KR100983878B1

KR100983878B1 - 유전자 재조합 기술에 의한 인간 트롬빈 제조 방법

Info

Publication number: KR100983878B1
Application number: KR1020097015790A
Authority: KR
Inventors: 히로시 요네무라; 다카유키 이마무라; 히로시 나카타케; 겐지 소에지마; 치카테루 노자키
Original assignee: 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-07-04
Publication date: 2010-09-27
Also published as: JPWO2003004641A1; EP1405910B1; KR20090087136A; CN1551917A; WO2003004641A1; US7635577B2; EP1405910A1; CN100347297C; EP1405910A4; KR20040032147A; CA2452768A1; JP4227012B2; CA2452768C; ATE423199T1; DE60231210D1; US20040197858A1

Abstract

유전자 재조합 인간 트롬빈을 제공한다. 인간 트롬빈은 (1) 인간 프리트롬빈을 코딩하는 유전자가 프로모터의 하류에 도입된 발현 벡터로 형질감염된 형질감염 동물 세포를 배양하여 배양 상등액중 인간 프리트롬빈을 생성하고 축적시킨 후 생성된 인간 프리트롬빈을 회수하고;

(2) 단계 (1)에서 회수한 인간 프리트롬빈을 포함하는 용액을 에카린으로 처리하여 인간 프리트롬빈을 트롬빈으로 전환시키고;

(3) 상기 활성화 공정 후 수득한 용액을 정제하여 정제된 인간 트롬빈을 수득하는 단계를 포함하는, 유전 공학 기술에 의해 효율적으로 제조된다. 본 발명은 혈액 유래 성분을 배제하고 있기 때문에 안전하고 경제적인 방식으로 인간 트롬빈을 대량으로 제공할 수 있도록 한다.

인간 트롬빈, 유전자 재조합

Description

유전자 재조합 기술에 의한 인간 트롬빈 제조 방법{Process for Producing Human Thrombin by Gene Modification Technique}

본 발명은 의약 분야에 포함되고 지혈제로서 사용할 수 있는 트롬빈에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 유전 공학에 의해 제조된 유전자 재조합 트롬빈 및 그를 제조하는 방법에 관한 것이다.

트롬빈은 지혈성 혈전의 형성 또는 상처 치유와 같은 생명 유지 및 발달에 필수적인 활성을 갖는 트립신성 세린 프로테아제이다. 트롬빈은 메이조트롬빈, α-트롬빈, β-트롬빈 및 γ-트롬빈을 포함하고, 이중 α-트롬빈이 생리학적 관점에서 가장 중요하다. 트롬빈의 전구체인 프로트롬빈은 비타민 K에 의존하는 방식으로 간세포에서 생합성적으로 생산되고 그의 혈액 수준은 100 내지 150μg/ml 범위이다. 비타민 K 의존성 응고 인자는 N-말단에 Gla 포함 영역(Gla 영역)을 갖고 Ca⁺²에 의해 인지질에 결합한다. Gla 영역이 Ca⁺²이온에 결합할 때 단백질의 고차원적 전체 구조는 변형되어 공인자와 상호작용함으로써 중요한 작용을 하게 된다.

프로트롬빈중 Arg320-Ile321 결합은 제한 절단을 통해 절단되어 Gal 영역 및 Kringle 영역을 갖는 메이조트롬빈을 형성하여 세포막의 인지질상에서 FXa-FVa 복합체에 의해 프로트롬빈은 활성화된다. 연속하여, Arg271-Thr272 결합은 제한 절단을 통해 α-트롬빈을 형성하고, 이는 세포막으로부터 유리되고 세포막상의 다양한 트롬빈 수용체 또는 다수의 혈장 단백질을 제한적으로 절단하여 다양한 생리학적 활성을 나타낸다. α-트롬빈은 A 쇄 및 B 쇄로 구성된 2-쇄 분자이다. 효소 활성에 필수적인 B 쇄가 자가용해될 때, β-트롬빈 또는 γ-트롬빈은 생산되어 섬유소원 또는 혈소판을 활성화시키는 능력을 상실하게 된다

형성된 트롬빈 대부분은 국부적으로 섬유소성 혈전에 결합하여 거대 혈전을 형성한다. α-트롬빈은 섬유소원을 섬유소로 전환시킬 뿐만 아니라 FXIII을 활성화시켜 섬유소의 가교-결합을 유발한다. 또한, α-트롬빈은 FVIII 및 FV, FIX 및 FXa의 공인자를 각각 활성화시켜 응고를 진행시킴으로써 응고를 가속화시킬 수 있다. 따라서, 트롬빈은 지혈에서 중요한 작용을 하기 때문에 지혈제로서 사용하기 위한 유용한 단백질이다.

한편, 트롬빈은 혈관 내피 세포상의 트롬보모듈린에 특이적으로 결합하여 그의 기질을 변형시켜 단백질 C를 활성화시켜 항응고를 촉진시킨다. 따라서, 이 효소 활성을 이용하여 트롬빈은 활성화된 단백질 C 제조를 위한 프로세스 단백질, 즉 항응고제로서 유용하다. 또한, α-트롬빈은 혈소판을 강력하게 응고시키고 활성화시키고, 또한 미토겐 활성을 나타낸다. 다양한 생리학적 활성을 나타내는 α-트롬빈은 다양한 연구 분야에서 시약으로서 사용되어 왔고 앞으로도 그의 유용성은 증가될 것으로 기대된다.

그의 작용 및 활성으로 트롬빈은 지혈제, 프로세스 효소 또는 연구용 시약으로서 광범위하게 사용되어 왔다. 예를 들면, 상부 소화관의 출혈에 대하여 혈액으로부터 유래된 트롬빈을 내시경적으로 산포하거나 경구 투여하여 지혈 효과를 얻었다. 또한, 조직 접착제로서 사용되는 섬유소 페이스트는 섬유소원 및 FXIII와 함께 혈액으로부터 유래된 트롬빈을 포함한다.

그러나, 상기 기술한 트롬빈 물질은 인간 또는 소 혈액으로부터 분리되어 인간에게 부작용을 일으킬 것으로 판단되는 공급원(source) 혈액으로부터 유래된 다양한 위험 인자를 포함한다. 예를 들면 HAV, HBV, HCV, HEV, 또는 TTV와 같이 간염을 유발하는 바이러스, HIV와 같이 면역결핍 질환을 유발하는 바이러스, 또는 CJD 등을 유발하는 이상 프리온이 트롬빈 물질에 존재하는 것으로 우려되고 있다. 사실, 이들 위험 인자로 오염된 혈액 표본에 의해 유발되는 약물 손상이 사회적으로 큰 문제거리가 되어 왔다. 또한 인간 또는 소 혈액은 살아있는 물질로부터 유래되기 때문에 안정적으로 제공한다고 보장할 수 없다. 즉, 이것이 약물과 관련하여 시급하게 해결되어야 할 특히 중요하고 심각한 문제이다.

통상의 방법에 따라, 트롬빈은 트롬빈의 전구체인 프로트롬빈을 혈액으로부터 유래된 FXa로 활성화시켜, 즉, 혈액-유래 FXa를 활성화 과정에 사용하여 트롬빈을 제조한다. 따라서, 트롬빈의 전구체를 유전 공학 기술에 의해 제조한다고 해도 혈액-유래 FXa를 활성화 효소로 사용하는 한 혈액 성분의 오염에 대한 우려는 배제할 수 없다. 유전 공학 기술에 의해 FXa를 제조하기 위해 그의 전구체 X를 유전 공 학 기술에 의해 제조하고 FIXa로 활성화시켜야 한다. 추가로, 유전 공학 기술에 의해 FIXa를 제조하기 위해 그의 전구체 IX를 유전 공학 기술에 의해 제조하고 또다른 응고 인자로 활성화시켜야 한다. 이러한 방식으로, 응고 반응의 캐스케이트에서 가장 상류의 효소를 유전 공학에 의해 제조하지 않는다면 오염된 혈액 성분의 위험 소지가 없는 트롬빈을 제조할 수 없다.

