CN1244894A - 组织型纤溶酶原活化剂(t－PA)变体:组合物及使用方法 - Google Patents

组织型纤溶酶原活化剂(t－PA)变体:组合物及使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1244894A
CN1244894A CN97181346A CN97181346A CN1244894A CN 1244894 A CN1244894 A CN 1244894A CN 97181346 A CN97181346 A CN 97181346A CN 97181346 A CN97181346 A CN 97181346A CN 1244894 A CN1244894 A CN 1244894A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
ser
fibrin
variant
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN97181346A
Other languages
English (en)
Inventor
埃德温·L·麦迪逊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Scripps Research Institute
Original Assignee
Scripps Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scripps Research Institute filed Critical Scripps Research Institute
Publication of CN1244894A publication Critical patent/CN1244894A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

组织纤溶酶原因子的变体表现出显著增强的血纤蛋白刺激性,大幅度增加的血纤蛋白辅因子的差别,对受PAI－1抑制的显著的耐受性,并实质性地增加酶原性,特征的组合增加了该酶的治疗应用。

Description

组织型纤溶酶原活化剂(t-PA)变体： 组合物及使用方法
本申请要求保护在此处用作参考的1996年11月16日申请的美国暂时申请S.N.60/030,655的利益。
本发明是在美国政府国立卫生研究所批号HL 52475和HL 31950的支持下完成的；美国政府在本发明中有特定权利。
本发明包含组织型纤溶酶原活化剂，也称t-PA，的蛋白质单链变体，及编码这种组织型纤溶酶原活化剂的核酸。这种t-PA蛋白变体比野生型的单链t-PA型式具有更高的酶原性(Eymogenicity)。还描述了生产和使用该t-PA变体体组合物的方法。
组织型纤溶酶原活化剂(t-PA)是通过纤溶酶原活化为蛋白酶解酶纤溶酶而在纤维蛋白溶解作用过程即凝血块的溶解中起关键作用的丝氨酸蛋白酶。通过基本DNA序列和推导出的氨基酸序列已对t-PA进行了充分的鉴定和表征。参见Penncia等，Nature，301：214(1983)和美国专利号4,853,330，公布于1989年8月1日，二者的内容均在此用作参考。人t-PA的核苷酸序列和推论出的一级氨基酸序列描述于图1A、图1B和图1C中。
在成熟的t-PA序列前面的从-35到-1的氨基酸残基组是“原”序列。成熟的t-PA分子(氨基酸残基1-527)含有5个结构域，其已参照于在许多其它蛋白质，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤溶酶原、凝血酶原、纤连蛋白以及上皮生长因子(EGF)中所鉴定的同源或相似的结构进行了限定。这些结构已被命名，起始处为成熟t-PA氨基酸序列的N端，1)各种被确定为包括氨基酸残基1到约44的指纹区(F)，2)各种被确定为从氨基酸残基45延伸至91的生长因子区(基于其与EGF的同源性)，3)被确定为从氨基酸残基92延伸至氨基酸残基173的Kringle 1(K1)，4)被确定为从氨基酸残基180延伸至氨基酸残基261的Kringle 2(K2)，以及5)基本上被确定为从约氨基酸残基264延伸至氨基酸残基527处的该分子C端的所谓的丝氨酸蛋白酶区(P)。这些基本上互相邻接或被短的“接头”区域所分开的区域组成了成熟形式的t-PA的从1到527氨基酸残基的全长氨基酸序列。
每个区域各种各样地上被描述为提供某种特定的生物学重要特性。指纹区被表征为含有至少对血纤蛋白高结合亲合性的显著重要性的序列。(这种活性据认为是对富含血纤蛋白的栓处的血块溶解时t-PA的高度特异性非常重要)。类似地，类生长因子区与细胞表面结合活性相关。该Kringle 2区与血纤蛋白结合及血纤蛋白刺激t-PA的活性是强烈相关的。丝氨酸蛋白酶区域负责纤溶酶原的酶切割变为纤溶酶。
在其前体的酶活性的水平上，在蛋白酶中t-PA是异乎寻常的。一般而言，蛋白酶被合成为酶原，非活化的前体必须要么经蛋白酶解加工，要么结合到特定的共因子上以得到真正的水解活性。酶原活化或酶产生后水解活性的增加在所有情况下都是相当显著的，虽然在胰凝乳蛋白酶群体中各成员之间有着广泛的差别。例如，强酶原，即具高度产酶性的那些，例如胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原，或纤溶酶原几乎是完全无活性的，其测定的酶原性为104到106(RobinSon，N.C.，Neurath，H.和Walsh，K.A.(1973)Biochemistry 12，420-426；Gertler，A.，Walsh，K.A.和Neurath，H.(1974)Biochemistry 13，1302-1310)。其它的丝氨酸蛋白酶也表现出了中等的酶原性。例如，因子XIIa的酶活化比其相应的酶原因子XII(Silverberg，M.，和Kaplan，A.P.(1982)Blood 60，64)的活性要高4000倍，而尿激酶的催化效率要比原尿激酶的要高250倍(Lijnen，H.R.，Van Hoef，B.，Nelles，L.，和Collen，D.(1990)J.Biol.Chem.265，5232-5236)。与此对照，单链和双链的t-PA的催化活性反相差5-10倍。
以成熟的被切好的双链酶的活性与单链前体形式的活性的比率表示的酶原性(zymogenicity)对野生型t-PA来说仅是5-10，与其它蛋白酶的前体几乎没有或没有催化活性形成了对比。因此，单链形式的野生型t-PA并非真正的酶原。
通过遗传工程已进行了许多尝试来改进t-PA的用途。此技术的现状综述于Krause，J.，和Tanswell，P.Arzneim.-Forsch.39：632-637(1989)和美国专利号5,616,486中，两者的内容均在此用作参考。
虽然对于作为血块溶解剂的天然的t-PA有着复杂的优点，人们并不认为天然的蛋白质一定在所有情况下都代表最佳的t-PA剂。因此已提议或设计了一些变体以改进t-PA的特性。在优选具长半衰期和低清除率的药剂时，例如是在深度静脉血栓的治疗和梗塞患者的重新灌注后，或者优选单链药剂时，这些变体中的某些有与天然t-PA的使用相关的不利之处。
例如，所有指纹区或实际部分的去除可导致血纤蛋白结合特征的显著降低的分子，虽然相应也有所得的实体的整体清除率的下降-参见WO89/00197，公开于1989年1月12日。
变体在EPO专利公开号199,574中有描述，其在第275、276和277位上的蛋白酶解切割位点上有氨基酸取代。这些优选表征为t-PA变体的变体在第275位上具有除精氨酸外的氨基酸，其被称之为抗蛋白酶单链t-PA变体，其中与可以单链或双链形式存在的天然t-PA不同的，在第275位上可耐受蛋白酶的切割，因此不能够在体内通过代谢转化为双链的形式。这种形式据认为有生物学和商业上的优势，其原因是它更稳定，而其血纤蛋白结合和血纤蛋白刺激相对于双链t-PA均有增加。而且，纤溶酶原被描述为含有一个能与血纤蛋白互作的结构域和尿激酶的蛋白酶结构域，在一个实施方案中尿激酶已被改变以使其更不易形成双链尿激酶。参见WO88/05081，公开于1988年7月14日。
关于t-PA的蛋白酶切割位点的修饰的更多的专利文献。参考例如EPO专利号241,209；EP 201,153，公开于1988年11月23日；公开于1987年8月19日的EP 233,013；公开于1988年11月23日的EP 292,009；公开于1988年12月7日的EP 293,936；以及公开于1988年12月7日的293,934；以及WO 88/10119。
当碳水化合物的摩尔百分比降低时，在117-119、184-186和448-450位上的糖基化变体表现出了更高的比活性。参见EPO公开号227,462；公开于1987年7月1日。该专利申请另外还公开了利用血纤蛋白/血纤蛋白降解产物的实验，并说明可在272-280位修饰t-PA分子并可从C端缺失多至25个氨基酸。而且，具有Asn 119、Ala 186和Asn 450的通过DNA修饰选择性除去了N-糖基化位点但包含残余的0-连接糖的t-PA变体被发现在体外水解实验中约是黑素瘤t-PA强度的2倍。参见EPO公开号225,286，公开于1987年6月10日。
在t-PA的第449位的氨基酸用除了精氨酸外的任何氨基酸来代替的对糖基化位点的修饰，以及Arg 275的修饰或-3到91区域的缺失，都已有说明。参见1987年8月13日公开的WO 87/04722。如所期望的公开了在第448位的以去除糖基化的氨基酸取代。参见1988年12月28日公开的EPO公开号297,066。1989年1月12日公开的WO 89/00191公开了位置448-450的修饰和N端1-82氨基酸的缺失的结合。此外，尿激酶已被在Asp302-Ser 303-Thr304区进行了修饰以防止糖基化。参见EPO公开号299,706，公开于1989年1月18日。
然而，糖基化位点，尤其是在氨基酸117上的改变，似乎肯定会形成一种分子，其溶解特征已受影响，并且可能会导致改变的循环半衰期形式以及/或者血纤蛋白结合特性。参见EPO专利公开号238,304，其公开于1987年9月23日。
当t-PA生长因子结构域被缺失之后，所得的变体仍然具有活性并结合于血纤蛋白上，如A.J.van Zonneveld等，Thrombos.Haemostas.54(1)：4(1985)所报道。在专利文献中也已报道了生长因子结构域的各种缺失。参见EPO公开号241,209(del-51-87)EPO公开号241,208(del-51-87和del-51-173)，PCT 87/04722(N端1-91所有部分的缺失)，EPO公开号231,624(缺失了所有生长因子结构域)，以及EPO公开号242,836和日本专利申请公开号62-269688(缺失了一些或所有生长因子结构域)。
还进一步表明t-PA可在第一Kringle结构域和生长因子结构域同时有修饰，这使得循环半衰期得以增加，参见EPO专利公开号241,208，公开于1987年10月14日。在氨基酸51和87(包括)之间的区域可从t-PA中缺失以得到具从血浆中缓慢清除的变体。Browne等。J.Biol.Chem.，263：1599-1602(1988)。而且，t-PA可被修饰，该修饰通过用不同的氨基酸来代替一个或多个氨基酸或特定氨基酸残基的缺失在成熟天然t-PA的氨基酸67到69之间的区域进行，同时不产生有害的生物学效应。参见EPO专利公开号240,334，公开于1987年10月7日。
还公开了使用包含氨基酸273-527的t-PA的区域的t-PA/尿激酶的杂合体。参见EPO 290,118公开于1998年11月9日。在蛋白酶结构域有改变的人t-PA的抗丝氨酸蛋白酶抑制剂突变体，包括del 296-302 t-PA，R304ST-PA，和R304E t-PA公开于Madison等，Nature，339：721-724(1989)。上述的清单并不是已描述过的t-PA的各种突变体的详尽无遗的综合。
作为前体t-PA的催化活性的结果，虽然在目的位点有有效的血凝块溶解，但也全身性地产生了不期望的蛋白酶解，其导致了循环血纤蛋白原，α2-抗纤溶酶和纤溶酶原的有害的消耗。所需要的是实现能提供有效的局部血凝块溶解并具有减少的全身性蛋白酶解效应的更高的酶原性的t-PA变体蛋白。
