JPH02142475A - ヒトの組織因子のクローニングと形質発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明はヒトの組織因子についてのクローン化したＤＮ
Ａの配列暗号化を含み、適当な宿主の中にレプリカ培養
（複製）できる新規の組換え（体）ベクターに関する。

また、本発明はヒトの組織因子のＤＮＡコーディング（
暗号）、及びこれから暗号化した、実質的に純粋なヒト
の組織因子並びにその機能的部分に関する。更に、本発
明はヒトの組織因子を発現できる発現ベクターを含む形
質転換宿主並びにヒトの組織因子の新規な可溶形態及び
ヒトの組織因子の新規な切形を提供する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）ヒト及
び動物における（血液の）凝固システムは止血の維持と
血栓（血餅、血塊）に対する主たる寄与者である。凝固
は、本質的には、不活性酵素の前駆体、すなわち、酵素
原として通常血液その他の組織に存在する各血餅形成因
子が次々に活性化されてタンパク分解酵素となり、今度
はこの酵素が血餅形成配列における次の酵素を選択的に
侵して、これを活性酵素に変換するという一種のカスケ
ード反応である。各段階でカスケード的増幅が行われる
ので、当初における小さな刺激も最終的には相当量のフ
ィブリンクロット（繊維素塊）となる。これが、血液凝
固の過程における最終生成物である。

血液凝固カスケードは、当初は２つの別個の経路である
が、最終的にはこれらが一つに収束する。

経路の一つは血液に対して「内因性」であるが、他の一
つは「外因性」と称される。外因性と言われる理由はこ
れが、通常は血液中に存在しない凝固因子によって誘発
されるものだからである。外傷につづく止血において主
な役割を果すのは内因性の経路の方であるとされている
。外因性経路は、多数の病理学的環境、例えば、漫（広
汎）性内皮損傷、悪性ガン、自前（素）血症、妊娠合併
症などにおいて活性化される。

現在では、第■因子、即ち、ビタミンに依存性血漿凝固
因子タンパクと組織因子、即ち、通常は血液細胞とは結
合していない細胞定着タンパクが相互に作用し合う、と
いう相当有力な証拠がある（例えば、ネマーソン、血液
７１．１−８．１９８８年回顧号参照）。この相互作用
の結果、酵素的活性を有する活性複合体が生じ、他の２
種のタンパク、即ち、因子Ｘと因子■をその活性のある
酵素型、即ち、因子Ｘａと因子ＩＸａに各変換すること
によって凝固を開始させることになる（一般の慣習によ
り、活性血液凝固因子の酵素前駆体はローマ数字によっ
て区別し、活性型は下付き文字“ａ”で表わす。例えば
、因子Ｘは酵素前駆体、因子Ｘａは活性因子を表わすも
のとする）。

組織因子は、通常状態では血液と直接には接触しないほ
とんどすべての細胞の表面に存在する血液凝固促進タン
パクである。しかしながら、種々の薬理学的メデイエー
タ−（伝達物質）、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）　、
インターロイキン１、エンドトキシン（内毒素）で刺激
すると内皮培養細胞や単核球内に組織因子を誘導できる
。外因性血液凝固経路は因子■、即ち、ビタミンに依存
性のセリンプロテアーゼ酵素前駆体と複合体を作る組織
因子によって誘発される。一種の血液凝固酵素補助因子
である組織因子による因子■の活性化は、カルシウムの
存在の下で生じ、且つ因子■におけるコンフォメーショ
ン（配座）の変化に由来する。

例えば、ネマーソン他、止血と血栓症、５ｐａｅｔＴ、
　Ｈ，ｅ＋ＩｉＬ　、グリュン＆ストラットン、ニュー
ヨーク、ｖｏｌ、６．ｐｐ、２３７〜２６１，１９８２
　　；カーソン。

Ｐｒｏｇ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ　・９：ｌ〜１
４．１９８４を参照）。

しかしながら、因子■が活性化し、且つ血液凝固を開始
させる原因となるコンフォメーション変化の正確な様子
は今なお明らかにされていない。

組織因子と血液凝固因子■は、血液凝固のカスケード反
応において極めて重要な成分である。因子■を顕著に欠
く個体にしばしば見られる激しい出血は、血液凝固の外
因性経路の生理学的重要性を立証するものである。これ
とは対照的に凝固の内因性経路の初期段階に関わりをも
つタンパク、例えば高分子キニノーゲン、プレカリクレ
イン、因子■を欠く固体の場合には無症候性である。

リン脂質と結合する細胞膜定着糖タンパクである組織因
子は、通常は血行中には存在しない。しかしながら、血
管が破裂すると、血漿凝固因子の一つである因子■は、
組織因子と複合体を形成することによって、触媒として
活性の種を作るのであって、これによって内因性経路の
成分である因子■（血漿トロンボプラスチン成分）が活
性化されてＩＸａが形成されると同時に、血液凝固の外
因性経路にも内因性経路にも関わりをもつ因子Ｘ（スチ
ュワート因子）が活性化されてＸａとなる。

組織因子は、このように、ヒトの血液凝固経路における
重要成分なのである。ヒトの組織因子は凝固障害をモニ
ターし研究するための一種の診断用試薬として用いるこ
とのできる重要な物質であり、且つ凝固阻止剤として使
用できる可能性をもっている。ヒトの組織因子の化学的
且つ生物学的性格づけは、このように、人体における血
液凝固のしくみを理解するのに明らかな重要性をもって
いる。

組織因子の未精製標本は、「クイック・ワンステージ・
プロトロンビン・タイム」　（急速−段階プロトロンビ
ン時間）として知られる試験を実施するため日常臨床実
験室で利用されている。この試験では、未精製の組織因
子は、通常は、アセトン脱水したウサギの脳と肺の混合
物であるが、これをＣａＣｌ２　と共に血漿標本に付加
する。この試験は広（用いられており、標準条件下の凝
固時間は通常約１２乃至１４秒である。

上記凝固時間の主たる決定因子は因子■のレベルと活性
であるが、因子■は付加される組織因子の量にもよるが
、血漿中の濃度が高い。従って、因子■の濃度が通常よ
り高い場合でも標準的凝固時間（１２乃至１４秒）にな
る。ただし、「−段階プロトロンビン時間」は標準レベ
ルより高い因子■に対しては感受性がない。

凝固カスケード反応の諸相がこれまで明らかにされてい
るにもかかわらず、生体内で血液凝固が開始するときの
実態については、なお十分には理解されていない。特に
、組織因子の役割はなお完全には研究されていない。凝
固の内因性、外因性多経路におけるその役割はごく最近
に認識されたにすぎないからである。例えばネマーソン
他、Ｐｒｏｇ、止血＆血栓症６：２３７〜２６１．１９
８２並びにネマーソン、血液７１；１〜８．１９８８参
照。加えて、試験管内での組織因子の機序を明らかにし
ようとする努力も、研究用として適量の純タンパクを得
ることが困難なために阻害されてきた。因子■と組織因
子の触媒作用による諸反応の動力学解析を容易にするた
め、ウシの脳から組織因子をとって均一に精製すること
が行われている。Ｂａｃｂ他。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｍ、　２５６：８３２４〜８３
３１．１９８１　、免疫学的親和性クロマトグラフィー
などのタンパクを単離するのに用いられる従来の精製技
術は、ウシの組織因子に対して単クローン性抗体を使用
する場合ですら煩雑なものであ・す、詳細な実験や臨床
にタンパクを使用する場合にその正確な量を求めるに適
さない。

同様に、剖検材料から取ったヒトの脳や妊娠満期の胎盤
から少量のヒトの組織因子を精製することが行われてい
る。ブローズ他、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ２６０：１０
９１７〜１０９２０．１９８５　；グハ他、　Ｐｒｏｃ
　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｊ１３：２９９〜３０２．１９
８６　。精製されたヒトの組織因子を、還元条件及び非
還元条件の下、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ３−ＰＡ
ＧＥ）中でポリアクリルアミド電気泳動によって分析し
たところ、分子量４６０００のポリペプチド単鎖である
ように思われた。

ヒトのタンパクはウシの脳の組織因子と同じく、トリプ
シンとキモトリプシンによる切断に抵抗する。しかしな
がら、いくつかの免疫学的研究の示すところによれば、
ウシとヒトとの組織因子は似たような機能を示すものの
、両者のタンパクの間には交叉反応性はほとんど認めら
れない。

ヒトの組織因子のアポタンパク（アポリポ蛋白）全体に
ついてＤＮＡシーケスコーディング（塩基配列暗号）を
クローン化してみれば、この生物学的に重要なタンパク
の遺伝子配列及びタンパク質配列順序が決定できるであ
ろう。ヒトの組織因子の遺伝子暗号は染色体１に位置し
ていることが知られている。なおまた、組織因子及びこ
れから暗号化したタンパクのアミノ酸配列順序のための
ＤＮＡ配列コーディング（暗号）に関する情報を提供す
る場合、組織因子についてのＤＮＡコーディングが一旦
与えられれば、染色体遺伝子の構造に関する重要な情報
が得られる。その上、クローン化したヒトの組織因子の
遺伝子を適当な宿主の中に発現させれば臨床用、診断用
、また実験研究用としてすぐに使用できる組織因子が提
供されることになろう。組織因子によって開始された血
液凝固（すなわち、外因性凝固経路）に関係するタンパ
クをコード化（暗号）するＤＮＡ塩基配列については、
組織因子自体を除き、すでにクローン化され、決定され
ている。

最近のいくつかの報告には、ヒトの組織因子の一部につ
いての相補的ＤＮＡ　　（ｃＤＮＡ）コーディングのク
ローン化について述べられている。モリセー他、１９８
７．　Ｆｅｄ　、　Ｐｒｏｃ、　４６：７１６　（Ａｂ
ｓｔｒ、）　　；スカルバチ他、１９８７．　Ｆｅｄ　
、　Ｐｒｏｃ４６ａ：２２４２　（Ａｂｓｆｒ、）。

これらの研究では組織因子タンパク全体についてのクロ
ーン化されたＤＮＡ断片のコーディングは得られていな
い。但し、ヒトの組織因子のアポ蛋白全体に関するｃＤ
ＮＡのクローン・コーディングのクローン化と配列を開
示した米国特許出願第０６２１６６号が登録された日以
降いくつかの刊行物の中でヒトの組織因子に関するｃＤ
ＮＡクローン・コーディングの単離と配列についての報
告がなされている。

例えば、モリセー他、細胞５０．１２９〜１３５，１９
８７　　、スパイサー他、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ！、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ　、　８４：５１４８〜５１５２．１９８７
　　、スカルバチ他、生化学２６：５２３４〜５２３８
．１９８７　　、フィッシャー他、血液４８；８９〜９
９、１９８？　）を参照。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段及び作用）本発明に基づき
、ヒトの組織因子アポ蛋白全体及びその機能的部分をコ
ード化（暗号）するような配列のクローン化ＤＮＡをも
ち適当な宿主の中で機能的なヒトの組織因子アポ蛋白と
可溶性組織因子を発現させる発現ベクターの生成を提供
するようなレプリカ培養（複製）の可能な組換え（体）
ベクターについて記述する。この組換え（体）ベクター
はヒトの組織因子に関し同定可能なヒトの胎盤のｃＤＮ
Ａライブラリーを含む組換え（体）クローニング・ベク
ターをスクリーニングし、且つヒトの組織因子アポ蛋白
全体に関するｃＤＮＡコーディング（暗号）を含む組換
え（体）ベクターを単離することによって得られたもの
である。クローン化した胎盤ｃＤＮＡのライブラリーを
作ることのできる適当な組換え体のクローニング・ベク
ターには、バクテリア（細菌）等の原核生物宿主の中で
レプリカ培養できるベクター、あるいは、酵母、昆虫細
胞ないし動物やヒトの細胞等の真核生物宿主の中でレプ
リカ培養できるベクターを含む。適当な原核生物ベクタ
ーにはプラスミド、コスミッド及びバクテリオファージ
を含む。但し、これらのみに限定するものではない。適
当な真核生物ベクターには、なかんづく、ワクチニアウ
ィルス、ウシの乳頭腫ウィルス、シミアンウィルス４０
　（ＳＶ４０）及びバキュロウィルスを含む。当業者に
とっては、本発明の実施において広範囲のクローニング
・ベクターと宿主を利用できることは自ら明瞭であろう
。

更に、本発明はヒトの組織因子アポ蛋白全体につきコー
ド化（暗号）を行う２１４７塩基対（ｂｐ）ｃＤＮＡ、
このようなｃＤＮＡの塩基配列、並にｃＤＮＡによって
コード化されるヒトの組織因子タンパク及びその機能的
部分を提供する。このｃＤＮＡは、クローン化されたヒ
トの胎盤のｃＤＮＡライブラリーから同定し単離したも
のである。成熟した組織因子のアポ蛋白、即ち、２６３
のアミノ酸のポリペプチド単鎖の一つは、ヌクレオチド
１１２から９９７にまたがるｃＤＮＡ断片のひとつの読
取り枠（ＯＲＦ）によってコード化される。この読取り
枠に対応するｍＲＮＡの実際上の翻訳産物は、翻訳後切
断した成熟したヒトの組織因子アポ１白を形成する３２
アミノのリーダー配列順序又はシグナルペプチドを有す
る２９５のアミノ酸の前駆体タンパク質である。

更に、式１に示すようなヌクレオチド９０乃至１３４０
を含む２１４７ｂｐｃＤＮＡ１．２５ｋｂ　（キロベー
ス）の断片を分離した。この切断は読取り枠全体並びに
５′−と３′−のフランキング（両側）シーケンス（配
列）を含んでおり、制限酵素（エンドヌクレアーゼ）に
消化されてヒトのく胎盤の）ゲノムＤＮＡ且つ組織因子
の遺伝子を９．５ｋｂＤＮＡにまで局在化し、かつまた
、適当な宿主の中でヒトの組織因子のアポ蛋白とヒトの
可溶性組織因子を含むその機能的部分とを発現する組換
え（体）発現ベクターを作る目的でこれを使用した。

更に本発明は、適当な被形質転換体宿主の中でヒトの機
能的組織因子を発現するような組換え（体）形質発現ベ
クターを提供する。適当な形質発現ベクターには細菌等
の原核生物宿主の中で所期のタンパクを複製し発現する
ベクター、あるいは、酵母、昆虫の細胞、動物やヒトの
細胞等真核生物宿主の中で複製するベクターがある。適
当な原核生物ベクターにはプラスミド、コスミッド及び
バクテリオファージが含まれる。但し、これらのものに
限定されない。適当な真核生物ベクターには、なかんづ
く、ワクチニア・ウィルス、ウシの乳頭腫ウィルス、シ
ミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）及びバキュロウィル
スを含む。当業者にとっては、本発明の実施において広
範囲のクローニング・ベクターと宿主を利用できること
は自ら明らかであろう。

特に重要なのは、タンパク質のカルボキシ末端疎水膜に
達する部分を欠く組織因子タンパクの端を切り取った、
可溶性のものを作る場合にも上記のベクターを利用でき
ることである。これらのベクターは、とりわけ、成熟し
たヒトの組織因子のアポ蛋白の細胞外ドメイン又は近似
的Ｎ末端２１９／２２２アミノ酸及び成熟したヒトの組
織因子アポ蛋白の１乃至２２７Ｎ末端アミノ酸を含む可
溶性の活性組織因子の形質を発現させる。このような、
可溶性のヒトの組織因子タンパク、切り取ったヒトの組
織因子タンパク並びに、その機能的な部分、即ち、ヒト
の組織因子の細胞外ドメインから取ったペプチドは、特
に診断試薬や血液凝固阻止剤として有用である。

（実施例） 今後は詳細説明、実施例及び図面を参照しながら本発明
を説明する。

本発明は、ヒトの組織因子アポタンパク全体又はその機
能的部分をコード化（暗号化）し、且つまた、適当な宿
主の中でその形質を発現させるような配列をもった、ク
ローン化したｃＤＮＡ挿入物（インサート）を含むとこ
ろの、レプリカ培養（複製）の可能な組換えベクターを
提供するものである。この組換えベクターは、適当な宿
主の中で複製できるクローニングベクターに挿入された
クローン化したヒトの胎盤ｃ　ＤＮＡライブラリー中の
ヒトの組織因子についてのＤＮＡ塩基配列暗号（コーデ
ィング）をスクリーニングして得たものである。ヒトの
ｃＤＮＡライブラリーをクローン化するための好ましい
ベクターの中に含まれるものとしては、プラスミド・バ
クテリオファージその他の細菌中で複製できるベクター
、また、酵母、昆虫の細胞、ヒトの細胞等の真核生物宿
主の中で複製できるベクターがある。原核生物に含まれ
るものとしては、なかんづく、プラスミド・コスミッド
及びバクテリオファージがある。真核生物ベクターに含
まれるものとしては、なかんず（ワクチニア・ウィルス
、ウシの乳頭腫ウィルス、５ｖ４０、酵母のベクター、
並びにバキュロウィルスがある。好ましいクローニング
ベクターとしてはバクテリオファージλｇｉｌｌ　、即
ち、ヤング及びデーヴイス、科学２２２ニア７８〜７８
２．１９８３によって記述された形質表現ベクターがあ
る。好ましい宿主生物は、１ｇ１１１の宿主として既知
の大腸菌株に１０８８である。

ヒトの組織因子のアポタンパク全体を暗号化（コード化
）する２１４７ｂｐＤＮＡ断片は、１ｇ１ｌｌ内にクロ
ーン化したヒトの胎盤のｃＤＮＡライブラリーから単離
した。ヒトの組織因子の暗号配列は、特定のオリゴヌク
レオチドのハイブリダイゼーション・プローブと雑種形
成（ハイブリッド）したＤＮＡをもつ組換えバクテリオ
ファージをスクリーニングすることにより、クローン化
された胎盤のｃＤＮＡライブラリーにおいて同定した。

このハイブリダイゼーション・プローブのＤＮＡ塩基配
列は、（ｉ）アミノ端、（ｉｉ）カルボキシ端、及び（
ｉ　ｉ　ｉ）組織因子のポリペプチド鎖の内部からの類
ペプチド断片のアミノ酸配列に対応し、且つこれらアミ
ノ酸配列についての暗号化を行う。

また、本発明は、特に、ファージ１ｇ１１１内でクロー
ン化した胎盤ｃＤＮＡライブラリーから得た組換えバク
テリオファージλ１０．３であって、胎盤ｃＤＮＡライ
ブラリーから得たヒトの組織因子アポタンパク全体につ
いての暗号化を行うクローン化された２１４７ｂｐｃＤ
ＮＡを含むものを提供する。同じく本発明に含まれるも
のとして、同じようにλｇｉｌｌから得た、組織因子暗
号配列を含む第２のバクテリオファージ、λ３，４があ
る。ファージ、λ３，４はヒトの胎盤のｂｐｃＤＮＡラ
イブラリーからのクローン化された１６１６ｂｐｃＤＮ
Ａ挿入物を含むが、そのヌクレオチド配列は、ファージ
λ１０，３の２１４７ｂｐｃＤＮＡ挿入物（インサート
）の３′部位に一致し、且つ、組織因子アポタンパクの
カルボキシ端部位についての暗号化を行う。

また、本発明はヒトの組織因子アポタンパク全体に対す
るクローン化された２１４７ｂｐｃＤＮＡ暗号を提供す
る。式Ｉにその配列を提供する。ＤＮＡ塩基配列の特徴
とするところは、ヌクレオチド１１２乃至１１４におけ
るＡＴＧ開始コドンから２９５アミノ酸のポリペプチド
単鎖をコード化する、ヌクレオチド９９７乃至９９９に
おけるＴＡＡ終結へと延びる単一の読み取り枠であって
、上記ポリペプチド単鎖は３２アミノ酸のリーダー配列
を含む組織因子前駆体タンパクである。この成熟した組
織因子のアポタンパクは、５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｈのアミノ端配列をもつ２６３アミノ酸の単
一ポリペプチドである。

同じく式１（残基−３２で始まる）に配列を示した上記
の前駆体タンパク質は、翻訳後に、式１の＋１で示すア
ミノ残基で開始する配列をもつ成熟した組織因子アポタ
ンパクに変換される。この成熟組織因子アポタンパク（
炭水化物を含まず）の分子量は計算の結果およそ２９．
６００となった。

また、本発明は、組織因子用２１４７ｃＤＮＡ挿入物（
インサート）暗号プラス組織因子ｃＤＮＡ挿入物（イン
サート）の各端末の両側にくる約１０００ｂｐのλＤＮ
Ａを含む約４．］５ｋｂのＤＮＡ断片をｐＵｃ１９のラ
クトースオペロンＺ′に挿入することにより、大腸菌の
クローニング・ベクターｐＵｃ１９から得られる組換え
プラスミドｐＫＳ−２Ｂを提供する。ｐＫＳ−２Ｂは、
ｐＵｃ１９の既知の宿主である大腸菌株７１−１８を変
換するのに用いられてきたものである。大腸菌７１−１
８／ｐＫＳ−２Ｆ！形質転換体は、ヒトの組織因子用２
１４７ｂｐｃＤＮＡ断片暗号化のソース（種）として好
ましいものである。

組織因子用のクローン化された２１４７ｂｐｃＤＮＡ暗
号の利用可能性により、タンパク質についての暗号化を
行うヒトのゲノム遺伝子を特徴づけることが可能になっ
ている。読取り枠を含み、且つ、５′及び３′−のフラ
ンキング・シーケンスを含む、式Ｉに示したヌクレオチ
ド９０−１３４０にまたがる１、２５ｋｂＤＮＡ断片は
、プラスミドｐＫｓ−２Ｂの制御酵素消化作用によって
得られた。この１．２５ｋｂ断片を、消化されたヒトの
胎盤のゲノムＤＮＡの９．５ｋｂＤＮＡ断片と雑種形成
（ハイブリッド）した。この９．５ｋｂゲノムＤＮＡ断
片は、組織因子用配列暗号内に少なくとも３つのイント
ロン（介在配列）を含むものとされている。この組織因
子遺伝子はヒトの染色体１にすでにマツピングされでい
るが、これまでのところ、特定のゲノムＤＮＡ断片に対
する遺伝子の位置は割り出されていない。また、１．２
５ｋｂ断片は、適当な宿主細胞内に、ヒトの組織因子の
アポタンパク全体及び可溶性のヒトの組織因子のための
形質発現ベクターを作る場合にも使用されている。

タンパクをコード（暗号）化し、且つ、タンパクの約７
０％のアミノ酸配列解析によって確認されるλ１０，３
のｃＤＮＡ挿入物（インサート）の配列から予測される
ヒトの組織因子アポタンパク全体のアミノ酸配列に基づ
き、この内在性膜結合タンパク質についてのドメイン構
造を提案する。タンパクのドメインは、タンパク質の独
立に折りたたまれた機能的部位、と定義できる。本発明
の提供するヒトの組織因子アポタンパクのドメインのひ
とつひとつは、次のような独自の構造上、機能上の特徴
を備えている。即ち、（ｉ）翻訳後、前駆体タンパク質
から成熟した活性組織因子への転換と同時に除去される
３２アミノ酸のシグナルペプチド又はリーダー配列；（
２）アミノ端末部２１９のアミノ酸を含む、細胞外の、
−船釣に疎水性のＮ−グリコジル化反応したドメイン、
（３）タンパク質の細胞膜にまたがる部分と考えられて
いるアミノ酸約２２０乃至２４２を含む、主として疎水
性のアミノ酸から成る約２３のアミノ酸ストレッチ（延
長）；及び（４）細胞内の細胞膜ドメインとされている
、アミノ酸残基約２４３乃至２６３を含む約２１のカル
ボキシ端アミノ酸。

第１図に示すのは、式Ｉに記するようなアミノ酸配列を
有する、本発明による実質的に純粋な成熟したヒトの組
織因子アポタンパク（これから３２アミノ酸シグナルペ
プチドを除去する）のドメイン構造と考えられているも
のである。組織因子のドメイン構造として提示したもの
（１−４）のいくつかの際立った特徴を第１図から読み
取ることができる。

分子には４つの潜在Ｎ一連鎖炭水化物組込み位置０ｓｎ
−Ｘ−８ｅｔ／Ｔｂｒ）が見出される。これらの位置の
一つはカルボキシ末端の細胞膜ドメインに在り、従って
、おそらくはグリコジル化していない。細胞外ドメイン
にある三つの位置のそれぞれは、第１図の（◇）印によ
って示されているが、このうちの二つの位置は、アミノ
酸配列解析法によって炭化水素をもっているものと同定
されている。実施例１に述べたように、ｃＤＮＡ塩基配
列からアスパラギンと予測されたアミノ酸１１及び１３
７　　（Ｉ式）においては、ＰＴＦＩアミノ酸は一つも
同定することができなかった。これらのＡｇｎの残基の
おのおのは、炭水化物組込み位置の初めの方を占める。

−般に炭水化物は、組織因子のような膜結合糖タンパク
の細胞外タンパク質にのみ見られるものであり、従って
、炭水化物は細胞外ドメインにのみ見出されるものと期
待されよう。

なお、同じく第１図及び式１から明らかなように、ヒト
の組織因子には全部で５つの半シスチン残基が含まれ（
第１図の丸で囲んだ個所）、そのうちの４つは細胞外の
ドメインに在り、従って、おそらくはジスルフィド結合
をなしている。ジスルフィド架橋の存在は、すでに以前
バッハ他、１゜８ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６：Ｈ２
４−８３３１，１９８１による観察によって暗示されて
いたところである。これは、ウシの組織因子についての
所見で、ＳＤＳの存在の下で２−メルカプトエタノール
を用いて還元したところ、組織因子の凝固促進活動が失
われるにいたったが、ＳＤＳで処理した時にはそうはな
らなかった、という内容のものである。ヒトの組織因子
の位置２４５におけるＣｙｓは、分子間のジスルフィド
結合の形成には与からないとされる。細胞質ドメインで
分離される、と思われるからである。単一のメチオニン
残基Ｍ　ｅ　（２１０におけるＣＮＢ　ｒの切断により
、ジスルフィド結合還元なしに精製した組織からカルボ
キシ端ペプチドが遊離する、という観察により、ヒトの
組織因子のＣＹｓ２４５は分子間ジスルフィド結合の形
成に関わらない、といういまひとつの確認が得られた。

Ｃｙ　ｓ　２４５は、バッハ他、生物学２５：４００７
−４０２０．１９８５によって記述されているように、
おそらくは、組織因子の自家会合をモジュレートしなが
ら、あるいは、精製中にタンパク質ないし脂肪酸のよう
な他の物質と相互に作用することによって、分子間のジ
スフィルド結合を形成するとも考えられる。

また、第１図には、カイト及びトウーリットル、Ｊ、　
Ｍｏ１ｅｃ、　　Ｂｉｏｌ、　　１５７：１０５−１３
２．１９８２の方法によるヒトロバシープロットを示す
。これは、組織因子の膜ドメインの疎水特性をグラフに
描いたものである。多値は２１アミノ酸の配列の平均ヒ
トロバシー指数として計算し、これを各配列の中間残基
にプロットした。タンパク質のカルボキシ端末部位にお
ける２３非極性アミノ酸の連続的ストレッチ（延び）は
、細胞の形質膜の脂質二重層にまたがる内在性膜タンパ
ク質のドメインに特有のものである。更に、正の負荷を
もつ４つのアミノ酸（第１図で（＋）印を付したもの）
が、疎水部位のカルボキシ側のすぐ近くに観察されるが
、これは多数の膜内在住タンパクの膜と細胞質ドメイン
の間の界面に見られる特徴である。（例えば、サバチニ
他、Ｊ、Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、　９２：ｌ〜２１．１
９８２を参照）。更に、組織因子の細胞質ドメインと思
われるところには、低密度のりボタンバク受容体とトロ
ンボモジュリン（ｆｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）に共
通の特徴がある。即ち、この部位につき３つのタンパク
質すべてを比較したところ、細胞質ドメインは短く、且
つ、単一のＣｙｓ残基を含むことが分った。（例えば、
ジャックマン他、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａ
ｄ、　　Ｓｃｉ、８３：８８３４〜８８３８、１９８６
及び山本他、細胞３９：２７〜３８．１９８４を参照）
。

１式に示すような実質上純粋なヒトの組織因子及びその
明らかなドメイン構造につき配置を決定することにより
、可溶性組織因子の形質を発現する形質発現ベクターを
含む形質転換宿主の外へ出すことのできるタンパク又は
その部分の細胞外ドメインを含むヒトの切り取った組織
因子及びヒトの可溶性組織因子を産生ずることが可能に
なった。

この配列は、また、ヒトの組織因子の機能的部分、即ち
、ヒトの組織因子から取ったペプチドの産生をも可能に
するもので、このペプチドは診断試薬として、また、因
子■が組織因子と結合することを防ぐ目的で使用するこ
とができる。無処理組織因子は膜結合の疎水性タンパク
である故、通常、ヒトの組織因子全体の形質発現のため
のベクターを含む形質転換宿主からこのタンパクを分離
することは容易ではない。しかしながら、可溶性の組織
因子を多量に使用できることから天然のタンパクを産生
ずることは可能である。ヒトの組織因子の膜に広がるド
メインと細胞質ドメインは、適当な技術、例えば、固相
ペプチド合成法等によって産生できる。無処理のヒトの
組織因子アポタンパクは、ＤＮＡ組換え技術その他の方
法によって産生じた可溶性のヒトの組織因子を、フラグ
メント縮合等のタンパク合成方法又はタンパク半合成技
術を経由させるペプチド合成技術によって生成した膜／
細胞質ドメインとの共有結合により再構成できる。

本発明による可溶性の組織因子には疎水性の膜スパニン
グ（ｓｐａｎｎｉＢ）　　と細胞質ドメインを欠いてい
る。しかし、驚くべきことに、これまで産生されたこと
がないこのような可溶性組織因子は、因子■の活性化、
及び標準２段階の血液凝固検定における、これに続く因
子■とＸの切断によって測定されるような最小限程度の
凝固促進活性を備えている。因子■と効果的に結合する
この可溶性組織因子は、未変性のヒトの組織因子の凝固
促進活性に対する阻害剤としての有用性ももっている。

従って、可溶性組織因子は一種の診断試薬として、また
、臨床用の潜在的抗凝固剤として強力且つ、重要な力を
内在する。

ヒトの組織因子及びプラスミドｐＫＳ−２８用のクロー
ン化２１４７ｂｐｃＤＮＡ暗号により、形質転換した宿
主の中で臨床用、診断用また実験研究用のヒトの組織因
子アポタンパク質及び可溶性のヒトの組織因子及びヒト
の切り取った組織因子を産生ずる組換え形質発現ベクタ
ーを構成することが可能になった。このような形質発現
ベクターの中には、細菌等の原核生物中で複製し発現す
るもの、あるいは、酵母、昆虫の細胞及び動物ないしヒ
トの細胞のような真核宿主内で複製するものが含まれる
。適当な原核生物ベクターにはプラスミド、コスミッド
及びバクテリオファージが含まれる。但し、これらに限
定されるものではない。また、適当な真核生物ベクター
形質には、なかんづく、ワクチニア、ウィルス、ウシの
乳頭腫ウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、
酵母ベクトル及びバキュロウィルスが含まれる。当業者
にとっては、本発明の実施において、広範囲のクローニ
ング・ベクターと宿主を利用できることは自ら明瞭であ
ろう。

特に、はぼｌ−２１９／２２０のアミノ酸にまたがる可
溶性組織因子、即ち、成熟したアポタンパク質の細胞外
ドメインをＤＮＡクローン化技術によって調整した。可
溶性の活性組織因子のＤＮＡ暗号化は、１式に記す組織
因子のタンパク配列順序のアミン酸２１９／２２０につ
いてのヌクレオチド暗号化のすぐ後に、この組織因子の
遺伝子の中に停止コドンを挿入することによって行った
。その結果、ヒトの組織因子のうち、疎水性の膜にまた
がる部位（ドメイン３）並びに細胞質（ドメイン４）が
欠失した（第１図参照）。

また、上記の代りになるものとして、部位特異的突然変
異を含む他の技術により、シグナルペプチドを伴う、な
いしは伴わない細胞外ドメインを含む可溶性組織因子を
産生じて切断された可溶性タンパクを生成するか、もし
くは、成熟したタンパクの２１０における独自のメチオ
ニン（Ｍｅｔ）残基においてタンパク質を切断するＣＮ
Ｂｒによりλ１０．１１への２１４７ｂｐｃＤＮＡ挿入
（インサート）ニヨってコード（暗号）化される成熟タ
ンパク（シグナルペプチドなし）を切断してこれと同じ
結果を得ることができる。このような可溶性組織因子の
タンパクは凝固阻止剤及び血液凝固障害の診断用薬とし
て用いることができる。更に、可溶性タンパク質から得
たペプチドに対応する可溶性タンパクの機能的部分を凝
固阻止剤及び診断試薬として使用することも可能である
。

凝固促進活性をもつような無傷のヒトの組織因子アポタ
ンパク質は、組織因子の疎水性ドメインと細胞質ドメイ
ンを含むアミノ酸を添加することにより、可溶性組織因
子から再構成できる。この疎水性ドメイン及び細胞質ド
メインは、フラグメント縮合やタンパク質半合成等周知
のタンパク化学の技術により、可溶性組織因子タンパク
に添加することができる。

また、式Ｉのアミノ酸１−２２７を含むヒトの切り取っ
た組織因子は、第１図のｃＤＮＡ暗号配列の３′末端か
ら１１０塩基対が欠失したヒトの組織因子遺伝子を含む
形質発現ベクターをつくることによって調製されている
。

また、本発明は、ヒトの組織因子及びタンパクの各部を
暗号化するＤＮＡ塩基配列のうち、ドメイン（１）乃至
（４）の構造、機能上の特徴をもつような部分を提供す
る。更に、本発明は、これまで産生されることのなかっ
た、実質的に精製された可溶性組織因子及び切り取った
組織因子をも提供する。

プラスミドｐＫＳ−２８とｐＴＬ８ＴＦＡ−１を担う大
腸菌株７１−１８は、ＡＴＣＣ（米代表徴生物種保存機
関）に登録、受は入れ番号６７４２６を付与されており
、エール大学ケーニヒスベルグ教授研究室で入手できる
。

以下に本発明を具体的に説明する実施例をいくつか掲げ
るが、これらは本発明を限定することを目的とするもの
ではない。

実施例１ 組織因子についてのクローン化されたｃＤＮＡ暗号化を
行うに先立ち、タンパク質配列順序決定技術により、ヒ
トの胎盤の組織因子につき約６７％のアミノ酸配置順序
を得た。アミノ酸の配列順序を知ることにより、クロー
ン化された胎盤ｃＤＮＡライブラリー中の組織因子を暗
号化するＤＮＡ塩基配列についてのスクリーニングをす
るために使用する、実施例２に示す特定のオリゴヌクレ
オチド雑種形成（ハイブリッド）プローブを設計するこ
とができた。タンパク質の配列順序は次のようにして決
定した。即ち、グハ他、　　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　
　Ｐｒｏｃ。

Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、８３：２９９〜３
０２によって記述されているような因子■の親和性カラ
ムを用いて精製したヒトの脳の組織因子に対する単クロ
ーン製免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、　ＨＴＦＩ−７８
８をカーソン他、血液７０：４９０−４９３．１９ａ７
によって調製した。この抗体は、コロラド州立大学保健
科学センターのスティーヴンＤ、カーサン博士とシナイ
山医学校のロナルド・バッハ博士から得たもので、ヒト
の組織因子の免疫親和性単離のための免疫吸着カラムを
調製する目的で使用した。組織因子は界面活性剤オクチ
ルフェノキシ・ポリエトキシ００）エタノール（トリト
ン［Ｆ］ｘ−１００）を用いてヒトの脳ないし胎盤組織
のアセトン粉末から抽出、次いで免疫親和カラムに吸着
させた。トリトン［Ｆ］Ｘ−１００を含むｐＨ７，５の
緩衝液で洗浄した後、ｐＨ２，５で単質をカラムからま
溶離した。次いでこれを濃縮した後、トリトン’りＸ−
１００に入れたウルトラゲルＡｃＡ３４で更に精製、組
織因子をともに溶出した少量の混在物質から分離し、実
質的に均質なタンパク標本を得た。各標本の純度は５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥ　（ラエムリ）、「ネイチャー」２２７＋
６８０〜６８５．１９７０）で評定した。バッハ他、１
、　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　２５６：８３２４〜８
３３１．１９８１に記述されているようなリン脂質小胞
内に界面活性剤可溶化タンパクを再構成した後、標準２
段階凝固検定法により標本中の組織因子凝固促進活性を
測定して精製をモニターした。

各組織因子標本のアミノ酸組成及びタンパク濃度をアミ
ノ酸分析によって決定した。即ち、０５１ＭのＮａＣ１
中に入れた１０Ｍｇのヒトの組織因子アポタンパク、０
．０５Ｍのトリス（ｐＨ７，５）及びθ、１％のトリト
ン＠Ｘ−ＩＨに１０％のトリクロロ酢酸（丁ＣＡ）を添
加（７て沈殿させた。１５分間水冷した後、５．０００
Ｘｇで３０分間の遠心分離してタンパク質をペレット化
した。界面活性材とＴＣＡの残留物はアセトン抽出（３
×）によって取り除いた。ペレットは真空中で乾燥させ
、１１５℃で６時間、０．２％のフェノールを含有する
６ＮのＨＣｌ中で加水分解した。加水分解物はベック７
２１２１Ｍアミノ酸分析装置で分析した。

アプライド・バイオシステム社（カリフォルニア州フォ
スター市）の気相シークエネーターを用いて無傷の組織
因子とこれから生成したペプチド断片のアミノ酸配列分
析を行った。配列決定の各サイクルで遊離したフェニル
チオヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体をメリル他、Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９１０８５０〜１０８５６
．１９８４が記述した方法で同定した。各タンパク質１
００乃至２００μｇを用いて無傷なヒトの脳と胎盤の組
織因子のアミノ酸配列順序を決定した。タンパクは上記
のようにして沈殿させた後、１００％のトリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）　に溶解しＧＦ／Ｃガラス濾過器のディス
クに塗布して気相配列決定を行った。ＴＣＡの沈殿とア
セトン抽出の後、塩酸グアニジン０．８　ｍｌ　６Ｍ、
　Ｎａｔ（ＣＪ５０ｍＭにｐＨ８，０で溶解した。タン
パクのアミノ端末は、１■の固体無水コハク酸（ピアス
ケミカル社）を３回連続して添加するスクシニル化によ
って遮断した。添加のたびごとにＩＮのＮａＯＨでサン
プルのｐＨを８．０に調整してから３０分間攪拌した。

その後、これにトリトン［Ｆ］ｘ−ｉｏｏを加えて最終
濃度を０．１％とし、こうしてできた混合物を２５°Ｃ
で一晩中透析した。無傷のタンパクをスクシニル化し、
且つ、タンパク中の単一メチオニン残基Ｍ　ｅ　（２１
０においてＣＮＢｒを用いて切断した時に気相配列分析
法によってカルボキシ末端ＣＮＢ　ｒペプチド（残基２
１１乃至２６３）のうち残基２１１乃至２４４にまたが
る一部のアミノ酸配列順次を得た。このカルボキシ端Ｃ
ＵＢ　ｒペプチドは約６０μｇの胎盤アポタンパクから
調整した。ＴＣＡで沈殿させた胎盤の組織因子（１２０
Ｍｇ）からトリプシンペプチドをも調整した。ＨＰＬＣ
で単離した後、このペプチドの配列を決定することによ
り更に配列情報を得た。ＴＣＡ沈殿タンパク質のペレッ
トは５０μｍの８）４尿素で可溶化し、この溶液を１５
０μｍ。

５　（１ｍＭのＮ）ｆｉ　ＨＣＯ３で希釈した。次イテ
、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケト
ン（ＴＰＣＫ、　クーパーバイオロジカル社）で処理し
たトリプシンを重量比１：２５　（トリプシン：組織因
子）の比率で添加した。２４時間、３７℃で消化させ、
０．０５％のＴＦＡで平衡させたヴイダック■Ｃ−１８
）ＩＰＬＣカラム（０，４５Ｘ　２５ｃｍ）に注入し、
毎分１　ｍｌの流量で流した。ペプチドは直線濃度勾配
の緩衝液Ｂ（０，０５％ＴＦＡ　、　Ｈ％アセトニトリ
ル）で次のようにして希釈した。すなわち、０乃至６３
分（２％乃至３７．５％Ｂ）、６３乃至９５分（３７，
５％乃至７５％Ｂ）、及び９５乃至１０５分（７５％乃
至９８％Ｂ）。

溶出プロフィルはＨＯｎｍと２８０ｎｍにおける吸光度
でモニターした。無傷のタンパクについて上記のように
して単離トリプシンペプチドの配列を決定した。

実施例２ ファージλ１０，３とλ３４４の単離 ヒトの組織因子についての２１４７ｂｐｃＤＮＡインサ
一ト暗号を含むファー・ジλ１０，３を、ヒトの組織因
子の暗号配列のため形質発現ベクターのファージ１ｇ１
１１内にクローン化されたヒトの胎盤のｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることによって単離した。約
１．２Ｘ１０’の独立した胎盤ｃＤＮＡを含む組換え型
を有する上記ライブラリーはクローンチック社（カリフ
ォルニア州パロアルト市）から購入した。２ｇ１ｌｌは
、β−ガラクトシダーゼ用の大腸菌Ｉａｃｚ遺伝子暗号
を含む周知のクローニングベクターである（ヤング及び
デーヴイス、サイエンス２２２：１８０〜１８２．１９
８３）。

クローン化した胎盤ｃＤＮＡライブラリーの中から組織
因子暗号配列をスクリーニングするため、３つのオリゴ
ヌクレオチド雑種形成（ハイブリッド）プローブを合成
した。第２図に示すこれらのプローブは、実施例１で決
定した組織因子のポリペプチド鎖の種々の部位（アミノ
端末、カルボキシ端末及び内部）からの短ペプチドのア
ミノ酸配列順序に対応し、且つこれについての暗号化を
行うＤＮＡと雑種形成（ハイブリッド）させた。オリゴ
ヌクレオチド・プローブは、アプライド・バイオシステ
ム社の３８ＯＡＤＮＡシンセサイザーを用いたホスホラ
ミダイト法によって合成した。プローブは［（ＰＩ、Ｃ
によりヌクレオーゲンＤＩ！ＡＥ６０−７カラム（マケ
リ＝ナゲル社）で精製し、またこれらの５′端において
３２ＦＡＴＰ　（アマージャム社）とＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（ファルマシア社）を用いて約ＩＸ　１０
８　ｃ　ｐｍ／ｆ１ｇの比活性まで放射ラベルをつけた
。

実施例１に示すようなヒトの組織因子のアミノ酸部分配
列の決定により、オリゴヌクレオチドの雑種形成（ハイ
ブリッド）プローブを構成できた。

第２図を参照することにより、組織因子タンパクの３つ
の部位についてのＤＮＡ暗号にこれらのプローブが対応
しているのが分る。すなわち、プローブ＃１はアミノ酸
２４乃至２９（タンパクのアミノ端部位）の配列暗号に
対応しプローブ＃３はアミノ酸２１０　乃至２１５（タ
ンパクのカルボキシ端部位）の配列暗号に対応、またプ
ローブ＃２はアミノ酸１４５乃至１４９（ポリペプチド
鎖の内部部位）の配列暗号に対応する。プローブ＃１と
＃３は二つと共に３２オリゴヌクレオチド、長さは各１
７塩基で、各ペプチドについての可能的暗号配列のすべ
てに対し相補性をもっていた。プローブ＃２は、ヒトの
組織因子の内部トリプシンペプチドについての最適なり
ＮＡ配列暗号に対応する単一の４５基デオキシオリゴヌ
クレオチド（４５ｍｅｒ　）であった。

４５ｍｅｔプローブの場合の最適暗号配列は、レーダ。

Ｊ１分子生物学１８３；Ｉ〜１２．１９８５が記述して
いるヒトの構造遺伝子における優先コドンに基づいて選
択した。

また第２図にはｃＤＮＡ断片部位における、１式に示す
ようなヒトの組織因子に対するｃＤＮＡ暗号の配列部分
のうちプローブ＃２と雑種形成（ハイブリッド）したも
のを示す。星印（＊）はプローブ＃２と実施例３に定め
たような、実際の組織因子ｃＤＮＡ暗号配列との間の不
適性塩基対を示している。

プローブ＃２と組織因子のｃＤＮＡ暗号との間の全相同
性は７５％であった。当初はＡｒｇと同定していた残基
１４８は後にＴｒｐと同定された。

胎盤ｃＤＮＡのライブラリーのスクリーニングは、寒天
平板に培養した大腸菌ｋ　１０８８細胞の菌叢に組換え
ファージを平板分離する方法で行った。

λｇｔｌｌの宿主である大腸菌に１０８８はアンピシリ
ン抵抗性を与えるプラスミドｐＭＣ９及びＩａｃｌ遺伝
子（ｉａｃ２遺伝子を効率的に抑制する）を担う。ヤン
グ及びデーヴイス、サイエンス２２２ニア７８〜７８２
．１９８３を参照。スクリーニングは、主として、組換
え２ｇ１１１のプラークを寒天平板からニトロセルロー
スフィルターに移し、且つ、固定ファージＤＮＡを（３
２，）−オリゴヌクレオチド−プローブと雑種形成させ
ることにより、マニアチス他の分子クロニング：ラボラ
トリー・マニュアル、ニューヨーク市コールドスプリン
グ、コールドスプリング港ラボラトリ−、１９８２のプ
ロトコルに従って行った。

大腸菌ｋ　１０８８の上に平板分離したプレート８５ｃ
ｍにつき約３乃至５Ｘ１Ｇ’のファージを、プローブま
で複製フィルタでリフトして（コロニー／プラーク・ス
クリーン、ニューイングランドニュクリアＸ　ＳＳＣ（
Ｉ　Ｘ　５ＳＣ＝０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ、　　０．０
１５クエン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ　）　）においてＴｍ−２５℃でプローブ
＃２と雑種形成（ハイブリッド）させることによってス
クリーニングした。次いで２ＸＳＳＣ中、Ｔ　ｍ　−８
℃で上記のフィルタを洗浄、強力スクリーン（デュポン
・ライトニング・プラス）を用いてＩ６乃至４０時間、
−７０℃でオートラジオグラフィーにかけた。

プローブ＃２に対して陽性シグナルを示したファージは
主としてプラーク精製してから、ベントン及びテーヴイ
ス、サイエンス１９６．１８０〜１８２．１９７７に記
述するプローブ＃と＃３にハイブリッド形成させること
によって再スクリーニングを行い、擬似陽性を取り除い
た。

胎盤ｃ　ＤＮＡ挿入物インサートを含む約２．５Ｘ１０
Ｂの組換え１ｇ１１１フアージをプローブ＃２でスクリ
ーニングした。このライブラリーから３６の潜在陽性プ
ラークを分離、精製し、さらに、プローブ＃１及び＃３
とのハイブリッド形成によってスクリーニングした。い
づれの場合でも、プローブ＃２はプローブ＃１乃至＃３
よりも有意的に強いノ１イブリッド形成シグナルを示し
た。当初３６あった単離された組換え型λファージの中
僅かに２つが第２のプローブに反応した。組換えファー
ジλ１０，３はプローブ＃１及び＃３に対し陽性を示し
たが、組換えファージλ３，４は、プローブ＃３とのみ
ハイブリッド形成した。従って、ヒトの組織因子にかか
わるｃ　ＤＮＡ暗号を含む組換えファージ・クローンの
数は、２．５Ｘ１０’の組換え体につき２乃至３４と推
定された。このようにして、胎盤ｃＤＮＡ中に比較的多
い組織因子配列は、７Ｘ１０４乃至ｌＸ１０８　ｃＤＮ
Ａにつき１つのヒト組織因子ｃ　ＤＮＡの割合であると
推定された。

組換えファージλ１０，３とλ３，４は、その宿主生物
である大腸菌ｋ　１０８８の中で守備よく繁殖した。

これにより、ヒトの組織因子のためのＤＮＡ挿入物暗号
を含む組換えファージλ１０，３とλ３，４を大量に産
生ずることが可能になった。

実施例３ 制限（酵素）分析の結果λ１０，３には２１４７ｂｐＤ
ＮＡインサートが含まれるのに対し、λ３，４には１６
１６ｂｐインサートが含まれることが示された。λ１Ｏ
１３とλ３４の制限酵素断片ＥｃｏＲＩ　、　５ａｕ３
Ａ及びＨｉｎｄｕをファージのクローニング・ベクター
Ｍ１３ｍｐ１８と旧３ｍｐ１９の中にクローン化しくメ
ツシング、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｘｙ＋＋＋ｏ１．　１０１：
２０〜７８，１９８３）　、これによってヌクレオチド
の配列分析をしやすいようにした。２つの組換えファー
ジの各々における（ｐＮＡインサートの配列順序は　（
３５３）−デオキシアデノシン５′−（α−チオ）三リ
ン酸（アマ−ジャム；　５００ｍＣ１／ｍモル）を用い
、サンガー他、ＰｒｏｃＮａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　７
４：５４６３〜５４６７１９７７によるチエインターミ
ネータ−法によって決定した。配列決定反応は、オート
ラジオグラフィーに先立って一晩中乾燥させた６％ポリ
アクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルで分析した。鎖長反応は
、ＥｃｏＲ１位置に関係する位置−２０と−４０に対し
相補的な１７のＭＩ３ヌクレオチドプライマーを用いて
プライマー合成したにューイングランド・バイオラブズ
；プライマー＃１２１１及び＃１２１２）。更に、ヒド
リの組織因子ｃＤＮＡの暗号配列に対して相補的な１８
の異なるオリゴヌクレオチド１８ｍａｒを実施例２に記
述したようにして合成し、Ｍ１３中の大型インサート内
に配列決定反応を開始するために使用した。

第３図に示したのは、λ１０，３に挿入したヒトの組織
因子用クローン化２１４７ｂｐｃＤＮＡ暗号全体の制限
酵素地図並びにλ３，４への対応する切断１６１６ｂｐ
ＨＡインサート（挿入物）である。これらｃＨＡの双方
ともに２つのＥｃｏＲＩ内部位置を含み、且つλ３，４
の小さい方のｃＤＮＡがλ１Ｏ１３の大きな方のＤＮＡ
インサートにすっぽり覆いかぶさって重複していること
が分った。

第３図について見ると、Ｍ１３サブクローンを形成する
のに用いる制限酵素位置は図の上部に示しである（ＲＩ
＝ＥｃｏＲ１；　５＝Ｓａｕ３Ａ　；　Ｈ３・Ｈｉｎｄ
ｍ）　。中空の細長い部分と黒く塗りつぶした横線部は
、各、シグナルペプチドと成熟タンパクの暗号部位を表
わしている。同じく第３図の２番目と３番目のラインは
、λ３．４とλ１０．３への組織因子ｃＤＮＡインサー
トの相対的大きさと位置をそれぞれ示している。

波線部はＭ１３サブクローンから決定したＤＮＡ塩基配
列の長さと方向を示す。丸で示したのは、配列決定反応
を開始させるため合成プライマーを用いた個所である。

これらのプライマーは、ヌクレオチド２８３−２６７　
、３２６乃至３３９　、５３９乃至５２７゜８２１乃至
８３８　、１０７５乃至１０３９．１３１０乃至１２９
３゜１８７５乃至１８５７及び１８７５における２１４
７ｂｐｃＤＮＡの配列順序に対応している。ヌクレオチ
ドの配列は、ＤＮＡの両ストランドにつき、成熟組織因
子アポタンパク質のｃＤＮＡ配列は１００％、ｃＤＮＡ
配列全体は約８０％として決定した。

ヒトの組織因子用のλ１０，３暗号からの２１４７ｂｐ
ｃＤＮ＾全体のヌクレオチド配列を１式に示す。式Ｉに
おいて、２１４７ｂｐｃＤＮ＾は、ヌクレオチド１１２
乃至１１４におけるＡＴＧ開始コドンからヌクレオチド
９９７乃至９９９におけるＴＡＡ停止コドンに延びる約
８８５ｂｐの単一な、長い読取り枠を含んでいる。

２６３アミノ酸のヒトの成熟組織因子アポタンパク質の
前駆体である２９５アミノ酸の前駆動体タンパクに対し
この読取り枠が暗号化を行う。また、同じく式■にＤＮ
Ａ塩基配列から導いた前駆動体タンパク質の配列全体を
示す。実施例１で決定したようなヒトの成熟組織因子（
Ｓｅｒ−Ｇ１７−Ｔｈｒ−Ｔｈｔ−Ａｓｎ）のアミノ端
未配列との比較に基づき、この前駆動体タンパクには３
２アミノ酸リ一ダー配列またはシグナルペプチドが含ま
れることが分った。

１式に見る通り、２１４７ｂｐｃＤＮＡに対応するｍＲ
ＮＡの５′不翻訳部位は、他の多くの真核生物シグナル
ペプチド部位の場合と同じ＜ＧＣがきわめて豊富（Ｇ十
〇で７２％）である（例えば、大野他、ネイチャー３２
５：１６１〜１６６、１９８７参照）。暗号化部分につ
づ＜　１１４７ヌクレオチドの３′不翻訳配列は僅かに
ＡＴが高かった（Ａ＋Ｔで６３％）。ヌクレオチド２１
２１乃至２１２６における配列ＡＡＴＡＡＡはその後の
ヌクレオチド２１４２乃至２１４７で６つのＡ残基が並
んでいるので、明らかにｍＲＮＡのポリアデニル化であ
る。

式■に揚げる組織因子のＤＮＡ塩基配列順序暗号化の精
度は、組織因子用ｃＤＮＡ暗号化の読取り枠から予想さ
れるタンパクのアミノ酸配列と、ヒトの脳と胎盤から精
製し、式Ｉに記すタンパクの配列順序決定技術によって
配列を定めた無傷の組織因子とそのトリプシン消化物の
アミノ酸配列とを比較して評定した。

上述のようなアミノ酸配列によって確認した組織用ｃＤ
ＮＡ暗号化の読取り枠の配列から予想される組織因子ア
ポタンパク質のアミノ酸配列部分を式■のアングライン
を施した個所で示す。成熟タンパクの暗号化部位の合計
７１．５％をアミノ酸配列分析によって確認し、ペプチ
ド配列はすべて予想したペプチドと合致した。λ１０．
３とλ３，４双方のｃＤＮＡインサートのＤＮＡ塩基配
列からグルタミン酸であり、且つまた残基２０２乃至２
１５にまたがるペプチドの気相配列決定に基づいてグリ
シンであると予想された残基２０８を除き、タンパクま
たはペプチドの配列決定によって決定された残り２６２
のアミノ酸残基は、すべて、組織因子用ｃＤＮＡ暗号化
の配列から予測した、１式に示すタンパク質配列と一致
した。以前はヒトの組織因子のアミノ酸配列の全貌は知
られていなかった。このようにして、ヒトノ組織因子用
２１４７ｂｐｃＤＮＡ断片の暗号化により、１式に示す
ようにアミノ酸配列をもつ実質的に純粋なヒトの組織因
子を合成することが可能になった。

実施例４ ヒトの組織因子アポタンパク質の特徴づけ脳と胎盤から
精製したアポタンパクにつき実施例１に示したようにし
てヒトの組織因子のアミノ産配列を決定した。これら２
つの精製物の配列は互いに等しく、また２１４７ｂｐｃ
ＤＮ＾断面のｃＤＮＡ配列から予測したアミノ酸配列と
も一致した。脳の組織因子のアミノ酸残基１乃至２２と
胎盤タンパク質の残基１乃至３８は１式に示す組織因子
の予測配列と同一であった。無傷のタンパクのアミノ酸
配列の多環は、残基２基分だけ相からづれた重複配列の
ある２つのＰＴＨアミノ酸を与えた。この解読内容はｃ
ＤＮＡ配列から導いた一次構造と一致している（１式）
。従って、脳と胎盤組織から単離した組織因子アポタン
パクの約半分に最初の２つのアミノ酸が欠けていたこと
になる。位置１１にはＰＴ■アミノ酸は全く見られなか
った。これは、この共通のＮ一連鎖グリコセル化位置（
Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒ／においてＡｓｎ残基がグリコセル
化したためと思われる（例えば、マーシャル、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、　　Ｓｙｍｐ４０：１７〜６．１
９７４を参照）。

１式に示す成熟組織因子のアミノ酸配列の全体は、実質
的に純粋な組織因子アポタンパク質の分子量を約２９．
６００とするが、これは以前、ヒトの組織についてブロ
ンズ他、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０１０９１７〜
１０９２０．１９８５　、グハ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　ＡｃａｄＳｃｉ、　８３：２９９〜３０２．１９
８６　、が５ＤＳ−ＰＡＧＥで評定した４４、０００乃
至４６．０００の分子量に比べて小さい。この差異を調
べるため、脳及び／または胎盤から精製した組織因子を
酵素的、化学的に脱グリコジル化し、その結果得たアポ
タンパクのＭｒを決定した。

胎盤組織因子（５μｇ）は、トリフルオロメタンスルホ
ン酸（ＴＦＭＳ）を用い、エツジ他、ＡｎａｌＢｌｏｃ
ｈｅｍ、　１１８　　：　１３１乃至１３７　、１９８
１の方法により化学的に脱グリコジル化した。タン゛バ
クはアセントン５ｖｏ１．で沈殿させ、５０００Ｘ’ｇ
で３０分ペレット化した後、真空乾燥した。次いでアニ
ソール２０μｍとＴＦＭＳ４０μｌをこれに加えた。試
験管は３０秒間チッ素でフラッシングし、密栓した上３
時間これを氷冷した。次いで、タンパクの沈澱を早める
ために５μｌのピリジンを添加、３ｍｌのエーテル：ヘ
キサン（９：ｌ）で３度にわたってサンプル抽出を行っ
た。最後にこれによって生成したペレットをアセントを
用いて一回限り抽出した。

組織因子からストイブ他、生化学２４＋３５８７〜３５
９２、１９８５が記述しているようなエンドグリコシダ
ーゼを用いた消化作用によりアスパラギン連鎖炭水化物
を酵素によって切り離した。またヒトの胎盤組織（５μ
ｇ）を上述したようにしてアセトンで沈降させた。次い
で、タンパク質ペレットを０．５％β−オクチル−Ｄ−
グルコピラノシド、２０ｍＭのＥＤＴＡから成る緩衝液
４０μｌ中に溶解し、これにｐＨ６，１の酢酸ナトリウ
ム５０ｍＪ及びエンドグリコシタ−セＦ　（０，１ユニ
ツト、ベーリンガーマンハイム、グレード■）を添加し
た。３７°Ｃで１６時間静置した後、アセトンが沈降し
て反応が終息した。

この後、化学的、酵素的脱グリコジル化の生成物をスワ
ンク及びムンクレス、Ａｎａｌ、　　Ｂｉｏｌｃｈｅｍ
３９：４６２〜４７７、１９７１の５ＤＳ−尿素ゲルシ
ステムによりＰＡＧＥで分析した。

未処理の組織因子を見掛けＭｒ４２．０００でスワンク
及びマンフリーズのＳＤＳ／尿素ＰＡＧＥシステム内に
移動させた。この値はラエムリの５ＤＳ−ＰＡＧＥシス
テムで観察された見掛け！Ｊｒ４６．０００とは優位的
に差があり、従って界面活性剤の結合が異常ではないか
と考えられた。ＴＦＭＳにより脱グリコジル化したタン
パクの場合スワンク及びマンフリーズのシステム内では
見掛けＭｒが３４，５００であったのに対し、酵素によ
って脱グリコジル化した原料の値は３３，５００であっ
た。従って炭水化物は組織因子の見掛けＭｒに対し約７
，５００乃至８．５００ダルトンの寄与をしていること
になる。化学的消化と酵素による消化の結果は本質的に
は同じものであったのでこの炭水化物はすべて（Ａｓｎ
＾）Ｎ一連鎖しているものと考えられる。

また、１式におけるヒトの組織因子の配列順序全体につ
き、ワシントンＤＣ，国立生物化学研究所（ＮＢＲＦ）
のタンパク質配列データベースの中の４６６８の配列と
の相同性を調べた。リップマン他、サイエンス２２７：
１４３５〜１４１１１９８５のＦＡＳＴＰプログラムを
用いて相同性を調べたが、ヒトの組織因子とデータベー
ス中のどのタンパク質との間にも有意なアミノ酸配列の
相同性は一切見られなかった。

特に、１式に示す組織因子の配列と他の凝固タンパク、
例えば、トロンボモジュリン、因子■、因子Ｖの周知の
アミノ酸配列との間には１次アミノ酸配列の類似はまっ
たく見られなかった。

実施例５（第４図） プラスミドＰＫＳ−２Ｂの構造 ファージλ１０１３のＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎｌと５ｓ
ｌｌで消化したところ組織因子の２１４７ｂｐｃＤＮＡ
インサートの暗号全体及びインサートの両側からの約１
０００ｂｐのλフアージＤＮＡを含むＤＮＡフラグメン
トが得られた。このよにして得た約４．１５ｋｂのＫｐ
ｎｌ／ＳｓＮのフラグメントをあらかじめＫｐｎｌと５
ｓｔｌ　（ママ）で消化しておいたプラスミドｐＵｃ１
９のＩａｃＺ遺伝子（ノランダー他、遺伝子２６：１０
１，１９８３　　、ヤニッシューペロン他遺伝子３３：
１０３．１９８５　）内にクローン化した。その後、こ
の組織因子遺伝子を含む組換えプラスミドｐＫＳ−２Ｂ
を得、これを用いて、ｐＵｃｌ、９の宿主である大腸菌
７１−１８への転換を行った。大腸菌７１−１８／ｐＫ
Ｓ−９Ｂの形質変換体はその後の研究及びヒトの成熟し
た組織因子アポタンパク（実施例７）とヒトの可溶性組
織因子（実施例８）を産生ずるための形質発現ベクター
の構成、並びにヒトのゲノム組織因子遺伝子（実施例６
）の局在化と特徴づけのためのこの上ない組織因子遺伝
子源を提供ｑることになった。

実施例６ ヒトの組織因子暗号のゲノムＤＮＡへの局在化サザン式
プロット分析によるハイブリダイゼーション技法により
、組織因子の暗号化配列を約９．５ｋｂフラグメントの
ゲノムＤＮＡに局在化した。

適当な膜に対して電気泳動を行った後のアガロースゲル
からのＤＮＡ制限酵素フラグメントのトランスファー、
これに続く特定のプローブを用いてのハイブリダイゼー
ションを含むこの過程を多くの研究に利用しゲノムの組
織と機能を分析した。

プラスミドｐＫＳ−２Ｂから、２１４７ｂ９の組織因子
ｃＤＮＡのヌクレオチド９０乃至１３４０を含む１．２
５ｋｂの５ａｕ３Ａ／ＨｉｎｄｌＤＮＡフラグメントを
得た。ヒトの組織因子全体の読取り枠（ＯＲＦ）を含む
この１，２５ｋｂフラグメント及び１１０ｂｐの５′−
非翻訳配列と３４３ｂｐの３′−非翻訳配列を用いてヒ
トのゲノムＤＮＡにおける組織因子の暗号化配列を探っ
た。

ヒトの胎盤のゲノムＤＮＡ全体を１パネルの制限酵素で
消化させた。各消化物３μｇを１０％のアゲロースゲル
で電気泳動させてから１５分間０．２５ＭのＭＣＩで処
理した。電気泳動に続いてこのような短時間の酸処理を
行うことによりＤＮＡは部分的に脱プリン化され、ＤＮ
Ａは膜に向って移動しやすい細片に分割された。長さが
５ｋｂを越えるＤＮＡフラグメントの定量的移動にはこ
の酸処理の段階が特に重要であった。

酸処理の後、上記のゲルを蒸留水で水洗いしその上にナ
イロン製のトランスファーメンブレン（膜）（ゼータプ
ローブ０、バイオラッド）をかぶせた。制限酵素の膜へ
のトランスファー（移動）は、０．４ＮのＮａＯＨ溶液
の存在化で一晩静置して行った。このようにして転移し
たＤＮＡは膜との共有結合をするに至った。

ｐＫｓ−２Ｂからの１．２５ｋｂＳａｕ３Ａ／旧ｎｄｌ
フラグメントを用いて組織因子暗号配列のための消化ゲ
ノムＤＮＡを探った。ハイブリダイゼーションに先立ち
、ファインバーブ及びフォーゲルシュタイン、Ａｎａｌ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１３２：５，１９８３；　　Ａ
ｎａｆ、Ｂｉｏｃｂｅｍ１３７二２６６、１９８４に記
述されているランダム・プライミング法を用いて上記フ
ラグメントを約５Ｘ１０’　ｃｐｍ／μｇという極めて
高い非活性まで放射能でラベルした。

パイラッド公報１２３４に記載の技術に従って、膜と結
合したゲノム制限酵素断片へのラベルした１、２５ｋｂ
断片のサザン法によるプロッティング（雑種分子形成）
を行った。ハイブリダイゼーションに先出し５０％ホル
ムアミド、４ＸＳＳＰＥ　（２０ＸＳＳＰＥ　＝３．６
　Ｍ　　Ｎａｃｌ、　　０．２　Ｍリン酸ナトリウム、
ｐＨ７，０゜０．２　Ｍ　　ＥＤＴＡ）　、１％ＳＤＳ
　、　０．５％プロット（Ｂｌｏｔｔｏ）及び０．５ｍ
ｇ／ｍｌの担体ＤＮＡ　　（サケの精子）を用いて上記
の膜を４７℃で処理した。１０％のプロットは、１００
　ｍｌの電離防除を施した無菌水の中に脱脂粉乳（ディ
プロマ）Ｉ０ｇを懸濁させ、これにアジ化ナトリウムを
加え全体の濃度を０．２％として調製した。非特異的ハ
イブリダイゼーションを最小限に抑えるため、ハイブリ
ダイゼーション前の段階で担体ＤＮＡを使用した。

４７％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、３ｘＳ
ＳＰＥ、　１％ＳＤＳ及び０．５％のプロット中に放射
能でラベルした１、２５ｋｇの組織因子ＤＮＡプローブ
を含むハイブリダイゼーション・カクテルを使用してハ
イブリッド形成を行った。またハイブリッド形成の直前
にプローブを０．２ＭのＮａＯＨ中に放射能でラベルし
た１、２５ｋｂフラグメントを溶解することによって断
片化し変性させた。担体ＤＮＡを余分に加え、こうして
できた混合物を短時間攪拌し遠心分離した。混合物はハ
イブリダイゼーションカクテルに添加する前に約５分間
１００℃で加熱した。

消化されたヒトのゲノムＤＮＡを含む膜はプローブ／ハ
イブリダイゼーションカクテルと共に４７℃（Ｔｍ−１
１℃）で−晩装置した。次いで２ＸＳＳＣ１０，１％Ｓ
ＤＳを用い室温で１５分間洗浄した。さらに０．１％Ｓ
Ｏ３を用い１４分間にわたり５０℃（Ｔｍ−５°Ｃ）で
このプロットを洗浄した後、増感スクリーン１枚を用い
一７０℃で一晩Ｘ線フィルム（ＸＡＲＸ−オーマット、
コダック社）に露光した。

組織因子暗号配列を含む１．２５ＤＮＡフラグメントを
胎盤のゲノムＤＮＡの種々の制限酵素消化物とハイブリ
ッド形成させた結果が示された。レーン１とレーン８は
対照消化物、即ち、Ｈａｃ［Ｏｘ／Ｈｉｎｄｌで消化さ
れたファージλＤＮＡである。レーン２は画法で消化さ
れたヒトのＤＮＡ　、　　レーン３はＥｃｏＲＩ消化物
、レーン４は旧ｎｄ［消化物、レーン５はＰｓｔ消化物
、レーン６はＳ　ａ　１１３Ａ消化物、レーン７は５ｓ
ｐｌ消化物である。第４図の右側に示したのは所定の長
さ（ｋｂ）のＤＮＡの電気泳動移動度である。

１．２５ｋｂの組織因子プローブが各７．Ｏｋｂと２、
５４６ｋｂの二つの旧ｎｄｌフラグメント、各４．２゜
３．０　、１．５　、０．７ｋｂの４つのＰｓｔｌフラ
グメント、各４．５　、３．８　、０．９８．０．３５
の４つの５ｓｐｌフラグメントとそれぞれハイブリット
を形成しているのがサザン式プロット分析（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎｂｌｏｌ）から分った。この情報に基づき、組織
因子のＤＮＡ暗号にまたがる染色体遺伝子の大きさは約
９．５ｋｂと決定した。

実施例７ ヒトの組織因子の形質発現 ヒトの組織因子の構造遺伝子の形質発現のためにいくつ
かの宿主系を選択した。例えば、大腸菌、ＣＨＯ細胞や
昆虫の細胞である。

周知の技術を用いてこれらの宿主系の中で形質を発現さ
せ、選択された宿主内に組織因子を発現させるための形
質発現ベクターを構成することができる。例えば、大腸
菌に対してはＭ１３／μＵＣベクター、ＣＨＯ細胞に対
しては哺乳動物のシャトルベクター、昆虫細胞の場合に
はバキュロウィルスである。組織因子の形質発現は、酵
母形質発現ベクター、例えばＣＹＣｌ、　ＹＣｐＣＹＣ
ｌ　、　ＹＲｐＣＹＣｌ　。

ｄＹｅＣＥＮ３を用いて酵母細胞内で行うことが可能で
ある。

（１）　　プラスミドｐＴＬ８ＦＱの構造プラスミドｐ
ＴＬ８ＦＱは、適当な宿主、例えば大腸菌７１−１８の
中でヒトの組織因子のアポタンパク質の形質を発現させ
るが、これは次のようにして構成した。

第４図において、実施例６で得たようなｐＫｓ−２Ｂか
らの１．２５ｋｂの５ａｎｌＡ／Ｈｉｎｄｌｌフラグメ
ントをクローニングベクターＭ１３ｍｐ１９のＢａｍＨ
Ｉ／［１ｉｎｄｌ［で消化されたＤＮＡと連結反応させ
てベクターＭ１３／ＬＢ２ＴＦを産生した。

第５Ｃ図に示したＴＦＡＤオリゴヌクレオチド配列を利
用し、座位特異的突然変異誘発により、Ｍ１３／ＬＢ２
ＴＦから１重複鎖ＤＮＡ内組織因子暗号部位のヌクレオ
チド２０１と２０２の間に６つの塩基を挿入し、遺伝子
内にＰｓｉ切断座位を形成した。

その構造はＭ１３／ＬＢ３ＴＦと呼ばれているが（第５
Ａ図）、これをＰｓｆｌと旧ｎｄｌｌで消化させ、Ｐｓ
ｊｌ／Ｈｉｎｄｕで消化した９ＵＣ１９ＤＮ八と連結反
応させることにより第５Ａ図に見るようなプラスミドｐ
ＬＢ４ＴＦを産生じた。

次にＧ８ＰＳＴと称するオリゴヌクレオチド（第５Ｃ図
）を用いて、Ｍｉ３遺伝子■のリーダー配列のすぐ下流
のバクテリオファージｔｇ１３１（多種クローニング部
位を含むファージＭ１３の誘導体）から部位特異的突然
変異誘発により、１重鎖ＤＮＡの中にＰｓｔ１部位を挿
入し、これにより！１ｌ１３／ＴＬ１３１Ｐ　（第５Ｂ
図）を形成した。次いでＭＩ３／ＴＬ１３１Ｐからの１
００ｂｐ　５ｎａＢＩ／Ｐｓｔｌフラグメントをプラス
ミドｐＬＢ４ＴＦのＰｓｌｌ／Ｓｍａ１部位に挿入して
プラスミドｐＴＬ８ＴＦを産生じたが、このプラスミド
ｐＴＬ８７Ｆには、Ｍ１３遺伝子■リーダー配列用ＤＮ
Ａ暗号とヒトの組織因子用の構造遺伝子がともに含まれ
ていた（第６図）。次いでプラスミドｐＴＬ８ＴＦを５
ｓｔｌと旧ｎｄｌで消化させて遺伝子■リーダーと組織
因子構造ＤＮＡの配列を含む１２５２ｂｐの制御酵素フ
ラグメントを産生じた。その後このフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動によって単離し、５ｓｔＩと旧ｎｄ
ｌで直鎖状にしてあったプラスミドｐＴＬ１３１Ｑの中
ヘクローン化した（第６図）。

