JP2002514433A - トランスジェニック植物由来ヒト凝血因子 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
ヒト血液凝固経路において活性化応答を誘発することができ、従って、凝血因子蛋白質が欠損していると診断されているヒトを治療する際に有用なトランスジェニック植物およびトランスジェニック植物から誘導されたヒト凝固因子の組成物が提供される。このような蛋白質は、植物全体および植物細胞培養物を使用してウィルス不含製造に到る方法によって製造することができる。このような因子を製造するための植物組織の適切な形質転換のための発現ベクター、並びに植物分子生物学的技法を使用してヒト凝固因子を製造するための形質転換された植物細胞および方法も提供される。
Description
【０００１】 発明の分野 本発明は、概して、トランスジェニック植物由来ヒト凝固因子に関する。より
具体的には、本発明は、ヒト凝固因子を産生するようコードされたトランスジェ
ニック植物細胞からのヒト様凝血因子（例えば、VIII因子、IX因子、XIII因子、
トロンビン）の製造に関する。本明細書において用いられるように、「ヒト因子
」及び「ヒト凝固因子」とは、相互に交換可能であり、トランスジェニック植物
由来のヒト因子様の凝固促進活性又は凝固活性を有するヒト様蛋白質を意味する
。
具体的には、本発明は、ヒト凝固因子を産生するようコードされたトランスジェ
ニック植物細胞からのヒト様凝血因子（例えば、VIII因子、IX因子、XIII因子、
トロンビン）の製造に関する。本明細書において用いられるように、「ヒト因子
」及び「ヒト凝固因子」とは、相互に交換可能であり、トランスジェニック植物
由来のヒト因子様の凝固促進活性又は凝固活性を有するヒト様蛋白質を意味する
。
【０００２】 発明の背景 過去十年にわたる組換えDNA技術の技術的進歩により、植物又は植物組織の価
値を増強する新たな特色を確立するため、新たな遺伝材料を植物細胞、植物体、
又は植物組織に導入することは、一般的に行われるようになった。本発明は、ヒ
ト凝血因子をコードする遺伝子又はDNAの植物への導入に関する。本発明は、ウ
イルスを含まないヒト様凝血因子を製造するための費用効果の高い手段を提供す
る、トランスジェニック植物材料からの活性ヒト様凝血蛋白質の製造にも関する
。本発明は、血液因子交換、創傷治癒、又はヒト凝血因子について考えられるそ
の他の治療的適用のための、植物由来ヒト因子の使用にさらに関する。以後用い
られる場合、「植物」という用語は、植物自体、植物由来の細胞もしくは組織、
種子、挿木、又はその他の植物由来構造を指すものとする。単子葉類及び双子葉
類の両方の被子植物が、「植物」の定義に含まれる。
値を増強する新たな特色を確立するため、新たな遺伝材料を植物細胞、植物体、
又は植物組織に導入することは、一般的に行われるようになった。本発明は、ヒ
ト凝血因子をコードする遺伝子又はDNAの植物への導入に関する。本発明は、ウ
イルスを含まないヒト様凝血因子を製造するための費用効果の高い手段を提供す
る、トランスジェニック植物材料からの活性ヒト様凝血蛋白質の製造にも関する
。本発明は、血液因子交換、創傷治癒、又はヒト凝血因子について考えられるそ
の他の治療的適用のための、植物由来ヒト因子の使用にさらに関する。以後用い
られる場合、「植物」という用語は、植物自体、植物由来の細胞もしくは組織、
種子、挿木、又はその他の植物由来構造を指すものとする。単子葉類及び双子葉
類の両方の被子植物が、「植物」の定義に含まれる。
【０００３】 凝血過程及び問題の一般的な概説 ヒト血管系に対する傷害により、血液損失の調節において重要な多くの生理学
的過程が関与するようになる。第一に、血小板が粘着性となって内皮結合組織構
造に結合するようになり、血小板血栓が形成される、血小板粘着過程が起こる。
第二に、血小板放出反応により、傷害を受けた血管の血管収縮を引き起こすセロ
トニンのような血管作用性アミンが生じる。第三の効果は、出血を阻止するため
の、内因性及び外因性の系の両方における蛋白質のカスケードを含む凝固過程の
誘発である。第四の重要な効果は、フィブリン血餅の分解、血管壁の治癒及び再
生をもたらす線維素熔解性系の活性化である。本発明は、凝固カスケードに関与
する蛋白質の製造に焦点を当てている。凝血の一般的な概説については、ダビエ
（Davie）らによる「凝血の基本メカニズム（Basic Mechanisms in Blood Coagu
lation）」（1975.Ann Rev Biochem 44:799）及び「正常な造血系（The Normal
Hematopoietic System）」（Bloom及びThomas編,Churchill,Livingstion,N.Y.,1
981,566-615頁）中のビセル（Bithell）による「凝血（Blood Coagulation）」
を参照のこと。
的過程が関与するようになる。第一に、血小板が粘着性となって内皮結合組織構
造に結合するようになり、血小板血栓が形成される、血小板粘着過程が起こる。
第二に、血小板放出反応により、傷害を受けた血管の血管収縮を引き起こすセロ
トニンのような血管作用性アミンが生じる。第三の効果は、出血を阻止するため
の、内因性及び外因性の系の両方における蛋白質のカスケードを含む凝固過程の
誘発である。第四の重要な効果は、フィブリン血餅の分解、血管壁の治癒及び再
生をもたらす線維素熔解性系の活性化である。本発明は、凝固カスケードに関与
する蛋白質の製造に焦点を当てている。凝血の一般的な概説については、ダビエ
（Davie）らによる「凝血の基本メカニズム（Basic Mechanisms in Blood Coagu
lation）」（1975.Ann Rev Biochem 44:799）及び「正常な造血系（The Normal
Hematopoietic System）」（Bloom及びThomas編,Churchill,Livingstion,N.Y.,1
981,566-615頁）中のビセル（Bithell）による「凝血（Blood Coagulation）」
を参照のこと。
【０００４】 凝固カスケードの第一の役割は、初期の血小板血栓を安定化させることである
。この系は、血漿中に存在する12個を超える相互作用蛋白質及び放出又は活性化
された細胞蛋白質からなる。カスケードの各段階は、特定の不活（チモーゲン）
型から触媒活性を有する型へのプロテアーゼの活性化を含む。各蛋白質のチモー
ゲン型には、数個の例外を除き、ローマ数字表記が与えられており、活性型は、
下付の「a」が後ろに付いたローマ数字により表記される。カスケードの各段階
における活性型プロテアーゼは、カスケードにおける後続のプロテアーゼの活性
化を触媒する。このようにして、接触又は蛋白分解のいずれかを介した小さな初
期の刺激が、各段階で触媒的に増幅され、最終的には、血餅（血小板血栓）安定
化に必要な不溶性フィブリンの形成を触媒するトロンビンを大量発生させる。
。この系は、血漿中に存在する12個を超える相互作用蛋白質及び放出又は活性化
された細胞蛋白質からなる。カスケードの各段階は、特定の不活（チモーゲン）
型から触媒活性を有する型へのプロテアーゼの活性化を含む。各蛋白質のチモー
ゲン型には、数個の例外を除き、ローマ数字表記が与えられており、活性型は、
下付の「a」が後ろに付いたローマ数字により表記される。カスケードの各段階
における活性型プロテアーゼは、カスケードにおける後続のプロテアーゼの活性
化を触媒する。このようにして、接触又は蛋白分解のいずれかを介した小さな初
期の刺激が、各段階で触媒的に増幅され、最終的には、血餅（血小板血栓）安定
化に必要な不溶性フィブリンの形成を触媒するトロンビンを大量発生させる。
【０００５】 凝血蛋白質は、フィブリン血餅の形成をもたらす2つの密接に関連した凝血メ
カニズムに関与する。これらのメカニズムは、内因性及び外因性の凝固経路と呼
ばれる（図1）。内因性凝固経路は、XII因子と活性表面（例えば、損傷のない皮
膚、関節軟骨、血管基底膜、皮脂、長鎖脂肪酸等）との接触により、又はカリク
レインもしくはその他のいくつかの酵素活性化因子による液相蛋白分解により開
始される。続くXII因子の活性化により、X因子の活性化をもたらす、XI因子、IX
因子、VIII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（HWMK）、及び血小
板因子3（PF-3）を含む一連の反応が開始される。外因性凝固経路は、Ca2＋の存
在下で組織因子とVII因子との相互作用により開始され、やはりX因子を活性化す
る酵素の産生をもたらす。この経路は、接触活性化を必要としない。しかし、凝
固の接触相の初期に発生する蛋白分解活性により、VII因子の活性化が大きく増
強される。
カニズムに関与する。これらのメカニズムは、内因性及び外因性の凝固経路と呼
ばれる（図1）。内因性凝固経路は、XII因子と活性表面（例えば、損傷のない皮
膚、関節軟骨、血管基底膜、皮脂、長鎖脂肪酸等）との接触により、又はカリク
レインもしくはその他のいくつかの酵素活性化因子による液相蛋白分解により開
始される。続くXII因子の活性化により、X因子の活性化をもたらす、XI因子、IX
因子、VIII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（HWMK）、及び血小
板因子3（PF-3）を含む一連の反応が開始される。外因性凝固経路は、Ca2＋の存
在下で組織因子とVII因子との相互作用により開始され、やはりX因子を活性化す
る酵素の産生をもたらす。この経路は、接触活性化を必要としない。しかし、凝
固の接触相の初期に発生する蛋白分解活性により、VII因子の活性化が大きく増
強される。
【０００６】 凝血過程における次の段階は、内因性経路及び外因性経路の両方に共通である
ため、凝固の共通経路と呼ばれる。この経路には、X因子、V因子、PF-3、プロト
ロンビン、及びフィブリノーゲンが含まれ、X因子がIXa因子、PF-3、及びVIIIa
因子（内因性経路）により活性化されるか、又はVIIa因子及び組織因子（外因性
経路）により活性化されるか、に関わらず、本質的に同様に進行する。共通経路
の最後の段階において、可溶性重合体フィブリンが、XIIIa因子との相互作用を
通して不溶性血餅へと安定化される。
ため、凝固の共通経路と呼ばれる。この経路には、X因子、V因子、PF-3、プロト
ロンビン、及びフィブリノーゲンが含まれ、X因子がIXa因子、PF-3、及びVIIIa
因子（内因性経路）により活性化されるか、又はVIIa因子及び組織因子（外因性
経路）により活性化されるか、に関わらず、本質的に同様に進行する。共通経路
の最後の段階において、可溶性重合体フィブリンが、XIIIa因子との相互作用を
通して不溶性血餅へと安定化される。
【０００７】 現在薬理学的に価値がある、又はその可能性がある特定の凝固因子には、VIII
因子、IX因子、VII因子、XIII因子、トロンビン、フィブリン、及びフィブリノ
ーゲンが含まれる。特に、VIII因子及びIX因子は、それぞれ、2つの最も多い血
友病である血友病A（古典的血友病）及び血友病B（クリスマス病）の治療におい
て用いられている。血友病Aは、ヒト凝固VIII因子の欠損を特徴とする伴性の出
血障害である。同様に、血友病Bは、ヒト凝固IX因子の欠損から生じる伴性の出
血障害である。全血友病のおよそ80％が、VIII因子の欠損による。いずれの型の
血友病も、臨床的には、血餅安定化に必要な十分なフィブリン形成の欠如を引き
起こす。その結果、血友病患者は、血餅形成が比較的弱い部位における慢性的な
出血エピソードに苦しむ。凝固カスケードにおける他の蛋白質と比較して、VIII
因子及びIX因子の欠損の頻度が比較的高いのは、それらがX染色体と遺伝学的に
連鎖しているためである。X染色体を1コピーしかもたない男性においては、単一
の欠陥対立遺伝子が、血友病を引き起こす。その他の凝固因子の欠損は、常染色
体と連鎖しているため（即ち、一般的に、欠損を引き起こすには2コピーが必要
である）、血友病A及びBは、はるかに最も多い遺伝性凝血障害であり、ほとんど
男性に限定されているようである。
因子、IX因子、VII因子、XIII因子、トロンビン、フィブリン、及びフィブリノ
ーゲンが含まれる。特に、VIII因子及びIX因子は、それぞれ、2つの最も多い血
友病である血友病A（古典的血友病）及び血友病B（クリスマス病）の治療におい
て用いられている。血友病Aは、ヒト凝固VIII因子の欠損を特徴とする伴性の出
血障害である。同様に、血友病Bは、ヒト凝固IX因子の欠損から生じる伴性の出
血障害である。全血友病のおよそ80％が、VIII因子の欠損による。いずれの型の
血友病も、臨床的には、血餅安定化に必要な十分なフィブリン形成の欠如を引き
起こす。その結果、血友病患者は、血餅形成が比較的弱い部位における慢性的な
出血エピソードに苦しむ。凝固カスケードにおける他の蛋白質と比較して、VIII
因子及びIX因子の欠損の頻度が比較的高いのは、それらがX染色体と遺伝学的に
連鎖しているためである。X染色体を1コピーしかもたない男性においては、単一
の欠陥対立遺伝子が、血友病を引き起こす。その他の凝固因子の欠損は、常染色
体と連鎖しているため（即ち、一般的に、欠損を引き起こすには2コピーが必要
である）、血友病A及びBは、はるかに最も多い遺伝性凝血障害であり、ほとんど
男性に限定されているようである。
【０００８】 VIII因子は、血友病Aの治療において、そしてその他の研究及び商業的適用の
ため主に用いられている、高度に専門化された型の蛋白質である。VIII因子は、
活性化されると、凝血カスケード中で、内因系凝固経路のIX因子により媒介され
るX因子の活性化において、カルシウム・イオン及びリン脂質と共に補因子とし
て機能する、大きな糖蛋白質である。それは、トロンビンを含むいくつかの凝固
酵素による蛋白分解により活性化されうる。血漿由来のVIII因子は慢性的に供給
不足であり、従ってこの型の療法は非常に高価である。さらに、血漿から得られ
る薬学的生成物は、純度が非常に低く、蛋白質1ミリグラム当たりのVIII因子の
比活性は0.5から2ユニットである（VIII因子活性の1ユニットは、通常の血漿1ミ
リリットル中に存在する活性と定義される）。得られる血漿由来VIII因子の純度
は、典型的には重量で1％未満である（Woodら、1984.Nature 312:330）。極めて
低い純度は、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、ヒト・パルボウイルス、及びヒト免
疫不全ウイルス（HIV）の病原体の伝搬を含む多様な重大な合併症を引き起こす
。ヒト血漿由来VIII因子に関連したウイルス性病原体伝搬の問題を回避し、生産
物コストを低下させるため、VIII因子を多様な哺乳動物細胞培養系において発現
させることが成功している。最初、組換えVIII因子は、7kbの蛋白質コード領域
（Woodら、前記1984,Caponら、1997.米国特許第5618788号）の取り込みのため、
リン酸カルシウム共沈法（Simonsenら、1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2495,
Wiglerら、1979.Proc Natl Acad Sci USA 76:1373）を用いて、新生ハムスター
腎（baby hamster kidney/BHK）細胞系において作製された。活性を有する組換
えヒトVIII因子が、チャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞（Kaufmanら、19
88.J Biol Chem 263:6352）及びサルCOS-7細胞（Tooleら、1984.Nature 312:342
,Truettら、1985.DNA 4:333）においても作製されている。しかし、これらの哺
乳動物細胞系を用いたVIII因子の作製においては、ヒト病原体の伝搬の可能性が
排除されない。その結果、これらの細胞系は、ウイルス伝搬を防止するため生物
学的安全性の試験における付加的な品質保証試験が必要である。
ため主に用いられている、高度に専門化された型の蛋白質である。VIII因子は、
活性化されると、凝血カスケード中で、内因系凝固経路のIX因子により媒介され
るX因子の活性化において、カルシウム・イオン及びリン脂質と共に補因子とし
て機能する、大きな糖蛋白質である。それは、トロンビンを含むいくつかの凝固
酵素による蛋白分解により活性化されうる。血漿由来のVIII因子は慢性的に供給
不足であり、従ってこの型の療法は非常に高価である。さらに、血漿から得られ
る薬学的生成物は、純度が非常に低く、蛋白質1ミリグラム当たりのVIII因子の
比活性は0.5から2ユニットである（VIII因子活性の1ユニットは、通常の血漿1ミ
リリットル中に存在する活性と定義される）。得られる血漿由来VIII因子の純度
は、典型的には重量で1％未満である（Woodら、1984.Nature 312:330）。極めて
低い純度は、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、ヒト・パルボウイルス、及びヒト免
疫不全ウイルス（HIV）の病原体の伝搬を含む多様な重大な合併症を引き起こす
。ヒト血漿由来VIII因子に関連したウイルス性病原体伝搬の問題を回避し、生産
物コストを低下させるため、VIII因子を多様な哺乳動物細胞培養系において発現
させることが成功している。最初、組換えVIII因子は、7kbの蛋白質コード領域
（Woodら、前記1984,Caponら、1997.米国特許第5618788号）の取り込みのため、
リン酸カルシウム共沈法（Simonsenら、1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2495,
Wiglerら、1979.Proc Natl Acad Sci USA 76:1373）を用いて、新生ハムスター
腎（baby hamster kidney/BHK）細胞系において作製された。活性を有する組換
えヒトVIII因子が、チャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞（Kaufmanら、19
88.J Biol Chem 263:6352）及びサルCOS-7細胞（Tooleら、1984.Nature 312:342
,Truettら、1985.DNA 4:333）においても作製されている。しかし、これらの哺
乳動物細胞系を用いたVIII因子の作製においては、ヒト病原体の伝搬の可能性が
排除されない。その結果、これらの細胞系は、ウイルス伝搬を防止するため生物
学的安全性の試験における付加的な品質保証試験が必要である。
【０００９】 IX因子は、凝固カスケードの内因系経路におけるX因子の活性化を担うセリン
プロテアーゼのチモーゲンであり、血友病Bの治療において主に用いられている
。IX因子は、XIa因子により直接活性化される。IX因子は、通常、肝臓において
合成され、グリコシル化、特定のグルタミン酸残基のγ-カルボキシル化（DiSci
pioら、1979.Biochem.18:899）、及び単一のアスパラギン酸残基のβ-水酸化（M
cMullenら、1983 Biochem Biophys Res Commun 115:8）を含む多数の翻訳後修飾
を受ける。VIII因子と同様に、血漿精製及び哺乳動物細胞系の遺伝学的修飾によ
り、商業的に入手可能なIX因子が作製されている。
プロテアーゼのチモーゲンであり、血友病Bの治療において主に用いられている
。IX因子は、XIa因子により直接活性化される。IX因子は、通常、肝臓において
合成され、グリコシル化、特定のグルタミン酸残基のγ-カルボキシル化（DiSci
pioら、1979.Biochem.18:899）、及び単一のアスパラギン酸残基のβ-水酸化（M
cMullenら、1983 Biochem Biophys Res Commun 115:8）を含む多数の翻訳後修飾
を受ける。VIII因子と同様に、血漿精製及び哺乳動物細胞系の遺伝学的修飾によ
り、商業的に入手可能なIX因子が作製されている。
【００１０】 VII因子は、外因系凝固経路におけるX因子の活性化のため、組織因子と複合体
を形成する酵素のチモーゲンである。VII因子は、生理学的条件下でカリクレイ
ン及びXIIf因子により主に活性化されるが、Xa因子、プラスミン、及びIXa因子
も活性化を達成することが報告されている。IX因子と同様に、VII因子は、肝臓
で合成され、グリコシル化及び特定のグルタミン酸残基のγ-カルボキシル化を
受ける（O'Haraら、1987 Proc Natl Acad Sci USA 84:5158）。治療的には、VII a 因子は最初、免疫系応答によりVIII因子を受容できない血友病患者における重
度の出血エピソードの治療のため用いられた。しかし、現在では、それぞれ血友
病A及びBの治療におけるVIII因子及びIX因子の補充治療薬としての使用が考えら
れている。VII因子は、血流全体に拡散するというよりむしろ、傷害部位に直接
的に移動するため、これらの他の因子よりも凝固における効率がよいかもしれな
い。組換えVII因子は、現在、新生ハムスター腎（BHK）細胞系において活性化さ
れた型（VIIa因子）で作製されている。
を形成する酵素のチモーゲンである。VII因子は、生理学的条件下でカリクレイ
ン及びXIIf因子により主に活性化されるが、Xa因子、プラスミン、及びIXa因子
も活性化を達成することが報告されている。IX因子と同様に、VII因子は、肝臓
で合成され、グリコシル化及び特定のグルタミン酸残基のγ-カルボキシル化を
受ける（O'Haraら、1987 Proc Natl Acad Sci USA 84:5158）。治療的には、VII a 因子は最初、免疫系応答によりVIII因子を受容できない血友病患者における重
度の出血エピソードの治療のため用いられた。しかし、現在では、それぞれ血友
病A及びBの治療におけるVIII因子及びIX因子の補充治療薬としての使用が考えら
れている。VII因子は、血流全体に拡散するというよりむしろ、傷害部位に直接
的に移動するため、これらの他の因子よりも凝固における効率がよいかもしれな
い。組換えVII因子は、現在、新生ハムスター腎（BHK）細胞系において活性化さ
れた型（VIIa因子）で作製されている。
【００１１】 トロンビン及びXIII因子を含むその他の凝血因子は、創傷閉鎖において直接的
に用いられうる。トロンビンは、凝固カスケードにおけるいくつかの重要な反応
を触媒する多機能性蛋白質である（Mannら、1988 Ann Rev Biochem,57:915）。
一つの反応において、この酵素は、安定な血餅における主要成分であるフィブリ
ンへとフィブリノーゲンを変換する触媒として作用する。この反応に加え、トロ
ンビンは、血小板、並びにV因子、VIII因子、IX因子、及びXIII因子も活性化す
る。治療的には、トロンビンは、通常フィブリノーゲンと共に、組織密封剤にお
いて主に用いられている。トロンビンのチモーゲンであるプロトロンビンは、活
性のため特定のグルタミン酸残基のγ-カルボキシル化を必要とする。プロトロ
ンビン（Mr72,000）は、凝血の最終相に関与するビタミンK依存性糖蛋白質であ
る（Mannら、1980:CRC Handbook Series in Clinical Laboratory Science,Sect
ion I:Hematology Schmidt RM編 第3巻 15〜31頁 CRC Press Boca Raton Florid
a）。凝血過程において、プロトロンビンは、第一Xa因子部位の切断により活性
化され、プレトロンビン-2を形成し、次にそれが第二Xa因子部位において切断さ
れ、トロンビンを形成する。トロンビン（Mr34,000）は、単一のジスルフィド結
合により接続された259アミノ酸の重鎖及び49アミノ酸の軽鎖からなる（Friezne
r Degenら、1983 Biochem 22:2087、DiBellaら、1995 J Biol Chem 270:163）。
に用いられうる。トロンビンは、凝固カスケードにおけるいくつかの重要な反応
を触媒する多機能性蛋白質である（Mannら、1988 Ann Rev Biochem,57:915）。
一つの反応において、この酵素は、安定な血餅における主要成分であるフィブリ
ンへとフィブリノーゲンを変換する触媒として作用する。この反応に加え、トロ
ンビンは、血小板、並びにV因子、VIII因子、IX因子、及びXIII因子も活性化す
る。治療的には、トロンビンは、通常フィブリノーゲンと共に、組織密封剤にお
いて主に用いられている。トロンビンのチモーゲンであるプロトロンビンは、活
性のため特定のグルタミン酸残基のγ-カルボキシル化を必要とする。プロトロ
ンビン（Mr72,000）は、凝血の最終相に関与するビタミンK依存性糖蛋白質であ
る（Mannら、1980:CRC Handbook Series in Clinical Laboratory Science,Sect
ion I:Hematology Schmidt RM編 第3巻 15〜31頁 CRC Press Boca Raton Florid
a）。凝血過程において、プロトロンビンは、第一Xa因子部位の切断により活性
化され、プレトロンビン-2を形成し、次にそれが第二Xa因子部位において切断さ
れ、トロンビンを形成する。トロンビン（Mr34,000）は、単一のジスルフィド結
合により接続された259アミノ酸の重鎖及び49アミノ酸の軽鎖からなる（Friezne
r Degenら、1983 Biochem 22:2087、DiBellaら、1995 J Biol Chem 270:163）。
【００１２】 しかし、トロンビンへの活性化において、プロトロンビンの全てのGla含有残
基が切断される。ヒト・プロトロンビン（Jorgensenら、1987.J Biol Chem 262:
6729）及びトロンビン（Russoら、1997.Prot Expr Purif 10:214）はいずれも、
組換えチャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞技術を用いて作製に成功して
いる。
基が切断される。ヒト・プロトロンビン（Jorgensenら、1987.J Biol Chem 262:
6729）及びトロンビン（Russoら、1997.Prot Expr Purif 10:214）はいずれも、
組換えチャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞技術を用いて作製に成功して
いる。
【００１３】 XIII因子は、溶解に対する血餅の強度を増加させる、フィブリン分子間の分子
間γ-グルタミル-ε-リジン架橋の形成を触媒するXIIIa因子のヘテロ四量体（a2 b2）チモーゲンである（Lorand 1972.Ann NY Acad Sci 202:6）。初期の研究に
より、XIII因子の非グリコシル化Aドメインが、フィブリンの架橋の触媒にとっ
て充分であることが示されている（Maryら、1988.Biochim Biophys Acta 966:32
8）。その結果、機能性XIII因子Aドメインを大腸菌において作製することが成功
している（Amannら、1988.Behring Inst Mitt 82:35,Laiら、1994.Prot Expr Pu
rif 5:125）。XIII因子は、現在のところ治療的適用において用いられていない
が、創傷閉鎖補助剤としての将来的な使用が考えられている。
間γ-グルタミル-ε-リジン架橋の形成を触媒するXIIIa因子のヘテロ四量体（a2 b2）チモーゲンである（Lorand 1972.Ann NY Acad Sci 202:6）。初期の研究に
より、XIII因子の非グリコシル化Aドメインが、フィブリンの架橋の触媒にとっ
て充分であることが示されている（Maryら、1988.Biochim Biophys Acta 966:32
8）。その結果、機能性XIII因子Aドメインを大腸菌において作製することが成功
している（Amannら、1988.Behring Inst Mitt 82:35,Laiら、1994.Prot Expr Pu
rif 5:125）。XIII因子は、現在のところ治療的適用において用いられていない
が、創傷閉鎖補助剤としての将来的な使用が考えられている。
【００１４】 外来蛋白質作製のためのトランスジェニック植物の一般的な概説 トランスジェニック植物は、価値の高い医学的に重要な蛋白質、例えばモノク
ローナル抗体（Hiattら、1989.Nature 342:76、Duringら、1990.Plant Mol Biol
115:281,Benvenutoら、1991.Plant Mol Biol 17:865,Firekら、1993.Plant Mol
Biol 23:861,Magnusonら、1996.Prot Expr Purif 7:220）、ヒト成長ホルモン
（Keyら、1987.Science 236:1299）、ヒト血清アルブミン（Sijmonsら、1990.Bi
o/Technol 8:217）、ヒトα-インターフェロン（DeZoetenら、1989.Virology 17
2:213）、及びヒト・エリスロポエチン（Matsumotoら、1995.Plant Mol Biol 27
:1163）の作製のため用いられうる。細菌とは異なり、植物は、哺乳動物蛋白質
を活性型で産生するために必要な複雑な蛋白質プロセシング段階の多くを実施す
る。大部分の哺乳動物導入遺伝子産物が1％未満の可溶性蛋白質というレベルで