本发明提供了与野生型人t-PA相比具有至少两个由中性或酸性氨基酸取代了碱性氨基酸的单链变体t-PA蛋白质，以及编码此类单链变体t-PA蛋白质的寡核苷酸。本发明的单链变体t-PA蛋白质具有由选自包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基取代的R275氨基酸残基。优选地，本发明的单链变体t-PA蛋白质具有由选自包括天冬氨酸和谷氨酸残基并且最优选由谷氨酸的氨基酸残基取代的R275氨基酸残基。
本发明的单链变体t-PA蛋白质额外在丝氨酸蛋白酶区残基处的至少一个其它碱性氨基酸残基被非碱性氨基酸取代从而一般在野生型单链t-PA的天冬氨酸477和赖氨酸429之间的盐桥互相作用被破坏了。优选地，碱性氨基酸被极性或酸性氨基酸所代替，更优选地，被选自包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的组中的氨基酸残基所代替。
在天冬氨酸477和赖氨酸429之间的盐桥互相作用可以通过477和429位上的取代所破坏，或者在提供天冬氨酸477和赖氨酸429的至少一个可替换的盐桥互相作用伙伴的丝氨酸蛋白酶区域内的位置上的代替所破坏。在一个优选的实施方案中，H417氨基酸残基由选自包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的组中的氨基酸残基所取代。更优选地本发明的单链变体t-PA蛋白质的R275氨基的残基和H417氨基酸残基都被选自包括天冬氨酸残基和谷氨酸残基的组的氨基酸残基所取代。两个示范性的优选单链变体t-PA蛋白质是被命名为R275E、H417E和R275E、H417D的t-PA变体。
在另外一个优选的实施方案中，K429氨基酸残基被选自包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的组的氨基酸残基取代。更优选地，本发明的单链变体t-PA蛋白质的R275氨基酸残基和K429氨基酸残基都被选自包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的组中的氨基酸残基取代。一个优选的单链变体t-PA蛋白是被命名为R275E、K429Y的t-PA变体。
与野生型单链t-PA蛋白相比，本发明的单链变体t-PA蛋白质表现出更大的酶原性，酶原性被表示为成熟的双链酶的活性与单链前体形式的活性的比率。本发明的单链变体t-PA蛋白质酶原性至少为10，优选约50到约200。
本发明的单链变体t-PA蛋白质与野生型单链t-PA蛋白质相比，其以有血纤蛋白和无血纤蛋白时的催化效率的比率表示的血纤蛋白刺激倍数更高。本发明的单链变体t-PA蛋白质的血纤蛋白刺激倍数至少为7,000，优选约20,000到约50,000。
本发明的单链变体t-PA蛋白质与野生型单链t-PA蛋白质相比，具有减少的纤溶酶原活化剂抑制剂1(PAI-1)的抑制。与野生型单链t-PA蛋白质相比，本发明的单链变体t-PA蛋白质被PAI-1至少要少抑制5倍，优选至少为9倍，最优选至少为200倍。
与野生型单链t-PA蛋白质相比，本发明的单链变体t-PA蛋白质表现出了更高的以在血纤蛋白存在时的和血纤蛋白原存在时的催化效率的比率表示的血纤蛋白选择性倍数。本发明的单链变体t-PA蛋白质的优选实施方案的血纤蛋白选择性倍数至少为10，优选至少50，更优选至少100。
图中，
图1A，1B和1C表明了全长人t-PA cDNA的核苷酸序列和推定的氨基酸序列；以及
图2图示了在缓冲液(空心方框)、DESAFIB(空心菱形)、血纤蛋白原(空心圆)、血纤蛋白原的溴化氰片段(空心三角)或刺激肽P368(阴影方框)存在下纤溶酶原活化的标准显色测试结果。
此处所说的“野生型t-PA”指在人体中天然存在的t-PA蛋白质。然而该人t-PA被示意为图1A，1B和1C中所描述的氨基酸序列时，术语野生型t-PA应当被理解为包括其天然存在的等位基因变化t-PA变体组合物
本发明的t-PA变体cDNA和相应的所表达的重组蛋白质是在此处所述的丝氨酸蛋白酶介导的纤溶控制中起作用的有用的化合物。
本发明的t-PA变体cDNA含有至少一个核苷酸取代以产生编码不可切割的单链t-PA变体的t-PA cDNA，即在正常条件下不可被纤溶酶来切割。核苷酸取代导致了t-PA前体中氨基酸残基275(或使用胰凝乳蛋白酶编码系统时的位置15)上的用谷氨酸(E)对精氨酸(R)的代替，这种替代产生了不可切割的变体。胰凝乳蛋白酶编号系统的第15、144、156和194位分别相当于图1所描述的t-PA编号系统的第275、417、429和477位。
这些取代突变体的变体由野生型人t-PA氨基酸残基的单字母编码来命名，残基的位置相对于图1中所描述的成熟人t-PA氨基末端，其后为取代了成熟人t-PA氨基酸残基的氨基酸残基的单字母编码。在275位的由谷氨酸取代精氨酸的取代被称之为R275E。产生不可切割的单链t-PA的等价的取代是本领域已知的(Higgins，D.L.等(1990)Thrombosis Res.57：527-539)。
除R275E取代之外，本发明的变体cDNA进一步包含至少一个在独立的位置上的其它的核苷酸取代以产生具有至少两个氨基酸取代的t-PA变体。优选的cDNA变体包括导致在氨基酸残基位置417上的组氨酸的由选自包括甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基的取代的至少一个核苷酸取代。优选的具体实施方案被命名为R275E、H417D和R275E、H417E。另一个cDNA变体包括导致在氨基酸残基位置429上的赖氨酸(K)由选自包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基的取代的至少一个核苷酸取代。一个这种优选的实施方案被称之为R275E、K429Y。
本发明的变体t-PA cDNA可用于产生上述的重组表达的变体t-PA。在另一个具体实施方案中，该变体t-PA cDNA具有在下述的基因治疗中的治疗用途。
本发明包括具体实施方案例如表达载体或质粒，其中编码变体t-PA的cDNA是可操作地连接的以提供在下述方法中使用的重组变体t-PA的表达。一个优选的实施方案是包含可操作地连接到编码变体蛋白质的多肽上的pSVT7表达载体的COS1细胞对变体t-PA蛋白的表达。在进一步的实施方案中，暂时和稳定转染的细胞中含有编码变体t-PA的cDNA。
此处所述的所得的重组表达t-PA变体被表征为具有一个或多个下列结构和功能特征：1)t-PA变体为含有一个R275E氨基酸取代的不可切割的单链蛋白形式或防止被t-PA活化酶切割的其等价物；2)t-PA变体表现出对丝氨酸蛋白酶抑制剂纤溶酶原活化剂抑制剂，I型(PAI-1)的抑制的增加的抗性；3)在辅助因子例如血纤蛋白不存在的情况下该t-PA变体对底物如纤溶酶原的催化活性降低了；4)该t-PA变体表现出了增强的被血纤蛋白的刺激；5)t-PA变体表现出了对底物例如纤溶酶原在辅助因子例如血纤蛋白存在的条件下的可比的催化活性；以及6)考虑到前述的特征，该t-PA变体从而在局部纤溶功能中是有效的，且没有大范围的全身性蛋白酶解，从而消除了对循环血纤蛋白原、α2-抗纤溶酶，纤溶酶原的消耗，而这种消耗是野生型人单链t-PA前体中常见的。
因此优选的重组表达t-PA变体包括R275E，H417D，R275E，H417E和R275E，K429Y，以及其保守性的取代。一般而言。保守取代的实例包括一个非极性(憎水的)残基例如异亮氨酸、缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个，一个极性(亲水的)残基取代另一个例如精氨酸和赖氨酸对，谷氨酰胺和天冬酰胺对，甘氨酸和丝氨酸对之间的取代，一个碱性残基例如例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸对另一个的取代，或者一个酸性残基，例如天冬氨酸或谷氨酸取代另一个。关于氨基酸分类的进一步的论述参见Lehninger，A.L.，Biochemistry第2版，Worth Publishers，New York，1975年，第71-94页。
短语“保守取代”还包括只要蛋白质表现出必需的结合活性，使用化学衍生的残基代替非衍生的残基。“化学衍生物”指具有一个或多个通过功能性侧基的反应而化学衍生的残基的目的蛋白。这种衍生的分子包括例如其中游离的氨基已被衍生形成盐酸胺盐、对甲苯磺酰基、苄酯基、叔丁氧羰基，氯乙酰基或甲酰基。可将游离的羟基衍生形成盐、甲基和乙基酯或其它类型的酯或酰肼。游离的羟基可衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可被衍生形成N-im-苄基组氨酸。还包括在化学衍生物中的有含有20个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代组氨酸；5-羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；鸟氨酸可取代赖氨酸。可包括D-氨基酸以代替一个或多个L-氨基酸。
在本发明的具体例子中，碱性氨基酸，即精氨酸、赖氨酸和组氨酸以非碱性氨基酸代替。优选地碱性氨基酸以极性或酸性氨基酸，即选自包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基来取代。用于本发明的保守取代被定义为意指非碱性氨基酸在取代成熟野生型人t-PA中的特定碱性氨基酸时可以一般选自非碱性氨基酸，优选选自含有甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸，更优选为选自包含酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的组，例如，使用天冬氨酸而非谷氨酸来代替细氨酸残基是保守取代。优选的变体是描述于实施例1中的R275E、H417D和R275E、H417E，以及描述于实施例2中的R275E，K429Y变体。
所表达的具有至少两个氨基酸取代，例如，R275E、H417D，R275E，H417E和R275E，K429Y，的重组t-PA变体进一步表现出独特的性质。R275E和R275E，H417E可被血纤蛋白原和血纤蛋白所活化而R275E、K429Y主要被血纤蛋白所活化而对血纤蛋白原并不敏感。后者对PAI-1的抑制比R275E、H417D和R275E、H417E变体更具抗性。这些特征在将该化合物以下述的治疗性溶栓组合物给药时更提供额外的优点。而且，此处所述的t-PA变体可用于下述的诊断应用。制备和使用t-PA变体组合物的方法制备方法
上述的t-PA变体cDNA和重组表达变体蛋白质可用于实施1和2所述的许多方法中。尤其是，分离的cDNA克隆可用于表达载体系统中以产生本发明的编码的t-PA变体蛋白质。从而，具有可操作地连接在其中的t-PA变体cDNA的表达载体系统，包括含该表达载体的细胞，被设计用于产生本发明的重组表达的变体蛋白质。诊断应用
此处描述了优选的诊断方法。尤其是，本发明的重组表达的t-PA变体可用于诊断实验以检测改变了活性的血纤蛋白和血纤蛋白降解产物。这些实验因此在血栓形成条件下被示出。其它诊断应用，包括含有抗t-PA变体的抗体的试剂盒对本领域技术人员是熟知的。治疗应用
本发明的t-PA变体cDNA可用于基因治疗应用中以用来缓解血栓形成的疾病，包括急性和慢性的症状。急性症状尤其包括其它症状中的心脏病和中风，而慢性症状包括动脉和深度静脉血栓形成和再狭窄。因此优选的治疗组合物包括作为裸DNA的cDNA化合物本身，其作为病毒载体运输系统或其它基于载体的基因表达运输系统的一部分，其存在于脂质体运输系统等中。
本发明的重组表达t-PA变体蛋白被设计为缓解上述的相同症状的溶栓治疗剂。根据上述的各种t-PA变体蛋白的各自的结构和功能特点，通过所期望的治疗效果确定特定的t-PA变体的选择。例如，血纤蛋白原介导的内源人t-PA的活化可被流血所活化，而然后可导致更广泛的不期望的全身性反应。因此，为了在急性或者慢性血栓形成症状下介导局部的纤溶过程的同时预防全身性的蛋白酶解活化，人们可以使用t-PA变体，即R275E，K429Y，其主要由血纤蛋白和非血纤蛋白原活化。用作溶栓治疗剂的组合物一般是在适于药用的赋形剂中的生理有效量的t-PA变体蛋白质。根据给药方式和所治疗的症状，该溶栓治疗剂可以单剂量或多剂量给药。如果以“集合药团(bolus)”剂量给药，剂量一般为约0.01到0.6mg/kg，优选为约0.05到约0.2mg/kg，后续给药约为0.1到约0.2mg/kg以维持t-PA血液水平为约3微克/毫升。本领域技术人员将可理解剂量的变化取决于所要治疗的症状。在其它应用中，在预防粘连的形成中变体t-PA的在组分中的凝胶组合物是有用的。
