DK175919B1 - Ekspression af biologisk aktiv faktor XIII - Google Patents

Description

DK 175919 B1

Ekspression af biologisk aktiv faktor XIII

Den foreliggende opfindelse angår generelt fremstillingen af faktor XIII og analoger hertil, og opfindelsen angår nærmere bestemt ekspressionen af 5 biologisk aktivt faktor XIII og analoger hertil i transformerede eller transfice-rede værtsceller.

Blodkoagulering er en proces, som består af en kompleks vekselvirkning mellem forskellige blodkomponenter eller faktorer, som i sidste ende medfø-10 rer dannelsen af en fibrinklump. Generelt er de blodkomponenter, som deltager i hvad der er blevet kaldt koagulerings- "kaskaden", proenzymer eller zymogener, enzymatisk inaktive proteiner, som omdannes til proteolytiske enzymer ved indvirkning af en aktivator, som i sig selv er en aktiveret størkningsfaktor. Koaguleringsfaktorer, som har gennemgået en sådan omdannel-15 se, kaldes normalt "aktiverede faktorer" og betegnes ved tilføjelsen af et lille "a" (f.eks. XII la).

Én komponent i blod koaguleringssystemet er faktor XIII (også kendt som fi-brinstabiliseringsfaktor, fibrinoligase eller plasmatransglutaminase), et 20 plasmaglycoprotein, der cirkulerer i blodet som et proenzym. I de sidste trin af blodkoaguleringen omdanner trombin proenzymformen af faktor XIII til en intermediær form, som derefter dissocierer i nærværelse af calciumioner til frembringelse af den aktive form af enzymet, der betegnes faktor XIIla. ,

Thrombin katalyserer polymeriseringen af fibrin via γ-dimerisering efterfulgt af 25 a-polymerisering, hvilket resulterer i en ikke-kovalent bundet fibrinklump, som af faktor Xllla omdannes til en tværbunden klump med betragtelig mekanisk styrke (R.Chen og R.F.Doolittle. Proc.Natl. Acad.Sci.USA 66: 472-479, 1970; J.J.Pisano et al., Ann.N.Y.Acad. Sci., 202: 98-113, 1972). Faktor Xllla er en transglutaminase, som katalyserer tværbindingen af fibrinpolymerer ved dan-30 nelsen af intermolekylære c(Y-glutamyl)lysinbindinger. Denne tværbindingsreaktion kræver tilstedeværelsen af calciumioner (L.Lorand et al.,

DK 175919 B1 I

Proq.Hemost.Thromb. 5: 245-290, 1980; J.E. Folk og J.S.Finlayson, ; I

Adv.Prot.Chem. 31:1-133.1977). · I

In vlvo katalyserer faktor Xllla tværbindingsreaktioner mellem andre protein- I

5 molekyler. F.eks. katalyserer faktor Xllla også tværbindingen af γ-kæden i j I

fibrin til a2-plasmininhibitor og fibronectin såvel som tværbindingen af kolla- I

gen og fibronectin, hvilken tværbinding kan være relateret til sårheling I

(Y.Sakata og N.Aoki, J.Clin. Invest. 65: 290-297, 1980; D.F.Mosher, I

J.Biol.Chem. 250:6614-6621. 1975; D.F. Mosher og P.E.Chad, J.Clin.Invest. I

10 64: 781-787,1979; Folk og Finlayson, se ovenfor; Lorand et al., se ovenfor). I

Den kovalente inkorporering af a2-plasmininhibitor i fibrinnetværket kan for- I

øge det størknede blods bestandighed over for lyse (Lorand et al., se oven- I

for). I

15 I plasma er den bedste aminogruppedonor og aminogruppeacceptor for fak- I

tor Xllla a2-plasmininhibitor henholdsvis fibrin (T.Tamaki og A.Aoki, I

J.Biol.Chem. 257:14767-14772. 1982; F.Carmassi og S.I.Chung, I

Prog.Fibrinolysis 6: 281-285, 1983). Defekter i enten faktor XIII eller α2- I

plasmininhibitor resulterer i "forhalet blødning", medens primær hæmostase I

20 hos disse personer er normal (Lorand et al., se ovenfor). Der foreslås såle- I

des en rolle for både faktor XIII og a2-plasmininhibitor i beskyttelsen af fi- I

brinklumper mod fordøjelse med plasmin. I

Faktor Xlll-zymogen (molekylvægt = ca. 320 kD) cirkulerer i blodet som et I

25 kompleks med fibrinogen (C.S. Greenberg og M.A.Shuman, J. Biol.Chem. I

257:6096-6101, 1982). Faktor XIII er en tetramer (a2b2), som består af to a- I

underenheder (molekylvægt = ca. 75 kD) og to b-underenheder (molekyl- I

vægt = ca. 80 kD) (S.I.Chung et al., 1 Biol. Chem. 249:940-950. 1974). a- I

Underenheden indholder det katalytiske sted for enzymet, medens b- I

30 underenheden formodes at stabilisere a-underenheden eller at regulere akti- I

veringen af faktor XIII (Folk og Finlayson, se ovenfor), L.Lorand et al., Bio- I

3 DK 175919 B1 chem.Biophvs.Res.Comm. 56: 914-922, 1974). Under aktiveringen af faktor XIII til faktor Xllla resulterer trombins spaltning i frigørelsen af et aktiveringspeptid (molekylvægt = 4 kD) fra den aminoterminale ende af hver af a-underenhederne (Schwartz et al., J.Biol.Chem. 248: 1395-1407, 1973). Ami-5 nosyresekvensen af aktiveringspeptidet og det område af a-kæden, som indeholder det katalytiske sted, er blevet bestemt (T.Takagi og R.F. Doolittle, Biochem.J. 13: 750-756, 1974; J.J. Holbrook et al., Biochem.J·. 135: 901-903,1973).

10 Den nuværende behandlingspraksis for patienter med faktor XIII- defekter involverer almindeligvis erstatningsterapi med plasma eller plasmaderivater eller med et placentalt faktor Xlll-råkoncentrat (Lorand et al., se ovenfor; Fro-bisch et ål., Dtsch.Med.Woschenschr. 97: 449-502, 1972; Kuratsuji et al., Haemostasis 11: 229-234, 1982). Dette koncentratet kræver anvendelsen af 15 en forholdsvis stor mængde af uensartet human-plasma eller placentavæv som udgangsmateriale. Ydermere er det vanskeligt at sikre, at de koncentrater, som er opnået fra en pulje af humant placentalt væv, er fri for viral kontaminering eller andre kontamineringer. Desuden er oprensningen af store mængder placental faktor Xlll-koncentrat vanskelig og dyr.

20

For nylig er der blevet anvendt et faktor Xlll-koncentrat til patienter med dårlig sårheling efter operation (Mishima et al., Chirura 55: 803-808, 1984; Baer et al., Zentralbl.Chir. 105:642-651. 1980) og scleroderma (Delbarre et al.,

Lancet 2: 204,1981). Endvidere er faktor XIII blevet anvendt som en kompo-25 nent i vævsklæbemidler (US patenterne nr. 4.414.976, 4.453.939, 4.377.572, 4.362.567.og 4.298.598) og er blevet foreslået til brug i antifibrinolytisk terapi til forhindring af postoperativ blødning og ved behandling af subarachnoideal blødning, ulcerativ colitis og almindelig sårheling. Disse potentielle anvendelser af human faktor Xlll-præparationer giver yderligere tilskyndelser til frem-30 stillingen af rekombineret faktor XIII.

I DK 175919 B1 I

I 4 I

I Der er følgelig et behov inden for fagområdet for en fremgangsmåde til frem-

I stilling af forholdsvis store mængder af rene præparationer af faktor XIII. Med I

I den foreliggende opfindelse opfyldes dette behov ved anvendelse af en re- I

I kombinant DNA-teknologi, hvorved man på vellykket måde undgår problemet I

I 5 med viral kontaminering og samtidig tilvejebringer en ensartet, homogen og . I

I økonomisk kilde til faktor XIII til behandling af faktor XIIl-deficiente patienter I

I og andre. I

I I korthed angår den foreliggende opfindelse DNA-sekvenser, som koder for I

I 10 proteiner, der stort set har den samme biologiske aktivitet som faktor XIII. I

I Opfindelsen tilvejebringer DNA-sekvenser, som koder for polypeptider, der er I

I funktionelt homologe med a’-underenhedeme i faktor XIII, hvilken sekvens I

I omfatter den i figur 1 viste sekvens fra basepar 202 til basepar 2283, såvel I

I som en DNA sekvens som koder for et polypeptid som er funktionelt homo- I

I 15 logt med a’-underenheden af faktor XIII, hvilken sekvens omfatter en DNA- I

I sekvens, som koder for den i figur 1 viste aminosyresekvens, som starter I

I med glycin nummer 38, og som slutter med methionin nymmer 731. Yderme- I

I re angår opfindelsen en ekspressionsvektor, som omfatter en transkriptionel I

I promotor, der nedstrøms er fulgt af en DNA-sekvens ifølge den ovenstående I

I 20 paragraf. I

I Værtsceller, som er transficeret med en ekspressionsvektor ifølge den oven- I

I stående paragraf omtales også. Værtscellen kan være en prokaryotisk eller I

I en eukaryotisk værtscelle, hvor gærværtsceller og pattedyrværtsceller er I

I 25 specielt foretrukne eukaryotiske værtsceller. I

I I et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse omtales en fremgangs- I

I måde til fremstilling af et protein, som ved dissociering har stort set den sam- I

I me biologiske aktivitet som faktor XIII omfattende: I

I 30 introducering i en værtscelle af en ekspressionsvektor omfattende en I

I transskriptionel promoter, som nedenstrøms er efterfulgt af en DNA- I

5 DK 175919 B1 sekvens som koder for et polypeptid som er funktionelt homolog med a'-underenheden af faktor XIII, omfattende den i figur 1 viste aminosy-resekvens, som starter med glycin nr. 38 og slutter med methionin nr.

731, og en transskriptionel promotor, som nedenstrøms er efterfulgt af 5 en DNA-sekvens som koder for et polypeptid som er funktionelt homo log med b-underenheden af faktor XIII; - dyrkning af værtscellen; og - isolering af proteinet fra værtscellen - dimerisering af polypeptidet til dannelse af homodimere.

10

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer endvidere en ekspressionsvektor omfattende en transskriptionel promoter, som nedenstrøms er efterfulgt af en DNA-sekvens, som koder for et protein med struktur og biologisk aktivitet af human faktor XIII a-underenhed eller human faktor XIII a’-underenheden, 15 omfattende den i figur 1 viste aminosyresekvens, som starter med glycin nr.

38 og slutter med methionin nr. 731, hvori DNA-sekvensen er i det væsentlige fri for 3’ utranslaterede sekvenser som normalt er forbundet med DNA-sekvensen, såvel som værtsceller transficeret med en ekspressionsvektor omfattende en transskriptionel promotor, som nedenstrøms er efterfulgt af en 20 DNA-sekvens, som koder for et protein med struktur og biologisk aktivitet af human faktor XIII a-underenhed eller human faktor XIII a’-underenheden, omfattende den i figur 1 viste aminosyresekvens, som starter med glycin nr.

38 og slutter med methionin nr. 731, hvori DNA-sekvensen er i det væsentlige fri for 3’ utranslaterede sekvenser som normalt er forbundetmed DNA-25 sekvensen, samt en fremgangsmåde til fremstilling af et protein som har den biologiske aktivitet af human faktor XIII, omfattende introducering i en værtscelle af en ekspressionsvektor omfattende en transskriptionel promoter, som nedenstrøms er efterfulgt af en DNA-sekvens, som koder for et protein med struktur og biologisk aktivitet af human faktor XIII a-underenhed eller human 30 faktor XIII a’-underenheden, omfattende den i figur 1 viste aminosyresekvens, som starter med glycin nr. 38 og slutter med methionin nr. 731, hvori

DK 175919 B1 I

DNA-sekvensen er i det væsentlige fri for 3’ utranslaterede sekvenser som I

normalt er forbundet med DNA-sekvensen; dyrkning af værtscellen; og isole- I

ring af proteinet som kodes af DNA-sekvensen fra værtscellen. I

5 Foruden at angå proteiner, som fremstilles ifølge de i korthed ovenfor be- . I

skrevne fremgangsmåder, er den foreliggende opfindelse også rettet mod en I

række farmaceutiske sammensætninger, som omfatter en effektiv mængde I

af et protein, der er fremstillet ifølge en hvilken som helst af de i korthed I

ovenfor beskrevne fremgangsmåder, samt en fysiologisk acceptabel bærer I

10 eller fortynder. I

Andre aspekter ifølge opfindelsen vil fremgå af den efterfølgende detaljerede I

beskrivelse og den tilhørende tegning. I

15 Figur 1 viser nukleotidsekvensen af det cDNA, som koder for a- og a'- I

underenhedeme af human faktor XIII, samt de udledte aminosyresekvenser I

for disse underenheder. Aminosyreme nr. -30 til -1 synes at repræsentere en I

sekvens i læseramme, medens aminosyreme +1 (serin) til +731 (methionin) I

repræsenterer aminosyrer i den modne a-underenhed. Aminosyreme nr. +38 I

20 (glycin) til +731 (methionin) repræsenterer aminosyreme i den modne a'- I

underenhed. I

Cys i det aktive "site" ved aminosyrerest +315 er omgivet af en cirkel. De bu- I

ede pile viser spaltningsstedet for en processeringsprotease (såsom en I

25 MET-aminopeptidase), som frembringer det modne protein med en amino- I

terminal Ser. Den lige pil identificerer spaltningsstedet for omdannelsen af I

faktor XIII a-underenhed til faktor XIII a'-underenhed ved hjælp af trombin. De I

aminosyrerester, som er markeret med udfyldte rhomber, er potentielle Asn- I

koblerede glycosyleringssteder ved Asn-x-Ser- eller Asn-x-Thr-sekvenser. De I

30 åbne rhomber identificerer Asn-rester med lidt eller ingen kulhydrat. I

7 DK 175919 B1

Figur 2 viser nukleotidsekvensen for det cDNA, som koder for b-underenheden af human faktor XIII, og den afledte aminosyresekvens. Ami-nosyreme nr. -19 til -1 repræsenterer en del af en ledersekvens, medens de aminosyrer, som er nummereret +1 (glutamat) til +641 (threonin), repræsen-5 terer de aminosyrer, som er til stede i den modne b-underenhed.

De aminosyrerester, hvorover der er tegnet en streg, blev også bestemt ved aminosyresekvensanalyse. (Aminosyreresteme 394, 536, 537 blev imidlertid ikke identificeret ved denne analyse). De aminosyrerester, som er markeret 10 med udfyldte rhomber, er potentielle Asn-koblede glycosyleringssteder ved Asn-x-Ser-sekvenser, medens den aminosyrerest, som er markeret med en åben rhombe, er et potentielt Asn-koblet glycosyleringssted ved en Asn-x-Cys-sekvens. De nukleotidsekvenser, som svarer til polyadenyleringssignalet og poly(A)-halen, er vist i kasser.

15

Figur 3 viser en sammenligning af aminosyresekvensen i de gentagne fragmenter 4, 5 og 6 i faktor XIII b-underenhed med de gentagne områder i β2-glycoproteinet I, de tre gentagne områder i Ba-kæden i faktor B af human komplement og human haptoglobin a1-kæde. Fire eller flere identiske amino-20 syrerester i den samme position er indrammet. Der blev indført huller for at opnå maximal gruppering. Tallene forud for hvert gentaget område identificerer aminosyretallet på den første aminosyre i hvert gentaget område.