트롬빈을 제조하고 효소를 활성화시키기 위한 공급원 물질로서 혈액을 사용하므로써 발생하는 위험 및 제한을 고려하여 대체 공급원 및 더욱 안전하고 더욱 안정적인 방식으로 트롬빈을 제공하는 방법이 요구되고 있다. 이러한 배경하에 숙주로서 동물 세포 또는 미생물을 사용하여 트롬빈을 발현시키는 것이 보고되었다.

그러나, 통상의 방법은 예를 들면 E. coli에서 발현되는 트롬빈은 일명 봉입체로 명명되는 응집을 형성하여 트롬빈 회수를 어렵게 한다는 단점을 갖고 있다. 특히 응집체를 용해시키고 그로부터 기능 단백질을 재구성하는 것은 더욱 비효율적이고 따라서 산업 용도로 적용할만 한 가치가 없다(J. Biol. Chem. 270, 163-169, 1995). 또한 햄스터 배양 세포를 사용한 발현 시스템은 발현 수준이 낮기 때문에 비실용적이다(Protein exp. purif. 10, 214-225, 1997). 또한 이들 방법에서 트롬빈은 전구체 형태로 발현되어 재조합 효소가 아닌 FXa와 같은 활성 효소로 활성화되어야 하고, 따라서 여전히 배제되지 않은 혈액 성분으로 오염된다. 따라서, 통상의 방법에 의해서는 안전하고 경제적인 비용으로 인간 트롬빈을 안정하게 제공하는 것은 어렵다.

따라서 본 발명은 상기 기술한 문제가 없는 안전하고 경제적으로 인간 트롬빈을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.

이러한 상황하에 본 발명자들은 상기 기술한 문제를 해결하기 위해 연구한 결과 본 발명을 완성함으로써 안전하고 경제적으로 인간 트롬빈을 제조하는 방법을 제공하게 되었다. 특히 본 발명자들은 인간 트롬빈 전구체를 코딩하는 유전자 또는 그의 활성화 효소를 코딩하는 유전자가 강력한 프로모터(즉, β-액틴 프로모터)의 하류에 연결되어 있는 플라스미드를 작제하고 상기 플라스미드를 동물 세포에 도입시켜 도입된 각 유전자에 대한 고도의 발현 시스템을 구축하므로써 안전하게 다량의 트롬빈 및 그의 활성화 효소를 제공하게 되었고, 이는 현재까지 통상의 방법에 의해 달성되지 않았던 것이다. 그렇게 생산된 트롬빈 및 그의 활성화 효소을 조합하여 본 발명자들은 다량의 활성 트롬빈을 안전하게 제공하게 되었다.

본 발명을 수행하기 위한 최상의 모드

상기 기술한 바와 같이 프로트롬빈은 Gla 영역, Kringle 영역 및 세린 프로테아제 영역으로 구성되어 있고, 이중 Gla 및 Kringle 영역은 가능하게는 단백질 생산에 대한 속도-제한 과정일 수 있는 해독후 변형을 겪게 된다. 한편, A 쇄 및 B 쇄로 구성된 α-트롬빈이 트롬빈의 생물학적 활성을 발휘하는 최소한의 활성 단 위(entity)이다. 이러한 관점에서 A-B쇄로 구성된 단일쇄 단백질인 프리트롬빈-2(이하 "프리트롬빈"으로 언급함)를 코딩하는 유전자를 발현을 위해 선별한다. 프리트롬빈 mRNA의 크기가 프로트롬빈 mRNA보다 작기 때문에 프로트롬빈을 코딩하는 유전자를 사용하는 것보다 프리트롬빈을 코딩하는 유전자를 사용하므로써 더욱 효율적으로 전사하고 해독할 수 있을 것으로 예상된다.

특히, 인간의 간으로부터 분리된 mRNAs를 주형으로서 사용하여 cDNAs를 합성한 후 프로트롬빈 유전자 서열로부터 설계된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 프로트롬빈 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 프로트롬빈 유전자를 사용하여 관심의 대상이 되는 프리트롬빈-2 유전자를 추가로 증폭시켰다. 동물 세포 숙주에 대한 고도의 발현 벡터를 제한하지 않고 사용할 수 있지만 가장 바람직한 일면은 본 발명자들이 소지하고 있는 닭 β-액틴 프로모터-기초 발현 플라스미드 pCAGG(Japanese patent publication No. 168087/1991)로부터 개량된 변형 플라스미드 벡터를 포함하고, 증폭된 프리트롬빈을 이에 도입하여 발현 플라스미드를 작제한다. 상기 플라스미드에서 사용되는 리더 서열은 본래의 트롬빈 유전자 또는 다른 유전자로부터 유래된 것을 포함한다. 상기 작제된 것과 같은 발현 플라스미드를 동물 세포내로 형질감염시킨 결과 현재까지 보고된 바 없는 고도의 발현 수준을 나타내는 동물 세포를 수득할 수 있었다. 숙주 세포로서 사용되는 동물 세포는 햄스터, 마우스, 또는 인간, 바람직하게 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 마우스 골수종 세포, BHK21 세포, 293 세포, COS 세포 등을 포함할 수 있다.

또한, 현재까지 트롬빈의 활성화 효소로서 사용되어 온 FXa를 대신하여 FXa 와 동일한 활성을 갖는 효소인 에카린(ecarin), 바람직하게 본 발명의 고도의 발현 시스템에 의해 성공적으로 제조할 수 있는 재조합 에카린을 사용하였다.

에카린은 특이적으로 프로트롬빈을 활성화시키는 것으로 공지되어 있는 에키스 카리나투스(Echis carinatus)로부터 분리된 뱀 독-유래 프로테아제이다(T.Morita et al., J. Biochem. 83, 559-570, 1978). S. Nishida 등(Biochemistry, 34, 1771-1778, 1995)은 에카린을 코딩하는 cDNA를 코딩하여 그의 구조를 밝혀냈다. 당단백질인 에카린은 메탈로프로테아제이고, 그의 성숙한 형태는 총 426개의 아미노산 잔기를 갖고, Zn⁺² 킬레이트, 디스인테그린 영역 및 Cys-풍부 영역을 포함하는 모자이크 구조를 갖고, RVV-X(Russell's viper 뱀독 X 활성자)의 H쇄와 61%의 상동성을 갖는다. 에카린은 그의 효소 활성이 EDTA에 의해 불활성화되지만 DFP 또는 항트롬빈 III에 의해 저해되지 않는다는 점에서 인자 Xa와 뚜렷이 구별되는 효소이다. 에카린외에 Fxa와 유사한 활성을 갖는 다른 활성화 효소를 이용할 수 있다.

에카린은 트립신 또는 플라스민과 같은 프로테아제의 작용에 의해 에카린 전구체를 활성화시키는 경우 그의 트롬빈-활성화 작용을 나타낸다. 따라서 트롬빈의 활성화를 위해 트립신 등으로 에카린 전구체를 활성화시키는 것이 필요하다. 그러나, 본 발명에 따라 트립신 등을 사용하지 않고 재조합 에카린의 정제 과정에서 에카린 전구체를 동시에 활성화시킬 수 있다.