植物内に蓄積するが、ハイアット（Hiatt）ら（前記、1989）は、タバコにおけ
る最大1.3％の可溶性蛋白質というIgG抗体レベルを報告した。さらに、家畜にお
いて用いられる消化酵素であるフィターゼ（phytase）をトランスジェニック・
タバコにおいて作製する試みにおいて、14.4％の可溶性蛋白質という外来蛋白質
レベルが報告された（Penら、1993.Bio/Technol 11:811-814）。これらの努力に
も関わらず、本発明者らの知る限りにおいて、トランスジェニック植物からのヒ
ト凝血因子の作製の成功は報告されていない。
ローナル抗体（Hiattら、1989.Nature 342:76、Duringら、1990.Plant Mol Biol
115:281,Benvenutoら、1991.Plant Mol Biol 17:865,Firekら、1993.Plant Mol
Biol 23:861,Magnusonら、1996.Prot Expr Purif 7:220）、ヒト成長ホルモン
（Keyら、1987.Science 236:1299）、ヒト血清アルブミン（Sijmonsら、1990.Bi
o/Technol 8:217）、ヒトα-インターフェロン（DeZoetenら、1989.Virology 17
2:213）、及びヒト・エリスロポエチン（Matsumotoら、1995.Plant Mol Biol 27
:1163）の作製のため用いられうる。細菌とは異なり、植物は、哺乳動物蛋白質
を活性型で産生するために必要な複雑な蛋白質プロセシング段階の多くを実施す
る。大部分の哺乳動物導入遺伝子産物が1％未満の可溶性蛋白質というレベルで
植物内に蓄積するが、ハイアット（Hiatt）ら（前記、1989）は、タバコにおけ
る最大1.3％の可溶性蛋白質というIgG抗体レベルを報告した。さらに、家畜にお
いて用いられる消化酵素であるフィターゼ（phytase）をトランスジェニック・
タバコにおいて作製する試みにおいて、14.4％の可溶性蛋白質という外来蛋白質
レベルが報告された（Penら、1993.Bio/Technol 11:811-814）。これらの努力に
も関わらず、本発明者らの知る限りにおいて、トランスジェニック植物からのヒ
ト凝血因子の作製の成功は報告されていない。
【００１５】 遺伝子組換え植物に基づく治療用蛋白質の作製には、ヒト体液／組織、組換え
微生物、トランスフェクトされた動物細胞系、又はトランスジェニック動物を含
む他の作製起源と比較して、いくつかの利点がある。第一に、トランスジェニッ
ク植物の栽培は、組換え蛋白質の直接製造コストを有意に減少させうる。大規模
農業系の製造コストは生蛋白質産物1kg当たり6から60ドルと低く、1kg当たり250
ドルと現在推定されている大腸菌における組換え体の同様の直接製造コストより
も1桁以上低い（Kusnadiら、1997.Biotechnol Bioeng 56:473）。同等に重要な
点として、植物系は、多くのヒト・蛋白質治療薬において活性のため必要な複雑
な翻訳後修飾を実施することができる。内膜（endomembrane）ターゲティングの
ためのシグナル、シグナル・ペプチド切断、BiP又はその他のシャペロンにより
媒介される折り畳み及び重合化、N結合型グリコシル化、イソプレニル化、及び
スルフヒドリル架橋形成は、植物と動物との間で高度に保存されている（Chrisp
eelsら、1991.Int Rev Cytol,125:1,Bennettら、1991 Plant Genetic Engineeri
ng,Grierson編:199-237,Chapman and Hall,New York）。いくつかの報告におい
て、哺乳動物シグナル・ペプチドは、インプランタ（in planta）で認識され、
植物内膜系の正確なターゲティング及び蛋白質サブユニットの正確な組み立てを
もたらした（Hiattら、前記1989,Heinら、1991.Biotechnol Prog 7:455）。最後
に、植物はヒト又は動物の感染性病原体のための宿主として機能しないため、植
物に基づく組換え蛋白質は、生成物の安全性を増加させる（Cramerら、1996.Ann
NY Acad Sci 792:62）。
微生物、トランスフェクトされた動物細胞系、又はトランスジェニック動物を含
む他の作製起源と比較して、いくつかの利点がある。第一に、トランスジェニッ
ク植物の栽培は、組換え蛋白質の直接製造コストを有意に減少させうる。大規模
農業系の製造コストは生蛋白質産物1kg当たり6から60ドルと低く、1kg当たり250
ドルと現在推定されている大腸菌における組換え体の同様の直接製造コストより
も1桁以上低い（Kusnadiら、1997.Biotechnol Bioeng 56:473）。同等に重要な
点として、植物系は、多くのヒト・蛋白質治療薬において活性のため必要な複雑
な翻訳後修飾を実施することができる。内膜（endomembrane）ターゲティングの
ためのシグナル、シグナル・ペプチド切断、BiP又はその他のシャペロンにより
媒介される折り畳み及び重合化、N結合型グリコシル化、イソプレニル化、及び
スルフヒドリル架橋形成は、植物と動物との間で高度に保存されている（Chrisp
eelsら、1991.Int Rev Cytol,125:1,Bennettら、1991 Plant Genetic Engineeri
ng,Grierson編:199-237,Chapman and Hall,New York）。いくつかの報告におい
て、哺乳動物シグナル・ペプチドは、インプランタ（in planta）で認識され、
植物内膜系の正確なターゲティング及び蛋白質サブユニットの正確な組み立てを
もたらした（Hiattら、前記1989,Heinら、1991.Biotechnol Prog 7:455）。最後
に、植物はヒト又は動物の感染性病原体のための宿主として機能しないため、植
物に基づく組換え蛋白質は、生成物の安全性を増加させる（Cramerら、1996.Ann
NY Acad Sci 792:62）。
【００１６】 植物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換（An 1986.Plant Phy
siol 81:86,Hoekemaら、1985.Plant Mol Biol 5:8589）、微小発射体衝撃（micr
oprojectile bombardment）（Kleinら、Gene Transfer by Particle Bomberment
,Plant Tissue Culture Manual,D1,112pe-ji ,1991,Kluwer Academic Publisher
s）、花粉形質転換（Saundersら、1997.米国特許第5629183号）、プロトプラス
トによる化学媒介取り込み（Krensら、1982.Nature 296:72）、及びエレクトロ
ポレーション（Langridgeら、1985 Plant Cell Reports 4:355）を含む多様な方
法を用いて、外来DNAを発現するよう形質転換されうる。
siol 81:86,Hoekemaら、1985.Plant Mol Biol 5:8589）、微小発射体衝撃（micr
oprojectile bombardment）（Kleinら、Gene Transfer by Particle Bomberment
,Plant Tissue Culture Manual,D1,112pe-ji ,1991,Kluwer Academic Publisher
s）、花粉形質転換（Saundersら、1997.米国特許第5629183号）、プロトプラス
トによる化学媒介取り込み（Krensら、1982.Nature 296:72）、及びエレクトロ
ポレーション（Langridgeら、1985 Plant Cell Reports 4:355）を含む多様な方
法を用いて、外来DNAを発現するよう形質転換されうる。
【００１７】 アグロバクテリウム形質転換 A.ツメファシエンス（A.tumefaciens）は、広範囲の双子葉類及び裸子植物の
病気である根頭癌腫病の病因菌である（DeCleeneら、1976.Bot Rev 42:389）。A
.ツメファシエンスの毒性株は、大きな腫瘍誘導（Ti）プラスミド（約200kb）を
含有する。損傷を受けた植物又は植物組織をそのようなアグロバクテリウム株と
共に培養すると、T-DNAと呼ばれるTiプラスミドの一部が、感染された植物細胞
の核ゲノムに導入され、組み込まれる（Hernalsteensら、1980.Nature 287:654,
Lichtensteinら、1987.Genet Eng 6:104）。T-DNAによりコードされる遺伝子は
、植物組織で転写及び翻訳され、オーキシン、サイトキニン、及びオピンを合成
する。オーキシン及びサイトキニンのレベルの上昇は、急速な植物細胞増殖を引
き起こし、えい瘤を形成させる（Gheysenら、1985.DNA flux across genetic ba
rriers:the crown gall phenomenon,Genetic Flux in Plants, Hohnら編、Sprin
ger,Wein,11-49頁）。
病気である根頭癌腫病の病因菌である（DeCleeneら、1976.Bot Rev 42:389）。A
.ツメファシエンスの毒性株は、大きな腫瘍誘導（Ti）プラスミド（約200kb）を
含有する。損傷を受けた植物又は植物組織をそのようなアグロバクテリウム株と
共に培養すると、T-DNAと呼ばれるTiプラスミドの一部が、感染された植物細胞
の核ゲノムに導入され、組み込まれる（Hernalsteensら、1980.Nature 287:654,
Lichtensteinら、1987.Genet Eng 6:104）。T-DNAによりコードされる遺伝子は
、植物組織で転写及び翻訳され、オーキシン、サイトキニン、及びオピンを合成
する。オーキシン及びサイトキニンのレベルの上昇は、急速な植物細胞増殖を引
き起こし、えい瘤を形成させる（Gheysenら、1985.DNA flux across genetic ba
rriers:the crown gall phenomenon,Genetic Flux in Plants, Hohnら編、Sprin
ger,Wein,11-49頁）。
【００１８】 遺伝学的形質転換のためTiプラスミドを活用するため、えい瘤形成を担う天然
型T-DNA配列を、選択可能マーカー及び目的の遺伝子を含む外来DNAと交換するこ
とができる。T-DNA領域内のDNA導入に必要な成分は、左及び右の境界配列のみで
ある（Zambryskiら、1982.J Mol Appl Genet 1:361）。しかし、Tiプラスミドは
サイズが大きいためにインビトロで直接的に操作することが困難であるため、単
純化された系が開発された。最も進歩した方法は、インシス（in cis）で必要な
最小の要素を含有するバイナリー・ベクターの系を利用するものである（An 前
記 1986,An 1987.Meth Enzymol 153:292）。遺伝子導入メカニズムにとって必要
なその他の機能は、別のヘルパーTiプラスミドから与えられる。バイナリー・ベ
クターは、大腸菌宿主において直接的に操作され、二親（biparental）又は三親
（triparental）の接合を通して、ヘルパーTiプラスミドを含有するA.ツメファ
シエンスに転移されうる。最後に、植物材料と形質転換されたA.ツメファシエン
スとの共培養により、T-DNA領域が植物核ゲノムに組み込まれる。アグロバクテ
リウム法を用いて形質転換された代表的な組織には、タバコ（Bartonら、1983.C
ell 32:1033）、トマト（Fillattiら、1987.Bio/Technol 5:726）、ヒマワリ（E
verettら、1987.Bio/Technol 5:1201）、ワタ（Umbeckら、1987.Bio/Technol 5:
263）、ナタネ（Puaら、1987.Bio/Technol 5:815）、ジャガイモ（Facciottiら
、1985.Bio/Technol 3:241）、ポプラ（Pythoudら、1987.Bio/Technol 5:1323）
、及びダイズ（Hincheeら、1988.Bio/Technol 6:915）が含まれる。
型T-DNA配列を、選択可能マーカー及び目的の遺伝子を含む外来DNAと交換するこ
とができる。T-DNA領域内のDNA導入に必要な成分は、左及び右の境界配列のみで
ある（Zambryskiら、1982.J Mol Appl Genet 1:361）。しかし、Tiプラスミドは
サイズが大きいためにインビトロで直接的に操作することが困難であるため、単
純化された系が開発された。最も進歩した方法は、インシス（in cis）で必要な
最小の要素を含有するバイナリー・ベクターの系を利用するものである（An 前
記 1986,An 1987.Meth Enzymol 153:292）。遺伝子導入メカニズムにとって必要
なその他の機能は、別のヘルパーTiプラスミドから与えられる。バイナリー・ベ
クターは、大腸菌宿主において直接的に操作され、二親（biparental）又は三親
（triparental）の接合を通して、ヘルパーTiプラスミドを含有するA.ツメファ
シエンスに転移されうる。最後に、植物材料と形質転換されたA.ツメファシエン
スとの共培養により、T-DNA領域が植物核ゲノムに組み込まれる。アグロバクテ
リウム法を用いて形質転換された代表的な組織には、タバコ（Bartonら、1983.C
ell 32:1033）、トマト（Fillattiら、1987.Bio/Technol 5:726）、ヒマワリ（E
verettら、1987.Bio/Technol 5:1201）、ワタ（Umbeckら、1987.Bio/Technol 5:
263）、ナタネ（Puaら、1987.Bio/Technol 5:815）、ジャガイモ（Facciottiら
、1985.Bio/Technol 3:241）、ポプラ（Pythoudら、1987.Bio/Technol 5:1323）
、及びダイズ（Hincheeら、1988.Bio/Technol 6:915）が含まれる。
【００１９】 微小発射体衝撃 この方法においては、金又はタングステンDNAコーティングされた粒子が、標
的植物細胞に向かって加速される（Kleinら、1987.Nature 327:70）。この技術
は、トウモロコシ及びタバコの安定的に形質転換された培養物を得るため（Klei
nら、1988.Bio/Technol 6:559)、及びタマネギにおける一過性発現のために用い
られている。微小発射体衝撃の包括的な要約は、「Kleinら、Gene Transfer by
Particle Bomberment,Plant Tissue Culture Manual,D1,112頁,1991,Kluwer Aca
demic Publishers」に与えられている。
的植物細胞に向かって加速される（Kleinら、1987.Nature 327:70）。この技術
は、トウモロコシ及びタバコの安定的に形質転換された培養物を得るため（Klei
nら、1988.Bio/Technol 6:559)、及びタマネギにおける一過性発現のために用い
られている。微小発射体衝撃の包括的な要約は、「Kleinら、Gene Transfer by
Particle Bomberment,Plant Tissue Culture Manual,D1,112頁,1991,Kluwer Aca
demic Publishers」に与えられている。
【００２０】 花粉形質転換 花粉形質転換技術においては、エレクトロポレーションのような技術によりDN
Aを花粉粒子に導入し（Mishraら、1987.Plant Sci 52:135）、所望の植物系の卵
を形質転換された花粉と接合し、形質転換された生殖質を選択することにより、
植物の生殖質が外来DNAで形質転換される。種子を生じる発芽花粉及び子孫のそ
れぞれを、外来遺伝子の発現に関してスクリーニングすることができる。形質転
換された花粉は、単子葉類及び双子葉類の両方を含む類似又は非類似起源の植物
系に、外来DNAを導入するためのベクターとして用いられうる。現在までのとこ
ろ、タバコ及びトウモロコシ植物から収集された花粉が、エレクトロポレーショ
ンを介して安定的に形質転換されている（Saundersら、前記1997）。さらに、卵
を形質転換されたタバコ花粉と接合させることにより、タバコ植物が、β-グル
コロニダーゼを産生するよう安定的に形質転換されている。
Aを花粉粒子に導入し（Mishraら、1987.Plant Sci 52:135）、所望の植物系の卵
を形質転換された花粉と接合し、形質転換された生殖質を選択することにより、
植物の生殖質が外来DNAで形質転換される。種子を生じる発芽花粉及び子孫のそ
れぞれを、外来遺伝子の発現に関してスクリーニングすることができる。形質転
換された花粉は、単子葉類及び双子葉類の両方を含む類似又は非類似起源の植物
系に、外来DNAを導入するためのベクターとして用いられうる。現在までのとこ
ろ、タバコ及びトウモロコシ植物から収集された花粉が、エレクトロポレーショ
ンを介して安定的に形質転換されている（Saundersら、前記1997）。さらに、卵
を形質転換されたタバコ花粉と接合させることにより、タバコ植物が、β-グル
コロニダーゼを産生するよう安定的に形質転換されている。
【００２１】 プロトプラストによる化学媒介取り込み 化学的刺激によるDNA取り込みは、単子葉及び双子葉両方のプロトプラストの
直接的な形質転換のため開発された（Krensら、前記1982）。この方法において
は、標準的な技術を用いて、まず植物細胞壁を酵素的に分解し、プロトプラスト
を形成させる。次に、プロトプラスト及びベクターを、直接的な挿入による形質
転換を促進するポリエチレングリコールの存在下でインキュベートする。直接的
な遺伝子転移ベクター又はTiプラスミドのいずれかが、形質転換において用いら
れうる。プロトプラスト形質転換は、24から48時間以内に測定可能な遺伝子発現
を促進するため、この方法は多くの研究者により広く用いられている（Prolsら
、1988.Plant Cell Reports 7:221,Topferら、1988.Plant Cell Reports 7:225
）。
直接的な形質転換のため開発された（Krensら、前記1982）。この方法において
は、標準的な技術を用いて、まず植物細胞壁を酵素的に分解し、プロトプラスト
を形成させる。次に、プロトプラスト及びベクターを、直接的な挿入による形質
転換を促進するポリエチレングリコールの存在下でインキュベートする。直接的
な遺伝子転移ベクター又はTiプラスミドのいずれかが、形質転換において用いら
れうる。プロトプラスト形質転換は、24から48時間以内に測定可能な遺伝子発現
を促進するため、この方法は多くの研究者により広く用いられている（Prolsら
、1988.Plant Cell Reports 7:221,Topferら、1988.Plant Cell Reports 7:225
）。
【００２２】 エレクトロポレーション 適当なDNAの存在下でプロトプラストを電気パルスで処理することによる、植
物プロトプラストへのDNAの導入は、エレクトロポレーションと呼ばれる過程で
ある（Frommら、1985.Proc Natl Acad Sci USA 82:5824）。超らせん状又は環状
のプラスミドDNAを、プロトプラストの懸濁液に添加する。溶液を混合し、10か
ら100秒未満、室温にておよそ400V/cmのパルスを与える。膜の可逆的な物理的破
壊が起こり、DNAがプロトプラストに取り込まれるようになる。エレクトロポレ
ーション法の成功は、一部は、膜、DNA、及び電場に対するパラメータの最適化
に依存する。エレクトロポレーション後の形質転換の成功の証拠は、放射性標識
されたDNAの取り込み（Tsongら、1985.Biblio Haematol 51:108）、一過性遺伝
子発現（Potterら、1984.Proc Natl Acad Sci USA 81:7161,Smithiesら、1985.N
ature 317:230）、及び安定的な形質転換体の形成（Riggsら、1986.Proc Natl A
cad Sci USA 83:5602,Stopperら、1985.Z Naturforsch 40:929）により測定され
ている。エレクトロポレーションに関連した迅速な実行のため、この技術は、植
物プロモーター及びシス作用性要素の迅速な単離及び特徴決定に適用されること
が多い（Anら、1993.Techniques for isolating and characterizing plant tra
nscription promoters,enhancers,and promoters.Methods in Plant Molecular
Biology and Biotechnology,Glickら編、CRC Press,Boca Raton,155〜165頁）。
物プロトプラストへのDNAの導入は、エレクトロポレーションと呼ばれる過程で
ある（Frommら、1985.Proc Natl Acad Sci USA 82:5824）。超らせん状又は環状
のプラスミドDNAを、プロトプラストの懸濁液に添加する。溶液を混合し、10か
ら100秒未満、室温にておよそ400V/cmのパルスを与える。膜の可逆的な物理的破
壊が起こり、DNAがプロトプラストに取り込まれるようになる。エレクトロポレ
ーション法の成功は、一部は、膜、DNA、及び電場に対するパラメータの最適化
に依存する。エレクトロポレーション後の形質転換の成功の証拠は、放射性標識
されたDNAの取り込み（Tsongら、1985.Biblio Haematol 51:108）、一過性遺伝
子発現（Potterら、1984.Proc Natl Acad Sci USA 81:7161,Smithiesら、1985.N
ature 317:230）、及び安定的な形質転換体の形成（Riggsら、1986.Proc Natl A
cad Sci USA 83:5602,Stopperら、1985.Z Naturforsch 40:929）により測定され
ている。エレクトロポレーションに関連した迅速な実行のため、この技術は、植
物プロモーター及びシス作用性要素の迅速な単離及び特徴決定に適用されること
が多い（Anら、1993.Techniques for isolating and characterizing plant tra
nscription promoters,enhancers,and promoters.Methods in Plant Molecular
Biology and Biotechnology,Glickら編、CRC Press,Boca Raton,155〜165頁）。
【００２３】 植物（材料）再生法 植物組織の形質転換の後、安定的な形質転換体の特徴決定、選択、育種及び分
離分析、並びに外来蛋白質（凝血因子）産生のため、植物は再生されなければな
らない。植物は、カルス培養物、プロトプラスト、及びA.ツメファシエンス組織
（即ち、外植体又はカルス）を含む多様な組織から再生されうる。カルス組織か
らの再生は、トウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、及びライムギのような単
子葉類、並びにヒマワリ、ダイズ、ワタ、ナタネ、及びタバコのような双子葉類
において証明されている。
離分析、並びに外来蛋白質（凝血因子）産生のため、植物は再生されなければな
らない。植物は、カルス培養物、プロトプラスト、及びA.ツメファシエンス組織
（即ち、外植体又はカルス）を含む多様な組織から再生されうる。カルス組織か
らの再生は、トウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、及びライムギのような単
子葉類、並びにヒマワリ、ダイズ、ワタ、ナタネ、及びタバコのような双子葉類
において証明されている。
【００２４】 プロトプラストからの植物の再生は、エレクトロポレーション、PEG媒介形質
転換、又は微小粒子衝撃を含む直接的な遺伝子導入法により形質転換された組織
にとって特に有用である。プロトプラストからの植物の再生は、特に、コメ（Ab
dulahら、1987.Bio/Technol 4:1987）、タバコ（Potrykusら、1985.Mol Gen Gen
et 199:169）、ナタネ（Kanshaら、1986.Plant Cell Reports 5:101）、及びジ
ャガイモ（Tavazzaら、1986.Plant Cell Reports 5:243）において証明されてい
る。
転換、又は微小粒子衝撃を含む直接的な遺伝子導入法により形質転換された組織
にとって特に有用である。プロトプラストからの植物の再生は、特に、コメ（Ab
dulahら、1987.Bio/Technol 4:1987）、タバコ（Potrykusら、1985.Mol Gen Gen
et 199:169）、ナタネ（Kanshaら、1986.Plant Cell Reports 5:101）、及びジ
ャガイモ（Tavazzaら、1986.Plant Cell Reports 5:243）において証明されてい
る。
【００２５】 A.ツメファシエンスで形質転換された組織からの植物の再生は、特に、タバコ
（Horschら、1985.Science 225:1229,Hererra-Estrellaら、1983.Nature 303:20
9）、ヒマワリ（Evarettら、前記1987）、トマト（Fillattiら、前記1987）、ナ
タネ（Puaら、前記1987）、及びワタ（Umbeckら、前記1987）において証明され
ている。
（Horschら、1985.Science 225:1229,Hererra-Estrellaら、1983.Nature 303:20
9）、ヒマワリ（Evarettら、前記1987）、トマト（Fillattiら、前記1987）、ナ
タネ（Puaら、前記1987）、及びワタ（Umbeckら、前記1987）において証明され
ている。
【００２６】 発明の概要 本発明は、ヒト凝固因子をコードするDNA配列を含有するトランスジェニック
植物を目的とする。本発明者らは、驚くべきことに、正確にプロセシングされた
活性凝血因子が、インプランタ（in planta）で作製されうることを見出した。
本発明は、さらに、ヒト凝固因子が、ヒト凝固様の凝固促進活性もしくは凝固活
性を有する蛋白質、又はヒト凝固因子のアミノ酸配列と実質的に等価なアミノ酸
配列のいずれかとして産生される、トランスジェニック植物又は植物培養細胞中
の組成物を目的とする。
植物を目的とする。本発明者らは、驚くべきことに、正確にプロセシングされた
活性凝血因子が、インプランタ（in planta）で作製されうることを見出した。
本発明は、さらに、ヒト凝固因子が、ヒト凝固様の凝固促進活性もしくは凝固活
性を有する蛋白質、又はヒト凝固因子のアミノ酸配列と実質的に等価なアミノ酸
配列のいずれかとして産生される、トランスジェニック植物又は植物培養細胞中
の組成物を目的とする。
【００２７】 これらのトランスジェニック植物組成物は、血液因子交換（血友病）、創傷治
癒、又はヒト凝血因子について考えられるその他の治療的適用における使用にと
って必要な、ウイルスを含まない活性ヒト様凝血蛋白質を製造するために有用で
ある。現在の製造法は、ヒト血清の分画又はトランスジェニック哺乳動物細胞培
養法に依存しているため、ウイルス病原性が血液由来治療薬に関する主要な問題
である。これらの哺乳動物に基づく系はいずれも、得られる治療薬蛋白質のヒト
病原体による汚染を引き起こす、病原性ウイルスを保有している可能性がある。
植物系は、ヒト又は哺乳動物のウイルスを保有又は伝搬することは知られていな
い。
癒、又はヒト凝血因子について考えられるその他の治療的適用における使用にと
って必要な、ウイルスを含まない活性ヒト様凝血蛋白質を製造するために有用で
ある。現在の製造法は、ヒト血清の分画又はトランスジェニック哺乳動物細胞培
養法に依存しているため、ウイルス病原性が血液由来治療薬に関する主要な問題
である。これらの哺乳動物に基づく系はいずれも、得られる治療薬蛋白質のヒト
病原体による汚染を引き起こす、病原性ウイルスを保有している可能性がある。
植物系は、ヒト又は哺乳動物のウイルスを保有又は伝搬することは知られていな
い。
【００２８】 トランスジェニック植物は、既知の植物分子生物学的方法を用いて植物を形質
転換し、ヒト凝固因子をコードする一つ又は複数のDNA配列を含有するベクター
を構築することにより生産される。本明細書において「ヒト因子」、「凝固因子
」又は「凝固N因子」（ここで、Nは、これらに限定されないが、VIII、IX、XIII
、及びトロンビンを含む）という言及は、これらのうちのいずれか、又はこれら
の任意の組み合わせの言及を含みうる。本明細書の範囲は、この列挙に限定され
ず、人体における等価な機能を果たす任意の類似の因子、及びそのような因子の
任意の誘導体を含むものとする。トランスジェニック植物は、天然のプロセシン
グ・メカニズムにより、さらなる遺伝子組換え修飾により、及び／又はインビト
ロ・プロセシングにより、これらの血液因子蛋白質の必要な翻訳後修飾（例えば
、グリコシル化、折り畳み、及びペプチド切断）を行うことができるため、ヒト
様凝固因子の製造に有用である。これらの翻訳後修飾は、これらのヒト様凝固因
子の活性、安定性、及び除去の特性にとって重要である。
転換し、ヒト凝固因子をコードする一つ又は複数のDNA配列を含有するベクター
を構築することにより生産される。本明細書において「ヒト因子」、「凝固因子