Figur 4 illustrerer grupperingen af 10 aminosyregentagelser, som er til stede i 25 b-underenheden af faktor XIII. De gentagne områder blev underinddelt i 4 grupper, som indeholdt de gentagne områder 1, 2 og 3; 4, 5 og 6; 7 og 9, samt 8 og 10. Tallene forud for hvert gentaget område identificerer aminosy-reresttallet på den første aminosyre i hvert gentaget område. To eller flere identiske aminosyrerester ved den samme position i hver gruppe af gentagne 30 områder blev indrammet. Der blev indført huller for at opnå maximal gruppering mellem de 10 gentagne segmenter.

DK 175919 B1 I

Figur 5 viser konstruktionen af plasmid pMVR1. I

Figur 6 viser konstruktionen af plasmid pAT 1. I

5 Figur 7 viser konstruktionen af plasmid pTRK4c og dets derivat pRS185. , I

Figur 8 viser konstruktionen af pRS201 og den mutagenisering, som fører til I

konstruktionen af plasmideme pRS202 og pRS203. I

10 Figur 9 viser konstruktionen af gærekspressionsvektoreme pRS216 og I

pRS217. I

Figur 10 viser konstruktionen af plasmid pRS111, som omfatter den codo- I

noptimerede MFa1 -sianalpeptidsekvens med den naturlige Glu-Ala-Glu-Ala- I

15 sekvens og Hind-I Il-sekvens. I

Figur 11 viser konstruktionen af pRS220 og pRS231. I

Før beskrivelsen af opfindelsen vil det for at forstå denne være en hjælp at I

20 anføre definitioner på visse udtryk, som anvendes herefter. I

Biologisk aktivitet: En funktion eller sæt af funktioner udøvet af et molekyle i I

en biologisk sammenhæng (dvs. i en organisme eller en in vitro kopi). Biolo- I

giske aktiviteter af proteiner kan inddeles i katalytiske aktiviteter og effekto- I

25 raktiviteter. Katalytiske aktiviteter for størkningsfaktorer involverer almindelig- I

vis aktivering af andre faktorer gennem den specifikke spaltning af forstadier. I

Effektoraktiviteter inkluderer specifik binding af det biologisk aktive molekyle I

til calcium eller andre små molekyler, til makromolekyler, såsom proteiner, I

eller til celler. Effektoraktivitet forøger ofte eller er ofte essentiel for katalytisk I

30 aktivitet under fysiologiske betingelser. Katalytisk aktivitet og effektoraktivitet I

kan i nogle tilfælde ligge i det samme domæne i et protein. I

I ' ^^—- DK 175919 B1 9

Som ovenfor anført er den biologiske aktivitet af human faktor XIII karakten* j seret ved dets evne til at stabilisere blodsammenklumpninger ved at tværbinde fibrinpolymerer gennem dannelsen af intermolekylære E-(Y-glutamyl)-lysinbinding. Faktor XIII kan også tværbinde fibrin til andre molekyler, såsom 5 02-plasmininhibitor. Faktor Xlll-zymogen er en tetramer sammensat af 4 underenheder, to a-underenheder og to b-underenheder, som er knyttet sammen ved ikke-covalente interaktioner. Interkædedisulfidbindinger kan være fraværende i a-underenheden, skønt b-underenheden synes at indeholde 20 intrakædedisulfidbindinger.

10

Faktor XIII antiveres i en to-trinsreaktion. Først spalter trombin et kort peptid (aktiveringspeptid) fra den aminoterminale ende af hver af a-underenhedeme, hvilket resulterer i strukturen a'2b2. Denne intermediære struktur dissocierer i nærværelse af calciumioner, hvilket giver den inaktive 15 b2-underenhed og den katalytiske aVunderenhed (R.D.Cooke, Biochem.J.

141: 683-691, 1974). Det formodes, at b-underenhederne beskytter eller stabiliserer a-underenhedeme og er til stede i overskud i plasma. a2-underenheden findes i megakaryocytter, blodplader, placenta, uterus, milten, prostata og makrofager (S.I.Chung, se ovenfor; T.H. Kiesselbach og 20 R.H.Wagner, Ann.N.Y. Acad.Sci. 202: 318-328, 1972; P.Henriksson et al., J.Clin.Invest. 76:528-534, 1985; L.Muszbek et al., Thromb.Res. 37:401-410.

1985). Endogene b-underenheder synes at stabilisere placental faktor XIII i plasmaet.

25 Hverken a- eller b-underenheden af faktor XIII er blevet sekventeret i udstrakt grad af andre fagfolk forud for de her beskrevne anstrengelser. Sekvensen af det aktiveringspeptid, som frigøres fra a-underenheden, såvel som aminosy-resekvensen i området omkring det katalytiske sted i a-underenheden, er tidligere blevet rapporteret (Takagi og Doolittle, se ovenfor; Holbrook et al, se 30 ovenfor). Den eneste aminosyresekvensinformation, som tidligere var tilgængelig for b-underenheden af faktor XIII, er den aminoterminale sekvens

DK 175919 B1 I

ίο ! I

Glu-Glx-Lys-Pro (Takagi og Doolittle, se ovenfor). Faktor XIII er således me-

get dårligt karakteriseret sammenlignet med andre blod koaguleringsfaktorer. I

Som følge heraf ved man meget lidt om de gener, der koder for faktor XIII. I

5 Med den foreliggende opfindelse omtales DNA-sekvenser, som koder for I

polypeptider, der er funktionelt homologe med a-, a- og b-underenhedeme af I

human faktor XIII. Der omtales den fulde a- og b-underenhed af human fak- I

tor XIII og de tilsvarende aminosyresekvenser af a- og b-underenhedeme. a- I

underenheden mangler disulfidbindinger og indeholder meget lidt kulhydrat I

10 om noget. Ydermere er en posttranslationel modifikation af faktor XIII acety- I

leringen af den aminoterminale ende af a-kæden. Biologisk aktiv faktor XIII I

kan udtrykkes i prokaryotiske celler såvel som i eukaryotiske celler. I

Human faktor XIII cDNA kan isoleres fra et humant cDNA-bibliotek fremstillet I

15 ud fra en hensigtsmæssig mRNA-kilde. Én kilde til a-underenhed-mRNA er I

humane placentale celler. Et cDNA-bibliotek fra denne kilde kan screenes I

med affinitetsoprenset antistof mod a-underenheden af faktor XIII og/eller I

med en oligonukleotidprobe, som svarer til en aminosyresekvens af aktive- I

ringspeptidet. En foretrukken kilde for b-underenhed mRNA er human lever- I

20 mRNA. Et cDNA-bibliotek fra denne kilde kan screenes med affinitetsopren- I

set antistof mod a-underenheden af human faktor XIII. Hvis der ved denne I

screeningsprocedure identificeres ufuldstændige cDNA-kloner, kan det være I

ønskeligt at screene cDNA-biblioteket igen under anvendelse af 5’- eller 3‘- I

enderne af partielle kloner. I

25 I

I én udførelsesform for den foreliggende opfindelse kan det være ønskeligt at I

udskifte cystein med serin i aminosyresekvensen for faktor XIII. Tilstedevæ- I

reisen af frie sulfhydrylgrupper kan føre til oxidation af faktor XIII og således I

fremkalde en uønsket ustabilitet i proteinet. Almindeligvis må serinen indsæt- I

30 tes i stedet for cystein under anvendelse af oligonukleotidstyret stedspecifik I

mutagenisering, hvilket f.eks. er beskrevet af Zoller et al., (Manual for Ad- I

i 11 DK 175919 B1 vanced Techniques in Molecular Cloning Course), Cold Spring Harbor Laboratory, 1983; Zoller og Smith, DNA. 3: 479-488, 1984; Kunkel et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492,1985). Der kan eksistere polymorfe forskelle inden for DNA-sekvenseme, og de sekvenser, der angives her, kan 5 derfor tilvejebringe et eksempel på 1 allel. Det skal imidlertid bemærkes, at disse polyforme forskelle stadig resulterer i polypeptider, som er funktionelt homologe med a-, a1- og b-underenhedeme af faktor XIII. a-Kæden af faktor XIII kan fremstilles cytoplasmatisk (versus secerneret) i gærværtceller på grund af gærcellernes evne til at acetylere aminoterminale serinrester på cy-10 toplasmatiske proteiner og på grund de fåtallige disulfidbindinger i a-kæden. i

Secerneringen af faktor XIII a-underenhed fra gærværtsceller vil imidlertid lette oprensningen af proteinet.

Når der er opnået en fuldlængde DNA-sekvens, som koder for et polypeptid, 15 der er funktionelt homolog med a-underenheden, a'-underenheden eller b-underenheden af human faktor XIII, indsættes DNA-sekvensen derefter i en egnet ekspressionsvektor. Ekspressionsvektorer, der er brugbare i forbindelse med den foreliggende opfindelse, vil yderligere omfatte en promotor, som på funktionsdygtig måde er koblet til den DNA-sekvens, som koder for a-, a’-20 eller b-polypeptider. Det foretrækkes, at ekspressionsvektorer yderligere omfatter et replikationsorigin såvel som nukleotidsekvenser, som regulerer og/eller forøger ekspressionsniveaueme, hvilket afhænger af den valgte værtscelle. Egnede ekspressionsvektorer kan hidrøre fra plasmider eller vira eller kan indeholde elementer af begge. Udvælgelsen af egnede vektorer og 25 deres komponentnukleotidsekvenser vil være indlysende for en fagmand.

a- eller a'-underenheden kan også coekspressioneres sammen med b-un-derenheden i en rekombineret celle. For at opnå dette indføres to ekspressionsenheder i værtscellen. Ekspressionsenhedeme kan være på forskellige 30 vektorer med forskellige selekterbare markører eller kan fortrinsvis være på

DK 175919 B1 I

en enkelt ekspressionsvektor. Sidstnævnte strategi giver den fordel, at der I

tilvejebringes det samme kopiantal af de to ekspressionsenheder. I

Foretrukne prokaryotiske værtsceller til brug ved udførelse af den foreliggen- I

5 de opfindelse er stammer af bakterierne Escherichia coli. skønt Bacillus og I

andre slægter også kan bruges. Metoder til transformering af disse værter og I

ekspression af fremmede gener, som er klonet i dem, er velkendte for en I

fagmand (se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. I

Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Vektorer, som anvendes til ekspressi- I

10 on af fremmede gener i bakterielle værter, vil almindeligvis indeholde en se- I

lekterbar markør, såsom et gen for antibiotikaresistens, samt en promotor, I

som fungerer i værtscellen. Egnede promotorer inkluderer trp-promotoren I

(Nichols og Yanofsky, Meth.Enzvmol. 101:155-164. 1983), lac-promotoren I

(Casadaban et al., J.Bacteriol. 143:971-980. 1980) og fag λ promotorsyste- I

15 met (Queen, J.Mol.Appl.Genet. 2:1-10.1983). Plasmider, som er brugbare til

at transformere bakterier, inkluderer pBR322 (Bolivat et al., Gene 2:95-113, I

1977), pUC-plasmideme (Messing, Meth.Enzvmol. 101:20-77. 1983; Vieira I

og Messing, Gene 19:259-268. 1982), pCQV2 (Queen, se ovenfor) og deri- I

vater heraf. Plasmider kan indeholde både virale og bakterielle elementer. I

20 I

Eukaryotiske mikroorganismer, såsom gæren Saccharomvces cerevisiae. I

Schizosaccharomvces pombe eller filamentøse svampe (f.eks. Aspergillus

spp.. Neurospora spp.) kan også anvendes som værtsceller ved den forelig- I

gende opfindelse. Metoder til transformering af gær er velkendte fra litteratu- I

25 ren og er f.eks. blevet beskrevet af Beggs (Nature 275: 104-108, 1978).

Asperqillus-arter kan transformeres ved hjælp af kendte producerer, f.eks. I

den, der er beskrevet af Yelton et al., (Proc.Natl.Acad.Sci.USA.. 81:1740- I

1747, 1984). Egnede gærekspressionsvektorer inkluderer YRp7 (Struhl et al., I

Proc.Natl. Acad.Sci.USA 76:1035-1039, 1979), YIP5 (Struhl et al., se oven- I

30 for), YEp13 (Broach et al., Gene 8:121-133, 1979), pJDB248 og pJDB219 I

(Beggs, se ovenfor) samt derivater heraf. Sådanne vektorer vil almindeligvis I

13 DK 175919 B1 inkludere en selekterbar markør, såsom næringsmarkøren LEU2, som muliggør selektion i en værtsstamme, der bærer en leu2-mutation, eller kan inkludere et "essentielt gen" som en selekterbar markør (Kawasaki og Bell, EP ' 171.142). En sådan foretrukken essentiel genmarkør er POT1-genet fra 5 Schizosaccharomvces pombe. som tilvejebringer en stabil plasmidoprethol-delse i en TPI-deficient værtscelle, som dyrkes i et rigt medium. Foretrukne promotorer, som kan bruges i gærekspressionsvektorer, inkluderer promoto- .

rer fra gærglycolytiske gener (Hitzeman et al., J.Biol.Chem. 255: 12073-12080, 1980; Alberog Kawasaki, J.Mol.Appl.Genet. 1:419-434. 1982; Kawa-10 saki, US patent nr. 4.599.311) eller alkoholdehydrogenasegener (Young et al., i "Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals", Hollaender et al., red., s.335, Plenum, New York, 1982; Ammerer, Meth. Enzvmol.. 101: 192-201, 1983; Russell et al., Nature. 304: 652-654, 1983). I denne henseende er specielt foretrukne promotorer TP11-promotoren, GAL10-15 promotoren og ADH2-4c-promotoren. Ydermere foretrækkes det at inkludere et transkriptionstermineringssignal, såsom TPI1-terminatoren, i ekspressionsvektoren. For at lette oprensningen af polypeptider, der er fremstillet i en gærtransformant, kan en signalsekvens, fortrinsvis fra et gærgen, som koder for et secerneret protein, knyttes til den kodende sekvens for det protein, som 20 har interesse. En specielt foretrukken signalsekvens er præproområdet af MFa1-genet (Kurjan og Herskowitz, Cell. 30: 933-943, 1982; Kurjan et al., US patent nr. 4.546.082). Et andet foretrukkent signalpeptid er et 19 aminosyrer langt signalpeptid udformet ifølge reglerne af von Heijne (Eur.J.Biochem. 133: 17-21, 1983; J.Mol.Biol. 184: 99-105, 1985; 25 Nucleic Acids Res. 14:4683-4690,1986).

Højere eukaryotiske celler kan også tjene som egnede værtsceller ved den foreliggende opfindelse, hvor dyrkede pattedyrceller foretrækkes. Ekspressionsvektorer til brug i pattedyrceller vil omfatte en promotor, som er i stand til 30 at dirigere transskriptionen af et fremmed gen, der indføres i en pattedyrcelle.