특히, 프리트롬빈의 경우과 같이 에카린을 코딩하는 유전자를 PCR에 의해 정 제하고 닭 β-액틴 프로모터-기초 발현 플라스미드 pCAGG로부터 유래된 발현 벡터로 도입하여 발현 벡터를 작제한다. 생성된 플라스미드가 도입된 동물 세포는 충분한 수준의 관심의 대상이 되는 에카린을 발현시킬 수 있다. 숙주 세포로 사용할 수 있는 동물 세포는 트롬빈의 경우과 같이 햄스터, 마우스 또는 인간으로부터 유래된 배양 세포를 포함할 수 있다.

이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과에 의해 수득한 배양 상등액으로부터 정제한 후, 트립신과 같은 활성화 효소를 사용하지 않고 에카린을 활성 단백질로서 분리시킬 수 있다. 본 발명자의 고안에 따라 동물 세포에서 발현된 에카린 단백질을 동시에 정제하고 활성화시킬 수 있었다. 적절하게 고안된 경우 에카린외의 다른 활성화된 효소에 대하여 동일한 효과 및 기술을 기대할 수 있었다.

상기 제조된 기질 재조합 프리트롬빈을 활성화시키기 위하여 그렇게 수득한 재조합 에카린을 사용한다. 생성된 재조합 α-트롬빈을 트롬빈과 특이적으로 반응하는 것으로 공지되어 있는 히루딘 펩티드를 사용한 친화성 크로마토그래피, 바람직하게는 고정된 히루딘 펩티드로 칼럼 크로마토그래피하에 고 순도로 정제할 수 있다. 트롬빈은 또한 다양한 포맷의 크로마토그래피의 조합법에 의해 정제될 수 있다.

혈액으로부터 유래된 자연발생 α-트롬빈과 비교할 때, 정제된 재조합 α-트롬빈은 유사한 성질을 나타내었고, 본 발명자들에 의해 제조된 재조합 α-트롬빈은 자연 발생된 α-트롬빈과 유사한 단백질이다.

상기 기술한 바와 같이, 본 발명자들은 유전 공학 기술에 의해 트롬빈 및 에 카린 전구체 모두를 제조하고, 다른 효소는 필요로 하지 않으면서 활성화된 인간 트롬빈을 성공적으로 제조하게 되었다.

본 발명은 혈액-유래 성분을 배제하여 의료 요법 및 연구분야에서 고도로 기여한다는 점에서 안전하고 경제적인 방식으로 인간 트롬빈을 대량을 제공할 수 있다.

본 발명을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하지만 어느 의미로든 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 하기 제조예 및 실시예에서 사용하는 시약은 Pharmacia, BioRad, Wako Pure Chemical Industrial, Ltd, TAKARA SHUZO CO., Ltd., Toyobo, 및 New England Biolabs으로부터 입수하였다.

실시예 1

(발현 플라스미드의 작제)

(1) 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal)의 작제

닭 β-액틴 프로모터-기초 발현 플라스미드 pCAGG(Japanese Patent Publication No. 168087/1991)을 제한효소 EcoRI로 분해하고 T4 DNA 폴리머라제로 둔단(blunt-end)시킨 후 인산화 XhoI 링커의 존재하에 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 pCAGG(Xho)를 작제하였다. 수득한 pCAGG(Xho)를 제한효소 SalI로 분해하고 T4 DNA 폴리머라제로 둔단시킨 후 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 pCAGG-Pv2를 작제하였다. 생 성된 pCAGG-Pv2를 제한 효소 XhoI로 분해한 후 S1 뉴클레아제로 처리하여 XhoI 인식 부위 주위의 수개의 뉴클레오티드를 제거하였다. 뉴클레아제 처리후, 단쇄 영역을 dNTPs의 존재하에 T4 DNA 폴리머라제로 변형시킨 후 인산 SalI 링커 존재하에 T4 DNA 폴리머제로 결찰시켜 pCAGG-S1(Sal)를 작제하였다.

(2) 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal).dhfr의 작제

DHFR 유전자를 포함하는 pSV2-dhfr(S.Subramani et al., Mol. Cell Biol., 1, p.854-864, 1981)을 제한효소 BglII로 분해하고 T4 DNA 폴리머라제로 둔단시킨 후 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 pSV2-dhfr-Bgn을 작제하였다. 수득한 pSV2-dhfr-Bgn을 제한효소 PvuII로 분해하고 인산 BglII 링커의 존재하에 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 pSV2-dhfr-BgB를 작제하였다. 생성된 pSV2-dhfr-BgB를 제한효소 BglII 및 BamHI로 분해한 후 아가로스겔 전기영동시켜 약 1.7kbp의 단편을 수득하였다. 상기에서 수득한 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal)를 제한효소 BamHI로 분해하고 1.7kbp의 단편과 폐환화되도록 결찰시켜 pCAGG-S1(Sal).dhfr를 작제하였다.

(3) 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo의 작제

아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제(neo^r)-기초 발현 플라스미드 pMClneo-polyA(K.R. Thomas et al., Cell, 51,p.503-512, 1987)을 제한효소 XhoI로 분해하고 인산화 BamHI 링커의 존재하에 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 pMClneo-2B를 작제하였다. 생성된 pMClneo-2B를 제한효소 BamI로 분해한 후 아가로스겔 전기영동시켜 약 1.1kbp의 단편을 수득하였다. 상기에서 수득한 발현 플라스미드 pCAGG- S1(Sal).dhfr를 제한효소 BamHI로 분해하고 1.1kbp의 단편과 폐환화되도록 결찰시켜 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo를 작제하였다.

(4) 변형된 DHFR-기초 발현 플라스미드 pSV2-mdhfr의 작제

하기 기술하는 PCR에서 DHFR cDNA를 코딩하는 발현 플라스미드 pSV2-dhfr을 주형으로서 사용하였다. PCR의 1번째 싸이클을 프라이머 1 및 프라이머 2의 조합물 및 프라이머 3 및 프라이머 4의 조합물로 수행하였다. 각 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 하기에 나타낸다:

5ng의 주형 및 각 100pmol의 프라이머를 사용하여 Pyroest DNA 폴리머라제에 의한 증폭을 25회 싸이클동안 수행하였다. 효소 제조사의 지시에 따라 PCR을 수행하였다. 증폭된 DNA 단편을 1% 아가로스겔 전기영동상에서 정제하였다. 이어서, 프라이머 1 및 프라이머 2의 조합물 및 프라이머 3 및 프라이머 4의 조합물로 증폭된 약 20ng의 DNA 단편 각각을 함께 혼합하고 프라이머 1 및 프라이머 4를 사용하여 주형으로서 이들 DNA 단편으로 PCR을 수행하였다. 각 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 하기에 나타낸다. 이 PCR은 DHFR중 23번째 류신을 아르기닌으로 전환시키는 핵산 돌연변이을 도입하였다. 증폭된 DNA 단편을 제한효소 HindIII-BamHI로 분해하 고 1% 아가로스겔 전기영동시켜 약 0.6kbp의 DNA 단편을 추출하였다. 이 DNA 단편을 HindIII-BamHI로 앞서 분해된 서브클로닝 플라스미드 pUC19와 폐화화되도록 결찰시켜 pUC-mDHFR을 작제하였다. 이 플라스미드의 DNA 서열을 결정하여 원하는 돌연변이가 정확하게 도입되었는지를 확인하고 다른 뉴클레오티드 서열에 오류가 없는지 확인하였다. 그의 뉴클레오티드 서열 확인시 플라스미드를 다시 HindIII-BamHI로 다시 분해하고 아가로스겔 전기영동시켜 약 0.6kbp의 DNA 단편을 추출하였다. 상기 기술된 바와 같은 발현 플라스미드 pSV2-dhfr을 HindIII-BamHI로 분해한 후 약 3kbp의 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동으로부터 추출하였다. 생성된 DNA 단편을 돌연변이 DHFR을 코딩하는 DNA 단편에 폐환화되도록 결찰시켜 pSV-mdhfr을 작제하였다.