本发明的其它变体和用途对本领域的技术人员来说是很明显的。实施例1定点诱变以及编码T-PA变体的表达载体的构建
寡核苷酸的定点特异性诱变所使用的方法为由Kunkel(Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82，488-492)所改良的Zoller和Smith(Zoller，M.I.和Smith，M.(1984)DNA9，479-488)的方法进行。突变被引入到事先已亚克隆到细菌噬菌体M13mp18的编码t-PA的cDNA的290bp的SacI-SmaI片段中。突变引物具有下列核苷酸序列：
H417D：5′-CTACGGCAAGGACGAGGCCTTGT-3′(SEQ ID NO：8)
H417E：5′-CTACGGCAAGGAGGAGGCCTTGT-3′(SEQ ID NO：9)突变发生之后，相应于全长290bp的SacI-SmaI片段的ssDNA被完全测序以保证所需的突变的出现和任何额外的突变的不存在。相应于H417D突变的290bp的SacI-SmaI片段的序列示于SEQ ID NO：5中，H417E突变的相应的序列示于SEQ ID NO：6中。为合适的噬菌体制备复制型(RF)DNA，将RF DNA以SacI和SmaI消化并在琼脂糖凝胶上电泳以回收突变的290bpSacI-SmaI片段。分离的突变SacI-SmaI片段被用于替换编码野生型人t-PA或t-PA/R275E的全长cDNA的相应片段以得到编码t-PA/H417D；t-PA/H417E；t-PA/R275E，H417D(SEQ ID NO：1)；以及t-PA/R275E，H417E(SEQ ID NO：2)的新的全长cDNA。通过COS细胞的瞬时转染表达酶
编码t-PA；t-PA/R275E；t-PA/H417D；t-PA/H417E；t-PA/R275E，H417D；和t-PA/R275E的cDNA被连到了瞬时表达载体pSVT7中，此载体在Madison，E.L.等(1989)Nature 339，721-724；Bird，P.M.等，(1987)J.Cell Biol.105：2905-2914；以及Sambrook，J.等(1986)Mol.Biol.Med.3：459-481中有描述。还可参见美国专利号.5,550,042，其在此处用作参考，其中描述了pSVT7的构建和用途，还有保藏于美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn Dr.，Rockville，MD 20852的含有其它p-SVT7t-PA构建体的培养物的MD20852。通过使用BioRad Gene Pulser将连接有cDNA插入物的载体以电穿孔导入到COS1细胞中。将含20μg cDNA、100微克载体DNA和约107COS细胞的等分试样置于0.4cm小池中，电穿孔通过320V，960μFD，Ω＝∞来进行。电穿孔之后，将细胞温育于含10％胎牛血清和5mM丁酸钠的DMEM上37℃ 48小时。细胞然后以无血清的培养基洗涤并于DMEM上温于37℃过夜。与无血清培养一起温育之后，收集条件培养基。收集的条件培养基中的等分试样中的酶浓度以ELISA测定使用间接显色实验的纤溶酶原活化的动力学分析
如前所述(Madison，.E.L.，Goldsmith，E.J.，Gerard，R.D.，Gething，M.-J.和Sambrook，J.F.，(1989)Nature 339，Madison，E.L，Goldsmith，E.J.，Gerard，R.D.，Gething，M.J.Sambrook，J.F.，以及Bassel-Daby，R.S.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，3530-3533；Madison，E.L.，Goldsmith，E.J.，Gething，M.J.，Sambrook，J.F.和Gerard，R.D.(1990)J.Biol.Chem 265，21423-21426.)利用底物赖氨酸-纤溶酶原(lys-plasminogen)(AmericanDiagnostica，Greenwich，CT)和Spectrozyme PL(American Diagnostica)进行t-PA的间接显色分析。在有和没有辅助因子DESAFIB(American Diagnostica)存在的条件下都进行了实验。在有DESAFIB存在时，赖氨酸-纤溶酶原的浓度在0.0125-0.2μM之间，在没有该辅助因子时，在0.9～15μM之间。使用小的合成底物的t-PA活性的动力学分析
利用底物甲磺酰基-D-环己基酪氨酰甘氨酰-精氨酸对硝基苯胺(Spectrozyme t-PA，American Diagnostica)按照前面所述(Strandberg，L.，和Madison，E.L.(1995)J.Biol.Chem.270，23444-23449；Smith，J.W.，Tachias，K.，和Madison，E.L.(1995)J.Biol.Chem.270，30486-30490)进行直接显色分析。PAI-1的抑制的二级速率常数的分析
在如上述的拟一级条件下测定野生型人t-PA和变体t-PA的二级速率常数。简而言之，预先将酶和抑制剂在23℃下温育0～30分钟。预温育后，稀释混合物，以标准的间接显色实验测定酶活性。对每种酶而言，酶和抑制剂的浓度和预温育的时间都经选择以产生数个数据点，该数据点的酶活在起始酶活的20％到80％之间。将比率(残余活性/起始活性)的自然对数对预温育时间作图来分析数据并测定所得的斜率。此斜率除以[I]得到所显示的二级速率常数。
发现以酸性残基对t-PA的组氨酸417的替换选择性抑制了单链t-PA的催化活性。组氨酸417被天冬氨酸或谷氨酸残基的替换产生了两个变体：t-PA/H417D和t-PA/H417E。但是，因为此实验中产生的纤溶酶很快地通过切割R275-I276的肽键将单链酶转化为其成熟的双链形式，所以单链形式的的这两种变体对纤溶酶原的酶活性的准确测定是有困难的。所以，为了克服这种技术上的困难，我们通过将额外的突变R275E导入现有的突变体中也构建了这两种突变酶的不可切割的形式。
野生型人t-PA、t-PA/R275E，以及所有含有位置417的突变的四个变体都以COS1细胞的瞬时表达来表达。由于这种方法产生的主要是单链的酶，所以纤溶酶-琼脂糖(Strandberg，L.，和Madison，E.L.(1995)J.Biol.Chem.270，23444-23449)处理该酶制剂来产生双链t-PA。以SDS-PAGE确定这种酶到其成熟双链形式的定量转换。如所期望的，合成含有R275E突变的变体，并且全部以单链酶分泌，而且不被纤溶酶-琼脂糖所切割。
下表I中列出了该单链和双链形式的野生型人t-PA和每个变体对小的合成底物的酶活性。组氨酸417的突变对双链酶的活性仅有非常小的影响。在此实验中，双链t-PA/H417D和t-PA/H417E分别展示了双链野生型人t-PA的67％和80％的活性。但是H417D和H417E突变对单链酶的活性却有更显著的影响。与单链t-PA/R275E相比，单链t-PA/R275E，H417D(SEQ IDNO：1)和t-PA/R275E，H417E(SEQ ID NO：2)分别表现出了单链t-PA/R275E活性的16％或25％。
                                 表1
    显色底物Spectrozyme t-PA被单链和双链t-PA变体切割的动力学常数
酶   Kcat(S-1)     Km(mM)   Kcat/Km(M-1S-1)
双链形式
t-PA     59     0.4      1.5×105
t-PA/H417D     41     0.4      1.0×105
t-PA/H417E     58     0.5      1.2×105
单链形式
t-PA/R275E     26     0.7      3.7×104
t-PA/R275E，H417D     5.9     1.0      5.9×103
t-PA/R275E，H417E     12     1.3      9.2×103
所分析的所有变体保持了对天然底物纤溶酶原在有辅剂血纤蛋白存在下(下面表II)的高的酶活性。双链形式的野生型人t-PA，t-PA/H417D，和t-PA/H417E的催化活性，其差异性的倍数仅为1.4。类似地，单链形式的t-PA/R275E，t-PA/R275E，H417D，以及t-PA/R275E，H417E活性的差异的倍数小于1.8。
                                  表2
     纤溶酶原在血纤蛋白存在下被单链和双链t-PA变体活化的动力学常数
酶   Kcat(S-1)    Km(μM)    Kcat/Km(M-1S-1)
双链形式
t-PA      0.11     0.017       6.5×106
t-PA/H417D      0.11     0.024       4.6×106
t-PA/H417E      0.10     0.022       4.5×106
单链形式
t-PA/R275E      0.16     0.017       9.4×106
t-PA/R275E，H417D      0.23     0.043       5.3×106
t-PA/R275E，H417E      0.17     0.028       6.1×106
在辅剂不存在时，位置417上的突变对双链t-PA对纤溶酶原的活性几乎没有效应；但是，这些突变明显减少了单链t-PA(下面的表III)的催化效率。与单链t-PA/R275E相比，t-PA/R275E，H417D和t-PA/R275E，H417E的活性被减小的倍数大约分别是14和6。在此实验中，“酶原性”或双链形式与单链形式的特定的酶的活性的比率约是野生型t-PA的活性的大约9倍。与此相对照，含有H417D或H417E突变的变体，这个比率分别约增加到了150或50(表III)。
                           表III纤溶酶原在没有辅剂存在情况下被单链和双链t-PA变体活化的动力学常数
酶    Kcat(S-1)   Km(μM)    Kcat/Km(M-1S-1)
双链形式
t-PA      0.093     6.7        1.4×104
t-PA/H417D      0.110     6.8        1.6×104
t-PA/H417E      0.099     8.7        1.1×104
单链形式
t-PA/R275E      0.014     9.5        1.5×103
t-PA/R275E，H417D      0.001     9.4        1.1×102
t-PA/R275E，H417E      0.002     8.5        2.4×102
t-PA由血纤蛋白的刺激的分子细节，一个几乎肯定涉及两种蛋白之间的多点接触的复杂过程，仍然是未知的。但血纤蛋白对双链t-PA的刺激可能通过单个机制而产生；可是单链t-PA被血纤蛋白辅剂的刺激似乎利用了至少两种截然不同的机制。首先，血纤蛋白显然通过模板机制同时刺激单链和双链t-PA从而形成了一个极大地增加酶和底物的局部浓度的三元复合体的形成。其次，由于单链和双链t-PA在有血纤蛋白存在下具有相等的活性，而在血纤蛋白不存在下则不然，看起来似乎对血纤蛋白的结合诱导了单链t-PA的活化结构域的构象变化。以前曾经描述过在结合到链激酶时纤溶酶原的类似的活化，以及结合到葡萄球菌凝固酶上的凝血酶原的活化。虽然丝氨蛋白酶原的这种不一般的非蛋白酶解的活化的机制仍然是完全不清楚的，但单链t-PA/R275E，H417D和t-PA/R275E，H417E的行为表明His417在此过程中并不起重要作用。而且，双链t-PA/H417D和t-PA/H417E的特性也表明His 417在t-PA的通过经典的蛋白酶解机制的酶原活化中也不起到重要的作用。
