e p h a r o s e 4 B (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に固定化したカラムを作製した（1 0mL) 。ヘリコバクタ一 · ピロリ（ATCC 4 3 5 04) 菌体を超音波破砕後、超遠心分離により得た上清（タンパク質濃度 4mg /mL) 5 mLをこのカラムに負荷した。室温にて 2時間静置後、 P B S 1 2 OmL (流速約 SmLZ分）にてカラムを洗浄し、 0. 2M グリシン HC 1緩衝液（p H 3. 0) 1 3 OmLにて溶出した。洗浄、溶出とも 1 OmLずつ分画し、 2 8 0 nmの吸光度及び抗原性を測定した。抗原性の測定は、実施例 2に記載のサンドィツチ E L I SA (固相化 2 1 G 2、標識 8 2 B 9) により行った。その結果、図 1に示した通り、溶出画分（画分 N o . 1 4〜 1 7) のみに抗原性が確認された。

(2) 精製抗原の純度及び分子量

溶出画分（N o . 1 4) 5 0 /z Lを、等量のサンプル緩衝液（2 %S D S— 5%メルカプトエタノール）と混合し、 1 0 0 、 5分間煮沸した。この溶液 2 0 μ Lを用いて SD S—ポリアクリルァミドゲル電気泳動（4一 2 0%アクリルアミドゲル）を行った。分子量マーカーは、ホスホリラ一ゼ、牛血清アルブミン、卵白アルブミン、炭酸脱水酵素、大豆トリプシンインヒビター、及び、 c 一ラクトアルブミンを用いた。泳動後、シルバースティン KANT〇 I I I (関東化学社製）を用いて、ゲルを染色した。その結果、精製抗原は単一バンドを示し、その分子量は 5 9 k D aであった。また、溶出画分（N o . 1 4) l mLを実施例 6に記載したのと同様の方法で S e p h a c r y l - S 3 0 0HRのゲル濾過を行った。得られた画分について、サンドイッチ E L I S Aにより抗原性を調べた結果、本精製抗原の分子量は、 2 7 0 kD aであり、糞便中抗原と同じであることがわかった。 (3) 精製抗原のァミノ末端側アミノ酸配列の決定

溶出画分（No. 14) 300 ;i Lを用いて HP G 1005 A P r o t e i n s e q u e n c i n g S y s t em (ョ本ヒュ一レツ卜 · ノヽッ力一ト个土製）により精製抗原のァミノ末端側アミノ酸配列を決定した。ァミノ末端から 8 残基の配列は、 Me t—V a 1—A s n - L y s—A s p— V a 1 - L y s— G 1 nであった。この配列は、ヘリコバクタ一 · ピロリのカタラーゼのァミノ末端からの配列（J. B a c t e r i o l . (1 996) ， 1 78, 6960— 69 67) と完全に一致した。 (4) 精製抗原のカタラーゼ活性及び紫外可視吸収スペクトルの測定

精製抗原のァミノ末端側アミノ酸配列がカタラーゼと一致したので、各画分の力タラ一ゼ活性を測定した。反応液には、 1 ImM過酸化水素を含む PB Sを用いた。各画分を P B Sにて 100倍希釈した後、その 50 μ Lを反応液 2mLに添加して反応を開始した。反応は室温にて行った。経時的に 240 nmの吸光度を測定し、 1分間あたりの吸光度の減少を求めた。ブランクには PB Sを用いた。その結果、図 1に示した通り、抗原画分にはカタラーゼ活性が検出された。

カタラーゼに含まれるヘムを確認するため、溶出画分 No. 14の紫外可視吸収スぺクトルを測定した。その結果、 407及び 277 nmに吸収極大を認めた。この値はヘリコバクタ一 · ピロリの力タラ一ゼの文献値（405及び 280 nm、 J . G e n. M i c r o b i o l . (1991) ， 1 37, 57— 61) とほぼ —致した。

(5) 精製抗原の保存安定性

溶出画分（No. 14) を 1. 4 μ g/mLとなるように 0. 1 % B S A含有 PB Sにて希釈した溶液を、 25 °Cで 1週間保存した。保存後の精製抗原の抗原性を実施例 5に記載したサンドイッチ E L I S A法により、また、力タラ一ゼ活性を（4) に記載した方法によりそれぞれ測定した。一 80°Cで凍結保存した精製抗原と比較した結果、抗原性は 25 °C保存でほとんど変化しなかった。しかし、力タラーゼ活性は著しく失活し、活性残存率 5 %以下となつた。実施例 10