(5) pCAGG-S1(Sal).mdhfr의 작제

발현 플라스미드 pCAGG-mdhfr을 제한효소 PvuII로 분해하고 인산화 BglII 링커의 존재하에 T4 DNA 리가제로 폐환화되도록 결찰시켜 pSV2-mdhfr-BgB를 작제하였다. 이 플라스미드를 제한효소 BglII-BamI로 분해하고 mDHFR 발현 카셋트를 코딩하는 약 1.7kbp의 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동으로부터 추출하였다. 단계 (1)에서 제조된 발현 플라스미드 pCAGGS1(Sal)을 제한효소 BamHI로 분해하고 T4 DNA 리가제로 1.7kbp의 단편과 폐환화되도록 결찰시켜 pCAGG-S1(Sal).mdhfr을 작제하였다.

실시예 2

(인간 프리트롬빈-2 유전자의 제조)

주형으로서 인간 간 mRNAs(Sawaday-Technology사 제조)를 사용하여 역전사효소(T-Primed First Strand Kit: Amersham Parhmacia사 제조)를 사용하여 프라이머로서 Oligo dT를 사용하여 본 분야에서 공지되어 있는 방법에 따라 제 1 cDNAs 스트랜드를 합성하였다. cDNAs에 기초하여, 하기 기술하는 프라이머를 설계하고 PCR에 사용하였다. 프로트롬빈의 N-말단에 상응하는 유전자에 대한 서열

의 프라이머 및 프로트롬빈의 C-말단에 상응하는 유전자에 대한 서열

의 프라이머를 사용하였다. 유전자 증폭을 위해 Pyrobest DNA 폴리머라제로 이 효소의 제조사의 지시에 따라 30 싸이클동안 PCR을 수행하였다. 하기 기술하는 PCR 또한 유사한 방식으로 수행하였다.

상기 제조한 프로트롬빈 cDNAs를 사용하여 프리트롬빈-2를 코딩하는 유전자를 제조하였다. 하기 기술하는 프라이머를 합성하고 주형으로서 프로트롬빈 cDNAs을 PCR동안 사용하였다. 사용된 각 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 하기에 나타낸다.

프로트롬빈의 프리프로(prepro) 리더 영역을 코딩하는 DNA 증폭을 위해 프라이머 1 및 2를 사용하였다(여기에서, 돌연변이는 Kozak 공통(consensus) 서열을 개시 코돈에 도입되고 제한 효소 SalI 및 EcoRI에 대한 인식 부위가 그의 상류에 도입된 것을 포함한다). 제한 효소 SalI 및 EcoRI에 대한 인식 부위가 종결 코돈의 하류에 도입된 프로트롬빈 해독 영역의 C-말단의 세린 프로테아제 영역을 코딩하는 프리트롬빈-2 유전자의 증폭을 위해 프라이머 3 및 4를 사용하였다. 프라이머 2 및 3은 그의 5' 말단을 인산화하기 앞서 T4~폴리뉴클레오티드 키나제로 처리하였다. 이들 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 관심의 대상이 되는 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 단편을 1% 아가로스 겔 전기영동으로부터 추출하였다. 프리프로 리더 영역 및 프로트롬빈-2 영역을 코딩하는 두개의 DNAs 모두를 거의 동량으로 혼합하고 T4 DNA 리가제를 사용하여 서로 결찰시켰다. 주형으로서 혼합물을 사용하여 프라이머 1 및 프라이머 4를 사용하여 추가로 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭된 DNAs중 약 1.1kbp DNA를 아가로스 겔 전기영동으로부터 추출하여 프리프로 리더를 코딩하는 DNA 서열 및 프리트롬빈-2를 코딩하는 DNA 서열의 결찰된 산물을 수득하였다. 이 유전자의 N-말단을 제한효소 EcoRI로 분해하였다. 서브클로닝 플라스미드 pTZ18R(Pharmacia)을 제한효소 SacI 및 PstI로 분해하고, Mung 빈(bean) 뉴클레아제로 둔단시키고, T4 DNA 리가아제로 폐환화되도록 결찰시켜 pTZΔScPt를 작제하였다. 생성된 플라스미드 pTZΔScPt를 제한 효소 EcoRI로 분해하고 T4 DNA 리가아제로 프리트롬빈을 코딩하는 단편과 함께 폐환화되도록 결찰시켜 pTZ.PT를 작제하였다. 생성된 플라스미드의 DNA 서열을 본 분야의 공지된 방법에 따라 결정하여 프로 트롬빈의 프리프로 리더 영역을 코딩하는 DNA 및 프리트롬빈 영역을 코딩하는 DNA가 동일 프레임에서 해독되었는지 확인하였다. 프리프로 리더 서열과 조합된 프리트롬빈 유전자를 이하 "프리트롬빈 구조 유전자"(서열번호 11)로 언급한다.

실시예 3

(인간 프리트롬빈-2 발현 플라스미드의 작제)

프리트롬빈 구조 유전자를 실시예 1에 기술된 바와 같은 플라스미드 pCAGG-S1(Sal) 및 pCAGG-S1(Sal).mdhfr내로 도입하였다. 플라스미드 pCAGG-S1(Sal) 및 pCAGG-S1(Sal).mdhfr를 제한효소 SalI로 분해하고 소 소장-유래 알칼리성 포스포타아제로 탈인산화시켰다. 상기에서 수득한 플라스미드 pTZ.PT를 제한효소 SalI로 분해하고 프리트롬빈-2 구조 유전자를 코딩하는 약 1.1kbp의 단편을 1% 아가로스겔 전기영동시켜 정제하였다. 이어서 탈인산화된 플라스미드 및 프리트롬빈-2 구조 유전자를 코딩하는 단편을 T4 DNA 리가제로 폐환화되도록 결찰시켜 pCAGG-S1.PT.dhfr.neo 및 pCAGG-S1.PT.mdhfr를 작제하였다.

실시예 4

(동물 세포를 사용하여 인간 프리트롬빈의 발현)

실시예 3에 기술된 바와 같은 프리트롬빈 발현 플라스미드를 사용하여 CHO DG44(G. Urlaub et al., Somatic cell. Mol. Genet., 12, p.555-566 1986;이하 "CHO"로 언급함) 세포 및 SP2/0 Ag14(M. Shulman et al., Mature, 16, p.269-270, 1978; 이하 "SP2/0"로 언급함) 세포를 형질전환시켰다. 플라스미드 pCAGG-S1.PT.dhfr.neo는 CHO 세포에 대하여, 플라스미드 pCAGG-S1.PT.mdhfr는 SP2/0 세포에 대하여 사용하였다. CHO 세포를 변형된 칼슘 포스페이트 방법에 의해 형질감염시키고(C.Chen et al., Mol. Cell. Biol. 1, [.2745-2752, 1987) SP2/0 세포는 일레트로포레이션(electroporation)에 의해 형질감염시켰다.

형질감염을 위한 발현 플라스미드는 제한 효소 PvuI로 분해하여 미리 선형화시켰다.

항-인간 트롬빈 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 프리트롬빈 측량을 수행하였다.

(1) CHO 세포를 사용한 프리트롬빈 생산의 수행

CHO 세포를 사용하여 하기 기술하는 형질감염으로부터 형질감염체를 선별하였다.