H417D和H417E突变的基本效应是在不存在血纤蛋白时单链t-PA活性的选择性减小，从而酶的酶原性得以增加。在分子水平上，这种效应可以通过单链t-PA的一个更惰性的新构象的稳定或通过一个或多个具有各自特性的现有构象向更惰性的构象的之间平衡的转换来介导。在不固守于唯一的假设的情况下，根据胰蛋白酶原、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶的结构研究发现活性结构域的多种构象之间平衡的存在似乎是胰凝乳蛋白酶原家族的酶原的一个基本特征。
据信通过将His 417转化为酸性残基所产生的效应是通过破坏Asp 477和Lys 429之间的重要的盐桥并提供一个可替代的对Lys 429的静电互作而介导的。在双链t-PA的蛋白酶结构域的最近所报道的结构中所发现的K429和E417之间的静电互作给这种假设提供了可信度，虽然在此研究中的单位细胞的两个成员中其距离和几何结构有一定程度的差异。而且，如同在本研究中所看到的，Lys 429和Asp/Glu 417之间的新的盐桥的形成将期望可选择性地抑制单链t-PA的活性，这是因为在双链酶中Lys 429并不与Asp477互相作用。与此相反，在双链t-PA中，如在其它成熟的类胰凝乳蛋白酶的酶类一样，插入到活化口性中的成熟的氨基末端起到了这个作用。因此，如同所看到的，双链t-PA/H417D和t-PA/H417E被期望保持高催化活性。因此在位置417含有酸性残基的t-PA变体表现出了显著增加的酶原性。
                  表IV
血纤蛋白对t-PA变体的催化效率的刺激效应
酶   Kcat/Km的刺激系数
双链形式
t-PA       460
t-PA/H417D       290
t-PA/H417E       410
单链形式
t-PA/R275E       6300
t-PA/R275E，H417D       48,200
t-PA/R275E，H417E       25,400
在此研究中所分析的单链形式的突变的酶所表现的血纤蛋白刺激的程度明显大于野生型t-PA所表现出的程度。野生型双链t-PA所具有的被确定为在有和无血纤蛋白存在下催化效率的比率的血纤蛋白刺激因子约为460(上面的表IV)。双链的变体表现出了相似的刺激因子，为290(t-PA/H417D)和410(t-PA/H417E)。单链野生型t-PA，其血纤蛋白刺激因子为6300，与双链酶相比，其被刺激到了一个非常高的程度，可信地反映了血纤蛋白在刺激单链酶时的能力不仅仅是通过模板机制而且还通过诱导非蛋白酶解的酶原活化进行。单链t-PA的刺激进一步被H417D或H417E突变所增加。血纤蛋白对单链t-PA/R275E，H417D和t-PA/H417E的刺激因子分别是48,200和25,400(上述的表IV)。这些变体的增加的血纤蛋白刺激并非是由于在血纤蛋白存在下活性增加所引起而是由于在没有刺激剂存在下活性的降低所引起，与此观点一致的事实是这些突变的效应是通过t-PA中Lys 429和Asp 477之间的盐桥的破坏介导的。
单链形式的酶原样t-PA变体被期望显示减少的活性，不仅对底物(表I和III，上文)，而且对特定的抑制剂。为了证明这点，我们通过测定丝氨酸蛋白酶抑制剂纤溶酶原活化剂I型(PAI-1)对单链t-PA/R275E，t-PA/R275E，H417D和t-PA/R275E，H417E的抑制的二级速率常数(下面的表V)。正如所期望的，两个含有位置417上突变的变体都呈现出对PAI-1的抑制的耐受性。与t-PA/R275E相比，t-PA/R275E，H417D或t-PA/R275E，H417E被PAI-1所抑制的二级速率常数分别被减少了约12或9倍。
                   表V
   野生型和变体t-PA被PAI-1的抑制
酶     二级速率常数
t-PA/R275E       1.8×106
t-PA/R275E，H417D       1.5×105
t-PA/R275E，H417E       2.1×105
作为单链酶，t-PA表现出了相当高的催化活性因此表现出了相当低的酶原性。与此相对照，作为单链酶，一个紧密相关的酶尿激酶(μ-PA)表现出了相当低的催化活性和更高的酶原性。此研究的一个重要发现是有利的静电互作在位置417和429上的残基之间的存在与否看起来是这两个人纤溶酶原活化剂之间的关键的功能区别的主要决定因素，野生型t-PA，μ-PA和在位置417上含有天冬氨酸的t-PA的酶原性约分别是9，250和150。
这些研究证明了t-PA的活化结构域内的结构/功能关系，并且阐明了t-PA和μ-PA之间的重要的功能区别的分子基础。这些结果也有助于设计改良的溶栓剂。例如t-PA/R275E，H417D，表现出了显著增加的血纤蛋白刺激，对PAI-1抑制的抗性，以及显著增加的酶原性，一种有用的特征的组合，其可以增加酶的治疗用途。实施例2
编码变体t-PA的表达载体的定点诱变和构建
根据实施例1的描述进行寡核苷酸定点特异性诱变。将K429Y突变导入290bp的预先已亚克隆至细菌噬菌体M13mP18中的编码t-PA的cDNA的SacI-SmaI片段中。突变的引物具有下述的核苷酸序列：
5′-CGGAGCGGCTGTATGAGGCTCATGT-3′(SEQ ID NO：10)
诱变之后，将相应于全长290bp SacI-SmaI片段的ssDNA进行完全测序以保证所需突变的出现以及任何额外的突变的不出现。相应于K429Y突变的290bp的SacI-SmaI片段的序列示于SEQ ID NO：7中。为合适的噬菌体制备复制型的(RF)DNA，并在用SaI和SmaI消化RF DNA化后和将消化产物在琼脂糖凝胶上电泳之后回收该290bp的SacI-SmaI片段。该分离的、突变SacI-SmaI片段被用来代替编码野生型t-PA或t-PA/R275E的全长cDNA中的相应片段以产生编码t-PA/K429Y和t-PA/R275E，K429Y的新的全长cDNA。通过COS细胞的瞬时转染表达酶
编码t-PA、t-PA/R275E，t-PA/K429Y和t-PA/R275E，K429Y的cDNA被连到瞬时表达载体pSVT7中然后通过实施例1所述用BioRadGene脉冲发生器的电穿孔导入COS细胞中。电穿孔之后，将细胞在含10％胎牛血清和5mM丁酸钠的DMEM中37℃温育过夜。然后以无血清培养基洗涤细胞并在DMEM中37℃温育48小时。与无血清培养基温育之后，收集条件培养基并以ELISA测定酶浓度。野生型和突变的t-PA变体的纯化
野生型和突变的t-PA的变体以FPLC系统和一个1ml的HiTrap螯合柱(pharmacia Biotech)纯化。柱以0.1M CuSO4溶液填充，以5-10ml蒸馏水洗涤，并以起始缓冲液(0.02M NaHPO4，pH7.2，1M NaCl和1mM咪唑)平衡。含有野生型或变体t-PA的条件培养基被调至1M NaCl并被注射到带50ml超级环(superloop)的柱(pharmacia Biotech)中。该柱然后以10柱体积的起始缓冲液洗涤并用相同缓冲液中的0-0.32M线性梯度的咪唑洗脱。收集并合并峰馏分。使用Centriplus 30浓缩器(Amicon)浓缩纯化的t-PA样品，并将缓冲液交换为25mM Tris(pH＝7.5)，50mM NaCl，1mM EDTA。使用小的合成底物的t-PA活性的动力学分析
如实施例1所述使用底物甲磺酰基-D-环己基酪氨酰-甘氨酰-精氨酸-对硝基苯胺(Spectrozyme t-PA，American Diagnostica)进行直接显色分析。用间接显色分析的纤溶酶原活化的动力学分析
如实施例1所述使用底物赖氨酸-纤溶酶原(American Diagnostica)和Spectrozyme PL(American Diagnostica)进行t-PA的间接显色分析。实验在有和没有辅剂PESAFIB(American Diagnostica)存在下都进行了。在各种血纤蛋白辅剂存在下的间接显色分析
进行了标准间接显色实验。简而言之，在100μl体积中有0.25-1ng的酶；0.2μM赖氨酸-纤溶酶原和0.62mM Spectrozyme PL。实验在存在缓冲液，25μg/ml DESAFIB，100μg/ml纤溶酶原；100μg/ml纤溶酶的溴化氢片段(American Diagnostica)，或100μg/ml受激13氨基酸肽P368。P368由Marshall Runge(University of Texas Medical Centre，Galveston，TX)惠赠。分析在微滴定板中进行，在Molecular Devices Thermomax上1小时内每30秒测定405nm的光学密度。反应在37℃下进行。PAI-1抑制的二级速率常数的测定
如实施例1所述在拟一级条件下测定对野生型和突变t-PA的抑制的二级速率常数。
寡核苷酸定点特异性突变被用于产生一个选择性地抑制单链t-PA的催化活性的t-PA的L429突变。赖氨酸429被酪氨酸残基取代产生了t-PA/K429Y。而且，为了能够精确地测定对这种变体的单链形式的纤溶酶原的酶活性，通过将其它的突变R275E导入到现存的突变体中以产生R275E，K429Y变体构建了不可切割的形式的突变酶。
如实施例1所述通过COS 1细胞的瞬时表达来表达野生型t-PA，t-PA/R275E，t-PA/K429Y和t-PA/R275E，K429Y。由于此程序产生的主要是单链酶，通过以纤溶酶-琼脂糖凝胶处理酶制剂来产生双链t-PA。通过SDS-PAGE验证酶定量转变为其成熟的双链形式，所前面所证明的，含R275E的突变的变体只以单链酶的形式合成和分泌并且不被纤溶酶-琼脂糖凝胶所切割。
                          表4
 显色底物Spectrozyme t-PA被单链和双链t-PA变体的切割的动力学常数
酶     Kcat(S-1)     Km(mM)     Kcat/Km(M-1S-1)
双链形式
t-PA     40     0.5        8.0×104
t-PA/K429Y     35     0.5        7.0×104
单链形式
t-PA/R275E     24     0.7        3.4×104
t-PA/R275E，K429Y     0.3     0.5        6.0×102
单链和双链形式的野生型和t-PA对小的合成底物的酶活性列于上面的表VI中。赖氨酸429的突变对双链t-PA的活性几乎没有影响。在此实验中，双链t-PA/K429Y表现出了约90％的双链野生型酶的活性。与之相对照，K429Y突变对单链t-PA的活性具有非常显著的效应。单链t-PA/R275E，K429Y表现出了约2％的单链t-PA/R285E的活性。在此实验中，定义为某特定酶的双链的活性与单链的活性的比率的酶原性约是野生型t-PA的2.5倍。与此相对照，对含有K429Y突变的变体而言，此比率增加到了约117(表VI)。
在没有辅剂时，K429Y突变在双链t-PA对纤溶酶原的活性上几乎没有效应；但是这种突变非常显著地减少了单链t-PA(下面的表VII)的催化效率)。与单链t-PA/R275E相比，单链t-PA/R275E，K429Y的活性被减少了17倍。与此相对照，双链t-PA和t-PA/K429Y活性仅差1.2倍。
                             表VII
 辅因子不存在时纤溶酶原被单链和双链t-PA变体活化的动力学常数
酶     Kcat(S-1)     Km(μM)     Kcat/Km(M-1S-1)
双链形式
t-PA     0.16     10     1.6×104
t-PA/K429Y     0.18     14     1.3×104
单链形式
t-PA/R275E    [0.038]    [30]     1.3×103
t-PA/R275E，K429Y    0.00046     5.9     7.8×101
在本研究中分析的所有变体在辅因子血纤蛋白存在下对天然底物纤溶酶原保持了相当高的酶活性(下面的表VII)。但是含有K429Y的单链形式的变体被影响的程度稍大于相应的成熟的双链形式的酶。双链t-PA/K429Y具有的活性约是双链t-PA的活性的75％而单链t-PA/R275E，K429Y所显示的活性约是单链t-PA/R275E的活性的40％。
                          表VIII血纤蛋白存在下纤溶酶原被单链和双链t-PA变体活化的动力学常数
酶     Kcat(S-1)     Km(μM)   Kcat/Km(M-1S-1)
双链形式
t-PA     0.08     0.02   4.0×106