」又は「凝固N因子」（ここで、Nは、これらに限定されないが、VIII、IX、XIII
、及びトロンビンを含む）という言及は、これらのうちのいずれか、又はこれら
の任意の組み合わせの言及を含みうる。本明細書の範囲は、この列挙に限定され
ず、人体における等価な機能を果たす任意の類似の因子、及びそのような因子の
任意の誘導体を含むものとする。トランスジェニック植物は、天然のプロセシン
グ・メカニズムにより、さらなる遺伝子組換え修飾により、及び／又はインビト
ロ・プロセシングにより、これらの血液因子蛋白質の必要な翻訳後修飾（例えば
、グリコシル化、折り畳み、及びペプチド切断）を行うことができるため、ヒト
様凝固因子の製造に有用である。これらの翻訳後修飾は、これらのヒト様凝固因
子の活性、安定性、及び除去の特性にとって重要である。
【００２９】 本発明の主題は、本明細書の特許請求の範囲において特に示され、明確に記載
される。しかし、組織、組成物、及び実施の方法は、それらのさらなる利点及び
目的と共に、添付の図面と合わせて以下の説明を参照することにより最も良好に
理解されると考えられる。なお、図面中、同様の参照記号は、同様の要素を指す
。
される。しかし、組織、組成物、及び実施の方法は、それらのさらなる利点及び
目的と共に、添付の図面と合わせて以下の説明を参照することにより最も良好に
理解されると考えられる。なお、図面中、同様の参照記号は、同様の要素を指す
。
【００３０】 詳細な説明 本発明は、（a）ヒト凝血因子及びヒト様凝血因子を発現することができる植
物、種子、及び植物組織、（b）投与時に凝血経路を誘導するためヒト血液にお
ける活性化応答を誘起することができる組成物、（c）血液因子交換、創傷治癒
、又はヒト凝血因子について考えられるその他の治療的適用に有用な組成物、（
d）ウイルスを含まないヒト様凝固因子を製造するための方法、（e）凝血因子を
コードするDNA配列を含有するユニークなベクター、及び（f）トランスジェニッ
ク植物において、ヒト及びヒト様の凝固促進活性もしくは凝固活性を有する蛋白
質、又はヒト凝固因子のアミノ酸配列と実質的に等価なアミノ酸配列を製造する
ための方法を包含する。本発明は、植物細胞が、生物学的な試験を実施し、生物
学的機能性を立証するために十分な量のヒトVIII因子を産生するよう、遺伝学的
に形質転換されうるという知見に基づいていた。同様に、これらに限定されない
が、IX因子、XIII因子、及びトロンビンのようなその他のヒト凝固因子を産生す
るよう植物を形質転換することも可能である。適当な生物学的機能性を確認した
後、商業的に実用的な量の凝固因子を産生するよう、トランスジェニック植物を
遺伝学的に操作することが可能である。本発明は、全ての点でこれらに関連した
態様を目的とする。
物、種子、及び植物組織、（b）投与時に凝血経路を誘導するためヒト血液にお
ける活性化応答を誘起することができる組成物、（c）血液因子交換、創傷治癒
、又はヒト凝血因子について考えられるその他の治療的適用に有用な組成物、（
d）ウイルスを含まないヒト様凝固因子を製造するための方法、（e）凝血因子を
コードするDNA配列を含有するユニークなベクター、及び（f）トランスジェニッ
ク植物において、ヒト及びヒト様の凝固促進活性もしくは凝固活性を有する蛋白
質、又はヒト凝固因子のアミノ酸配列と実質的に等価なアミノ酸配列を製造する
ための方法を包含する。本発明は、植物細胞が、生物学的な試験を実施し、生物
学的機能性を立証するために十分な量のヒトVIII因子を産生するよう、遺伝学的
に形質転換されうるという知見に基づいていた。同様に、これらに限定されない
が、IX因子、XIII因子、及びトロンビンのようなその他のヒト凝固因子を産生す
るよう植物を形質転換することも可能である。適当な生物学的機能性を確認した
後、商業的に実用的な量の凝固因子を産生するよう、トランスジェニック植物を
遺伝学的に操作することが可能である。本発明は、全ての点でこれらに関連した
態様を目的とする。
【００３１】 特定の凝血因子 凝固VIII因子 VIII因子は、内因性凝固経路におけるIXa因子により媒介されるX因子の活性化
においてカルシウム・イオン及びリン脂質と共に機能する補因子として、凝血カ
スケードにおいて機能する大きな糖蛋白質のチモーゲンである。VIII因子は、ト
ロンビンを含むいくつかの凝固酵素による蛋白分解により活性化されうる。
においてカルシウム・イオン及びリン脂質と共に機能する補因子として、凝血カ
スケードにおいて機能する大きな糖蛋白質のチモーゲンである。VIII因子は、ト
ロンビンを含むいくつかの凝固酵素による蛋白分解により活性化されうる。
【００３２】 VIII因子は、慢性的に供給不足であり、従って血友病A療法としてのその使用
は非常に高価である。さらに、血漿から得られる薬学的生成物は、純度が非常に
低く、蛋白質1ミリグラム当たりのVIII因子の比活性は0.5から2ユニットである
（VIII因子活性の1ユニットは、通常の血漿1ミリリットル中に存在する活性と定
義される）。得られる血漿由来VIII因子の純度は、典型的には重量で1％未満で
ある（Woodら、前記1984）。極めて低い純度は、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、
ヒト・パルボウイルス、及びヒト免疫不全ウイルス（HIV）の病原体の伝搬を含
む多様な重大な合併症を引き起こす。
は非常に高価である。さらに、血漿から得られる薬学的生成物は、純度が非常に
低く、蛋白質1ミリグラム当たりのVIII因子の比活性は0.5から2ユニットである
（VIII因子活性の1ユニットは、通常の血漿1ミリリットル中に存在する活性と定
義される）。得られる血漿由来VIII因子の純度は、典型的には重量で1％未満で
ある（Woodら、前記1984）。極めて低い純度は、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、
ヒト・パルボウイルス、及びヒト免疫不全ウイルス（HIV）の病原体の伝搬を含
む多様な重大な合併症を引き起こす。
【００３３】 300kDという相対量のVIII因子は、二価カチオン、おそらくCa2＋によりイオン
的に維持された重鎖ペプチド・セグメント及び軽鎖ペプチド・セグメントからな
るヘテロ二量体分子である。全長蛋白質コード配列は、ウッド（Wood）ら（前記
、1984）によりヒトX染色体が濃縮されたゲノミック・ライブラリーから回収さ
れる。この配列は、19アミノ酸のシグナル・ペプチドを含む2,351アミノ酸のポ
リペプチドと推定された。2,332アミノ酸の成熟蛋白質は、SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により決定されるように、グリコシル化を含む、330kDという分
子量を有する。糖鎖を持たないペプチドの分子量は、およそ265kDと計算される
。内部相同性が見出され、A1-A2-B-A3-C1-C2のように配置された、3重のAドメイ
ン、単独のBドメイン、及び2重のCドメインからなるVIII因子蛋白質のドメイン
構造が推定された（Gitschierら、1984.Nature 312:326,Tooleら、前記1984）。
単独のBドメインは、可能性のあるアスパラギン結合型グリコシル化部位25個の
うちの19個を含有し、凝固促進活性又は凝固活性にとって不必要なVIII因子の部
分に相当する。VIII因子は、N及びO結合型グリコシル化、軽鎖及び重鎖を生じる
残基1648のアルギニンの後における一次翻訳蛋白質の切断、並びに軽鎖及び重鎖
の金属イオン会合を含む、多数の翻訳後プロセシングをインビボで受ける（Kauf
manら、前記1988）。
的に維持された重鎖ペプチド・セグメント及び軽鎖ペプチド・セグメントからな
るヘテロ二量体分子である。全長蛋白質コード配列は、ウッド（Wood）ら（前記
、1984）によりヒトX染色体が濃縮されたゲノミック・ライブラリーから回収さ
れる。この配列は、19アミノ酸のシグナル・ペプチドを含む2,351アミノ酸のポ
リペプチドと推定された。2,332アミノ酸の成熟蛋白質は、SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により決定されるように、グリコシル化を含む、330kDという分
子量を有する。糖鎖を持たないペプチドの分子量は、およそ265kDと計算される
。内部相同性が見出され、A1-A2-B-A3-C1-C2のように配置された、3重のAドメイ
ン、単独のBドメイン、及び2重のCドメインからなるVIII因子蛋白質のドメイン
構造が推定された（Gitschierら、1984.Nature 312:326,Tooleら、前記1984）。
単独のBドメインは、可能性のあるアスパラギン結合型グリコシル化部位25個の
うちの19個を含有し、凝固促進活性又は凝固活性にとって不必要なVIII因子の部
分に相当する。VIII因子は、N及びO結合型グリコシル化、軽鎖及び重鎖を生じる
残基1648のアルギニンの後における一次翻訳蛋白質の切断、並びに軽鎖及び重鎖
の金属イオン会合を含む、多数の翻訳後プロセシングをインビボで受ける（Kauf
manら、前記1988）。
【００３４】 ヒト血漿由来VIII因子に関連したウイルス性病原体伝搬の問題を回避し、生産
物コストを低下させるため、VIII因子を多様な哺乳動物細胞培養系において発現
させることが成功している。最初、VIII因子は、7kbの蛋白質コード領域（Wood
ら、前記1984,Caponら、1997）の取り込みのため、リン酸カルシウム共沈法（Si
monsenら、前記1983,Wiglerら、前記1979）を用いて、新生ハムスター腎（BHK）
細胞系において発現された。この特定の研究において、エピトープ・スクリーニ
ングにより決定された得られたVIII因子レベルは、対照T細胞ハイブリドーマと
比較して300倍増加していた。コーテスト（Coatest）アッセイ法を用いて決定さ
れたIXa因子の有意な活性化が、トランスフェクトされたBHK細胞において見られ
た。活性を有する組換えヒトVIII因子が、チャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO
）細胞（Kaufmanら、前記1988）及びサルCOS-7細胞（Tooleら、前記1984,Truett
ら、前記1985）においても作製されている。しかし、これらの哺乳動物細胞系を
用いたVIII因子の作製においては、ヒト病原体の伝搬の可能性が完全には排除さ
れない。その結果、これらの細胞系は、生物学的安全性の試験において、インビ
ボ及びインビトロのウイルス試験、並びにマイコプラズマ検出が必要であると考
えられる。
物コストを低下させるため、VIII因子を多様な哺乳動物細胞培養系において発現
させることが成功している。最初、VIII因子は、7kbの蛋白質コード領域（Wood
ら、前記1984,Caponら、1997）の取り込みのため、リン酸カルシウム共沈法（Si
monsenら、前記1983,Wiglerら、前記1979）を用いて、新生ハムスター腎（BHK）
細胞系において発現された。この特定の研究において、エピトープ・スクリーニ
ングにより決定された得られたVIII因子レベルは、対照T細胞ハイブリドーマと
比較して300倍増加していた。コーテスト（Coatest）アッセイ法を用いて決定さ
れたIXa因子の有意な活性化が、トランスフェクトされたBHK細胞において見られ
た。活性を有する組換えヒトVIII因子が、チャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO
）細胞（Kaufmanら、前記1988）及びサルCOS-7細胞（Tooleら、前記1984,Truett
ら、前記1985）においても作製されている。しかし、これらの哺乳動物細胞系を
用いたVIII因子の作製においては、ヒト病原体の伝搬の可能性が完全には排除さ
れない。その結果、これらの細胞系は、生物学的安全性の試験において、インビ
ボ及びインビトロのウイルス試験、並びにマイコプラズマ検出が必要であると考
えられる。
【００３５】 初期の哺乳動物細胞培養作製研究を超えて、発現レベルを増加させ、患者にお
ける望ましくない免疫応答を減少させるため、組換えVIII因子のいくつかの修飾
が分子レベルでなされた。VIII因子をコードするcDNAのBドメインの欠失は、外
来ペプチドの生物学的活性に影響を与えることなく、遺伝学的に修飾されたチャ
イニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞における発現を増加させることが示され
た（Pittmanら、1993.Blood 81:2925）。同様に、A1ドメインのカルボキシ末端
の110アミノ酸配列をV因子のA1ドメイン由来の相同配列と交換することにより、
哺乳動物細胞培養系におけるVIII因子の分泌は10倍増加した（Marquetteら、199
5.J Biol Chem 270:10297）。交換された領域においては、BiPとの結合能を有し
、従って分泌を阻害する、複数の短いペプチド配列がクラスターを形成している
。又、VIII因子の重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインの正確な組み立て、並びにその
後の構築物の生物学的活性にとって、フォンビルブランド因子の付加も必要であ
る場合がある（Wiseら、1991.J Biol Chem 266:21948）。フォンビルブランド因
子は、哺乳動物細胞培養適用においてインビトロでVIII因子を安定化させること
が示されている、複雑な多量体構造の大きな（220kD）糖蛋白質である（Kaufman
ら、前記1988）。
ける望ましくない免疫応答を減少させるため、組換えVIII因子のいくつかの修飾
が分子レベルでなされた。VIII因子をコードするcDNAのBドメインの欠失は、外
来ペプチドの生物学的活性に影響を与えることなく、遺伝学的に修飾されたチャ
イニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞における発現を増加させることが示され
た（Pittmanら、1993.Blood 81:2925）。同様に、A1ドメインのカルボキシ末端
の110アミノ酸配列をV因子のA1ドメイン由来の相同配列と交換することにより、
哺乳動物細胞培養系におけるVIII因子の分泌は10倍増加した（Marquetteら、199
5.J Biol Chem 270:10297）。交換された領域においては、BiPとの結合能を有し
、従って分泌を阻害する、複数の短いペプチド配列がクラスターを形成している
。又、VIII因子の重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインの正確な組み立て、並びにその
後の構築物の生物学的活性にとって、フォンビルブランド因子の付加も必要であ
る場合がある（Wiseら、1991.J Biol Chem 266:21948）。フォンビルブランド因
子は、哺乳動物細胞培養適用においてインビトロでVIII因子を安定化させること
が示されている、複雑な多量体構造の大きな（220kD）糖蛋白質である（Kaufman
ら、前記1988）。
【００３６】 さらに、VIII因子のA2ドメイン及びC2ドメインが、大部分の阻害的なアロ抗体
及び自己抗体の標的となるエピトープを含有することが見出された（Lubinら、1
994.J Biol Chem 269:8639）。ヒト阻害剤は通常ブタVIII因子との限定された反
応を示すか、又は全く示さないため、推定ヒトA2ドメイン配列（残基387〜604）
を相同ブタ配列と交換することにより、組換えヒト／ブタVIII因子分子が構築さ
れた。このハイブリッドは、A2ドメイン・エピトープ特異的抗体の存在下で完全
な活性を維持していたが、抗C2抗体の存在下では不活化された。
及び自己抗体の標的となるエピトープを含有することが見出された（Lubinら、1
994.J Biol Chem 269:8639）。ヒト阻害剤は通常ブタVIII因子との限定された反
応を示すか、又は全く示さないため、推定ヒトA2ドメイン配列（残基387〜604）
を相同ブタ配列と交換することにより、組換えヒト／ブタVIII因子分子が構築さ
れた。このハイブリッドは、A2ドメイン・エピトープ特異的抗体の存在下で完全
な活性を維持していたが、抗C2抗体の存在下では不活化された。
【００３７】 本明細書に報告された研究の他には、哺乳動物細胞以外の組換え宿主における
VIII因子の製造は、まだ完全には成功していない。VIII因子は活性のためにグル
タミン酸残基のγ-カルボキシル化を必要としないが、VIII因子は25個の異なる
グリコシル化部位を有しているため、グリコシル化が活性にとって必要である場
合には特に、原核宿主生物を製造に用いることは不可能であるかもしれない。さ
らに、蛋白質コード領域が大きい（7.3kD）ため、多くの原核宿主及び下等真核
宿主は使用不可であるかもしれない。
VIII因子の製造は、まだ完全には成功していない。VIII因子は活性のためにグル
タミン酸残基のγ-カルボキシル化を必要としないが、VIII因子は25個の異なる
グリコシル化部位を有しているため、グリコシル化が活性にとって必要である場
合には特に、原核宿主生物を製造に用いることは不可能であるかもしれない。さ
らに、蛋白質コード領域が大きい（7.3kD）ため、多くの原核宿主及び下等真核
宿主は使用不可であるかもしれない。
【００３８】 凝固因子IX IX因子またはクリスマス因子は、内因性凝固経路に関係するセリンプロテアー
ゼのチモーゲンであり、VIIIa因子、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、X
因子を特異的に活性化する。IX因子は、世界中に一万人以上の患者がいる血友病
B（ヒトIX因子の特異的欠乏）の治療に用いられる。VIII因子同様、血漿由来IX
因子の濃縮物の不純物は、A型、B型、C型肝炎、ヒトパルボウィルス、及びヒト
免疫不全ウィルス（HIV）の病原体の感染を含む様々な深刻な合併症を引き起こ
す可能性がある。
ゼのチモーゲンであり、VIIIa因子、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、X
因子を特異的に活性化する。IX因子は、世界中に一万人以上の患者がいる血友病
B（ヒトIX因子の特異的欠乏）の治療に用いられる。VIII因子同様、血漿由来IX
因子の濃縮物の不純物は、A型、B型、C型肝炎、ヒトパルボウィルス、及びヒト
免疫不全ウィルス（HIV）の病原体の感染を含む様々な深刻な合併症を引き起こ
す可能性がある。
【００３９】 約56kDの該成熟蛋白質は416のアミノ酸から成り、アミノ末端近くの12γ-カル
ボキシグルタミン酸（Gla）残基、及び64位のβ-ヒドロキシアスパラギン酸（Hy
a）残基を含む。これらのグルタミン酸残基の少なくとも一部のビタミンK依存性
γ-カルボキシル化は、IX因子活性に必要である。Gla残基はIX因子への金属結合
特性を有し、膜結合特性及び凝固活性の発現に不可欠な二つの連続した配置変化
が可能となる（Borowskiら、1986. J Biol Chem 261: 14969, Liebmanら、1985.
Thromb Haemost 54: 226）。残基64のアスパラギン酸のβヒドロキシル化は、I
X因子凝血促進性機能に必要ではないようである（Derianら、1989. J Biol Chem
264: 6615）。IX因子の活性はXIa因子、及び複数の別のセリンプロテアーゼに
触媒され、その結果活性化ペプチド（35アミノ酸）及び、ジスルフィド結合で結
ばれた軽鎖（145アミノ酸）／重鎖（236アミノ酸）複合体を形成する（Kurachi
ら、1982. Proc Natl Acad Sci USA 79: 6461）。
ボキシグルタミン酸（Gla）残基、及び64位のβ-ヒドロキシアスパラギン酸（Hy
a）残基を含む。これらのグルタミン酸残基の少なくとも一部のビタミンK依存性
γ-カルボキシル化は、IX因子活性に必要である。Gla残基はIX因子への金属結合
特性を有し、膜結合特性及び凝固活性の発現に不可欠な二つの連続した配置変化
が可能となる（Borowskiら、1986. J Biol Chem 261: 14969, Liebmanら、1985.
Thromb Haemost 54: 226）。残基64のアスパラギン酸のβヒドロキシル化は、I
X因子凝血促進性機能に必要ではないようである（Derianら、1989. J Biol Chem
264: 6615）。IX因子の活性はXIa因子、及び複数の別のセリンプロテアーゼに
触媒され、その結果活性化ペプチド（35アミノ酸）及び、ジスルフィド結合で結
ばれた軽鎖（145アミノ酸）／重鎖（236アミノ酸）複合体を形成する（Kurachi
ら、1982. Proc Natl Acad Sci USA 79: 6461）。
【００４０】 部分活性を有する組換えヒトIX因子は、ヒト肝腫瘍細胞（De la Salleら、198
5. Nature 316: 268）、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（CHO）（Kaufmanら
、1986. L Biol Chem 261: 9622）、及び新生児ハムスター腎細胞（BHK）（Busb
yら、1985 Nature 316: 271）で産生されている。CHO細胞由来組換えIX因子は、
12のグルタミン酸残基のうち平均6.5個をγ-カルボキシル化するためにビタミン
Kを必要とした。このγ-カルボキシル化のレベルで、組換えIX因子は、血漿由来
の完全カルボキシル化IX因子の特異的活性の約50％を保持していた。IX因子の部
分カルボキシル固定形態には、非不可欠γ-カルボキシグルタミン酸のみが欠失
している場合に、部分的に活性する可能性が高いものがある（Kaufmanら、上記1
986）。IX因子のγ-カルボキシル化は、また、ウシ肝臓由来の部分精製カルボキ
シル化酵素系を用いてインビトロで行われてきた。このインビトロ系の使用によ
り、見かけ上のカルボキシル化レベルがIX因子一分子につき3残基から8残基に上
昇される（Souteら、1989. Thromb Haemost 61: 238）。
5. Nature 316: 268）、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（CHO）（Kaufmanら
、1986. L Biol Chem 261: 9622）、及び新生児ハムスター腎細胞（BHK）（Busb
yら、1985 Nature 316: 271）で産生されている。CHO細胞由来組換えIX因子は、
12のグルタミン酸残基のうち平均6.5個をγ-カルボキシル化するためにビタミン
Kを必要とした。このγ-カルボキシル化のレベルで、組換えIX因子は、血漿由来
の完全カルボキシル化IX因子の特異的活性の約50％を保持していた。IX因子の部
分カルボキシル固定形態には、非不可欠γ-カルボキシグルタミン酸のみが欠失
している場合に、部分的に活性する可能性が高いものがある（Kaufmanら、上記1
986）。IX因子のγ-カルボキシル化は、また、ウシ肝臓由来の部分精製カルボキ
シル化酵素系を用いてインビトロで行われてきた。このインビトロ系の使用によ
り、見かけ上のカルボキシル化レベルがIX因子一分子につき3残基から8残基に上
昇される（Souteら、1989. Thromb Haemost 61: 238）。
【００４１】 凝固因子XIII 血管損傷後XIII因子が能してフィブリン分子間のγ-グルタミル-εリジル共有
結合の形成を触媒し、フィブリン凝固の形成を強化する。この凝固強化能により
、外因性XIII因子は創傷治癒剤として、この種の利用が現在のところ認可されて
いないにもかかわらず期待されている。構造的には血漿由来XIII因子は、二つの
A鎖（81kD）及び二つのB鎖（75kD）から成る四量体である（Laiら、上記1994）
。血小板及び胎盤由来XIII因子は、一つのA鎖ホモダイマーのみから成る。A鎖は
XIII因子の触媒ドメインを有しており、グリコシル化されておらずジスルフィド
結合もしていないと考えられる。B鎖は血漿中のXIIIa因子の□-トロンビン媒介
蛋白質分解不活性化を妨げると考えられる（Maryら、上記1994）。XIII因子の活
性化は、A鎖のN末端から4kDの活性化ペプチドのトロンビン切断により開始され
る。B鎖が存在すれば、その後、残りの分子によりカルシウム依存性解離を受け
る。
結合の形成を触媒し、フィブリン凝固の形成を強化する。この凝固強化能により
、外因性XIII因子は創傷治癒剤として、この種の利用が現在のところ認可されて
いないにもかかわらず期待されている。構造的には血漿由来XIII因子は、二つの
A鎖（81kD）及び二つのB鎖（75kD）から成る四量体である（Laiら、上記1994）
。血小板及び胎盤由来XIII因子は、一つのA鎖ホモダイマーのみから成る。A鎖は
XIII因子の触媒ドメインを有しており、グリコシル化されておらずジスルフィド
結合もしていないと考えられる。B鎖は血漿中のXIIIa因子の□-トロンビン媒介
蛋白質分解不活性化を妨げると考えられる（Maryら、上記1994）。XIII因子の活
性化は、A鎖のN末端から4kDの活性化ペプチドのトロンビン切断により開始され
る。B鎖が存在すれば、その後、残りの分子によりカルシウム依存性解離を受け
る。
【００４２】 大腸菌に基づいた組換えXIIIA因子鎖産生の最初の試みで、適切な大きさで、
また抗-XIII因子抗体に免疫反応性の不活性生成物が産生された（Amannら、上記
1988）。その後の研究で、活性A鎖を大腸菌JM105株で発現させた（Lai et al上
記1994）。ゲル濾過分析で二量体として作用する得られた蛋白質は、トロンビン
-及びカルシウム-活性化架橋フィブリンで、精製血漿XIII因子と同程度にフィブ
リンと結合した。
また抗-XIII因子抗体に免疫反応性の不活性生成物が産生された（Amannら、上記
1988）。その後の研究で、活性A鎖を大腸菌JM105株で発現させた（Lai et al上
記1994）。ゲル濾過分析で二量体として作用する得られた蛋白質は、トロンビン
-及びカルシウム-活性化架橋フィブリンで、精製血漿XIII因子と同程度にフィブ
リンと結合した。
【００４３】 トロンビン トロンビンは制限的蛋白質分解によりフィブリノーゲンをフィブリンに変換し
、共通の凝血経路の最終段階でフィブリノペプチドA及びBを放出するセリンプロ
テアーゼ（Mr=34kD）である。フィブリンは鬱血につながる架橋マトリックス（
凝血）を形成する。トロンビンは現在、局所性鬱血の治療に使用されている。
、共通の凝血経路の最終段階でフィブリノペプチドA及びBを放出するセリンプロ
テアーゼ（Mr=34kD）である。フィブリンは鬱血につながる架橋マトリックス（
凝血）を形成する。トロンビンは現在、局所性鬱血の治療に使用されている。
【００４４】 肝臓で合成される、トロンビンに対応するチモーゲンであるプロトロンビン（
Mr=72kD）は、Va因子、カルシウムイオン、及びリン脂質の存在下で内因性経路
においてXa因子によるマイナーな蛋白質分解によってトロンビンへと変換される
（Friezner Deganら、上記1983）。内因性経路でVIIa因子及び組織因子との相互
関連を通してプロトロンビンが活性化される（Nemersonら、1985. Thrombosis R
es. 40: 351）。VII因子のようにプロトロンビンは、N末端から最初の40アミノ
酸内に10のγ-カルボキシグルタミン酸残基を有する。これらの残基はプロトロ
ンビンのプロトロンビナーゼへの付着に必要で、プロトロンビンの活性化中、反
応ペプチドにより取り除かれる。γ-カルボキシル化は、膜結合ビタミンK依存性
カルボキシラーゼにより達成される（MacGillivrayら、Biochem, 23: 1626）。
Mr=72kD）は、Va因子、カルシウムイオン、及びリン脂質の存在下で内因性経路
においてXa因子によるマイナーな蛋白質分解によってトロンビンへと変換される
（Friezner Deganら、上記1983）。内因性経路でVIIa因子及び組織因子との相互
関連を通してプロトロンビンが活性化される（Nemersonら、1985. Thrombosis R
es. 40: 351）。VII因子のようにプロトロンビンは、N末端から最初の40アミノ
酸内に10のγ-カルボキシグルタミン酸残基を有する。これらの残基はプロトロ
ンビンのプロトロンビナーゼへの付着に必要で、プロトロンビンの活性化中、反
応ペプチドにより取り除かれる。γ-カルボキシル化は、膜結合ビタミンK依存性
カルボキシラーゼにより達成される（MacGillivrayら、Biochem, 23: 1626）。
【００４５】 ヒトプロトロンビンcDNAを、ビタミンK存在下でCHO細胞内で発現させ、血漿由
来プロトロンビンの特異的凝固活性に相当する特異的凝固活性を有する完全γ-
カルボキシル化された蛋白質を産生した（Jorgensenら、上記1987）。関連の研
究では、プロトロンビン活性化における中間体であるプレトロンビン-2をCHO細
胞（Rossoら、上記1997）、及び大腸菌（DiBellaら、上記1995）にクローニング
した。プレトロンビン-2にはプロトロンビンのN末端前駆配列はないが、しかし
、特徴的なトロンビン軽鎖及び重鎖を形成するために切断されていない。得られ
た組換えプレトロンビン-2は、エキス・カリナタス（Echis carinatus）蛇毒由
来のプロテアーゼであるエカリンにより蛋白質を分解して活性化した。大腸菌由