형질감염하기 전날 세포를 5 x 10⁵세포/디쉬의 세포 밀도로 10cm 디쉬에 10% 우태아 혈청(FCS: GIBCO-BRL 제조)로 보충된 핵산을 갖는 MEM 알파 배지(FCS: GIBCO-BRL 제조)에 세포를 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 세포를 20μg/ml의 선형화된 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo로 형질감염시켰다. 3% CO₂에서 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 세포를 Dulbecco PBS(-)로 세척하고 배양 배지를 10% 투석된 FCS 및 500μg/ml Geneticin(FCS: GIBCO-BRL 제조)를 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지로 대체하였다. 선별을 위해 매 3 내지 4일마다 이 배 양 배지를 대체하면서 5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서 배양을 계속한 후, 출현된 형질감염체를 풀링(pool)하고 프리트롬빈을 생성하는 그의 능력에 대하여 분석하였다.

형질감염된 세포를 2 x 10⁵세포/디쉬의 밀도로 10% 투석된 FCS로 보충된 핵산이 결여된 MEM 알파 배지에 플레이팅하고 밤새도록 배양하였다. 그 다음날, 무혈청 YMM 배지(인슐린, 트랜스페린, 에탄올아민 및 소듐 셀레나이트를 포함하는 아미노산/비타민이 보강된 핵산이 결여된 MEM 알파 배지)로 대체하였다. 5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서 7 내지 10일동안 배양한 후 배양 상등액중 프리트롬빈 수준을 측정하였다. 결과 배양 상등액중 20μg/ml의 프리트롬빈이 검출되었다. 배양 배지를 매 3 내지 4일마다 대체하면서 세포를 약 14일 동안 100nmol/L 메토트렉세이트(MTX; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10% 투석된 FCS 및 500μg/ml Geneticin을 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지로 세포를 배양하였다. 이후, 유전자 증폭을 위해 500μg/ml Genetiin, 500nmol/L MTX 및 10% 투석된 FCS를 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지로 배양 배지를 대체하면서 세포를 희석시키고 계대 배양하고 14일 동안 배양하였다. 생성된 세포를 풀링하고 각 200㎕/웰의 세포를 동일 배양 배지를 사용하여 0.5세포/웰의 농도로 96웰 플레이트상에 접종하여 한계 희석에 의해 클로닝을 실시하였다. 각각의 수득한 클론을 프리트롬빈을 생성하는 능력에 대하여 분석하였다. 각 클론을 2 x 10⁵세포/디쉬의 밀도로 10% 투석된 FCS로 보충된 핵산이 결여된 MEM 알파 배지에 플레이팅하고 밤새도록 배양하였다. 그 다음날, YMM 배지로 대체하였다. 5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서 7 내지 10일동안 배양한 후 배양 상등액중 프리트롬빈 수준을 측정하였다. 수득한 클론중 #10 클론은 배양 상등액중 90μg/ml의 프리트롬빈-2을 발현시킨 반면, #72 클론은 110μg/ml의 프리트롬빈-2을 발현시켰다.

(2) SP2/0 세포를 사용한 프리트롬빈 생산의 수행

SP2/0 세포를 사용하여 하기 기술하는 형질감염으로부터 형질감염체를 선별하였다.

SP2/0 세포를 냉각된 Dulbecco PBS(-)로 2회 세척하고 0.8ml의 PBS(-)중 현탁된 10⁷개의 세포를 일렉트로포레이션을 위한 큐벳에 놓았다(전극 폭 0.4cm; BIO-RAD 제조). 선형화된 발현 플라스미드(40μg)를 가하고 피펫과 혼합하였다. Gene PulserII(BIO-RAD 제조)를 사용하여 975μF에서 0.22kv로 펄스를 적용시켰다. 큐벳을 10분 동안 얼음 상에서 냉각시킨 후, 세포 현탁액을 10% 우태아 혈청(FCS)을 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지를 사용하여 약 5,000세포/50㎕로 희석하고, 각각 50㎕/웰로 5개의 96-웰 플레이트상에 플레이팅하였다. 그 다음날, 10% 투석된 FCS를 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지 50㎕/웰을 가하고 밤새도록 추가로 배양하였다. 그 다음날, 10% 투석된 FCS 및 100nmol/L 또는 200nmol/L MTX를 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지 100㎕/웰을 가하였다. 10 내지 14일 동안 배양한 후, 각 웰에 출현한 형질감염체를 프리트롬빈을 생성하는 능력에 대하여 분석하 였다. 세포를 약 4 x 10⁵세포/mL의 밀도로 2% 투석된 FCS를 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지로 세포를 플레이팅하였다. 24시간동안 배양한 후 배양 상등액중 프리트롬빈-2 수준 및 세포 밀도를 측정하여 1시간에 세포당 프리트롬빈을 생성하는 능력에 대하여 분석하였다. 결과 각 형질감염체는 2 내지 10μg/일/10⁶세포의 프리트롬빈을 생성하는 것으로 나타났다.

이들 형질감염체중 고수준의 프리트롬빈 생산 능력을 갖는 것을 선별하고 10% 투석된 FCS 및 1μmol/L MTX를 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지와 약 14일 동안 배양하였다.

수득한 MTX 내성 세포를 YMM 배지를 사용하여 무혈청 배지에 순응시켰다. 2% 투석된 FCS를 포함하는 YMM 배지를 배양에 사용학 세포 성장을 확인하였다. 이후, 첨가하는 혈청 수준을 0.5% 및 추가로 0.1%로 서서히 감소시키면서 배양을 계속하였다. 세포가 잘 증식되었는지 확인한 후, 완전하게 무혈청 YMM 배지와 함께 배양하였다. 세포 성장을 확인하고 프리트롬빈을 생성하는 그의 능력을 YMM 배지를 사용하여 상기 기술된 방법에 따라 분석하였다. 수득한 형질감염체중 #32 클론은 15μg/일/10⁵ 세포의 프리트롬빈을 생성하는 능력을 가졌다. #32 클론을 디쉬상에 3 x 10⁵ 세포/ml의 밀도로 YMM 배지에 플레이팅하였다. 약 7일 동안 배양한 후, 배양 상등액 중 발현된 프리트롬빈 수준을 측정하였다. 결과 #32은 배양 상등액 중 약 150μg/ml의 프리트롬빈을 발현시켰다.

실시예 5

(프리트롬빈-생산 세포의 대량 배양)

실시예 4에 기술된 바와 같은 무혈청 배양액에 순응된 프리트롬빈-생산 세포 #32을 스피너 플라스크로 현탁배양시켰다. 세포를 확장(expansion)시킨 후 250mL의 세포를 2 x 10⁵세포/mL 밀도로 250mL 스피너 플라스크(Techne 제조)중 YMM 배지로 배양하였다. 세포를 1 x 10⁶세포/mL 이상의 밀도로 1L 스피너 플라스크로 확장시켰다. 세포 성장을 확인한 후, 세포를 추가로 5개의 1L 스피너 플라스크로 확장시켰다. 세포를 약 7일 동안 배양한 후 배양 상등액 중 프리트롬빈 수준을 측정하여 약 100μg/ml 프리트롬빈-2의 발현을 검출하였다.