t-PA/K429Y     0.08     0.03   3.0×106
单链形式
t-PA/R275E     0.10     0.02   5.0×106
t-PA/R275E，K429Y     0.10     0.07   2.0×106
单链形式的t-PA/R275E，K429Y被血纤蛋白所刺激的程度显著地高于野生型t-PA被刺激的程度。野生型双链t-PA所具有的被定义为在血纤蛋白存在下和不存在下的催化效率的比率的血纤蛋白刺激倍数约为250(下面的表IX)。双链t-PA/K429Y变体显示出了相似的刺激倍数为230。单链野生型t-PA具有的血纤蛋白刺激倍数为3800，其被刺激到了一个比双链酶程度高得多的程度，可能反应了血纤蛋白刺激单链酶的能力不仅仅是通过模板机制而且还诱导非蛋白酶解的酶原活化。单链t-PA的刺激进一步被K429Y突变所增强。单链t-PA/R275E，K429Y的血纤蛋白刺激倍数约为26,000。变体的增加了的血纤蛋白刺激并非由于血纤蛋白存在下活性的增加而且由于刺激剂不存在时活性的降低而引起的，此事实与我们的假设的这些突变的效应是由于单链t-PA中Lys 429和Asp 477之间的盐桥的破坏所介导是一致的。
                  表IX
  血纤蛋白对t-PA变体的催化效率的刺激效应
酶     Kcat/Km的受激因子
双链形式
t-PA     250
t-PA/K429Y     230
单链形式
t-PA/R275E     3800
t-PA/R275E，K429Y     26,000
突变的酶t-PA/R275E，K429Y被可溶性血纤蛋白刺激的程度不仅远高于t-PA(上面的表IX)，而且在区分血纤蛋白辅因子时也远高于野生型的酶(图2)。双链形式的野生型t-PA和t-PA/K429Y都非常强地被可溶性血纤蛋白单体(DESAFIB)，血纤蛋白原、血纤蛋白原的CNBr片段、以及一个13个氨基酸的肽(P368)所刺激。另一方面，单链t-PA/R275E被可溶性血纤蛋白和血纤蛋白原强烈刺激，被CNBr片段和肽P368中度刺激。与这些酶形成鲜明对比的是，单链t-PA/R275E，K429Y虽然可被血纤蛋白单体强烈刺激，但对血纤蛋白原、血纤蛋白原的CNBr片段，肽P368实际上是无反应的。
在有血纤蛋白存在下纤溶酶原激活剂的比活性与在血纤蛋白原存在下纤溶酶原的比活性的比率，或“血纤蛋白选择性因子”是酶在体内所要表现出的“血块选择性”的一个指标。具有增加的血纤蛋白选择性的酶可以有效地完成栓溶而表现出降低的全身性活性。在本申请所报道的实验条件下，血纤蛋白选择性对双链t-PA而言是1.5，对双链t-PA/K429Y而言是1.5，对单链t-PA/R275E而言是1.0。但是对单链t-PA/R275E，K429Y是146。因此，这种双突变体在双血纤蛋白和血纤蛋白原间的差别约比单链或双链野生型t-PA的高约两个数量级。
期望t-PA的单链形式的酶原样变体不仅可展示出对底物(上文的表VI和VIII)而且对特定抑制剂都有降低的活性。单链形式的t-PA/R275E和t-PA/R275E，K429Y被t-PA的主要生理学抑制剂-1型丝氨酸蛋白酶抑制剂纤溶酶原活化剂抑制剂，1型(PAI-1)所抑制的二级速率常数示于下面的表X。如所期望的，t-PA/R275E，K429Y表现出了对PAI-1抑制的抗性。该二级与t-PA/R275E进行了比较。
                     表X
        野生型和t-PA变体被PAI-1的抑制
    酶     二级速率常数(M-1S-1)
    t-PA/R275E     1.8×106
    t-PA/R275E，K429Y     7.7×103
本研究的一个重要发现是赖氨酸429到酪氨酸残基的转变选择性地抑制了单链t-PA的活性，从而显著地增加了该酶的酶原性。此外，我们还证明了单链t-PA/R275E，K429Y被血纤蛋白所刺激的程度以及对血纤蛋白的选择性都要显著高于单或双链的野生型t-PA。单链t-PA/R275E，K429Y也表现出了对被PAI-1的抑制的显著的抗性。据信这种突变的效应是被据预测存在于单链但不存在于双链t-PA中的Lys 429和Asp 477之间所形成的关键的盐桥的破坏所介导的。据信这种假定的盐桥的主要作用是稳定单链t-PA的活化构象。因此双链t-PA/K429Y就如本研究中所证明的一样可期望保持高度的酶活性。
这些结果有助于设计改进了栓溶的药剂。例如，t-PA/R275E，K429Y表现出了显著的增加了的血纤蛋白刺激性，极强地增加了在血纤蛋白辅剂中的区别，对被PAI-1的抑制的显著的抗性，以及极大地增加了的酶原性，这些特征的结合增加了该酶的治疗用途。
上文意在描述本发明，而并非限制(本发明)。在不偏离本发明的实质精神和范围的情况下可以对本发明进行各种改变和修改。
                        序列表(1)基本信息：
(i)申请人：Madison，Edwin L
(ii)发明题目：具酶原特性的组织型纤溶酶原活化剂(t-PA)变体、组合
       物及使用方法
(iii)序列数：1
(iv)通信地址：
     (A)收信人：McDonnell Boehnen Hulbert & Berghoff
     (B)街道：300 South Wacker Drive，32nd Floor
     (C)城市：Chicago
     (D)州：IL
     (E)国家：USA
     (F)编码：60606
(v)计算机可读形式：
     (A)介质类型：软盘
     (B)计算机：IBM PC兼容
     (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
     (D)软件：PatentIn Release #1.0，版本#1.30
(vi)当前申请资料：
     (A)申请号：
     (B)申请日：
     (C)分类：
(viii)律师/代理人信息：
     (A)姓名：Zimmerman，Roger p
     (B)登记号：37,670
     (C)参考/案卷号：97,707
(ix)电讯信息：
     (A)电话：312-913-0001
     (B)传真：312-913-0002(2)SEQ ID NO：1信息
(i)序列特征：
 (A)长度：527氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：不相关
 (D)拓扑学：不相关(ii)分子类型：肽(iii)假拟结构：无(iv)反义：无(Vi)来源：
 (A)生物：Homo sapiens(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln1               5                   10                  15Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu
        20                  25                  30Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val
    35                  40                  45Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln
50                  55                  60Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala65                  70                  75                  80Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln
            85                  90                  95Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu
        100                 105                 110Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly
    115                 120                 125Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys
130                 135                 140Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala145                 150                 155                 160Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly
            165                 170                 175Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His
        180                 185                 190Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile
    195                 200                 205Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu
210                 215                 220Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys225                 230                 235                 240Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys
            245                 250                 255Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro
        260                 265                 270Gln Phe Glu Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro
    275                 280                 285Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg
290                 295                 300Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala305                 310                 315                 320Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile
            325                 330                 335Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe
        340                 345                 350Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr
    355                 360                 365Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys
370                 375                 380Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp385                 390                 395                 400Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys
            405                 410                 415Asp Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His
        420                 425                 430Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn
    435                 440                 445Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly
450                 455                 460Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly465                 470                 475                 480Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile
            485                 490                 495Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr
        500                 505                 510Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
    515                 520                 5252)SEQ ID NO：2信息
(i)序列特征：
 (A)长度：527氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：不相关
 (D)拓扑学：不相关(ii)分子类型：肽(iii)假拟结构：无(iv)反义：无(vi)来源：
(A)生物：Homo sapiens(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln1               5                   10                  15Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu
        20                  25                  30Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val
    35                  40                  45Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln
50                  55                  60Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala65                  70                  75                  80Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln
            85                  90                  95Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu
        100                 105                 110Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly
    115                 120                 125Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys
130                 135                 140Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala145                 150                 155                 160Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly
            165                 170                 175Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His
        180                 185                 190Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile
    195                 200                 205Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu
210                 215                 220Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys225                 230                 235                 240Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys
            245                 250                 255Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro
        260                 265                 270Gln Phe Glu Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro
    275                 280                 285Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg
290                 295                 300Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala305                 310                 315                 320Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile
            325                 330                 335Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe
        340                 345                 350Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr
    355                 360                 365Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys
370                 375                 380Ala Gln Glu Ser Sar Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp385                 390                 395                 400Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys
            405                 410                 415Glu Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His
        420                 425                 430Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn
    435                 440                 445Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Tar Arg Ser Gly
450                 455                 460Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly465                 470                 475                 480Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile
            485                 490                 495Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr
        500                 505                 510Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
    515                 520                 5252)SEQ ID NO：3信息(i)序列特征：
   (A)长度：527氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：不相关
   (D)拓扑学：不相关(ii)分子类型：肽(iii)假拟结构：无(iv)反义：无(vi)来源：
   (A)生物：Homo sapiens(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln1               5                   10                  15Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu
        20                  25                  30Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val
    35                  40                  45Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln
50                  55                  60Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala65                  70                  75                  80Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln
            85                  90                  95Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu
        100                 105                 110Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly
    115                 120                 125Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asp His Asn Tyr Cys
130                 135                 140Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala145                 150                 155                 160Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly
            165                 170                 175Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His
        180                 185                 190Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile
    195                 200                 205Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu
210                 215                 220Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys225                 230                 235                 240Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys
            245                 250                 255Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro
        260                 265                 270Gln Phe Glu Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro
    275                 280                 285Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg
290                 295                 300Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala305                 310                 315                 320Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile
            325                 330                 335Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe
        340                 345                 350Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr
    355                 360                 365Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys
370                 375                 380Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp385                 390                 395                 400Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys
            405                 410                 415His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Tyr Glu Ala His
        420                 425                 430Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn
     435                440                 445Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly
450                 455                 460Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly465                 470                 475                 480Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile
            485                 490                 495Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr
        500                 505                 510Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
    515                 520                 525(2)SEQ ID NO：4信息
(i)序列特征：
     (A)长度：290碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：不相关
     (D)拓扑学：不相关
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟结构：无
(iv)反义：无
(vi)来源：
     (A)生物：Homo sapiens
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：CTACGGCAAG  CATGAGGCCT  TGTCTCCTTT  CTATTCGGAG  CGGCTGAAGG  AGGCTCATGT        60CAGACTGTAC  CCATCCAGCC  GCTGCACATC  ACAACATTTA  CTTAACAGAA  CAGTCACCGA       120CAACATGCTG  TGTGCTGGAG  ACACTCGGAG  CGGCGGGCCC  CAGGCAAACT  TGCACGACGC       180CTGCCAGGGC  GATTCGGGAG  GCCCCCTGGT  GTGTCTGAAC  GATGGCCGCA  TGACTTTGGT       240GGGCATCATC  AGCTGGGGCC  TGGGCTGTGG  ACAGAAGGAT  GTCCCGGGTG                   290(2)SEQ ID NO：5信息
(i)序列特征：
     (A)长度：290碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：不相关
     (D)拓扑学：不相关
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟结构：无
(iv)反义：无
(vi)来源：
     (A)生物：Homo sapiens(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CTACGGCAAG  GACGAGGCCT  TGTCTCCTTT  CTATTCGGAG  CGGCTGAAGG  AGGCTCATGT      60CAGACTGTAC  CCATCCAGCC  GCTGCACATC  ACAACATTTA  CTTAACAGAA  CAGTCACCGA     120CAACATGCTG  TGTGCTGGAG  ACACTCGGAG  CGGCGGGCCC  CAGGCAAACT  TGCACGACGC     180CTGCCAGGGC  GATTCGGGAG  GCCCCCTGGT  GTGTCTGAAC  GATGGCCGCA  TGACTTTGGT     240GGGCATCATC  AGCTGGGGCC  TGGGCTGTGG  ACAGAAGGAT  GTCCCGGGTG                 290(2)SEQ ID NO：6信息
(i)序列特征：
     (A)长度：290碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：不相关
     (D)拓扑学：不相关
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟结构：无
(iv)反义：无
(vi)来源：
     (A)生物：Homo sapiens
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：CTACGGCAAG GAGGAGGCCT TGTCTCCTTT CTATTCGGAG CGGCTGAAGG AGGCTCATGT       60CAGACTGTAC CCATCCAGCC GCTGCACATC ACAACATTTA CTTAACAGAA CAGTCACCGA      120CAACATGCTG TGTGCTGGAG ACACTCGGAG CGGCGGGCCC CAGGCAAACT TGCACGACGC      180CTGCCAGGGC GATTCGGGAG GCCCCCTGGT GTGTCTGAAC GATGGCCGCA TGACTTTGGT      240GGGCATCATC AGCTGGGGCC TGGGCTGTGG ACAGAAGGAT GTCCCGGGTG                 290(2)SEQ ID NO：7信息
(i)序列特征：
     (A)长度：290碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：不相关
     (D)拓扑学：不相关(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟结构：无(iv)反义：无(vi)来源：
