CN1551917A - 利用基因工程技术制备人凝血酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基因重组人凝血酶。利用基因工程技术有效地制备人凝血酶，制备方法包括下列步骤：(1)培养转染体动物细胞，所述细胞用启动子下游整合有编码人前凝血酶基因的表达载体转染，使在培养上清液中产生和积累前凝血酶，并回收产生的人前凝血酶；(2)用伊卡因对包含步骤(1)中回收的人前凝血酶的溶液进行处理，将人前凝血酶转化成人凝血酶；和(3)对上述活化步骤之后获得的溶液进行纯化，获得纯化的人凝血酶。因为不使用来源于血液的组分，本发明能够以安全、经济的方式大量供应人凝血酶。

Description

利用基因工程技术制备人凝血酶的方法
发明领域
本发明属于医药领域，具体地说本发明涉及一种可用作止血剂的凝血酶。更具体地说，本发明涉及一种利用基因工程技术制备的基因重组凝血酶和制备该酶的方法。
背景技术
凝血酶是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，具有生命维持和发展所必需的活性，如止血性血栓的形成、伤口愈合等。凝血酶包括间凝血酶(meizothrombin)、α-凝血酶、β-凝血酶和γ-凝血酶。从生理学观点来说，其中α-凝血酶是最重要的一种。凝血酶的前体之一凝血酶原(prothrombin)，在肝细胞内以依赖于维生素K的方式合成，其在血液中的水平为100μg/ml～150μg/ml。一种维生素K依赖性的凝血因子在N-末端具有含Gla的区域(Gla域)，通过Ca2+离子结合在磷脂上。众所周知，一旦Gla域与Ca2+离子结合，整个蛋白的高级结构发生改变，与辅助因子相互作用，从而发挥关键作用。
凝血酶原的活化是通过细胞膜磷脂上的FXa-FVa复合物实现的。活化过程包括以限制性切割方式切割凝血酶原内的Arg320-Ile321键，形成含Gal域和Kringle域的间凝血酶。随后，以限制性切割方式切割Arg271-Thr272键形成α-凝血酶。α-凝血酶从细胞膜释放出来，通过限制性地切割多种血浆蛋白或细胞膜上的多种凝血酶受体表现出各种生理活性。α-凝血酶是由A链和B链组成的双链分子。当酶活性所必须的B链自我裂解时，可生成β-凝血酶或γ-凝血酶，从而失去激活血小板或纤维蛋白原的能力。
所形成的大部分凝血酶和纤维性血栓结合，参与局部更大血栓的形成。α-凝血酶不仅将纤维蛋白原转化成纤维蛋白，而且激活FXIII引发纤维蛋白的相互交联。另外，α-凝血酶可通过激活FVIII和FV而加速凝血，FVIII和FV分别是FIX和FXa引发凝血的辅助因子。因此，凝血酶在止血中起重要作用，是一种可用作止血剂的、非常有用的蛋白。
另一方面，与血管内皮细胞上的血栓调节蛋白结合后，凝血酶改变其底物专一性，从而激活C蛋白，启动抗凝血作用。因此，利用这种酶活性，凝血酶也可用作制备抗凝剂——活化C蛋白的加工酶。而且，α-凝血酶可强烈凝聚和活化血小板，还具有丝裂原活性。因为α-凝血酶具有这些不同的生理活性，它已作为一种试剂在各研究领域得以应用，预计在将来其应用程度仍会上升。
由于具有这些功能和活性，凝血酶已广泛用作止血剂、加工酶或研究用试剂。例如，在上消化道出血时，口服血液来源的凝血酶或利用内窥镜将其涂布于患处可成功止血。一种作为组织贴附剂的纤维膏也含有血液来源的凝血酶、纤维蛋白原和FXIII。
发明内容
然而，上述的凝血酶材料是从人血或牛血中分离的，因而也可能含有来源于血液、对人有不良反应的各种危险因子。人们担心凝血酶材料中存在有HAV、HBV、HCV、HEV或TTV之类引起肝炎的病毒、HIV之类引起免疫缺陷疾病的病毒或者引起CJD等的异常朊病毒。实际上，被这些危险因子污染的血液制品所导致的药物损害已成为一大社会问题。而且，由于人血或牛血来源于活体材料，就不能保证它可以稳定地供应。从药物的角度来说，这是一个非常重要、严峻、急待解决的问题。
依据传统的方法，用来源于血液的FXa激活凝血酶原(凝血酶前体)来制备凝血酶，即血液来源的FXa用于活化过程。这样，只要用血源来源的FXa作为活化酶，即使凝血酶前体是利用基因工程技术制备的，对血源组分污染的担心也不能被排除。要利用基因工程技术制备FXa，就必须利用基因工程技术制备其前体X，并用FIXa将其活化。而且，要利用基因工程技术制备FIXa，必须利用基因工程技术制备其前体IX，并用另一凝血因子将之活化。采用这种方式，如果凝血级联反应的最上游的酶不是利用基因工程技术制备的，就不能制备出不受血液组分污染的凝血酶。
考虑到使用血液作为制备凝血酶和活化酶原材料的危险和局限性，需要寻找替代来源和制备方法，以更安全、更稳定的方式供应人凝血酶。在此背景下，有报道利用微生物或动物细胞作为宿主来表达凝血酶。
然而，传统方法具有缺点，例如大肠杆菌中表达的凝血酶形成称为包含体的凝聚体，很难回收凝血酶。特别是溶解凝聚体并将之重新折叠成功能性蛋白的效率很低，因而不值得用于工业生产(J.Biol.Cherm.270，163-169，1995)。仓鼠培养细胞的表达系统的表达水平也低得可怜，因此并不实用(Protein exp.purif.，10，214-225，1997)。而且，在这些方法中，凝血酶以前体形式表达，必须用Fxa之类的活化酶加以活化，而FXa并非重组酶，因此不能排除血液组分的污染。综上所述，依据传统方法难以安全、经济地稳定地供应人凝血酶。
在这样的情况下，本发明人进行了解决上述问题的研究，并成功完成了本发明，提供了一种用于制备人凝血酶的安全而经济的方法。具体地说，本发明人构建了一些质粒，其中编码人凝血酶前体的基因或编码人凝血酶前体的活化酶的基因连接到强启动子(即β-肌动蛋白启动子)的下游，然后将该质粒掺入动物细胞以建立掺入各种基因的高表达系统，从而能够安全地大量供应凝血酶及其活化酶。这是传统方法至今仍无法达到的。本发明人将此法产生的凝血酶及其活化酶联用，已成功地大量供应具有安全性的活性凝血酶。
附图简述
图1.所示为凝血酶原-2各纯化步骤中所得级分的SDS-PAGE和蛋白染色结果，凝血酶原-2来自于可产生凝血酶原-2的SP2/0细胞的培养上清液。
图2.所示为凝胶过滤所得级分的SDS-PAGE和蛋白染色结果，在对产生伊卡因(ecarin)的SP2/0细胞的培养上清液进行伊卡因纯化中，凝胶过滤是最后一个步骤。
实施本发明的最佳方式