실시예 6

(뱀 독 에카린 cDNA의 제조)

문헌(S. Nishida et al., Biochemistry, 34, p.1771-1778, 1995)에 보고된 에카린 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 주형으로 사용하여 PCR을 수행하여 제한효소 XhoI의 인식 부위를 두개의 말단에 도입하였다. 수득한 유전자를 제한효소 XhoI로 분해하고 pUC18내로 서브클로닝하여 pUC.EC를 작제하였다. 생성된 플라스미드의 에카린 cDNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 통상의 방법에 따라 결정하여 개시 코돈으로부터 종결 코돈까지의 뉴클레오티드 서열이 상기 문헌에 보고된 서열에 정확하게 일치하는 에카린 cDNA를 수득하였다(서열번호 12).

실시예 7

(에카린 발현 플라스미드의 작제)

실시예 1에 기술된 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo내로 에카린 cDNA를 도입하였다. 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo를 제한효소 SalI로 분해한 후 소 소장-유래 알칼리성 포스포타아제로 탈인산화시켰다. 상기에서 수득한 플라스미드 pUC.EC를 제한효소 XhoI로 분해하고 에카린 cDNA를 코딩하는 약 1.8kbp의 단편을 아가로스겔 전기영동시켜 정제하였다. 이어서 탈인산화된 플라스미드 및 에카린 cDNA를 코딩하는 단편을 T4 DNA 리가제로 폐환화되도록 결찰시켜 pCAGG-S1.EC.dhfr.neo를 작제하였다.

실시예 8

(동물 세포를 사용한 에카린의 발현)

실시예 7에 기술된 바와 같은 에카린 발현 플라스미드 pCAGG-S1.EC.dhfr.neo를 사용하여 CHO 세포 및 SP2/0 세포를 형질전환시켰다. 기준으로서 상업적으로 이용가능한 뱀 독 유래 에카린(Sigma 제조)을 사용하여 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시키는 활성에 기초하여 에카린 측량을 수행하였다. 발현 수준을 활성 유니트(U/mL)로서 표시하였다.

(1) CHO 세포를 사용한 에카린 생산의 수행

형질감염하기 전날 세포를 5 x 10⁵세포/디쉬의 세포 밀도로 10cm 디쉬에 10% 우태아 혈청으로 보충된 핵산을 갖는 MEM 알파 배지에 세포를 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 세포를 20μg/ml의 선형화된 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo로 형질감염시켰다. 3% CO₂에서 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 세포를 Dulbecco PBS(-)로 세척하고 배양 배지를 10% 투석된 FCS 및 500μg/ml Geneticin을 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지로 대체하였다. 선별을 위해 매 3 내지 4일마다 이 배양 배지를 대체하면서 5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서 배양을 계속한 후, 출현된 형질감염체를 풀링하고 에카린을 생성하는 그의 능력에 대하여 분석하였다.

형질감염된 세포를 2 x 10⁵세포/디쉬의 밀도로 10% 투석된 FCS로 보충된 핵산이 결여된 MEM 알파 배지에 플레이팅하고 밤새도록 배양하였다. 그 다음날, 무혈청 YMM 배지로 대체하였다. 5% CO₂ 인큐베이터에서 35℃에서 약 14일 동안 배양한 후 배양 상등액 중 에카린 수준을 측정하였다. 결과 배양 상등액 중 10U/mL의 에카린이 검출되었다.

(2) SP2/0 세포를 사용한 에카린 생산의 수행

SP2/0 세포를 사용하여 하기 기술하는 형질감염으로부터 형질감염체를 선별 하였다.

SP2/0 세포를 냉각된 Dulbecco PBS(-)로 2회 세척하고 0.8ml의 PBS(-)중 현탁된 10⁷개의 세포를 일렉트로포레이션을 위한 큐벳에 놓았다(전극 폭 0.4cm; BIO-RAD 제조). 선형화된 발현 플라스미드(40μg)를 가하고 피펫을 혼합하였다. Gene PulserII(BIO-RAD 제조)를 사용하여 975μF에서 0.22kv로 펄스를 적용시켰다. 큐벳을 10분 동안 얼음 상에서 냉각시킨 후, 세포 현탁액을 10% 우태아 혈청(FCS)을 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지를 사용하여 약 5,000세포/50㎕로 희석하고, 각각 50㎕/웰로 5개의 96-웰 플레이트 상에 플레이팅하였다. 그 다음날, 10% 투석된 FCS를 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지 50㎕/웰을 가하고 밤새도록 추가로 배양하였다. 그 다음날, 1mg/mL Geneticin 및 10% 투석된 FCS를 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지 100㎕/웰을 가하였다. 10 내지 14일 동안 배양한 후, 각 웰에 출현한 형질감염체를 에카린을 생성하는 능력에 대하여 분석하였다. 세포를 약 3 x 10⁵세포/mL의 밀도로 2% 투석된 FCS 및 500μg/ml Geneticin을 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지로 세포를 플레이팅하였다. 약 14일 동안 배양한 후 배양 상등액 중 에카린 수준을 측정하였다. 결과 각 형질감염체는 2 내지 10U/mL의 에카린을 생성하는 것으로 나타났다. 이들 형질감염체중 고수준의 에카린 생산 능력을 갖는 것 각 200㎕/웰을 동일 배양 배지를 사용하여 0.5세포/웰의 농도로 96웰 플레이트상에 접종하여 한계 희석에 의해 클로닝을 실시하였다. 수득한 각 클론은 에카린을 생성하는 능력에 대하여 분석하였다. 각 클론을 약 3 x 10⁵세포/mL의 밀도 로 2% 투석된 FCS를 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지로 플레이팅하였다. 약 14일동안 5% CO₂ 인큐베이터에서 35℃에서 배양한 후 배양 상등액중 에카린 수준을 측정하였다. 수득한 클론중 클론 #1H-8은 배양 상등액중 15U/ml의 에카린을 발현시켰다.

이 클론 #1H-8을 YMM 배지를 사용하여 무혈청 배지에 순응시켰다. 2% 투석된 FCS를 포함하는 YMM 배지를 배양에 사용하고 세포 성장을 확인하였다. 이후, 첨가하는 혈청 수준을 0.5% 및 추가로 0.1%로 서서히 감소시키면서 배양을 계속하였다. 세포가 잘 증식되었는지 확인한 후, 완전하게 무혈청 YMM 배지와 함께 배양하였다. 세포 성장을 확인하고 에카린을 생성하는 그의 능력을 YMM 배지를 사용하여 상기 기술된 방법에 따라 분석하였다. 무혈청 배양액에 순응시킨 후 클론 #1H-8은 20U/mL의 에카린을 생성하는 능력을 가졌다.

실시예 9

(에카린-생산 세포의 대량 배양)

실시예 8에 기술된 바와 같은 무혈청 배양액에 순응된 에카린-생산 세포 #1H-8을 스피너 플라스크로 현탁배양시켰다. 세포를 확장시킨 후 250mL의 세포를 2 x10⁵세포/mL 밀도로 250mL 스피너 플라스크(Techne 제조) 중 YMM 배지로 배양하였다. 세포를 1 x10⁶세포/mL 이상의 밀도로 1L 스피너 플라스크로 확장시켰다. 세포 성장을 확인한 후, 세포를 추가로 5개의 1L 스피너 플라스크로 확장시켰다. 세포를 약 7일 동안 배양한 후 배양 상등액중 에카린 수준을 측정하여 약 18U/mL 에카린의 발현을 검출하였다.

실시예 10

(히루딘-고정된 칼럼의 제조)

히루딘은 거머리로부터 분리된 트롬빈-특이성 저해제이다. 히루딘의 아미노산 서열에 기초하여, 서열번호 13에 나타낸 서열

의 펩티드를 펩티드 합성기(Applied)로 합성하였다. 이 펩티드(10mg)를 제조사의 지시에 따라 포르밀 Cellulofine(1ml; Chisso Corporation 제조)과 커플링하였다.