Specielt foretrukne promotorer er musemetallothionein-1 -promotoren (MT-1-

I DK 175919 B1 I

I 14 I

I promotoren) (Palmiter et al., Science 222: 809-814, 1983) eller sen hoved- I

I promotor fra adenovirus 2. Ligeledes inkluderet i sådanne ekspressionsvek- I

I torer er et polyadenyleringssignal anbragt nedenstrøms DNA-sekvens- I

I indsættelsesstedet. Polyadenyleringssignalet kan være signalet for det klo- I

I 5 nede gen, eller det kan hidrøre fra et heterologt gen. Der kan også være in- I

I kluderet andre sekvenser, såsom forstærkere (eng: enhancere) og RNA- I

splejsningssignaler. Ekspressionsvektorkonstruktionen kan foretages af en I

fagmand. I

I 10 Klonede DNA-sekvenser kan derefter indføres i dyrkede pattedyrceller ved I

I f.eks. calcium-phosphat-medieret transficering (Wigler et al., Cell 14: 725, I

1978; Coraro og Pearson, Somat.Cell.Genet. 7: 603, 1981; Graham og Van I

I der Eb, Virol. 52:456, 1973). Der dannes et præcipitat af DNA og cal- I

I ciumphosphat, og dette præcipitat tilføres til pattedyrcelleme. Nogle af celler- I

I 15 ne optager det fremmede DNA og bevarer det inden i værtscellen i adskillige I

I dage. En lille fraktion af disse celler (typisk ca. en ud af 104) integrerer det I

I heterologe DNA i genomet. For at identificere disse celler, som integrerer det I

I heterologe DNA, indføres der almindeligvis i cellerne et gen, som giver en I

I selekterbar fænotype (en selekterbar markør) sammen med det gen, som har I

I 20 interesse. Foretrukne selekterbare markører inkluderer gener, som giver re- I

I sistens mod medikamenter, såsom neomycin, hygromycin og methotrexat. I

I Selekterbare markører kan indføres i cellen på en separat ekspressionsvek- I

I tor samtidig med det gen, som har interesse, eller de kan indføres på den I

samme ekspressions vektor. Der kan også anvendes alternative transfice- I

I 25 ringsteknikker, såsom elektrisk poredannelse (Neumann et al., EMBO J. I

I 1:841-845,1982). I

I Kopiantallet af den integrerede gensekvens kan forøges ved amplifikation I

I ved hjælp af medikamentselektion på den selekterbare markør. Medikament- I

I 30 koncentrationen forøges på trinvis måde med selektion af resistente celler i I

15 DK 175919 B1 hvert trin. Ved at selektere for forøget kopiantal af kloningssekvenser kan ekspressionniveauer hæves væsentligt.

De selekterede værtsceller dyrkes i et egnet dyrkningsmedium, og den re-5 kombinerede faktor XIII kan isoleres ifølge standardprocedurer. I korthed isoleres faktor XIII ved DEAE-cellulosekromatografi efterfulgt af fraktionering på en Sepharose-6B-søjle. Søjlen elueres med en egnet puffer, såsom 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, som indeholder 1 mM EDTA. Den aktive top koncentreres ved præcipitering med 40% ammoniumsulfat. Der kan anvendes alternative 10 procedurer, såsom immunoaffinitetskromatografi eller HPLC.

Én anvendelse af proteinerne fremstillet ved de her beskrevne metoder er som farmaceutiske sammensætninger. Proteinerne kan oprenses og formuleres på traditionel måde, hvilket resulterer i en egnet koncentration i forhold 15 til den bestemte vært, som skal behandes. Der kan også anvendes fysiologisk acceptable bærere eller fortyndere, såsom sterilt vand, salin og pufret salin. En sådan farmaceutisk sammensætning kan indgives på en række forskellige måder. Proteinerne kan ofte anvendes ved formulering af vævstætningsmidler.

20

De efterfølgende eksempler gives til illustration og har ikke på nogen måde til hensigt at være begrænsende.

DK 175919 B1 I

' I

Eksempler I

Med mindre andet angives blev der anvendt molekylærbiologiske stan- I

dardmetoder. I

Restriktionsendonukleaser, exonuklease BAL-31 og TVDNA-ligase blev op- | I

nået fra Bethesda Research Laboratories eller New England Biolabs. Kle- i I

now-fragmentet af Escherichia coli DNA-polymerase, bakteriel alkalisk I

phosphatase, ATP, deoxynukleotider, dideoxynukleotidtriphosphater, I

10 M13mp10, M13mp11, M13mp18, M13mp19, pUC9 og pUC19 blev opnået fra I

Bethesda Research Laboratories. Et humant placenta cDNA-bibliotek blev I

opnået fra Clontech Lab., Inc. (Palo Alto, Calif.). Na125l- og 32P-mærkede nu- I

kleotider samt [cr^SKdATP blev opnået fra New England Nuclear eller I

Amersham. Normal human plasma var fra Pacific Nothwest Red Cross Blood I

15 Service, Portland, Oregon. I

Faktor XIII blev oprenset fra human plasma ifølge fremgangsmåden af I

C.G.Curtis og L.Lorand, Meth.Enzvmol. 45: 177-191,1976. Den blev omdan- I

net til faktor XIIla i nærværelse af thrombin, og thrombinet blev derefter inak- I

20 tiveret af hirudin, a - og b-enhedeme blev fraktioneret ved gelfiltrering på en I

Bio-Gel-A-5m-$øjle ifølge fremgangsmåden af Chung et al., se ovenfor. I

Polyklonale antistoffer mod a'-underenhedeme og b-underenhedeme af fak- I

tor XIII blev rejst i kaniner, og immunoglobulinfraktioneme blev oprenset ved I

25 ammoniumsulfatfraktionering, DEAE-Sephadex-søjlekromatografi og affini- I

tetskromatografi under anvendelse af en immobiliseret antigen-Sepharose- I

søjle. I

Oligonukleotider blev syntetiseret på et Applied Biosystems (Foster City, Ca- I

30 lif.) model 380A syntetiseringsapparat og blev oprenset på polyacrylamidge- I

ler. I

DK 175919 B1 17 ,

Eksempel 1

Kloning af et cDNA. som koder for a-underenheden af human faktor XIII

5 A. Screening for cDNA, som koder for a-underenheden af human faktor XIII. i

Et Agt11 -ekspressionsbibliotek, som indeholder cDNA'er, der er fremstillet ud fra human placenta mRNA, blev screenet for a-underenheden af human fak-10 tor XIII. Et 125l-mærket, affinitetsoprenset kaninantistof (specifik aktivitet = 6 x 106 cpm/pg) blev anvendt til at screene filtrene, som indeholdt fager udpladet med en tæthed på 1,5 x 105 plaques pr. 150 mm plade. Der blev isoleret 6 positive kloner ved at screene ca. 3 x 106 fager, og hver positiv fag blev pla-que-oprenset.

15

Plaque-oprensede kloner blev derefter screenet med følgende 32P-mærket oligonukleotidprobe: 5' CTC CAC GGT GGG CAG GTC GTC CTC G3\ Denne probe koder for aminosyresekvensen: Ala-Glu-Asp-Asp-Leu-Pro-Thr-Val-Glu, som er til stede i aktiveringspeptidet af a-underenheden (Takagi og Doo-20 little, se ovenfor), Nukleotidsekvensen for proben blev udvalgt ved at anvende den mest almindelige codonudnyttelse til aminosyrer for en række forskellige humane proteiner (Chen og Barker, Trends in Genetics i: 221-223, 1985). Oligonukleotidet blev mærket med 32P til et en specifik aktivitet på 1,1x108 cpm/pg.

25 B. DNA-sekventerina af cDNA-indføielser.

Der blev fremstillet fag-DNA fra positive kloner ved lyseringsmetoden med flydende kultur (T.J.Silhavy et al., i Experiments with Gene Fusions. CSH 30 Laboratory, N.Y., s.140-141, 1984) efterfulgt af centrifugering og adskillelse i bånd på en cæsiumchloridtringradient. cDNA-indføjelser blev isoleret ved

18 I

DK 175919 B1 I

fordøjelse af fag-DNA med Eco-RI-endonuklease, og 5'- og 3'-endeme af hver indføjelse blev sekventeret. En af kloneme med en stor cDNA-indføjelse

(AHFXIIIa3,77, ATCC nr.40261) blev udvalgt til yderligere sekvensanalyse. I

Denne indføjelse indeholdt tre interne Eco Rl-steder, hvilket gav årsag til 4

5 cDNA-fragmenter ved fordøjelse af fag-DNA’et med Eco R1. Disse frag- . I

menter og adskillige yderligere restriktionsfragmenter blev subklonet i I

plasmid pUC9 eller pUC19. Ydreligere restriktionsfragmenter fra andre I

cDNA-indføjelser blev subklonet i M13mp10, M13mp11, M13mp18 eller I

M13mp19 for at opnå overlappende sekvenser cDNA-indføjelseme blev I

10 derefter sekventeret ved dideoxymetoden (F.Sanger et al., Proc. I

Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467, 1977) under anvendelse af [a35SJ(dATP I

og puffergradientgeler (M.D.Biggin et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3963- I

3965, 1983). Der blev udført fordøjelser med nuklease BAL-31 for at frem- I

bringe 5 yderligere fragmenter, som tilvejebragte sekvenser, der overlappede I

15 med Eco Rl-restriktionsfragmenteme. I

Sekvensen for 3831 basepar fra disse overlappende kloner og den afledte aminosyresekvens er vist i fig. 1. Denne DNA-sekvens koder for hele amino- syresekvensen af den modne a-underenhed af human faktor XHI, som cirku-

20 lerer i blodet. a-Underenheden er sammensat af 731 aminosyrer, som starter I

med en aminoterminal sekvens på Ser-Glu-Thr-Ser. Denne aminoterminale I

sekvens blev tidligere rapporteret af Takagi og Doolittle, se ovenfor. Det car- I

boxyterminale Met (nukleotid 2281-2283) er efterfulgt af en stopcodon (TGA), I

1535 basepar med ikke-kodende sekvens og et potentielt polyadenylerings- I

25 signal eller processeringssignal på AATAAA. Polyadenyleringssekvensen var I

lokaliseret 14 nukleotider opstrøms poly(A)-halen på 10 nukleotider. Poly(A)- I

halen var kun til stede i en anden cDNA-klon, betegnet ÅHFXIIIa3,82. I

cDNA-indføjelsen i AHFXIIIa3,77 koder også for 30 aminosyrerester, som I

30 synes at kode for en sekvens i læseramme. Spaltning af bindingen mellem I

Met og Ser ved hjælp af en processeringsprotease til frembringelse af mo- I

19 DK 175919 B1 dent faktor XIII ville kræve en yderligere processeringsprotease til frembringelse af det modne protein med en aminoterminal Ser. Dette ville blive efterfulgt af en acetyleringsreaktion, som førte til dannelsen af acetyl-serin ved den aminoterminale ende af det modne protein (Takagi og Doolittle, se oven-5 for; S. Nakamura et al., JJ3iochem. 78:1247-1266, 1975).

En forskel i nukleotidsekvensen for a-underenheden af faktor XIII blev fundet ved 3 positioner, hvor en sammenligning mellem cDNA- indføjelserne blev udført i områder, hvor der var blevet opnået overlappende sekvenser. Nu-10 kleotideme 2038, 2041 og 2727 indeholdt A, C henholdsvis T i AHFXIIIa3,77 (fig. 2), medens AHFXIIIa3,82 indeholdt G, G og A i de samme positioner.

Disse forskelle resulterede i en ændring i to aminosyrer (Ile 650 og Gin 651 til Val og Glu) og kunne repræsentere en polymorfisme, som bidrager til mikro-heterogeniteten i a-underenheden af faktor XIII (P.G.Board og M.Coggan, 15 Hum.Genet. 59:135-136.19811 C. Aminosvresekventerinq

Der blev også udført aminosyresekvensanalyser på cyanogenbromid-fragmenter fra a-underenheden af faktor XIII. I korthed blev 10 mg faktor XIII 20 dialyseret natten over mod 5% HCOOH, og dialysatet belv indstillet til pH 4,0 med ammoniumhydroxid. Præcipitatet, som var beriget med a-underenheden (83% a og 17% a-underenheder) blev S-carboxymethyleret og fordøjet med cyanogenbromid. De fremkomne fragmenter blev separeret ved gelfiltrering på en Sephadex G-50 superfin søjle under anvendelse af 5% HCOOH og 25 yderligere oprenset på et Waters HPLC-system under anvendelse af Ultrapo-’ re C3 med omvendt fase (Altex). Den anvendte gradient bestod af 0,1% trifluoreddikesyre som en mobil fase og 0,8% trifluoreddikesyre i 80% aceto-nitril som et mobilfasemodificerende middel. Søjlen blev kørt ved en flow-hastighed på 1,5 ml/min, og eluatet blev fulgt ved en absorbans ved 214 nm.

30

20 I

DK 175919 B1 I

11 af de fra cDNA'et forventede 18 cyanogenbromidfragmenter blev isoleret.

Peptider fra b-underenheden (A.lchinose et al., Biochem. 25:4633-4638,

1986) blev let identificeret og blev frasorteret fra de resterende peptider hid- I

rørende fra a-underenheden. Sekvensanalysen af hver af de oprensede cya-

5 nogenbromidfragmenter blev udført med et automatiseret Beckman- . I

sekventeringsapparat, model 890C ved metoden ifølge P.Edman og G.Begg, I

Eur.J.Biochem. V. 80-91, 1967. PTH-aminosyrer blev identificeret ved hjælp I

af to komplementære søjlesystemer med omvendt fase (L.H.Ericsson et al., i I

"Solid Phase Methods in Protein Sequence Analysis", A.Previero og I

10 M.A.Coletti-Previero (red.), s. 13-142, 1977; J.L.Glajch et al., J.Chromatoar. I

318:23-29, 1985). Ialt 363 aminosyrerester blev utvetydigt identificeret (ami- I

nosyreresteme med en streg over i figur 1). Disse aminosyresekvenser var i I

fuldstændig overensstemmelse med dem, der blev afledt fra cDNA'et. I

15 Den proteinsekvens, som kan udledes fra cDNA'et, inkluderer 6 potentielle I

Asn-koblede glycosyleringssteder med en sekvens på Asn-X-Ser eller Asn-X- I

Thr. Disse Asn-rester er lokaliseret ved positionerne 17, 46, 541, 556, 613 og I

686. To af disse Asn-rester har lidt eller ingen kulhydrat, eftersom Asn let I

kunne påvises i position 613 og 686 ved aminosyresekvensanalysen. Yder- I

20 mere blev kulhydrat ikke rapporteret i Asn 17 af Takagi og Doolittle (se oven- I

for). Eftersom a-underenheden af faktor XIII kun indeholder 1,5% kulhydrat, I

er det også muligt, at positionerne nr. 46, 541 og 556 kun indeholder lidt kul- I

hydrat eller intet kulhydrat. En delvis glycosylering af nogle af disse Asn- I

rester kunne imidlertid bidrage til mikroheterogeniteten af a-underenheden af I

25 human faktor XIII (Board og Coggan, se ovenfor). I

a-underenheden af faktor XIII består af 731 aminosyrerester med følgende I

sammensætning: Ala37, Arg45, Asn4o, Asp47, 1/2Cys9, Gln27, Glu», Glyso. I

His14, lle39, Leu-w, Lys38, Metig, Phe32, Pro33, Ser45, acetyl-Sen, Thr45, Trpi5, I

30 Tyr29, Val7o. Molekylvægten af polypeptiddelen af molekylet blev beregnet til I

at være 80.488. Tilføjelsen af 1,5% kulhydrat giver en molekylvægt på ca. I

21 DK 175919 B1 81.700 for hver af a-underenhedeme af human faktor XIII. Dette er i god overensstemmelse med værdien på 75.000, som er beregnet ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (Chung et al., se ovenfor).