[抗ヘリコパクター · ピロリモノクローナル抗体と糞便中抗原のサブュニットとの反応性]

抗ヘリコパクター . ピロリモノクローナル抗体と糞便中抗原のサブュニットとの反応性を測定するため、実施例 8に記載のへリコパクター · ピロリ陽性者の糞便懸濁液上清 50 ;z Lを用いて、実施例 9 (2) に記載した SD S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。対照として実施例 9の精製抗原（溶出画分 No. 14) 50 Lも同様に電気泳動した。泳動後、ウェスタンブロッテイング法によりニトロセルロース膜にタンパク質を転写した。ニトロセルロース膜を 1%スキムミルク液に 1時間浸してマスキングした後、モノクローナル抗体 21 G 2又は 82 B 9と 1時間反応させた。ニトロセルロース膜を 0. 05%ツイ一ン 20 — PB Sで 5回洗浄後、ペルォキシダーゼ標識抗マウス I gG抗体と反応させた。ニトロセルロース膜を 0. 05%ツイーン 20— PB Sで 5回洗浄後、基質液 (過酸化水素 + 3， 3，一ジァミノベンチジン）を加えて 10分間インキュベートしたが、糞便抗原、精製抗原を泳動したレーンともに、いずれのモノクローナル抗体を用いても抗原性に由来する発色は認められなかった。サブュニット分子に抗原性が認められなかった原因を明らかにするため、サブュニットへの解離処理で抗原性が変わるかどうかドットブロッテイング法により調べた。 1 % S D S による解離処理前後の検体をそれぞれニトロセルロース膜に 5 μ L滴下し、風乾した。ニトロセルロース膜に吸着したタンパク質の抗原性を上記と同様の方法で調べた結果、糞便抗原、精製抗原ともに 1%SDSによる解離処理後は、抗原性が著しく低下することがわかった。従って、本発明のモノクローナル抗体はカタラーゼのサブュニット即ち一次構造上のェピトープを認識するのではなく、より N a t i V eな高次構造をェピトープとして認識していることが示唆された。実施例 1 1

[糞便中抗原の精製]

(1) 糞便中抗原の分子量糞便中へリコパクター · ピロリ抗原が最高値を示した陽性者（表 4の検体番号 8) から提供された糞便 1 65 gを 4倍量の PB Sに懸濁し、遠心分離（700 0 r pm、 30分）して得られた上清を更に超遠心分離（ 30000 r p m、 3 0分）して上清を得た。上清 680mLに 40 %飽和となるように硫安 1 65 g を加えて撹拌後、生じた沈殿を遠心分離（7000 r pm、 30分）により除去した。上清 75 OmLに 80%飽和となるように硫安 2 14 gを加えて撹拌し、生じた沈殿を遠心分離（7000 r pm、 30分）により回収した。沈殿を PB Sに懸濁し、 1 0 Lの蒸留水に対して透析した。透析内液 82mLの内、 2mL を用いて実施例 6と同様の方法で S e p h a c r y 1— S 300HRカラムによるゲル濾過を行った。得られた画分について、実施例 5と同様の方法でサンドィツチ EL I S Aにより抗原性を調べた結果、本糞便中抗原の分子量は、 270 k D aであり、実施例 8に記載した陽性者 2名の糞便中抗原及び実施例 9に記載した精製抗原の分子量と同じであった。 (2) 糞便中抗原の精製

(1) の透析内液 4 OmLを 1 OmMリン酸緩衝液（pH7. 0) で 1 00m Lに希釈した後、同緩衝液で平衡化した陽イオン交換樹脂 CM— S e p h a d e x C- 50 (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）のカラム（1 X 2. 5 c m) に負荷した。同緩衝液 1 OmLで洗浄後、 P B S 1 0 m Lで溶出した。通塔、洗浄、溶出の各画分を 0. 1%スキムミルクを含む PB Sにて 3 20倍希釈した後、実施例 5に記載のサンドイッチ EL I S Aにより抗原性を測定した。抗原性は溶出画分に認められた。