如上所述，凝血酶原由Gla域、Kringle域及丝氨酸蛋白结构域组成。其中Gla域和Kringle域发生翻译后修饰，这种翻译后修饰可能是蛋白质生成的限速步骤。另一方面，由A链和B链组成的α-凝血酶是发挥凝血酶生理活性的最小活性单位。从这些角度出发，选用编码前凝血酶(prethrombin)-2(以下亦称“前凝血酶”)的基因来表达，所述前凝血酶是由A-B链组成的单链蛋白。可以预见的是，使用编码前凝血酶的基因其转录和翻译效率要比使用编码凝血酶原的基因高，因为前凝血酶的mRNA比凝血酶原的mRNA小。
具体地说，利用从人肝脏分离的mRNA作为模板合成cDNA，然后用根据凝血酶原基因序列设计的引物进行PCR来扩增凝血酶原基因。使用这样扩增的凝血酶原基因，进一步扩增目标前凝血酶-2基因。可以无限制地使用任何一种动物细胞宿主的高表达载体，但是大部分优选实施方案包括一种改造的质粒载体，该载体是通过对本发明人所持有的、基于鸡β-肌动蛋白启动子的表达载体pCAGG(日本专利公开号NO.168087/1991)加以改进而获得的。将扩增得到的前凝血酶基因插入到该构建体中构建表达质粒。该质粒使用的前导序列包括从原始凝血酶原基因或其他基因获得的序列。将上述构建的表达质粒转染入动物细胞的结果是获得具有高表达水平的细胞，这样的细胞至今仍未见报道。可用作宿主细胞的动物细胞包括来源于仓鼠、小鼠或人的培养细胞，优选中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠骨髓瘤细胞、BHK21细胞、293细胞、COS细胞等。
此外，本发明人用具有与FXa相同酶活性的伊卡因替代至今为止一直用作凝血酶活化酶的FXa，并优选利用本发明高表达系统成功制备的重组伊卡因。
伊卡因是一种从锯鳞蝰( Echis Carinatus)分离的蛇毒来源蛋白酶(T.Morita等，J.Biochem.83，559-570，1978)，已知能特异性地激活凝血酶原。S.Nishida等(Biochemistry，34，1771-1778，1995)克隆了编码伊卡因的cDNA以揭示其结构。糖蛋白伊卡因是一种金属蛋白酶，成熟的伊卡因共有426个氨基酸残基，有一个包含螯合Zn2+的镶嵌结构、单链蛇毒多肽域和富含Cys域，与RVV-X(拉塞蝰蛇毒X激活子)的H链具有61％的同源性。伊卡因是一种与Xa因子截然不同的酶，因为它的酶活性可以被EDTA灭活，而不能被DFP或抗凝血酶III灭活。除伊卡因之外，还可使用具有与FXa相似酶活性的其他活化酶。
一旦伊卡因前体经蛋白酶如胰蛋白酶或纤溶酶活化，即表现出激活凝血酶的活性。这样，为了活化凝血酶，必须用胰蛋白酶等活化伊卡因前体。而依据本发明，可在重组伊卡因的纯化过程中同时活化伊卡因前体，并不使用胰蛋白酶等。
特别地说，和前凝血酶情况相似，通过PCR扩增编码伊卡因的基因并将之插入来源于基于鸡β-肌动蛋白的表达质粒pCAGG的表达载体，构建表达载体。转染有载体的动物细胞可以表达足够高水平的伊卡因。可用作宿主细胞的动物细胞与凝血酶情况相似，包括来源于仓鼠、小鼠或人的培养细胞。
得到的培养上清液经离子交换层析和凝胶过滤纯化后，伊卡因可作为活性蛋白得以分离，而不需使用诸如胰蛋白酶之类的活化酶。依据本发明人的设计，动物细胞中表达的伊卡因蛋白可同时得以纯化和活化。如果设计合理，除伊卡因之外，相同的技术和效果还适合于其他的活化酶。
这样获得的重组伊卡因用于活化前面所制备的底物——重组前凝血酶。得到的重组α-凝血酶可通过水蛭素肽亲和层析纯化至高纯度，水蛭素肽可特异性地与凝血酶反应，优选水蛭素肽固定柱层析。也可将各种层析法任意联用来纯化凝血酶。
与来源于血液的天然α-凝血酶相比，纯化的重组α-凝血酶表现出相似的特性，提示本发明人制备的重组α-凝血酶和天然α-凝血酶是相同的蛋白质。
如上所述，本发明人仅使用经基因工程技术制备的凝血酶和伊卡因蛋白前体，而不需要其他酶就成功地制备了具活性的人凝血酶。
下文提供的实施例对本发明作出更详细的阐述。从任何意义上说这些实例对本发明的范围都不构成任何限制。下列制备过程和实施例所使用的试剂从Pharmacia、BioRad、Wako Pure Chemical Industries有限公司、TAKARA SHUZO有限公司、Toyobo和New EnglandBiolabs获得。
实施例1
(表达质粒的构建)
(1)表达质粒pCAGG-S1(Sal)的构建
用限制性酶EcoRI消化基于鸡β-肌动蛋白启动子的表达质粒pCAGG(日本专利公开号NO.168087/1991)，T4 DNA聚合酶钝化末端，然后在磷酸化XhoI衔接物存在的条件下用T4 DNA连接酶连接末端，以此构建pCAGG(Xho)。所得pCAGG(Xho)用限制性酶SalI消化，T4 DNA聚合酶钝化末端，然后在磷酸化XhoI衔接物存在的条件下用T4 DNA连接酶连接末端，以此构建pCAGG-Pv2。所得pCAGG-Pv2用限制性酶EcoRI消化，然后用S1核酸酶切去pCAGG-Pv2识别位点旁数个核苷酸。经核酸酶处理后，在dNTPs存在的条件下用T4 DNA聚合酶对单链区进行修饰，然后在磷酸化SalI衔接物存在的条件下用T4 DNA连接酶连接末端，构建pCAGG-S1(Sal)。
(2)表达质粒pCAGG-S1(Sal).dhfr的构建
用限制性酶BglII消化含DHFR基因的表达质粒pSV2-dhfr(S.Subramani等，Mol.细胞.Biol.，1，p.854-864，1981)，T4 DNA聚合酶钝化末端，然后用T4 DNA连接酶连接，以此构建pSV2-dhfr-Bgn。所得pSV2-dhfr-Bgn用限制性酶PvuII消化，然后在磷酸化BglII衔接物存在的条件下用T4 DNA连接酶连接，以此构建pSV2-dhfr-BgB。所得pSV2-dhfr-BgB用限制性酶BglII和BamHI消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳获得一长约1.7kbp的片段。前面所得的pCAGG-S1(Sal)经限制性酶BamHI消化，然后与1.7kbp片段连接成环，构建pCAGG-S1(Sal).dhfr。
(3)表达质粒pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo的构建