来プレトロンビン-2も、活性化の前の再折り畳みに必要であった。
来プロトロンビンの特異的凝固活性に相当する特異的凝固活性を有する完全γ-
カルボキシル化された蛋白質を産生した（Jorgensenら、上記1987）。関連の研
究では、プロトロンビン活性化における中間体であるプレトロンビン-2をCHO細
胞（Rossoら、上記1997）、及び大腸菌（DiBellaら、上記1995）にクローニング
した。プレトロンビン-2にはプロトロンビンのN末端前駆配列はないが、しかし
、特徴的なトロンビン軽鎖及び重鎖を形成するために切断されていない。得られ
た組換えプレトロンビン-2は、エキス・カリナタス（Echis carinatus）蛇毒由
来のプロテアーゼであるエカリンにより蛋白質を分解して活性化した。大腸菌由
来プレトロンビン-2も、活性化の前の再折り畳みに必要であった。
【００４６】 植物形質転換ベクター 本発明のベクターは特異的凝固因子をコードするDNAを含み、植物を形質転換
できる。外来DNAとは、形質転換する生物にとって外因性の、または該生物内で
は天然には見つからないDNAである。外来DNAをクローニングベクターに挿入し、
植物を形質転換することができ、外来DNAは特異的凝血因子をコードするDNAに由
来するか、または該DNAとかなりの配列相同性を有する。本発明における植物発
現ベクターは、標準的分子クローニングの手順（Ausubelら、Current protocols
in molecular biology. Wiley, New York）及びスプライシングPCR技術（Marks
et al, 1992, J Biol Chem 267: 16007）を用いて生産できる。しかしながら、
産生されたベクターは形質転換の種類及び形質転換する植物種による。Tiプラス
ミド由来ベクターは、植物体全体及び培養植物細胞のアグロバクテリウム属媒介
形質転換に適している。植物プロトプラストのエレクトロポレーションにおいて
、Tiプラスミドまたは別の適当な直接的遺伝子導入ベクターを用いて形質転換を
行うことができる。特定の植物組織を形質転換する場合には、これらの組織で活
性な適切なベクターを使用しなければならない。植物発現ベクターの具体的な例
は、ホエケマら（Hoekema）（上記1985）、ムシーギアンら（Mushegian）（1995
. Microbiol Rev 59: 548）及びAn（上記1987）により示されている。
できる。外来DNAとは、形質転換する生物にとって外因性の、または該生物内で
は天然には見つからないDNAである。外来DNAをクローニングベクターに挿入し、
植物を形質転換することができ、外来DNAは特異的凝血因子をコードするDNAに由
来するか、または該DNAとかなりの配列相同性を有する。本発明における植物発
現ベクターは、標準的分子クローニングの手順（Ausubelら、Current protocols
in molecular biology. Wiley, New York）及びスプライシングPCR技術（Marks
et al, 1992, J Biol Chem 267: 16007）を用いて生産できる。しかしながら、
産生されたベクターは形質転換の種類及び形質転換する植物種による。Tiプラス
ミド由来ベクターは、植物体全体及び培養植物細胞のアグロバクテリウム属媒介
形質転換に適している。植物プロトプラストのエレクトロポレーションにおいて
、Tiプラスミドまたは別の適当な直接的遺伝子導入ベクターを用いて形質転換を
行うことができる。特定の植物組織を形質転換する場合には、これらの組織で活
性な適切なベクターを使用しなければならない。植物発現ベクターの具体的な例
は、ホエケマら（Hoekema）（上記1985）、ムシーギアンら（Mushegian）（1995
. Microbiol Rev 59: 548）及びAn（上記1987）により示されている。
【００４７】 特に、例えばMC1000のような大腸菌宿主を用いて、ベクターを構築できる。こ
れらのベクターは、プロトプラストのエレクトロポレーションまたはマイクロイ
ンジェクションのような、直接的遺伝子導入法に直接用いることができる。アグ
ロバクテリウム属媒介形質転換法を用いる場合には、ベクターはなかでも、A.ツ
メファシエンス(tumefaciens) LBA4404のような適切な株にまず導入しなければ
ならない。該ベクターは、特に「凍結-融解」法を用いて大腸菌からアグロバク
テリウム属へ導入することが可能である（Anら、1988. In Plant Molecular Bio
logy Manual A3, pp. 1-19, Kluwer Academic, Dordrecht）。
れらのベクターは、プロトプラストのエレクトロポレーションまたはマイクロイ
ンジェクションのような、直接的遺伝子導入法に直接用いることができる。アグ
ロバクテリウム属媒介形質転換法を用いる場合には、ベクターはなかでも、A.ツ
メファシエンス(tumefaciens) LBA4404のような適切な株にまず導入しなければ
ならない。該ベクターは、特に「凍結-融解」法を用いて大腸菌からアグロバク
テリウム属へ導入することが可能である（Anら、1988. In Plant Molecular Bio
logy Manual A3, pp. 1-19, Kluwer Academic, Dordrecht）。
【００４８】 本発明のベクターは凝血因子及び凝血または凝血促進活性を有する凝血因子様
分子をコードするDNA配列を含む。DNA配列は、特に、完全長の成熟2332アミノ酸
蛋白質をコードする凝固因子VIIIの7.2kb完全長cDNAクローンのような、完全な
凝血因子をコードする完全長cDNAまたはゲノムのクローンから成っていてもよい
。逆に、例えばトロンビンの直接的前駆体である、プレトロンビン-2をコードす
る2.0kbプロトロンビンcDNA断片（Russoら、上記1997）、またはB-ドメイン欠失
VIII因子をコードするVIII因子cDNA断片（Pittmanら、上記1993）のような、凝
血因子のコード配列の特異的断片から成っていてもよい。更には、DNA配列は、
例えばVIII因子のA1ドメインの300bpがV因子の相同な領域で置換されたV因子／V
III因子ハイブリッド構築物（Marquetteら、上記1995）のような、2つまたはそ
れ以上の異なった凝血因子のコード領域のハイブリッド構築物から成っていても
よい。
分子をコードするDNA配列を含む。DNA配列は、特に、完全長の成熟2332アミノ酸
蛋白質をコードする凝固因子VIIIの7.2kb完全長cDNAクローンのような、完全な
凝血因子をコードする完全長cDNAまたはゲノムのクローンから成っていてもよい
。逆に、例えばトロンビンの直接的前駆体である、プレトロンビン-2をコードす
る2.0kbプロトロンビンcDNA断片（Russoら、上記1997）、またはB-ドメイン欠失
VIII因子をコードするVIII因子cDNA断片（Pittmanら、上記1993）のような、凝
血因子のコード配列の特異的断片から成っていてもよい。更には、DNA配列は、
例えばVIII因子のA1ドメインの300bpがV因子の相同な領域で置換されたV因子／V
III因子ハイブリッド構築物（Marquetteら、上記1995）のような、2つまたはそ
れ以上の異なった凝血因子のコード領域のハイブリッド構築物から成っていても
よい。
【００４９】 特異的遺伝子調節要素（すなわち、転写プロモーター、転写ターミネーター、
シグナルペプチドコード領域、非翻訳リーダー配列）を本発明のベクターに挿入
し、所望の発現特徴を産生できる。転写の開始に必要な転写プロモーターをヒト
凝血因子のコード配列の連結部位の上流または5’末端に配置する。特異的な転
写プロモーターの例には、植物組織全体での恒常的発現を一般的に可能にするCa
MV 35Sプロモーター（Odellら、1985. Nature 313: 810）、及び外来遺伝子の発
現を葉緑体を保持する組織（すなわち、葉や茎のような緑色組織）に限定するリ
ブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子プロモーター
（Picherskyら、1986. Proc Natl Acad Sci USA 83: 3880）が含まれる。転写の
終結に必要な転写ターミネーターは、該連結部位の下流または3’末端に挿入す
る。特異的な例にはA.ツメファシエンスTiプラスミドノパリン合成酵素（Tnos）
及びマンノピン合成酵素（Tmas）転写ターミネーターが含まれる。さらに、特異
的細胞小器官へのヒト凝血因子の産生を調節するために、単一ペプチドをコード
する別の調節要素をプロモーターと連結部位の5’末端との間、または連結部位
の3’末端とターミネーターとの間に付加することもできる。シグナルペプチド
の特異的な例には、葉緑体局在を可能にするリブロースビスホスフェートカルボ
キシラーゼ小サブユニットシグナルペプチド（Fritzら、1993. Gene 137: 271）
、アポプラスト局在を可能にするタバコPR-1蛋白質シグナルペプチド（Cornelli
ssenら、1986. Nature 321: 531）及び小胞体局在を可能にするC末端KDELコード
領域（Pelham 1990. Trends Biochem Sci 15: 483）が含まれる。さらに非翻訳
リーダー配列（UTL）を、プロモーターとシグナルペプチドをコードする付加的
調節要素との間、または、コード配列の3’末端のいずれかに付加して、転写事
象と翻訳事象との間のmRNAの安定性を得ることができる。特異的な例にはアルフ
ァルファモザイクウィルスサブゲノミックRNA 4の36bpのUTL（Joblingら、1987.
Nature, 325: 622）及びリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブ
ユニットUTL（Fritz et al上記1993）が含まれる。
シグナルペプチドコード領域、非翻訳リーダー配列）を本発明のベクターに挿入
し、所望の発現特徴を産生できる。転写の開始に必要な転写プロモーターをヒト
凝血因子のコード配列の連結部位の上流または5’末端に配置する。特異的な転
写プロモーターの例には、植物組織全体での恒常的発現を一般的に可能にするCa
MV 35Sプロモーター（Odellら、1985. Nature 313: 810）、及び外来遺伝子の発
現を葉緑体を保持する組織（すなわち、葉や茎のような緑色組織）に限定するリ
ブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子プロモーター
（Picherskyら、1986. Proc Natl Acad Sci USA 83: 3880）が含まれる。転写の
終結に必要な転写ターミネーターは、該連結部位の下流または3’末端に挿入す
る。特異的な例にはA.ツメファシエンスTiプラスミドノパリン合成酵素（Tnos）
及びマンノピン合成酵素（Tmas）転写ターミネーターが含まれる。さらに、特異
的細胞小器官へのヒト凝血因子の産生を調節するために、単一ペプチドをコード
する別の調節要素をプロモーターと連結部位の5’末端との間、または連結部位
の3’末端とターミネーターとの間に付加することもできる。シグナルペプチド
の特異的な例には、葉緑体局在を可能にするリブロースビスホスフェートカルボ
キシラーゼ小サブユニットシグナルペプチド（Fritzら、1993. Gene 137: 271）
、アポプラスト局在を可能にするタバコPR-1蛋白質シグナルペプチド（Cornelli
ssenら、1986. Nature 321: 531）及び小胞体局在を可能にするC末端KDELコード
領域（Pelham 1990. Trends Biochem Sci 15: 483）が含まれる。さらに非翻訳
リーダー配列（UTL）を、プロモーターとシグナルペプチドをコードする付加的
調節要素との間、または、コード配列の3’末端のいずれかに付加して、転写事
象と翻訳事象との間のmRNAの安定性を得ることができる。特異的な例にはアルフ
ァルファモザイクウィルスサブゲノミックRNA 4の36bpのUTL（Joblingら、1987.
Nature, 325: 622）及びリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブ
ユニットUTL（Fritz et al上記1993）が含まれる。
【００５０】 植物の形質転換 前述及び後述の参考文献に記載されたものを含む当技術分野で公知の任意の方
法を用いて、植物細胞を前述のベクターで形質転換する。これらの方法は、上記
ホエケマ（Hoekema）ら1985の記載の通りTi-プラスミドを保持するA.ツメファシ
エンスを植物組織と共培養するアグロバクテリウム法を含むが、これに限定され
ない。別の適切な形質転換方法にはエレクトロポレーション（Langridgeら、上
記1985）、プロトプラストによる化学物質媒介導入（Krensら、上記1982）、マ
イクロインジェクション（Crosswayら、Mol Gen Genet 303: 179, 1986）、微小
発射体衝撃(microprojectile bombardment)（Kleinら、上記1991）、及び花粉形
質転換（Saundersら、上記1997）が含まれる。
法を用いて、植物細胞を前述のベクターで形質転換する。これらの方法は、上記
ホエケマ（Hoekema）ら1985の記載の通りTi-プラスミドを保持するA.ツメファシ
エンスを植物組織と共培養するアグロバクテリウム法を含むが、これに限定され
ない。別の適切な形質転換方法にはエレクトロポレーション（Langridgeら、上
記1985）、プロトプラストによる化学物質媒介導入（Krensら、上記1982）、マ
イクロインジェクション（Crosswayら、Mol Gen Genet 303: 179, 1986）、微小
発射体衝撃(microprojectile bombardment)（Kleinら、上記1991）、及び花粉形
質転換（Saundersら、上記1997）が含まれる。
【００５１】 形質転換後、形質転換した植物組織を、抗生物質耐性スクリーニングのような
従来の方法で選抜する。陽性の形質転換組織（外来遺伝子を含む）を、苗条／根
再生、または懸濁細胞培養を含む当技術分野で公知の方法を用いて再生すること
ができる。再生植物体、及び／または懸濁培養細胞をスクリーニングして、遺伝
子挿入、転写、外来蛋白質の蓄積、及び外来蛋白質活性を確認する。再生植物体
の子孫を同様にスクリーニングして改良植物体及び種子系統を発育させる。外来
遺伝子を、古典的な育種、プロトプラスト融合、核移植、及び染色体移植を含む
様々な方法で、別の遺伝系統へ移動させることもできる。
従来の方法で選抜する。陽性の形質転換組織（外来遺伝子を含む）を、苗条／根
再生、または懸濁細胞培養を含む当技術分野で公知の方法を用いて再生すること
ができる。再生植物体、及び／または懸濁培養細胞をスクリーニングして、遺伝
子挿入、転写、外来蛋白質の蓄積、及び外来蛋白質活性を確認する。再生植物体
の子孫を同様にスクリーニングして改良植物体及び種子系統を発育させる。外来
遺伝子を、古典的な育種、プロトプラスト融合、核移植、及び染色体移植を含む
様々な方法で、別の遺伝系統へ移動させることもできる。
【００５２】 凝血組成物の活性 別のトランスジェニック植物の薬学的調製物を用いて、トランスジェニック植
物及び植物培養細胞におけるヒト凝血因子のクローニング及び発現の成功の確実
性が確立されるに違いない。植物材料由来の全ての凝血因子は、酵素結合免疫吸
着法により確認したクローン由来凝血因子を有する血漿由来凝血因子に対して発
生した抗体の免疫交差反応性を示すはずである。さらに、植物材料由来の凝血因
子は全て、それぞれの血漿由来凝血因子と同等の相対的な蛋白質の大きさを有す
るはずである。
物及び植物培養細胞におけるヒト凝血因子のクローニング及び発現の成功の確実
性が確立されるに違いない。植物材料由来の全ての凝血因子は、酵素結合免疫吸
着法により確認したクローン由来凝血因子を有する血漿由来凝血因子に対して発
生した抗体の免疫交差反応性を示すはずである。さらに、植物材料由来の凝血因
子は全て、それぞれの血漿由来凝血因子と同等の相対的な蛋白質の大きさを有す
るはずである。
【００５３】 機能的植物由来凝血因子は、インビトロアッセイにおいて凝血カスケードの適
切な活性化機能を特異的に行うはずである。一般的に、合成色素産生基質の変換
に基づく種々の利用可能なアッセイ法は次のものを試験する： VIII因子：トロンビン存在下でのVIII因子の活性化に続く、IXa因子、カルシ
ウムイオン、及びリン脂質存在下でのX因子の活性化。 IX因子：カルシウムイオン及びXIa因子存在下でのIX因子の活性化に続く、VII
Ia因子、カルシウムイオン、及びリン脂質存在下でのX因子の活性。 XIII因子：トロンビン存在下でのXIII因子の活性化後の、トランスグルタミナ
ーゼ活性（すなわちフィブリンのγ-グルタミル-ε-リジル架橋）。 トロンビン：カルシウムイオン存在下でのフィブリノーゲンの可溶性フィブリ
ンへの変換中のフィブリノペプチドAの放出。
切な活性化機能を特異的に行うはずである。一般的に、合成色素産生基質の変換
に基づく種々の利用可能なアッセイ法は次のものを試験する： VIII因子：トロンビン存在下でのVIII因子の活性化に続く、IXa因子、カルシ
ウムイオン、及びリン脂質存在下でのX因子の活性化。 IX因子：カルシウムイオン及びXIa因子存在下でのIX因子の活性化に続く、VII
Ia因子、カルシウムイオン、及びリン脂質存在下でのX因子の活性。 XIII因子：トロンビン存在下でのXIII因子の活性化後の、トランスグルタミナ
ーゼ活性（すなわちフィブリンのγ-グルタミル-ε-リジル架橋）。 トロンビン：カルシウムイオン存在下でのフィブリノーゲンの可溶性フィブリ
ンへの変換中のフィブリノペプチドAの放出。
【００５４】 さらに、VIII因子及びIX因子の活性は、それぞれ、VIII因子欠乏、及びIX因子
欠乏血漿試料の較正を通じて試験できる。VIII因子はまた、固定されたフォンビ
ルブランド因子との結合及びその後の溶出を試験することもできる。
欠乏血漿試料の較正を通じて試験できる。VIII因子はまた、固定されたフォンビ
ルブランド因子との結合及びその後の溶出を試験することもできる。
【００５５】実施例1-ベクターの構築 ヒト凝固因子をコードするDNA配列での植物を形質転換に有効なベクターはpZD
201、pGA2023、pGA2049、pGA2029、及びpGA2030である。公知で一般的に入手可
能な出発材料及び方法からこれらのベクターが構築できるように十分な情報を実
施例1に提供する。ここで入手可能な情報により別の出発材料から類似のベクタ
ーを構築することも可能である。
201、pGA2023、pGA2049、pGA2029、及びpGA2030である。公知で一般的に入手可
能な出発材料及び方法からこれらのベクターが構築できるように十分な情報を実
施例1に提供する。ここで入手可能な情報により別の出発材料から類似のベクタ
ーを構築することも可能である。
【００５６】 A.プラスミドベクターpZD201（VIII因子）の構築 ヒト胎児肝臓由来のVIII因子cDNAの完全長ポリペプチドをコードする遺伝子を
含む大腸菌プラスミドpSP64-FVIIIc（ATCC番号：39812）をATCCより入手した（
図E1-1）。凝固因子VIIIは重鎖、Bドメイン、及び軽鎖を含む2332アミノ酸の蛋
白質である。7.2kbのプレ-凝固因子VIIIcDNAは天然シグナルペプチド（NH2-末端
の最初の19アミノ酸）及び成熟蛋白質をコードする。
含む大腸菌プラスミドpSP64-FVIIIc（ATCC番号：39812）をATCCより入手した（
図E1-1）。凝固因子VIIIは重鎖、Bドメイン、及び軽鎖を含む2332アミノ酸の蛋
白質である。7.2kbのプレ-凝固因子VIIIcDNAは天然シグナルペプチド（NH2-末端
の最初の19アミノ酸）及び成熟蛋白質をコードする。
【００５７】 完全長全凝固因子VIIIcDNAをSalI制限酵素で切り出し、バイナリーベクターpG
A748のCaMV35Sプロモーター及びT7-T5転写ターミネーターの間に位置する適合す
る制限酵素XhoI部位に連結し、18.8kbのプラスミドpZD201を形成した（図E1-2）
。
A748のCaMV35Sプロモーター及びT7-T5転写ターミネーターの間に位置する適合す
る制限酵素XhoI部位に連結し、18.8kbのプラスミドpZD201を形成した（図E1-2）
。
【００５８】 B.プラスミドベクターpZD2023（VIII A因子-ドメイン）の構築 成体ヒト子宮（妊娠）凝固因子VIII A-ドメインの完全長ポリペプチドをコー
ドする遺伝子（cDNA）を含むpUC18-FXIIIベクターをワシントン州シアトル市の
ワシントン大学Earl W. Davie博士より入手した（Ichinoseら、1986 Biochem 25
: 6900）凝固因子XIIIはニ量体として連結する二つのAサブユニット及び二つの
弱く結合したBサブユニットからなる四量体である（Schwartsら、1973. J. Biol
Chem 248: 1395）。Aサブユニットは83150の分子量を有する731アミノ酸残基か
ら成る。Bサブユニットポリペプチドは73183の分子量を有する641アミノ酸残基
から成り、環状蛋白質の分子量にかなり付加する炭水化物の構成要素を含む。凝
固の間、Aサブユニットチモーゲンはトロンビン触媒アミノ末端ペプチド(4kDa)
の切断により活性化される。活性化されたAサブユニットはγ-グルタミル-ε-リ
ジンペプチド結合の形成を触媒し、フィブリンの架橋を容易にし、それにより形
成されたフィブリン凝塊を強化する（Lorandら、1980. Prog Haemost Throms 5;
245）。3.9kbのプレ−凝固因子XIIIAドメインcDNAは天然シグナルペプチド後の
成熟蛋白質をコードする。
ドする遺伝子（cDNA）を含むpUC18-FXIIIベクターをワシントン州シアトル市の
ワシントン大学Earl W. Davie博士より入手した（Ichinoseら、1986 Biochem 25
: 6900）凝固因子XIIIはニ量体として連結する二つのAサブユニット及び二つの
弱く結合したBサブユニットからなる四量体である（Schwartsら、1973. J. Biol
Chem 248: 1395）。Aサブユニットは83150の分子量を有する731アミノ酸残基か
ら成る。Bサブユニットポリペプチドは73183の分子量を有する641アミノ酸残基
から成り、環状蛋白質の分子量にかなり付加する炭水化物の構成要素を含む。凝
固の間、Aサブユニットチモーゲンはトロンビン触媒アミノ末端ペプチド(4kDa)
の切断により活性化される。活性化されたAサブユニットはγ-グルタミル-ε-リ
ジンペプチド結合の形成を触媒し、フィブリンの架橋を容易にし、それにより形
成されたフィブリン凝塊を強化する（Lorandら、1980. Prog Haemost Throms 5;
245）。3.9kbのプレ−凝固因子XIIIAドメインcDNAは天然シグナルペプチド後の
成熟蛋白質をコードする。
【００５９】 完全長プレ-凝固因子XIIIAドメインcDNAをPstI制限酵素でpUC18-FXIIIから切
り出し、図E1-3に示すようにpBluescript SK-（Stratagene, La Jolla, CA）の
マルチクローニング部位の適合するPst I制限酵素部位に連結した。そしてpGA20
20の制限酵素部位Xba I/ Cla IからXIIIAドメインのクローンを切り出し、バイ
ナリーベクターのpGA643のCaMV35SプロモーターとT7-T5転写ターミネーターの間
にあるXba Iと/Cla Iの制限酵素部位にそれぞれ連結し、14.0kbのプラスミドpGA
2023を作製した（Fig. E1-4）。
り出し、図E1-3に示すようにpBluescript SK-（Stratagene, La Jolla, CA）の
マルチクローニング部位の適合するPst I制限酵素部位に連結した。そしてpGA20
20の制限酵素部位Xba I/ Cla IからXIIIAドメインのクローンを切り出し、バイ
ナリーベクターのpGA643のCaMV35SプロモーターとT7-T5転写ターミネーターの間
にあるXba Iと/Cla Iの制限酵素部位にそれぞれ連結し、14.0kbのプラスミドpGA
2023を作製した（Fig. E1-4）。
【００６０】 C.プラスミドベクターpGA2043及びpGA2049（トロンビン）の構築 プロトロンビンの完全長ペプチドをコードするcDNAを含むベクターpHII-3をワ
シントン州シアトル市のワシントン大学Earl W. Davie博士より入手することが
可能である（Friezner Degenら、上記1983）。プロトロンビン（Mr72,000）は凝
固の最終局面に関係するビタミンK依存性蛋白質である。血液凝固過程の間、プ
ロトロンビンは第一因子Xa部位での切断により活性化され、プレトロンビン-2を
形成することができる。プレトロンビン-2はその後、第ニ因子Xa部位で切断され
、トロンビンを形成する。正しく加工されたトロンビン（Mr34,000）は単一のジ
スルフィド結合で結合した259アミノ酸の重鎖及び49アミノ酸の軽鎖から成る。
シントン州シアトル市のワシントン大学Earl W. Davie博士より入手することが
可能である（Friezner Degenら、上記1983）。プロトロンビン（Mr72,000）は凝
固の最終局面に関係するビタミンK依存性蛋白質である。血液凝固過程の間、プ
ロトロンビンは第一因子Xa部位での切断により活性化され、プレトロンビン-2を
形成することができる。プレトロンビン-2はその後、第ニ因子Xa部位で切断され
、トロンビンを形成する。正しく加工されたトロンビン（Mr34,000）は単一のジ
スルフィド結合で結合した259アミノ酸の重鎖及び49アミノ酸の軽鎖から成る。
【００６１】 トロンビン発現ベクターのクローニングは幾つかの段階から成る。最初の段階
では、鋳型としての完全長ヒトプロトロンビン遺伝子及び以下のプライマーを用
いて、天然トロンビンシグナルペプチド配列（36アミノ酸）をクリーニングした
。フォワードプライマーは制限酵素部位XbaI及びシグナルペプチドの5’末端の
開始コドン（ATG）を適応させるように設計し、シグナルペプチドの3’末端をリ
バースプライマーとして使用した。PCRシグナルペプチド配列は適応XbaI部位か
ら数えて111bpを含む。
では、鋳型としての完全長ヒトプロトロンビン遺伝子及び以下のプライマーを用
いて、天然トロンビンシグナルペプチド配列（36アミノ酸）をクリーニングした
。フォワードプライマーは制限酵素部位XbaI及びシグナルペプチドの5’末端の
開始コドン（ATG）を適応させるように設計し、シグナルペプチドの3’末端をリ
バースプライマーとして使用した。PCRシグナルペプチド配列は適応XbaI部位か
ら数えて111bpを含む。
【００６２】 二番目に、DNAの鋳型として最初の段階からの精製PCR産物、P1プライマー、及
び次のリバースプライマーを用いて、シグナルペプチド配列へプレトロンビン-2
遺伝子に12bpの配列を付加するために、精製PCR産物を用いて別のPCRを行った。
第一因子Xaコドン部位で始まる12bpのプレトロンビン-2配列と隣接するP2プライ
マー配列を用いてリバースプライマーを設計した。PCR産物をプロトロンビンSP
と命名した。PCR産物の配列は適応されたXbaI部位から数えて123bpの長さであっ
た。
び次のリバースプライマーを用いて、シグナルペプチド配列へプレトロンビン-2
遺伝子に12bpの配列を付加するために、精製PCR産物を用いて別のPCRを行った。
第一因子Xaコドン部位で始まる12bpのプレトロンビン-2配列と隣接するP2プライ
マー配列を用いてリバースプライマーを設計した。PCR産物をプロトロンビンSP
と命名した。PCR産物の配列は適応されたXbaI部位から数えて123bpの長さであっ
た。
【００６３】 そして、DNAの鋳型としてプロトロンビン遺伝子、及び次のプライマーを用い
て、シグナルペプチド配列を持たないプレトロンビン-2遺伝子（PT2 w/o SP）を
第一因子Xaコドンへクローニングした。フォワードプライマーはプレトロンビン
-2遺伝子の5’末端の第一因子Xaコドン部位の下流に直接設計し、リバースプラ
イマーは6-ヒスチジン標識配列（His）6、それに続く終止コドン（TGA）及び3’
末端制限酵素部位Cla Iを適応させるように設計した。C-末端の6-ヒスチジンペ
プチドは、発現プレトロンビン-2蛋白質の精製に用いることができる。
て、シグナルペプチド配列を持たないプレトロンビン-2遺伝子（PT2 w/o SP）を
第一因子Xaコドンへクローニングした。フォワードプライマーはプレトロンビン
-2遺伝子の5’末端の第一因子Xaコドン部位の下流に直接設計し、リバースプラ
イマーは6-ヒスチジン標識配列（His）6、それに続く終止コドン（TGA）及び3’
末端制限酵素部位Cla Iを適応させるように設計した。C-末端の6-ヒスチジンペ
プチドは、発現プレトロンビン-2蛋白質の精製に用いることができる。
【００６４】 最後に、DNAの鋳型として精製PCR産物、123SP、及びPT2w/o SP及びプライマー
P1及びP4を用いてPCRを行い、プロトロンビンSP配列及びプレトロンビン-2遺伝
子配列を付加した。PCR産物は1062bpで、PT2とし命名され、5’末端に制限酵素
部位XbaI及び3’末端に制限酵素部位Cla Iを有する。得られた精製PCR PT2 DNA