5 Aktivering af faktor XIII med thrombin skyldes fra spaltningen af et aktiveringspeptid fra den aminoterminale ende af hver af a-underenhedeme i molekylet (Schwartz et al., se ovenfor). Den aminoterminale sekvens af a-underenheden af faktor XIII, som blev deduceret ud fra alle 6 cDNA-kloner, var den samme som den, der er rapporteret af Takagi og Doolittle, (se oven-10 for), med undtagelse af en yderligere Val ved aminosyrerest 34. Følgelig forudsiger cDNA-resuitateme et aktiveringspeptid på 37 aminosyrer i stedet for 36 aminosyrer, a-underenheden af bovin faktor XIII indeholder en Leu-rest i position 34 i stedet for Val, og aktiveringspeptidet er også 37 aminosyrer langt (Nakamura et al., se ovenfor).

15

Den carboxyterminale rest af a-underenheden af faktor XIII blev identificeret som Met, hvilket er det samme som for bovinmolekylet. Både de amino- og carboxylterminale sekvenser af a-underenheder af faktor XIII er imidlertid totalt forskellig fra sekvenserne for vævstransglutaminase (J.M. Connellan et 20 al.. J.Biol.Chem. 246:1093-1098, 1972).

Aminosyresekvenserne ved de aktive steder i plasma faktor XIII og vævstransglutaminase er blevet identificeret som Gly-GIn-Cys-Trp henholdsvis Tyr-Gly-GIn-Cys-Trp (Cooke, se ovenfor; J.E.Folk og P.W.Cole, 25 J.Biol.Chem. 241: 3238-3240, 1966). De foreliggende resultater fra cDNA-analyse og aminosyresekvensanalyse indikerer, at sekvensen for det aktive sted i Tyr-Gly-GIn-Cys-Trp starter ved aminosyreresten Tyr 311.

DNA-sekvenseme blev analyseret med et computorprogram fra Textco 30 (W.Lebanon, N.H.) under anvendelse af en Apple Macintosh computor. En computorstøttet analyse under anvendelse af et Dayhoff-program (M.O.

I DK 175919 B1 I

I 22 I

I Dayhoff et al., Meth.Enzvmol. 91:524-545, 1983) afslørede, at aminosyre- I

I sekvensen for a-underenheden af faktor XIII er unik, og der blevet fundet li- I

I den væsentlig homologi med nogen andre proteiner bortset fra det aktive I

I sted i transglutaminase og mindre sekvenshomologi med γ-underenheden af I

I 5 acetylcholinreceptor. I

I Eksempel II I

I Kloning af et cDNA. som koder for b-underenheden af I

I 10 Human faktor XIII I

I A. Screening af et cDNA-bibliotek I

I Et Agt11-ekspressionsbibliotek, som indeholdt cDNA'er, der er fremstillet ud I

I fra human lever-mRNA, blev screenet for b-underenheden af human faktor I

I 15 XIII under anvendelse af et 125l-mærket, affinitetsoprenset, kaninantistof. Det I

I oprensede antistof blev mærket med Na125l til specifik aktivitet på 4 x 106 I

I cpm/pg og blev anvendt til at screene filtere, som indeholdt fager, der var ud- I

I pladet ved en densitet på 1,5x105 plaque pr. 150 mm plade. Der blev isoleret I

I 9 positive kloner ved at screene 2x106 fager, og hver blev plaque-oprenset. I

I 20 I

I B. DNA-sekventerinq af cDNA-indføielser. I

I Der blev fremstillet fag-DNA ud fra positive kloner ved hjælp af en lyse- I

I ringsmetode i flydende kultur (Silhavy et al., se ovenfor) efterfulgt af centrifu- I

I gering og bånddannelse på en cæsiumchloridtringradient. Klonen med den I

I 25 største cDNA-indføjelse (ca. 2,2 kilobaser) blev betegnet AHFXIIIb2,2 og blev I

udvalgt til yderligere undersøgelser. Fag-DNA fra AHFXIIIb2,2 blev skåret I

I med Eco RI til isolering af den 2,2 kb lange cDNA-indføjelse. Dette fragment I

I blev subklonet i plasmid pUC9, som var blevet lineariseret ved fordøjelse I

I med Eco RI til konstruktion af plasmid pUC9b2,2 (ATCC nr. 40260). Hen- I

I 30 sigtsmæssige restriktionsfragmenter fra indføjelsen blev derefter subklonet i I

I M13mp10 eller M13mp18 til sekventering ved dideoxymetoden (Sanger et I

23 DK 175919 B1 al., se ovenfor) under anvendelse af [a35S](dATP og puffergradientgeler (Biggin et al., se ovenfor). Der blev udført styrede fordøjelser med nuklease BAL-31 til frembringelse af egnede fragmenter, som tilvejebragte sekvenser, der overlappede med restriktionsfragmenterne. Alle sekvensbestemmelser 5 blev udført mindst 3 gange på begge DNA-strenge.

cDNA-indføjelsen fandtes at være sammensat at 2180 basepar, som kodede ! for hele aminosyresekvensen for b-underenhedenaf faktor XIII, som cirkulerer i blodet (figur 2). Den modne b-underenhed er sammensat af 641 amino-10 syrer, som starter med det aminoterminale Glu (nukleotiderne 56-58). Den aminoterminale sekvens på Glu-Glx-Lys-Pro for b-underenheden af human faktor XIII blev fastlagt tidligere af Takagi og Doolittle (se ovenfor) og blev udvidet i forbindelse med den foreliggende opfindelse. Det carboxyterminale Thr (nukleotiderne 1979-1981) efterfølges af en stopcodon (TAG), 187 base-15 par af ikke-kodende sekvens og en poly(A)-hale på 9 basepar. Polyadenyle-rings- eller processeringssignalet på AATAAA blev identificeret 19 nukleo-tider opstrøms poly(A)-halen.

cDNA-klonen koder også for 19 aminosyrerester, som udgør en del af et le-20 derpeptid. Den partielle ledersekvens på 19 aminosyrer inkluderer en typisk hydrofob,kerne og en Ala-rest ved position -1 og Leu ved position -3. Disse aminosyrerester er i overensstemmelse med ”-1 og -3-reglen", hvor -1 positionen hovedsagelig er optaget af Ala i signalsekvenser (D.Periman og H.O.Halvorson, J.Molec.Biol. 167: 391-409, 1983; G. von Heijne, 25 J.Molec.Biol. 173:243-251. 1984). Aminosyresekvensanalyse af det intakte • protein blev derefter udført på et Beckman-sekventeringsapparat, og de 19 aminosyrer blev identificeret. Dette udvidede den aminoterminale sekvens, som oprindelig blev rapporteret af Takagi og Doolittle, se ovenfor.

30

DK 175919 B1 I

C. Aminosvresekventerina I

Der blev også udført aminosyresekvensanalyser på cyanogenbromin- I

fragmenter af b-underenheden af human faktor XIII. Faktor XIII blev oprenset

fra human plasma ifølge framgangsmåden af Curtis og Lorand, se ovenfor. I

5 Efter inkubering med thrombin blev b-underenheden af faktor XIII separeret I

fra a-underenheden ved gelfiltrering. Den oprensede b-underenhed (10 mg) I

blev derefter S-pyridylethyleret (M. Friedman et al., J.Biol.Chem. 245:3868- I

3871, 1970) og fordøjet med cyanogenbromid. De fremkomne fragmenter I

blev separeret og oprenset ifølge den fremgangsmåde, der er beskrevet I

10 ovenfor i eksempel I.C. H

Der blev isoleret 9 af de 10 cyanogenbromidfragmenter, som var forventet ud I

fra den aminosyresekvens, der er opnået fra cDNA’et, og disse svarer til H

cyanogenbromidfragmenterne 1-4 og 6-10, nummereret fra den aminotermi- I

15 nåle ende af proteinet (figur 3). Hver af disse fragmenter blev derefter under- H

kastet aminosyresekvensanalyse som beskrevet i eksempel I.C., og ialt 299 I

aminosyrerester blev klart identificeret. Disse aminosyresekvenser var i fuld- H

stændig overensstemmelse med dem, der er afledt af cDNA'et og den ami- I

noterminale sekvensanalyse af det intakte protein. I

20 I

b-Underenheden af faktor XIII består af 641 aminosyrerester og har følgende H

komposition: Alai7l Arg26, Asn30, Asp22, 1/2Cys40, Gln20, Glu6o, Gly48, Hisi8, I

lle^, Leu47, Lys*,, Metg, Phe20, Pro41, Ser45l Thr*,, Trp10, Tyr42l Val29. Mole- I

kylvægten af polypeptiddelen blev beregnet til at være 69.973. Tilføjelsen af I

25 8,5% kulhydrat giver en molekylvægt på ca. 76.500 for hver af b- I

underenhedeme af human faktor XIII. Dette er i god overensstemmelse med I

værdien på 80.000 beregnet ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese I

(Schwartz et al., se ovenfor; Chung et al., se ovenfor). H

30 Den proteinsekvens, som er afledt fra cDNA'et, inkluderer to potentielle Asn- I

koblede glycosyleringssteder med sekvensen Asn-Tyr-Ser og Asn-Gly-Ser, I

25 DK 175919 B1 som starter med aminosyreresterne 142 henholdsvis 525. Ydermere er et tredie potentielt kulhydratfastgørelsessted tilstede i sekvensen Asn-Arg-Cys, som starter med aminosyre 252. Fastgørelsen af kulhydratkæder til Asn-rester i en sekvens på Asn-X-Cys blev først rapporteret i bovin-protein C 5 (J.Stenflo og P.Femlund, J.Biol.Chem, 257:12180-12185,1982) og senere i human von Willebrand faktor (K.Titani et al., Biochem. 25:3171-3184. 1986).

Den differentielle glycosylering af disse Asn-rester kan tildels være ansvarlige for mikroheterogeniteten af b-underenheden af human faktor XIII (C.G.

Curtis et al., Biochem. 13: 3774-3780, 1974; P.G.Board, Am.J.Hum. Genet.

10 32: 348-353, 1980). De 20 potentielle disulfidbindinger, som er identificeret ved det cDNA, som koder for b-underenheden af faktor XIII, er i rimelig god overensstemmelse med de 16-17 disulfidbindinger, som tidligere er rapporteret (Chung et al., se ovenfor). b-Underenheden af faktor XIII mangler frie -SH-grupper.

15

Aminosyresekvensen for b-underenheden af faktor XIII viser tegn på betragtelig intern gendupiikering, hvilket involverer 10 gentagne sekvenser på ca.

60 aminosyrer. Disse gentagne sekvenser blev underinddelt i 4 forskellige grupper (fig. 4). Identiteterne i grupperne 1, 2, 3 og 4 var 34-42%, 34-42%, 20 38% henholdsvis 41%. Skønt identiteterne blandt de 4 grupper af gentagne områder tydeligvis er mindre end hver intern identitet indikerer en høj skoring ved gruppering under anvendelse af Dayhoff-programmet (Dayhoff et al., se ovenfor), at disse 4 grupper er divergeret fra én prototype. F.eks. var gruppe- n ringsskoringen 7,7 mellem gentagelsesområdeme 3 og 4, 12,1 mellem gen-25 tagelsesområderne 5 og 7 og 3,4 mellem gentagelsesområdeme 6 og 8. De 10 gentagne områder (1-10) kan lægges på række efter hinanden gennem 98% af molekylet og inkluderer aminosyreresterne 1-626. En kort sekvens på 15 aminosyrer (aminosyreresterne 627-641) efter det sidste gentagne område ved carboxylenden af molekylet var ikke homolog med de gentagne om-30 råder 1-10.

i_________

26 I

DK 175919 B1 I

Den computorstøttede analyse under anvendelse af et Dayhoff-program af- I

slørede, at de gentagne sekvenser i b-underenheden af faktor XIII er med- I

lemmer af en familie af gentagelser, som meget ligner 3 gentagne segmenter I

i Ba-kæden i faktor B af human komplement (J.E.Mole et al., J.Biol.Chem. I

5 259: 3407-3412, 1984), fem gentagne segmenter i human 62-glycoprotein I ., I

(J.Lozier et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3640-3444.1984) [et protein, som I I

er identisk med det aktiverede protein C bindingsprotein (W.M.Canfield og I

W.Kisiel, J.Clin.Invest 70:1260-1272. 1982] og human haptoglobin a1-kæde I

(A.Kurosky et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:3388-3392, 1980). Denne se- I

10 kvenshomologi er vist på figur 3. Det fjerde segment af 32-glycoproteinet I, I

det andet segment af komplementfaktor Ba og human haptoglobin a1-kæde I

viste de største grupperingsskoringer (11, 8,0 henholdsvis 4,2) med det gen- I

tagne område 6 af b-underenheden af human faktor XIII. Disse resultater I

indikerer, at disse 4 proteiner deler en fælles forfader og er sandsynligvis et I

15 resultat af exonmanipulering under evolutionen. I

Lokaliseringen af 5 disulfidbindinger i de 5 homologe segmenter i β2- I

glycoprotein I er blevet fastslået og har vist sig at ske mellem den første og I

tredie og den anden og fjerde Cys-rest i hvert segment (Lozier et al., se

20 ovenfor). Det synes således sandsynligt, at en lignende parring finder sted I

med disulfidbindingeme i de 10 gentagne områder i b-underenheden af fak- I

tor XIII. I

Eksempel III I

25 Kloning oq subklonina af promotorer I

A. Konstruktion af pMVRI I

Plasmid pMVRI, der anvendes som kilden til TP11-promotoren i efterfølgende I

vektorkonstruktioner, omfatter TP11-promotoren, et α-1-antitrypsin-cDNA I

30 (AAT-cDNA) og TPI1-terminatoren i vektoren plC7RI*. Plasmid pMVRI blev I

konstrueret på følgende måde (figur 5). Plasmid plC7 (Marsh et al., Gene I

DK 175919 B1

27 I

32:481-486, 1984) blev fordøjet med EcoRI, fragmentendeme blev gjort stumpe med DNA:polymerase I (Klenow-fragment), og det liniære DNA blev gjort cirkulært igen under anvendelse af T4-DNA-ligase. Det fremkomne plasmid blev anvendt til at transformere E.coli stamme RRI. Plasmid-DNA 5 blev fremstillet ud fra transformanteme og screenet for tabet af Eco Rl-stedet. Et plasmid med det korrekte restriktionsmønster blev betegnet plC7RI*. TP11 -promotorfraqmentet blev opnået fra plasmid pTPICIO (Albar og Kawasaki, se ovenfor). Dette plasmid blev skåret under anvendelse af det unikke Kpn l-sted i TP11-genet, og det TP11-kodende område blev fjernet ved 10 behandling med nuklease BAL-31. Kinasebehandlede Eco Rl-linkere (GGAATTCC) blev tilføjet til fragmentet, som derefter blev fordøjet med Bgl II og Eco RI til frembringelse af et 0,9 kb langt TP11 -promotorfraqment. Dette fragment blev føjet til plasmid YRp7' (Stinchcomb et al., Nature 282:39-43.