用限制性酶XhoI消化基于氨基糖苷磷酸转移酶(neor)的表达质粒pMClneo-polyA(K.R.Thomas等，细胞，51，p.503-512，1987)，然后在磷酸化BamHI衔接物存在的条件下用T4 DNA连接酶连接，构建pMCleno-2B。所得pMCleno-2B用限制性酶BamHI消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳获得一长约1.1kbp的片段。前面所得的pCAGG-S1(Sal).dhfr经限制性酶BamHI消化，然后与约1.1kbp的片段连接成环，构建pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo。
(4)基于DHFR的改进表达质粒pSV2-mdhfr的构建
使用编码DHFR cDNA的表达载体pSV2-dhfr作为下述PCR的模板。引物1和引物2联用及引物3和引物4联用分别进行PCR的第一个循环。各引物的核苷酸序列如下所示：
引物1：  5’-AAAAGCTTGCCATCATGGTTCGACC[SEQ ID NO：1]
引物2：  5’-CGGAGGCCAAGGCCTGTCTCCGTTCTTGCCAATCCC[SEQ ID NO：2]
引物3：  5’-AACGGAGACAGGCCTTGGCCTCCGCTCAGGAACGAG[SEQ ID NO：3]
引物4：5’-GGGGATCCTGTTAGTCTTTCTTCTCGTAGAC[SEQ ID NO：4]
使用5ng模板、100pmol各引物、Pyrobest DNA聚合酶进行25个循环的扩增。按照酶厂家的使用说明进行PCR。扩增得到的DNA片段通过1％琼脂糖凝胶电泳加以纯化。引物1和引物2联用及引物3和引物4联用的扩增DNA片段各取20ng，并将之混合。以此为模板，用引物1和引物4进行PCR。各引物的核苷酸序列如下所述。该PCR引入核苷酸突变，使DHFR的第23个亮氨酸变成了精氨酸。扩增出来的DNA片段用限制性酶HindIII-BamHI消化，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，提取获得一长约0.6kbp的片段。将该片段与预先用限制性酶HindIII-BamHI消化的pUC19亚克隆质粒连接成环，构建pUC-mDHFR。测定该质粒的DNA序列以确认精确地引入了所需突变，而其他核苷酸序列不发生错误。质粒的序列一经确认即用限制性酶HindIII-BamHI消化，并进行1％琼脂糖凝胶电泳，提取得到一长约0.6kbp、编码引入有突变的DHFR基因的片段。上述的表达质粒pSV2-dhfr用限制性酶HindIII-BhlII消化，然后通过琼脂糖凝胶电泳提取约3kbp的DNA片段。将所得的DNA片段与编码突变DHFR的DNA片段连接成环，以构建pSV2-mdhfr。
(5)表达质粒pCAGG-S1(Sal).mdhfr的构建
表达质粒pSV2-mdhfr用限制性酶PvuII消化，然后在磷酸化BglII衔接物存在的条件下用T4 DNA连接酶连接，构建pSV2-mdhfr-BgB。该质粒用限制性酶BhlII-BamHI消化，然后通过琼脂糖凝胶电泳提取获得一长约1.7kbp、编码mDHFR表达盒的DNA片段。第(1)步制备的表达质粒pCAGGS1(Sal)用限制性酶BamHI消化，用T4 DNA连接酶将之与约1.7kbp的片段连接成环，构建pCAGG-S1(Sal).mdhfr。
实施例2
(人前凝血酶-2基因的制备)
以人肝mRNA(Sawaday-Technology生产)为模板，应用本技术领域中熟知的方法，以Oligo-dT作为引物并使用逆转录酶(T-引发的第一链试剂盒，Amersham Pharmacia生产)合成第一链cDNA。基于该cDNA，设计下述引物用于PCR。使用与凝血酶原N-端序列相对应的引物5’-ATGGCGCACGTCCGAGGCTTGCAGCTGCCT(PT1；SEQ ID NO：5)和与凝血酶原的C-端序列相对应的引物5’-CTACTCTCCAAACTGATCAATGACCTTCT(PT2；SEQ ID NO：6)。使用Pyrobest DNA聚合酶，按照酶厂家的使用说明进行PCR，基因扩增30个循环。下述的PCR也以类似方式进行。
利用上述制备的凝血酶原cDNA制备编码前凝血酶-2的基因。合成下述的引物，以凝血酶原cDNA为模板进行PCR。所用各引物的核苷酸序列如下：
引物1：5’-AAGAATTCGTCGACCACCATGGCGCACGTCCGAG[SEQ ID NO：7]
引物2：5’-TCTTCTCACTCTCTGGAGCAGCGACCG[SEQ ID NO：8]
引物3：5’-ACCGCCACAAGTGAGTAC [SEQ ID NO：9]
引物4：5’-AAGAATTCGTCGACCTACTCTCCAAACTG[SEQ IDNO：10]
引物1和引物2用于扩增编码凝血酶原前原引导(preproleader)区的DNA，其中该区包含一突变以便往起始密码子中引入Kozak共有序列，并在起始密码子上游引入限制性酶SalI和EcoRI识别位点。引物3和引物4用于扩增编码位于凝血酶原翻译区C-端的丝氨酸蛋白酶域的前凝血酶基因，其中在终止子的下游引入有限制性酶SalI和EcoRI的识别位点。进行PCR之前，用T4多聚核苷酸激酶对引物2和引物3处理，使其5’端磷酸化。用这些引物进行PCR来扩增感兴趣的基因。通过1％琼脂糖凝胶电泳提取扩增出来的片段。将编码前原引导区的基因和编码凝血酶原-2区的DNA以近似等量得加以混合，用T4 DNA连接酶将它们互相连接。以混合物为模板，用引物1和引物4进一步进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳从扩增产物中提取一长约1.1kbp的片段，即编码前原引导区DNA序列和编码凝血酶原-2区的DNA序列的连接产物。用限制性酶EcoRI消化该基因的N-端。用限制性酶SacI和PstI对亚克隆质粒pTZ18R加以消化，用Mung bean核酸酶钝化末端，然后用T4 DNA连接酶将之与编码前凝血酶的片段连接成环，构建pTZ.PT。利用本技术领域所熟知的方法测定所得质粒的DNA序列，确认编码前原引导区DNA序列和编码凝血酶原-2区DNA序列在同一框架内翻译。连接有前原引导区序列的前凝血酶基因以下称为“前凝血酶结构基因”(SEQ ID NO：11)。
实施例3
(人前凝血酶-2表达质粒的构建)