アマシャムファノレマシアバイオテク社ァフィ二ティークロマトグラフィ一ハンドブックに記載の方法により、モノクローナル抗体 2 1 G 2を、 CNB r—活性化 S e p h a r o s e 4 B (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に固定化したカラムを作成した（2 X 3 cm) 。上記溶出画分 6 mLをモノクロ一ナル抗体固定化カラムに負荷し、室温にて 2時間静置した。 PB S 5 OmLで洗浄した後、 0. 21 グリシン1^〇 1緩衝液（pH3. 0) で溶出し、 1 OmLづっ分画した。各画分を 0. 1 %スキムミルクを含む PB Sにて 10倍希釈した後、実施例 5に記載のサンドイッチ E L I S Aにより抗原性を測定した。また、実施例 9 に記載した方法により力タラ一ゼ活性を測定した。その結果、図 2に示した通り、矢印で示した溶出開始直後の溶出画分（画分 N o . 7〜8 ) に抗原性が認められ、力タラ一ゼ活性も、抗原性と一致した。以上のことから本糞便中には 4個のサブュニットを有し、カタラーゼ活性も有する N a t i v eな抗原が含まれることがわかった。産業上の利用可能性

本発明は、上述の構成よりなるので、へリコパクター ' ピロリのカタラーゼに特異的に存在するェピトープを認識することができるモノクローナル抗体を提供することができ、更に、本発明のモノクローナル抗体を用いれば、ヘリコバクタ一' ピロリを極めて特異的に認識することができる。また、ヘリコパクター · ピ口リのカタラーゼを認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの樹立に成功したので、同一のモノクローナル抗体を半永久的に製造することができる。本発明のモノクローナル抗体を用いた診断キットは、消化管排泄物を検体とすることができ、被験者に苦痛を与えることなく、簡便かつ効率よくへリコパクター · ピロリ感染を検出することができる。また、本発明のモノクローナル抗体を用いた診断キットは、 1種のみのモノクローナル抗体を用いる場合であっても、極めて優れた精度を呈し、ロット毎の差がなく、安定しており、常に特異的かつ精度良くへリコパクター · ピロリ感染を検出することができる。

Claims

請求の範囲

1. へリコパクター · ピロリの力タラ一ゼを抗原とすることを特徴とするモノクローナ/レ抗体。

2. ヘリコパクター . ピロリのカタラーゼを抗原とするモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイプリドーマ。

3. ハイプリドーマは、 21 G2 (F ERM B P— 7336) 、 41 A 5 (F ERM BP— 7337) 、又は、 82 B 9 (F ERM B P— 7338) であることを特徴とする請求の範囲第 2項記載のハイプリドーマ。

4. 請求の範囲第 2又は 3項記載のハイプリドーマにより産生されることを特徴とするモノクローナル抗体。

5. 請求の範囲第 1又は 4項記載のモノクローナル抗体の少なくとも 1種を用いて行うことを特徴とする免疫学的測定法。

6. 請求の範囲第 1又は 4項記載のモノクローナル抗体のいずれか 1種を用いて行うことを特徴とする請求の範囲第 5項記載の免疫学的測定法。

7. へリコパクター ' ピロリへの感染を判定するために用いられることを特徴とする請求の範囲第 5又は 6項記載の免疫学的測定法。

8. 検体は、消化管排泄物であることを特徴とする請求の範囲第 5、 6又は 7項記載の免疫学的測定法。

9. EL I S A法によることを特徴とする請求の範囲第 5、 6、 7又は 8項記載の免疫学的測定法。

10. ィムノクロマトグラフィー法によることを特徴とする請求の範囲第 5、 6、 7又は 8項記載の免疫学的測定法。

1 1. 請求の範囲第 1又は 4項記載のモノクローナル抗体の少なくとも 1種を含むことを特徴とする診断キット。

12. 請求の範囲第 1又は 4項記載のモノクローナル抗体のいずれか 1種を含むことを特徴とする請求の範囲第 1 1項記載の診断キット。

13. へリコパクター ' ピロリへの感染を判定するために用いられることを特徴とする請求の範囲第 1 1又は 12項記載の診断キット。

14. 検体は、消化管排泄物であることを特徴とする請求の範囲第 1 1、 12又は 13項記載の診断キット。

15. EL I SA法によることを特徴とする請求の範囲第 1 1、 12、 13又は 14項記載の診断キット。

16. ィムノクロマトグラフィー法によることを特徴とする請求の範囲第 1 1、 12、 13又は 14項記載の診断キット。