1979), som var blevet skåret med Bgl II og Eco RI. Det fremkomne plasmid, 15 pTE32, blev spaltet med Eco RI og Barn Hl til fjernelse af en del af tetra-cyklinresistensgenet. Det lineariserede plasmid blev derefter gjort cirkelformet igen ved tilføjningen af en kinasebehandlet Eco RI - Barn Hl-oligo-nukleotidadaptor (5' AAT TCA TGG AG 3' og 5’ GAT CCT CCA TG 3’). Det fremkomne plasmid, pTEA32, blev fordøjet med Bgl II og Eco RI til isolering 20 af det 900 bp lange TP11 -promotorfraqment. Dette fragment blev sluttet sammen med plC19H (Marsh et al., se ovenfor), som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Bgl II og Eco RI. Det fremkomne plasmid blev betegnet pICTPI. Plasmid pFATPOT (deponeret som en S.cerevisiae transformant i stamme E18, ATCC nr. 20699) blev fordøjet med Sph I og Hind III til isolering 25 af det 1750 bp lange fragment, som omfattede den partielle TP11-promotor, et cDNA, som koder for human a-1-antitrypsin, og TPI1-terminatoren.

Plasmid pICTPI blev fordøjet med Nar I og Sph I til isolering af det 1,1 kb lange fragment, som omfattede den partielle TP11-promotor og den lacZ-kodende sekvens. Plasmid plC7RI* blev fordøjet med Hind III og Nar I til iso-30 lering af det 2,5 kb lange vektorfragment. plC7RI*-fragmentet, det partielle TPI1-promotorfragment hidrørende fra plasmid pICTPI og det 1,75 kb lange

28 I

DK 175919 B1 I

fragment hidrørende fra plasmid pFATPAT blev bundet sammen i en 3-parts I

ligering til frembringelse af plasmid pMVRI. I

B. Konstruktion af dTRK4c I

5 ADH2-4c-promotoren blev afledt fra plasmideme pBR322-ADR2-B$a (V.M. I

Williamson et al., Cejl 23:605-64, 1981) og YRd7-ADR3-4c (D.W. Russell et I

al., se ovenfor). Et Eco Rl-sted blev anbragt netop 3’ for translationsstartco- I

donen af ADH2-promotoren hidrørende fra plasmid pBR322-ADR2-BSa ved I

in vitro mutagenisering. Efter mutageniseringen blev 5’-flankerende sekven- I

10 ser, som tilvejebringer ADH2-4c-fænotypen, anvendt til at erstatte de analoge I

sekvenser i ADH2-promotoren. Det 2,2 kb lange Bam Hl-fragment fra

pBR322-ADR2-BSa, som indeholdt det strukturelle ADH2-aen og de 5'-flan- I

kerende sekvenser, blev ligeret med M13mp19, som var blevet liniariseret I

med Barn Hl. Orienteringen af indføjelsen blev bestemt ved restriktionsanaly- I

15 se. Enkeltstrengede template-DNA blev fremstillet ud fra den fremkomne I

fagklon. Der blev udført stedspecifik in vitro mutagenisering (M.J.Zoller og I

M.Smith, DNA 3: 479-488,1984) på templaten under anvendelse af oligonu- I

kleotid ZC237 (tabel 1) til udsløjfning af den strukturelle del af ADH2-genet, I

under fusionering af den 5'-flankerende sekvens, herunder translationsstart- I

20 signalet, med Eco Rl-stedet i M13mp19-polylinkeren. Den replikative form af I

den mutageniserede fag blev fremstillet og skåret med Barn Hl og Eco RI til

isolering af det 1,2 kb lange promotorfragment. Dette fragment blev ligeret i I

pUC13, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Barn Hl og Eco RI til I

frembringelse af plasmidet p237WT. For at ændre p237WT-promotoren til I

25 "promotor op" mutanten ADH2-4C. blev et 1,1 kb langt Barn Hl-Sph l-partielt I

promotorfragment fra YRp7-ADR3-4c subklonet i vektorfragmentet fra I

p237WT skåret med Barn Hl og Sph I. Det fremkomne plasmid blev betegnet I

d237-4c. I

30 I

29 DK 175919 B1

Tabel 1 ZC87 5' TCC CAG TCA CGA CGT 3’ ZC212 5’ GAC CTG CAG GAT CCA TGC AGC GCG TGA ACA TGA TCA TGG 3' 5 ZC213 5' GAG GCC TGG TGA TTC TGC CAT GAT CAT GTT CAC GCG CTG 3' ZC235 5* GAT CCA TGC AGC GC 3' ZC237 5' GCC AGT GAA TTC CAT TGT GTA TTA 3' ZC410 5’ CGT ATT ACA GAA TTC CCG GG 3' ZC862 5’ CGA ATC TTT TGA GCT CAG AAA CAC C 3’ 10 ZC1019 5’ ACC CAA GGA TCT CTT GTC CAA AGA AAC ACC TCC TTC 3' ZC1056 5’ ATT TAG ATC TGC A 3' ZC1057 5' GAT CT 3'

ZC1059 5' TCA AAG AAC CCA AGG AAG CTT CAG CCT CTC TTT TAC CCA AAG

AAA C 3' 15 ZC1113 5' CGA CCT TCC ATG TGA TAA CTC GAG AAC CTG AGA TGA AC 3' ZC1206 5' GGA CCT TGT AAA GTG AGA AGC TTC AGA AAC TTC CAG GA 3'

ZC1209 5' GAT GTT GTT GCA AGC TTT CTT GTT CTT GTT GGC TGG TTT CGC

AGG TAC CGA 3'

ZC1210 5' AGC TTC GGT ACC TGG AGC GAA ACC AGC CAA CAA GAA CAA GAA

20 AGC TTG CAA CAA CAT CTC CA 3’

Der henvises til figur 6, hvor ADH2-promotoren p237WT blev modificeret til frembringelse af en "universel" ADH2-promotor. Promotoren blev først sub-klonet i plasmid pCPOT (deponeret hos ATCC som en E.coli stamme HB101 25 transformant, ATCC nr. 39685), som omfatter hele 2-mikronplasmid-DNA'et, Ieu2-d-qenet. pBR322-vektorsekvenseme og Schizosaccharomyces pombe POT1 -genet. Plasmid pCPOT blev fordøjet fuldstændig med Barn Hl og Sal I til isolering af det ca. 10 kb lange liniære vektorfragment. Plasmid pMVRI (eksempel III.A) blev skåret med Eco RI og Xho I til isolering af det 1,5 kb 30 lange AAT-cDNA- TP11 -terminatorfragment. Det 1,2 kb lange ADH2-promotorfragment blev isoleret fra plasmid p237WT som et BamHI-Eco Rl- fragment og blev ligeret med det 1,5 kb lange AAT-cDNA-TPI1_- terminatorfragment og det lineariserede pCPOT i en trepartsligering til frembringelse af plasmidet betegnet pAT-1.

30 I

DK 175919 B1 I

Den ADH2-promotor, som var til stede i plasmid pAT-l, blev derefter modifi- I

ceret til frembringelse af en "universel” promotor ved at fjerne translations- I

startcodon'en og fusionere promotoren til et Eco Rl-sted. Plasmid pAT-1 blev I

fordøjet med Sph I og Barn Hl til isolering af det 190 bp lange fragment, som I

5 omfattede ADH2-promotoren fra Sph l-stedet til Bam Hl-stedet i AAT-cDNA. I

Dette fragment blev ligeret i M13mp18, som var blevet lineariseret ved fordø- I

jelse med Barn Hl og Sph I. En positiv klon blev bekræftet ved restriktions- I

analyse. Tempiate-DNA blev fremstillet ud fra den positive klon. Oiigonukleo- I

tid ZC410 (tabel 1) blev udformet til at erstatte ADH2-translationsstartsignalet I

10 og pUC18-polylinkersekvenserne med et enkelt Eco Rl-sted fusioneret til I

M13mp18-polylinkeren ved Sma l-stedet. Templaten blev udsat for in vitro I

mutagenisering under anvendelse af to-primermetoden (Zoller og Smith, se I

ovenfor, 1984) og oligonukleotideme ZC410 og ZC87 (tabel 1). Positive klo- I

ner blev bekræftet ved dideoxysekventering gennem fusionspunktet. For at I

15 lette manipulering blev det 175 bp lange Sph Ι-Eco Rl-mutageniserede pro- I

motorfragment ligeret i pUC19, som var blevet lineariseret med Sph I og I

Eco RI. Det fremkomne plasmid, betegnet p410ES, omfattede 3-delen af en I

"universel" ADH2-promotor. I

20 Der blev konstrueret en "universel" ADH2-4c-promotor under anvendelse af I

det mutageniserede ADH2-promotorfragment fra p410ES og ADH2-4C- I

promotorfragmentet fra p237-4c. Plasmid p410ES blev fordøjet med Sph I og I

Eco RI til isolering af det 175 bp lange partielle ADH2-promotorfragment. I

Plasmid p237-4c blev skåret med Bam Hl og Sph I til isolering af det 1 kb I

25 lange partielle ADH2-4c-promotorfraQment. ADH2-4c-promotoren blev rekon- I

strueret i en 3-partsligering med Bam Hl-Sph l-promotorfragmentet fra p237- I

4C, Sph Ι-Eco Rl-promotorfragmentet fra p410ES og pUC13, som var lineari- I

seret ved fordøjelse med Bam Hl og Eco RI. Det fremkomne plasmid, p410- I

4C, omfattede en "universel" ADH2-4c-promotor. I

30 I

31 | DK 175919 B1

Som illustreret i figur 7 blev den "universelle” promotor fra plasmid p410-4c anvendt til at erstatte TP11-promotoren, som var til stede i plasmid pMWRI (eksempel III.A.). Plasmid p410-4c blev skåret med Barn Hl og Eco RI til isolering af det 1,2 kb lange ADH2-4c-promotorfraqment. Plasmid pMVRI blev 5 skåret med Barn Hl og Eco RI til isolering af det 1,2 kb lange ADH2-4C-promotorfragment. Plasmid pMVRI blev fordøjet fuldstændig med Eco RI og blev delvis fordøjet med Bgl II til isolering af det 4,2 kb lange AAT-TPI1-terminator-vektor-fragment. Disse to fragmenter blev ligeret til dannelse af plasmidet pTRK4c.

10

Eksempel IV

Konstruktion af vektoren PEAS102

Plasmid pEAS102, som omfatter dele af vektorerne Ylp5 og pJDB207, blev 15 konstrueret på følgende måde. Plasmid pJDB207 (J.D.Beggs, "Proceedings of Alfred Benzon Symposium", 16: 383-389, "Molecular Genetics in Yeast", København, 1981), et derivat af pJDB219 (J.D.Beggs, Nature 275: 104-108, 1978), blev fordøjet med Barn Hl og Pst I til isolering af det 4,4 kb lange fragment, som omfattede Ieu2-d-qenet og 2 mikron DNA samt pBR322- 20 sekvenser. Plasmid Ylp5 (Struhl et al., se ovenfor) blev udsat for delvis fordøjelse med Pst I og fuldstændig fordøjelse med Barn Hl til isolering af det 4,3 kb lange fragment, som omfattede URA3-genet og pBR322-sekvenseme.

Disse to fragmenter blev ligeret, og det fremkomne plasmid blev betegnet pEA102 (illustreret i figur 9).

25

Eksempel V

Ekspression af faktor XIII a-underenhed i aær A. Konstruktion af pRS202.

30 Faktor XIII a-underenhed cDNA (asFXIII-cDNA) blev modificeret ved in vitro mutagenisering til erstatning af det ikke-kodende 3'-område et Xho l-sted 32 11

DK 175919 B1 I

(figur 8). For at lette manipulering blev den 3,0 kb lange asFXIII-cDNA- I

indføjelse, som fandtes i fagklonen AHFXIIIa3,82, subklonet i pUC18. Fag- I

klonen AHFXIIIa3,82 blev fordøjet fuldstændig med Pst I til isolering af det 2,3 I

kb lange fragment, som omfattede asFXIII-cDNA'et. Dette fragment blev lige- I

5 ret med pUC18, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Pst I. Det I

fremkomne plasmid, pUC18 nr. 9, fandtes at indeholde den 2,3 kb lange I

Pst l-indføjelse i anti-sense-orienteringen. asFXIII-cDNA-indføjelsen i pUC18 I

nr. 9 omfattede 19 bp 5* for translationsstarten, det asFXIII-kodende område I

og 120 bp 3' for translationsstoppet. I

10 I

asFXIII-cDNA-indføjelsen blev derefter isoleret og subklonet i vektoren I

pUC118, (opnået fra J.Vieira og J.Messing, Waksman Institute of Microbiolo- I

gy, Rutgers, Piscataway, NJ). Den 2,3 kb lange asFXIII-indføjelse blev isole- I

ret fra pUC18 nr. 9 ved fordøjelse med Pst I, blev subklonet i pUC118 Pst I- I

15 stedet og transformeret i E.coli stamme JM109. En positiv klon, som inde- I

holdt den 2,3 kb lange asFXIIl-indføjelse i anti-sense-orientering, blev beteg- I

netpRS201. I

Det 120 bp lange ikke-translaterede 3’-område af asFXIII-cDNA'et blev fjer- I

20 net og der blev indsat et Xho l-sted 3' for translationsstopcodonen ved sted- I

styret mutagenisering. Plasmid pRS201 blev transformeret i E.coli stamme I

MV1193, og der blev isoleret enkeltstrenget template-DNA. Oligonukleotid I

ZC1113 (tabel 1) blev udformet for at fjerne det ikke-translaterede 3-område I

efter den asFXIII-kodende sekvens og indføre et Xho l-sted 3' for translati- I

25 onsstoppet. Den enkeltstrengede template fra pRS201 blev underkastet in I

vitro mutagenisering ved fremgangsmåden ifølge Zoller og Smith (1984, se I

ovenfor) under anvendelse af det mutagene oligonukleotid ZC1113. En posi- I

tiv klon, som blev bekræftet ved restriktionsanalyse, blev betegnet pRS202. I

30 I

33 DK 175919 B1 B. Konstruktion af plasmid pRS217

Som vist i figur 9 blev det 2,2 kb lange asFXIII-cDNA-fragment fra plasmid pRS202 anbragt bag ADH2-4c-promotoren og blev anbragt i plasmid pEAS102 (eksempel IV). Plasmid pTRK4c (eksempel III.B) blev fordøjet fuld-5 stændig med Eco RI og Sal I til isolering af det 4 kb lange fragment, som omfattede ADH2-4c-promotoren. TRI1-terminatoren og p!C7RI*-vektorsekven-seme. Oligonukleotideme ZC1056 og ZC1057 (tabel 1) blev udformet til at danne en adaptor med en klæbrig Eco Rl-ende, et Bgl Il-sted og en klæbrig Pst-ende. Den klæbrige Eco Rl-ende af adaptoren ødelægger ved ligering til 10 en anden klæbrig Eco Rl-ende Eco Rl-stedet. Oligonukleotideme ZC1056 og ZC1057 blev kinasebehandlet og anneleret (eng.: annealed) til dannelse af Eco Rl-adaptoren. Det 2,2 kb lange Pst l-Xho l-asFXIII-fragment, isoleret fra plasmid pRS202 (eksempel V.A.) blev sat sammen med ZC1056/1057-adaptoren og det 4 kb lange pTRK4c-fragment i en trepartsligering. Det 15 fremkomne plasmid blev betegnet pRS215.