将前凝血酶结构基因插入到实施例1所述的质粒pCAGG-S1.dhfr.neo和pCAGG-S1(Sal).mhfr中。用限制性酶SalI消化质粒pCAGG-S1.dhfr.neo和pCAGG-S1(Sal).mhfr，然后用来源于牛小肠的碱性磷酸酶将之去磷酸化。用限制性酶SalI消化前面所得的质粒pTZ.PT，然后通过琼脂糖凝胶电泳提纯一长约1.1kbp、编码前凝血酶-2结构基因的片段。然后用T4 DNA连接酶将去磷酸化的质粒与编码前凝血酶-2结构基因的片段连接成环，构建pCAGG-S1.PT.dhfr.neo和pCAGG-S1.PT.mdhfr。
实施例4
(用动物细胞表达人前凝血酶)
使用实施例3所述的前凝血酶表达质粒转化CHO DG44细胞(G.Urlaub等，somatic细胞.Mol.Genet.，12，p.555-556 1986；以下称“CHO”)和SP2/0 Ag14细胞(M.Shulman等，Nature，16，P.269-270，1978；以下称“SP2/0”)。质粒pCAGG-S1.PT.dhfr.neo用于转化CHO细胞，而质粒pCAGG-S1.PT.mdhfr用于转化SP2/0细胞。使用改进的磷酸钙法(C.Chen等，Mol.Cell.Biol.，1，p.2745-2752，1987)转染CHO细胞，而SP2/0细胞的转染则使用电穿孔法。
转染中所用到的表达质粒预先用限制性酶PvuI消化成线形。
使用抗人凝血酶抗体，通过三明治ELISA法对前凝血酶加以定量。
(1)CHO细胞产生前凝血酶的绩效
如下所述，使用CHO细胞进行转染，并从转染体系中选择转染体(transfectant)。
转染前一天，将细胞铺到加有α-MEM培养基的10-cm培养皿中，使之密度为5×105细胞/皿。其中α-MEM培养基含核酸(GIBCO-BRL生产)，并添加有10％胎牛血清(FCS，GIBCO-BRL生产)。37℃培养过夜，将20μg/mL线形化达质粒pCAGG-S1.PT.dhfr.neo转染细胞。在3％CO2培养箱内于35℃培养过夜，用Dulbecco PBS(-)洗涤细胞，培养基换成不含核酸而添加有10％透析FCS和500μg/mL遗传霉素(GIBCO-BRL生产)的α-MEM培养基。为了选择转染体，细胞继续于37℃、5％CO2培养箱内培养，每3至4天换液一次，收集出现的转染体，并检测其产生前凝血酶的能力。
转染细胞以2×105细胞/mL的密度铺到不含核酸而添加有10％透析FCS的α-MEM培养基中，并培养过夜。第二天，培养基换成无血清的YMM培养基(不含核酸而富含氨基酸/维生素，并含有胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和亚硒酸钠的α-MEM培养基)。于37℃、5％CO2培养箱内培养7天至10天后，测定培养上清液中凝血酶的水平。结果检测到培养上清中含20μg/mL的前凝血酶。将细胞置于不含核酸而含有100nM氨甲蝶呤(MTX，Wako Pure Chemical Industries，Ltd生产)、10％透析FCS和500μg/mL遗传霉素的α-MEM培养基中培养约14天，期间每3-4天换液一次。然后，将细胞稀释、传代，培养基换成不含核酸而含有500nM MTX、10％透析FCS和500μg/mL遗传霉素的α-MEM培养基培养14天，进行基因扩增。收集所得细胞，通过有限稀释法将悬于同样培养基中的细胞以200μL/孔的量接种到96孔板中，使浓度为0.5细胞/孔，对细胞进行克隆。将各克隆以2×105细胞/mL密度接种至不含核酸而添加有10％透析FCS的α-MEM培养基中，培养过夜。第二天，培养基换成YMM培养基。于37℃、5％CO2培养箱内培养7至10天后，测定培养上清液中凝血酶的水平。在所获得的克隆中，克隆#10培养上清液中的前凝血酶-2含量为90μg/mL，而克隆#72则为110μg/mL。
(2)SP2/0细胞产生前凝血酶的绩效
如下所述，使用SP2/0细胞进行转染，并从转染体系中选择转染体。
SP2/0细胞用冷Dulbecco PBS(-)洗涤两次，将悬于0.8mLPBS(-)中的107细胞加入到电穿孔样品池(电极宽0.4cm，BIO-RAD生产)中。加入线形化的表达质粒(40μg)，并用吸管吹打混匀。使用GenePulser II(BIO-RAD生产)施加一次0.22kv、975μF脉冲。将样品池置冰上预冷10分钟后，用含核酸和10％胎牛血清(FCS)的α-MEM培养基将细胞悬液稀释至约5000细胞/50μL，以50μL/孔的量铺到5块96孔板中，在3％CO2培养箱内于35℃培养过夜。第二天，每孔加入不含核酸而含有10％透析FCS的培养基50μL，继续培养过夜。第二天，每孔加入不含核酸而含有10％透析FCS、100nM或200nM MTX的α-MEM培养基100μL。培养10天至14天后，分析各孔转染体产生前凝血酶的能力。将细胞以4×105细胞/mL的密度接种至不含核酸而含有2％透析FCS的α-MEM培养基中。培养24小时后，测定培养上清中前凝血酶-2的水平及细胞密度，以确定每细胞每小时产生前凝血酶的能力。结果发现各转染体表达前凝血酶的水平为2～10μg/天/106细胞。
从这些转染体中，选择具有表达高水平前凝血酶能力的转染体，用不含核酸而添加有10％透析FCS和1μM MTX的α-MEM培养基培养约14天。
用YMM培养基使所得MTX耐受细胞适应于无血清培养基。用含2％透析FCS的YMM培养基进行培养并确认其可以生长。然后将血清含量逐渐降到0.5％，进一步降到0.1％，继续培养。确认细胞增殖良好后，使用完全不含血清的YMM培养基培养。确认细胞可以生长，然后应用YMM培养基按上述方法测定其产生前凝血酶的能力。在所获得的转染体中，克隆#32产生前凝血酶的能力为15μg/天/106细胞。将克隆#32细胞接种在含有YMM培养基的培养皿中，使之密度为3×105细胞/mL。培养约7天后，测定培养上清中前凝血酶的水平。结果#32的培养上清液中表达约150μg/mL前凝血酶。
实施例5
(可产生前凝血酶的细胞的大规模培养)
按实施例4所述方法，使可产生前凝血酶的细胞#32适应于无血清培养基后，用旋转瓶进行悬浮培养。细胞增殖后，将250mL细胞以2×105细胞/mL的密度于250-mL旋转瓶(Techne生产)内用YMM培养基培养。将细胞以大于1×106细胞/mL的密度扩容至1-L旋转瓶。确认细胞可以生长后，将细胞扩容至5个1-L旋转瓶中。培养约7天，然后测定培养上清液中前凝血酶的水平，其值约为100μg/mL前凝血酶-2。
实施例6
(蛇毒素伊卡因cDNA的制备)