をXba及びCla Iで切断し、pBluescript SK-ベクターのXba及びCla I制限酵素部
位へクローニングし、図E1-5に示すベクターpGA2042（4.02kb）を作成した。天
然シグナルペプチド配列を有する構築したプレトロンビン-2遺伝子をXba及びCla
Iで切断し、バイナリー発現ベクターpZD261のルビスコ（RbcS-3C）プロモータ
ー及び（13.4 kb）T5-T7転写ターミネーターの間に位置する適合する制限酵素部
位に連結し、図E1-6に示す14.5 kbのベクターpGA2043を作成した。図E1-6では、
BLはT-DNAの左端、BRはT-DNAの右端、nptはネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子、oriTは、接合伝達のRK2起点、OriVは転写のRK2起点、pRBC / AMVは
アルファルファモザイクウィルスのリーダー配列を有するルビスコの（RbcS-3C
）プロモーター、T5は転写ターミネター5、T7は転写ターミネター７、tetはRK2
プラスミドのテトラシクリン耐性遺伝子、trfA*は複製蛋白質のセグメントを示
す。
P1及びP4を用いてPCRを行い、プロトロンビンSP配列及びプレトロンビン-2遺伝
子配列を付加した。PCR産物は1062bpで、PT2とし命名され、5’末端に制限酵素
部位XbaI及び3’末端に制限酵素部位Cla Iを有する。得られた精製PCR PT2 DNA
をXba及びCla Iで切断し、pBluescript SK-ベクターのXba及びCla I制限酵素部
位へクローニングし、図E1-5に示すベクターpGA2042（4.02kb）を作成した。天
然シグナルペプチド配列を有する構築したプレトロンビン-2遺伝子をXba及びCla
Iで切断し、バイナリー発現ベクターpZD261のルビスコ（RbcS-3C）プロモータ
ー及び（13.4 kb）T5-T7転写ターミネーターの間に位置する適合する制限酵素部
位に連結し、図E1-6に示す14.5 kbのベクターpGA2043を作成した。図E1-6では、
BLはT-DNAの左端、BRはT-DNAの右端、nptはネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子、oriTは、接合伝達のRK2起点、OriVは転写のRK2起点、pRBC / AMVは
アルファルファモザイクウィルスのリーダー配列を有するルビスコの（RbcS-3C
）プロモーター、T5は転写ターミネター5、T7は転写ターミネター７、tetはRK2
プラスミドのテトラシクリン耐性遺伝子、trfA*は複製蛋白質のセグメントを示
す。
【００６５】 更に、天然のシグナルペプチドを有するプレトロンビン-2遺伝子を別のバイナ
リー発現ベクターpGA643（11.7kb）にクローニングし、図E1-7に示す12.8 kbの
ベクターpGA2049を作製した。バイナリーベクターpGA2049のプレトロンビン-2遺
伝子の発現は35Sプロモーター（P35S）及びT5-T7ターミネーターの制御下にあっ
た。これらの構築したバイナリーベクターを、凍結-融解法（An、上記 1987）
でアグロバクテリウム-ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）LBA440
4に導入した。
リー発現ベクターpGA643（11.7kb）にクローニングし、図E1-7に示す12.8 kbの
ベクターpGA2049を作製した。バイナリーベクターpGA2049のプレトロンビン-2遺
伝子の発現は35Sプロモーター（P35S）及びT5-T7ターミネーターの制御下にあっ
た。これらの構築したバイナリーベクターを、凍結-融解法（An、上記 1987）
でアグロバクテリウム-ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）LBA440
4に導入した。
【００６６】 D.プラスミドベクターpGA2029及びpGA2030（IX因子）の構築 ヒト肝臓由来のプレ−凝固因子IXの完全長ポリペプチドをコードする遺伝子（
cDNA）を有するpGA748-F9cベクターをワシントン州シアトル市のワシントン大学
生化学学部Earl W. Davie博士より入手する（Kurachiら、上記1982）。凝固因子
IXは単一鎖の、分子量約56000を有する416アミノ酸から成る糖蛋白質で、アミノ
末端領域に12のγ-カルボキシグルタミン酸（gla）残基を含む。凝固過程の間に
、IX因子はXIa因子によりIXa因子に変換され、その後、VIIIa因子、リン脂質、
及びCa2+の存在下で、IXa因子はX因子をXa因子に変換する。12のN末端のgla残基
の少なくとも一部が、IX因子の活性に必要である。1.5kbの凝固因子IXcDNAは成
熟蛋白質、18アミノ酸のプロ-配列（pro-sequence）、及び28アミノ酸のシグナ
ルペプチドをコードする。
cDNA）を有するpGA748-F9cベクターをワシントン州シアトル市のワシントン大学
生化学学部Earl W. Davie博士より入手する（Kurachiら、上記1982）。凝固因子
IXは単一鎖の、分子量約56000を有する416アミノ酸から成る糖蛋白質で、アミノ
末端領域に12のγ-カルボキシグルタミン酸（gla）残基を含む。凝固過程の間に
、IX因子はXIa因子によりIXa因子に変換され、その後、VIIIa因子、リン脂質、
及びCa2+の存在下で、IXa因子はX因子をXa因子に変換する。12のN末端のgla残基
の少なくとも一部が、IX因子の活性に必要である。1.5kbの凝固因子IXcDNAは成
熟蛋白質、18アミノ酸のプロ-配列（pro-sequence）、及び28アミノ酸のシグナ
ルペプチドをコードする。
【００６７】 後述のプライマーを用いたPCRにより完全長プレ-プロ-凝固因子IXcDNAをクロ
ーニングした。成熟IX因子をコードするIX因子cDNAの5’末端のXbaI制限酵素部
位に適合するようにフォワードプライマーを設計した。リバースプライマーは6-
ヒスチジン標識配列（His）6、それに続く終止コドン（TGA）及び3’末端制限酵
素部位Cla Iを適合するように設計した。C末端の6-ヒスチジンペプチドを用いて
発現後の発現プレ-凝固因子IXを精製できる。
ーニングした。成熟IX因子をコードするIX因子cDNAの5’末端のXbaI制限酵素部
位に適合するようにフォワードプライマーを設計した。リバースプライマーは6-
ヒスチジン標識配列（His）6、それに続く終止コドン（TGA）及び3’末端制限酵
素部位Cla Iを適合するように設計した。C末端の6-ヒスチジンペプチドを用いて
発現後の発現プレ-凝固因子IXを精製できる。
【００６８】 PCR及び制限酵素XbaI及びClaIでの切断後、バイナリー発現ベクター pZD256及
びpZD261（13.4 kb）のルビスコ（RbcS-3C）プロモーター（Sugitaら、1987 Mol
. Gen. Genet. 209: 247）及びT5-T7転写ターミネーター間に位置する適合性の
制限酵素部位に連結し、図E1-8及びE1-9に示す14.8 kbのベクターpGA2029及びpG
A2030を作成した。図E1-8及びE1-9では、 BLはT-DNAの左端、BRはT-DNAの右端、
nptはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、oriTは、接合伝達のRK2起
点、OriVは転写のRK2起点、pRBC / AMVはアルファルファモザイクウィルスのリ
ーダー配列を有するルビスコの（RbcS-3C）プロモーター、T5は転写ターミネタ
ー5、T7は転写ターミネター７、tetはRK2プラスミドのテトラシクリン耐性遺伝
子、trfA*は複製蛋白質のセグメントを示す。プレ-プロ凝固因子IXの発現は、pG
A2029の液胞シグナルペプチド配列及びpGA2030のアルファルファモザイクウィル
ス（AMV）リーダー配列を有するRbeS-3Cプロモーターの制御下にある。これらの
構築バイナリーベクターを凍結-融解法（An、上記 1987）でアグロバクテリウ
ム-ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404に導入した。
びpZD261（13.4 kb）のルビスコ（RbcS-3C）プロモーター（Sugitaら、1987 Mol
. Gen. Genet. 209: 247）及びT5-T7転写ターミネーター間に位置する適合性の
制限酵素部位に連結し、図E1-8及びE1-9に示す14.8 kbのベクターpGA2029及びpG
A2030を作成した。図E1-8及びE1-9では、 BLはT-DNAの左端、BRはT-DNAの右端、
nptはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、oriTは、接合伝達のRK2起
点、OriVは転写のRK2起点、pRBC / AMVはアルファルファモザイクウィルスのリ
ーダー配列を有するルビスコの（RbcS-3C）プロモーター、T5は転写ターミネタ
ー5、T7は転写ターミネター７、tetはRK2プラスミドのテトラシクリン耐性遺伝
子、trfA*は複製蛋白質のセグメントを示す。プレ-プロ凝固因子IXの発現は、pG
A2029の液胞シグナルペプチド配列及びpGA2030のアルファルファモザイクウィル
ス（AMV）リーダー配列を有するRbeS-3Cプロモーターの制御下にある。これらの
構築バイナリーベクターを凍結-融解法（An、上記 1987）でアグロバクテリウ
ム-ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404に導入した。
【００６９】実施例2-アグロバクテリウム媒介形質転換 N.タバカム（N. tobacum）植物体を、実施例1に従い調製したVIII因子、IX因
子、XIII因子-Aドメイン及びトロンビン生産のための発現ベクターを有するA.ツ
メファシエンス（A. tumefaciens）LBA4404で形質転換した。これらのプラスミ
ドは凍結-融解法（An、上記 1987）でA.ツメファシエンス（A. tumefaciens）L
BA4404に直接導入した。その後、タバコの葉のディスクまたはカルスとアグロバ
クテリウムを共培養して植物体の形質転換を行った。2〜3日後、アグロバクテリ
ウム死滅のための抗生物質のカルベニシリン及び陽性形質転換体選抜のためカナ
マイシンを含む新しい培地に外植体組織を移した。カナマイシンを含む地上部ま
たは根再生培地にて植物体全体を再生させた。
子、XIII因子-Aドメイン及びトロンビン生産のための発現ベクターを有するA.ツ
メファシエンス（A. tumefaciens）LBA4404で形質転換した。これらのプラスミ
ドは凍結-融解法（An、上記 1987）でA.ツメファシエンス（A. tumefaciens）L
BA4404に直接導入した。その後、タバコの葉のディスクまたはカルスとアグロバ
クテリウムを共培養して植物体の形質転換を行った。2〜3日後、アグロバクテリ
ウム死滅のための抗生物質のカルベニシリン及び陽性形質転換体選抜のためカナ
マイシンを含む新しい培地に外植体組織を移した。カナマイシンを含む地上部ま
たは根再生培地にて植物体全体を再生させた。
【００７０】実施例3-VIII因子産生 A. 蛋白質イムノブロティング 実施例1-aに記載のベクターpZD201を使用する。植物体のタバコを実施例2に記
載のアグロバクテリウム法で形質転換した。カナマイシン抵抗性選抜後の陽性形
質転換体を得て、成熟植物体のタバコ及びカルスについてヒト凝固因子VIIIの存
在について測定した。抽出可能な葉の蛋白質を用いて予備的な蛋白質イムノブロ
ッティング（ドットブロットアッセイ、図E3-1）を行ったところ、T0の植物体全
体の形質転換体で凝固因子VIII抗原の存在を示された。図E3-1に示されるように
、強度のVIII因子: ag発現特徴が植物体1004-3、1006-2及び1006-3で見られた。
S1及びS2に示されるように陽性対照のVIII因子標準品（American Diagnostica,
Greenwich, CT）が示され、一方、SRに示されるように非形質転換体のN.タバカ
ム（N. tubacum）の品種SR1由来の陰性対照の葉の蛋白質が示された。ドット-ブ
ロットイムノアッセイの実施後、T0植物体を自家受粉させ、T1の種子ストックを
得た。T1の種子をカナマイシン選抜培地で発芽させ、成熟した植物体を制御環境
化で栽培した。図E3-2に示すウェスタンイムノブロットアッセイを様々なT0植物
体系統から再生したT1植物体の葉の蛋白質の抽出物について行ったところ、血漿
由来のVIII因子（American Diagnostica, Greenwich, CT）に相当する大きさの
免疫反応のバンドが存在した。主なバンドは約240kDであった。血漿由来のVIII
因子及び植物形質転換体の別の弱いバンドは、90〜200kDのVIII因子重鎖、及び8
0 kDのVIII因子軽鎖にあたることが判明した。植物由来及び血漿由来のVIII因子
の間に類似の免疫反応のバンドが見られたことは、植物由来VIII因子が正しいヒ
ト様翻訳後修飾を行っていることを示す。ヒツジ抗-ヒトVIII因子: Cポリクロー
ナル抗体（Haematologic Technologies, Inc., Essex Jet., VT）及びヒツジ抗-
ヒトVIII因子: Cポリクローナル抗体AB787（Chemicon International, Inc., Te
mecula, CA）を混合して、ウェスタンブロット及びドットブロットイムノアッセ
イ法に使用した。
載のアグロバクテリウム法で形質転換した。カナマイシン抵抗性選抜後の陽性形
質転換体を得て、成熟植物体のタバコ及びカルスについてヒト凝固因子VIIIの存
在について測定した。抽出可能な葉の蛋白質を用いて予備的な蛋白質イムノブロ
ッティング（ドットブロットアッセイ、図E3-1）を行ったところ、T0の植物体全
体の形質転換体で凝固因子VIII抗原の存在を示された。図E3-1に示されるように
、強度のVIII因子: ag発現特徴が植物体1004-3、1006-2及び1006-3で見られた。
S1及びS2に示されるように陽性対照のVIII因子標準品（American Diagnostica,
Greenwich, CT）が示され、一方、SRに示されるように非形質転換体のN.タバカ
ム（N. tubacum）の品種SR1由来の陰性対照の葉の蛋白質が示された。ドット-ブ
ロットイムノアッセイの実施後、T0植物体を自家受粉させ、T1の種子ストックを
得た。T1の種子をカナマイシン選抜培地で発芽させ、成熟した植物体を制御環境
化で栽培した。図E3-2に示すウェスタンイムノブロットアッセイを様々なT0植物
体系統から再生したT1植物体の葉の蛋白質の抽出物について行ったところ、血漿
由来のVIII因子（American Diagnostica, Greenwich, CT）に相当する大きさの
免疫反応のバンドが存在した。主なバンドは約240kDであった。血漿由来のVIII
因子及び植物形質転換体の別の弱いバンドは、90〜200kDのVIII因子重鎖、及び8
0 kDのVIII因子軽鎖にあたることが判明した。植物由来及び血漿由来のVIII因子
の間に類似の免疫反応のバンドが見られたことは、植物由来VIII因子が正しいヒ
ト様翻訳後修飾を行っていることを示す。ヒツジ抗-ヒトVIII因子: Cポリクロー
ナル抗体（Haematologic Technologies, Inc., Essex Jet., VT）及びヒツジ抗-
ヒトVIII因子: Cポリクローナル抗体AB787（Chemicon International, Inc., Te
mecula, CA）を混合して、ウェスタンブロット及びドットブロットイムノアッセ
イ法に使用した。
【００７１】 B. VIII因子活性アッセイ法 トランスジェニック植物体の葉の材料を採取し、標準的な方法で全可溶性蛋白
質を抽出した。コーテスト法(Coatest)（Helena Laboratories, Bcaumont, Texa
s）で組換えヒトVIII因子の機能性を分析した。トロンビンで活性化すると、VII
I因子は、カルシウム及びリン脂質存在下でのIXa因子によるX因子のXa因子への
変換における補因子として作用する。コーテスト(Coatest)アッセイ法で産生し
たXa因子の量を特異的な色素産生基質（MeO-CO-D-CHG-Gly-Arg-pNa）を用いて測
定すると、試験検体でのVIII因子量に直接的に比例していた。機能性の試験の間
に、VIII因子蛋白質発現植物体、非形質転換対照植物体及びCBHIセルラーゼ発現
タバコ植物体からの全蛋白質検体を試験した。
質を抽出した。コーテスト法(Coatest)（Helena Laboratories, Bcaumont, Texa
s）で組換えヒトVIII因子の機能性を分析した。トロンビンで活性化すると、VII
I因子は、カルシウム及びリン脂質存在下でのIXa因子によるX因子のXa因子への
変換における補因子として作用する。コーテスト(Coatest)アッセイ法で産生し
たXa因子の量を特異的な色素産生基質（MeO-CO-D-CHG-Gly-Arg-pNa）を用いて測
定すると、試験検体でのVIII因子量に直接的に比例していた。機能性の試験の間
に、VIII因子蛋白質発現植物体、非形質転換対照植物体及びCBHIセルラーゼ発現
タバコ植物体からの全蛋白質検体を試験した。
【００７２】 表E3-1にコーテスト(Coatest)アッセイ法の結果を示す。各植物体検体で1.5mg
の可溶性植物蛋白質を用いた。試験A、B、Cをそれぞれ別の日程で行い、それぞ
れ別の非形質転換対照植物体を用いた。試験A及びBでは、Xa因子の添加後のイン
キュベーション時間が5分間であった。試験CではXa因子の添加後のインキュベー
ション時間が4分間であった。また、試験CではVIII因子基準血漿標準品（Helena
Laboratories, Bcaumont, TX）のアリコートを別々の二つのタバコ植物体対照
に加えた。試験CでのVIII因子の添加により媒介された増加に比べ、試験A及びB
の結果は、明確にタバコの植物系統1005-5、1005-6及び1006-3でのVIII因子凝血
促進性活性の存在を示すものである。1006-3系統で観察された最高レベルの活性
は1500μgの検体あたり、26ngのVIII因子（試験Cからの較正データの線形回帰に
基づく）、または抽出可能な葉蛋白質の0.002％の発現レベルにほぼ相当する。
この驚くべき結果は組換えヒトVIII因子は正しく植物でプロセッシングを受け、
凝血促進性活性をもたらしたことを示す。
の可溶性植物蛋白質を用いた。試験A、B、Cをそれぞれ別の日程で行い、それぞ
れ別の非形質転換対照植物体を用いた。試験A及びBでは、Xa因子の添加後のイン
キュベーション時間が5分間であった。試験CではXa因子の添加後のインキュベー
ション時間が4分間であった。また、試験CではVIII因子基準血漿標準品（Helena
Laboratories, Bcaumont, TX）のアリコートを別々の二つのタバコ植物体対照
に加えた。試験CでのVIII因子の添加により媒介された増加に比べ、試験A及びB
の結果は、明確にタバコの植物系統1005-5、1005-6及び1006-3でのVIII因子凝血
促進性活性の存在を示すものである。1006-3系統で観察された最高レベルの活性
は1500μgの検体あたり、26ngのVIII因子（試験Cからの較正データの線形回帰に
基づく）、または抽出可能な葉蛋白質の0.002％の発現レベルにほぼ相当する。
この驚くべき結果は組換えヒトVIII因子は正しく植物でプロセッシングを受け、
凝血促進性活性をもたらしたことを示す。
【００７３】
【表Ｅ３−１】 選択された植物形質転換体のコーテストアッセイ法の結果
【００７４】実施例4-XIII因子A-ドメイン A.因子XIII遺伝子挿入確認 実施例1に記載するベクターpGA2023を使用する。実施例2に記載するアグロバ
クテリウム法を使用してタバコ植物を形質転換した。カナマイシン耐性スクリー
ニングにより陽性形質転換体を得た後、選択培地スクリーニングによって50のタ
バコ植物形質転換体を得て、トランスジェニック植物ゲノムに因子XIII遺伝子が
挿入されたことを確認した。ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（
CTAB）ミニプレパレーション法を使用して、これらの植物のゲノムDNAを調製し
た。簡単に述べると、この方法では、少量の植物材料（25〜100 mg）を液体窒素
で微細粉末に粉砕し、3% CTAB、1.42 M NaCl、20 mM EDTA、100 mM Tris-HCl、5
mMアスコルビン酸および2%（w/v）ポリビニルピロリドン（PVP-40; Sigma Chem
ical Co.）を含有する抽出緩衝液中でゲノムDNAについて65℃で抽出し、その後
フェノール-クロロホルム抽出を実施した。10,000×gで5分間遠心分離後、上層
の水相を回収し、酢酸ナトリウムの存在下でイソプロパノール中でゲノムDNAを
沈殿させた。因子XIII遺伝子から誘導した以下のプライマーを使用したPCRによ
って、得られたDNA試料を因子XIII遺伝子増幅に使用した。フォワードプライマ
ーは開始コドン（ATG）のすぐ下流の配列に特異的であり、リバースプライマー
は停止コドン（TGA）のすぐ上流の配列に特異的である。
クテリウム法を使用してタバコ植物を形質転換した。カナマイシン耐性スクリー
ニングにより陽性形質転換体を得た後、選択培地スクリーニングによって50のタ
バコ植物形質転換体を得て、トランスジェニック植物ゲノムに因子XIII遺伝子が
挿入されたことを確認した。ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（
CTAB）ミニプレパレーション法を使用して、これらの植物のゲノムDNAを調製し
た。簡単に述べると、この方法では、少量の植物材料（25〜100 mg）を液体窒素
で微細粉末に粉砕し、3% CTAB、1.42 M NaCl、20 mM EDTA、100 mM Tris-HCl、5
mMアスコルビン酸および2%（w/v）ポリビニルピロリドン（PVP-40; Sigma Chem
ical Co.）を含有する抽出緩衝液中でゲノムDNAについて65℃で抽出し、その後
フェノール-クロロホルム抽出を実施した。10,000×gで5分間遠心分離後、上層
の水相を回収し、酢酸ナトリウムの存在下でイソプロパノール中でゲノムDNAを
沈殿させた。因子XIII遺伝子から誘導した以下のプライマーを使用したPCRによ
って、得られたDNA試料を因子XIII遺伝子増幅に使用した。フォワードプライマ
ーは開始コドン（ATG）のすぐ下流の配列に特異的であり、リバースプライマー
は停止コドン（TGA）のすぐ上流の配列に特異的である。
【００７５】 PCR結果を図E4-1に示す。この図では、レーンSはサイズマーカーで、レーンSR
1は陰性対照として形質転換していない植物であり、レーンFXIIIは陽性対照とし
てXIII因子A-サブユニットDNAであり、レーン11、23、33、35、45、47はトラン
スジェニック植物試料である。結果は、2.3 kbのDNAバンドが示した全てのトラ
ンスジェニック植物に存在し、XIII因子DNAのPCRバンドに一致する。形質転換し
ていない植物DNA試料中では2.3 kb PCRバンドは観察されない。ここでの結果に
よって、因子XIII遺伝子のタバコ植物ゲノムへの挿入が確認されている。合計50
の形質転換植物を因子XIII遺伝子挿入についてスクリーニングし、40の植物がXI
II因子Aサブユニット遺伝子挿入を示した。
1は陰性対照として形質転換していない植物であり、レーンFXIIIは陽性対照とし
てXIII因子A-サブユニットDNAであり、レーン11、23、33、35、45、47はトラン
スジェニック植物試料である。結果は、2.3 kbのDNAバンドが示した全てのトラ
ンスジェニック植物に存在し、XIII因子DNAのPCRバンドに一致する。形質転換し
ていない植物DNA試料中では2.3 kb PCRバンドは観察されない。ここでの結果に
よって、因子XIII遺伝子のタバコ植物ゲノムへの挿入が確認されている。合計50
の形質転換植物を因子XIII遺伝子挿入についてスクリーニングし、40の植物がXI
II因子Aサブユニット遺伝子挿入を示した。
【００７６】 B.ウェスタンブロット分析 50 mM pH7.5 Tris-HCl、0.5 M NaCl、0.05% Nonidet P-40および1.0 mMフェニ
ルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）を含有する高塩緩衝液（HSB）を総蛋
白質抽出に使用した。エッペンドルフチューブグラインダーを使用して、エッペ
ンドルフチューブ中で四角形の培養容器中で生育させたトランスジェニック植物
の葉材料を粉砕し、HSB中で抽出した。20,000×gで10分間遠心分離後、植物抽出
物上清を採取した。Bradford試薬（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を使
用して総蛋白質量を求めた。100μgの総蛋白質を含有する蛋白質試料をドデシル
硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）試料緩衝液で95
℃において5分間変性させ、その後4〜20%濃度勾配SDS-PAGEゲル（Bio-Rad Labor
atories, Richmond, CA）によって分析した。陽性対照として、3.65μgのヒト血
漿凝固因子XIIIをSDS-PAGE中に使用した（Haematologic Technologies Inc.,Ess
ex Junction, VT）。分離した蛋白質をProtranニトロセルロース膜（Schleicher
&Schuell, Keene, NH）に電気泳動的にブロットした。一次抗体として1000倍希
釈で使用したヒツジ抗ヒト因子XIIIポリクローナル抗体PAHFXIII-S（Haematolog
ic Technologies Inc.,Essex Junction, VT）と、二次抗体として1000倍希釈で
使用したアルカリホスファターゼ-結合ウサギ抗ヒツジIgG（Jackson ImmunoRese
arch Laboratories, Inc., West Grove, PA）を用いてウェスタンブロットを実
施した。Immun-Blot Colorimetricアッセイキット（Bio-Rad Laboratories, Her
cules, CA）を使用して免疫複合体を検出した。
ルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）を含有する高塩緩衝液（HSB）を総蛋
白質抽出に使用した。エッペンドルフチューブグラインダーを使用して、エッペ
ンドルフチューブ中で四角形の培養容器中で生育させたトランスジェニック植物
の葉材料を粉砕し、HSB中で抽出した。20,000×gで10分間遠心分離後、植物抽出
物上清を採取した。Bradford試薬（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を使
用して総蛋白質量を求めた。100μgの総蛋白質を含有する蛋白質試料をドデシル
硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）試料緩衝液で95
℃において5分間変性させ、その後4〜20%濃度勾配SDS-PAGEゲル（Bio-Rad Labor
atories, Richmond, CA）によって分析した。陽性対照として、3.65μgのヒト血
漿凝固因子XIIIをSDS-PAGE中に使用した（Haematologic Technologies Inc.,Ess
ex Junction, VT）。分離した蛋白質をProtranニトロセルロース膜（Schleicher
&Schuell, Keene, NH）に電気泳動的にブロットした。一次抗体として1000倍希
釈で使用したヒツジ抗ヒト因子XIIIポリクローナル抗体PAHFXIII-S（Haematolog
ic Technologies Inc.,Essex Junction, VT）と、二次抗体として1000倍希釈で
使用したアルカリホスファターゼ-結合ウサギ抗ヒツジIgG（Jackson ImmunoRese
arch Laboratories, Inc., West Grove, PA）を用いてウェスタンブロットを実
施した。Immun-Blot Colorimetricアッセイキット（Bio-Rad Laboratories, Her
cules, CA）を使用して免疫複合体を検出した。
【００７７】 トランスジェニック因子XIII植物のウェスタンブロット結果を図E4-2および図
E4-3に示す。図E4-2では、2つのトランスジェニック植物蛋白質試料（レーン1お
よび2）をウェスタンブロット分析に使用し、3つの対照蛋白質試料を陰性対照と
して使用した。C1：形質転換していない植物蛋白質試料；C2およびC3：因子XIII
遺伝子を含有するバイナリー発現ベクターで形質転換したトランスジェニック植
物蛋白質試料。この結果は、83 kDa因子XIIIバンドはトランスジェニック因子XI
II植物のみに発現されるが、形質転換していない対照植物および形質転換した対
照植物では発現されないことを示している。図E4-3は、種々の因子XIIIトランス
ジェニック植物の別のウェスタンブロット分析の結果を示す。図E4-3において、