Den ekspressionsenhed, som var til stede i pRS215, blev anbragt i gærvektoren pEA5102. Plasmid pEAS102 blev fordøjet fuldstændig med Hind III efterfulgt af behandling med bakteriel alkalisk phosphatase for at forhindre 20 gendannelse af en cirkel. Plasmid pRS215 blev fordøjet med Hind III til isolering af den 3,5 kb lange ekspressionsenhed, som omfattede ADH2-40-promotoren, asFXIII-cDNA'et og TPI1 -terminatoren. Disse to fragmenter blev ligeret sammen til frembringelse af plasmidet pRS217.

25 Plasmid pRS217 blev transformeret i Saccharomvces cerevisiae stamme XV794-7-1c (MATa ade2-1 leu2-3 Ieu2-113 ura3 Aoep4::TPI1-CAT cir*). idet metoden ifølge Beggs (Nature 275:104-108. 1978) stort set blev anvendt. Transformanter blev selekteret for evnen til at vokse på syntetisk medium, som manglede uracil (-UraD).

30

I DK 175919 B1 I

I 34 I

I Ekspression af faktoren XIII a-underenhed fra pRS217-plasmidet trans- I

I formeret i stammen XV794-7-1C blev opnået ved først at dyrke trans- I

I formanterne natten over i 5 ml -UraD. Kulturerne dyrket natten over blev in- I

I okuleret i 1 liter -UraD og blev dyrket i 48 timer ved 30°C. Kulturerne blev I

I 5 centrifugeret for at høste cellepelleteme, som blev vasket 1 gang med destil- I

I leret vand og opbevaret ved -80°C. I

I Cellepelleteme blev analyseret for aktiv faktor XIII a-underenhed som be- I

I skrevet i eksempel XI. XV794-7-1C-celler transformeret med pRS217 produ- I

I 10 cerede 50 mg/l faktor XIII a-underenhed. I

I C. Konstruktion af plasmid pRS216 I

I Som vist i figur 9 blev det 2,2 kb lange asFXIII-cDNA-fragment fra plasmid I

I PRS202 anbragt baa TP11-promotoren oa indsat i plasmid PEAS102 (eksem- I

I 15 pel IV). Plasmid pMVRI (eksempel III.A.) blev fordøjet fuldstændig med I

I Eco RI og Sal I til isolering af det 3,7 kb lange fragment, som omfattede I

I TPI1-promotoren. TPI1-terminatoren og plC7RI*-vektorsekvenseme. Plasmid I

I pRS202 (eksempel V.A.) blev fordøjet med Pst I og Xho I til isolering af det I

I 2,2 kb lange asFXHI-fragment. Det 2,2 kb lange asFXIII-fragment, den kina- I

I 20 sebehandlede og annelerede ZC1056/1057-adaptor (eksempel V.B.) og li- I

neariseret pMVRI blev føjet sammen i en trepartsligering til frembringelse af I

I plasmidet pRS214. I

I Den ekspressionsenhed, som var til stede i pRS214, blev anbragt i gærvek- I

I 25 toren pEAS102. Plasmid pEAS102 blev lineariseret ved fordøjelse med I

I Hind III og blev behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase for at forhindre I

I gendannelse af cirklen. Plasmid pRS214 blev fordøjet med Hind III til isole- I

I ring af den 3,2 kb lange ekspressionsenhed, som omfattede TPI1- I

I promotoren, asFXIH-cDNA'et og TPH-temninatoren. Disse to fragmenter blev I

30 ligeret til dannelse af plasmidet pRS216. I

35 DK 175919 B1 Gærværtsceller blev transformeret og dyrket som ovenfor beskrevet. XV794- 7-1C transformeret med pRS216 producerede 10 mg/l aktiv faktor XIII a-underenhed som analyseret i eksempel XI.

5 Eksempel VII

Secernering af faktor XIII a-underenhed fra gær A. Konstruktion af plasmid pRS2Q3.

Til konstruktion af ekspressionsenheder, som er i stand til at dirigere sekreti-10 onen af FXIII a-underenhed protein, blev asFXIII-cDNA'et ændret til indsættelse af et Hind lll-genkendelsessted 3' for translationsstartstedet til indsættelse af secemeringssignalsekvenser. Oiigonukleotid ZC1206 (tabel 1) blev udformet til at fjerne det 19 bp lange ikke-translatenede 5-DNA-stykke og indsætte et Hind lll-genkendelsessted 3’ for translationsstartstedet. Der blev 15 fremstillet enkeltstrenget template-DNA ud fra E.coli stamme MV1193 transformeret med pRS202 (eksempel V.A.). Templaten blev udsat for in vitro mu-tagenisering under anvendelse af ZC1206 og fremgangsmåden beskrevet af Zoller og Smith (1984, se ovenfor). En positiv klon, som var blevet bekræftet ved restriktionsanalyse, blev betegnet pRS203 (figur 8).

20 B. Konstruktion af optimeret MFa1

Den codonoptimerede MFa1-signalpeptidsekvens blev opnået ud fra en ekspressionsvektor, som indeholdt genet for insulinforstadiet B( 1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) (Markussen et al., EP 164.529). Et Eco Rl-Xba l-fragment, som 25 omfattede MFa1-signalpeptidet og insulinsekvenseme fra pMT610 (Markussen et al., se ovenfor), blev klonet i pUC118 fordøjet med Eco RI og Xba I (figur 10), og der blev fremstillet enkeltstrenget template-DNA. Denne template blev derefter mutageniseret under anvendelse af metoden beskrevet af Zoller og Smith (1984, se ovenfor) under anvendelse af det mutagene 30 oiigonukleotid ZC862 (tabel 1). Mutageniseringen resulterede i frembringelsen af et Sst l-sted ved 3’-enden af MFa1-signalpeptidsekvensen. En positiv

DK 175919 B1 j I

36 I

klon, som indeholdt et Sst l-sted 3' for MFa1 -sionalDeptidsekvensen. blev I

udvalgt og betegnet pKP23. MFa1 -siqnalpeptidsekvensen blev fjernet fra I

plasmid pKP23 og subklonet i plC19H (Marsh et al., Gene 32:481-485, I

1984). Det fremkomne plasmid blev betegnet pKP24. I

Plasmid pB12, som omfattede TPI1 -promotoren. MFgl-signalpeptid- I

sekvensen, en DNA-sekvens, som koder for human PDGF B-kæden, TPI1- I

terminatoren og plC19H-vektorsekvenserne, blev fordøjet med Eco RI og I

Xba I til isolering af det fragment, som koder for MFa1 -signalpeptidet og I

10 PDGF-B-kæden. Plasmid pKP10, som omfattede TPM-promotor-MFgl- I

siqnalsekvens-V-SIS-TP11 -terminatorekspressionsenheden indsat i en I

pBR322-vektor, der manglede Eco Rl-stedet, blev fordøjet med Eco RI og I

Xba I til fjernelse af MFa1 -sianalsekvensen og B-kædesekvensen. Vektor- I

fragmentet fra pKP10 blev ligeret med det fragment, som hidrører fra plasmid I

15 pB12. Det fremkomne plasmid pKP26 blev fordøjet med Eco RI og Sst I til I

isolering af det fragment, som omfattede TP11-promotoren. V-SIS- I

sekvensen, TP11-terminatoren og pBR322-vektorsekvenseme. Plasmid I

pKP24 blev fordøjet med Eco RI og Sst I til isolering af det fragment, som I

koder for den codonoptimerede MFa1 -signalpeotidsekvens. Det fragment, I

20 som koder for det codonoptimerede MFcri-signalpeptid, og Eco Rl-Sst I- I

vektorfragmentet fra pKP26 blev sat sammen til frembringelse af plasmid I

pKP28. I

Det Sst l-genkendelsessted, som blev indført i MFo1-signalpeptidsekvensen I

25 for at lette konstruktionen af pKP28, blev derefter fjernet for at genetablere I

vildtype kodesekvensen. Plasmid pKP28 blev fordøjet med Eco RI og Xba I I

til isolering af det fragment, som koder for den codonoptimerede MFa1- I

signalpeptidsekvens og PDGF-B-kæden. Dette fragment blev klonet i I

pUC118, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Eco RI og Xba I. I

30 Enkeltstrenget template blev isoleret, og templaten blev mutageniseret ved I

metoden ifølge Zoller og Smith (1984, se ovenfor) under anvendelse af oli- I

37 1 DK 175919 B1 gonukleotid ZC1019 (tabel 1). Et korrekt mutageniseret plasmid blev betegnet pKP32.

Den codonoptimerede MFa1-signalpeptidsekvens, som er til stede i plasmid 5 pKP32, blev modificeret ved in vitro mutagenisering til indførelse af den naturlige Glu-Ala-Glu-Ala-sekvens og Hind lll-genkendelsessted, som fandtes i MFgi-signalsekvensen. Enkeltstrenget template-DNA, som er fremstillet ud fra pKP32, blev mutageniseret under anvendelse af ZC1059 (tabel 1) ved j i fremgangsmåden ifølge Zoller & Smith (1984, se ovenfor). DNA fra positive j 10 kloner blev skåret med Hind III til screening for indførelsen af et Hind III- ! genkendelsessted ved 3-enden af signalsekvensen. Kloneme blev derefter sekventeret for yderligere at bekræfte mutageniseringen. En positiv klon med den korrekte sekvens for det codonoptimerede MFgl-signalpeptid, som indeholder den naturlige Glu-Ala-Glu-Ala-sekvens og Hind lll-genkendelses-15 stedet, blev betegnet pRS111. Det mutageniserede MFgl-signalpeptid blev subklonet i vektoren pUC118. Plasmid pRS111 blev fordøjet med Hind III til eliminering af B-kædesekvensen. Plasmidet blev genomdannet til cirkelformen og betegnet pRS112 (figur 10).

20 C. Konstruktion af vektorer til sekretion af faktor XIII a-under-enhed fra gær under anvendelse MFa1-signalpeptidet.

Til konstruktion af en ekspressionsenhed, som omfattede ADH2-40-promotoren, det codonoptimerede MFa1-signalpeptid, asFXIII-cDNA'et og TPH-terminatoren. blev plasmid pTRK4c anvendt som kilde til ADH2-4C-25 promotoren og TPH-terminatoren. Plasmid pTRK4c blev fordøjet med Eco RI og Sal I til isolering af det 4 kb lange fragment, som omfattede ADH2-40-promotoren, TPH-terminatoren og plC7RI*-vektorsekvenseme. Plasmid pRS203 (eksempel VIII.A.) blev fordøjet med Hind III og Xho I til isolering af det 2,2 kb lange asFXIII-cDNA-fragment. Plasmid pRS112 blev fordøjet med 30 Eco RI og Hind III til isolering af det 0,34 kb lange MFa1 -promotorfraqment-pTRK4c-fragmentet blev føjet sammen med asFXIII-cDNA-fragmentet og

I DK 175919 B1 I

I 38 I

MFgl-signalpeptidet i en 3-partsligering. Det fremkomne plasmid blev beteg- I

I net pRS231 (figur 11). I

I Den ekspressionsenhed, som var til stede i plasmid pRS231, blev indsat i I

I 5 vektorerne YEp13 og pEAS102. Plasmid pRS231 blev fordøjet med Xho I til I

I isolering af den 5 kb lange ekspressionsenhed. Dette fragment blev ligeret til I

YEp13, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Xho I. Det fremkomne I

I plasmid blev betegnet pRS233. Det 5 kb lange Xho l-fragment, som var ble- I

I vet isoleret fra pRS231, blev ligeret i pEAS102, som var blevet lineariseret I

I 10 ved fordøjelse med Sal I. Det fremkomne plasmid blev betegnet pRS232. I

I De ovenfor beskrevne plasmider blev transformeret, stort set som beskrevet I

I af Beggs (1978, se ovenfor) i en egnet gærvært, såsom samme XV794-7-1 C. I

I Transformerede celler blev selekteret og opretholdt på syntetisk medium, I

I 15 som manglede uracil (-UraD). Transformanter blev inokuleret i 5 ml -UraD og I

I blev dyrket natten over ved 30°C. Kulturen, som var dyrket natten over, blev I

I anvendt til at inokulere 1 liter -UraD. Den ene liter kultur blev derefter dyrket I

I som ovenfor beskrevet. Kulturerne blev derefter centrifugeret for at fjerne I

I cellerne, og supematantfraktionerne blev høstet. Supematanteme blev ana- I

I 20 lyseret for tilstedeværelse af faktor XIII a-underenhed under anvendelse af I

I den metode, som er beskrevet i eksempel XI.B. I

I D. Konstruktion af vektorer til sekretion af faktor XIII a-under- I

I enhede fra aær under anvendelse af et syntetisk siqnalpeptid. I

I 25 Der blev konstrueret en ekspressionsenhed, som omfattede ADH2-4C- I

I promotoren, et 19 aminosyrer langt signalpeptid, som var udformet under I

I anvendelse af reglerne ifølge von Heijne (se ovenfor), asFXIII-cDNA’et og I

I TPU-temninatoren. Oligonukleotider ZC1209 og ZC1210 (tabel 1) blev ud- I

I formet til, når de blev anneleret, at danne en adaptor, som omfattede en I

I 30 klæbrig Pst l-5'-ende, en sekvens, som koder for et 19 aminosyrer langt sig- I

I nalpeptid (med aminosyresekvensen Met - Leu - Leu - Gin - Ala - Phe - Leu - I

39 DK 175919 B1

Phe - Leu - Leu - Ala - Gly - Phe - Ala - Pro - Gly - Thr - Glu - Ala) og en klæbrig Hind lll-3'-ende. Oligonukleotideme blev kinasebehandlet og annele-ret under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Maniatis et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold 5 Spring Harbor, N.Y., 1982).

Kilden til ADH2-4c-promotoren og TPI1-terminatoren var plasmid pTRK4c (eksempel III.B.). Plasmid pTRK4c blev modificeret for at anbringe et Pst I-genkendelsessted 3’ for ADH2-4c-promotoren. Plasmid pTRK4c blev fordøjet 10 med Pst I og Eco RI til isolering af det 3,7 kb lange fragment, som omfattede ADH2-4c-promotoren. TPI1-terminatoren og plC7RI*-vektorsekvenseme. Den kinasebehandlede, annelerede ZC1056/ZC1057 adaptor (eksempel V.B.) blev ligeret med pTRK4c-fragmentet. Det fremkomne plasmid blev betegnet pRS185 (figur 7). Plasmid pRS185 blev lineariseret ved fordøjelse med Pst I 15 og Sal I. Plasmid pRS203 (eksempel VILA.) blev fordøjet med Hind III og Xho I til isolering af det 2,2 kb lange asFXIII-cDNA-fragment, som blev føjet sammen med den lineariserede pRS185 og den kinasebehandlede, annelerede ZC1209/ ZC1210-adaptor til frembringelse af plasmidet pRS220 (figur 11).

20

Den ekspressionsenhed, som var til stede i plasmid pRS220, blev klonet i vektoren pEAS102 (eksempel IV) til frembringelse af plasmidet pRS221. Plasmid pRS220 blev fordøjet med Xho I til isolering af den 5 kb lange ekspressionsenhed. Plasmid pEAS102 blev fordøjet med Sal i og behandlet med 25 bakteriel alkalisk phosphatase for at forhindre gendannelse af en cirkel. Den 5 kb lange ekspressionsenhed blev ligeret med den lineariserede pEAS102-vektor. Det fremkomne plasmid, betegnet pE220, omfattede ADH2-40-promotoren, den adaptor, som kodede for det 19 aminosyrer lange, syntetiske signalpeptid, asFXIII-cDNA'et, TPI1-terminatoren og pEAS102-30 vektorsekvenseme.