실시예 11

(에카린의 일부 펩티드에 대한 항체 제조)

에카린 cDNA에 의해 코딩된 아미노산 서열을 Hopp and Wood(T.P.Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 78, 3824-3828, 1981)에 따라 그의 친수성 및 소수성 영역에 따라 분석하였다. 고도의 친수성 영역으로서 서열번호 14을 기술한아미노산 서열

을 갖는 펩티드를 펩티드 합성기(Applied)로 합성하였다. 0일째 프로인트 완전 아주반트의 존재하에, 14일 및 28일째 프로인트 불완전 아주반트의 존재하에 이 펩티드(500μg)를 진피내 접종하여 에카린 펩티드에 대항 폴리클로날 항체를 제조하였다. 웨스턴 블랏을 사용하여 수득한 항체가 에카린을 인식하는지 확인하였다. 자연발생된 에카린을 2-머캅토에탄올의 부재하에 SDS-PAGE시켰다. 전기영동시킨 후, 겔을 트랜스퍼 완충액(10mM N-사이클로헥실-3-아미노프로판설폰산, 10% 메탄올, pH 11)에 5분동안 침지시킨 후 100% 메탄올 및 트랜스퍼 완충액에 미리 침지시킨 PVDF 막(Immovilon: Millipore)상에 오버레이시켜 TRANS-BLOTCELL(BIO-RAD)를 사용하여 16시간동안 160mA에서 트랜스퍼를 수행하였다. TBST(50mM Tris-HCl, pH 8.0; 150mM NaCl; 0.05% Tween 20, 5% 스킴 밀크 포함)으로 차폐시킨 후, 실온에서 1시간동안 합성 펩티드를 투여받은 래빗으로부터의 TBST로 500배 희석된 혈청과 함께 막을 인큐베이션시킨 후 TBST로 세척하였다. 실온에서 1시간 동안 2000배 희석된 항-래빗 IgG-HRP 표지 항체(Bio-RAD)와 막을 반응시켰다. 세척 후, 막을 Konica Immunostaining HRP 1000(Konica)로 염색하였다. 결과, 합성 펩티드를 면역화되어 수득한 혈청이 에카린과 특이적으로 반응한다고 입증되었다.

실시예 12

(재조합 트롬빈의 정제)

(1) 양이온 교환 크로마토그래피

프리트롬빈-2-생산 SP2/0 세포로부터 배양 상등액(2000ml)을 1M 시트르산으로 pH 6.0으로 조정하고 0.45μm 필터를 통해 여과하여 샘플로서 사용하였다. 20mM 시트레이트 + 0.05% PLURONIC F-68(pH 6.0)으로 평형화된 SP TOYOPEARL 550C(20ml: Tosoh Corporation) 칼럼에 2ml/분의 유속으로 적용시켰다. 칼럼을 동일한 완충액(100mL)로 세척한 후 50mM 내지 1000mM NaCl/20mM 시트르산(pH 6.0; 210ml) 범위의 염 농도 구배로 2ml/분의 유속으로 용출시켰다. 분획 1분량을 항-트롬빈 항체(Sigma)와 함께 웨스턴 블랏에 사용하여 용출된 트롬빈을 갖는 분획을 확인하고, 풀링하고 16시간 동안 4℃에서 0.1M NaCl을 포함하는 20mM Tris-HCl(pH 8.5)에 대하여 투석하였다.

(2) 트롬빈의 활성화

투석 후 SP TOYOPEARL 550C의 풀링된 분획(400ml)에 25mL의 1M 벤즈아미딘을 가하고 추가로 16시간 동안 37℃에서 반응을 위해 최종 농도 6.5U/ml으로 정제된 재조합 에카린을 가하였다.

(3) 히루딘-고정된 칼럼을 사용한 트롬빈의 정제

단계 (2)에서 수득한 에카린을 처리한 후 반응 용액을 1ml/분을 실시예 10에서 제조된 히루딘 펩티드를 고정화시켰다. 샘플을 가한 후, 칼럼을 0.5M NaCl를 포함하는 50ml의 20mM Tris-HCl(pH 8.5) 완충액으로 세척한 후 1M 포타슘 티오시아테이트를 포함하는 50ml의 20mM Tris-HCl(pH 8.5) 완충액으로 용출을 수행하였다. 이 단계를 통해 최종 활성 수율이 40%인 고도로 정제된 α-트롬빈을 수득하였다.

도 1은 2-머캅토에탄올의 존재하의 SDS-PAGE 및 각 정제 단계에서 수득한 분획에 대한 Coomassie Brilliant Blue 염료를 사용한 단백질 염색 결과를 나타낸다.

실시예 13

(에카린의 정제)

(1) 양이온 교환 크로마토그래피

에카린-생산 SP2/0 세포로부터 배양 상등액(2000ml)을 2회 분량의 물로 희석시키고 1M 시트르산으로 pH 5.0으로 조정하고 0.45μm 필터를 통해 여과하여 샘플로서 사용하였다. 20mM 시트레이트(pH 5.0) 완충액으로 평형화된 Macro-Prep High S Support(20ml; Bio-Rad Laboratories) 칼럼에 4ml/분의 유속으로 적용시켰다. 칼럼을 동일한 완충액(150mL)로 세척한 후 0mM 내지 1000mM NaCl/20mM 시트르산(pH 5.0; 210ml) 범위의 염 농도 구배로 4ml/분의 유속으로 용출시켰다. 분획 1분량을 실시예 11에서 수득한 항-에카린 항체(Sigma)와 함께 웨스턴 블랏에 사용하여 용출된 에카린을 갖는 분획을 확인하고, 풀링하고 50mM NaCl을 포함하는 20mM 탄산수소나트튬 완충액(pH 9)에 대하여 투석하였다.

(2) 양이온 교환 크로마토그래피

상기 양이온 교환 크로마토그래피 (1)에서 과정에서 수득한 산물을 50mM NaCl를 포함하는 20mM 탄산수소나트튬 완충액(pH 9)으로 평형화된 Sulfate Cellulofine(2ml; SEIKAGAKU CORPORATION) 칼럼에 0.5ml/분의 유속으로 적용시켰다. 칼럼을 상기 기술된 완충액(14ml)으로 세척하고 50mM 내지 600mM NaCl/20mM 탄산수소나트튬 완충액(pH 9; 20ml)의 범위의 염농도 구배로 유속 0.5ml/분으로 용출시켰다. 분획 1분량을 실시예 11에서 수득한 항-에카린 항체와 함께 웨스턴 블랏에 사용하여 용출된 에카린을 갖는 분획을 확인하고, 용출된 에카린과 함께 분획을 풀링하였다.

(3) 겔 여과

상기 크로마토그래피 (2) 과정에서 수득한 재조합 에카린을 포함하는 분획을 100mM NaCl을 포함하는 10mM 포스페이트(pH 7.0) 완충액으로 평형화된 겔 여과 칼럼 HiLoad 16/60(Pharmacia)에 유속 0.5ml/분을 적용시켰다. 겔 여과 마커(Bio-Rad)를 분자량 기준으로서 사용하였다. 각 분획을 프로트롬빈을 활성화시키는 능력에 대하여 측정하여 약 M.W. 80,000 분획에서 피크 활성을 검출하였다(도 3). 정제된 에카린의 수득한 분획을 Coomassie Brilliant Blue로 연속처리하고 2-머캅토에탄올 존재하에서 SDS-PAGE 시켰다. 수득한 패턴을 도 2에 나타낸다. 상기 3단계의 정제를 통해 최종 활성 수율이 13%이고 배양 상등액과 비교하여 12,000배 높은 특이적 활성을 갖는 재조합 에카린을 수득하였다.