以文献(S.Nishida等，Biochemistry，34，1771-1778)报道的伊卡因cDAN核苷酸序列为模板进行PCR，在伊卡因cDAN两端引入限制性酶XhoI的识别位点。所得基因用限制性酶XhoI消化，然后亚克隆至pUC18，构建pUC.EC。利用传统方法测定所得质粒伊卡因cDNA区的核苷酸序列，获得起始密码子至终止子间序列(SEQ IDNO：12)与文献报道序列完全相同的伊卡因cDNA。
实施例7
(伊卡因表达质粒的构建)
将伊卡因cDNA插入实施例1所述的质粒pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo。用限制性酶SalI消化质粒pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo，然后用来源于牛小肠碱性磷酸酶将之去磷酸化。用限制性酶XhoI消化前面所得的质粒pUC.EC，然后通过脂糖凝胶电泳提纯一长约1.8kbp、编码伊卡因cDNA的片段。用T4 DNA连接酶将去磷酸化的质粒与编码伊卡因  cDNA的片段连接成环，构建pCAGG-S1.EC.dhfr.neo。
实施例8
(利用动物细胞表达伊卡因)
用实施例7中所述伊卡因表达质粒pCAGG-S1.EC.dhfr.neo转化CHO细胞和SP2/0细胞。使用商品化的蛇毒素伊卡因(Sigma生产)作为标准品，根据伊卡因将凝血酶原转化成凝血酶的活性对伊卡因加以定量。伊卡因的表达水平以活性单位(U/mL)表示。
(1)CHO细胞产生伊卡因的绩效
如下所述，使用CHO细胞进行转染，并从转染体系中选择转染体。
转染前一天，将细胞铺到加有MEM培养基的10-cm培养皿中，使之密度为5×105细胞/皿。其中MEM培养基含核酸，并添加有10％胎牛血清。37℃培养过夜，使用20μg/mL线形化表达质粒pCAGG-S1.EC.dhfr.neo转染细胞。在3％CO2培养箱内于35℃培养过夜，用Dulbecco PBS(-)洗涤细胞，培养基换成不含核酸而含有10％透析FCS和500μg/mL遗传霉素的α-MEM培养基。为了选择转染体，细胞继续于37℃、5％ CO2培养箱内培养，每3至4天换液一次。收集出现的转染体，并分析其产生伊卡因的能力。
转染细胞以2×105细胞/mL密度接种至不含核酸而含有10％透析FCS的α-MEM培养基中，培养过夜。第二天，培养基换成无血清的YMM培养基。于37℃、5％CO2培养箱内培养约14天后，测定培养上清液中伊卡因的水平。结果检测到培养上清液中含10U/mL的伊卡因。
(2)SP2/0细胞产生伊卡因的绩效
如下所述，使用SP2/0细胞进行转染，并从转染体系中选择转染体。
SP2/0细胞用冷Dulbecco PBS(-)洗涤两次，将悬于0.8mLPBS(-)中的107细胞加入到电穿孔样品池(电极宽0.4cm，BIO-RAD生产)中。加入线形化的表达质粒(40μg)，并用吸管吹打混匀。使用GenePulser II(BIO-RAD生产)施加一次0.22kv、975μF脉冲。将样品池置冰上预冷10分钟后，用含核酸和10％胎牛血清(FCS)的α-MEM培养基将细胞悬液稀释至约5000细胞/50μL，以50μL/孔的量铺到5块96孔板中，在3％CO2培养箱内于35℃培养过夜。第二天，每孔加入不含核酸而含有10％透析FCS的培养基50μL，继续培养过夜。第二天，每孔加入不含核酸而含有10％透析FCS、100nM或200nMMTX的α-MEM培养基100μL。培养10天至14天后，分析各孔转染体产生伊卡因的能力。将细胞以3×105细胞/mL的密度接种至不含核酸而含有2％透析FCS的α-MEM培养基中。培养约14天后，测定培养上清液中伊卡因的水平。结果发现各转染体表达伊卡因的水平为2～10U/mL。通过有限稀释法将悬于同样培养基中的细胞以200μL/孔的量接种到96孔板中，使浓度为0.5细胞/孔，对细胞进行克隆。分析所得各克隆产生伊卡因的能力。将各克隆以3×105细胞/mL的密度接种至不含核酸而含有2％透析FCS的α-MEM培养基中。在3％CO2培养箱内于35℃培养14天后，测定培养上清液中伊卡因的水平。在所获得的克隆中，克隆#1H-8的培养上清液中表达有15U/mL的伊卡因。
用YMM培养基使克隆#1H-8适应于无血清培养基。用含2％透析FCS的YMM培养基进行培养并确认其可以生长。然后将血清含量逐渐降到0.5％，进一步降到0.1％，继续培养。确认细胞增殖良好后，使用完全不含血清的YMM培养基培养。确认细胞可以生长，然后使用YMM培养基按上述方法测定其产生伊卡因的能力。适应无血清培养基的克隆#1H-8具有产生20U/mL伊卡因的能力。
实施例9
(可产生伊卡因的细胞的大规模培养)
按实施例8所述方法，使可产生伊卡因的细胞#1H-8适应于无血清培养基后，用旋转瓶进行悬浮培养。细胞增殖后，将250mL细胞以2×105细胞/mL的密度于250-mL旋转瓶(Techne生产)内用YMM培养基培养。将细胞以大于1×106细胞/mL的密度扩容至1-L旋转瓶。确认细胞可以生长后，将细胞扩容至5个1-L旋转瓶中。培养约7天，然后测定培养上清液中伊卡因的水平，其值约为18U/mL。
实施例10
(水蛭素固定柱的制备)
水蛭素是一种从水蛭中分离出来的特异性凝血酶抑制剂。根据水蛭素的氨基酸序列，使用肽合成仪(Applied)合成序列为Lys-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Glu的肽，该序列定为SEQID NO：13。依据厂家使用说明将该肽(10mg)与甲酰化Cellulofine相偶联。
实施例11
(抗伊卡因部分肽的抗体的制备)