40 I

DK 175919 B1 I

Gærceller blev transformeret og dyrket som ovenfor beskrevet. Til- I

stedeværelsen af faktor XIII a-underenhed blev bestemt under anvendelse af I

den analysemetode, der er beskrevet i eksempel XI.B. ! I

5 Eksempel IX I I

Ekspression af a'-underenheden af faktor XIII I

a-Underenheden af faktor XIII blev aktiveret til a'-underenheden ved hjælp af I

en thrombinspaltning, som fjerner 37 aminosyrer fra den aminoterminale en- I

10 de af proteinet. asFXIII-cDNA’et blev ændret for at fjerne de sekvenser, som I

koder for de 37 aminoterminale aminosyrer. Der blev fremstillet enkelt- I

strenget template-DNA fra plasmid pRS202 (eksempel V.A.), som omfattede I

asFXIII-cDNA'et i vektoren pUC118. Et oligonukleotid blev udformet til at I

fjerne de 5'-sekvenser, som koder for det 37 bp lange aktiveringspeptid, og I

15 erstatte det med et Eco Rl-genkendelsessted efterfulgt af sekvenser, som I

koder for en initieringsmethionin, som fusioneres i læseramme med GGC ved I

+38 i det asFXIII-cDNA-kodende område. Dette oligonukleotid blev anvendt I

til at mutagenisere det enkeltstrengede pRS202-template-DNA under anven- I

delse af den metode, som er beskrevet af Zoller og Smith (se ovenfor). Den I

20 fremkomne sekvens, som koder for den aminoterminale del af a'-under- I

enheden (a'sFXIII) med et Eco RI genkendelsessted 5' for initierings- I

methionin-codonen, som er fusioneret med den codon, der koder for amino- I

syre +38. DNA i replikativ form, fremstillet ud fra den mutageniserede fag, I

blev fordøjet med Eco RI og Xho I til isolering af a'sFXIII-cDNA'et. I

25 I

Der blev konstrueret en ekspressionsvektor, som omfattede ADH2-4C- pro- I

motoren, a'sFXIII-cDNA'et og TPI1-temninatoren. Kilden til ADH2-4C- I

promotoren og TPI1-terminatoren er plasmid pTRK4c (eksempel III.B.). I

Plasmid pTRK4c blev fordøjet med Eco RI og Sal I til isolering af det 4 kb I

30 lange fragment, som omfattede ADH2-4c-promotoren. TPI1-terminatoren og I

plC7RI*-vektorsekvenseme. Dette lineariserede vektorfragment blev ligeret I

41 DK 175919 B1 med a'sFXIII-cDNA-fragmentet, som var blevet fordøjet med Eco RI og Xho I.

Det fremkomne plasmid blev betegnet pa'TRK4c.

Den ekspressionsenhed, som er til stede i en paTRK4c, blev anbragt i gær- i 2 5 vektoren pEAS102. a'sFXIII-cDNA-fragmentet blev isoleret fra plasmid paTRK4c ved fordøjelse med Hind III. a'sFXIII-cDNA-fragmentet blev sat sammen med plasmid pEAS102, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Hind III og behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase for at forhindre gendannelse af en cirkel. Ligeringsblandingen blev transformeret i E.coli 10 stamme RRI. Plasmid DNA, fremstillet ud fra de fremkomne transformanter, blev analyseret ved restriktionsanalyse for at bestemme orienteringen af indføjelsen. En positiv klon blev betegnet pa'EAS102.

Gærceller blev transformeret og dyrket som ovenfor beskrevet. Faktor XIII a'-15 underenheden blev analyseret under anvendelse af den metode, som er beskrevet i eksempel XI.B.

Eksempel X

Ekspression af faktor XIII b-underenhed 20 A. Ekspression i aær

Sekretion af b-underenheden af faktor XIII blev opnået ved at koble MFgl-signalpeptidsekvensen til den kodende sekvens for den modne form af b-underenheden af faktor XIII. Fusionen mellem den codonoptimerede MFa1-25 signalpeptidsekvens, som er til stede i plasmid pKP24 (eksempel Vlll.A.), og faktor XIII b-underenhed cDNA (FXIIIb) involverer in vitro mutagenisering.

Plasmid pKP24, som omfattede den codonoptimerede MFa1-signalpeptid-sekvens med et Sst l-genkendelsessted indsat efter den codon, som koder for aminosyre 81 i MFa1 -sionalpeptidsekvensen. blev fordøjet med Barn Hl 30 og Sst I til isolering af MFa1 -sionalpeptidsekvensen. Det 2,2 kb lange Eco RI FXIIIb-cDNA-fragment, som blev isoleret fra fagklonen AHFXIIIb2,21 blev

I DK 175919 B1 I

I 42 I

I subklonet i p(JC118, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Eco RI. I

I Ligeringsblandingen blev transformeret i E.coli stamme JM83. Der blev frem· I

stillet plasmid DNA ud fra transformanteme, og det blev fordøjet med Stu I og I

I Sst I for at bestemme orienteringen af indføjelsen. En positiv klon, betegnet I

I 5 pFXIIIb, omfattede FXIIIb-cDNA'et i anti-sense-orienteringen med hensyn til I

I lacZ'-genet. Plasmid pFXIIIb blev lineariseret ved fordøjelse med Barn Hl og I

I Sst I og blev ligeret til det codonoptimerede MFgl-signalpeptidsekvens- I

fragment isoleret fra pKP24. Det fremkomne plasmid blev betegnet I

I p118FXIIIb. I

I 10 I

Der blev udformet et syntetisk oligonukleotid til at udsløjfe sekvenserne mel- I

lem Sst l-genkendelsesstedet og den sekvens, som koder for den modne I

FXIIIb-underenhed, og indsætte de naturlige sekvenser, som koder for ami- I

nosyreme 82-85 i MFa1. Plasmid p118FXIIIb blev transformeret i E.coli I

15 stamme MV1193. Enkeltstrenget template-DNA, fremstillet ud fra en trans- I

formant, blev udsat for in vitro mutagenisering ifølge standardmetoder. Posi- I

I tive kloner blev sekventeret og analyseret ved restriktionsanalyse for at be- I

I kræfte mutageniseringen. En korrekt mutageniseret klon blev betegnet I

I pMFFXIIIb. I

I 20 I

I Det FXIIIb-cDNA, som er til stede i pMFFXIIIb, blev mutageniseret under an- I

I vendelse af en syntetisk oligonukleotid, som vil fjerne den 3'-flankerende se- I

I kvens og indsætte et Xba I genkendelsessted 3' for stopcodonen. Enkelt- I

I strenget template-DNA blev fremstillet ud fra E.coli stamme MV1193 trans- I

I 25 formeret med pMFFXIIIb. Den enkeltstrengede template blev udsat for in I

I vitro mutagenisering. Positive kloner blev sekventeret og analyseret ved re- I

I striktionsanalyse for at bekræfte mutageniseringen. En korrekt mutageniseret I

I klon blev betegnet pMFFXIIIbX. I

I 30 Den indføjelse, som er til stede i plasmid pMFFXIIIbX, blev anbragt bag I

I PTI1-promotoren, som er til stede i plasmid pMVRI (eksempel III.A). Plasmid I

43 DK 175919 B1 j pMVR1 blev fordøjet med Eco RI og Xba I til isolering af det 4 kb lange fragment, som omfattede TP11-promotoren. TP11-terminatoren og plC7RI*-vektorsekvenseme. Plasmid pMFFXIIIbX blev fordøjet med Eco RI og Xba I til isolering af det fragment, som omfattede MFa1-signalpeptidsekvensen og 5 FXIIIb-cDNA'et. Dette fragment blev ligeret med pMVRI-fragmentet, og det fremkomne plasmid blev betegnet pMVRIFXIIIb.

Den ekspressionsenhed, som er til stede i plasmid pMVRIFXIIIb, blev sub-klonet i gærvektoren YEp13. Plasmid pMVRIFXIIIb blev fordøjet med Sst I til 10 isolering af den 3,2 kb lange ekspressionsenhed. Dette fragment blev ligeret til YEp13, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Sst I. Ligeringsblandingen blev transformeret i E.coli stamme RRI. Plasmid DNA, som var fremstillet ud fra transformanteme, blev analyseret ved restriktionsanalyse for at bestemme orienteringen i indføjelsen. Positive kloner blev betegnet 15 pYEFXIIIbl, hvilket specificerer en klon, hvor transkriptionsretningen af indføjelsen har samme orientering som LEU2-genet, og pYEFXIIIb2, som har indføjelsen i den modsatte orientering.

Plasmideme pYEFXIIIbl og pYEFXIIIb2 blev transformerede i egnede gær-20 værtsceller, og cellerne blev dyrket som ovenfor beskrevet.

B. Ekspression af faktor Xlllb underenhed i pattedvrceller b-Underenheden af faktor XIII udtrykkes i pattedyrceller ved at anvende faktor IX ledersekvensen (FIX-ledersekvensen) fusioneret til FXIIIb-fragmentet 25 (39 bp) i en ekspressionsvektor hidrørende fra FIX/VII/pD2. FIX- ledersekvensen blev opnået fra FIX(-G) -» pUC13, som var blevet konstrueret som nedenfor beskrevet.

For at opnå en hensigtsmæssig sekretionssignalsekvens blev et cDNA, som 30 kodede for human faktor IX, opnået fra et bibliotek fremstillet ud fra mRNA fra human lever (Kurachi og Davie, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6461-6464.

I DK 175919 B1 I

I 44 I

I 1982). Faktor IX-sekvensen blev Isoleret fra pBR322-vektoren ved fordøjelse I

I med Pst I og blev indsat i Pst l-genkendelsesstedet i pUC13. Dette plasmid I

I blev betegnet FIX-pUC13. For at fjerne det G-rige område, som var til stede I

I ved 5'-enden af faktor IX-indføjelsen som et resultat af cDNA-kloning, blev en I

I 5 syntetisk oligonukleotidadaptor indsat i stedet for 5-enden af det klonede I

I fragment. Oligonukleotideme ZC212 og ZC213 (tabel 1) blev syntetiseret og I

I anneleret til frembringelse af en 22 basepar lang overlappende del, fragmen- I

I tenderne blev fyldt ud og skåret med hensigsmæssige restriktionsendo- I

I nukleaser, og det fremkomne fragment blev føjet sammen med faktor IX- I

10 sekvensen. I

I For at konstuere adaptoren blev 100 pmol af hver af ZC212 og ZC213 fryse- I

I tørret og resuspenderet i 10 μΙ 10x kinase/ligase-puffer (600 mM Tris pH 8,0, I

I 100 mM MgCl2, 100 nM DTT) plus 86 μΙ H2O. Anneleringsreaktionen blev I

I 15 udført ved 65°C i 10 minutter; blandingen blev langsomt afkølet til I

I stuetemperatur og sat på is. Til denne blanding tilsattes 4 μΙ 2,5 mM dNTP- I

blanding og 1 μΙ (8 enheder) T4-DNA-polymerase. Reaktionen fik lov til at I

I forløbe 45 minutter ved 14°C. Derefter tilsattes 10 μΙ 5 M NH4OAc, og DNA'et I

I blev ekstraheret en gang med phenol/CHCI3; to gange med CHCI3 og blev I

I 20 præcipiteret med ethanol. DNA'et blev centrifugeret og resuspenderet i 100 I

I pi mediumsaltpuffer (Maniatis et al., se ovenfor) s. 100), blev fordøjet med 9 I

I enheder Pst I og 8 enheder Cfo I og ekstraheret som ovenfor. I

I Den modificerede faktor IX-sekvens blev derefter konstrueret ved at kombi- I

25 nere 0,16 pmol af det syntetiske Pst Ι-Cfo l-adaptorfragment, 0,14 pmol af et I

I 1,4 kb langt Cfo I - Barn Hl faktor IX-fragment fra FIX-pUC13 og 0,14 pmol af I

I et 2,7 kb langt Barn Hl-Pst l-pUC13-vektorfragment I en 20 μΙ reaktionsbian- I

I ding, som indeholdt 60 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og I

I 0,9 enheder T4-ligase. Reaktionsblandingen blev inkuberet i 3 timer ved stue- I

I 30 temperatur og blev anvendt til at transformere kompetente E.coli JM83 (Mes- I

I sing, Recombinant DNA Technical Bulletin. NIH publication nr. 79-99, 2, I

45 DK 175919 B1

No.2, 43-48, 1979). Cellerne blev udpladet med 50 μΙ 2% X-gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-p-D-galactosid) på L-medium, som indeholdt 40 pg/ml ampicil-lin, og blev inkuberet ved 37°C natten over. Hvide kolonier blev overført på I

en anden plade, som indeholdt ampicillin, og blev dyrket ved 37°C natten ! 5 over. Kolonierne blev overført på Whatman 540 papir, og papiret blev forbe- j redt til hybridisering ifølge fremgangsmåden af Wallace et al. (Gene 16:21.

1981), med undtagelse af, at inkubering natten over på chloramphenicolpla-der blev udeladt. Papirerne blev inkuberet ved 44°C i to timer i 0,9 M NaCI, 0,09 M Tris-HCI, pH 7,5, 6 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40, 150 pg/ml E.coli 10 tRNA. Papirerne blev proberet med 32P-mærket ZC235 (tabel 1), en 14-mer, som er specifik for den ændrede 5’-endesekvens. Hybridisering med 1-2 x 106 cpm pr. filter blev udført ved 44°C i præhybridiseringspuffer natten over.

Filtrene blev derefter vasket 3 gange i 6 x SSC, 0,1% SDS ved 4°C og 3 gange i 2x SCC, 0,1% SDS ved 44°C og blev eksponeret på røntgenfilm. Der 15 blev opnået 2 positve kloner. En af disse kloner blev betegnet FIX(-G) -» pUC13.

For at bekræfte sekvensen af det ændrede område af faktor IX-delen af FIX(-G) -> pUC13 konstruktionen blev der udført dideoxysekventering direkte på 20 pUC-plasmidet under anvendelse af BRL-reversprimeren under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Wallace et al., (Gene 16: 21, 1981), hvortil blev anvendt en primer, som var endemærket med polynukleotidkinase og γ32Ρ-ATP ved metoden ifølge Chaconas et al., (Biochem.Biophvs.Res.Comm. 60: 962,1975). Sekvensen var som forudsagt.

25

Plasmid FIX(-G) -» pUC13 blev fordøjet med Pst I og Hae III til isolering af den 39 bp lange FIX-ledersekvens. FXIII b-underenheden blev opnået fra pFXIIIb. Plasmid pFXIIIb blev lineariseret med Eco RI og enderne blev gjort stumpe med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase. DNA-fragmentet blev 30 derefter fordøjet med Hind III til isolering af det 0,14 kb FXIIIb-fragment. For at lette manipulering blev det 39 bp lange FXIIIb-lederfragment og det 0,14

46 I

DK 175919 B1 I

kb lange FXIIIb-fragment ligeret i pUC12, som var lineariseret med Pst I og I

Hind III. Det fremkomne plasmid blev spaltet med Pst I og Hind III til isolering I

af det 0,18 kb lange FIX-FXIIIb-fusionsfragment. Dette fragment blev ligeret i I

M13mp11, som var lineariseret med Pst I og Hind III. I

5 I

FIX-ledersekvensen blev præcist sluttet sammen med FXIIIb ved in vitro I

stedstyret mutagenisering under anvendelse af et oligonukleotid, som var I

udformet til at udsløjfe de intervenerende sekvenser mellem enden af FIX- I

lederen og glutaminsyre i den modne form af FXIIIb. Den replikative form af I

10 DNA blev fremstillet ud fra den mutageniserede fag og blev skåret med Pst I I

og Hind I til isolering af det 0,1 kb lange FIX-FXIIIb-fusionsfragment. For at I

lette manipulering blev dette fragment subklonet i pUC13, som var linearise- I

ret med Hind III og Pst I. Det fremkomne plasmid blev fordøjet med Hind III I

og Barn Hl til isolering af det 0,1 kb lange FIX-FXIIIb fusionsfragment. I

15 I

AHFXIIIb2,2 blev skåret med Hind III og Eco RI til isolering af den 2 kb lange I

3-ende af FXIIIb. Dette fragment blev subklonet i pUC13, som var linearise- I

ret med Hind III og Eco RI. Det fremkomne plasmid blev lineariseret med I

Eco RI, enderne blev gjort stumpe med Klenow-fragmentet af DNA- I

20 polymerase I og ligeret til kinasebehandlede Bgl-ll-linkere. Overskud af Bgl- I

ll-linkere blev fjernet ved fordøjelse med Bgl-ll, og det liniære fragment blev I

genformet til en cirkel med T4-DNA-ligase. Det fremkomne plasmid blev spal- I

tet med Hind III og Bgl II til isolering af det 2 kb lange FXIIIb-fragment. I

25 Faktor Xlllb-ekspressionsvektoren hidrørte fra plasmid FIX/VII/pD2 (ATCC I

nr. 53068). Fordøjelse af FIX/VII/pD2 med Barn Hl frigør det 5 kb lange I

FIX/VII-fragment og efterlader pD2-vektorfragmentet, som omfattede hele I

den tredelte adenovirus 2-leder, SV40 polyadenyleringssignalet og pBR322- I

vektorsekvenseme. Dette vektorfragment blev behandlet med bakteriel alka- I

30 lisk phosphatase for at forhindre gendannelse af en cirkel og blev ligeret i I

trepartsligering til det 0,1 kb lange FIX-FXIIIb-fusionsfragment og det 2 kb I

47 DK 175919 B1 lange FXIIIb-fragment. Plasmidet med den korrekte indføjelse blev bestemt ved fordøjelse med Barn Hl og Hind III. Dette plasmid blev betegnet pMFXIIIb.

5 Den fremgangsmåde, der blev anvendt til at transficere babyhamster-nyreceller (BHK-celler) (tilgængelig fra American Type Culture Collection, ATCC nr. CCL10) med pMFXIIIb, ligner de publicerede metoder. (F.eks.

Wigler et al., Cell. 14:725, 1978; Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham og Van der Eb, Virol. 52: 456, 1973). BHK-celleme 10 blev dyrket ved 37°C, 5% CO2 i Dulbecco's medium (plus 10 % varmeinakti-veret føtal kalveserum og suppleret med glutamin og penicillin-streptomycin) i 60 mm vævsdyrkningspetriskåle til en sammenløbning på 20%. Ialt 10 pg DNA blev anvendt til at transficere en 60 mm petriskål: 3,75 pg pMFXIIIb, 1,25 pg pKO-neo (Southern og Berg, J.Mol.ADDl.Genet. 1: 327-341,1982) og 15 5 pg laksesperm DNA. DNA'erne blev præcipiteret i 0,3 M NaOAc, 75% ethanol, blev skyllet med 70% ethanol og genopløst i 20 pi 10 mM Tris-HCI, pH 8, 1 mM EDTA. DNA'et blev kombineret med 440 pi H20 og 500 pi 280 ml NaCI, 1,5 mM NaHP04, 12 mM dextrose, 50 mM HEPES pH 7,12. 60 pi 2 M CaCl2 blev dråbevis tilsat til ovennævnte blanding, og opløsningen henstod 20 ved stuetemperatur i 30 minutter. Opløsningen tilsattes derefter til cellerne, og cellerne blev sat tilbage til 37°C i 4 timer. Mediet blev fjernet, og der blev tilsat 5 ml 20% DMSO i Dulbecco's medium med serum i 2 minutter ved stuetemperatur. Skålene blev derefter vasket hurtigt med 2 skift af medium og inkuberet i frisk medium natten over. 24 timer efter tilsætning af DNA'et blev 25 mediet fjernet, og der blev tilsat selektivt medium (10 mg/ml af G418, 498 pg/mg, Gibco, i Dulbecco's medium med serum). Efter 10 og 13 dage blev individuelle kloner, som repræsenterer celler, der har inkorporeret pKO-neo-genet og således er resistente mod G-418, overført til plader med 96 brønde (eller 24 brønde) og blev dyrket til proteinanalyser.

30

I DK 175919 B1 I

I 48 I

Cellerne blev dyrket i Dulbeccos medium plus 10% føtal kalveserum. Mediet I

blev separeret fra cellerne og celleresteme ved centrifugering og blev analy- I

seret for faktor XIII underenhed b-polypeptid (f.eks. med ELISA) og for biolo- I

gisk aktivitet. Cellerne blev fjernet fra pladerne med trypsin og blev vasket I

5 med frisk medium, blev centrifugeret og frosset ved -20°C. Cellepelleterne I

blev derefter optøet i PBS, blev pelleteret og resuspenderet i PBS, som inde- I

H holdt 0,25% Triton X-100. Prøverne blev fortyndet og analyseret for polypep- I

tid og aktivitet. I

10 Eksempel XI I

Beskrivelse af analyser I

A. Fremstilling af cellepelleter. I

Hensigtmæssigt dyrkede gærceller, som beskrevet i de tidligere afsnit, blev I

15 centrifugeret for at pelletere cellerne, og det brugte medium blev kasseret. I

Cellerne blev pelleteret og vasket i destilleret vand. De vaskede pelleter blev I

frosset ved -80°C, før de blev analyseret. I

Der blev fremstillet rålysater med glaskugler ud fra de frosne cellepelleter. De I

20 vaskede cellepelleter blev optøet på is og blev fortyndet i et lige så stort νο· I

lumen phosphatpufret salin (PBS; Sigma, St.Louis, Mo.), 1 mM β- I

mercaptoethanol (Sigma). Glaskugler (450-500 pm) blev tilsat til halvdelen af I

det totale volumen. Denne blanding blev vortexbehandiet ved fuld hastighed i I

1 minut, tre gange, idet prøverne blev afkølet på is mellem vortexbehandlin- I

25 gerne. Væsken blev fjernet fra reagensglassene med en pasteurpipette og I

overført til et mikrocentrifugeringsglas. Glaskugleme blev vasket 1 gang i det I

oprindelige volumen PBS, som indeholdt 1 mM β-mercaptoethanol (BME). I

Kuglerne blev vortexbehandlet 1 minut, og væsken blev fjernet med en pa- I

steurpipette og blev ført sammen med det oprindelige lysat. Lysaterne blev I

30 derefter centrifugeret i en Eppendorf-microcentrifuge (Brinkmann, Westbury, I

49 DK 175919 B1 N.Y.) ved tophastighed i 5 minutter. Supematanten blev omhyggeligt fjernet til analyse.

B. Faktor XIll-aktivitetsanalvse 5 Til måling af faktor Xlll-aktiviteten blev stort set anvendt den metode, der er beskrevet af Curtis og Lorand (se ovenfor). Lysaterne blev målt for total gærprotein ved fremgangsmåden ifølge Lowry et al. (J.Biol.Chem. 193:265-275, 1951). Prøverne blev fortyndet til 10 pg/μΙ total gærprotein med PBS +1 mM BME. Standarderne, hvortil blev anvendt kommercielt tilgængelig faktor 10 XIII (tabel 2) blev fortyndet trinvis i 50 mM Tris-HCL, pH 7,5, 10 mM dithioth-reitol. 5 μΙ prøve eller standard blev tilsat til 35 μΙ 50 mM Tris-HCI, pH 7,6 og 1 μΙ thrombin (tabel 2). Blandingerne fik lov til at inkubere ved 37°C i 30 minutter. Reaktionerne blev undertrykt ved tilsætning af en 2 U Hiridin (Sigma).

60 μΙ reaktionsblanding (tabel 2) ved 37°C blev tilsat, og blandingen blev in-15 kuberet i 30 minutter. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 1 ml 7,5% trichloreddikesyre (TCA). Prøverne blev centrifugeret i mikrocentrifugen ved tophastighed i 5 minutter, og supematanteme blev bortkastet. Pelleteme blev vasket to gange med 7,5% TCA. Pelleteme blev derefter opløst i 100 μΙ iseddikesyre. Der blev tilsat 5 ml scintillationscocktail (Optifluor, Packard Instru-20 ments, Co., Downers Grove, III.), og prøverne blev talt på scintillationstælle-ren (Beckman, Palo Alto, Calif.).

50 I

DK 175919 B1 I

Tabel 2 I

Thrombin: Frysetørret thrombin (Sigma, St.Louis, Mo.) blev opløst I I

i 50% glycerol, 0,25 M Tris-HCI, pH 7,5 til 1000 U/ml. I

5 Denne opløsning blev opbevaret ved -20°C. I

Kommerciel Faktor XIII (Green Cross, Osaka, Japan) opløst I

faktor XIII: i 1 ml 50% glycerol, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM I

dithiothreitol (DTT; Sigma, St.Louis, Mo.). Denne, op- I

10 løsning blev opbevaret ved-20°C. I

Ν,Ν-Dimethylcasein: N.N-Dimethylcasein (Sigma, St. Louis, Mo.) blev opløst I

til 10 mg/ml i 0,5 M Tris-HCI, pH 7,5. I

15 3H-Histamin- 1 mCi 3H-histamindihydrochlorid (New England I

dihydrochlorid: Nuclear, Boston, Mass.) blev opløst i 4 ml 10 mM ikke- I

mærket histamindihydrochlorid. Denne opløsning blev I

opbevaret ved -20°C. I

20 Reaktionspuffer: 1,4 M NaCI I

1.0 M Tris Base I

0,1 M CaCI2 I

0,2 M DTT I

pH indstillet til 7,5 I

25 I

Reaktionsblanding: 2,0 ml 3H-histidindihydrochlorid I

8.0 ml Ν,Ν-Dimethylcasein I

1,8 ml Reaktionspuffer I

Claims (12)

51 DK 175919 B1

1. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den koder for et polypeptid, som j er funktionelt homolog med a’-underenheden af faktor XIII, hvilken sekvens 5 omfatter den i figur 1 viste sekvens fra basepar 202 til basepar 2283. i

2. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den koder for et polypeptid som er funktionelt homolog med a’-underenheden af faktor XIII, hvilken sekvens omfatter en DNA-sekvens som koder for den i figur 1 viste aminosyrese- 10 kvens, som starter med glycin nr. 38 og slutter med methionin nr. 731.

3. Ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at den omfatter en transkrip-tionel promotor, som nedenstrøms er efterfulgt af en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2. 15

4. Ekspressionsvektor ifølge krav 3, kendetegnet ved, at promotoren er ADH2-4C, TPI1 eller GAL10.

5. Værtscelle transficeret med en ekspressionsvektor ifølge krav 3 eller 4. 20

6. Værtscelle ifølge krav 5, kendetegnet ved, at værtscellen er en gærværtscelle.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein, som ved dissociering har den 25 biologiske aktivitet af faktor XII la, omfattende: - introducering i en værtscelle af en ekspressionsvektor omfattende en transskriptionel promoter, som nedenstrøms er efterfulgt af en DNA-sekvens som koder for et polypeptid som er funktionelt homolog med a’-underenheden af faktor XIII, omfattende den i figur 1 viste aminosy-30 resekvens, som starter med glycin nr. 38 og slutter med methionin nr. 731, og en transskriptionel promotor, som nedenstrøms er efterfulgt af I DK 175919 B1 I I 52 I I en DNA-sekvens som koder for et polypeptid som er funktionelt homo- I I log med b-underenheden af faktor XIII; I I - dyrkning af værtscellen; og I I - isolering af proteinet fra værtscellen. I I 5 I

8. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein, som har den biologiske aktivi- I I I tet af faktor Xllla, omfattende: I I - introducering i en værtscelle af en ekspressionsvektor omfattende en I I transskriptionel promotor, som nedenstrøms er efterfulgt af en DNA- I I 10 sekvens som koder for et polypeptid, som er funktionelt homolog med I I a’-underenheden af faktor XIII, omfattende den i figur 1 viste aminosy- I I resekvens, som starter med glycin nr. 38 og slutter med methionin nr. I I 731; I I - dyrkning af værtscellen; I 15. isolering af polypeptidet fra værtscellen; og I I - dimerisering af polypeptidet til dannelse af homodimere. I

9. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein, som har den biologiske aktivi- I I tet af faktor Xllla, omfattende: I I 20 introducering i en værtscelle af en ekspressionsvektor omfattende en I I transskriptionel promoter, som nedenstrøms er efterfulgt af en DNA- I I sekvens, som koder for et polypeptid som er funktionelt homolog med I I a’-underenheden af faktor XIII, omfattende den i figur 1 viste aminosy- I I resekvens, som starter med glycin nr. 38 og slutter med methionin nr. I I 25 731; I I - dyrkning af værtscellen; og I I - isolering af proteinet fra værtscellen. I

10. Ekspressionsvektor omfattende en transskriptionel promoter, som I I 30 nedenstrøms er efterfulgt af en DNA-sekvens, som koder for et protein I I med struktur og biologisk aktivitet af human faktor XIII a-underenhed eller I i 53 DK 175919 B1 human faktor XIII a’-underenhéden, omfattende den i figur 1 viste amino-syresekvens, som starter med glycin nr. 38 og slutter med methionin nr. 731, hvori DNA-sekvensen er i det væsentlige fri for 3’ utranslaterede sekvenser som normalt er forbundet med DNA-sekvensen. 5

11. Værtscelle transficeret med en ekspressionsvektor omfattende en transskriptionel promotor, som nedenstrøms er efterfulgt af en DNA-sekvens, som koder for et protein med struktur og biologisk aktivitet af human faktor XIII a-underenhed eller human faktor XIII a’-underenheden, 10 omfattende den i figur 1 viste aminosyresekvens, som starter med glycin nr. 38 og slutter med methionin nr. 731, hvori DNA-sekvensen er i det væsentlige fri for 3’ utranslaterede sekvenser som normalt er forbundet-med DNA-sekvensen.

12. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein som har den biologiske aktivitet af human faktor XIII, omfattende introducering i en værtscelle af en ekspressionsvektor omfattende en transskriptionel promoter, som nedenstrøms er efterfulgt af en DNA-sekvens, som koder for et protein med struktur og biologisk aktivitet af human faktor XIII a-underenhed eller 20 human faktor XIII a’-underenheden, omfattende den i figur 1 viste aminosyresekvens, som starter med glycin nr. 38 og slutter med methionin nr. 731, hvori DNA-sekvensen er i det væsentlige fri for 3’ utranslaterede sekvenser som normalt er forbundet med DNA-sekvensen; dyrkning af værtscellen; og isolering af proteinet som kodes af DNA-sekvensen fra 25 værtscellen. 30