レーンFXIIIは陽性対照としてヒト血漿凝固因子XIIIであり、レーンSR1は陰性対
照として形質転換していない植物であり、レーン11、23、33、35、45、47はトラ
ンスジェニック植物試料である。ウェスタンブロットは少なくとも2つの主要な
蛋白質を明らかにしている。蛋白質バンドの1つは主要な83 kDa蛋白質であり、
ヒト血漿因子XIIIと同じサイズを有する。他方の蛋白質バンドは未処理の二量体
化したXIII因子Aサブユニット蛋白質の複合体であり得る、210 kDaのサイズを有
する。ウェスタンブロット分析を使用して合計40のトランスジェニック植物をス
クリーニングし、40の植物のうち37がヒトXIII因子A-サブユニットを発現した。
ウェスタンブロット分析に基づいた発現収量は、抽出した総可溶性葉蛋白質の約
0.1〜1.8%であった。
E4-3に示す。図E4-2では、2つのトランスジェニック植物蛋白質試料（レーン1お
よび2）をウェスタンブロット分析に使用し、3つの対照蛋白質試料を陰性対照と
して使用した。C1：形質転換していない植物蛋白質試料；C2およびC3：因子XIII
遺伝子を含有するバイナリー発現ベクターで形質転換したトランスジェニック植
物蛋白質試料。この結果は、83 kDa因子XIIIバンドはトランスジェニック因子XI
II植物のみに発現されるが、形質転換していない対照植物および形質転換した対
照植物では発現されないことを示している。図E4-3は、種々の因子XIIIトランス
ジェニック植物の別のウェスタンブロット分析の結果を示す。図E4-3において、
レーンFXIIIは陽性対照としてヒト血漿凝固因子XIIIであり、レーンSR1は陰性対
照として形質転換していない植物であり、レーン11、23、33、35、45、47はトラ
ンスジェニック植物試料である。ウェスタンブロットは少なくとも2つの主要な
蛋白質を明らかにしている。蛋白質バンドの1つは主要な83 kDa蛋白質であり、
ヒト血漿因子XIIIと同じサイズを有する。他方の蛋白質バンドは未処理の二量体
化したXIII因子Aサブユニット蛋白質の複合体であり得る、210 kDaのサイズを有
する。ウェスタンブロット分析を使用して合計40のトランスジェニック植物をス
クリーニングし、40の植物のうち37がヒトXIII因子A-サブユニットを発現した。
ウェスタンブロット分析に基づいた発現収量は、抽出した総可溶性葉蛋白質の約
0.1〜1.8%であった。
【００７８】 C.植物由来ヒトXIII因子Aサブユニットの活性分析 50 mM pH7.6 mM Tris-HClを含有する緩衝液中で植物葉材料から植物蛋白質試
料を抽出した。抽出混合物は20,000×gで15分間遠心分離し、上清を採取し、蛋
白質および因子XIII活性測定に使用した。Hornyakら、（1989 Biochem 28:7326
）によって記載される方法を使用して、植物由来ヒト因子XIIIの活性を測定した
。XIII因子Aサブユニット活性は、活性化XIII因子A-サブユニットのトランスア
ミダーゼ活性によってカゼインに取り込まれたモノダンシルカダベリンの量とし
て規定する（Cogganら、1984 Anal Biochem 137:402）。モノダンシルカダベリ
ンのカゼインへの取り込みは反応混合物の蛍光の増加として測定する。蛍光取り
込み反応の前に、XIII因子A-サブユニットは、アミノ末端ペプチド（4 kDa）の
トロンビン触媒切断によって活性化される。この方法では、100μlの抽出した植
物蛋白質試料を、100μlの50 mM pH7.6 Tris-HCl緩衝液、50 mM Tris-HCl緩衝液
中で調製した20μlの4 mMモノダンシルカダベリン、50 mM Tris-HCl緩衝液中で
調製した50μl 0.4 M CaCl2、1200μl 50 mM、pH 9.0ビシン緩衝液と共に2.0 ml
の反応管に加えた。反応混合物を37℃の温浴中で1分間加温した。形質転換して
いない植物蛋白質試料、因子XIII標準品（3.65μl）およびブランク（200μl Tr
is-HCl緩衝液）との反応も対照としてセットした。50μlα-トロンビン溶液を上
記の反応混合物に添加し、37℃の温浴中で10分間インキュベーションして因子XI
IIを活性化した。α-トロンビン試薬（500単位/ml, Haematologic Technologies
Inc.,Essex Junction, VT）を25 mM pH 7.5 Tris-HCl緩衝液および25%グリセロ
ール中で調製した。上記インキュベーション後、50μl の0.2M DTT溶液を反応混
合物に添加し、37℃において1分間インキュベーションした。200μlの2%N,N’-
ジメチルカゼインを反応混合物に添加し、蛍光光度計で0時間における蛍光を測
定した。その後、反応混合物をさらに37℃の温浴中でインキュベーションし、蛍
光の増加をモニターした。蛍光の総増加量を因子XIII活性を算出するために使用
した。表E4-1は、陽性対照としてヒト血漿因子XIII、陰性対照として形質転換し
ていないSR1植物蛋白質試料を使用して植物由来XIII因子A-サブユニットの活性
を示す。純粋なヒト血漿因子XIIIは、総蛋白質1ミリグラムあたり50.2単位の活
性を有する。この結果では、植物組換えXIII因子Aサブユニットの活性は、可溶
性蛋白質1ミリグラムあたり0.012〜0.237単位の範囲であることを示されている
。これは、植物総可溶性蛋白質の0.1〜2.5%のXIII因子A-サブユニット蛋白質に
相当する。
料を抽出した。抽出混合物は20,000×gで15分間遠心分離し、上清を採取し、蛋
白質および因子XIII活性測定に使用した。Hornyakら、（1989 Biochem 28:7326
）によって記載される方法を使用して、植物由来ヒト因子XIIIの活性を測定した
。XIII因子Aサブユニット活性は、活性化XIII因子A-サブユニットのトランスア
ミダーゼ活性によってカゼインに取り込まれたモノダンシルカダベリンの量とし
て規定する（Cogganら、1984 Anal Biochem 137:402）。モノダンシルカダベリ
ンのカゼインへの取り込みは反応混合物の蛍光の増加として測定する。蛍光取り
込み反応の前に、XIII因子A-サブユニットは、アミノ末端ペプチド（4 kDa）の
トロンビン触媒切断によって活性化される。この方法では、100μlの抽出した植
物蛋白質試料を、100μlの50 mM pH7.6 Tris-HCl緩衝液、50 mM Tris-HCl緩衝液
中で調製した20μlの4 mMモノダンシルカダベリン、50 mM Tris-HCl緩衝液中で
調製した50μl 0.4 M CaCl2、1200μl 50 mM、pH 9.0ビシン緩衝液と共に2.0 ml
の反応管に加えた。反応混合物を37℃の温浴中で1分間加温した。形質転換して
いない植物蛋白質試料、因子XIII標準品（3.65μl）およびブランク（200μl Tr
is-HCl緩衝液）との反応も対照としてセットした。50μlα-トロンビン溶液を上
記の反応混合物に添加し、37℃の温浴中で10分間インキュベーションして因子XI
IIを活性化した。α-トロンビン試薬（500単位/ml, Haematologic Technologies
Inc.,Essex Junction, VT）を25 mM pH 7.5 Tris-HCl緩衝液および25%グリセロ
ール中で調製した。上記インキュベーション後、50μl の0.2M DTT溶液を反応混
合物に添加し、37℃において1分間インキュベーションした。200μlの2%N,N’-
ジメチルカゼインを反応混合物に添加し、蛍光光度計で0時間における蛍光を測
定した。その後、反応混合物をさらに37℃の温浴中でインキュベーションし、蛍
光の増加をモニターした。蛍光の総増加量を因子XIII活性を算出するために使用
した。表E4-1は、陽性対照としてヒト血漿因子XIII、陰性対照として形質転換し
ていないSR1植物蛋白質試料を使用して植物由来XIII因子A-サブユニットの活性
を示す。純粋なヒト血漿因子XIIIは、総蛋白質1ミリグラムあたり50.2単位の活
性を有する。この結果では、植物組換えXIII因子Aサブユニットの活性は、可溶
性蛋白質1ミリグラムあたり0.012〜0.237単位の範囲であることを示されている
。これは、植物総可溶性蛋白質の0.1〜2.5%のXIII因子A-サブユニット蛋白質に
相当する。
【表Ｅ４−１】 *Δ蛍光は、270分経過時における蛍光から0時間における蛍光を引いて算出した
。
。
【００７９】 D.種々の葉位置における植物組換えXIII因子Aサブユニットの発現 ヒトXIII因子A-サブユニット蛋白質を発現するトランスジェニックタバコ植物
を温室で完全に生育するまで栽培した。ウェスタンブロット分析を使用して異な
る葉位置においてXIII因子Aサブユニットの発現を試験した。壊死性黄変葉を除
いて、上部から底部までの位置で1、3、5および7枚目の葉から、HSB緩衝液を使
用して蛋白質試料を抽出した。7.5% SDS-PAGEを使用して蛋白質試料を分析し、
その後ニトロセルロース膜にブロットした。一次抗体として1000倍希釈で使用し
たヒツジ抗ヒト因子XIIIポリクローナル抗体PAHFXIII-S（Haematologic Technol
ogies Inc.,Essex Junction, VT）と、二次抗体として1000倍希釈で使用したア
ルカリホスファターゼ-結合ウサギ抗ヒツジIgG（Jackson ImmunoResearch Labor
atories, Inc., West Grove, PA）を用いてウェスタンブロットを実施した。Imm
un-Blot Colorimetricアッセイキット（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）
を使用して免疫複合体を検出した。ウェスタンブロット分析の結果を図E4-4に示
す。図E4-4では、レーンFXIIIは陽性対照としてのヒト因子XIIIはヒト因子XIII
蛋白質試料（3.65μg）であり、レーンSR1は形質転換していない植物蛋白質試料
（100μg）であり、レーンSJは四角い培養容器中で生育させた天葉のトランスジ
ェニック植物蛋白質試料（100μg）であり、レーンG1、G3、G5およびG7はトラン
スジェニック植物の、それぞれ、葉位置1、3、5および7の蛋白質試料（100μg）
である。XIII因子A-サブユニットの発現は異なる葉位置でも同様の発現レベルで
あることがわかる。また、因子XIII蛋白質の発現レベルは、四角い培養容器のト
ランスジェニック植物と、温室で生育させた植物とで同じである。しかし、免疫
活性を有する210kDa蛋白質バンドは、葉位置が1から3、5および7と変化するにつ
れて徐々に消失する。これは、おそらく、XIII因子A-サブユニット複合体と推定
されるものの翻訳後修飾が終了し、1本鎖のXIII因子A-サブユニットを放出する
ためであると考えられる。
を温室で完全に生育するまで栽培した。ウェスタンブロット分析を使用して異な
る葉位置においてXIII因子Aサブユニットの発現を試験した。壊死性黄変葉を除
いて、上部から底部までの位置で1、3、5および7枚目の葉から、HSB緩衝液を使
用して蛋白質試料を抽出した。7.5% SDS-PAGEを使用して蛋白質試料を分析し、
その後ニトロセルロース膜にブロットした。一次抗体として1000倍希釈で使用し
たヒツジ抗ヒト因子XIIIポリクローナル抗体PAHFXIII-S（Haematologic Technol
ogies Inc.,Essex Junction, VT）と、二次抗体として1000倍希釈で使用したア
ルカリホスファターゼ-結合ウサギ抗ヒツジIgG（Jackson ImmunoResearch Labor
atories, Inc., West Grove, PA）を用いてウェスタンブロットを実施した。Imm
un-Blot Colorimetricアッセイキット（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）
を使用して免疫複合体を検出した。ウェスタンブロット分析の結果を図E4-4に示
す。図E4-4では、レーンFXIIIは陽性対照としてのヒト因子XIIIはヒト因子XIII
蛋白質試料（3.65μg）であり、レーンSR1は形質転換していない植物蛋白質試料
（100μg）であり、レーンSJは四角い培養容器中で生育させた天葉のトランスジ
ェニック植物蛋白質試料（100μg）であり、レーンG1、G3、G5およびG7はトラン
スジェニック植物の、それぞれ、葉位置1、3、5および7の蛋白質試料（100μg）
である。XIII因子A-サブユニットの発現は異なる葉位置でも同様の発現レベルで
あることがわかる。また、因子XIII蛋白質の発現レベルは、四角い培養容器のト
ランスジェニック植物と、温室で生育させた植物とで同じである。しかし、免疫
活性を有する210kDa蛋白質バンドは、葉位置が1から3、5および7と変化するにつ
れて徐々に消失する。これは、おそらく、XIII因子A-サブユニット複合体と推定
されるものの翻訳後修飾が終了し、1本鎖のXIII因子A-サブユニットを放出する
ためであると考えられる。
【００８０】実施例5-トロンビン A.プレトロンビン-2遺伝子挿入の確認 実施例1に記載するベクターpGA2043およびpGA2049を使用した。実施例2に記載
するアグロバクテリウム法を使用してタバコ植物を形質転換した。カナマイシン
耐性スクリーニングにより陽性形質転換体を得た後、選択培地スクリーニングに
よって完全に生育した17のタバコ植物形質転換体を得て、トランスジェニック植
物ゲノムにプレトロンビン-2遺伝子が挿入されたことを確認するために使用した
。ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB）ミニプレパレーショ
ン法を使用して、これらの植物のゲノムDNAを調製した。簡単に述べると、この
方法では、少量の植物材料（25〜100 mg）を液体窒素で微細粉末に粉砕し、3% C
TAB、1.42 M NaCl、20 mM EDTA、100 mM Tris-HCl、5 mMアスコルビン酸および2
%（w/v）ポリビニルピロリドン（PVP-40; Sigma Chemical Co.）を含有する抽出
緩衝液中でゲノムDNAについて65℃で抽出し、その後フェノール-クロロホルム抽
出を実施した。10,000×gで5分間遠心分離後、上層の水相を回収し、酢酸ナトリ
ウムの存在下でイソプロパノール中でゲノムDNAを沈殿させた。先に記載したプ
ライマーP1およびP4を使用したPCRによって、得られたDNA試料をプレトロンビン
-2遺伝子増幅に使用した。PCR結果を図E5-1に示す。この図では、レーンSはサイ
ズマーカーであり、レーンPTは陽性対照としてシグナル配列を有するプレトロン
ビン-2DNAであり、レーンSR1は陰性対照として形質転換していない植物であり、
レーン1、2、3は、バイナリーベクターpGA2043で形質転換したトランスジェニッ
ク植物試料であり、レーン4はバイナリーベクターpGA2049で形質転換したトラン
スジェニック植物試料である。結果は、1.06 kbの別個のDNAバンドが全てのトラ
ンスジェニック植物に存在し、シグナル配列を有するプレトロンビン-2遺伝子の
PCRバンドに一致する。形質転換していない植物DNA試料中では1.06 kbバンドは
観察されない。ここでの結果により、プレトロンビン-2遺伝子のタバコ植物ゲノ
ムへの挿入が確認されている。
するアグロバクテリウム法を使用してタバコ植物を形質転換した。カナマイシン
耐性スクリーニングにより陽性形質転換体を得た後、選択培地スクリーニングに
よって完全に生育した17のタバコ植物形質転換体を得て、トランスジェニック植
物ゲノムにプレトロンビン-2遺伝子が挿入されたことを確認するために使用した
。ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB）ミニプレパレーショ
ン法を使用して、これらの植物のゲノムDNAを調製した。簡単に述べると、この
方法では、少量の植物材料（25〜100 mg）を液体窒素で微細粉末に粉砕し、3% C
TAB、1.42 M NaCl、20 mM EDTA、100 mM Tris-HCl、5 mMアスコルビン酸および2
%（w/v）ポリビニルピロリドン（PVP-40; Sigma Chemical Co.）を含有する抽出
緩衝液中でゲノムDNAについて65℃で抽出し、その後フェノール-クロロホルム抽
出を実施した。10,000×gで5分間遠心分離後、上層の水相を回収し、酢酸ナトリ
ウムの存在下でイソプロパノール中でゲノムDNAを沈殿させた。先に記載したプ
ライマーP1およびP4を使用したPCRによって、得られたDNA試料をプレトロンビン
-2遺伝子増幅に使用した。PCR結果を図E5-1に示す。この図では、レーンSはサイ
ズマーカーであり、レーンPTは陽性対照としてシグナル配列を有するプレトロン
ビン-2DNAであり、レーンSR1は陰性対照として形質転換していない植物であり、
レーン1、2、3は、バイナリーベクターpGA2043で形質転換したトランスジェニッ
ク植物試料であり、レーン4はバイナリーベクターpGA2049で形質転換したトラン
スジェニック植物試料である。結果は、1.06 kbの別個のDNAバンドが全てのトラ
ンスジェニック植物に存在し、シグナル配列を有するプレトロンビン-2遺伝子の
PCRバンドに一致する。形質転換していない植物DNA試料中では1.06 kbバンドは
観察されない。ここでの結果により、プレトロンビン-2遺伝子のタバコ植物ゲノ
ムへの挿入が確認されている。
【００８１】 B.ウェスタンブロット分析 50 mM pH7.5 Tris-HCl、0.5 M NaCl、0.05% Nonidet P-40および1.0 mMフェニ
ルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）を含有する高塩緩衝液（HSB）を使用
して、形質転換した植物および形質転換しない植物から総植物葉蛋白質を抽出し
た。エッペンドルフチューブグラインダーを使用して、エッペンドルフチューブ
中で四角形の培養容器中で生育させたトランスジェニック植物の葉材料を粉砕し
、HSB中で抽出した。20,000×gで10分間遠心分離後、植物抽出物上清試料を採取
した。蛋白質標準としてBradford試薬（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）
および牛血清アルブミンを使用して総蛋白質量を求めた。100μgの総蛋白質を含
有する蛋白質試料をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS-PAGE）試料緩衝液で95℃において5分間変性させ、その後4〜20%濃度勾配S
DS-PAGE（Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA）によって分析した。陽性対照
として、6.5μgのヒト血漿α-トロンビンを陽性対照としてSDS-PAGEに使用した
（Haematologic Technologies Inc.,Essex Junction, VT）。分離した蛋白質をP
rotranニトロセルロース膜（Schleicher&Schuell, Keene, NH）に電気泳動的に
ブロットした。一次抗体として1000倍希釈で使用したヒツジ抗ヒトプロトロンビ
ンポリクローナル抗体PAHFII-S（Haematologic Technologies Inc.,Essex Junct
ion, VT）と、二次抗体として1000倍希釈で使用したアルカリホスファターゼ-結
合ウサギ抗ヒツジIgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Gro
ve, PA）を用いてウェスタンブロットを実施した。Immun-Blot Colorimetricア
ッセイキット（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を使用して免疫複合体を
検出した。トランスジェニックプレトロンビン-2植物におけるウェスタンブロッ
トの結果を図E5-2に示す。この図では、レーンTHは陽性対照として使用したヒト
血漿α-トロンビンであり、レーン1、2、3および4はプレトロンビン-2トランス
ジェニック植物試料であり、レーンCは陰性対照として使用した形質転換してい
ない植物である。トランスジェニック試料3および4は39kDaのプレトロンビン-2
バンドを示し、これはヒトα-トロンビン（34kDa）より約5kDa大きい。5-kDaの
差は、おそらく、シグナルペプチド（4.5kDa）と6-ヒスチジン標識（0.66 kDa）
の不完全な切断によると考えられる。
ルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）を含有する高塩緩衝液（HSB）を使用
して、形質転換した植物および形質転換しない植物から総植物葉蛋白質を抽出し
た。エッペンドルフチューブグラインダーを使用して、エッペンドルフチューブ
中で四角形の培養容器中で生育させたトランスジェニック植物の葉材料を粉砕し
、HSB中で抽出した。20,000×gで10分間遠心分離後、植物抽出物上清試料を採取
した。蛋白質標準としてBradford試薬（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）
および牛血清アルブミンを使用して総蛋白質量を求めた。100μgの総蛋白質を含
有する蛋白質試料をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS-PAGE）試料緩衝液で95℃において5分間変性させ、その後4〜20%濃度勾配S
DS-PAGE（Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA）によって分析した。陽性対照
として、6.5μgのヒト血漿α-トロンビンを陽性対照としてSDS-PAGEに使用した
（Haematologic Technologies Inc.,Essex Junction, VT）。分離した蛋白質をP
rotranニトロセルロース膜（Schleicher&Schuell, Keene, NH）に電気泳動的に
ブロットした。一次抗体として1000倍希釈で使用したヒツジ抗ヒトプロトロンビ
ンポリクローナル抗体PAHFII-S（Haematologic Technologies Inc.,Essex Junct
ion, VT）と、二次抗体として1000倍希釈で使用したアルカリホスファターゼ-結
合ウサギ抗ヒツジIgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Gro
ve, PA）を用いてウェスタンブロットを実施した。Immun-Blot Colorimetricア
ッセイキット（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を使用して免疫複合体を
検出した。トランスジェニックプレトロンビン-2植物におけるウェスタンブロッ
トの結果を図E5-2に示す。この図では、レーンTHは陽性対照として使用したヒト
血漿α-トロンビンであり、レーン1、2、3および4はプレトロンビン-2トランス
ジェニック植物試料であり、レーンCは陰性対照として使用した形質転換してい
ない植物である。トランスジェニック試料3および4は39kDaのプレトロンビン-2
バンドを示し、これはヒトα-トロンビン（34kDa）より約5kDa大きい。5-kDaの
差は、おそらく、シグナルペプチド（4.5kDa）と6-ヒスチジン標識（0.66 kDa）
の不完全な切断によると考えられる。
【００８２】 C.プレトロンビン-2蛋白質の精製および銀染色分析 1mM PMSFを添加したHSB緩衝液を使用して、トランスジェニックプレトロンビ
ン-2植物の葉材料から総蛋白質試料を抽出した。1グラムの葉組織を最初に液体
窒素中で粉末に粉砕し、乳鉢および乳棒を使用して、5 mlのHSB緩衝液中に抽出
した。その後、試料を20,000×gで10分間遠心分離し、上清を後の蛋白質精製の
ために保存した。金属キレート形成セファロースFast Flow（Pharmacia Biotech
, Piscataway, NJ）をプレトロンビン-2蛋白質精製に使用した。各試料について
、3mlの使い捨てカラムに1ミリリッターの金属キレート形成セファロースを充填
した。セファロースは以下のように調製した：4容量の脱イオン水で洗浄し、2容
量の0.1 M NiSO4溶液で活性化し、6容量の脱イオン水で再度洗浄し、4容量のHSB
緩衝液で平衡化させた。5ミリリッターの蛋白質試料上清をカラムに適用し、そ
の後6容量の10 mMのpH8.0イミダゾール溶液で洗浄した。セファロースに結合し
た蛋白質を500 mMのpH8.0イミダゾール溶液で溶出し、溶出した試料は0.5ml分量
ずつ採取した。Bio-Rad蛋白質アッセイ試薬（Bio-Rad Laboratories）を使用し
た蛋白質濃度測定に基づくと、2番目および3番目の0.50 ml試料は溶出した蛋白
質のほとんどを含有したので、2番目および3番目の0.50 ml試料を合わせた。10
μgの溶出した蛋白質を含有する蛋白質試料をSDS-PAGE試料緩衝液中で95℃にお
いて変性させ、その後4〜20%濃度勾配SDS-PAGEによって分析した。分離後、銀染
色プラスキット（Bio-Rad Laboratories）を使用してゲルを染色した。結果を図
E5-3に示す。この図では、レーンSMは蛋白質サイズマーカーであり、レーンTHは
ヒトα-トロンビン蛋白質試料であり、レーンC1は形質転換していない植物蛋白
質試料であり、レーンC2はトランスジェニック植物対照蛋白質試料であり、レー
ン1、2および3はプレトロンビン-2トランスジェニック植物蛋白質試料である。
図E5-3からわかるように、試料2および3は、図E5-2に示すものと同一の植物由来
プレトロンビン-2蛋白質である39 kDaの蛋白質バンドを示す。このバンドは形質
転換していない、または形質転換した対照試料中では示されていない。
ン-2植物の葉材料から総蛋白質試料を抽出した。1グラムの葉組織を最初に液体
窒素中で粉末に粉砕し、乳鉢および乳棒を使用して、5 mlのHSB緩衝液中に抽出
した。その後、試料を20,000×gで10分間遠心分離し、上清を後の蛋白質精製の
ために保存した。金属キレート形成セファロースFast Flow（Pharmacia Biotech
, Piscataway, NJ）をプレトロンビン-2蛋白質精製に使用した。各試料について
、3mlの使い捨てカラムに1ミリリッターの金属キレート形成セファロースを充填
した。セファロースは以下のように調製した：4容量の脱イオン水で洗浄し、2容
量の0.1 M NiSO4溶液で活性化し、6容量の脱イオン水で再度洗浄し、4容量のHSB
緩衝液で平衡化させた。5ミリリッターの蛋白質試料上清をカラムに適用し、そ
の後6容量の10 mMのpH8.0イミダゾール溶液で洗浄した。セファロースに結合し
た蛋白質を500 mMのpH8.0イミダゾール溶液で溶出し、溶出した試料は0.5ml分量
ずつ採取した。Bio-Rad蛋白質アッセイ試薬（Bio-Rad Laboratories）を使用し
た蛋白質濃度測定に基づくと、2番目および3番目の0.50 ml試料は溶出した蛋白
質のほとんどを含有したので、2番目および3番目の0.50 ml試料を合わせた。10
μgの溶出した蛋白質を含有する蛋白質試料をSDS-PAGE試料緩衝液中で95℃にお
いて変性させ、その後4〜20%濃度勾配SDS-PAGEによって分析した。分離後、銀染
色プラスキット（Bio-Rad Laboratories）を使用してゲルを染色した。結果を図
E5-3に示す。この図では、レーンSMは蛋白質サイズマーカーであり、レーンTHは
ヒトα-トロンビン蛋白質試料であり、レーンC1は形質転換していない植物蛋白
質試料であり、レーンC2はトランスジェニック植物対照蛋白質試料であり、レー
ン1、2および3はプレトロンビン-2トランスジェニック植物蛋白質試料である。
図E5-3からわかるように、試料2および3は、図E5-2に示すものと同一の植物由来
プレトロンビン-2蛋白質である39 kDaの蛋白質バンドを示す。このバンドは形質
転換していない、または形質転換した対照試料中では示されていない。
【００８３】 D.プロトロンビンおよびプレトロンビン-2一過的発現ベクター構築 Dr. Earl W. Davie, Biochemistry Department, University of Washington,
Seattle, Washington（Friezner Degenら、前記 1983）からベクターpHII-3にお
ける全長ヒトプロトロンビン遺伝子（2006 bp）を入手した。プロトロンビン一
過的発現ベクターを構築する際にはいくつかの段階が含まれる。第1の段階では
、バイナリーベクターpGA643（An, 1995）中にカリフラワーモザイクウィルスプ
ロモーターCaMV 35Sプロモーター（P 35S）、多数のクローニング部位（MSC）お
よび転写ターミネーター（T7-T5）だけを有する発現カセットを、以下のプライ
マーを用いたTaq ポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA）によってPCRを使
用してクローニングした。
Seattle, Washington（Friezner Degenら、前記 1983）からベクターpHII-3にお
ける全長ヒトプロトロンビン遺伝子（2006 bp）を入手した。プロトロンビン一