 (A)生物：Homo sapiens(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：CTACGGCAAG  CATGAGGCCT  TGTCTCCTTT  CTATTCGGAG  CGGCTGTATG  AGGCTCATGT        60CAGACTGTAC  CCATCCAGCC  GCTGCACATC  ACAACATTTA  CTTAACAGAA  CAGTCACCGA       120CAACATGCTG  TGTGCTGGAG  ACACTCGGAG  CGGCGGGCCC  CAGGCAAACT  TGCACGACGC       180CTGCCAGGGC  GATTCGGGAG  GCCCCCTGGT  GTGTCTGAAC  GATGGCCGCA  TGACTTTGGT       240GGGCATCATC  AGCTGGGGCC  TGGGCTGTGG  ACAGAAGGAT  GTCCCGGGTG                   290(2)SEQ ID NO：8信息
(i)序列特征：
     (A)长度：23碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：不相关
     (D)拓扑学：不相关
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟结构：无
(iv)反义：无
(vi)来源：
     (A)生物：Homo sapiens
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
CTACGGCAAG GACGAGGCCT TGT(2)SEQ ID NO：9信息
(i)序列特征：
     (A)长度：23碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：不相关
      (D)拓扑学：不相关
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟结构：无
(iv)反义：无
(vi)来源：
     (A)生物：Homo sapiens
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
CTACGGCAAG GAGGAGGCCT TGT(2)SEQ ID NO：10信息
(i)序列特征：
     (A)长度：25碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：不相关
     (D)拓扑学：不相关
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟结构：无
(iv)反义：无
(vi)来源：
     (A)生物：Homo sapiens
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
CGGAGCGGCT GTATGAGGCT MCATGT

Claims (31)

1.具有R275并且在丝氨酸蛋白酶区至少有一个其它氨基酸残基被非碱性氨基酸残基取代从而破坏了天冬氨酸477和赖氨酸429之间的盐桥相互作用的变体单链人组织型纤溶酶原活化剂蛋白质。
2.权利要求1的蛋白质，其中非碱性氨基酸残基选自含有甘氨酸丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的组中并且所具有的酶原性至少为10。
3.权利要求1的蛋白质，具有酶原性至少为50。
4.权利要求1的蛋白质，具有酶原性至少为100。
5.权利要求1的蛋白质，具有血纤蛋白刺激倍数至少为10,000。
6.权利要求1的蛋白质，具有血纤蛋白刺激倍数至少为20,000。
7.权利要求1的蛋白质，具有血纤蛋白刺激倍数至少为10,000。
8.权利要求2的蛋白质，具有血纤蛋白刺激倍数至少为20,000。
9.权利要求3的蛋白质，具有血纤蛋白刺激倍数至少为20,000。
10.权利要求1的蛋白质，其中与野生型单链人组织型纤溶酶原活化剂蛋白相比，其被PAI-1抑制至少要少5倍。
11.权利要求1的蛋白质，其中与野生型单链人组织型纤溶酶原活化剂蛋白相比，其被PAI-1抑制至少要少9倍。
12.权利要求1的蛋白质，其中与野生型单链人组织型纤溶酶原活化剂蛋白相比，其被PAI-1抑制至少要少200倍。
13.权利要求8的蛋白质，其中与野生型单链人组织型纤溶酶原活化剂蛋白相比，其被PAI-1抑制至少要少9倍。
14.权利要求8的蛋白质，其中与野生型单链人组织型纤溶酶原活化剂蛋白相比，其被PAI-1抑制至少要少200倍。
15.权利要求1的蛋白质，其具有的血纤蛋白选择性倍数至少为100。
16.权利要求8的蛋白质，其具有的血纤蛋白选择性倍数至少为100。
17.权利要求14的蛋白质，其具有的血纤蛋白选择性倍数至少为100。
18.编码权利要求1的蛋白质的多聚核苷酸。
19.含有权利要求18的多聚核苷酸的表达载体。
20.含有权利要求19的表达载体的细胞。
21.选自R275E，H417D，R25E，H417E和R275E，K429Y的变体单链人组织型纤溶酶原活化剂蛋白质。
22.编码权利要求21的蛋白质的多聚核苷酸。
23.含有权利要求22的多聚核苷酸的表达载体
24.含有权利要求23的表达载体的细胞。
25.在可药用的适当的赋形剂中含有生理有效量的权利要求1的蛋白质的用于治疗血栓形成疾病的组合物。
26.权利要求25的组合物，其中蛋白质的剂量从约0.05毫克/千克体重到约0.2毫克每千克体重。
27.包含权利要求1的蛋白质的抗体的诊断试剂盒。
28.包含权利要求1的蛋白质的诊断试剂盒。
29.含有能与权利要求18的多核苷酸杂交的多核苷酸的诊断试剂盒。
30.制备变体单链人组织型纤溶酶原活化剂蛋白质的方法，包括将权利要求24的细胞进行培养的步骤。
31.权利要求30的方法，其进一步包括纯化该蛋白质的附加步骤。
CN97181346A 1996-11-12 1997-11-12 组织型纤溶酶原活化剂(t－PA)变体:组合物及使用方法 Pending CN1244894A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3065596P 1996-11-12 1996-11-12
US60/030,655 1996-11-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1244894A true CN1244894A (zh) 2000-02-16

Family

ID=21855292

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN97181346A Pending CN1244894A (zh) 1996-11-12 1997-11-12 组织型纤溶酶原活化剂(t－PA)变体:组合物及使用方法

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0950095A2 (zh)
JP (1) JP2001505765A (zh)
CN (1) CN1244894A (zh)
AU (1) AU735519B2 (zh)
CA (1) CA2271697C (zh)
WO (1) WO1998021320A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114736948A (zh) * 2022-06-10 2022-07-12 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999009184A1 (de) * 1997-08-13 1999-02-25 Roche Diagnostics Gmbh Plasminogenaktivator mit verbesserter zymogenität und verminderter fibrinbindung
EP2948167A4 (en) * 2013-01-22 2016-10-19 Univ Tennessee Res Foundation TISSUE CLASMINE ACTIVATOR ANTIBODIES AND METHOD OF USE THEREOF

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0199574B1 (en) * 1985-04-22 1991-10-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator mutants, methods and intermediates therefor, and compositions using such mutants
US5108901A (en) * 1988-09-02 1992-04-28 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114736948A (zh) * 2022-06-10 2022-07-12 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CA2271697A1 (en) 1998-05-22
JP2001505765A (ja) 2001-05-08
AU5585098A (en) 1998-06-03
AU735519B2 (en) 2001-07-12
CA2271697C (en) 2007-10-23
WO1998021320A2 (en) 1998-05-22
WO1998021320A3 (en) 1998-07-09
EP0950095A2 (en) 1999-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1103815C (zh) 凝血酶突变体
CN1630721A (zh) 人凝血因子vii变体
CN1133743C (zh) 修饰的凝血因子vii
CN1152962C (zh) 新型抗血管生成肽、其编码多核苷酸和抑制血管生成的方法
CA2129660C (en) Tissue plasminogen activator glycosylation variants with improved therapeutic properties
CN1131872C (zh) 修饰过的因子vii
CN1246462C (zh) 修饰的维生素k依赖性多肽
CN1148382C (zh) 组织蛋白酶o2蛋白酶
CN1602354A (zh) 人凝血因子ⅶ多肽
CN1768138A (zh) 在微生物中生产重组蛋白质的方法
CN1115412C (zh) 前尿激酶突变体
CN1139955A (zh) 新的人kunitz型抑制剂和其相关方法
CN1839203A (zh) 因子VII或VIIa的GLA结构域变体
JPS62104577A (ja) ポリクリングルプラスミノ−ゲン活性化因子
CN1433466A (zh) Masp－3,一种固定补体的酶,及其应用
CN1057124C (zh) 具改进纤溶特性和凝血酶抑制活性的双功能尿激酶变异体
CN1211280A (zh) 凝血酶突变蛋白质作为凝血酶抑制剂的解毒剂
CN1551917A (zh) 利用基因工程技术制备人凝血酶的方法
CN1244894A (zh) 组织型纤溶酶原活化剂(t－PA)变体:组合物及使用方法
CN1181099C (zh) 兼抗凝溶栓双重功能的血栓靶向融合蛋白mA5UKB
CN1035526A (zh) 表达人c蛋白酶原的载体和化合物
CN1829798A (zh) 蛋白酶、编码该蛋白酶的dna、蛋白酶的制备方法
US6869778B2 (en) Tissue type plasminogen activator (t-PA) variants: compositions and methods of use
CN1498223A (zh) 抗血管增生的多肽
CN1226926A (zh) 可凝血酶活化的血纤溶酶原激活物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication