JPH09327296A - 第ＸＩＩＩａ因子及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 第ＸIII 因子の新規な製造方法の提供。 【解決手段】 活性化後に第ＸIII ａ因子と実質的に同
一の活物学的活性を有する蛋白質の製造方法であって、
転写プロモーター及びこれに続きその下流にある第ＸII
I 因子のａサブユニットと機能的に相同なポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列並びに転写プロモーター及びこ
れに続きその下流にある第ＸIII 因子のｂサブユニット
と機能的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
を含んで成る発現ベクターを宿主細胞に導入し；該宿主
細胞を適切な条件下で培養し；そして該宿主細胞から前
記蛋白質を単離する；ことを含んで成る方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般的に第ＸIII
因子及びその類似体の製造、そしてより詳しくは、形質
転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞中にお
ける生物学的に活性な第ＸIII 因子及びその類似体の発
現に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液凝固は、最終的にフィブリンクロッ
トを生じさせる種々の血液成分又は因子の複雑な相互反
応から成る過程である。一般的に、凝固“カスケード”
と称される現象に関与する血液成分は、プロ酵素又はチ
モーゲン、すなわち活性化因子すなわち活性化された凝
固因子自体の作用によってタンパク質分解酵素に転換さ
れる酵素的に不活性なタンパク質である。そのような転
換を受けた凝固因子は、一般的に“活性化された因子”
と称され、そして小文字“ａ”の付加によって命名され
る（たとえばＸIII ａ）。

【０００３】血液凝固系の１つの成分は、第ＸIII 因子
（また、フィブリン安定化因子、フィブリノリガーゼ又
は血漿トランスグルタミナーゼとして知られる）、すな
わちプロ酵素として血液中に循環する血漿糖タンパク質
である。血液凝固の最終段階の間、トロンビンは、第Ｘ
III 因子のプロ酵素形を中間体形に転換し、次にこれは
カルシウムイオンの存在下で解離して第ＸIII 因子と命
名される酵素の活性形をもたらす。

【０００４】トロンビンはγ−二量体化、次いでα−多
量体化を通してフィブリンの重合を触媒して非共有的フ
ィブリンクロットを生じさせ、このものは第ＸIII ａ因
子によって相当な機械的強度の架橋されたクロットに転
換される（Ｒ．Ｃｈｅｎ ＆Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌ
ｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
６６：４７２〜４７９ページ、１９７０；Ｊ．Ｊ．Ｐｉ
ｓａｎａなど．、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
２０２：９８〜１１３ページ、１９７２）。第ＸIII ａ
因子は、分子間ε（γ−グルタミル）リジン結合の形成
を通してフィブリンポリマーの架橋を触媒するトランス
グルタミナーゼである。この架橋反応は、カルシウムイ
オンの存在を必要とする（Ｌ．Ｌｏｒａｎｄなど．、Ｐ
ｒｏｇ．Ｈｅｍｏｓｔ．Ｔｈｒｏｍｂ．５：２４５〜２
９０ページ、１９８０；Ｊ．Ｅ．Ｆｏｌｋ及びＪ．Ｓ．
Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３
１：１〜１３３ページ、１９７７）。

【０００５】インビボで、第ＸIII ａ因子は、他のタン
パク質分子間の架橋反応を触媒する。たとえば、第ＸII
I ａ因子はまた、α₂ −プラスミン阻害因子及びフィブ
ロネクチンへのフィブリンのγ鎖の架橋、並びに創傷の
治癒に関係されるコラーゲン及びフィブロネクチンの架
橋も触媒する（Ｙ．Ｓａｋａｌａ及びＮ．Ａｏｋｉ，
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６５：２９０〜２７９ペ
ージ、１９８０；Ｄ．Ｆ．Ｍｏｓｈｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：６６１４〜６６２１ページ、１
９７５；Ｄ．Ｆ．Ｍｏｓｈｅｒ及びＰ．Ｅ．Ｃｈａｄ，
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６４：７８１〜７８７ペ
ージ、１９７９；Ｆｏｌｋ及びＦｉｎｌａｙｓｏｎ、前
記；Ｌｏｒａｎｄなど．、前記）。フィブリンの網状構
造中へのα₂−プラスミン阻害因子の共有結合的な導入
は、溶解に対するクロットの耐性を高めることができる
（Ｌｏｒａｎｄなど．、前記）。

【０００６】血漿中において、第ＸIII ａ因子のための
最良のアミノ基供与体及びアミノ基受容体は、それぞれ
α₂ −プラスミン阻害因子及びフィブリンである（Ｔ．
Ｔａｍａｋｉ及びＮ．Ａｏｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５７：１４７６７〜１４７７２ページ、１９８
２；Ｆ．Ｃａｒｍａｓｓｉ及びＳ．Ｉ．Ｃｈｕｎｇ，Ｐ
ｒｏｇ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ６：２８１〜２８
５ページ、１９８３）。第ＸIII 因子又はα₂ −プラス
ミン阻害因子のいづれかの欠失は、これらの個体におけ
る初期の止血は正常であるけれども、“遅延された出
血”をもたらす（Ｌｏｒａｎｄなど．、前記）。従っ
て、プラスミンによる消化からのフィブリンクロットの
保護における第ＸIII 因子及びα₂ −プラスミン阻害因
子の両者のための役割が示唆される。

【０００７】第ＸIII 因子（Ｍｒ＝約３２０KD）のチモ
ーゲンは、フィブリノーゲンとの複合体として血液中を
循環する（Ｃ．Ｓ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ及びＭ．Ａ．Ｓ
ｈｕｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：６０９
６〜６１０１ページ、１９８２）。第ＸIII 因子は、２
個のａサブユニット（Ｍｒ＝約７５KD）及び２個のｂサ
ブユニット（Ｍｒ＝約８０KD）から成るテトラマー（ａ
₂ ｂ₂ ）である（Ｓ．Ｉ．Ｃｈｕｎｇなど．，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：９４０〜９５０ページ、１９
７４）。ａサブユニットは酵素の触媒部位を含み、そし
てｂサブユニットは、ａサブユニットを安定化し、又は
第ＸIII 因子の活性化を調節するように思われる（Ｆｏ
ｌｋ及びＦｉｎｌａｙｓｏｎ、前記；Ｌ．Ｌｏｒａｎｄ
など．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍｍ．５６：９１４〜９２２ページ、１９７４）。

【０００８】第ＸIII ａ因子への第ＸIII 因子の活性化
の間、トロンビンによる切断は、ａサブユニットのそれ
ぞれのアミノ末端から活性化ペプチド（Ｍｒ＝４KD）の
開放をもたらす（Ｓｃｈｗａｒｔｓなど．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２４８：１３９５〜１４０７ページ、１
９７３）その活性化ペプチド及び触媒部位を含むａ鎖の
領域のアミノ酸配列はすでに決定されている（Ｔ．Ｔａ
ｋａｇｉ及びＲ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１３：７５０〜７５６ページ、１９７４；Ｊ．
Ｊ．Ｈｏｌｂｒｏｏｋなど．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１
３５：９０１〜９０３ページ、１９７３）。

【０００９】第ＸIII 因子を欠失する患者のための現在
の治療実施は、一般的に血漿又は血漿誘導体もしくは粗
胎盤第ＸIII 因子濃縮物による代替治療である（Ｌｏｒ
ａｎｄなど．、前記；Ｆｒｏｂｉｓｃｈなど．，Ｄｔｓ
ｃｈ．Ｍｅｄ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．９７：４４９〜
５０２ページ、１９７２；Ｋｕｒａｔｓｕｊｉなど．，
Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １１：２２９〜２３４ペー
ジ、１９８２）。この濃縮物は、出発原料として比較的
多量の種々のヒト血漿又は胎盤組織の使用を必要とす
る。さらに、プールされたヒト胎盤組織から得られた濃
縮物がウイルス及び他の汚染物を含まないことを確認す
ることは困難である。さらに、多量の胎盤第ＸIII 因子
の濃縮物の精製は難かしく且つ費用がかかる。

【００１０】最近、第ＸIII 因子濃縮物は、手術後の創
傷の治癒における障害（Ｍｉｓｈｉｍａなど．，Ｃｈｉ
ｒｕｒｇ ５５：８０３〜８０８ページ、１９８４；Ｂ
ａｅｒなど．，Ｚｅｎｔｒａｂｌ．Ｃｈｉｒ．１０５：
６４２〜６５１ページ、１９８１）及び硬皮症（Ｄｅｌ
ｂａｒｒｅなど．，Ｌａｎｃｅｔ ２：２０４ページ、
１９８１）を有する患者に使用されて来た。さらに第Ｘ
III 因子は、組織癒着剤の成分として使用され（アメリ
カ特許第４，４１４，９７６号；第４，４５３，９３９
号；第４，３７７，５７２号；第４，３６２，５６７号
及び第４，２９８，５９８号）、そして手術後の出血の
防止のための抗フィブリン溶解治療に、及びクモ膜下出
血、潰瘍性大腸炎及び一般的な創傷の治癒の処置に使用
するために提案されて来た。ヒト第ＸIII 因子調製物の
これらの可能性ある適用は、組換え第ＸIII 因子の生成
に対してさらに刺激を与える。

【００１１】従って、比較的多量の第ＸIII 因子の純粋
な調製物を生成する方法が当業界において必要である。
本発明は、組換えＤＮＡ技法の使用によりこの必要性を
満たし、その結果ウイルス汚染の問題を取り除き、そし
て同時に、第ＸIII 因子を欠失する患者及び他のものを
治療するために活性第ＸIII 因子の一貫した、均質の且
つ経済的な入手源を提供する。

【００１２】

【発明の開示】手短に言えば、本発明は、第ＸIII 因子
と実質的に相同な生物学的活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列を開示する。より詳しくは、第ＸII
I 因子のａ，ａ′及びｂサブユニットに機能的に類似す
るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が開示される。
さらに、転写プロモーター、及び続いてその下流にヒト
第ＸIII 因子と実質的に同じ生物学的活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクタ
ーもまた開示される。プロモーターの後のＤＮＡ配列
は、第ＸIII 因子のａ，ａ′又はｂサブユニットに機能
的に類似するポリペプチドをコードすることができる。

【００１３】転写プロモーター、及び続いてその下流に
ヒト第ＸIII 因子と実質的に同じ生物学的活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベ
クターによりトランスフェクトされた宿主細胞もまた開
示される。その宿主細胞は、原核宿主細胞又は真核宿主
細胞、酵母宿主細胞及び哺乳類の宿主細胞であることが
でき、そして特に真核宿主細胞が好ましい。

【００１４】本発明のもう１つの観点は、第ＸIII 因子
と実質的に同じ生物学的活性を有するタンパク質を生成
するための種々の方法を開示する。これらの方法の１つ
においては、第ＸIII 因子のａサブユニットの機能的に
相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が第一の宿
主細胞に導入され、そして第ＸIII 因子のｂサブユニッ
トに機能的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列が第二の宿主細胞に導入される。

【００１５】次に、宿主細胞は培養され、そしてａサブ
ユニット及びｂサブユニットが第一及び第二の宿主細胞
から単離される。続いて、ａ及びｂサブユニットは二量
体化され、ａ₂ 及びｂ₂ ホモダイマーが形成され、そし
てそのホモダイマーはａ₂ ｂ ₂ テトラマーを形成するた
めに組合わされ、そして該テトラマーは、第ＸIII 因子
と実質的に同じ生物学的活性を有する。

【００１６】そのようなタンパク質を調製するもう１つ
の方法は、第ＸIII 因子のａサブユニットと機能的に相
同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を第一宿主細
胞中に導入し、そして第ＸIII 因子のｂサブユニットと
機能的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を
第二宿主細胞中に導入することを含んで成る。その第一
及び第二宿主細胞が培養され、そしてａ₂ 及びｂ₂ のホ
モダイマーが前記宿主細胞から単離され、そして続い
て、ａ₂ ｂ₂ テトラマーを形成するために組合わされ、
そして該テトラマーは、第ＸIII 因子と実質的に同じ生
物学的活性を有する。

【００１７】本発明のもう１つの観点においては、カル
シウムの存在下での解離に基づいて、第ＸIII ａ因子と
実質的に同じ生物学的活性を有するタンパク質を調製す
るための方法が開示される。１つのそのような方法にお
いては、第ＸIII 因子のａ′サブユニットと機能的に相
同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が第一宿主細
胞に導入され、そして第ＸIII 因子のｂサブユニットと
機能的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が
第二宿主細胞中に導入される。

【００１８】次に、その第一及び第二宿主細胞は培養さ
れ、そしてａ′サブユニット及びｂサブユニットがそれ
ぞれ第一及び第二宿主細胞から単離される。次に、ａ′
及びｂサブユニットは二量体化され、ａ′₂ 及びｂ₂ ホ
モダイマーが形成され、そしてそのホモダイマーは、
ａ′₂ ｂ₂ テトラマーを形成するために組合わされ、そ
して該テトラマーは、解離に基づいて、第ＸIII ａ因子
と実質的に同じ生物学的活性を有する。

【００１９】この事に関する他の方法は、第ＸIII 因子
のａ′サブユニットと機能的に相同なポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を第一宿主細胞に導入し、そして第
ＸIII 因子のｂサブユニットと機能的に相同なポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を第二宿主細胞に導入する
ことを一般的に含んで成る。次に、その第一及び第二宿
主細胞は培養され、そしてａ′₂ 及びｂ₂ ホモダイマー
が前記宿主細胞から単離される。次に、ａ′₂ 及びｂ₂
ホモダイマーは、ａ′₂ ｂ₂ テトラマーを形成するため
に組合わされ、そして該テトラマーは解離後に、第ＸII
I ａと実質的に同じ生物学的活性を有する。

【００２０】この事に関するもう１つの方法は、第ＸII
I 因子のａ′サブユニットと機能的に相同なポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列を第一宿主細胞に導入し、そ
して第ＸIII 因子のｂサブユニットと機能的に相同なポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列を第二宿主細胞中に
導入することを一般的に含んで成る。次に、その第一及
び第二宿主細胞は培養され、そしてａ′₂ 及びｂ₂ ホモ
ダイマーが前記宿主細胞から単離される。次に、ａ′₂
及びｂ₂ ホモダイマーは、ａ′₂ ｂ₂ テトラマーを形成
するために組合わされ、そして該テトラマーは、解離後
に、第ＸIII ａ因子と実質的に同じ生物学的活性を有す
る。

【００２１】本発明のさらにもう１つの観点は、活性化
後に第ＸIII ａ因子と実質的に同じ生物学的活性を有す
るタンパク質を調製するための方法を開示する。１つの
そのような方法においては、転写プロモーター、及び続
いてその下流に第ＸIII 因子のａサブユニットと機能的
に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで
成る発現ベクターが宿主細胞中に導入される。続いて、
その宿主細胞は適切な条件下で培養され、そしてａサブ
ユニットがその宿主細胞から単離される。次に、そのよ
うにして単離されたａサブユニットがａ₂ ホモダイマー
を形成するために二量体化される。

【００２２】この事に関するもう１つの方法は、転写プ
ロモーター、及び続いてその下流に第ＸIII 因子のａサ
ブユニットと機能的に相同なポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターを宿主細胞中に導
入することを一般的に含んで成る。次に、その宿主細胞
は適切な条件下で培養され、そしてａ₂ ホモダイマーが
前記宿主細胞から単離される。

【００２３】活性化後に第ＸIII ａ因子と実質的に同じ
生物学的活性を有するタンパク質を調製するためのもう
１つの方法は、前記宿主細胞から前記タンパク質を分泌
することである。１つのそのような方法においては、転
写プロモーター、及び続いて下流に第ＸIII 因子のａサ
ブユニットと機能的に相同なポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列と読み枠を合わせて融合されたシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクター
が宿主細胞中に導入される。続いて、その宿主は適切な
条件下で培養され、そして培地中に分泌されるａサブユ
ニットがその培養培地から単離される。

【００２４】次にそのようにして単離されたａサブユニ
ットがａ₂ ホモダイマーを形成するために二量体化され
る。この事に関するもう１つの方法は、転写プロモータ
ー、及び続いてその下流に第ＸIII 因子のａサブユニッ
トに機能的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列と読み枠を合わせて融合されたシグナルペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターを宿主細
胞中に導入することを一般的に含んで成る。次に、その
宿主細胞は適切な条件下で培養され、そして該宿主細胞
から分泌されるａ₂ ホモダイマーが前記培養培地から精
製される。

【００２５】本発明のもう１つの観点は、第ＸIII ａ因
子と実質的に同じ生物学的活性を有するタンパク質を調
製するための方法を開示する。１つのそのような方法に
おいては、転写プロモーター、及び続いてその下流に第
ＸIII 因子のａ′サブユニットと機能的に相同なポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクタ
ーが宿主細胞中に導入される。続いて、その宿主細胞は
適切な条件下で培養され、そしてａ′サブユニットが前
記宿主細胞から単離される。

【００２６】次に、ａ′サブユニットは二量体化され、
ａ′₂ ホモダイマーが形成される。そのようなタンパク
質を調製するための類似する方法は、転写プロモータ
ー、及び続いてその下流に第ＸIII 因子のａ′サブユニ
ットに機能的に類似するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を含んで成る発現ベクターを宿主細胞中に導入す
ることを一般的に含んで成る。次に、その宿主細胞は適
切な条件下で培養され、そしてａ′₂ ホモダイマーが前
記宿主細胞から単離される。

【００２７】本発明のさらにもう１つの観点において
は、活性化後に第ＸIII ａ因子と実質的に同じ生物学的
活性を有するタンパク質を調製するための方法が開示さ
れる。１つのそのような方法においては、転写プロモー
ター、及び続いてその下流にある第ＸIII 因子のａ′サ
ブユニットと機能的に相同なポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列並びに転写プロモーター及び続いてその下流
にある第ＸIII 因子のｂサブユニットと機能的に相同な
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現
ベクターが宿主細胞中に導入される。続いて、その宿主
細胞は適切な条件下で培養され、そしてタンパク質が前
記宿主細胞から単離される。

【００２８】簡単に上に記載された方法により精製され
たタンパク質を開示する他に、本発明はまた、簡単に上
に記載された方法のそれぞれにより生成された有効量の
タンパク質及び生理学的に許容されるキャリヤー及び希
釈剤を含んで成る種々の医薬組成物にも向けられる。本
発明の他の観点は、次の詳細な説明及び添付図面により
明らかになるであろう。

【００２９】図１〜５は、ヒト第ＸIII 因子のａ及び
ａ′サブユニットをコードするヌクレオチド配列及びこ
れらのサブユニットの推定アミノ酸配列を示す。第−３
０番〜第−１番ａアミノ酸は、イン−フレーム配列を表
わしているように思われ、他方＋１（セリン）〜＋７３
１（メチオニン）のアミノ酸は、成熟ａサブユニットに
存在するアミノ酸を表わす。＋３８（グリシン）〜＋７
３１（メチオニン）のアミノ酸は、成熟ａ′サブユニッ
トに存在するアミノ酸を表わす。

【００３０】残基＋３１５の活性部位Ｃｙｓは、円で囲
まれている。曲がっている矢印は、アミノ末端のＳｅｒ
を有する成熟タンパク質を生成する。プロセシングプロ
テアーゼ（たとえばＭＥＴアミノペプチダーゼ）による
切断の部位を示す。まっすぐな矢印は、トロンビンによ
る第ＸIII 因子ａ′サブユニットへの第ＸIII 因子ａサ
ブユニットの転換のための切断部位を明らかにする。黒
くぬりつぶされたひし形で印された残基は、Ａｓｎ−Ｘ
−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列での潜在的なＡ
ｓｎ−結合のグリコシル化部位である。中空のひし形
は、ほとんど又は全く炭水化物を持たないＡｓｎ残基を
特定する。

【００３１】図６〜１０は、ヒト第ＸIII 因子のｂサブ
ユニットをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び
この推定アミノ酸配列を示す。−１９〜−１のアミノ酸
は、リーダー配列の部分を表わし、そして＋１（グルタ
メート）〜＋６４１（トレオニン）のアミノ酸は、成熟
ｂサブユニットに存在するアミノ酸を表わす。上線を引
かれたアミノ酸残基はまた、アミノ酸配列分析によって
決定された。（しかしながら、残基３９４，５３６，５
３７は、この分析によって同定されなかった。）黒くぬ
りつぶされたひし形により印された残基は、Ａｓｎ−Ｘ
−Ｓｅｒ配列での潜在的なＡｓｎ−結合のグリコシル化
部位であり、他方中空のひし形により印された残基は、
Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ配列での潜在的なＡｓｎ−結合のグ
リコシル化部位である。ポリアデニル化シグナル及びｐ
ｏｌｙ（Ａ）末端に対応するヌクレオチド配列は、ボッ
クス内に示される。

【００３２】図１１は、β₂ −グリコプロテインＩにお
ける５回の反復、ヒト補体のＢ因子のＢの鎖における３
回の反復及びヒトヘプトグロビンα¹ 鎖のアミノ酸配列
と、第ＸIII 因子のｂサブユニットの反復４，５及び６
におけるアミノ酸配列との比較を示す。同じ位置におけ
る４又はそれよりも多くの同一の残基はボックスで囲ま
れる。最大の平面図を得るために、ギャップは最少にさ
れた。それぞれの反復の前の数字は、それぞれの反復に
おける最初のアミノ酸の残基番号を示す。

【００３３】図１２は、第ＸIII 因子のｂサブユニット
に存在する１０個のアミノ酸反復の平面図を示す。その
反復は、反復１，２及び３；４，５及び６；７及び９；
並びに８及び１０を含む４種のグループに分けられた。
それぞれの反復の前の数字は、それぞれの反復における
最初のアミノ酸の残基の番号を示す。反復のそれぞれの
グループにおける同じ位置での２又はそれよりも多くの
同一の残基はボックスで囲まれている。１０個の反復さ
れた部分の間のギャップは、最大の平面図を得るために
最少にされた。

【００３４】図１３はプラスミドｐＭＶＲ１の造成法を
示す。図１４はプラスミドｐＡＴ−１の造成法を示す。
図１５はプラスミドｐＴＲＫ４ｃ及びその誘導体ｐＲＳ
１８５の造成法を示す。図１６はｐＲＳ２０１の造成法
及びプラスミドｐＲＳ２０２及びｐＲＳ２０３の造成法
を導びく突然変異誘発を示す。

【００３５】図１７は酵母発現ベクターｐＲＳ２１６及
びｐＲＳ２１７の造成法を示す。図１８は天然のＧｌｕ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａを有する、コドンを最適化さ
れたＭＦα１シグナルペプチド配列及びＨｉｎｄIII 配
列を含んで成るプラスミドｐＲＳ１１１の造成法を示
す。図１９はｐＲＳ２２０及びｐＲＳ２３１の造成法を
示す。

【００３６】

【発明実施のための最良の態様】本発明を説明する前
に、本発明の理解を助けるよう以下で用いる所定の用語
の定義の説明を行なう。生物学的活性 ：生物学的情況において（すなわち、生物
体中でまたはインビトロ複写において）分子によって行
なわれる１つの機能または一連の複数の機能。タンパク
質の生物学的活性は触媒活性とエフェクター活性とに分
けることができ。凝固因子の触媒活性は一般に、前駆体
の特異的開裂を介する他の因子の活性化を含んでいる。

【００３７】エフェクター活性は、カルシウムもしくは
他の低分子、高分子例えばタンパク質、または細胞への
生物学的に活性な分子の特異的結合を含んでいる。エフ
ェクター活性は生理的条件下で触媒活性を増大させ、ま
たは該活性のために必須である。触媒活性及びエフェク
ター活性はある場合にはタンパク質の同じドメイン内に
存している。

【００３８】前記のように、ヒト第ＸIII 因子の生物学
的活性は、分子間Ｅ（γ−グルタミル）リジン結合の形
成を介してフィブリンポリマーを架橋することによって
血餅を安定化する能力によって特徴付けられる。第ＸII
I 因子は、フィブリンを他の分子、例えばα₂ −プラス
ミン阻害剤に架橋することもできる。チモーゲンは、４
つのサブユニット、すなわち２つのａサブユニット及び
２つのｂサブユニットからなる四量体であり、これらの
サブユニット非共有的相互作用によって結合している。
鎖間ジスルフィド結合はａサブユニットに不存在であろ
うが、ｂサブユニットは２０の鎖内ジスルフィド結合を
含んでいるものと思われる。

【００３９】第ＸIII 因子は２段階反応を介して活性化
される。最初に、トロンビンが各ａサブユニットのアミ
ノ末端から短ペプチド（活性化ペプチド）を開裂して、
構造ａ′₂ ｂ₂ を生ずる。この中間構造物はカルシウム
イオンの存在下に解離して、不活性ｂ₂ サブユニット及
び触媒ａ′₂ サブユニットを生ずる〔アール．ディー．
クーク（Ｒ．Ｄ．Ｃｏｏｋｅ）、バイオケム．ジェイ．
（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）１４１：６８３〜６９１頁、
１９７４年〕。ｂサブユニットは、ａサブユニットを保
護しまたは安定化すると考えられており、血漿中に過剰
に存在する。

【００４０】ａ₂ サブユニットは巨核球、血小板、胎
盤、子宮、脾臓、前立腺及びマクロファージ内に見い出
されている〔エス．アイ．チャン（Ｓ．Ｉ．Ｃｈｕｎ
ｇ）前掲；ティー．エイチ．キーセルバック（Ｔ．Ｈ．
Ｋｉｅｓｓｅｌｂａｃｋ）及びアール．エイチ．ワグナ
ー（Ｒ．Ｈ．Ｗａｇｎｅｒ）、アン．エヌ．ワイ．アカ
ド．サイ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）２
０２：３１８〜３２８頁、１９７２年；ピー．ヘンリク
ソン（Ｐ．Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ）等、ジェイ．クリ
ン．インヴェスト．（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）
７６：５２８〜５３４頁、１９８５年：エル．ムズベク
（Ｌ．Ｍｕｓｚｂｅｋ）等、トロンブ．リス．（Ｔｈｒ
ｏｍｂ．Ｒｅｓ）３７：４０１〜４１０頁、１９８５
年〕。内因性のｂサブユニットは、注入された血漿中の
胎盤第ＸIII 因子を安定化するように思われる。

【００４１】第ＸIII のａサブユニットもｂサブユニッ
トも、本明細書に記載する努力前には、他の当業者によ
る配列決定は十分になされていなかった。ａサブユニッ
トから放出される活性化ペプチドの配列、ならびにａサ
ブユニットの触媒部位の周囲領域のアミノ酸配列は既に
報告されている〔タカギ（Ｔａｋａｇｉ）及びドゥーリ
ットル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、前掲；ホルブルック
（Ｈｏｌｂｒｏｏｋ）等、前掲〕。

【００４２】第ＸIII 因子のｂサブユニットについて既
に得られている唯一のアミノ酸配列情報はアミノ末端配
列Ｇｌｕ−Ｇｌｘ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏである（タカギ及び
ドゥーリットル、前掲）。従って、第ＸIII 因子は他の
血液凝固因子と比べ極めて不十分な特徴付けがなされて
いるに過ぎない。結果として、第ＸIII 因子をコードす
る遺伝子についてはほとんど知られていない。

【００４３】本発明は、ヒト第ＸIII 因子のａ，ａ′及
びｂサブユニットと機能的に相同であるポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列を開示する。ヒト第ＸIII 因子の
完全なａ及びｂサブユニット及び該ａ及びｂサブユニッ
トの対応するアミノ酸配列を開示する。ａサブユニット
はジスルフィド結合を欠いており、そして存在するとし
ても炭水化物の含量は極めてわずかである。さらに、第
ＸIII 因子の翻訳後の１つの変形はａ鎖のアミノ末端の
アセチル化である。生物学的に活性な第ＸIII因子は原
核細胞ならびに真核細胞において発現され得る。

【００４４】ヒト第ＸIII 因子ｃＤＮＡは、メッセンジ
ャーＲＮＡの適当な供給源から調製されたヒトｃＤＮＡ
ライブラリーから単離することができる。ａサブユニッ
トｍＲＮＡの１つの供給源はヒト胎盤細胞である。この
供給源からのｃＤＮＡライブラリーは、ヒト第ＸIII 因
子のａサブユニットに対してアフィニティー精製された
抗体を用いて、及び／または活性化ペプチドのアミノ酸
配列に相当するオリゴヌクレオチドプローブを用いてス
クリーニングすることができる。

【００４５】ｂサブユニットｍＲＮＡの好ましい供給源
はヒト肝臓ｍＲＮＡである。この供給源からのｃＤＮＡ
ライブラリーは、ヒト第ＸIII 因子のａサブユニットに
対してアフィニティー精製された抗体を用いてスクリー
ニングすることができる。このスクリーニング手順を介
して不完全なｃＤＮＡクローンが固定される場合には、
部分的クローンの５′末端または３′末端を用いてｃＤ
ＮＡライブラリーを再スクリーニングすることが望まし
いことがある。

【００４６】本発明の１態様において、第ＸIII 因子の
アミノ酸配列内のシステインをセリンに換えるのが望ま
しい場合がある。遊離のスルフヒドリル基の存在は第Ｘ
III因子の酸化を導き、従ってタンパク質の望ましくな
い不安定性を惹起することがある。一般に、システイン
は、例えばゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）等によって記載され
ているように、オリゴヌクレオチド指令部位特異的変異
誘発を用いてセリンと置換することができる〔マニュア
ル・フォー・アドバンスト・テクニクス・イン・モレキ
ュラー・クローニング・コース（Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ）、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）、１９８３年；ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）及びスミ
ス（Ｓｍｉｔｈ）、ＤＮＡ ３：４７９〜４８８頁、１
９８４年；クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）等、プロク．ナト
ル．アカド．サイ．ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８２：４８８〜４９２
頁、１９８５年〕。

【００４７】ＤＮＡ配列内に多型性の相違が存在するこ
とがあるので、本明細書に記載の配列は１つの対立遺伝
子の例を与えるものである。しかしながら、これらの多
型性の差違はなお、第ＸIII 因子のａ，ａ′及びｂサブ
ユニットに機能的に相同なポリペプチドをもたらすこと
に留意されたい。細胞質タンパク質のアミノ末端セリン
残基をアセチル化する酵母細胞の能力により及びａ鎖の
ジスルフィド結合の数が少ないことにより、第ＸIII 因
子のａ鎖は酵母宿主細胞中に細胞質的（分泌されるので
はなく）に生成され得る。しかしながら、酵母宿主細胞
からの第ＸIII因子ａサブユニットの分泌はタンパク質
の精製を促進する。

【００４８】ヒト第ＸIII 因子のａサブユニット、ａ′
サブユニットまたはｂサブユニットに機能的に相同であ
るポリペプチドをコードする全長ＤＮＡ配列が得られた
後、このＤＮＡ配列を適当な発現ベクター中に挿入す
る。本発明の実施に有用な発現ベクターはさらにａ，
ａ′またはｂポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作
用可能に連結されたプロモーターを含んでいる。

【００４９】この発現ベクターはさらに、選択された宿
主細胞に応じて、複製起点、ならびに発現レベルを調節
しそして／または高めるヌクレオチド配列を含んでいる
ことが好ましい。適当な発現ベクターは、プラスミドま
たはウイルスから誘導することができるか、または両者
の要素を含んでいることができる。適当なベクターの選
択及びそれらベクターの成分のヌクレオチド配列は当業
者に明白であろう。

【００５０】ａサブユニットまたはａ′サブユニットは
組換え体細胞中でｂサブユニットと同時発現（ｃｏ−ｅ
ｘｐｒｅｓｓ）させることができる。この目的のため
に、２の発現ユニットを宿主細胞中に導入する。発現ユ
ニットは、異なる選択マーカーをもった異なるベクター
上に、または好ましくは単一の発現ベクター上にあるこ
とができる。後者の方法は、等しいコピー数の２の発現
ユニットを与えるという好都合をもたらす。

【００５１】本発明を実施する際の使用において好まし
い原核宿主細胞は細菌エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の株であるが、他の属も使用
可能である。これらの宿主を形質転換しこれらの中でク
ローン化された外来遺伝子を発現させる技法は当業者に
よく知られている〔例えば、マニアチス（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラト
リー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）、１９８２年に参照されたい〕。

【００５２】細菌宿主中で外来遺伝子を発現させるため
使用するベクターは選択マーカー、例えば抗生物質耐性
遺伝子、及び宿主細胞内で機能するプロモーターを含ん
でいる。適当なプロモーターとして、ｔｒｐ〔ニコルス
（Ｎｉｃｈｏｌｓ）及びヤノフスキー（Ｙａｎｏｆｓｋ
ｙ）、メス．エンザイモル．（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．）１０１：１５５〜１６４頁、１９８３年〕、ｌａ
ｃ〔カサダバン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）等、ジェイ．バ
クテリオル．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１４３：９
７１〜９８０頁、１９８０年〕及びλファージプロモー
ター系〔クウィーン（Ｑｕｅｅｎ）、ジェイ．モル．ア
プル．ジャネット（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅ
ｔ．）２：１〜１０頁、１９８３年〕を挙げることがで
きる。

【００５３】細菌を形質転換するのに有用なプラスミド
として、ｐＢＲ３２２〔ボリヴァー（Ｂｏｌｉｖａｒ）
等、ジーン（Ｇｅｎｅ）２：９５〜１１３頁、１９７７
年〕、ｐＵＣプラスミド類〔メッシング（Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ）、メス．エンザイモル．（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．）１０１：２０〜７７頁、１９８３年；ヴィエイラ
（Ｖｉｅｉｒａ）及びメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、
ジーン（Ｇｅｎｅ）１９：２５９〜２６８頁、１９８２
年〕、ｐＣＱＶ２〔クウィーン（Ｑｕｅｅｎ）、前掲〕
及びそれらの誘導体を挙げることができる。プラスミド
はウイルス要素及び細菌要素の両者を含んでいることが
できる。

【００５４】真核微生物、例えば、酵母サッカロマイセ
ス・セレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ
（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂ
ｅ）または糸状菌〔例えば、アスペルギルス種（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）及びニューロスポラ種
（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）〕も本発明の宿主
細胞として使用することができる。酵母を形質転換する
技法は文献においてよく知られており、例えば、ベッグ
ス（Ｂｅｇｇｓ）〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２７
５：１０４〜１０８頁、１９７８年〕に記載されてい
る。

【００５５】アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ）種は、公知の手順、例えば、イェルトン（Ｙｅｌｔ
ｏｎ）等の手順〔プロク．ナトル．アカド．サイ．ユー
エスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ）８１：１７４０〜１７４７頁、１９８４年〕に従
って形質転換することができる。適当な酵母発現ベクタ
ーとして、ＹＲｐ７〔ストルール（Ｓｔｒｕｈｌ）等、
プロク．ナトル．アカド．サイ．ユーエスエー（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７６：１０
３５〜１０３９頁、１９７９年〕、ＹＥｐ１３〔ブロー
チ（Ｂｒｏａｃｈ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）８：１２１
〜１３３頁、１９７９年〕、ｐＪＤＢ２４８及びｐＪＤ
Ｂ２１９〔ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）、前掲〕及びそれら
の誘導体を挙げることができる。

【００５６】このようなベクターは一般に選択マーカ
ー、例えば、栄養マーカーＬＥＵ２を含んでおり、ｌｅ
ｕ２突然変異をもつ宿主株の選択を可能にする。また
は、このようなベクターは選択マーカーとして「必須遺
伝子（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ）」を含んでいる
ことができる〔カワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）及びベル
（Ｂｅｌｌ）、ヨーロッパ特許（ＥＰ）第１７１，１４
２号〕。好ましいこのような必須遺伝子マーカーは、シ
ゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）のＰＯＴ１遺伝子であ
り、これは富培地で培養されたＴＰＩ欠損宿主細胞にお
いて安定なプラスミドの維持を提供する。

【００５７】酵母発現ベクターにおいて有用な好ましい
プロモーターとして、酵母解糖系遺伝子（ｇｌｙｃｏｌ
ｙｔｉｃ ｇｅｎｅｓ）からのプロモーター〔ヒトゼマ
ン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）等、ジェイ．バイオル．ケム．
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５５〜１２０７３〜１
２０８０頁、１９８０年；アルバー（Ａｌｂｅｒ）及び
カワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）、ジェイ．モル．アプ
ル．ジェネット（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅ
ｔ．）１：４１９〜４３４頁、１９８２年；カワサキ
（Ｋａｗａｓａｋｉ）、米国特許第４，５９９，３１１
号〕またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子〔ヤング
（Ｙｏｕｎｇ）等、ジェネティック・エンジニアリング
・オブ・マイクロオーガニズムス・フォー・ケミカルズ
（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉ
ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）、ホレンダー（Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ）等（編）、
３３５頁、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク、
１９８２年；アメレル（Ａｍｍｅｒｅｒ）、メス．エン
ザイモル．（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ）１０１：１９
２〜２０１頁、１９８３年；ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ
ｌ）等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０４：６５２〜
６５４頁、１９８３年〕を挙げることができる。

【００５８】これに関して、とりわけ好ましいプロモー
ターはＴＰＩ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター
及びＡＤＨ２−４Ｃプロモーターである。さらに、発現
ベクター内に転写終結シグナル、例えばＴＰＩ１ターミ
ネーターを含んでいるのが好ましい。酵母形質転換体に
よって生産されたポリペプチドの精製を促進するため
に、好ましくは分泌タンパク質をコードする酵母遺伝子
からのシグナル配列を、注目しているタンパク質に対す
るコード配列に連結することができる。

【００５９】とりわけ好ましいシグナル配列はＭＦα１
遺伝子のプレ−プロ領域（ｐｒｅ−ｐｒｏ ｒｅｇｉｏ
ｎ）である〔クルジャン（Ｋｕｒｊａｎ）及びヘルスコ
ウィツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）、セル（Ｃｅｌｌ）３
０：９３３〜９４３頁、１９８２年；クルジャン（Ｋｕ
ｒｊａｎ）等、米国特許第４，５４６，０８２号〕。別
の好ましいシグナルペプチドは、ヴォン・ヘイジン（ｖ
ｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ）の規則〔ユール．ジェイ．バイオ
ケム（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１３３：１７〜
２１頁、１９８３年；ジェイ．モル．バイオル．（Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１８４：９９〜１０５頁、１９８
５年；ニュークレイック・アシッズ・リス．（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１４：４６８３〜４６
９０頁、１９８６年〕に従って設計された１９残基のシ
グナルペプチドである。

【００６０】高等真核細胞も、本発明の範囲内で適当な
宿主細胞として働くことができる。その際、培養された
哺乳動物細胞が好ましい。哺乳動物細胞において使用す
る発現ベクターは、哺乳動物細胞内に導入される外来遺
伝子の転写を指令することができるプロモーターを含ん
でいる。とりわけ好ましいプロモーターは、マウスのメ
タロチオネイン−１（ＭＴ−１）プロモーター〔パルミ
テル（Ｐａｌｍｉｔｅｒ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）２２２：８０９〜８１４頁、１９８３年〕、また
はアデノウイルス２の主要後期（ｌａｔｅ）プロモータ
ーである。

【００６１】このような発現ベクター中に、ＤＮＡ配列
挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルも含
めることができる。ポリアデニル化シグナルは、クロー
ン化遺伝子のそれであることができ、または異種（ｈｅ
ｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子から誘導することもでき
る。他の配列、例えば、エンハンサー及びＲＮＡスプラ
イシングシグナルも含めることができる。発現ベクター
造成物は当業者のレベルの範囲内にある。

【００６２】次いで、クローニングしたＤＮＡ配列を、
例えば、リン酸カルシウム介在トランスフェクションに
よって、培養哺乳動物細胞中に導入することができる
〔ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）等、セル（Ｃｅｌｌ）１
４：７２５頁、１９７８年；コラロ（Ｃｏｒａｒｏ）及
びピアーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、ソマット．セル・ジ
ェネット．（Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．）
７：６０３頁、１９８１年；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）
及びヴァン・デル．エブ（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ）、ヴ
ィロル．（Ｖｉｒｏｌ．）５２：４５６頁、１９７３
年〕。ＤＮＡ及びリン酸カルシウムの沈殿を形成せし
め、そしてこの沈殿を哺乳動物細胞に適用する。

【００６３】一部の細胞は外来ＤＮＡを取込みそしてそ
れを数日間該宿主細胞内部に維持する。これらの細胞の
一部（典型的には１０⁴ 中の約１）は異種ＤＮＡをゲノ
ム内に組込む。これらの組込み体を固定するために、一
般に、選択可能な表現型を与える遺伝子（選択マーカ
ー）を注目の遺伝子と共に細胞内に導入する。好ましい
選択マーカーは、薬物、例えば、ネオマイシン、ヒグロ
マイシン及びメトトレキセートに対する耐性を与える遺
伝子を含んでいる。選択マーカーは、注目の遺伝子と同
時に別の発現ベクター上で細胞内に導入することがで
き、または該マーカーは同じ発現ベクター上で導入する
ことができる。別のトランスフェクション技法、例え
ば、エレクトロポレーション〔ニューマン（Ｎｅｕｍａ
ｎｎ）等ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１〜８４５頁、１９８
２年〕も使用することができる。

【００６４】組込まれた遺伝子配列のコピー数は、選択
マーカーに対する薬剤選択による増幅を介して増加させ
ることができる。薬剤濃度は、各段階で耐性細胞を選択
することによって段階的に高められる。増加したコピー
数のクローン化された配列を選択することによって、発
現レベルを実質的に高めることができる。選択した宿主
細胞を適当な培地で増殖させ、そして標準的方法に従っ
て組換え体第ＸIII 因子を単離することができる。簡潔
に述べれば、第ＸIII 因子をＤＥＡＥ−セルロースクロ
マトグラフィーによって、次いでセファロース−６Ｂカ
ラム上での分画によって単離する。カラムは、適当な緩
衝液、例えば、１mM ＥＤＴＡを含有する５０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、pH７．５の緩衝液によって溶離する。活
性ピークを、４０％硫酸アンモニウムによる沈殿によっ
て濃縮する。これに代えて、イムノアフィニティークロ
マトグラフィーまたはＨＰＬＣのような方法も使用可能
である。

【００６５】本明細書に記載した方法によって生成した
タンパク質の１つの利用は医薬組成物としての利用であ
る。タンパク質を精製し常法によって製剤化し、治療す
べき特定の宿主に対して適当な濃度を提供するようにす
る。生理学的に許容され得る担体または稀釈剤、例え
ば、滅菌水、生理的食塩水及び緩衝化された塩水も用い
ることができる。このような医薬組成物は種々の方法で
投与することができる。このタンパク質は組織シーラン
トを調製する際にも用いることができる。

【００６６】以下の例は説明のために与えるものであ
り、限定を目的とするものではない。

【００６７】

【実施例】特にことわらない限り、標準分子生物学的方
法を用いた。制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレア
ーゼＢＡＬ−３１、及びＴ₄ ＤＮＡリガーゼをベセスダ
リサーチラボラトリー（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはニューイン
グランドバイオラボ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ）より得た。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノー（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）フラグメント、細菌アルカリホスファターゼ、ＡＴ
Ｐ、デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチドト
リホスファターゼ、Ｍ１３ｍｐ１０，Ｍ１３ｍｐ１１，
Ｍ１３ｍｐ１８，Ｍ１３ｍｐ１９，ｐＵＣ９、及びｐＵ
Ｃ１９をベセスダリサーチラボラトリーより得た。

【００６８】人胎盤ｃＤＮＡライブラリーをクロンテッ
クラボ社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）（パ
ロアルト市、カリフォルニア州）より得た。Ｎａ¹²⁵ Ｉ
及び ³²Ｐ−ラベルヌクレオチド並びに〔α³⁵Ｓ〕ｄＡＴ
Ｐをニューイングラントニュークリアー（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）またはアマーシャム（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）より得た。正常の人の血漿は、オレゴ
ン州ポートランド市のパシフィックノースウェストレッ
ドクロスブラッドサービス（ｔｈｅ Ｐａｃｉｆｉｃ
Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｒｅｓ Ｃｒｏｓｓ Ｂｌｏｏｄ
Ｓｅｒｖｉｃｅ）、より提供された。

【００６９】第ＸIII 因子は、メソド・エンザイモロジ
ー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）４５巻、１７７〜１
９１頁、１９７６年のカーティス及びロランド（Ｃ．
Ｇ．Ｃｕｒｔｉｓ ａｎｄ Ｌ．Ｌｏｒａｎｄ）の方法
に従って人の血漿より精製した。これをトロンビン存在
下で第ＸIII ａ因子に転化し、次いでこのトロンビンを
ヒルジンに不活性化した。ａ′及びｂサブユニットはチ
ュン（Ｃｈｕｎｇ）らの方法（前掲）に従ってバイオゲ
ルＡ−５ｍカラムのゲル濾過により分画された。

【００７０】第ＸIII 因子のａ′サブユニット及びｂサ
ブユニットに対するポリクローナル抗体はウサギ内でつ
くり、免疫グロブリン画分を硫安分画、ＤＥＡＥ−セフ
ァデックスカラムクロマトグラフィー、及び固定抗原セ
ファロースカラムを用いたアフィニティクロマトグラフ
ィーにより精製した。オリゴヌクレオチドはアプライド
バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）（フォスターシティ、カルフォルニア）モデル３８
０Ａ合成機で合成し、ポリアクリルアミドゲルで精製し
た。

【００７１】実施例 Ｉ ヒト第ＸIII 因子のａサブユニットをコード化するｃＤ
ＮＡのクローニング Ａ．ヒト第ＸIII 因子のａサブユニットをコード化する
ｃＤＮＡのスクリーニング 人胎盤ｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡを含むλｇｔｌｌ
発現ライブラリーをヒト第ＸIII 因子のａサブユニット
についてスクリーニングした。 ¹²⁵Ｉラベルアフィニテ
ィ精製ウサギ抗体（比活性＝６×１０⁶ cpm／μｇ）を
用いて、１５０mmのプレートあたり１．５×１０⁵ 個の
プラークの密度でひろげたファージを含むフィルターを
スクリーニングした。６個の陽性クローンが約３×１０
⁶ をファージをスクリーニングすることにより単離さ
れ、各陽性ファージは精製された。

【００７２】プラーク精製したクローンを以下の³²Ｐ−
ラベルオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングし
た：^5'ＣＴＣ ＣＡＣ ＧＧＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴ
ＣＧＴＣ ＣＴＣ Ｇ³'。このプローブはａサブユニッ
トの活性化ペプチド中に存在するＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ
のアミノ酸配列をコードにする〔タカギ及びドーリット
ル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）前掲〕。このプローブのヌク
レオチド配列は、多くの異なるヒト蛋白質のアミノ酸に
最も一般的に使用されるコドンを用いることにより選択
された（チェン及びベーカー（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｂａ
ｒｋｅｒ）、Ｔｒｅｎｄ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１
巻、２２１〜２２３頁、１９８５年）。このオリゴヌク
レオチドは³²Ｐでラベルされ、１．１×１０⁸ cpm／μ
ｇの比活性を有している。

【００７３】Ｂ．ｃＤＮＡ挿入部のＤＮＡ配列 ファージＤＮＡは、液体培養溶解法（シルヘビィ（Ｔ．
Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗ
ｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，ＣＳＨラボラトリ
ー、ニューヨーク、１４０〜１４１頁、１９８４年）に
より、さらに続いて塩化セシウム段階勾配で遠心しそし
てバンド化することにより陽性クローンより調製した。
ｃＤＮＡ挿入部はＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼによる
ファージＤＮＡの分解により単離され、各挿入部の５′
及び３′末端は配列決定された。大きなｃＤＮＡ挿入部
を有するクローンの１種（λＨＦＸIII ａ３．７７，Ａ
ＴＣＣ No. ４０２６１）は、さらに配列分析のため選
択された。この挿入部は３個の内部ＥｃｏＲＩサイトを
含み、ＥｃｏＲＩによるファージＤＮＡの分解の際、４
種のｃＤＮＡフラグメントが生じた。

【００７４】これらのフラグメント及びいくつかの追加
の制限フラグメントはプラスミドｐＵＣ９またはｐＵＣ
１９にサブクローンされた。他のｃＤＮＡ挿入部からの
追加の制限フラグメントは重複する配列を得るためＭ１
３ｍｐ１０，Ｍ１３ｍｐ１１，Ｍ１３ｍｐ１８、または
Ｍ１３ｍｐ１９にサブクローンされた。次いでこのｃＤ
ＮＡ挿入部は、〔α³⁵Ｓ〕ｄＡＴＰ及びバッファー勾配
ゲル〔ビギン（Ｍ．Ｄ．Ｂｉｇｇｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０巻、３９６
３〜３９６５頁、１９８３年〕を用いたジデオキシ法
〔サンガー（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４巻、５４６３〜５
４６７頁、１９７７年〕により配列決定された。ヌクレ
アーゼＢＡＬ−３１による分解は、ＥｃｏＲＩ制限フラ
グメントとオーバーラップする配列を与える５種の追加
のフラグメントを生じさせた。

【００７５】これらのオーバーラップするクローンから
の３８３１塩基対の配列及び予想アミノ酸配列を図１〜
５に示す。このＤＮＡ配列は、血中を循環するヒト第Ｘ
III因子の完全なａサブユニットのアミノ酸配列全体を
コードする。このａサブユニットは７３１個のアミノ酸
よりなり、Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒのアミノ末
端配列で開始する。このアミノ末端配列はタカギ及びド
ーリットル（前掲）により以前に報告された。

【００７６】カルボキシ末端Ｍｅｔ（ヌクレオチド２２
８１〜２２８３）に続き停止コドン（ＴＧＡ）、非コー
ド配列の１５３５塩基対、及び潜在するポリアデニル化
またはＡＡＴＡＡＡシグナルが存在する。このポリアデ
ニル化配列は１０個のヌクレオチドのポリ（Ａ）テイル
から１４ヌクレオチド上流に配置されている。このポリ
（Ａ）テイルはλＨＦＸIII ａ３．８２と呼ばれる第二
ｃＤＮＡクローンにのみ存在する。

【００７７】λＨＦＸIII ａ３．７７中のｃＤＮＡ挿入
部はまたフレーム内配列をコードすると思われる３０個
のアミノ酸残基をコードする。完全な第ＸIII 因子を生
ずるプロセシングプロテアーゼによるＭｅｔとＳｅｒの
間の結合の開裂は、アミノ末端Ｓｅｒを有する完全な蛋
白質を生ずるために追加のプロセシングプロテアーゼを
必要とする。この後アセチル化反応がおこり、成熟蛋白
質のアミノ末端におけるアセチル−セリンの形成が導か
れる（タカギ及びドーリットル（Ｔａｋａｇｉ ａｎｄ
Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、ｉｂｉｄ；ナカムラ（Ｓ．Ｎ
ａｋａｍｕｒａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８巻、１
２４７〜１２６６頁、１９７５年）。

【００７８】第ＸIII 因子のａサブユニットのためのヌ
クレオチド配列の違いは、重複配列が得られた領域でｃ
ＤＮＡの比較を行った際、３か所で発見された。λＨＦ
ＸIII ａ３．７７はヌクレオチド２０３８，２０４１、
及び２７２７においてそれぞれＡ．Ｃ．及びＴを含み、
一方λＨＦＸIII ａ３．８２は同じ位置においてＧ．
Ｇ．及びＡを含んでいた。これらの違いは２種類のアミ
ノ酸の変化（Ｉｌｅ６５０及びＧｌｎ６５１からＶａｌ
及びＧｌｕへ）となり、第ＸIII 因子のａサブユニット
におけるミクロヘテロゲナイティーに寄与する多形を示
す（ボート及びコガン（Ｐ．Ｇ．Ｂｏａｒｄ ａｎｄ
Ｍ．Ｃｏｇｇａｎ）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５９巻、１
３５〜１３６頁、１９８１年）。

【００７９】Ｃ．アミノ酸配列 ヒト第ＸIII 因子のａサブユニットの臭化シアンフラグ
メントに対しアミノ酸分析を行った。１０mgの第ＸIII
因子を５％ ＨＣＯＯＨに対し一晩透析し、透析液を水
酸化アンモニウムでpH４にあわせた。ａサブユニットに
富んだ（８３％がａ及び１７％がａサブユニット）沈殿
をＳ−カルボキシメチル化し、臭化シアンで分解した。

【００８０】生じたフラグメントを５％ ＨＣＯＯＨを
用いたセファデックスＧ−５０スーパーファインカラム
のゲル濾過により分離し、さらにウルトラポアーＣ３逆
相カラム（アルテックス）を用いたウォーターズＨＰＬ
Ｃシステムで精製した。用いた勾配は移動相として０．
１％トリフルオロ酢酸及び移動相モディファイアーとし
て８０％アセトニトリル中の０．８％トリフルオロ酢酸
を用いた。カラムは流速１．５ml／min で行ない、溶出
は２１４nmの吸収でモニターした。

【００８１】ｃＤＮＡより予想される１８個の臭化シア
ンフラグメントのうち１１個を単離した。ｂサブユニッ
トから生ずるペプチド（イチノセ（Ａ．Ｉｃｈｉｎｏｓ
ｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５巻、４６３３〜４６３８
頁、１９８６年）は容易に確認でき、ａサブユニット由
来の残りのペプチドから除いた。精製した各々の臭化シ
アンフラグメントの配列分析をベックマン自動シークエ
ンサー、モデル８９０を用い、エドマン及びベッグ
（Ｐ．Ｅｄｍａｎ ａｎｄ Ｇ．Ｂｅｇｇ）のＥｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１巻、８０〜９１頁、１９６７年
の方法により行った。

【００８２】ＰＴＨ−アミノ酸は２種の補足的逆相カラ
ムシステム（エリクソン（Ｌ．Ｈ．Ｅｒｉｃｓｓｏｎ）
ら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ、プレビエロ及びコレチプレビエロ（Ａ．Ｐｒｅｖｉ
ｅｒｏ ａｎｄ Ｍ．Ａ．Ｃｏｌｅｔｔｉ−Ｐｒｅｖｉ
ｅｒｏ）、１３〜１４２頁、１９７７年；グラッチ
（Ｊ．Ｌ．Ｇｌａｊｃｈ）ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒ，３１８巻、２３〜２９頁、１９８５年）により同定
された。総計３６３個の残基が明確に同定された（残基
は図１〜５に示す）。これらのアミノ酸配列はｃＤＮＡ
より予想されたものと完全に一致した。

【００８３】ｃＤＮＡより予想された蛋白配列はＡｓｎ
−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒの配列を有する
６種の潜在的Ａｓｎ−結合グリコシル化サイトを含む。
これらのＡｓｎ残基は、１７，４６，５４１，５５６，
６１３、及び６８６の位置にある。これらのＡｓｎ残基
のうち２つは炭水化物をほとんどまたは全く有さない。
６１３と６８６の位置にあるＡｓｎはアミノ酸配列分析
により容易に同定されるからである。さらに、タカギ及
びドーリットル（前掲）によりＡｓｎ １７中には炭水
化物は報告されなかった。

【００８４】従って第ＸIII 因子のａサブユニットは炭
水化物を１．５％のみ含み、４６，５４１及び５５６の
位置はほとんどまたは全く炭水化物を含まないこともあ
りうる。しかしこれらのＡｓｎ残基のいくつかの部分的
グリコシル化はヒト第ＸIII因子のａサブユニットのミ
クロヘテロゲナイティーに寄与するかもしれない（ボー
ド及びコガン、前掲）。

【００８５】第ＸIII 因子のａサブユニットは以下の組
成の７３１個のアミノ酸残基からなる。Ａｌａ₃₇，Ａｒ
ｇ₄₅，Ａｓｎ₄₀，Ａｓｐ₄₇，１／２ Ｃｙｓ₉ ，Ｇｌｎ
₂₇，Ｇｌｕ₄₈，Ｇｌｙ₅₀，Ｈｉｓ₁₄，Ｉｌｅ₃₉，Ｌｅｕ
₄₈，Ｌｙｓ₃₈，Ｍｅｔ₁₉，Ｐｈｅ₃₂，Ｐｒｏ₃₃，Ｓｅｒ
₄₅、アセチルＳｅｒ₁ ，Ｔｈｒ₄₅，Ｔｒｐ₁₅，Ｔｙ
ｒ ₂₉，Ｖａｌ₇₀。この分子のポリペプチド部分の分子量
は８０，４８８と計算された。１．５％の炭水化物を加
えると、ヒト第ＸIII 因子のａサブユニット各々に対し
約８１，７００の分子量となる。これはＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動により推定される７５，０００の値
（チュンら、ｉｂｉｄ．）とよく一致する。

【００８６】トロンビンによる第ＸIII 因子の活性化
は、この分子のａサブユニットのアミノ末端から活性化
ペプチドが開裂することによる（シュワルツら、前
掲）。６種のｃＤＮＡクローンすべてからの第ＸIII 因
子のａサブユニットのアミノ末端配列は、第３４の残基
における追加のＶａｌを除いてタカギ及びドーリットル
（ｉｂｉｄ．）により報告されたものと同じであった。
従って、ｃＤＮＡのデータは３６個のアミノ酸ではな
く、むしろ３７個の活性化ペプチドに基づく。ウシの第
ＸIII 因子のａサブユニットは３４位においてＶａｌの
かわりにＬｅｕ残渣を含み、活性化ペプチドは長さ３７
個のアミノ酸である（ナカムラら、前掲）。

【００８７】第ＸIII 因子のａサブユニットのカルボキ
シ末端残基はＭｅｔと同定され、それはウシの分子のも
のと同じである。しかし第ＸIII 因子のアミノ及びカル
ボキシ末端配列の両方とも、全く組織トランスグルタミ
ナーゼのものとは異る（コネラン（Ｊ．Ｍ．Ｃｏｎｎｅ
ｌｌａｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６巻、１
０９３〜１０９８頁、１９７２年）。

【００８８】血漿第ＸIII 因子及び組織トランスグルタ
ミナーゼの活性サイトにおけるアミノ酸配列はそれぞれ
Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ及びＴｙｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐと同定された（クック（Ｃｏｏ
ｋｅ）、前掲；フォルク及びコール（Ｊ．Ｅ．Ｆｏｌｋ
ａｎｄ Ｐ．Ｗ．Ｃｏｌｅ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４１巻、３２３８〜３２４０頁、１９６６
年）。

【００８９】ｃＤＮＡ及びアミノ酸配列分析の結果はＴ
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐの活性サイト配
列がＴｙｒ３１１から始まることを示している。アップ
ルマッキントッシュコンピューターを用い、テキストコ
（Ｔｅｘｔｃｏ）のコンピュータープログラムにより、
ＤＮＡ配列を分析した。ディホッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）
プログラムを用いたコンピューター分析（ディホッフ
ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１巻、５２４〜５４
５頁、１９８３年）はヒト第ＸIII因子のａサブユニッ
トのアミノ酸配列が独特であり、トランスグルタミナー
ゼの活性サイト及び少数の配列がアセチルコリンレセプ
ターのγサブユニットと相同である以外は他のどの蛋白
質とも明確な相同はみられなかった。

【００９０】実施例 II ヒト第ＸIII 因子のｂサブユニットをコードしているｃ
ＤＮＡのクローニング Ａ．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング ヒト肝ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを含有するλｇｔ
II発現ライブラリーから、 ¹²⁵Ｉで標識し、アフィニテ
ィ精製したウサギ抗体を用いて、ヒト第ＸIII因子のｂ
サブユニットをスクリーニングした。この精製抗体を、
Ｎａ ¹²⁵Ｉで比活性４×１０⁶ cpm／μｇに標識し、こ
れを用いて、１５０mmのプレート当たり１．５×１０⁵
個のプラーク密度でおおっているファージ含有フィルタ
ーをスクリーニングした。２×１０⁶ 個のファージをス
クリーニングして、９個の陽性クローンを単離し、その
後各クローンをプラーク精製した。

【００９１】Ｂ．ｃＤＮＡ挿入部のＤＮＡ配列 液体培養溶菌法〔シルハヴィ（Ｓｉｌｈａｖｙ）等、同
書〕により、ファージＤＮＡを陽性クローンから調製し
た。このファージＤＮＡを遠心分離し、塩化セシウムス
テップ勾配でバンドを形成した。最も大きなｃＤＮＡ挿
入部（約２．２キロベース）を有するクローンを、λＨ
ＦＸIII ｂ２．２と命名し、それをその後の研究に用い
た。λＨＦＸIII ｂ２．２から得たファージＤＮＡを、
ＥｃｏＲＩで切断し、２．２kbのｃＤＮＡ挿入部を単離
した。

【００９２】ＥｃｏＲＩで消化して線状化したプラスミ
ドｐＵＣ９にサブクローニングし、プラスミドｐＵＣ９
ｂ２．２（ＡＴＣＣ寄託番号第４０２６０号）を造成し
た。その後、この挿入部からの適当な制限断片を、Ｍ１
３ｍｐ１０あるいはＭ１３ｍｐ１８にサブクローニング
して、〔α³⁵Ｓ〕ｄＡＴＰ及び緩衝液勾配ゲル〔ビギン
（Ｂｉｇｇｉｎ）等、同書〕を用いて、ジデオキシ法
〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、同書〕により配列を決
定した。ヌクレアーゼＢＡＬ−３１で制御された消化を
行い、制限断片と重複する配列を与える適当な断片を生
成した。全ての配列決定を、ＤＮＡの両方の鎖について
少なくとも３回行った。

【００９３】その結果、ｃＤＮＡが、血液を循環する第
ＸIII 因子のｂサブユニットのアミノ酸配列全体をコー
ドする２１８０塩基対から構成されていることが判明し
た（図６〜１０参照）。成熟サブユニットは、アミノ末
端Ｇｌｕ（ヌクレヌトチド５６〜５８）から始まる６４
１個のアミノ酸から構成されている。ヒト第ＸIII 因子
のｂサブユニットに関するアミノ末端配列Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｘ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏは、既に高木及びドーリトリ（Ｄｏ
ｏｌｉｔｔｌｅ）（前掲）により決定されていたが、本
発明により更に広範囲の配列が決定された。

【００９４】カルボキシル末端Ｔｈｒ（ヌクレヌトチド
１９７９〜１９８１）の次には、停止コドン（ＴＡ
Ｇ）、１８７塩基対の非コード配列及び９塩基対のポリ
（Ａ）テイルが続いている。ポリアデニル化あるいはプ
ロセシングシグナルＡＡＴＡＡＡが、ポリ（Ａ）テイル
から１９のヌクレヌトチド上流に確認された。ｃＤＮＡ
クローンは、リーダーペプチドの一部分を構成する１９
個のアミノ酸残基をもコードしている。１９個のアミノ
酸の部分リーダー配列には、典型的な疎水性コアー及び
ポジション−１のＡｌａ残基並びにポジション−３のＬ
ｅｕ残基が含まれている。これらの残基は、ポジション
−１がシグナル配列におけるＡｌａにより主に占められ
る「−１及び−３ルール」と一致する〔ディ・パールマ
ン及びエイチ．オー．ハルヴォソン（Ｄ．Ｐｅｒｌｍａ
ｎ ａｎｄ Ｈ．Ｏ．Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ）、ジェイ・
モレク・バイオル（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ）、１６
７，３９１〜４０９（１９８３）；ジィー・フォンハイ
ネ（Ｇ．ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ）、ジェイ・モレク・バイ
オル（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ）、１７３，２４３〜
２５１（１９８４）参照〕。その後、インタクトなタン
パク質のアミノ酸配列の解析を、ベックマンシークエネ
ーターで行い、１９個のアミノ酸が確認された。これ
は、高木及びドーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、前掲
により最初に報告されたアミノ末端配列を延長したもの
である。

【００９５】Ｃ．アミノ酸配列 ヒト第ＸIII 因子のｂサブユニットの臭化シアン断片に
ついてもアミノ酸配列の解析を行った。カーチス（Ｃｕ
ｒｔｉｓ）及びローランド（Ｌｏｒａｎｄ）、上掲、の
方法に準じて、第ＸIII 因子をヒト血漿から精製した。
トロンビンと共にインキュベーションした後、ゲル濾過
により、ａサブユニットから第ＸIII 因子のｂサブユニ
ットを分離した。次に、精製ｂサブユニット（１０mg）
を、Ｓ−ピリジルエチル化〔エム・フリードマン（Ｍ．
Ｆｒｉｅｄｍａｎ）等、ジェイ・バイオル・ケム（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４５，３８６８〜３８７１
（１９７０）し、その後、臭化シアンで消化した。得ら
れた断片を分離し、上述の実施例Ｉ．Ｃ．に述べた方法
に準じて精製した。

【００９６】ｃＤＮＡから得られたアミノ酸配列より推
測された１０個の臭化シアン断片のうちの９個が単離さ
れた。それらは、タンパク質のアミノ末端からカルボキ
シル末端の方向に番号を付けた時の、臭化シアン断片１
〜４及び６〜１０に相当した（図１１参照）。その後、
これらの各断片を、実施例Ｉ．Ｃ．に述べた方法によ
り、アミノ酸配列の解析を行い、合計で２９９個の残基
が正確に確認された。これらのアミノ酸配列は、ｃＤＮ
Ａ、及びインタクトなタンパク質のアミノ末端配列の解
析により推定したものと完全に一致した。

【００９７】第ＸIII 因子のｂサブユニットは、６４１
個のアミノ酸残基からなり、次の組成を有している：Ａ
ｌａ₁₇，Ａｒｇ₂₆，Ａｓｎ₃₀，Ａｓｐ₂₂，１／２ Ｃｙ
ｓ₄₀，Ｇｌｎ₂₀，Ｇｌｕ₆₀，Ｇｌｙ₄₈，Ｈｉｓ₁₈，Ｉｌ
ｅ₂₉，Ｌｅｕ₄₇，Ｌｙｓ₄₄，Ｍｅｔ₉ ，Ｐｈｅ₂₀，Ｐｒ
ｏ₄₁，Ｓｅｒ₄₅，Ｔｈｒ₄₄，Ｔｒｐ₁₀，Ｔｙｒ₄₂，Ｖａ
ｌ₂₉。ポリペプチド部分の分子量を計算したところ６
９，９７３であった。炭水化物が８．５％付加すると、
ヒト第ＸIII 因子の各ｂサブユニットの分子量は約７
６，５００になる。この分子量は、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動により推定した分子量８０，０００
とよく一致した〔シュワルツ（Ｓｃｗａｒｔｚ）等、同
書；チォン（Ｃｕｎｇ）等、前掲〕。

【００９８】ｃＤＮＡから推定されたタンパク質の配列
には、アミノ酸残基１４２及び５２５からそれぞれ始ま
る、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ及びＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒの配列を有する２個の潜在的Ａｓｎ結合グリコシル化
部位が含まれている。更に、三番めの潜在的炭水化物結
合部位が、残基２５２から始まるＡｓｎ−Ａｒｇ−Ｃｙ
ｓの配列に存在する。Ａｓｎ−ｘ−Ｃｙｓの配列におけ
るＡｓｎ残基への炭水化物鎖の結合は、最初に牛プロテ
インＣにおいて報告され〔ジェイ・ステンフロ（Ｊ．Ｓ
ｔｅｎｆｌｏ）及びピー・フェルンランド（Ｐ．Ｆｅｒ
ｅｎｌｕｎｄ）、ジェイ・バイオル・ケム（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７，１２１８０〜１２１８５
（１９８２）〕、その後、ヒト・フォン・ビルブランド
因子において報告された〔ケイ・チタニ（Ｋ．Ｔｉｔａ
ｎｉ）等、バイオケム（Ｂｉｏｃｈｅｍ）、２５，３１
７１〜３１８４（１９８６）〕。

【００９９】これらのＡｓｎ残基の特異的なグリコシル
化は、一部分、ヒト第ＸIII 因子のｂサブユニットのミ
クロヘトロゲナイティーの原因になるものと思われる
〔シー・ジー・カーチス（Ｃ．Ｇ．Ｃｕｒｔｉｓ）等、
バイオケム（Ｂｉｏｃｈｅｍ）、１３，３７７４〜３７
８０（１９７４）；ピー・ジー・ボード（Ｐ．Ｇ．Ｂｏ
ａｒｄ）、アム・ジェイ・ヒューム・ジェネテ（Ａｍ．
Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）、３２，３４８〜３５３
（１９８０）〕。第ＸIII 因子のｂサブユニットをコー
ドするｃＤＮＡにより確認された２０個の潜在的ジスル
フィド結合は、以前に報告された１６〜１７個のジスル
フィド結合とかなりよく一致する〔チュン（Ｃｕｎｇ）
等、前掲）。又、第ＸIII 因子のｂサブユニットには、
遊離の−ＳＨ基がない。

【０１００】第ＸIII 因子のｂサブユニットのアミノ酸
配列は、約６０個のアミノ酸の反復配列１０個を含むか
なりの内部遺伝子重複があることを裏付けている。これ
らの反復配列を、４つの別個のグループに下位分類した
（図１２参照）。グループ１，２，３及び４内の同一性
は、それぞれ、３４〜４２％，３４〜４２％，３８％及
び４１％であった。４つのグループの反復の間の同一性
は、明らかに各内部同一性よりも小さいが、デイホッフ
（Ｄａｙｈｏｆｆ）プログラムを用いた時の整列スコア
〔デイホッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）等、同書〕が高く、こ
れらの４つのグループが一つのプロトタイプから分かれ
たものであることを示している。

【０１０１】例えば、反復３及び４の間の整列スコアは
７．７、反復５及び７の間の整列スコアは１２．１、反
復６及び８の間の整列スコアは３．４であった。１０個
の反復（１〜１０）は、分子の９８％を通じて連続して
整列しており、１〜６２６個のアミノ酸残基を含んでい
る。分子のカルボキシル未満での最後の反復に続く１５
個のアミノ酸（残基６２７〜６４１）からなる短い配列
は、反復１〜１０とは相同ではなかった。

【０１０２】デイホッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）プログラム
を用いたコンピューターでの解析により、第ＸIII 因子
のｂサブユニットにおける反復配列は、ヒト補体の因子
ＢのＢａ鎖に存在する３つの反復セグメント〔ジェイ・
イー・モレ（Ｊ．Ｅ．Ｍｏｌｅ）等、ジェイ・バイオル
・ケム（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５９，３４０
７〜３４１２（１９８４）、ヒトβ₂ −グリコプロテイ
ンＩ中の５つのセグメント〔ジェイ・ロッツェル（Ｊ．
Ｌｏｚｉｅｒ）等、プロク・ナチュル・アカド・サイ・
ユーエスエイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ）、８１，３６４０〜３６４４（１９８
４）〕、活性プロテインＣ結合プロテインと同一のｌａ
プロテイン〔ダブリュ・エム・キャンフィールド（Ｗ．
Ｍ．Ｃａｎｆｉｅｌｄ）及びダブリュ・キシール（Ｗ．
Ｋｉｓｉｅｌ）、ジェイ・クリン・インベスト（Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、７０，１２６０〜１２７２
（１９８２）及びヒトハプトグロビンα¹ 鎖〔エー・ク
ロスキー（Ａ．Ｋｕｒｏｓｋｙ）等、プロク・ナチュル
・アカド・サイ・ユーエスエイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７７，３３８８〜３３９
２（１９８０）〕に非常に類似している種類の反復に入
る。

【０１０３】この配列の相同性を図１１に示す。β₂ −
グリコプロテインＩの４番目のセグメント、補体因子Ｂ
ａの２番目のセグメント及びヒトハプトグロビンα¹ 鎖
は、ヒト第ＸIII 因子のｂサブユニットの反復６と最も
高い整列スコア（それぞれ１１，８．０及び４．２）を
示す。これらのデータは、これらの４つのタンパク質が
共通の系統を有し、おそらく、進化の過程でエクソン・
シャッフリング（ｅｘｏｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によ
り生じたものであることを示している。

【０１０４】β₂ −グリコプロテインＩの５つの相同セ
グメントにおける５個のジスルフィド結合の位置を決定
し、それらの結合が各セグメントの第１及び第３ Ｃｙ
ｓ残基の間、並びに第２及び第４ Ｃｙｓ残基の間で生
じることが示されている〔ロッツェル（Ｌｏｚｉｅ
ｒ）、前掲〕。従って、第ＸIII 因子のｂサブユニット
における１０個の反復のジスルフィド結合で同様な対が
生じているものと思われる。

【０１０５】実施例 III プロモーターのクローニング及びサブクローニング Ａ．ｐＭＶＲ１の造成 次のベクターの造成におけるＴＰＩ１プロモーターの起
源として用いられるプラスミドｐＭＶＲ１は、ベクター
ｐＩＣ７Ｒ１中のＴＰＩ１プロモーター、α−１−アン
チトリプシン（ＡＡＴ）ｃＤＮＡ及びＴＰＩ１ターミネ
ーターを含む。プラスミドｐＭＶＲ１は次のように造成
された（図１３）。

【０１０６】プラスミドｐＩＣ７（Ｍａｒｓｈ等、Ｇｅ
ｎｅ ３２：４８１〜４８６，１９８４）をＥｃｏＲＩ
で消化し、そのフラグメント端をＤＮＡポリメラーゼＩ
（クレノウフラグメント）で平滑化し、そしてその線状
ＤＮＡを、Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて再び環状化し
た。その生成プラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ株ＲＲＩ
を形質転換した。プラスミドＤＮＡをその形質転換細胞
から調製し、そしてＥｃｏＲＩ部位の損失についてスク
リーニングした。正しい制限パターンをもつプラスミド
はｐＩＣ７Ｒ１と呼ばれた。ＴＰＩ１プロモーターフラ
グメントはプラスミドｐＴＰＩＣ１０（Ａｌｂｅｒ及び
Ｋａｗａｓａｋｉ、前掲）から得られた。

【０１０７】このプラスミドを、ＴＰＩ１遺伝子内のユ
ニークＫｐｎＩ部位で切断し、そしてそのＴＰＩ１をコ
ードする領域を、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１での処理に
よって除去した。キナーゼ処理されたＥｃｏＲＩリンカ
ー（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）をそのフラグメントに付加し、
次いでそのフラグメントをＢｇｌII及びＥｃｏＲＩで消
化し０．９kbのＴＰＩ１プロモーターフラグメントを得
た。このフラグメントをＢｇｌII及びＥｃｏＲＩで切断
されているプラスミドＹＲｐ７′（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍ
ｂ等、Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９〜４３，１９７９）
に連結した。

【０１０８】その生成プラスミドｐＴＥ３２、をＥｃｏ
ＲＩ及びＢａｍＨＩで開裂させてテトラサイクリン耐性
遺伝子の一部を取り出した。その線状化されたプラスミ
ドを次いで、キナーゼ処理されたＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉオリゴヌクレオチドアダプター（５′ＡＡＴ ＴＣＡ
ＴＧＧ ＡＧ３′及び５′ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＣＡＴ
Ｇ３′）の付加によって再び環状化させた。その生成プ
ラスミドｐＴＥＡ３２、をＢｇｌII及びＥｃｏＲＩで消
化して、９００bpのＴＰＩ１プロモーターフラグメント
を単離した。

【０１０９】このフラグメントを、ＢｇｌII及びＥｃｏ
ＲＩでの消化によって線状化されているｐＩＣ１９Ｈ
（Ｍａｒｓｈ等、前掲）と連結した。その生成プラスミ
ドはｐＩＣＴＰＩと呼ばれた。プラスミドｐＦＡＴＰＯ
Ｔ（株Ｅ１８にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換細胞
として寄託されている、ＡＴＣＣ No. ２０６９９）を
ＳｐｈＩ及びＨｉｎｄIII で消化して、部分的なＴＰＩ
１プロモーター、ｃＤＮＡをコードするヒトα−１−ア
ンチトリプシン、及びＴＰＩ１ターミネーターを含む１
７５０bpのフラグメントを単離した。

【０１１０】プラスミドｐＩＣＴＰＩをＮａｒＩ及びＳ
ｐｈＩで消化し、部分的なＴＰＩ１プロモーター及びｌ
ａｃＺ′をコードする配列を含む１．１kbのフラグメン
トを単離した。プラスミドｐＩＣ７ＲＩをＨｉｎｄIII
及びＮａｒＩで消化し、２．５kbのベクターフラグメン
トを単離した。そのｐＩＣ７ＲＩフラグメント、プラス
ミドｐＩＣＴＰＩから誘導された部分的なＴＰＩ１プロ
モーターフラグメント及びプラスミドｐＦＡＴＰＯＴか
ら誘導された１．７５kbのフラグメントを３つの部分の
連結反応で連結してプラスミドｐＭＶＲ１を製造した。

【０１１１】Ｂ．ｐＴＲＫ４ｃの造成 ＡＤＨ２−４^C プロモーターをプラスミドｐＢＲ３２２
−ＡＤＲ２−ＢＳａ（Ｖ．Ｍ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ
等、Ｃｅｌｌ ２３：６０５〜６１４，１９８１）及び
ＹＲｐ７−ＡＤＲ３−４^C （Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ
等、前掲）から誘導した。ＥｃｏＲＩ部位を、生体外で
の変異誘発によって、プラスミドｐＢＲ３２２−ＡＤＲ
２−ＢＳａから誘導されたＡＤＨ２プロモーターの翻訳
開始コドンに対してちょうど３′に配置した。変異誘発
に続いて、ＡＤＨ２−４^C 表現型を与える５′フランキ
ング配列を用いて、ＡＤＨ２プロモーターの類似の配列
を置き換えた。

【０１１２】ＡＤＨ２構造遺伝子及び５′フランキング
配列を含有するｐＢＲ３２２−ＡＤＲ２−ＢＳａからの
２．２kbのＢａｍＨＩフラグメントを、ＢａｍＨＩで線
状化されたＭ１３ｍｐ１９と連結反応させた。その挿入
方向は制限分析によって決定された。生成したファージ
クローンから一本鎖鋳型ＤＮＡを作った。部位特異的生
体外変異誘発（Ｍ．Ｊ．Ｚｏｌｌｅｒ及びＭ．Ｓｍｉｔ
ｈ，ＤＮＡ ３：４７９〜４８８，１９８４）を、オリ
ゴヌクレオチドＺＣ２３７（第１表）を用いて、上記の
鋳型で実施することにより、ＡＤＨ２遺伝子の構造部分
をループアウトし、翻訳開始シグナルを含有する５′側
面配列をＭ１３ｍｐ１９ポリリンカーのＥｃｏＲＩ部位
と融合させた。

【０１１３】変異誘発されたファージの複製型分子を作
りそしてＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断して１．２kb
のプロモーターフラグメントを単離した。このフラグメ
ントを、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩでの消化によって線
状化されているｐＵＣ１３中に連結してプラスミドｐ２
３７ＷＴを形成した。ｐ２３７ＷＴプロモーターを“プ
ロモーターアップ”突然変異体ＡＤＨ２−４^C に変化さ
せるために、ＹＲｐ７−ＡＤＲ３−４^C からの１．１kb
のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ部分的プロモーターフラグメン
トを、ＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで切断されたｐ２３７Ｗ
Ｔのベクターフラグメントにサブクローニングした。そ
の生成プラスミドはｐ２３７−４^C と呼ばれた。

【０１１４】

【表１】

【０１１５】図１４を参照にして、ｐ２３７ＷＴからの
ＡＤＨ２プロモーターを変性させて“ユニバーサル”Ａ
ＤＨ２プロモーターを作った。そのプロモーターを最初
にプラスミドｃＣＰＯＴ（Ｅ．Ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１形
質転換細胞としてＡＴＣＣに寄託されたもの、ＡＴＣＣ
No. ３９６８５）にサブクローニングした。それは完
全な２ミクロンプラスミドＤＮＡ、ｌｅｕ２−ｄ遺伝
子、ｐＢＲ３２２ベクター配列及びシゾサッカロミセス
・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｐｏｍｂｅ）ＰＯＴ１遺伝子を含んでいる。

【０１１６】プラスミドｐＣＰＯＴをＢａｍＨＩ及びＳ
ａｌＩで完全消化し、ほぼ１０ｋｂの線状ベクターフラ
グメントを単離した。プラスミドｐＭＶＲＩ（実施例II
I ．Ａ．）をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断して１．５
ｋｂのＡＡＴ ｃＤＮＡ−ＴＰＩ１ターミネーターフラ
グメントを単離した。１．２ｋｂのＡＤＨ２プロモータ
ーフラグメントをプラスミドｐ２３７ＷＴからＢａｍＨ
Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして単離し、そして１．
５ｋｂのＡＡＴ ｃＤＮＡ−ＴＰＩ１ターミネーターフ
ラグメント及び線状化されたｐＣＰＯＴと、３部分連結
反応で連結反応してｐＡＴ−１と呼ばれるプラスミドを
得た。

【０１１７】プラスミドｐＡＴ−１中に存在するＡＤＨ
２プロモーターを次いで、翻訳開始コドンの除去及びＥ
ｃｏＲＩ部位へのプロモーターの融合によって変形して
“ユニバーサル”プロモーターを作った。プラスミドｐ
ＡＴ−１をＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＡＡＴ
ｃＤＮＡのＳｐｈＩ部位からＢａｍＨＩ部位までのＡＤ
Ｈ２プロモーターを含む１９０bpのフラグメントを単離
した。このフラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで
の消化によって線状化されているＭ１３ｍｐ１８中に連
結した。

【０１１８】陽性クローンを制限分析によって確認し
た。鋳型ＤＮＡをその陽性クローンから作った。オレゴ
ヌクレオチドＺＣ４１０（第１表）は、ＡＤＨ２翻訳開
始シグナル及びｐＵＣ１８ポリリンカー配列をＳｍａＩ
部位でＭ１３ｍｐ１８ポリリンカーに融合した単一のＥ
ｃｏＲＩ部位により置き換るように設計されている。そ
の鋳型を、オリゴヌクレオチドＺＣ４１０及びＺＣ８７
（第１表）を用いる２プライマー法（Ｚｏｌｌｅｒ及び
Ｓｍｉｔｈ、同書、１９８４）を用いて生体外変異誘発
にかけた。

【０１１９】陽性クローンを融合点までのジデオキシ配
列決定によって確認した。操作を容易にするために、１
７５bpのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ変異されたプロモーター
フラグメントを、ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで線状化され
ているｐＵＣ１９に連結した。ｐ４１０ＥＳと呼ばれる
その生成したプラスミドは“ユニバーサル”ＡＤＨ２プ
ロモーターの３′部分を含む。

【０１２０】“ユニバーサル”ＡＤＨ２−４^C プロモー
ターを、ｐ４１０ＥＳからの変異誘発されたＡＤＨ２プ
ロモーターフラグメント及びｐ２３７−４^C からのＡＤ
Ｈ２−４^C プロモーターフラグメントを用いて造成し
た。プラスミドｐ４１０ＥＳをＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩ
で消化して１７５bpの部分的ＡＤＨ２プロモーターフラ
グメントを単離した。プラスミドｐ２３７−４^C をＢａ
ｍＨＩ及びＳｐｈＩで切断して１kbの部分的ＡＤＨ２−
４^C プロモーターフラグメントを単離した。

【０１２１】そのＡＤＨ２−４^C プロモーターをｐ２３
７−４^C からのＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩプロモーターフラ
グメント、ｐ４１０ＥＳからのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩプ
ロモーターフラグメント、及びＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲ
Ｉでの消化によって線状化されているｐＵＣ１３を用い
ての３部分連結反応で再構成した。その生成プラスミド
であるｐ４１０−４ｃは“ユニバーサル”ＡＤＨ２−４
^C プロモーターを含んでいた。

【０１２２】図１５に説明されているように、プラスミ
ドｐ４１０−４^C からのその“ユニバーサル”プロモー
ターを用いて、プラスミドｐＭＶＲ１（実施例III ．
Ａ．）中に存在しているＴＰＩ１プロモーターを置き換
えた。プラスミドｐ４１０−４ ^C をＢａｍＨＩ及びＥｃ
ｏＲＩで切断して１．２kbのＡＤＨ２−４^C プロモータ
ーフラグメントを単離した。プラスミドｐＭＶＲ１をＢ
ａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断して１．２kbのＡＤＨ２
−４^C プロモーターフラグメントを単離した。プラスミ
ドｐＭＶＲ１をＥｃｏＲＩで完全に消化し且つＢｇｌII
で部分的に消化して４．２kbのＡＡＴ−ＴＰＩ１ターミ
ネーター・ベクターフラグメントを単離した。これらの
２つのフラグメントを連結してｐＴＲＫ４ｃと呼ばれる
プラスミドを生成させた。

【０１２３】実施例 IV ベクターｐＥＡＳ１０２の造成 ベクターＹＩｐ５及びｐＪＤＢ２０７の各々の一部を含
むプラスミドｐＥＡＳ１０２を次のようにして造成し
た。ｐＪＤＢ２１９（Ｊ．Ｄ．Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔｕｒ
ｅ ２７５：１０４〜１０８，１９７８）の誘導体であ
るプラスミドｐＪＤＢ２０７（Ｊ．Ｄ．Ｂｅｇｇｓ，Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ａｌｆｒｅｄ Ｂｅｎｚ
ｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ １６：３８３〜３８９，
“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｙｅ
ａｓｔ”デンマーク国コペンハーゲン、１９８１）をＢ
ａｍＨＩ及びＰａｔＩで消化し、ｌｅｕ２−ｄ遺伝子及
び２ミクロンＤＮＡ及びｐＢＲ３２２配列を含む４．４
kbのフラグメントを単離した。プラスミドＹＩｐ５（Ｓ
ｔｒｕｈｌ等、前掲）をＰｓｔＩでの部分消化及びＢａ
ｍＨＩでの完全消化にかけ、ＵＲＡ３遺伝子及びｐＢＲ
３２２配列を含む４．３kbのフラグメントを単離した。
これらの２つのフラグメントを連結した。その生成プラ
スミドはｐＥＡＳ１０２（図１７に説明されている）と
呼ばれた。

【０１２４】実施例 Ｖ 酵母中での第ＸIII 因子ａサブユニットの発現 Ａ．ｐＲＳ２０２の造成 第ＸIII 因子ａサブユニット（ａｓＦ ＸIII ）ｃＤＮ
Ａを、生体外変異誘発によって変形して、３′非−コー
ド領域をＸｈｏＩ部位で置き換えた（図１６）。操作を
容易にするために、ファージクローンλＨＦ ＸIII ａ
３．８２中に含まれる３．８kbのａｓＦ ＸIII ｃＤＮ
Ａ挿入部をｐＵＣ１８中にサブクローニングした。ファ
ージクローンλＨＦ ＸIII ａ３．８２をＰｓｔＩで完
全消化してａｓＦ ＸIII ｃＤＮＡを含む２．３kbのフ
ラグメントを単離した。

【０１２５】このフラグメントを、ＰｓｔＩでの消化に
よって線状化されているｐＵＣ１８と連結した。その生
成プラスミドであるｐＵＣ１８＃９は、アンチセンス方
向に２．３kbのＰｓｔＩ挿入部をもっていると決定され
た。ｐＵＣ１８＃９中に存在するａｓＦ ＸIII ｃＤＮ
Ａ挿入部は翻訳開始部への５′側１９bp、ａｓＦ ＸII
I をコードする領域、及び翻訳終止部への３′側１２０
bpを含んでいた。

【０１２６】そのａｓＦ ＸIII ｃＤＮＡ挿入部を次い
で単離し、そしてベクターｐＵＣ１１８（Ｊ．Ｖｉｃｉ
ｒａ及びＪ．Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｗａｋｓｍａｎ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｕ
ｔｇｅｒｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから得られた
もの）にサブクローニングした。２．３kbのａｓＦＸII
I 挿入部をＰｓｔＩでの消化によってｐＵＣ１８＃９か
ら単離し、ｐＵＣ１１８のＰｓｔＩ部位にサブクローニ
ングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９に形質転換し
た。２．３kbのａｓＦ ＸIII 挿入部をアンチセンス方
向に含んでいる陽性クローンはｐＲＳ２０１と呼ばれ
た。

【０１２７】ａｓＦ ＸIII ｃＤＮＡの１２０bpの３′
非翻訳領域を除去し、そしてＸｈｏＩ部位を部位特定突
然変異誘発によって翻訳停止コドンに対して３′に挿入
した。プラスミドｐＲＳ２０１をＥ．Ｃｏｌｉ株ＭＶＩ
１９３に形質転換し、そして一本鎖鋳型ＤＮＡを単離し
た。オリゴヌクレオチドＺＣ１１１３（第１表）は、ａ
ｓＦ ＸIII をコードする配列に続く３′非翻訳領域を
除去し、そして翻訳終止部位の３′側にＸｈｏＩ部位を
導入するように設計されている。ｐＲＳ２０１の一本鎖
鋳型を、突然変異誘発オリゴヌクレオチドＺＣ１１１３
を用いてのＺｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈの方法（１９８
４、同書）によって生体外変異誘発にかけた。制限分析
によって確認された陽性クローンはｐＲＳ２０２と呼ば
れた。

【０１２８】Ｂ．プラスミドｐＲＳ２１７の造成 図１７に示されているように、プラスミドｐＲＳ２０２
からの２．２kbのａｓＦ ＸIII ｃＤＮＡフラグメント
をＡＤＨ２−４ｃプロモーターの後３に配置し、そして
プラスミドｐＥＡＳ１０２（実施例IV）中に配置した。
プラスミドｐＴＲＫ４ｃ（実施例III ．Ｂ．）をＥｃｏ
ＲＩ及びＳａｌＩで完全消化し、ＡＤＨ２−４^C プロモ
ーター、ＴＰＩ１ターミネーター及びｐＩＣ７Ｒ１ベク
ター配列を含む４kbのフラグメントを単離した。オリゴ
ヌクレオチドＺＣ１０５６及びＺＣ１０５７（第１表）
は、ＥｃｏＲＩ付着末端、ＢｇｌII部位及びＰｓｔＩ付
着末端を有するアダプターを形成するように設計されて
いる。

【０１２９】アダプターのＥｃｏＲＩ付着端は、その他
のＥｃｏＲＩ付着端への連結の後、ＥｃｏＲＩ部位を破
壊する。オリゴヌクレオチドＺＣ１０５６及びＺＣ１０
５７をキナーゼ処理し且つアニーリング処理してＥｃｏ
ＲＩアダプターを形成させた。プラスミドｐＲＳ２０２
（実施例Ｖ．Ａ．）から単離した２．２kbのＰｓｔＩ−
ＸｈｏＩ ａｓＦ ＸIII フラグメントを３部分連結反
応でＺＣ１０５６／１０５７アダプター及び４kbのｐＴ
ＲＫ４ｃフラグメントと連結させた。その生成プラスミ
ドはｐＲＳ２１５と呼ばれた。

【０１３０】ｐＲＳ２１５中に存在する発現ユニットを
酵母ベクターｐＥＡＳ１０２中に配置した。プラスミド
ｐＥＡＳ１０２をＨｉｎｄIII で完全消化し、次いで細
菌性アルカリ性ホスファターゼで処理して再環状化を防
止した。プラスミドｐＲＳ２１５をＨｉｎｄIII で消化
し、ＡＤＨ２−４ｃプロモーター、ａｓＦ ＸIII ｃＤ
ＮＡ及びＴＰＩ１ターミネーターを含む３．５kbの発現
ユニットを単離した。これらの２つのフラグメントを一
緒に連結してプラスミドｐＲＳ２１７を作った。

【０１３１】プラスミドｐＲＳ２１７を、Ｂｅｇｇｓに
よって記載された方法（Ｎａｔｕｒｅ ２７５：１０４
〜１０８，１９７８）と本質的に同じ方法を用いてサッ
カロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＸＶ７９４−７−１Ｃ
（ＭＡＴａ ａｄｅ２−１ ｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−
１１３ ｕｒａ３ Δｐｅｐ４：：ＴＰＩ−ＣＡＴ ｃ
ｉｒ±）に形質転換した。形質転換細胞を、ウラシルを
欠いている合成培地（−ＵｒａＤ）で増殖する能力につ
いて選択した。

【０１３２】株ＸＶ７９４−７−１Ｃに形質転換したｐ
ＲＳ２１７プラスミドからの第ＸIII 因子ａサブユニッ
トの発現は、最初にその形質転換細胞を一晩５mlの−Ｕ
ｒａＤ中で増殖させることによって達成された。その一
晩の培養物を１ｌの−ＵｒａＤ中に接種し、そして３０
℃で４８時間増殖させた。その培養物を遠心分離して細
胞ペレットを得、それを一度蒸留水で洗浄し、そして−
８０℃で貯蔵した。

【０１３３】細胞ペレットを実施例ＸＩで記載したよう
にして活性第ＸIII 因子のサブユニットについて検定し
た。ｐＲＳ２１７で形質転換されたＸＶ７９４−７−１
Ｃ細胞は１ｌ当り５０mgの第ＸIII 因子ａサブユニット
をもたらした。 Ｃ．プラスミドｐＲＳ２１６の造成 図１７に示されているように、プラスミドｐＲＳ２０２
からの２．２kbのａｓＦ ＸIII ｃＤＮＡフラグメント
をＴＰＩ１プロモーターの後に配置しそしてプラスミド
ｐＥＡＳ１０２（実施例IV）中に挿入した。プラスミド
ｐＭＶＲ１（実施例III ．Ａ．）をＥｃｏＲＩ及びＳａ
ｌＩで完全消化して、ＴＰＩ１プロモーター、ＴＰＩ１
ターミネーター及びｐＩＣ７ＲＩベクター配列を含む
３．７kbのフラグメントを単離した。

【０１３４】プラスミドｐＲＳ２０２（実施例Ｖ．
Ａ．）をＰａｔＩ及びＸｈｏＩで消化して２．２kbのａ
ｓＦ ＸIII フラグメントを単離した。その２．２kbの
ａｓＦＸIII フラグメント、キナーゼ処理し且つアニー
リング処理したＺＣ１０５６／ＺＣ１０５７アダプター
（実施例Ｖ．Ｂ．）及び線状化されたｐＭＶＲ１を３部
分連結反応で連結してプラスミドｐＲＳ２１４を作っ
た。

【０１３５】ｐＲＳ２１４に存在する発現ユニットを酵
母ベクターｐＥＡＳ１０２中に配置した。プラスミドｐ
ＥＡＳ１０２をＨｉｎｄIII での消化によって線状化
し、そして細菌性アルカリ性ホスファターゼで処理して
再環状化を防止した。プラスミドｐＲＳ２１４をＨｉｎ
ｄIII で消化し、ＴＰＩ１プロモーター、ａｓＦ ＸII
I ｃＤＮＡ及びＴＰＩ１ターミネーターを含む３．２kb
の発現ユニットを単離した。これらの２つのフラグメン
トを一緒に連結してプラスミドｐＲＳ２１６を作った。

【０１３６】酵母宿主細胞を前記したようにして形質転
換しそして増殖させた。ｐＲＳ２１６で形質転換された
ＸＶ７９４−７−１Ｃは、実施例ＸＩで検定されている
ように、１ｌ当り１０mgの活性第ＸIII 因子ａサブユニ
ットをもたらした。実施例 VII 酵母から第ＸIII 因子ａサブユニットの分泌 Ａ．プラスミドｐＲＳ２０３の造成 第ＸIII 因子ａサブユニットタンパク質の分泌を指令し
得る発現ユニットを造成するために、ａｓＦ ＸIII ｃ
ＤＮＡを改変し、分泌シグナル配列の挿入するためのＨ
ｉｎｄIII 部位を翻訳開始部位の３′側に挿入した。

【０１３７】オリゴヌクレオチドＺＣ１２０６（第１
表）は、５′非翻訳領域ＤＮＡの１９bpを除去しそして
翻訳開始部位の３′側にＨｉｎｄIII 部位を挿入するよ
うに設計されている。１本鎖鋳型ＤＮＡを、ｐＲＳ２０
２（実施例Ｖ．Ａ．）で形質転換した大腸菌株ＭＶ１１
９３から調製した。ＺＣ１２０６、及びＺｏｌｌｅｒと
Ｓｍｉｔｈが記載した方法（１９８４、前記文献）、を
用いて、この鋳型を試験管中で変異させた。目的のクロ
ーンは制限酵素切断解析により確認し、これをｐＲＳ２
０３（図１６）と命名した。

【０１３８】Ｂ．最適化されたＭＦα１の造成 コドンが最適化されたＭＦα１のシグナルペプチド配列
を、インシュリン前駆体Ｂ（１−２９）−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ｌｙｓ−Ａ（１−２１）の遺伝子を含む発現ベクタ
ー（Ｍａｒｋｕｓｓｅｎら、ＥＰ １６４ ５２９）か
ら得た。ＭＦａ１シグナルペプチド配列及びインシュリ
ン配列を含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片をｐＭＴ６１０
（Ｍａｒｋｕｓｓｅｎら、上記文献）から得て、これを
ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断したｐＵＣ１１８（図１
８）にクローン化し、１本鎖鋳型ＤＮＡを調製した。

【０１３９】次に、この鋳型に、ＺｏｌｌｅｒとＳｍｉ
ｔｈの方法（１９８４、上記文献）及び変異源であるオ
リゴヌクレオチドＺＣ８６２（第１表）を用いて変異処
理を行った。この処理によって、ＭＦα１シグナルペプ
チド配列の３′末端にＳｓｔＩ部位が生じた。ＭＦα１
シグナルペプチド配列の３′側にＳｓｔＩ部位３′を含
む陽性クローンを選択し、ｐＫＰ２３と命名した。ＭＦ
α１シグナルペプチド配列をプラスミドｐＫＰ２３から
取り出し、ｐＩＣ１９Ｈ（Ｍｏｒｓｈら、「Ｇｅｎｅ」
３２：４８１−４８５，１９８４）に再びクローン化し
た。これで得られたプラスミドをｐＫＰ２４と命名し
た。

【０１４０】ＴＰＩ１プロモーター、ＭＦα１シグナル
ペプチド配列、ヒトＰＤＧＦ Ｂ鎖をコードするＤＮＡ
配列、ＴＰＩ１ターミネーター、及びｐＩＣ１９Ｈベク
ター配列を含んで成るプラスミドｐＢ１２をＥｃｏＲＩ
及びＸｂａＩで切断し、ＭＦα１シグナルペプチド及び
ＰＤＧＦ Ｂ鎖をコードする断片を単離した。ＴＰＩ１
プロモーター、ＭＦα１シグナル配列、Ｖ−ＳＩＳ配
列、ＴＰＩ１ターミネーター発現ユニットを含んで成る
プラスミドｐＫＰ１０は、ＥｃｏＲＩ部位を欠くｐＢＲ
３２２ベクターに挿入されており、このｐＫＰ１０をＥ
ｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断して、ＭＦα１シグナル配
列及びＢ鎖配列を除去した。

【０１４１】ｐＫＰ１０のベクター断片をプラスミドｐ
Ｂ１２由来の断片と連結した。この結果得られたプラス
ミドｐＫＰ２６をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断し、Ｔ
ＰＩ１プロモーター、Ｖ−ＳＩＳ配列、ＴＰＩ１ターミ
ネーター及びｐＢＲ３２２ベクター配列を含んで成る断
片を単離した。プラスミドｐＫＰ２４をＥｃｏＲＩ及び
ＳｓｔＩで切断して、コドンが最適化されたＭＦα１シ
グナルペプチド配列をコードする断片を単離した。コド
ンが最適化されているＭＦα１シグナルペプチドをコー
ドする断片とｐＫＰ２６のＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩベクタ
ー断片とを連結し、プラスミドｐＫＰ２８を造成した。

【０１４２】ｐＫＰ２８を造成しやすくするようにＭＦ
α１シグナルペプチド配列に導入されたＳｓｔＩ部位を
次に除去して、野生型のコード配列を回復させた。プラ
スミドｐＫＰ２８をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断し、
コドンが最適化されたＭＦα１シグナルペプチド配列及
びＰＤＧＦ Ｂ鎖をコードする断片を単離した。この断
片を、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断して線状になった
ｐＵＣ１１８にクローン化した。１本鎖鋳型を単離し、
オリゴヌクレオチドＺＣ１０１９（第１表）を用いたＺ
ｏｌｌｅｒとＳｍｉｔｈの方法（１９８４、前記の文
献）によって変異処理した。目的どおりに変異したプラ
スミドをｐＫＰ３２と命名した。

【０１４３】プラスミドｐＫＰ３２中に存在する、コド
ンが最適化されたＭＦα１シグナルペプチド配列を試験
管内変異により変形し、天然のＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
−Ａｌａ配列及びＭＦα１シグナル配列に見られるＨｉ
ｎｄIII 部位を導入した。ｐＫＰ３２から得た１本鎖鋳
型ＤＮＡを、ＺＣ１０５９（第１表）を用いたＺｏｌｌ
ｅｒとＳｍｉｔｈの方法（１９８４、前記の文献）によ
って変異処理した。陽性コロニーからのＤＮＡをＨｉｎ
ｄIII で切断し、シグナル配列の３′末端へのＨｉｎｄ
III 部位の導入についてスクリーニングした。

【０１４４】続いて、変異の発生を一層確実に調べるた
めに配列を決定した。コドンが最適化されたＭＦα１シ
グナルペプチドについて正しい配列を有する目的のクロ
ーンは、天然のＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ配列及
びＨｉｎｄIII 部位を含んでおり、ｐＲＳ１１１と命名
した。変異したＭＦα１シグナルペプチドをベクターｐ
ＵＣ１１８に再びクローン化した。プラスミドｐＲＳ１
１１をＨｉｎｄIII で切断し、Ｂ鎖を除去した。再び環
化したプラスミドをｐＲＳ１１２（図１８）と命名し
た。

【０１４５】Ｃ．ＭＦα１シグナルペプチドを用いる酵
母より第ＸIII 因子ａサブユニットを分泌させるための
ベクターの造成 ＡＤＨ２−４^C プロモーター、コドンが最適化されたＭ
Ｆα１シグナルペプチド、ａｓＦ ＸIII ｃＤＮＡ、及
びＴＰＩ１ターミネーターを含んで成る発現ユニットを
造成するために、プラスミドｐＴＲＫ４ｃをＡＤＨ２−
４^C プロモーター源及びＴＰＩ１ターミネーター源とし
て使用した。プラスミドｐＴＲＫ４ｃをＥｃｏＲＩ及び
ＳａｌＩで切断し、ＡＤＨ２−４^C プロモーター、ＴＰ
Ｉ１ターミネーター、及びｐＩＣ７ＲＩ^* ベクター配列
を含んで成る４kb断片を単離した。

【０１４６】プラスミドｐＲＳ２０３（実施例VIII．
Ａ．）をＨｉｎｄIII 及びＸｈｏＩで切断し、２．２kb
のａｓＦ ＸIII ｃＤＮＡ断片を単離した。プラスミド
１１２をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII で切断し、０．３
４kbのＭＦα１プロモーター断片を単離した。ｐＴＲＫ
４ｃ断片、ａｓＦ ＸIII ｃＤＮＡ断片、及びＭＦα１
シグナルペプチドの３つの部分をリガーゼによって連結
した。この結果生じたプラスミドをｐＲＳ２３１と命名
した（図１９）。

【０１４７】ｐＲＳ２３１中に存在する発現ユニットを
ベクターＹＥｐ１３及びｐＥＡＳ１０２へ挿入した。プ
ラスミドｐＲＳ２３１をＸｈｏＩで消化して５kbの発現
ユニットを単離した。この断片を、ＸｈｏＩの切断によ
り線状になったＹＥＰ１０に連結した。その結果得られ
たプラスミドをプラスミド２３３と命名した。ｐＲＳ２
３１から単離した５kb ＸｈｏＩ断片を、ＳａｌＩで切
断して線状になったＰＥＡＳ１０２に連結した。これで
生じたプラスミドをＰＢＳ２３２と命名した。

【０１４８】実質的にＢｅｇｇｓの方法（１９７８、前
記の文献）通り、上記のプラスミドにより株Ｖ−７９４
−７−１ｃ等の適当な酵母宿主を形質転換した。形質転
換細胞は、ウラシルを含まない合成培地（−ＵｒａＤ）
上で選択し、かつ培養した。形質転換細胞を５mlの−Ｕ
ｒａＤ上に接種し、３０℃で一晩増殖させる。続いて、
培養物を遠心して細胞を除き、そして上清分画を収得す
る。上清は、実施例ＸＩ．Ｂ．に記載した方法を用いて
アッセイし、第ＸIII 因子ａサブユニットの存在を調べ
た。

【０１４９】Ｄ．合成シグナルペプチドを用いる酵母か
ら、第ＸIII 因子を分泌させるためのベクターの造成 ＡＤＨ２−４^C プロモーター、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ
（前記の文献）の規則により合成した１９個のアミノ酸
のシグナルペプチド、ａｓＦ ＸIII ｃＤＮＡ、及びＴ
ＰＩ１ターミネーターを含んで成る発現ユニットを造成
した。オリゴヌクレオチドＺＣ１２０９及びＺＣ１２１
０（第１表）は、アニーリングを実施すれば、５′Ｐｓ
ｔＩ粘着末端、１９個のアミノ酸のシグナルペプチド
（Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−
Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａのアミノ酸配列を有するもの）をコードする配列、及
び３′ＨｉｎｄIII 粘着末端を含んで成るアダプターを
形成するように設計されている。

【０１５０】オリゴヌクレオチドへのキナーゼ処理及び
アニーリングは、Ｍａｉａｔｉｓらの記載する方法
（「分子のクローニング：実験法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ〕」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２）に従って実施した。

【０１５１】ＡＤＨ２−４^C プロモーター源及びＴＰＩ
１ターミネーター源としては、プラスミドｐＴＲＫ４ｃ
（実施例III ．Ｂ．）を用いた。プラスミドｐＴＲＫ４
ｃをＡＤＨ２−４^C プロモーターの３′側にＰｓｔＩ部
位を配置するような修飾した。プラスミドｐＴＲＫ４ｃ
をＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで切断して、ＡＤＨ２−４ ^C
プロモーター、ＴＰＩ１ターミネーター、及びｐ１Ｃ７
ＲＩ^* ベクター配列を含んで成る３．７kb断片を単離し
た。キナーゼ処理及びアニーリング処理したＺＣ１０５
６／ＺＣ１０５７（実施例Ｖ．Ｂ．）のアダプターをｐ
ＴＲＫ４ｃ断片と連結した。これによって生じたプラス
ミドをｐＲＳ１８５（図１５）と命名した。

【０１５２】プラスミドｐＲＳ１８５をＰｓｔＩ及びＳ
ａｌＩで切断して線状化した。プラスミドｐＲＳ２０３
（実施例VII ．Ａ．）をＨｉｎｄIII 及びＸｈｏＩで切
断して２．２kbのａｓＦ ＸIII ｃＤＮＡ断片を単離し
た。そして、この断片を、線状化したｐＲＳ１８５、及
びキナーゼ処理ならびにアニーリング処理したＺＣ１２
０９／ＺＣ１２１０アダプターに連結して、プラスミド
ｐＢＲ２２０（図１８）を造成した。

【０１５３】プラスミドｐＲＳ２２０中に存在する発現
ユニットをベクターｐＥＡＳ１０２（実施例IV）中にク
ローン化し、プラスミドｐＲＳ２２１を造成する。プラ
スミドｐＲＳ２２０をＸｈｏＩで切断して５kbの発現ユ
ニットを単離する。プラスミドｐＥＡＳ１０２をＳａｌ
Ｉで切断し、そして細菌アルカリホスファターゼで処理
して、再び環化することを防ぐ。

【０１５４】そして、５kbの発現ユニットと線状化され
たｐＥＡＳ１０２ベクターを連結する。その結果生じた
プラスミドをｐＥ２２０と命名し、これには、ＡＤＨ２
−４ ^C プロモーター、１９個のアミノ酸の合成シグナル
ペプチドをコードするアダプター、ａｓＦ ＸIII ｃＤ
ＮＡ、ＴＰＩ１ターミネーター、及びｐＥＡＳ１０２ベ
クター配列が含まれている。

【０１５５】酵母細胞を上記の通り形質転換し、そして
培養する。第ＸIII 因子ａサブユニットの存在は、実施
例ＸＩ．Ｂ．に記載したアッセイ法を用いて調べる。実施例 IX 第ＸIII 因子ａ′サブユニットの発現 第ＸIII 因子のａサブユニットはトロンビン開裂によっ
てａ′サブユニットに活性化され、この開裂によりタン
パク質のアミノ末端から３７個のアミノ酸が除去され
る。ａｓＦ ＸIII ｃＤＮＡを、アミノ末端の３７個の
アミノ酸をコード配列を除くように変更する。一本鎖の
鋳型ＤＮＡを、ベクターｐＵＣ１１８中にａｓＦ ＸII
I ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＲＳ２０２（実施例
Ｖ．Ａ．）から調製した。オリゴヌクレオチドは、３７
bp活性化ペプチドをコードする５′配列を除きそしてこ
れをＥｃｏＲＩ部位及びこれに続く開始メチオニンをコ
ード化する配列であってａｓＦ ＸIII ｃＤＮＡコード
領域の＋３８におけるＧＧＣとフレームに融合している
もので置換するように設計されている。

【０１５６】このオリゴヌクレオチドは、ゾーラー（Ｚ
ｏｌｌｅｒ）とスミス（Ｓｍｉｔｈ）（同上）によって
記載された方法を用いてｐＲＳ２０２一本鎖鋳型ＤＮＡ
を変異誘発させるのに用いる。生成する配列は、ａ′サ
ブユニット（ａ′ＳＦＸIII）のアミノ末端部分をコー
ドし、アミノ酸＋３８をコードするコドンに融合した開
始メチオニンコドンの５′側のＥｃｏＲＩ部位を伴う。
変異誘発されたファージから調製される複製型ＤＮＡ
を、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩとで消化して、ａ′ｓＦＸII
I ｃＤＮＡを単離する。

【０１５７】ＡＤＨ２−４^C プロモーター、ａ′ｓＦＸ
III ｃＤＮＡ及びＴＰＩ１ターミネーターを含んで成る
発現ベクターを造成する。ＡＤＨ２−４^C プロモーター
とＴＰＩ１ターミネーターの源は、プラスミドｐＴＲＫ
４ｃ（実施例III ．Ｂ．）である。プラスミドｐＴＲＫ
４ｃをＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化して、ＡＤＨ２−４
^C プロモーター、ＴＰＩ１ターミネーター及びｐＩＣ７
ＲＩ^* ベクター配列を有する４kbフラグメントを単離す
る。この線形化したベクターフラグメントを、ＥｃｏＲ
Ｉ−ＸｈｏＩａ′ｓＦＸIII ｃＤＮＡフラグメントと連
結する。生成するプラスミドは、ｐａ′ＴＲＫ４ｃと呼
ばれる。

【０１５８】ｐａ′ＴＲＫ４ｃに存在する発現ユニット
を、酵母ベクターｐＥＡＳ１０２中に入れる。ａ′ｓＦ
ＸIII ｃＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄIII で消化する
ことによってプラスミドｐａ′ＴＲＫ４ｃから単離す
る。ａ′ｓＦＸIII ｃＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄII
I で消化し、細菌性アルカリホスファターゼで処理して
再環化を防止し、線形化したプラスミドｐＥＡＳ１０２
と連結する。連結混合物を、Ｅ．コーリー（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）株ＲＲＩ中に形質転換する。生成する形質転換体か
ら調製されるプラスミドＤＮＡを制限分析によって分析
して、挿入部の方向を決定する。陽性のクローンをｐ
ａ′ＥＡＳ１０２と呼ぶ。

【０１５９】酵母細菌は、上記のように形質転換され、
培養される。第ＸIII 因子ａサブユニットは、実施例Ｘ
Ｉ．Ｂ．に記載の方法を用いて検定する。実施例 Ｘ 第ＸIII 因子ｂサブユニットの発現 Ａ．酵母における発現 第ＸIII 因子のｂサブユニットの分泌は、ＭＦα１シグ
ナルペプチド配列をファクターＸIII のｂサブユニット
の成熟型のコード配列に連結することによって達成され
る。プラスミドｐＫＰ２４（実施例VIII．Ａ．）に存在
するコドンを最適化したＭＦα１シグナルペプチド配列
と第ＸIII 因子ｂサブユニットｃＤＮＡ（ＦＸIII ｂ）
との融合は、生体外変異誘発を用いる。

【０１６０】ＭＦα１シグナルペプチド配列のアミノ酸
８１をコードするコドンの後に挿入されるＳｓｔＩ部位
と共にコドンが最適化されたＭＦα１シグナルペプチド
配列を含有するプラスミドｐＫＰ２４を、ＢａｍＨＩと
ＳｓｔＩで消化して、ＭＦα１シグナルペプチド配列を
単離する。ファージクローンＡＨＦＸIII ｂ２．２から
単離される２．２kbのＥｃｏＲＩ ＦＸIII ｂ ｃＤＮ
Ａフラグメントを、ＥｃｏＲＩで消化することによって
線形化したｐＵＣ１１８にサブクローニングする。連結
混合物を、Ｅ．コーリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＪＭ８３中
に形質転換する。

【０１６１】プラスミドＤＮＡはこの形質転換体から作
られ、ＳｔｕＩ及びＳｓｔＩで消化されて、挿入部の方
向を決定する。ｐＦＸIII ｂと呼ばれる陽性クローンは
ｌａｃＺ′遺伝子に関してアンチセンス（ａｎｔｉｓｅ
ｎｓｅ）の方向でＦＸIII ｂｃＤＮＡを有する。プラス
ミドＦＸIII ｂをＢａｍＨＩとＳｓｔＩで消化すること
によって線形化して、ｐＫＰ２４から単離されたコドン
が最適化されたＭＦα１シグナルペプチド配列フラグメ
ントに連結する。生成するプラスミドをｐ１１８ ＦＸ
III ｂと命名する。

【０１６２】合成オリゴヌクレオチドは、ＳｓｔＩ部位
と成熟ＦＸIII ｂサブユニットをコードする配列との間
の配列をループ・アウト（ｌｏｏｐ ｏｕｔ）しそして
ＭＦα１のアミノ酸８２−８５をコード化する天然配列
を挿入するように設計されている。プラスミドｐ１１８
ＦＸIII ｂは、Ｅ．コーリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＶ
１１９３中に形質転換される。形質転換体から作られた
一本鎖鋳型ＤＮＡを、標準的処理法にしたがって生体外
変異誘発にかける。陽性クローンを制限分析によって配
列決定しそして分析し、変異誘発を確認する。正確に変
異誘発したクローンをｐＭＦＦＸIII ｂと命名する。

【０１６３】ｐＭＦＦＸIII ｂに存在するＦＸIII ｂ
ｃＤＮＡを、３′フランキング配列を除きそして停止コ
ドンの３側にＸｂａＩ部位３′を挿入する合成オリゴヌ
クレオチドを用いて変異誘発させる。一本鎖鋳型ＤＮＡ
を、ｐＭＦＦＸIII ｂで形質転換したＥ．コーリー
（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＶ１１９３から作る。一本鎖鋳型
を、生体外で変異誘発させる。陽性クローンを制限分析
によって配列決定しそして分析し、変異誘発を確認す
る。正確に変異誘発したクローンをｐＭＦＦＸIII ｂと
命名する。

【０１６４】プラスミドｐＭＦＦＸIII ｂＸ中に存在す
る挿入部を、プラスミドｐＭＶＲ１（実施例III ．
Ａ．）中に存在するＴＰＩ１の後ろに置く。プラスミド
ｐＭＶＲ１をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化して、ＴＰ
Ｉ１プロモーター、ＴＰＩ１ターミネーター及びｐＩＣ
７ＲＩ^* ベクター配列を有する４kbフラグメントを単離
する。プラスミドｐＭＦＦＸIII ｂＸをＥｃｏＲＩとＸ
ｂａＩで消化して、ＭＦα１シグナルペプチド配列とＦ
ＸIII ｂ ｃＤＮＡを含有するフラグメントを単離す
る。このフラグメントをｐＭＶＲ１フラグメントと連結
して、生成するプラスミドをｐＭＶＲ１ＦＸIII ｂと命
名する。

【０１６５】プラスミドｐＭＶＲ１ＦＸIII ｂ中に存在
する発現ユニットを、酵母ベクターＹＥｐ１３中にサブ
クローニングする。プラスミドｐＭＶＲ１ＦＸIII ｂを
ＳｓｔＩで消化して３．２kb発現ユニットを単離する。
このフラグメントを、ＳｓｔＩで消化することによって
線形化したＹＥｐ１３に連結した。この連結混合物を
Ｅ．コーリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＲＲＩ中に形質転換す
る。これらの形質転換体から作られるプラスミドＤＮＡ
を制限分析によって分析を行い、挿入部の方向を決定す
る。ＬＥＵ２遺伝子と同じ配向の転写方向の挿入部を有
するクローンを規定する陽性クローンをｐＹＥＦＸIII
ｂ１と命名し、反対の配向の挿入部を有するものをｐＹ
ＥＦＸIII ｂ２と命名する。

【０１６６】プラスミドｐＥＦＸIII ｂ１及びｐＹＥＦ
ＸIII ｂ２を適当な酵母宿主細胞中に形質転換し、これ
らの細胞を上記のように培養する。 Ｂ．哺乳類の細胞における第ＸIII 因子ｂサブユニット
の発現 第ＸIII 因子のｂサブユニットは、ＦIX／VII ／ｐＤ２
に由来する発現ベクター中のＦＸIII ｂフラグメント
（３９bp）に融合したファクターIX（ＦIX）リーダー配
列を用いることによって哺乳類細胞中で発現する。ＦIX
リーダー配列は、以下のように造成されたＦIX（−Ｇ）
−＞ｐＵＣ１３から得た。

【０１６７】適当な分泌シグナル配列を得るために、ヒ
ト第IX因子をコードするｃＤＮＡを、ヒト肝臓からのｍ
ＲＮＡで作ったライブラリーから得た（クラチ（Ｋｕｒ
ａｃｈｉ）とデビック（Ｄａｖｉｃ）のＰｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９巻、６４６１〜
６４６４頁、１９８２年）。第IX因子配列を、ｐＢＲ３
２２ベクターをＰｓｔＩで消化することによって単離
し、ｐＵＣ１３のＰｓｔＩ部位中に挿入した。このプラ
スミドをＰIX−ｐＵＣ１３と命名した。

【０１６８】ｃＤＮＡクローニングの結果として第IX因
子挿入部の５′末端に存在するＧに富んでいる領域を除
くために、合成オリゴヌクレオチドアダプターによりク
ローン化したフラグメントの５′末端を置換した。オリ
ゴヌクレオチドＺＣ２１２及びＺＣ２１３（表−１）を
合成し、アニーリングして２２bpのオーバーラップを生
じさせ、フラグメント末端を適当な制限エンドヌクレア
ーゼで満たして、切断し、生成するフラグメントを第IX
因子配列に結合させた。

【０１６９】アダプターを構成するため、ＺＣ２１２及
びＺＣ２１３のそれぞれ１００ピコモルを凍結乾燥し、
１０μｌの１０×キナーゼ／リガーゼ緩衝液（６００mM
トリス、pH８．０，１００mMのＭｇＣｌ₂ ，１００nMの
ＤＴＴ）に８６μｌの水を加えたものに再分散した。ア
ニーリング反応は６５℃で１０分間行い、混合物を徐々
に室温に冷却し、氷上に置いた。この混合物に２．５mM
のｄＮＴＰミックス４μｌとＴ₄ ＤＮＡポリメラーゼ１
μｌを加えた。

【０１７０】反応を１４℃で４５分間進行させた。次い
で、５ＭのＮＨ₄ ＯＡｃ １０μｌを加え、ＤＮＡをフ
ェノール／ＣＨＣｌ₃ で一度、ＣＨＣｌ₃ で２回抽出し
て、エタノールで沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離し、１
００μｌの中間塩濃度緩衝液（マニアチス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）ら、同上、１００頁）中に再分散し、９単位の
ＰｓｔＩ及び８単位のＣｆｏＩで消化し、上記のように
抽出した。

【０１７１】次に、改変された第IX因子配列を、６０mM
のトリス−ＨＣｌ（pH７．５），１０mMのＭｇＣｌ₂ ，
１０mMのＤＴＴ及び０．９単位のＴ₄ リガーゼを含む２
０μｌの反応溶液中で、０．１６ピコモルの合成Ｐｓｔ
Ｉ−ＣｆｏＩアダプターフラグメント、０．１４ピコモ
ルのＦIX−ｐＵＣ１３由来の１．４kbのＣｆｏＩ Ｂａ
ｍＨＩフラグメント及び０．１４ピコモルの２．７kbの
ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩｐＵＣ１３ベクターフラグメント
を組み合わせることによって造成した。

【０１７２】反応混合物を室温で３時間インキュベーシ
ョンし、コンピテント・Ｅ．コーリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ＪＭ８３を形質転換するのに用いた（メッシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃ
ｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，ＮＩＨ出版７９〜９
９号、２頁；２号、４３〜４８頁、１９７９年）。これ
らの細胞を、５０μｌの２％ Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド）と共に４０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−ブロ
ス上に置いて、３７℃で一晩インキュベーションした。
白色コロニーをアンピシリンを含む別のプレートへ移
し、３７℃で一晩インキュベーションした。

【０１７３】コロニーをワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）
５４０濾紙及びクロラムフエニコールプレート上で一晩
インキュベーションすることを省略することを除いて、
ウォーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）らの方法（Ｇｅｎｅ，１
６巻、２１頁、１９８１年）に従ってハイブリダイゼー
ション用の濾紙にブロットした。これらの濾紙を、０．
９ＭのＮａＣｌ，０．０９Ｍのトリス−ＨＣｌ，pH７．
５，６mMのＥＤＴＡ，０．５％のノニデット（Ｎｏｎｉ
ｄｅｔ）Ｐ−４０，１５０μｇ／mlのＥ．コーリー
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡ中で４４℃で２時間インキュ
ベーションした。

【０１７４】濾紙を、³²Ｐ標識ＺＣ２３５（表−１）、
すなわち変更した５′末端配列に特異的な１４−マーで
検査した。フィルター当たり１〜２ｘ１０⁶ cpm で４４
℃、で一晩予備ハイブリダイゼーション緩衝液中でハイ
ブリダイゼーションを行った。次いで、フィルターを６
×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ中で３回洗浄し、×ＳＳ
Ｃ，０．１％ ＳＤＳ中で４４℃で３回洗浄し、Ｘ−線
フィルムに暴露した。２種の陽性のクローンが得られ
た。これらのクローンの一方をＦIX（−Ｇ）−＞ｐＵＣ
１３と命名した。

【０１７５】ＦIX（−Ｇ）−＞ｐＵＣ１３造成物の第IX
因子部分の変更した領域の配列を確かめるために、ＲＲ
Ｌ逆プライマーを用いてｐＵＣプラスミド上に直接にジ
デオキシ配列決定を、ポリマーヌクレオチドキナーゼ及
びチャクナス（Ｃｈａｃｕｎａｓ）ら（（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，６０巻、９
６２頁、１９７５年）の方法によってＹ³²ＰＡＴＰで標
識したプライマー末端を用いて、ウォーレス（Ｗａｌｌ
ａｃｅ）ら（Ｇｅｎｅ，１６巻、２１頁、１９８１年）
の方法を用いて行った。この配列は予測された通りであ
った。

【０１７６】プラスミドＦIX（−Ｇ）−＞ｐＵＣ１３
を、ＰｓｔＩとＨａｅIII を用いて消化し、３９bpのＦ
IXリーダー配列を単離した。ＦＸIII ｂサブユニット
は、ＦＸIII ｂから得られる。プラスミドｐＦＸIII ｂ
をＥｃｏＲＩで線形化して、末端をＤＮＡポリメラーゼ
のクレナウフラグメントで平滑化する。次に、ＤＮＡフ
ラグメントをＨｉｎｄIII で消化して、０．１４kb Ｆ
ＸIII ｂフラグメントを単離する。操作を簡単にするた
めに、３９bpのＦIXリーダーフラグメント及び０．１４
kbのＦＸIII ｂフラグメントを、ＰｓｔＩとＨｉｎｄII
I で線形化したｐＵＣ１２中に連結する。生成するプラ
スミドをＰｓｔＩとＨｉｎｄIII で開裂して、０．１８
kb ＦIX−ＦＸIII ｂ融合フラグメントを単離する。こ
のフラグメントを、ＰｓｔＩとＨｉｎｄIII で線形化し
たＭ１３ｍｐＩ１に連結する。

【０１７７】ＦIXリーダーの末端とＦＸIII ｂの成熟型
におけるグルタミン酸との間の介在配列をループアウト
するように設計されたオリゴヌクレオチドを用いて、生
体外の部位特定変異誘導によってＦIXリーダー配列を正
確にＦＸIII ｂに連結させる。複製型ＤＮＡを変異誘導
されたファージから調製し、ＰｓｔＩとＨｉｎｄIIIで
切断し、０．１kbのＦIX−ＦＸIII ｂ融合フラグメント
を単離する。操作を簡単にするため、このフラグメント
を、ＨｉｎｄIII とＰｓｔＩで線形化したｐＵＣ１３中
にサブクローンする。生成するプラスミドをＨｉｎｄII
I とＢａｍＨＩで消化して、０．１kb ＦIX−ＦＸIII
ｂ融合フラグメントを単離する。

【０１７８】λＨＦＸIII ｂ２．２をＨｉｎｄIII とＥ
ｃｏＲＩで切断し、ＦＸIII ｂの２kbの３′末端を単離
する。このフラグメントをＨｉｎｄIII とＥｃｏＲＩで
線形化したｐＵＣ１３中にサブクローン化した。生成す
るプラスミドをＥｃｏＲＩで線形化し、末端をＤＮＡポ
リメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑化し、
キナーゼを作用させたＢｇｌIIリンカーに連結する。過
剰のＢｇｌIIリンカーをＢｇｌIIで消化して除去し、線
状のフラグメントをＴ₄ ＤＮＡリガーゼで再環化する。
生成するプラスミドをＨｉｎｄIII とＢｇｌIIで切断し
て、２kbのＦＸIII ｂフラグメントを単離する。

【０１７９】第ＸIII ｂ因子発現ベクターを、プラスミ
ドＦIX／VII ／ｐＤ２（ＡＴＣＣ５３０６８号）から誘
導する。ＦIX／VII ／ｐＤ２をＢａｍＨＩで消化する
と、５kb ＦIX／VII フラグメントを放出し、全アデノ
ウイルス２三分節リーダー、ＳＶ４０ポリマーアデニル
化シグナル及びｐＢＲ３２２ベクター配列を含んで成る
ｐＤ２ベクターフラグメントが残る。このベクターフラ
グメントを細菌性アルカリホスファターゼで処理して再
環化を防止し、０．１kbのＦIX−ＦＸIII ｂ融合フラグ
メントと２kb ＦＸIII ｂフラグメントに３部連結で連
結する。正確な挿入部を有するプラスミドをＢａｍＨＩ
とＨｉｎｄIII で消化することによって決定する。この
プラスミドをｐＭＦＸIII ｂと命名する。

【０１８０】仔ハムスターの腎（ＢＨＫ）細胞（アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手、Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ１０号）にｐＭＦＸIII ｂをトランスフ
ェクションするのに用いる処理法は、既報の方法〔例え
ば、ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら、Ｃｅｌｌ，１４
巻、７２５頁、１９７８年；コルサロ（Ｃｏｒｓａｒ
ｏ）とピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｓｏｍｔｉｃ Ｃ
ｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７巻、６０３頁、１９８１
年；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）とファン・デル・エブ
（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ）、Ｖｉｒｏｌ．，５２巻、４
５６頁、１９７３年〕と同じである。

【０１８１】ＢＨＫ細胞は、ダルベッコの培地（に１０
％加熱によって不活性化したウシ胎児血清を加え、グル
タミン及びペニシリン−ストレプトマイシンを補充した
もの）を６０mm組織培養用ペトリ皿に入れて、３７℃で
５％ ＣＯ₂ で２０％のコンフルエントに増殖させる。
１０μｇのＤＮＡの全量を用いて一つの６０mm皿をトラ
ンスフェルトする。３．７５μｇのｐＭＦＸIII ｂ，
１．２５μｇのｐＫＯ−ｎｅｏ〔サザン（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ）とベルグ（Ｂｅｒｇ）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇ
ｅｎｅｔ．，１巻、３２７〜３４１頁、１９８２年〕及
び５μｇのサケ精子ＤＮＡをトランスフェクションに用
いる。ＤＮＡを０．３ＭのＮａＯＡｃ及び７５％エタノ
ールで沈殿せしめ、７０％エタノールで洗浄し、２０μ
ｌの１０mMトリス−ＨＣｌ（pH８），１mMのＥＤＴＡに
再溶解する。

【０１８２】ＤＮＡを４４０μｌの水と５００μｌの２
８０mMのＮａＣｌ，５mMのＮａＨＰＯ₄ ，１２mMのデキ
ストロース，５０mMのＨＥＰＥＳ（pH７．１２）と、混
合する。２ＭのＣａＣｌ₂ ６０μｌを上記混合物に滴下
して加え、溶液を室温で３０分間放置する。次いで、溶
液を細胞に加え、これらの細胞を４時間３７℃に戻す。
培地を除去し、そして２０％ ＤＭＳＯ／ダルベッコの
培地に血清を加えたもの５mlを加えて２分間室温に放置
する。

【０１８３】次いで、培地を２回交換して手早く皿を洗
浄し、新たな培地中で一晩インキュベーションする。Ｄ
ＮＡを加えてから２４時間後、培地を除き選択培地（１
０mg／mlのＧ４１８，４９８μｇ／mgのギブコ／血清を
有するダルベッコの培地）を加える。１０日後及び１３
日後に、ｐＫＯ−ｎｅｏ遺伝子を含有し、そしてそれ故
にＧ４１８に耐性を有する細胞を代表するそれぞれのク
ローンを９６ウェル（または２４ウェル）プレートに移
し増殖させてタンパク質の検討を行う。

【０１８４】細胞をダルベッコ培地に１０％ウシ胎児血
清を含むもので増殖させる。培地を遠心分離によって細
胞及び細胞破砕物から分離して、第ＸIII 因子サブユニ
ットｂポリペプチド及び生物活性について検討する（例
えば、ＥＬＩＳＡによる）。細胞をトリプシンでプレー
トから除いて、新鮮な培地で洗浄し、遠心分離し、−２
０℃で凍結する。細胞ペレットをＰＢＳ中で解凍し、ペ
レット化し、０．２５％トリトンＸ−１００を含むＰＢ
Ｓに再分散する。試料を希釈し、そしてポリマーペプチ
ド及び活性を検査する。

【０１８５】実施例 ＸＩ アッセイの説明 Ａ．細胞ペレットの調製 上記節で記載した適当に増殖した酵母細胞を遠心分離し
て、細胞をペレット化し、スペント培地を廃棄した。細
胞をペレット化して、蒸留水で洗浄した。洗浄したペレ
ットをアッセイを行うまで−８０℃で凍結した。

【０１８６】凍結した細胞ペレットから、粗いガラス玉
による細胞溶解物を作った。洗浄した細胞ペレットを氷
上で解凍し、等容量のリン酸緩衝化食塩水〔ＰＢＳ、シ
グマ（Ｓｉｇｍａ）社、セント・ルイス、ミズリー〕、
１mMのβ−メルカプトエタノール（シグマ社）で希釈し
た。ガラス玉（４５０〜５００μｍ）を総量の半分に加
えた。この混合物を１分間全力で３回撹拌し、撹拌の間
に試料を氷上で冷却した。液体をパスツール・ピペット
で試験管から抜き取り、微量遠心管に移した。

【０１８７】ガラス玉を、β−メルカプトエタノール１
mMを含むＰＢＳの最初の量で洗浄した。ガラス玉を１分
間撹拌し、液体をパスツールピペットで抜き取り、もと
の溶解物と一緒にした。この溶解物を次にエッペンドル
フ遠心管〔ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）、ウェ
ストバリー、ニュー・ヨーク〕中で最高速度で５分間遠
心分離した。上澄液を注意深く抜き取ってアッセイし
た。

【０１８８】Ｂ．第ＸIII 因子の活性分析 第ＸIII 因子の活性を、カーチス（Ｃｕｒｔｉｓ）及び
ローランド（Ｌｏｒａｎｄ）（同上）によって記載され
ている方法と本質的に同じ方法を用いて測定する。溶解
物はローリー（ｌｏｗｒｙ）らが記載した方法（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３巻、２６５〜２７５頁、１９
５１年）によって、総酵母タンパク質について測定す
る。試料をＰＢＳ＋１mMのＢＭＥを有する１０μｇ／μ
ｌの総酵母タンパク質に希釈する。市販の第ＸIII 因子
（表−２）を用いる標準を、５０mMのトリス−ＨＣｌ
（pH７．５）、１０mMのジチオスレイトール中で段階希
釈で希釈する。

【０１８９】５μｌの試料または標準を３５μｌの５０
mMトリス−ＨＣｌ（pH７．６）及び１μｌのトロンビン
に加える（第２表）。混合物を３７℃で３０分間インキ
ュベーションする。反応混合物に２Ｕのヒルジン（シグ
マ社）を加えることによって反応を停止する。３７℃の
６０μｌの反応混合物（表−２）を加えて、混合物を３
０分間インキュベーションする。７．５％トリクロロ酢
酸（ＴＣＡ）１mlを加えることによって、反応を停止す
る。試料を微量遠心管中で最高速度で５分間遠心分離し
て、上澄液を廃棄する。

【０１９０】ペレットを７．５％ ＴＣＡで２回洗浄す
る。次いで、ペレットを１００μｌの氷酢酸に溶解す
る。５mlのシンチレーションカクテル〔オプティフロー
ア（Ｏｐｔｉｆｌｕｏｒ）、パッカード・インスツルメ
ンツ・カンパニー（（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓ Ｃｏ．）、ダウナーズグローブ（Ｄｏｗｎｅ
ｒｓ Ｇｒｏｖｅ）、イリノイ〕を加え、試料をシンチ
レーションカウンター上で〔ベックマン（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ）、パロアルト、カリフォルニア〕計測する。

【０１９１】第２表 トロンビン：凍結トロンビン〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）、
セントルイス、ミズーリー〕を５０％グリセロール、
０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解して１０
００Ｕ／mlとする。この溶液を−２０℃で保存する。市
販の第ＸIII 因子：１mlの５０％グリセロール、５０mM
トリス−ＨＣｌ（pH７．５）、１０mMジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ、シグマ社、セントルイス、ミズーリー）１
mlに第ＸIII 因子（緑十字、大阪、日本）を溶解する。
この溶液を−２０℃で保存する。Ｎ，Ｎ−ジメチルカゼ
イン：Ｎ，Ｎ−ジメチルカゼイン（シグマ社、セントル
イス、ミズーリー）を０．５Ｍトリス−ＨＣｌ、pH７．
５に溶解して１０mg／mlとする。

【０１９２】³Ｈ−ヒスタミン二塩酸塩：１ｍCiの ³Ｈ
−ヒスタミン二塩酸塩〔ニューイングランド・ニューク
レアー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）ボ
ストン、マサチューセッツ〕を１０mMの非標識ヒスタミ
ン二塩酸塩４mlに溶解した。この溶液を−２０℃で保存
する。

【０１９３】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒト第ＸIII 因子のａ及びａ′サブユ
ニットをコードするヌクレオチド配列及びこれらのサブ
ユニットの推定アミノ酸配列を示す図である。

【図２】図２は、ヒト第ＸIII 因子のａ及びａ′サブユ
ニットをコードするヌクレオチド配列及びこれらのサブ
ユニットの推定アミノ酸配列を示す図である。

【図３】図３は、ヒト第ＸIII 因子のａ及びａ′サブユ
ニットをコードするヌクレオチド配列及びこれらのサブ
ユニットの推定アミノ酸配列を示す図である。

【図４】図４は、ヒト第ＸIII 因子のａ及びａ′サブユ
ニットをコードするヌクレオチド配列及びこれらのサブ
ユニットの推定アミノ酸配列を示す図である。

【図５】図５は、ヒト第ＸIII 因子のａ及びａ′サブユ
ニットをコードするヌクレオチド配列の３′に存在する
非翻訳領域のヌクレオチド配列を示す図である。

【図６】図６は、ヒト第ＸIII 因子のｂサブユニットを
コードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びこの推定ア
ミノ酸配列を示す図である。

【図７】図７は、ヒト第ＸIII 因子のｂサブユニットを
コードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びこの推定ア
ミノ酸配列を示す図である。

【図８】図８は、ヒト第ＸIII 因子のｂサブユニットを
コードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びこの推定ア
ミノ酸配列を示す図である。

【図９】図９は、ヒト第ＸIII 因子のｂサブユニットを
コードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びこの推定ア
ミノ酸配列を示す図である。

【図１０】図１０は、ヒト第ＸIII 因子のｂサブユニッ
トをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びこの推
定アミノ酸配列を示す図である。

【図１１】図１１は、β₂ −グリコプロテインＩにおけ
る５回の反復、ヒト補体のＢ因子のＢの鎖における３回
の反復及びヒトヘプトグロビンα¹ 鎖のアミノ酸配列
と、第ＸIII 因子のｂサブユニットの反復４，５及び６
におけるアミノ酸配列との比較を示す図である。同じ位
置における４又はそれよりも多くの同一の残基はボック
スで囲まれる。最大の平面図を得るために、ギャップは
最少にされた。それぞれの反復の前の数字は、それぞれ
の反復における最初のアミノ酸の残基番号を示す。

【図１２】図１２は、第ＸIII 因子のｂサブユニットに
存在する１０個のアミノ酸反復の平面図を示す。その反
復は、反復１，２及び３；４，５及び６；７及び９；並
びに８及び１０を含む４種のグループに分けられた。そ
れぞれの反復の前の数字は、それぞれの反復における最
初のアミノ酸の残基の番号を示す。反復のそれぞれのグ
ループにおける同じ位置での２又はそれよりも多くの同
一の残基はボックスで囲まれている。１０個の反復され
た部分の間のギャップは、最大の平面図を得るために最
少にされた。

【図１３】図１３はプラスミドｐＭＶＲ１の造成法を示
す図である。

【図１４】図１４はプラスミドｐＡＴ−１の造成法を示
す図である。

【図１５】図１５はプラスミドｐＴＲＫ４ｃ及びその誘
導体ｐＲＳ１８５の造成法を示す図である。

【図１６】図１６はｐＲＳ２０１の造成法及びプラスミ
ドｐＲＳ２０２及びｐＲＳ２０３の造成法を導びく突然
変異誘発を示す図である。

【図１７】図１７は酵母発現ベクターｐＲＳ２１６及び
ｐＲＳ２１７の造成法を示す図である。

【図１８】図１８は天然のＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａ
ｌａを有する、コドンを最適化されたＭＦα１シグナル
ペプチド配列及びＨｉｎｄIII 配列を含んで成るプラス
ミドｐＲＳ１１１の造成法を示す図である。

【図１９】図１９はｐＲＳ２２０及びｐＲＳ２３１の造
成法を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 アール ダブリュ．デービー アメリカ合衆国，ワシントン 98004，ベ ルビュー，ノース イースト トゥウェン ティセカンド プレイス 9010 (72)発明者 ロナルド エル．シィール アメリカ合衆国，ワシントン 98112，シ アトル，シックスティーンス アベニュ イースト 611 (72)発明者 アキタダ イチノセ アメリカ合衆国，ワシントン 98145，シ アトル，テラス ドライブ ノース イー スト 4877 (72)発明者 ジュリー アン ホリー アメリカ合衆国，ワシントン 98117，シ アトル，セカンド アベニュ ノース ウ ェスト 9721 (72)発明者 ゲーリー イー．パーカー アメリカ合衆国，ワシントン 98239，ク ープビル，サウス メドウラーク ロード 170

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 活性化後に第ＸIII ａ因子と実質的に同
   一の活物学的活性を有する蛋白質の製造方法であって、 転写プロモーター及びこれに続きその下流にある第ＸII
   I 因子のａサブユニットと機能的に相同なポリペプチド
   をコードするＤＮＡ配列並びに転写プロモーター及びこ
   れに続きその下流にある第ＸIII 因子のｂサブユニット
   と機能的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
   を含んで成る発現ベクターを宿主細胞に導入し；該宿主
   細胞を適切な条件下で培養し；そして該宿主細胞から前
   記蛋白質を単離する；ことを含んで成る方法。
2. 【請求項２】 活性化後に第ＸIII ａ因子と実質的に同
   一の生物学的活性を有する蛋白質の製造方法であって、 転写プロモーター及びこれに続きその下流にある第ＸII
   I 因子のａ′サブユニットと機能的に相同なポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ配列並びに転写プロモーター及び
   これに続きその下流にある第ＸIII 因子のｂサブユニッ
   トと機能的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配
   列を含んで成る発現ベクターを宿主細胞に導入し；該宿
   主細胞を適切な条件下で培養し、そして該宿主細胞から
   前記蛋白質を単離する；ことを含んで成る方法。
3. 【請求項３】 活性化後に第ＸIII ａ因子と実質的に同
   一の生物学的活性を有する蛋白質の製造方法であって、 転写プロモーター及びこれに続きその下流に存在する第
   ＸIII 因子のａサブユニットと機能的に相同なポリペプ
   チドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクター
   を宿主細胞に導入し；該宿主細胞を適切な条件下で培養
   し；該宿主細胞から前記ａサブユニットを単離し；そし
   て該ａサブユニットをダイマー化する；ことを含んで成
   る方法。
4. 【請求項４】 活性化後に第ＸIII 因子ａと実質的に同
   じ生物学的活性を有する蛋白質の製造方法であって、 転写プロモーター及びこれに続きその下流に存在する第
   ＸIII 因子のａサブユニットと機能的に相同なポリペプ
   チドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクター
   を宿主細胞に導入し；該宿主細胞を適切な条件下で培養
   し；そして該宿主細胞からａ２ホモダイマーダイマーを
   単離する；ことを含んで成る方法。
5. 【請求項５】 第ＸIII ａ因子と実質的に同一な生物学
   的活性を有する蛋白質の製造方法であって、 転写プロモーター及びこれに続きその下流に存在する第
   ＸIII 因子のａ′サブユニットと機能的に相同なポリペ
   プチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクタ
   ーを宿主に導入し；該宿主細胞を適切な条件下で培養
   し；該宿主細胞からａ′サブユニットを単離し；そして
   該ａ′サブユニットをダイマー化してａ′２ホモダイマ
   ーを形成する；ことを含んで成る方法。
6. 【請求項６】 第ＸIII ａ因子と実質的に同一の生物学
   的活性を有する蛋白質の製造方法であって、 転写プロモーター及びこれに続きその下流に第ＸIII 因
   子のａ′サブユニットと機能的に相同なポリペプチドを
   コードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターを宿主
   細胞に導入し；該宿主細胞を適切な条件下で培養し；そ
   して該宿主細胞からａ′２ホモダイマーを単離すること
   を含んで成る方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかの方法に従って
   製造された蛋白質。
8. 【請求項８】 請求項１〜６のいずれかに記載の蛋白質
   の有効量、及び生理的に許容されるキャリヤー又は稀釈
   剤を含んで成る医薬組成物。
9. 【請求項９】 活性療法剤として使用するための、請求
   項１〜６のいずれかに従って製造された蛋白質。
10. 【請求項１０】 前記第ＸIII 因子のａサブユニット又
    はａ′サブユニットをコードするＤＮＡが該ＤＮＡに通
    常結合している３′−非翻訳配列を伴っていない、請求
    項１〜６のいずれか１項に記載の方法。