실시예 14

(재조합 α-트롬빈의 효소적 성질)

실시예 12에 기술한 바와 같이 제조된 정제된 재조합 α-트롬빈을 그의 효소적 성질, 즉, 섬유소원을 섬유소로 전환시키는 활성, 트롬보모듈린에 대한 분해 상수, 트롬보모듈린의 존재 및 부재하에서의 단백질 C을 활성화시키는 활성, 및 항트 롬빈 III의 저해성에 대하여 측정하였다. 혈장으로부터 유래된 정제된 α-트롬빈(Hematologic Institute로부터 구입)을 양성 대조군으로서 사용하였다. 결과, 정제된 재조합 α-트롬빈은 각 효소 파라미터에서 표 1에 나타낸 바와 같이 정제된 혈장-유래 α-트롬빈의 것과 일치하는 값을 나타내었다.

표 1: 재조합 α-트롬빈 및 혈액-유래 α-트롬빈사이의 효소 파라미터 비교

상기 기술된 실시예에서 트롬빈 및 에카린의 활성 측정을 하기와 같이 수행하였다:

(1) 트롬빈 활성 측정

하기 기술하는 바와 같이 트롬빈 활성을 측정하였다.

샘플(20㎕), 50mM Tris-HCl, pH 8.5 + 50mM NaCl 완충액(60㎕), 및 0.1% PLURONIC F-68(20㎕)을 2008 튜브(Falcon)에 가하고 3분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 인간 혈장으로부터 유래된 정제된 α-트롬빈(Hematologic Technology: HCT-0020으로부터 구입)을 기준으로서 동일한 완충액을 사용한 5, 2.5, 1.25, 0.625, 및 0.3125μg/ml로의 희석액과 함께 사용하였다. 교반하면서 반응 혼합물에 100㎕의 TestTeam 전개 기질 S-2238(1mM; DAIICH PURE CHEMICALS CO., LTD.)을 가하였다. 5분 동안 37℃에서 반응시킨 후, 반응을 800㎕의 0.1M 시트르산을 퀸칭하였다. 반응 용액(200㎕)을 96-웰 플레이트에 이동시키고 OD 450/650을 측정하였다.

(2) 에카린 활성 측정

샘플(20㎕), 및 50mM Tris-HCl, pH 8.5 + 50mM NaCl 완충액(60㎕), 및 0.1% PLURONIC F-68("완충액 1"; 60㎕)을 2008 튜브(Falcon)에 가하였다. 그에 0.01% 트립신(2㎕)을 가하고 혼합물을 교반하고 10분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 그의 농도에 의존하여 필요에 따라 완충액 1로 희석하였다. 반응 용액에 10㎕의 프로트롬빈(0.4mg/ml; Hematologic Tecnology로부터 구입)에 가하고 혼합물을 5분동안 37℃에서 반응시켰다. 이어서 교반하면서 10mM EDTA(10㎕) 및 TestTeam 전개 기질 S-2238(1mM; 100㎕)을 반응 혼합물에 가하였다. 5분동안 37℃에서 반응시킨 후, 반응을 800㎕의 0.1M 시트르산을 퀸칭하였다. 반응 용액(200㎕)을 96-웰 플레이트에 이동시키고 DOD 450/650을 측정하였다. 에카린 활성 측량을 위해, 뱀 독으로부터 유래된 에카린(Sigma로부터 상업적으로 이용가능)을 완충액 1로 25U/ml, 12.5, 6.25, 및 3.125U/ml로 희석하였다. 각 20㎕의 이들 표준 용액을 트립신 용액 을 가하지 않는 샘플을 대신하여 사용하고 프로트롬빈을 가한 후 상기 기술된 단계를 반복하였다.

통상의 방법으로 현재까지 재조합 트롬빈의 발현 수준은 약 25μg/ml로 보고되어 왔다. 주목할만큼 대조적으로 본 발명에 따라 작제된 트롬빈의 발현 시스템은 약 150μg/ml만큼 높은 발현 수준에 이르게 하였고, 이는 통상의 방법에 의해 달성된 발현 수준을 훨씬 초과한다. 또한 본 발명자들은 활성화 효소로서 사용하기 위한 재조합 에카린을 성공적으로 제조함으로써 혈액으로부터 유래된 성분을 배제하고 완벽하게 안전한 인간 트롬빈을 제조하는 방법을 확립하게 되었다. 따라서, 본 발명은 혈액-유래 성분을 배제하여 의료 요법 및 연구분야에서 고도로 기여한다는 점에서 안전하고 경제적인 방식으로 인간 트롬빈을 대량을 제공할 수 있다.

도 1은 프리트롬빈-2-생산 SP2/0의 배양 상등액으로부터 프리트롬빈-2의 각 정제 단계에서 수득한 분획에 대한 SDS-PAGE 및 단백질 염색 결과를 나타낸다.

도 2는 에카린-생산 SP2/0의 배양 상등액으로부터 에카린 정제의 최종 단계인 겔 여과에서 수득한 분획에 대한 SDS-PAGE 및 단백질 염색 결과를 나타낸다.

<110> JURIDICAL FOUNDATION THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE <120> A method for preparing recombinant human thrombin <130> 663290 <150> JP 2001-206919 <151> 2001-07-06 <160> 14 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 aaaagcttgc catcatggtt cgacc 25 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 cggaggccaa ggcctgtctc cgttcttgcc aatccc 36 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 aacggagaca ggccttggcc tccgctcagg aacgag 36 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ggggatcctg ttagtctttc ttctcgtaga c 31 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 atggcgcacg tccgaggctt gcagctgcct 30 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ctactctcca aactgatcaa tgaccttct 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 aagaattcgt cgacctactc 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Hirudine peptide <400> 13 Lys Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Glu 1 5 10 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Echis carinatus <400> 14 Lys Asn Asp Tyr Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Lys Gly Ile Val Glu 1 5 10 15 Pro Gly Thr Lys Cys 20

Claims

(1) 상류의 프로트롬빈 프리프로 리더 서열과 조합된 인간 프리트롬빈을 코딩하는 유전자가 닭 β-액틴 프로모터의 하류에 도입되고, 유전자 증폭 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 형질감염 동물 세포를 배양하여 배양 상등액 중 인간 프리트롬빈을 생성하고 축적시키고, 생성된 인간 프리트롬빈을 회수하며;

(2) 단계 (1)에서 회수한 인간 프리트롬빈을 포함하는 용액을 에카린으로 처리하여 인간 프리트롬빈을 트롬빈으로 전환시키고;

(3) 단계 (2)에서의 처리 후 수득한 용액을 정제하여 정제된 인간 트롬빈을 수득하는 단계를 포함하는, 유전공학 기술에 의해 인간 트롬빈을 제조하는 방법.
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제1항에 있어서, 유전자 증폭 유전자가 디하이드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 인간 트롬빈을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상류 프리프로 리더 서열을 갖는 인간 프리트롬빈을 코딩하는 유전자가 서열번호 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 트롬빈을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 형질감염체가 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 마우스 골수종 세포, 베이비 햄스터 신장21 세포(BHK21 세포), 인간 배아 신장 293 세포(HEK 293 세포) 및 COS 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 동물 세포인 것을 특징으로 하는 인간 트롬빈을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 인간 프리트롬빈의 활성화에 사용되는 에카린이 유전 공학 기술에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 인간 트롬빈을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 인간 트롬빈의 정제 공정이 히루딘 펩티드를 사용하는 친화성 크로마토그래피로 구성된 것을 특징으로 하는 인간 트롬빈을 제조하는 방법.