過的発現ベクターを構築する際にはいくつかの段階が含まれる。第1の段階では
、バイナリーベクターpGA643（An, 1995）中にカリフラワーモザイクウィルスプ
ロモーターCaMV 35Sプロモーター（P 35S）、多数のクローニング部位（MSC）お
よび転写ターミネーター（T7-T5）だけを有する発現カセットを、以下のプライ
マーを用いたTaq ポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA）によってPCRを使
用してクローニングした。
【００８４】 図E5-4に示すように、クローニングした発現カセットをプラスミドベクターpG
EM-T（Promega, Madison, WI）にライゲーションして、一過的植物発現ベクター
pGA2054aを作製した。ベクターpGA2054aはまたアンピシリン耐性遺伝子（Amp）
およびf1ファージ起点（f1 ori）を含有する。発現試験のために、異種遺伝子を
この一過的ベクターpGA2054aにクローニングすることができる。
EM-T（Promega, Madison, WI）にライゲーションして、一過的植物発現ベクター
pGA2054aを作製した。ベクターpGA2054aはまたアンピシリン耐性遺伝子（Amp）
およびf1ファージ起点（f1 ori）を含有する。発現試験のために、異種遺伝子を
この一過的ベクターpGA2054aにクローニングすることができる。
【００８５】 第2に、遺伝子の5'末端にXba Iクローニング部位および3'末端にClaクローニ
ング部位を適合させるために、Taqポリメラーゼ（Stratagene）によるPCRを使用
して、ヒトプロトロンビンおよびプレトロンビン遺伝子をクローニングした。以
下のプライマーP1およびP3をプロトロンビンPCRクローニング反応に使用し、プ
ライマーP2およびP3をプレトロンビン-2クローニング反応に使用した。クローニ
ングしたプレトロンビン-2も遺伝子の5'末端の開始コドンATGに適合させた。
ング部位を適合させるために、Taqポリメラーゼ（Stratagene）によるPCRを使用
して、ヒトプロトロンビンおよびプレトロンビン遺伝子をクローニングした。以
下のプライマーP1およびP3をプロトロンビンPCRクローニング反応に使用し、プ
ライマーP2およびP3をプレトロンビン-2クローニング反応に使用した。クローニ
ングしたプレトロンビン-2も遺伝子の5'末端の開始コドンATGに適合させた。
【００８６】 その後、クローニングしたプロトロンビン遺伝子をベクターpGEM-T（Promega, Madison, WI）にライゲーションし、図E5-5に示すようにベクターpGA2056を作
製した。また、プレトロンビン2遺伝子をpGEM-Tにライゲーションし、図E5-6に
示すようにベクターpGA2057を作製した。pGA2056のプロトロンビン遺伝子および
pGA2057のプレトロンビン-2遺伝子を、それぞれ、Xba IおよびCla I制限酵素で
切り出した。逐次的に、これらの遺伝子を一過的ベクターpGA2054aのXba Iおよ
びCla I部位にそれぞれクローニングし、それぞれ、図E5-7に示すプロトロンビ
ン-2一過的発現ベクターｐGA2058および図5-8に示すプレトロンビン-2一過的発
現ベクターpGA2059を作製した。
製した。また、プレトロンビン2遺伝子をpGEM-Tにライゲーションし、図E5-6に
示すようにベクターpGA2057を作製した。pGA2056のプロトロンビン遺伝子および
pGA2057のプレトロンビン-2遺伝子を、それぞれ、Xba IおよびCla I制限酵素で
切り出した。逐次的に、これらの遺伝子を一過的ベクターpGA2054aのXba Iおよ
びCla I部位にそれぞれクローニングし、それぞれ、図E5-7に示すプロトロンビ
ン-2一過的発現ベクターｐGA2058および図5-8に示すプレトロンビン-2一過的発
現ベクターpGA2059を作製した。
【００８７】 E.タバコプロトプラストのエレクトロポレーションを使用した一過的分析 プロトプラストを調製するために3日目のNT1タバコ細胞懸濁液を使用した。簡単
に説明すると、10 mg/lセルロース、500μg/mlペクトポリアーゼ（pectoplyase
）（Kanematsu-Gosho, Los Angeles,CA）および0.4 M D-マンニトールを含有す
るpH 5.8の溶液で28℃において100rpmで20分間処理することによって、プロトプ
ラストを単離した。次いで、プロトプラストを0.4 Mマンニトールで丁寧に洗浄
してセルロースおよびペクトリアーゼを除去した。最後に、1×106個のプロトプ
ラストを、2.38mg/ml HEPES、8.76 mg/ml NaCl、735μg/mlCaCl2および0.4 M D-
マンニトールを含有する0.5 mlのpH 5.5のエレクトロポレーション緩衝液中に懸
濁させた。
に説明すると、10 mg/lセルロース、500μg/mlペクトポリアーゼ（pectoplyase
）（Kanematsu-Gosho, Los Angeles,CA）および0.4 M D-マンニトールを含有す
るpH 5.8の溶液で28℃において100rpmで20分間処理することによって、プロトプ
ラストを単離した。次いで、プロトプラストを0.4 Mマンニトールで丁寧に洗浄
してセルロースおよびペクトリアーゼを除去した。最後に、1×106個のプロトプ
ラストを、2.38mg/ml HEPES、8.76 mg/ml NaCl、735μg/mlCaCl2および0.4 M D-
マンニトールを含有する0.5 mlのpH 5.5のエレクトロポレーション緩衝液中に懸
濁させた。
【００８８】 pGA2058およびpGA2059の20μgスーパーコイルプラスミドDNA並びにキャリヤー
DNAとして10μgサケ精子DNAを添加した後、210μFのコンデンサーを用いた300ボ
ルトパルスを使用して、プロトプラストをエレクトロポレーションした。その後
、ペトリ皿の7 mlのプロトプラスト培養培地内に処理したプロトプラストを移し
、28℃において48時間培養した。培養培地は、3%スクロース、0.18 mg/ml KH2PO 4 、0.1 mg/mlイノシトール、1μg/ml塩酸チアミンおよび0.2μg/ml 2,4-ジクロ
ロフェノキシ酢酸（2.4-D）を添加した4.3 mg/ml MS塩並びに0.4 M D-マンニト
ールを含有する改良Murashige and Skoog（MS）培地（MurashigeおよびSkoog, 1
962）である。
DNAとして10μgサケ精子DNAを添加した後、210μFのコンデンサーを用いた300ボ
ルトパルスを使用して、プロトプラストをエレクトロポレーションした。その後
、ペトリ皿の7 mlのプロトプラスト培養培地内に処理したプロトプラストを移し
、28℃において48時間培養した。培養培地は、3%スクロース、0.18 mg/ml KH2PO 4 、0.1 mg/mlイノシトール、1μg/ml塩酸チアミンおよび0.2μg/ml 2,4-ジクロ
ロフェノキシ酢酸（2.4-D）を添加した4.3 mg/ml MS塩並びに0.4 M D-マンニト
ールを含有する改良Murashige and Skoog（MS）培地（MurashigeおよびSkoog, 1
962）である。
【００８９】 培養したプロトプラストをゆるやかな遠心分離によって採取し、50 mM Tris-H
Cl pH 8.3、227 mM NaCl、1 mg/mlウシ血清アルブミンおよび1 mg/mlアジ化ナト
リウムを含有する100μlの抽出緩衝液中に懸濁した。プロトプラストを30秒間隔
で8秒間を3回超音波処理することによって、蛋白質試料を抽出した。超音波処理
した混合物を15,000×5分間遠心分離することによって、蛋白質試料を採取した
。上清を取り、Bio-Rad蛋白質測定法（Bio-Rad, Hercules, CA）を使用して、蛋
白質濃度を測定した。
Cl pH 8.3、227 mM NaCl、1 mg/mlウシ血清アルブミンおよび1 mg/mlアジ化ナト
リウムを含有する100μlの抽出緩衝液中に懸濁した。プロトプラストを30秒間隔
で8秒間を3回超音波処理することによって、蛋白質試料を抽出した。超音波処理
した混合物を15,000×5分間遠心分離することによって、蛋白質試料を採取した
。上清を取り、Bio-Rad蛋白質測定法（Bio-Rad, Hercules, CA）を使用して、蛋
白質濃度を測定した。
【００９０】 50マイクログラムの抽出した蛋白質を、一過的に発現されたプロトロンビンま
たはプレトロンビン-2によって放出されるα-トロンビンを測定に用いた。ヒト
プロトロンビン（Haematologic Technologies Inc., Vermont）を陽性対照とし
て使用し、エレクトロポレーションした形質転換していないNT1プロトプラスト
由来の蛋白質試料を陰性対照として使用した。エカリン（Sigma）を使用して、
プロトロンビンおよびプレトロンビン-2を切断して活性α-トロンビン蛋白質を
放出した。1単位のエカリンを各試料に添加し、試料を37℃において15分間イン
キュベーションした。各分析は、エカリンと反応させた100μlの試料を速やかに
0.9 mlの抽出緩衝液および0.1 mlの1.25 mg/mlのChromozym TH溶液と混合して、
吸光度の変化を分光光度法によってモニターした。結果を表E5-1に示す。
たはプレトロンビン-2によって放出されるα-トロンビンを測定に用いた。ヒト
プロトロンビン（Haematologic Technologies Inc., Vermont）を陽性対照とし
て使用し、エレクトロポレーションした形質転換していないNT1プロトプラスト
由来の蛋白質試料を陰性対照として使用した。エカリン（Sigma）を使用して、
プロトロンビンおよびプレトロンビン-2を切断して活性α-トロンビン蛋白質を
放出した。1単位のエカリンを各試料に添加し、試料を37℃において15分間イン
キュベーションした。各分析は、エカリンと反応させた100μlの試料を速やかに
0.9 mlの抽出緩衝液および0.1 mlの1.25 mg/mlのChromozym TH溶液と混合して、
吸光度の変化を分光光度法によってモニターした。結果を表E5-1に示す。
【表Ｅ５−１】 一過的発現方法によって調製した蛋白質試料においてエカリン
処理によって放出されたα-トロンビン活性 各試料は1単位のエカリンで等しく処理した。トランスジェニック試料は、個々
に調製したプラスミドDNAによって一過的に発現される。
処理によって放出されたα-トロンビン活性 各試料は1単位のエカリンで等しく処理した。トランスジェニック試料は、個々
に調製したプラスミドDNAによって一過的に発現される。
【００９１】実施例6-プロ-凝固因子IX A.IX因子遺伝子挿入の確認 実施例1に記載するベクターpGA2029およびpGA2030を使用する。実施例2に記載
するアグロバクテリウム法を使用してタバコ植物を形質転換した。カナマイシン
耐性スクリーニングにより陽性形質転換体を得た後、選択培地スクリーニング方
法によってpGA2029およびpGA2030を形質転換するための、それぞれ、40および37
のタバコ植物形質転換体を得て、トランスジェニック植物ゲノムにIX因子遺伝子
が挿入されたことを確認した。ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド
（CTAB）ミニプレパレーション法を使用して、これらの植物のゲノムDNAを調製
した。簡単に述べると、この方法では、少量の植物材料（25〜100 mg）を液体窒
素で微細粉末に粉砕し、3% CTAB、1.42 M NaCl、20 mM EDTA、100 mM Tris-HCl
、5 mMアスコルビン酸および2%（w/v）ポリビニルピロリドン（PVP-40; Sigma C
hemical Co.）を含有する抽出緩衝液中でゲノムDNAについて65℃で抽出し、その
後フェノール-クロロホルム抽出を実施した。10,000×gで5分間遠心分離後、上
層の水相を回収し、酢酸ナトリウムの存在下でイソプロパノール中でゲノムDNA
を沈殿させた。先に記載したプライマーP1およびP2を使用したPCRによって、得
られたDNA試料をIX因子遺伝子増幅に使用した。PCR結果を図E6-1に示す。この図
では、レーンSはサイズマーカーで、レーンFIXは陽性対照として作用するIX因子
DNAであり、レーンSR1は陰性対照として作用する形質転換していない植物であり
、レーン1、2、3および4は、バイナリーベクターpGA2029で形質転換したトラン
スジェニック植物試料である。図E6-2は、バイナリーベクターpGA2030で形質転
換したトランスジェニック植物と類似した結果を示す。図E6-1および図6-2は、
プレ-プロ-IX因子遺伝子（陽性対照）のサイズに相当する、1.28 kbの別個のDNA
バンドが全てのトランスジェニック植物に存在することを示す。IX因子遺伝子の
挿入は、バイナリーベクターpGA2029およびpGA2030の、それぞれ、合計38および
34のトランスジェニック植物中で確認された。
するアグロバクテリウム法を使用してタバコ植物を形質転換した。カナマイシン
耐性スクリーニングにより陽性形質転換体を得た後、選択培地スクリーニング方
法によってpGA2029およびpGA2030を形質転換するための、それぞれ、40および37
のタバコ植物形質転換体を得て、トランスジェニック植物ゲノムにIX因子遺伝子
が挿入されたことを確認した。ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド
（CTAB）ミニプレパレーション法を使用して、これらの植物のゲノムDNAを調製
した。簡単に述べると、この方法では、少量の植物材料（25〜100 mg）を液体窒
素で微細粉末に粉砕し、3% CTAB、1.42 M NaCl、20 mM EDTA、100 mM Tris-HCl
、5 mMアスコルビン酸および2%（w/v）ポリビニルピロリドン（PVP-40; Sigma C
hemical Co.）を含有する抽出緩衝液中でゲノムDNAについて65℃で抽出し、その
後フェノール-クロロホルム抽出を実施した。10,000×gで5分間遠心分離後、上
層の水相を回収し、酢酸ナトリウムの存在下でイソプロパノール中でゲノムDNA
を沈殿させた。先に記載したプライマーP1およびP2を使用したPCRによって、得
られたDNA試料をIX因子遺伝子増幅に使用した。PCR結果を図E6-1に示す。この図
では、レーンSはサイズマーカーで、レーンFIXは陽性対照として作用するIX因子
DNAであり、レーンSR1は陰性対照として作用する形質転換していない植物であり
、レーン1、2、3および4は、バイナリーベクターpGA2029で形質転換したトラン
スジェニック植物試料である。図E6-2は、バイナリーベクターpGA2030で形質転
換したトランスジェニック植物と類似した結果を示す。図E6-1および図6-2は、
プレ-プロ-IX因子遺伝子（陽性対照）のサイズに相当する、1.28 kbの別個のDNA
バンドが全てのトランスジェニック植物に存在することを示す。IX因子遺伝子の
挿入は、バイナリーベクターpGA2029およびpGA2030の、それぞれ、合計38および
34のトランスジェニック植物中で確認された。
【００９２】 B.蛋白質精製および蛋白質ゲル染色 形質転換した植物および形質転換していない植物から植物葉材料を採取した。
50 mM pH7.5 Tris-HCl、0.5 M NaCl、0.05% Nonidet P-40および1.0 mMフェニル
メチルスルホニルフルオライド（PMSF）を含有する高塩緩衝液（HSB）を総蛋白
質抽出に使用した。最初に、乳鉢および乳棒を用いて液体窒素中で葉材料を粉砕
し、その後当容量のHSB緩衝液中で抽出した。20,000×gで10分間遠心分離した後
、植物抽出液上清を採取した。Bradford試薬（Bio-Rad Laboratories, Hercules
, CA）および蛋白質標準品としてのウシ血清アルブミンを使用して総蛋白質量を
求めた。金属キレート形成セファロース（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ
）を使用して、蛋白質抽出物を6-ヒスチジン標識IX因子蛋白質について精製した
。3mlのサイズカラムに1ミリリッターの金属キレート形成セファロースを充填し
、0.1 M NiSO4溶液によって活性化した。6容量の脱イオン水で十分に洗浄し、4
容量のHSB緩衝液で平衡させた後、蛋白質試料上清（5 ml）をカラムに適用し、
その後6容量の10 mMのpH8.0イミダゾール溶液で洗浄した。セファロースに結合
した蛋白質を50 mMのpH6.0イミダゾール溶液で溶出し、溶出した試料は0.5ml分
量ずつ採取した。2番目の0.5 ml試料が最も多く蛋白質を含有しており、ゲル電
気泳動に使用した。40μgの溶出した蛋白質を含有する蛋白質試料をSDS-PAGE試
料緩衝液中で95℃において変性させ、その後4〜20%濃度勾配SDS-PAGEによって分
析した。分離後、クマシーブリリアントブルー溶液を使用してゲルを染色した。
結果を図E6-3に示す。この図では、レーンFIXはIX因子標準品（Haematologic Te
chnologies Inc., Essex Junction, VT）であり、レーンCは形質転換していない
植物蛋白質試料であり、レーン1および2は形質転換した植物蛋白質試料である。
結果は、組換え植物由来ヒトIX因子は約65 kDのサイズを有することを示してい
る。レーン1の形質転換した植物試料は、形質転換していない植物試料では観察
されない約58 kDの独自のバンドを示す。レーン2の形質転換した植物試料は、ゲ
ル染色では同様の58 kDの蛋白質バンドを示さない。
50 mM pH7.5 Tris-HCl、0.5 M NaCl、0.05% Nonidet P-40および1.0 mMフェニル
メチルスルホニルフルオライド（PMSF）を含有する高塩緩衝液（HSB）を総蛋白
質抽出に使用した。最初に、乳鉢および乳棒を用いて液体窒素中で葉材料を粉砕
し、その後当容量のHSB緩衝液中で抽出した。20,000×gで10分間遠心分離した後
、植物抽出液上清を採取した。Bradford試薬（Bio-Rad Laboratories, Hercules
, CA）および蛋白質標準品としてのウシ血清アルブミンを使用して総蛋白質量を
求めた。金属キレート形成セファロース（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ
）を使用して、蛋白質抽出物を6-ヒスチジン標識IX因子蛋白質について精製した
。3mlのサイズカラムに1ミリリッターの金属キレート形成セファロースを充填し
、0.1 M NiSO4溶液によって活性化した。6容量の脱イオン水で十分に洗浄し、4
容量のHSB緩衝液で平衡させた後、蛋白質試料上清（5 ml）をカラムに適用し、
その後6容量の10 mMのpH8.0イミダゾール溶液で洗浄した。セファロースに結合
した蛋白質を50 mMのpH6.0イミダゾール溶液で溶出し、溶出した試料は0.5ml分
量ずつ採取した。2番目の0.5 ml試料が最も多く蛋白質を含有しており、ゲル電
気泳動に使用した。40μgの溶出した蛋白質を含有する蛋白質試料をSDS-PAGE試
料緩衝液中で95℃において変性させ、その後4〜20%濃度勾配SDS-PAGEによって分
析した。分離後、クマシーブリリアントブルー溶液を使用してゲルを染色した。
結果を図E6-3に示す。この図では、レーンFIXはIX因子標準品（Haematologic Te
chnologies Inc., Essex Junction, VT）であり、レーンCは形質転換していない
植物蛋白質試料であり、レーン1および2は形質転換した植物蛋白質試料である。
結果は、組換え植物由来ヒトIX因子は約65 kDのサイズを有することを示してい
る。レーン1の形質転換した植物試料は、形質転換していない植物試料では観察
されない約58 kDの独自のバンドを示す。レーン2の形質転換した植物試料は、ゲ
ル染色では同様の58 kDの蛋白質バンドを示さない。
【００９３】実施例7-プロ-IX因子のインビトロにおける活性化 実施例6において記載した精製プロ-凝固因子IXを使用する。アカルボキシル-
プロ-凝固因子IX中のアカルボキシル-グルタミル残基を、ビタミンK-依存的カル
ボキシラーゼで処理することによって、γ-カルボキシル化することができる（S
outeら、前記 1989）。ビタミンK-依存的カルボキシラーゼは正常なウシ肝臓か
ら調製し、Souteら、（1987. Thromb Haemostas 57:77）に記載されるように部
分的に精製した。Van Haarlemら、（1987. FEBS Lett 222:353）によって報告さ
れるように、標準的なγ-カルボキシル化反応混合物は、1.0 mgの部分的精製し
たカルボキシラーゼ、2μgの組換えアカルボキシル-プロ-IX因子、0.15 M NaCl
、1 M （NH4）SO4、20 mM Tris/HCl pH 7.5、5μCi NaH14CO3、8 mM MnCl2、0.1
6%（w/v）、3-（[3-コールアミドプロピル]ジメチルアンモニオ）-1-プロパンス
ルホネート、0.4 mg/mLホスファチジルコリン（1:1[w/w]比でコール酸塩との混
合ミセルとして添加）、還元剤（0.2 mM チオレドキシン、0.2 μMチオレドキシ
ン還元酵素および4 mM NADPH）および0.4 mMビタミンKヒドロキノンからなり、
総反応容量は125μLである。ビタミンKヒドロキノンは、De Metzら、（1981. J
Biol Chem 256: 10843）の方法により、ホスファチジルコリンと混合してから、
混合ミセルを調製することによって溶解する。プロ-IX因子中にgla残基が存在す
ることは、NAH14CO3を使用してγ-カルボキシル化反応を完了させ、シンチレー
ション計測法を使用して14CO2の取り込みを測定することによって、試験するこ
とができる。または、gla残基の存在は、Jieら、前記（1995）によって報告され
るように、ポリアクリルアミドゲルの4-ジアゾベンゼンスルホン酸を使用した比
色検出に基づいて確認することができる。標準的な蛋白質精製方法を使用して、
反応混合物から適切にγ-カルボキシル化したプロ-IX因子を分離することができ
る。
プロ-凝固因子IX中のアカルボキシル-グルタミル残基を、ビタミンK-依存的カル
ボキシラーゼで処理することによって、γ-カルボキシル化することができる（S
outeら、前記 1989）。ビタミンK-依存的カルボキシラーゼは正常なウシ肝臓か
ら調製し、Souteら、（1987. Thromb Haemostas 57:77）に記載されるように部
分的に精製した。Van Haarlemら、（1987. FEBS Lett 222:353）によって報告さ
れるように、標準的なγ-カルボキシル化反応混合物は、1.0 mgの部分的精製し
たカルボキシラーゼ、2μgの組換えアカルボキシル-プロ-IX因子、0.15 M NaCl
、1 M （NH4）SO4、20 mM Tris/HCl pH 7.5、5μCi NaH14CO3、8 mM MnCl2、0.1
6%（w/v）、3-（[3-コールアミドプロピル]ジメチルアンモニオ）-1-プロパンス
ルホネート、0.4 mg/mLホスファチジルコリン（1:1[w/w]比でコール酸塩との混
合ミセルとして添加）、還元剤（0.2 mM チオレドキシン、0.2 μMチオレドキシ
ン還元酵素および4 mM NADPH）および0.4 mMビタミンKヒドロキノンからなり、
総反応容量は125μLである。ビタミンKヒドロキノンは、De Metzら、（1981. J
Biol Chem 256: 10843）の方法により、ホスファチジルコリンと混合してから、
混合ミセルを調製することによって溶解する。プロ-IX因子中にgla残基が存在す
ることは、NAH14CO3を使用してγ-カルボキシル化反応を完了させ、シンチレー
ション計測法を使用して14CO2の取り込みを測定することによって、試験するこ
とができる。または、gla残基の存在は、Jieら、前記（1995）によって報告され
るように、ポリアクリルアミドゲルの4-ジアゾベンゼンスルホン酸を使用した比
色検出に基づいて確認することができる。標準的な蛋白質精製方法を使用して、
反応混合物から適切にγ-カルボキシル化したプロ-IX因子を分離することができ
る。
【００９４】 18のアミノ酸プロ-ペプチドを切断し、適切に処理された凝固因子IXを放出す
るために、γ-カルボキシル化反応混合物から約1 mgの硫酸アンモニウム沈殿さ
せた蛋白質を、0.4 M Tris-HCL（pH 7.0）、0.1% ルブロール、1 mM EDTA、1 mg
/mLペプスタチン、1 mg/mLベスタチンおよび50 gのKEX2エンドペプチダーゼを含
有する1 mLの反応混合物中に、2 mM CaCl2の存在下において37℃において1時間
溶解した（米国特許第5,234,830号参照）。その後の硫酸アンモニウム沈殿およ
びTris-HCl（pH 7.0）緩衝液中に蛋白質を懸濁させた後、ウェスタンブロットイ
ムノアッセイ法を使用して、N-末端、18アミノ酸プロ-ペプチドの切断量を測定
することができる。
るために、γ-カルボキシル化反応混合物から約1 mgの硫酸アンモニウム沈殿さ
せた蛋白質を、0.4 M Tris-HCL（pH 7.0）、0.1% ルブロール、1 mM EDTA、1 mg
/mLペプスタチン、1 mg/mLベスタチンおよび50 gのKEX2エンドペプチダーゼを含
有する1 mLの反応混合物中に、2 mM CaCl2の存在下において37℃において1時間
溶解した（米国特許第5,234,830号参照）。その後の硫酸アンモニウム沈殿およ
びTris-HCl（pH 7.0）緩衝液中に蛋白質を懸濁させた後、ウェスタンブロットイ
ムノアッセイ法を使用して、N-末端、18アミノ酸プロ-ペプチドの切断量を測定
することができる。
【００９５】 IX因子凝固活性は、IX因子-欠損血漿（Proctorら、1961. J. Clin Pathol 36:
212）を使用した2段階アッセイ法を用いて測定される。1単位のIX因子活性は、
1 mLの正常なヒト貯留血漿中のIX因子の量を示す。
212）を使用した2段階アッセイ法を用いて測定される。1単位のIX因子活性は、
1 mLの正常なヒト貯留血漿中のIX因子の量を示す。
【００９６】実施例8- トウモロコシプロトプラストにおけるヒト凝固XIII因子Aサブユニット の一過的な発現 A.因子XIII一過的発現ベクター構築 図E1-4に示すように、バイナリープラスミドベクター中のXIII因子Aサブユニ
ットの発現カセットを、一過的発現ベクターの構築に使用した。XIII因子Aサブ
ユニットの発現は35Sプロモーターの制御下にあり、転写はT7ターミネーターに
よって停止される。以下のプライマーを使用したTaqポリメラーゼ（Stratagene,
La Jolla, CA）を用いたPCRによって、因子XIII発現カセット（3.6 kb）をクロ
ーニングした：
ットの発現カセットを、一過的発現ベクターの構築に使用した。XIII因子Aサブ
ユニットの発現は35Sプロモーターの制御下にあり、転写はT7ターミネーターに
よって停止される。以下のプライマーを使用したTaqポリメラーゼ（Stratagene,
La Jolla, CA）を用いたPCRによって、因子XIII発現カセット（3.6 kb）をクロ
ーニングした：
【００９７】 クローニングした発現カセットを、プラスミドベクターpGEM-T（Promega, Mad
ison, WI）にライゲーションして、図E8-1に示す一過的因子XIII発現ベクターpG
A2052aを作製した。ベクターpGA2052aはまたアンピシリン耐性遺伝子（Amp）お
よびf1ファージ起点（f1 ori）を含有する。
ison, WI）にライゲーションして、図E8-1に示す一過的因子XIII発現ベクターpG
A2052aを作製した。ベクターpGA2052aはまたアンピシリン耐性遺伝子（Amp）お
よびf1ファージ起点（f1 ori）を含有する。
【００９８】 B.トウモロコシプロトプラストのエレクトロポレーションを使用した一過的分析 トウモロコシ（Zea mays）プロトプラストを一過的因子XIII発現分析に使用す
る。トウモロコシ細胞懸濁液を、3%スクロース、0.18 mg/ml KH2PO4、0.1 mg/ml
イノシトール、1μg/ml塩酸チアミンおよび0.5μg/ml 2.4-ジクロロフェノキシ
酢酸（2.4-D）を添加した4.3mg/ml MS塩を含有する改良Murashige and Skoog（M
S）培地（MurashigeおよびSkoog, 1962）で増殖させた。4日目のトウモロコシ細
胞懸濁液をプロトプラストの調製に使用する。簡単に説明すると、懸濁細胞を、
10 mg/lセルラーゼ、500μg/mlペクトポリアーゼ（pectoplyase）（Kanematsu-G
osho, Los Angeles, CA）および0.4 M D-マンニトールを含有するpH 5.8の溶液
で28℃において2〜4時間100rpmでゆっくり振とうしながら処理することによって
プロトプラストを単離する。過剰消化しないように、30分ごとにプロトプラスト
をチェックする。酵素消化終了時に、プロトプラストを0.4 Mマンニトールで丁
寧に洗浄してセルラーゼおよびペクトリアーゼを除去する。最後に、1-2×106プ
ロトプラストを、2.38mg/ml HEPES、8.76mg/ml NaCl、735μg/ml CaCl2および0.