依据Hopp和Wood所述方法(T.P.Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci，Vol.78，3824-3628，1981)分析伊卡因cDNA所编码的氨基酸序列的亲水区和疏水区。用肽合成仪(Applied)合成序列为Lys-Asn-Asp-Tyr-Ser-Tyr-Ala-Asp-Glu-Asn-Lys-Gly-Ile-Val-Glu-Pro-Gly-Thr-Lys-Cys的肽作为高度亲水区，该序列定为SEQ ID NO：14。在弗氏完全佐剂存在的条件下将该肽(500μg)于第0天接种入兔皮内，在弗氏不完全佐剂存在的条件下于第14天和第28天进行接种，制备抗伊卡因肽的多克隆抗体。利用Western印迹法确认所得抗体是否识别伊卡因肽。在无2-巯基乙醇存在的条件下，对天然伊卡因进行SDS-PAGE电泳。电泳后，将凝胶置于转膜缓冲液(10mM N-环己基-3-氨基丙磺酸，10％甲醇，pH11)中浸泡5分钟，然后覆盖到已先后以100％甲醇和转膜缓冲液中浸泡的PVDF膜上，利用TRANS-BLOT细胞(BIO-RAD)在160mA的电流下转膜16小时。用TBST(50mMTris-HCl，pH8.0，150mM NaCl；0.05％吐温20，含5％脱脂奶)将膜封闭。室温下，将该膜与从接种合成肽的兔获得的、经TBST稀释500倍的血清温孵1小时，并用TBST洗涤。然后于室温下，使该膜与2000倍稀释的、抗兔IgG-HRP标记的抗体(BIO-RAD)反应1小时。洗涤该膜，用柯尼卡免疫染色HRP 1000试剂盒(Konica)染色。结果表明用合成肽接种所获得的血清能够和伊卡因发生特异性反应。
实施例12
(重组凝血酶的纯化)
(1)阳离子交换层析
用1M柠檬酸将产生前凝血酶-2的SP2/0细胞培养上清液(2000mL)调到pH6.0，经0.45μm滤膜过滤后作为样品。将样品加到用20mM柠檬酸和0.05％PLURONIC F-68缓冲液(pH6.0)以2mL/min流速所平衡的SP TOYOPEAL 550C层析柱(20mL：Tosoh公司)上。用同样的缓冲液(100mL)洗涤层析柱，然后用盐浓度为50mM～1000mM的NaCl/20mM柠檬酸(pH6.0；210mL)以2mL/min流速进行梯度洗脱。取各级分的一部分用抗凝血酶抗体(Sigma)进行Western印迹试验，以鉴别洗脱有凝血酶的级分。收集该级分，用含0.1M NaCl的20mM Tris-HCl(pH8.5)于室温下透析16小时。
(2)凝血酶的活化
透析后，往SP TOYOPEAL 550C层析柱收集到的级分(40mL)中加入1M的苯甲脒25mL，然后加入纯化的重组伊卡因，使其终浓度为6.5U/mL，37℃反应16小时。
(3)用水蛭素固定柱纯化凝血酶
将步骤(2)中伊卡因处理后的反应溶液以1mL/min流速加到实施例10中水蛭素肽固定的10mL凝胶中。上样后，用含0.5M NaCl的20mM Tris-HCl(pH8.5)缓冲液50mL洗涤层析柱，然后用含1M硫氰酸钾的20mM Tris-HCl(pH8.5)缓冲液50mL洗脱。这些步骤可以得到高度纯化的α-凝血酶，其最终活性收率为40％。
图1所示为2-巯基乙醇存在条件下进行SDS-PAGE、并用考马斯亮蓝染料对各纯化步骤所得级分中的蛋白质加以染色的结果。
实施例13
(伊卡因的纯化)
(1)阳离子交换层析
产生伊卡因的SP2/0细胞培养上清(2000mL)用2倍量的水稀释，用1M柠檬酸调到pH5.0，经0.45μm滤膜过滤后作为样品。将样品加到用20mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)以4mL/min流速所平衡的Macro-Prep High S Support层析柱(20mL：Bio-Rad Laboratories)上。用同样的缓冲液(150mL)洗涤层析柱，然后用盐浓度为0mM-1000mM的NaCl/20mM柠檬酸(pH5.0；210mL)以4mL/min流速进行梯度洗脱。取各级分的一部分用实施例11中所得抗伊卡因抗体进行Western印迹试验，以鉴别洗脱有伊卡因的级分。收集该级分，用含50mM NaCl的20mM碳酸氢钠缓冲液(pH9.0)透析。
(2)阳离子交换层析
上述阳离子交换层析(1)过程中获得的透析产物，加到用含50mMNaCl的20mM碳酸氢钠缓冲液(pH9.0)以0.5mL/min流速所平衡的硫酸Cellulofine层析柱(2mL：SEIKAGAKU CORPORATION)上。用如上所述缓冲液(140mL)洗涤层析柱，然后用盐浓度为50mM～600mM的NaCl/20mM的碳酸氢钠缓冲液(pH9.0；20mL)以0.5ml/min流速进行梯度洗脱。取各级分的一部分用实施例11中所得抗伊卡因抗体进行Western印迹试验，以鉴别洗脱有伊卡因的级分。
(3)凝胶过滤
以0.5mL/min流速，将层析过程(2)含重组伊卡因的级分加到用含100mM NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)所平衡的HiLoad16/60凝胶过滤层析柱(Pharmacia)上。然后以0.5mL/min的流速进行分级分离。使用凝胶过滤标记物(Bio Rad)作为分子量标准品。测定各级分活化凝血酶的能力，在分子量约80,000的级分中检测到了峰活性(图3)。在存在2-巯基乙醇的情况下对得到的纯化的伊卡因级分进行SDS-PAGE，随后用考马斯亮蓝进行处理。得到的图样见图2。
经过上述的三步纯化，获得最终活性收率为13％的重组伊卡因，其比活比培养上清液高12000倍。
实施例14
(重组α-凝血酶的酶学特性)
对于如实施例12所述制备的纯化重组α-凝血酶进行酶学特性的测定。即测定将纤维蛋白原转化成纤维蛋白的活性、凝血调节蛋白的解离常数、不存在及存在凝血调节蛋白的条件下活化蛋白C的活性和抗凝血酶III对其的抑制作用。使用来源于血浆(购自Hematologic研究所)的纯化α-凝血酶作为阳性对照。结果如表1所示，纯化的重组α-凝血酶的各个酶活性参数与来源于血浆的纯化α-凝血酶相当。
表1：重组α-凝血酶和血液来源的α-凝血酶之间酶参数的比较
  重组α-凝血酶    来源于血浆的α-凝血酶
水解S-2238的活性kcat(sec-1)Km(μM)kcat/Km(μM-1sec-1) 165±56.9±1.523.3±2.5 174±198.3±1.521.2±2.7
将纤维蛋白原转化成纤维蛋白FpA的kcat t/Km(μM-1sec-1) 10.9±0.6 10.6±0.8
凝血调节蛋白的解离常数K dapp(nM) 1.3±0.1 1.4±0.2
活化蛋白C的活性(TM-)kcat(min-1)Km(μM)kcat/Km(μM-1min-1) 9.1±0.115.7±0.30.58±0.01 8.5±0.216.3±0.30.52±0.02
活化蛋白C的活性(TM+)kcat(min-1)Km(μM)kcat/Km(μM-1min-1) 86.6±1.76.2±0.514.0±1.5 85.8±3.55.5±0.115.5±0.5
 ATIII的抑制作用二级反应常数(μM-1min-1) 0.57±0.01 0.65±0.01
对上述实施例中的凝血酶和伊卡因进行下列的活性测定：
(1)凝血酶活性测定
如下所述测定凝血酶活性。
将样品(20μL)、pH为8.5的50mM Tris-HCl和50mM NaCl配成的缓冲液(60μL)及0.1％PLURONIC F-68(20μL)加到2008管(Falcon)中，于37℃孵育3分钟。使用人血浆来源的纯化α-凝血酶(购自Hematologic Institute：HCT-0020)作为标准品，用相同缓冲液稀释至5、2.5、1.25、0.625和0.3125μg/mL。搅拌加入100μLTestTeam显色底物S-2238(1mM：DATIC PURE CHEMICALS有限公司)。37℃反应5分钟，用800μL的0.1M柠檬酸终止反应。将反应溶液(200μL)转移到96孔板中，测定OD405/650值。
(2)伊卡因活性测定
如下所述测定伊卡因活性。
将样品(20μL)、pH为8.5的50mM Tris-HCl、50mM NaCl和0.1％PLURONIC F-68配成的缓冲液(“缓冲液1”；60μL)加到2008管(Falcon)中。此后，加入0.01％胰蛋白酶(2μL)，对混合物加以搅拌，于37℃孵育10分钟。使用人血浆(购自HematologicInstitute：HCT-0020)来源的纯化α-凝血酶作为标准品，根据浓度需要用缓冲液1对样品加以稀释。加入10μL凝血酶原(0.4mg/mL，购自Hematologic Thecnology)，于37℃反应5分钟。然后，搅拌加入10mM EDTA(10μL)和TestTeam显色底物S-2238(1mM；100μL)。37℃反应5分钟，用800μL的0.1M柠檬酸终止反应。反应溶液(200μL)转移到96孔板中，测定OD405/650值。为了对伊卡因活性加以定量，将蛇毒素来源的伊卡因(可从Sigma获得)用缓冲液1稀释至25、12.5、6.25和3.125mU/mL。用20μL标准溶液替换样品，不加胰蛋白酶，重复上述步骤中加胰蛋白酶后的步骤。
到目前为止，传统方法所报道的重组凝血酶活性约为25μg/mL。与此形成鲜明对比的是，依据本发明所构建的凝血酶表达系统可以实现高达约150μg/ml的凝血酶表达水平，大大超出传统方法所能达到的水平。而且，本发明人也成功的制备了作为活化酶的重组伊卡因，从而建立了一种不使用血液来源组分、完全安全的人凝血酶制备方法。这样，本发明能够不使用血液来源组分而安全、经济地大量供应人凝血酶，因而对医学治疗和研究领域有很大贡献。
                        序列表
<110>财团法人化学及血清疗法研究所
<120>利用基因工程技术制备人凝血酶的方法
<130>663290
<150>JP 2001-206919
<151>2001-07-06
<160>14
<210>1
<211>25
<212>DNA
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<220>
<223>引物
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<211>34
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cctgaaggag acgtggacag ccaacgttgg taaggggcag cccagtgtcc tgcaggtggt    780
gaacttgccc attgtggagc ggccggtctg caaggactcc acccggatcc gcatcactga    840
caacatgttc tgtgctggtt acaagcctga tgaagggaaa cgaggggatg cctgtgaagg    900
tgacagtggg ggaccctttg tcatgaagag cccctttaac aaccgctggt atcaaatggg    960
catcgtctca tggggtgaag gctgtgaccg ggatgggaaa tatggcttct acacacatgt    1020
gttccgcctg aagaagtgga tacagaaggt cattgatcag tttggagagt ag            1072
<210>12
<211>1863
<212>DNA
<213>锯鳞蝰
<400>12
ctcgagatga tccagattct cttggtaatt atatgcttag cagtttttcc atatcaaggt    60
tgctctataa tcctgggatc tgggaatgtt aatgattatg aagtagtgta tccacaaaaa    120
gtcactgcat tgcccaaagg agcagttcag cagcctgagc aaaagtatga agatgccatg    180
caatatgaat ttgaagtgaa gggagagcca gtggtccttc acctagaaaa aaataaagaa    240
cttttttcag aagattacag tgagactcat tattcgtctg atgacagaga aattacaaca    300
aacccttcag ttgaggatca ctgctattat catggacgga tccagaatga tgctgagtca    360
actgcaagca tcagtgcatg caatggtttg aaaggacatt tcaagcttcg aggggagacg    420
tactttattg aacccttgaa gattcccgac agtgaagccc atgcagtcta caaatatgaa    480
aacatagaaa atgaggatga agcccccaaa atgtgtgggg taacccagga taattgggaa    540
tcagatgaac ccatcaaaaa gactttgggg ttaattgttc ctcctcatga acgaaaattt    600
gagaaaaaat tcattgagct tgtcgtagtt gtggaccaca gtatggtcac aaaatacaac    660
aatgattcaa ctgctataag aacatggata tatgaaatgc tcaacactgt aaatgagata    720