4 M D-マンニトールを含有する0.5 mlのpH 5.5エレクトロポレーション緩衝液に
懸濁する。
る。トウモロコシ細胞懸濁液を、3%スクロース、0.18 mg/ml KH2PO4、0.1 mg/ml
イノシトール、1μg/ml塩酸チアミンおよび0.5μg/ml 2.4-ジクロロフェノキシ
酢酸（2.4-D）を添加した4.3mg/ml MS塩を含有する改良Murashige and Skoog（M
S）培地（MurashigeおよびSkoog, 1962）で増殖させた。4日目のトウモロコシ細
胞懸濁液をプロトプラストの調製に使用する。簡単に説明すると、懸濁細胞を、
10 mg/lセルラーゼ、500μg/mlペクトポリアーゼ（pectoplyase）（Kanematsu-G
osho, Los Angeles, CA）および0.4 M D-マンニトールを含有するpH 5.8の溶液
で28℃において2〜4時間100rpmでゆっくり振とうしながら処理することによって
プロトプラストを単離する。過剰消化しないように、30分ごとにプロトプラスト
をチェックする。酵素消化終了時に、プロトプラストを0.4 Mマンニトールで丁
寧に洗浄してセルラーゼおよびペクトリアーゼを除去する。最後に、1-2×106プ
ロトプラストを、2.38mg/ml HEPES、8.76mg/ml NaCl、735μg/ml CaCl2および0.
4 M D-マンニトールを含有する0.5 mlのpH 5.5エレクトロポレーション緩衝液に
懸濁する。
【００９９】 pGA205aの20μgスーパーコイルプラスミドDNAおよび10μgサケ精子キャリヤー
DNAを添加した後、210μFのコンデンサーを用いた300ボルトパルスを使用して、
プロトプラストをエレクトロポレーションすることができる。その後、ペトリ皿
の7 mlのプロトプラスト培養培地内に処理したプロトプラストを移し、28℃にお
いて48時間培養してから蛋白質を抽出する。培養培地は0.4 M D-マンニトールを
添加した改良MS培地である。48時間培養してから、ゆるく遠心分離することによ
って培養したプロトプラストを採取して、50 mM pH 7.5 Tris-HCl、0.5 M NaCl
、0.05% Nonidet P-40および1.0 mMフェニルメチルスルフォニルフルオリド（PM
SF）を含有する植物抽出緩衝液中に懸濁させることができる。30秒間隔で8秒間
、3回、氷上でプロトプラストを超音波処理することによって蛋白質試料を抽出
することができる。15,000gで5分間超音波処理した混合物を遠心分離することに
よって蛋白質試料を採取することができる。上清を蛋白質濃度分析、ウェスタン
ブロット分析および活性アッセイに使用する。ウェスタンブロット分析は、先の
タバコに基づいた因子XIII発現実施例に概要したものと同じ手法を実施する。同
様に、先のタバコに基づいた因子XIII発現実施例に記載されている方法を使用し
て、XIII因子Aサブユニット活性を測定する。XIII因子Aサブユニット活性は、活
性化されたXIII因子A-サブユニットのトランスアミダーゼ活性によってカゼイン
に取り込まれたモノダンシルカダベリンの量と規定される。
DNAを添加した後、210μFのコンデンサーを用いた300ボルトパルスを使用して、
プロトプラストをエレクトロポレーションすることができる。その後、ペトリ皿
の7 mlのプロトプラスト培養培地内に処理したプロトプラストを移し、28℃にお
いて48時間培養してから蛋白質を抽出する。培養培地は0.4 M D-マンニトールを
添加した改良MS培地である。48時間培養してから、ゆるく遠心分離することによ
って培養したプロトプラストを採取して、50 mM pH 7.5 Tris-HCl、0.5 M NaCl
、0.05% Nonidet P-40および1.0 mMフェニルメチルスルフォニルフルオリド（PM
SF）を含有する植物抽出緩衝液中に懸濁させることができる。30秒間隔で8秒間
、3回、氷上でプロトプラストを超音波処理することによって蛋白質試料を抽出
することができる。15,000gで5分間超音波処理した混合物を遠心分離することに
よって蛋白質試料を採取することができる。上清を蛋白質濃度分析、ウェスタン
ブロット分析および活性アッセイに使用する。ウェスタンブロット分析は、先の
タバコに基づいた因子XIII発現実施例に概要したものと同じ手法を実施する。同
様に、先のタバコに基づいた因子XIII発現実施例に記載されている方法を使用し
て、XIII因子Aサブユニット活性を測定する。XIII因子Aサブユニット活性は、活
性化されたXIII因子A-サブユニットのトランスアミダーゼ活性によってカゼイン
に取り込まれたモノダンシルカダベリンの量と規定される。
【０１００】 結語 本発明の好ましい態様および別の態様が示され、記載されているが、より広い
局面において本発明から逸脱することなく、多数の変更および改良を加えること
が可能であることは当業者に明らかである。従って、添付の特許請求の範囲は、
本発明の真の精神および範囲内に入るものとしてこのような全ての変更および改
良を包含するものと意図される。
局面において本発明から逸脱することなく、多数の変更および改良を加えること
が可能であることは当業者に明らかである。従って、添付の特許請求の範囲は、
本発明の真の精神および範囲内に入るものとしてこのような全ての変更および改
良を包含するものと意図される。
【図1】 内因的、外因的および共通の経路を含む血液凝固カスケードの概
略を図示する。Bithellによる、正常の造血系（The Normal Hematopoietic Syst
em）（BloomおよびThomas, Eds., Churchill, Livingston, N. Y., 1981, p579
）の「血液凝固」から複写した図である。
略を図示する。Bithellによる、正常の造血系（The Normal Hematopoietic Syst
em）（BloomおよびThomas, Eds., Churchill, Livingston, N. Y., 1981, p579
）の「血液凝固」から複写した図である。
【図E1-1】 植物発現ベクターpGA748にクローニングするためのプレ-凝固
因子VIIIのコード配列を得るために使用するベクター、pSP64-FVIIIcの構築の概
略を図示する。2332アミノ酸の成熟蛋白質プラス19アミノ酸の天然シグナルをコ
ードするプレ-凝固因子VIIIｃDNAを、Sal Iアダプターを使用してpSP64プラスミ
ドのSal I部位に挿入し、新規の10200 bp pSP64-FVIIIcプラスミドを得た。この
プラスミドは、大腸菌（E. coli）における陽性形質転換体の選択のためにアン
ピシリン耐性遺伝子を保有した。
因子VIIIのコード配列を得るために使用するベクター、pSP64-FVIIIcの構築の概
略を図示する。2332アミノ酸の成熟蛋白質プラス19アミノ酸の天然シグナルをコ
ードするプレ-凝固因子VIIIｃDNAを、Sal Iアダプターを使用してpSP64プラスミ
ドのSal I部位に挿入し、新規の10200 bp pSP64-FVIIIcプラスミドを得た。この
プラスミドは、大腸菌（E. coli）における陽性形質転換体の選択のためにアン
ピシリン耐性遺伝子を保有した。
【図E1-2】 プレ-凝固因子VIIIコード領域を保有する植物発現ベクターで
ある、pZD201の構築の概略を示す。全長プレ-凝固因子VIII cDNAをSal I制限酵
素で切断し、バイナリーベクターpGA748のCaMV 35SプロモーターとT7-T5転写タ
ーミネーターの間に位置する適合する制限酵素部位Xho Iに連続的にライゲーシ
ョンし、18800 bpプラスミドpZD201を作製した。このプラスミドは、大腸菌（E.
coli）において陽性形質転換体の選択のためにテトラサイクリン耐性遺伝子並
びに植物全体および植物細胞培養陽性形質転換体を選択するためのカナマイシン
耐性遺伝子を保有した。
ある、pZD201の構築の概略を示す。全長プレ-凝固因子VIII cDNAをSal I制限酵
素で切断し、バイナリーベクターpGA748のCaMV 35SプロモーターとT7-T5転写タ
ーミネーターの間に位置する適合する制限酵素部位Xho Iに連続的にライゲーシ
ョンし、18800 bpプラスミドpZD201を作製した。このプラスミドは、大腸菌（E.
coli）において陽性形質転換体の選択のためにテトラサイクリン耐性遺伝子並
びに植物全体および植物細胞培養陽性形質転換体を選択するためのカナマイシン
耐性遺伝子を保有した。
【図E1-3】 植物発現ベクターpGA643にクローニングするための凝固因子XI
II A-ドメインのコード配列を得るために使用したベクターであるpGA2020の構築
の略図を図示する。731アミノ酸蛋白質および29アミノ酸シグナルペプチドをコ
ードする凝固因子XIII A-ドメインcDNAをpBluescript SKのPst I部位に挿入して
、5'末端のXba I部位および3'末端のCla I部位に適合させ、新規な5.3 kbのpGA2
020プラスミドを作製した。このプラスミドは、大腸菌（E.coli）において陽性
形質転換体選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を保有した。
II A-ドメインのコード配列を得るために使用したベクターであるpGA2020の構築
の略図を図示する。731アミノ酸蛋白質および29アミノ酸シグナルペプチドをコ
ードする凝固因子XIII A-ドメインcDNAをpBluescript SKのPst I部位に挿入して
、5'末端のXba I部位および3'末端のCla I部位に適合させ、新規な5.3 kbのpGA2
020プラスミドを作製した。このプラスミドは、大腸菌（E.coli）において陽性
形質転換体選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を保有した。
【図E1-4】 凝固因子XIII A-ドメインコード領域を保有する植物発現ベク
ターである、pGA2023の構築の概略を図示する。全長凝固因子XIII A-ドメインcD
NAをXba I/Cla I制限酵素部位で切断し、バイナリーベクターpGA643のCaMV 35S
プロモーターとT7-T5転写ターミネーターの間に位置する適合Xba IおよびCla I
制限酵素部位に連続的にライゲーションし、14.0 kbのプラスミドpGA2023を作製
した。このプラスミドは、大腸菌（E.coli）において陽性形質転換体の選択のた
めのアンピシリン耐性遺伝子並びに植物全体および植物細胞培養陽性形質転換体
を選択するためのカナマイシン耐性遺伝子を保有した。
ターである、pGA2023の構築の概略を図示する。全長凝固因子XIII A-ドメインcD
NAをXba I/Cla I制限酵素部位で切断し、バイナリーベクターpGA643のCaMV 35S
プロモーターとT7-T5転写ターミネーターの間に位置する適合Xba IおよびCla I
制限酵素部位に連続的にライゲーションし、14.0 kbのプラスミドpGA2023を作製
した。このプラスミドは、大腸菌（E.coli）において陽性形質転換体の選択のた
めのアンピシリン耐性遺伝子並びに植物全体および植物細胞培養陽性形質転換体
を選択するためのカナマイシン耐性遺伝子を保有した。
【図E1-5】 プレトロンビン-2（PT2）遺伝子を保有するプラスミドベクタ
ーpGA2042の構築マップである。
ーpGA2042の構築マップである。
【図E1-6】 ヒトプレトロンビン-2遺伝子を含有するバイナリーベクターpGA
2043の構築マップである。
2043の構築マップである。
【図E1-7】 ヒトプレトロンビン-2遺伝子を含有するプラスミドベクターpG
A2049の構築マップである。
A2049の構築マップである。
【図E1-8】 トランスジェニック植物においてヒトIX因子を発現するための
プラスミドベクターpGA2029の構築マップである。
プラスミドベクターpGA2029の構築マップである。
【図E1-9】 トランスジェニック植物においてヒトIX因子を発現するための
プラスミドベクターpGA2030の構築マップである。
プラスミドベクターpGA2030の構築マップである。
【図E3-1】 T0因子VIII植物形質転換体のドットブロットイムノアッセイ法
の結果を示す。陽性対照血漿由来VIII因子標準品（American Diagnostica, Gree
nwich, CT）をS1およびS2として示す。ニコチアナ-タバカム（Nicotiana tabacu
m）cv. SR1から抽出した陰性対照葉蛋白質をSRとして示す。陽性植物一次形質転
換体（葉蛋白質抽出物）を1004-3、1006-2および1006-3として示す。
の結果を示す。陽性対照血漿由来VIII因子標準品（American Diagnostica, Gree
nwich, CT）をS1およびS2として示す。ニコチアナ-タバカム（Nicotiana tabacu
m）cv. SR1から抽出した陰性対照葉蛋白質をSRとして示す。陽性植物一次形質転
換体（葉蛋白質抽出物）を1004-3、1006-2および1006-3として示す。
【図E3-2】 いくつかの植物形質転換からの蛋白質抽出物について実施した
ウェスタンブロットイムノアッセイ法によって得られた蛋白質ゲルバンドを形質
転換していない対照培養および血漿由来VIII因子標準品（American Diagnostica
, Greenwich, CT）と比較したものを示す。レーン1は血漿由来VIII因子（FVIIIc
）標準品であり、レーン2は形質転換していないN.タバカム（N. tabacum）cv. S
R1対照から採取した葉蛋白質の総蛋白質抽出物を示し、レーン3〜9は、一次形質
転換体タバコ植物由来のT1植物系統から採取した葉外植片の総蛋白質抽出物を示
す。
ウェスタンブロットイムノアッセイ法によって得られた蛋白質ゲルバンドを形質
転換していない対照培養および血漿由来VIII因子標準品（American Diagnostica
, Greenwich, CT）と比較したものを示す。レーン1は血漿由来VIII因子（FVIIIc
）標準品であり、レーン2は形質転換していないN.タバカム（N. tabacum）cv. S
R1対照から採取した葉蛋白質の総蛋白質抽出物を示し、レーン3〜9は、一次形質
転換体タバコ植物由来のT1植物系統から採取した葉外植片の総蛋白質抽出物を示
す。
【図E4-1】 トランスジェニック植物ゲノムDNA試料および対照DNA試料のPC
R産物の逆相電気泳動ゲル画像である。
R産物の逆相電気泳動ゲル画像である。
【図E4-2】 トランスジェニックXIII因子A-サブユニット蛋白質試料および
種々の対照蛋白質試料のウェスタンブロット分析画像である。
種々の対照蛋白質試料のウェスタンブロット分析画像である。
【図E4-3】 種々のトランスジェニックXIII因子A-サブユニット蛋白質試料
および対照蛋白質試料のウェスタンブロット分析画像である。
および対照蛋白質試料のウェスタンブロット分析画像である。
【図E4-4】 異なる葉位置のXIII因子A-サブユニット発現のウェスタンブロ
ット分析画像である。
ット分析画像である。
【図E5-1】 プレトロンビン-2トランスジェニック植物ゲノムDNA試料およ
び対照DNAのPCR産物の逆相電気泳動ゲル画像である。
び対照DNAのPCR産物の逆相電気泳動ゲル画像である。
【図E5-2】 トランスジェニックプレトロンビン-2植物蛋白質試料のウェス
タンブロット画像である。
タンブロット画像である。
【図E5-3】 金属キレートセファロースカラムによって精製した蛋白質試料
の銀染色分析である。
の銀染色分析である。
【図E5-4】 一過的発現プラスミドベクターpGA2054aの構築マップである。
【図E5-5】 プロトロンビン遺伝子を含有するプラスミドベクターpGA2056
の構築マップである。
の構築マップである。
【図E5-6】 プレトロンビン-2遺伝子を含有するプラスミドベクターpGApGA
2057の構築マップである。
2057の構築マップである。
【図E5-7】 プロトロンビン一過的発現のプラスミドベクターpGA2058の構
築マップである。
築マップである。
【図E5-8】 プレトロンビン-2一過的発現のプラスミドベクターpGA2059の
構築マップである。
構築マップである。
【図E6-1】 pGA2029によって形質転換したIX因子トランスジェニック植物
ゲノムDNA試料および対照DNA試料におけるPCR産物の逆相電気泳動ゲル画像であ
る。
ゲノムDNA試料および対照DNA試料におけるPCR産物の逆相電気泳動ゲル画像であ
る。
【図E6-2】 pGA2030によって形質転換したIX因子トランスジェニック植物
ゲノムDNA試料および対照DNA試料におけるPCR産物の逆相電気泳動ゲル画像であ
る。
ゲノムDNA試料および対照DNA試料におけるPCR産物の逆相電気泳動ゲル画像であ
る。
【図E6-3】 精製したトランスジェニックIX因子植物蛋白質試料および対照
試料の蛋白質ゲルにおけるクーマジーブルー染色分析画像である。
試料の蛋白質ゲルにおけるクーマジーブルー染色分析画像である。
【図E8-1】 一過的発現プラスミドベクターpGA2052aの構築マップである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ０７Ｋ 14/745 Ａ６１Ｋ 37/46 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/47 37/475 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (71)出願人 Ｐａｃｉｆｉｃ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｄ ｉｖｉｓｉｏｎ， Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕ ａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ ｓ， Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ 999， Ｒｉｃ ｈｌａｎｄ， ＷＡ 99352 Ｕ．Ｓ．Ａ． (72)発明者 ガオ ジャンウェイ アメリカ合衆国 ワシントン州 リッチラ ンド スナイダー ロード 506 (72)発明者 アンダーソン ダニエル ビー． アメリカ合衆国 ワシントン州 パスコ 1919 ロード 80 (72)発明者 ダイ ズィユー アメリカ合衆国 ワシントン州 リッチラ ンド モナーチ レーン 2835 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD06 CD09 4B024 AA01 BA07 BA80 CA04 DA05 EA01 GA11 HA01 HA03 4B064 AG01 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA20 4C084 AA02 AA06 AA07 BA44 CA53 DC03 DC04 DC10 DC11 DC14 DC16 DC17 DC18 DC19 DC20 DC25 ZA532 4H045 AA20 BA10 CA42 DA65 EA20 FA72 FA74
Claims (26)
- 【請求項１】 凝血因子蛋白質をコードするDNA配列を含み発現するトラン
スジェニック植物由来の凝血蛋白質を含む、ヒト凝血経路における活性化応答を
誘発することができる凝固因子であって、該トランスジェニック植物から抽出さ
れた該凝血蛋白質が、凝固因子の投与時にヒト凝血経路における活性化応答を誘
発することができる、凝固因子。 - 【請求項２】 DNA配列が、凝固因子をコードする遺伝子、遺伝子の組み合
わせ、遺伝子断片、又は遺伝子断片の組み合わせを含む、請求項1記載の凝固因
子。 - 【請求項３】 V因子、VII因子、IX因子、X因子、XI因子、XII因子、XIII因
子、プロトロンビン、プレトロンビン2、トロンビン、フィブリン、フィブリノ
ーゲン、組織因子、フォンビルブランド因子、プレカリクレイン、HMWキニノー
ゲン、及びそれらの組み合わせを含む、請求項1記載の凝固因子。 - 【請求項４】 VIII因子、XIII因子、IX因子、プロトロンビン、プレトロン
ビン2、トロンビン、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求
項1記載の凝固因子。 - 【請求項５】 トランスジェニック植物が双子葉類及び単子葉類の被子植物
から本質的になる群より選択される、請求項1記載の凝固因子。 - 【請求項６】 凝血因子蛋白質をコードするDNA配列を含み発現するトラン
スジェニック植物由来の凝血蛋白質を含む、ヒト凝血経路における活性化応答を
誘発することができる凝固因子であって、該凝血蛋白質が、ヒトウイルス性病原
体を含まず、凝固因子の投与時にヒト凝血経路における活性化応答を誘発するこ
とができる、凝固因子。 - 【請求項７】 凝固因子の投与時にヒト凝血経路における活性化応答を誘発
することができるヒト凝固因子をコードするDNA配列を含み発現するトランスジ
ェニック植物。 - 【請求項８】 内部で発現される凝固因子が、V因子、VII因子、IX因子、X
因子、XI因子、XII因子、XIII因子、プロトロンビン、プレトロンビン2、トロン
ビン、フィブリン、フィブリノーゲン、組織因子、フォンビルブランド因子、プ
レカリクレイン、HMWキニノーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群より選
択される、請求項7記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項9】 内部で発現される凝固因子が、VIII因子、XIII因子、IX因子
、プロトロンビン、プレトロンビン2、トロンビン、及びそれらの組み合わせを
含む、請求項7記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項10】 単子葉類及び双子葉類の被子植物から本質的になる群より選
択される、請求項7記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項11】 （a）ヒト凝血経路における活性化応答を誘発することがで
きるヒト凝固因子をコードするDNA配列を含み発現するトランスジェニック植物
を作製する段階、 （b）該トランスジェニック植物から該ヒト凝固因子を抽出する段階、 （c）患者の凝血経路における活性化応答を誘導するため、該ヒト凝固因子をヒ
ト患者に投与する段階 を含む、ヒト凝血経路における活性化応答を誘発する方法。 - 【請求項12】 V因子、VII因子、IX因子、X因子、XI因子、XII因子、XIII因
子、プロトロンビン、プレトロンビン2、トロンビン、フィブリン、フィブリノ
ーゲン、組織因子、フォンビルブランド因子、プレカリクレイン、HMWキニノー
ゲン、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される凝固因子をトランスジ
ェニック植物から抽出することをさらに含む、請求項11記載の方法。 - 【請求項13】 VIII因子、XIII因子、IX因子、プロトロンビン、プレトロン
ビン2、トロンビン、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される凝固因
子を植物細胞から抽出することをさらに含む、請求項12記載の方法。 - 【請求項14】 （a）ヒト凝固因子の産物をコードする遺伝材料を保持する
植物の陽性形質転換体を得る段階、 （b）陽性形質転換体を複製する段階、及び （c）商業的な量のヒト凝固因子を植物から抽出する段階 を含む、ヒト・ウイルス性病原体を含まないヒト様凝固因子を植物から製造する
方法。 - 【請求項15】 凝固因子が完全な植物体において複製される、請求項14記載
の方法。 - 【請求項16】 凝固因子が植物組織培養物において複製される、請求項14記
載の方法。 - 【請求項17】 ヒト凝固因子が、ヒト凝固因子型の凝固促進活性又は凝固活
性を有する蛋白質である、請求項14記載の方法。 - 【請求項18】 陽性形質転換体を得ることが、植物発現ベクターへのサブク
ローニングのためヒト凝固因子のコード配列を修飾する段階を含む、請求項14記
載の方法。 - 【請求項19】 コード配列が、コピーDNA、ゲノムDNA、及びそれらの組み合
わせからなる群より選択される、請求項18記載の方法。 - 【請求項20】 （a）植物発現ベクターへコード配列をサブクローニングし
、サブクローニングされた植物発現ベクターを得る段階、 （b）サブクローニングされた植物発現ベクターを複数の植物細胞に導入する段
階、 （c）抗生物質選択培地上で複数の植物細胞から複数の陽性形質転換体を選択す
る段階、 （d）完全な植物又は懸濁液中で陽性形質転換体の増殖を誘導する段階、及び （e）ある量のヒト凝固因子を段階（d）の植物から抽出する段階 をさらに含む、請求項18記載の方法。 - 【請求項21】 導入が直接粒子衝撃（direct particle bombardment）によ
る、請求項19記載の方法。 - 【請求項22】 導入がアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換
による、請求項19記載の方法。 - 【請求項23】 導入が花粉形質転換による、請求項18記載の方法。
- 【請求項24】 アグロバクテリウム媒介形質転換が、 （a）サブクローニングされた植物発現ベクターをアグロバクテリウムに移入す
る段階、及び （b）サブクローニングされた植物発現ベクターを含有するアグロバクテリウム
を複数の植物細胞と共培養する段階 を含む、請求項21記載の方法。 - 【請求項25】 ヒト凝固因子が、V因子、VII因子、IX因子、X因子、XI因子
、XII因子、XIII因子、プロトロンビン、プレトロンビン2、トロンビン、フィブ
リン、フィブリノーゲン、組織因子、フォンビルブランド因子、プレカリクレイ
ン、HMWキニノーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請
求項19記載の方法。 - 【請求項26】 ヒト凝固因子が、VIII因子、XIII因子、IX因子、プロトロン
ビン、プレトロンビン2、トロンビン、及びそれらの組み合わせからなる群より
選択される、請求項19記載の方法。
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