tacttacctt tcaatattcg tgtagcactg gttggcctag aattttggtg caatggagac    780
ttgattaacg tgacatccac agcagatgat actttgcact catttggaga atggagagca    840
tcagatttgc tgaatcgaaa aagacatgat catgctcagt tactcacgaa cgtgacactg    900
gatcattcca ctcttggaat cacgttcgta tatggcatgt gcaaatcaga tcgttctgta    960
gaacttattc tggattacag caacataact tttaatatgg catatataat agcccatgag    1020
atgggtcata gtctgggcat gttacatgac acaaaattct gtacttgtgg ggctaaacca    1080
tgcattatgt ttggcaaaga aagcattcca ccgcccaaag aattcagcag ttgtagttat    1140
gaccagtata acaagtatct tcttaaatat aacccaaaat gcattcttga tccacctttg    1200
agaaaagata ttgcttcacc tgcagtttgt ggaaatgaaa tttgggagga aggagaagaa    1260
tgtgattgtg gttctcctgc agattgtcga aatccatgct gtgatgctgc aacatgtaaa    1320
ctgaaaccag gggcagaatg tggaaatgga gagtgttgtg acaagtgcaa gattaggaaa    1380
gcaggaacag aatgccggcc agcaagggat gactgtgatg tcgctgaaca ctgcactggc    1440
caatctgctg agtgtcccag aaatgagttc caaaggaatg gacaaccatg ccttaacaac    1500
tcgggttatt gctacaatgg ggattgcccc atcatgttaa accaatgtat tgctctcttt    1560
agtccaagtg caactgtggc tcaagattca tgttttcaga ggaacttgca aggcagttac    1620
tatggctact gcacaaagga aattggttac tatggtaaaa ggtttccatg tgcaccacaa    1680
gatgtaaaat gtggcagatt atactgctta gataattcat tcaaaaaaaa tatgcgttgc    1740
aagaacgact attcatacgc ggatgaaaat aagggaatag ttgaacctgg aacaaaatgt    1800
gaagatggaa aggtctgcat caacaggaag tgtgttgatg tgaatacagc ctactaactc    1860
gag                                                                  1863
<210>13
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>水蛭素肽
<400>13
Lys Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Glu
  1               5                  10
<210>14
<211>20
<212>PRT
<213>锯鳞蝰
<400>14
Lys Asn Asp Tyr Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Lys Gly Ile Val Glu
  1               5                  10                  15
Pro Gly Thr Lys Cys
             20

Claims (11)

1.利用基因工程技术制备人凝血酶的方法，该方法包括下列步骤：
(1)培养转染体动物细胞，所述细胞用启动子下游整合有编码人前凝血酶基因的表达载体转染，使在培养上清液中产生和积累人前凝血酶，并回收产生的人前凝血酶；
(2)用伊卡因对包含步骤(1)中回收的人前凝血酶的溶液进行处理，以将人前凝血酶转化成人凝血酶；和
(3)对上述活化步骤之后得到的溶液进行纯化，获得纯化的人凝血酶。
2.权利要求1的制备人凝血酶的方法，其中所述启动子选自SV40早期启动子、SV40晚期启动子、巨细胞病毒启动子和鸡β-肌动蛋白启动子。
3.权利要求2的制备人凝血酶的方法，其中所述启动子为鸡β-肌动蛋白启动子。
4.权利要求1至3中任一项的制备人凝血酶的方法，其中所述表达载体在编码前凝血酶的基因的上游含有信号序列。
5.权利要求4的制备人凝血酶的方法，其中所述信号序列选自免疫球蛋白SG-1或C25信号序列。
6.权利要求1至5中任一项的制备人凝血酶的方法，其中所述表达载体还包含基因扩增基因，转染体在适于基因扩增的条件下培养。
7.权利要求6的制备人凝血酶的方法，其中所述基因扩增基因是编码二氢叶酸还原酶的基因。
8.权利要求1至7中任一项的制备人凝血酶的方法，其中所述编码人前凝血酶的基因是具有SEQ ID NO：11中核苷酸序列的基因片段。
9.权利要求1至8中任一项的制备人凝血酶的方法，其中所述转染体是选自中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠骨髓瘤细胞、BHK21细胞、293细胞和COS细胞的动物细胞。
10.权利要求1的制备人凝血酶的方法，其中用于活化人前凝血酶的伊卡因是用基因工程技术制备的。
11.权利要求1的制备人凝血酶的方法，其中人凝血酶的纯化方法包括利用水蛭素肽进行亲和层析。
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