プラスミドｐＴＬ１３１Ｑは、ｉ　ｇ　１３１　ＤＮＡ
をプラスミドｐｔａｃ−１２の唯一のＰｕｖ［Ｉ坐位に
ｔｇ１３１のＤＮＡを挿入して予め形成させておいたも
ので、プラスミドｐｔａｃ−１２はジョン・ブロシウス
博士から入手していたものである。プラスミドｐｔａｃ
−１２はｐＢＲ３２２誘導体の一種でアマン他、遺伝子
２５：１６７〜１７８．１９８３によって開示されたよ
うなハイブリッドの“ｔａｃ’　　（ｔｒｐ／Ｉａｃ）
プロモータ遺伝子を含んでいる。ファージｔｇ１３１の
ＤＮＡはＢｇｌｎで切断され、ＥｃｏＲＩは、大腸菌の
ＤＮＡポリメラーゼエのフレノウフラグメントを用いて
プラントエンドに転換された。このＩ）ＮＡをｐｔａｃ
−１２のＰｖｕ■部位に挿入したところＢｇｌｌ［の部
位は破壊されたが組換えｐＴＬ１３１Ｑ中のＥｃｏＲ１
部位は復活した。今度はプラスミドｐＴＬ１３１Ｑにｔ
ａｃプロモーター遺伝子が含まれていた。これはイソプ
ロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導できる。

１２５２ｂｐフラグメントをｐＴＬ８ＴＦからｐＴＬ１
３１Ｑに挿入したところ組換え形質発現ベクターｐＴＬ
８ＦＱ（第６図）を結果したが、これは、大腸菌７１−
１８のような適当な宿主の中ではヒトの組織因子アポタ
ンパク質の形質を発現させる。

（２）　　大腸菌／ｐＴＬ８ＦＱ形質転換体におけるヒ
トの組織因子の発現 次いでプラスミドｐＴＬ８ＦＱを用いて大腸菌７１−１
８の形質転換を行った。ヒトの組織因子遺伝子をプラス
ミド中のｔａｃプロモーター遺伝子と対照させたので、
大腸菌７１−１８／ＤＴＬ８ＦＱ形質転換細胞中のヒト
の組織の形質を最大限に発現させるよめにＩＰＴＧを使
用した。形質発現を誘導した後、実施例１のような２段
階血液凝固検定法を用い、細胞の音波処理をして組織因
子活性を検定した。

形質転換細胞の抽出物は、約６Ｘ１０１ユニツト／■タ
ンパクの組織因子の比活性を示した。このタンパク質は
、培養菌１　ｍｌにつきｌｎＨのヒトの組織因子に対応
する。比較の標準として実施例１で調整したようなヒト
の精製組織因子タンパクを使用した。

坑ヒト組織因子単りローン性抗体を用いてウェスターン
法によるプロッティング（吸収転移）分析をしたところ
、単りローン性抗組織因子抗体と特異的に反応すタンパ
ク質の存在が、立証された。レーン１には分子量標準液
を通した。

レーン２は全大腸菌７１−１８／ｐＴＬ８ＦＱ形質転換
細胞抽出物、レーン３は、音波処理した大腸菌７ｌ−１
８ｐＴＩ、８ＦＱ形質転換細胞の遠心分離の結果得られ
た上清、レーン４は、大腸菌７１−１８／ｐＴ１８ＦＱ
形質転換細胞の遠心分離の結果得られたペレット。２つ
のバンドの近似的分子量は各３５．０００と３３．００
０であった。３５に対３３にの比は約５：ｌであった。

大きな方のタンパクは、Ｍ１３遺伝子■のリーダー配列
を有するタンパクと思われる。

大腸菌やＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞な
どの哺乳動物の形質を転換できるシャトルベクター、ｐ
ＭＡＭ　（クローンチック、ｃａｔ＃６１００−１より
得たもの）を選択し、適当な哺乳動物宿主の細胞、例え
ばＣＩＯ細胞中にヒトの組織因子を発現する哺乳動物ベ
クターの構成を試みた。このｐＭＡＭベクターにはマウ
スの乳房腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）のプロモーター遺伝
子などの目的に適合する若干の重要な特徴を備えている
。

ＭＭＴＶは転写及びＭＭＴ’／プロモータ遺伝子に隣接
する多数のクローニング部位のデキサメタシン調節を可
能にし、また、大腸菌のグアニン、フォスフオリボシル
トランスフエラーゼ用の遺伝子を許容する。このトラン
スフェラーゼは、選択的遺伝標識の暗号化を行って哺乳
動物の細胞の形質転換を標準したり、同じく一種の遺伝
標識であるアンピシリン耐性の暗号化を行って、大腸菌
形質転換細胞中のプラスミドを検出することを可能にす
る。また、ｐＭＡＭには、哺乳動物の細胞内でタンパク
の合成を可能にするＳＶ４０のポリアデニル化部位が含
まれている。

第７図は哺乳動物の細胞内でヒトの組織因子の形質を発
現させるのに使用できるｐＭＡＭ／ＴＦベクターを示し
たものである。このベクターは、実施例６に示したｐＫ
Ｓ−２Ｂの５ａｕ３Ａ／Ｈｉｎｄｕ　７ラグメントを次
のようにしてｐＭＡＭ内にクローン化することによって
構成した。即ち、まずｐＫｓ−２８のＤＮＡを旧ｎｄｌ
で消化させ、次いで旧ｎｄｌ切断部位にＸｈｏｌリンカ
−を加えた。その後Ｓｓｆ［で］）Ｎ＾を消化させ、５
ｓｔｌの切断部位にＸｂａｌリンカ−を添加した。こう
して得たフラグメントを、ｐｌ、ＩＡＭ／ＴＦを産生ず
るためｌ：Ｎｈｅｌとｘｈ０１ニヨル切断であらかじめ
直鎖状にしてあったｐＭＡＭＤＮＡ内にクローン化した
（第７図）。

大腸菌ＸＬ−１青色（ブルー）細胞（ストラタジーン社
から得たもの）をｐＭＡＭ／ＴＦで形質転換する。ヒト
の組織因子遺伝子の有無を調べるため、アンピシリン耐
性ＸＬ−１／ｐＭＡＭ／ＴＦ形質転換細胞をスクリーニ
ングする。組織因子の暗号配列をもつＸＬ−１の青色（
ブルー）形質転換細胞を選択し、プラスアミドを増幅、
獲得して適当なＣｌｌ０宿主細胞の形質を転換する（こ
れにはグアニン・フォスフオリボシルトランスフエラー
ゼの遺伝子暗号がない）。機能的グアニンフオスフオリ
ボシルトランスフエラーゼを獲得した細胞だけが増殖で
きるような培地、例えばＨＡＴ培地中にＣＨＯ／ｐＭＡ
Ｍ／ＴＦ形質転換細胞を選抜する。次いで、選択培地に
増殖した形質転換細胞をテストしてヒトの組織因子ＤＮ
Ａ塩基配列の有無、及びヒトの組織因子タンパク産生の
有無を調べる。

実施例８ 可溶性のヒトの組織因子タンパクの形質発現第８図にお
いて、実施例６に記述した全組織因子読取り枠（ＯＲＦ
）を含む５ａｕ３ａ／１（ｉｎｄＪの１、２５ｋｂＤＮ
ＡフラグメントをＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌ消化したｐＵ
ｃ１９に連結した。こうして得たプラスミドを、まず旧
ｎｄｌで消化、次いで５ｓｐｌで部分消化させたところ
、アポタンパク質配列のアミノ酸に近似的に対応する部
位の組織因子ＯＲＦ内に切断を生じた（Ｎ端末からの読
み取り）。消化されたＤＮＡをアガロースゲルで電気泳
動した後、成熟アポタンパクの細胞外ドメイン（近似的
にアミノ酸１−２１９／２２０）のＤＮＡ塩基配列暗号
をもった３、４４７ｂｐ断片か得られた。断片の陥入（
凹）端は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエのフレノウ断片
を用いて埋めた。

３つの読取り枠内のナンセンス（終結）コドンを含むＸ
ｂａｌリンカ−にューイングランド、ノ々イオラブ、Ｃ
ａｔ、　＃　１０６２から得たもの）をこの断片に連結
した。次いで、この断片をＸｂａｌで消化させた後、再
び連結してプラスミドｐＬＢ５ＴＦを産出した（第８図
）。

切断した組織因子のＯＲＦの３′側に接するＸｂａｌリ
ンカ−が、組織因子細胞外ドメインＣ端末のＤＮＡ暗号
のすぐ下流のプラスミド中に停止コドンを誘導する。こ
のようにしてプラスミドＰＬＢ５ＴＦは細胞外ドメイン
を含むヒトの切断した可溶性組織因子の暗号化を行う。

切断した組織因子の暗号配列を増幅するため、プラスミ
ドｐＬ８５ＴＦを大腸菌７１−１８細胞に挿入し、この
細胞による複製を行った。しかしながら、プラスミドｐ
ＬＢ５７Ｆは形質発現ベクターではなく、また大腸菌７
１−１８／ｐＬＢ５ＴＦの形質転換細胞は、可溶性組織
因子を産生じなかった。

形質転換宿主の中で細胞外ドメインを含むヒトの可溶性
組織因子の形質を発現させた形質発現ベクターｐＬＢ６
ＴＦは以下のようにして産生じた（第９図参照）。

実施例７に記述したプラスミドｐＴＬ８ＦＱをＥｃｏＯ
１０９とＡｃｃｌで消化して電気泳動にかけた。バクテ
リオファージＭ］３遺伝子■生成物のリーダー配列のＤ
ＮＡ塩基配列暗号をもつ５００ｂｌｌの断片、ヒトの成
熟組織因子アポタンパクのＮ端末アミノ酸１−３４　（
プラス、Ｎ一端末にａｌａ−ａｓｐ　　（アラニン−ア
スパラギン酸）を添加１．ｔａｃプロモーター遺伝子領
域及びベクターＤＮＡの一部を電気泳動にかけた後アガ
ロースゲルから単離し、予めＥｃｏＯ１０９とＡｃｃｌ
で消化させておいたｐＬＢ５７ＦのＤＮＡ断片に連結さ
せた。このようにして得たプラスミドｐＬＢ６ＴＦはｔ
ａｃプロモーター遺伝子を含んでいた。また、遺伝子■
リーダーのＤＮＡ塩基配列暗号は、ヒトの成熟組織因子
の細胞外ドメインのＤＮＡ配列暗号と結合していた。ｐ
ＬＢ６ＴＦは、一種の形質発現ベクターであり、大腸菌
のような適当な宿主の中では、ヒトの成熟組織因子アポ
タンパクの細胞外ドメインを含む可溶性因子アポタンパ
クの細胞外ドメインを含む可溶性の活性ヒト組織因子を
産生じた。

切断された可溶性組織因子の形質発現はｌａｃプロモー
タ遺伝子に左右されるので、ヒトの可溶性組織因子の形
質発現を最大限にするためＩＰＴＧを用いて大腸菌７１
−１８／ｐＬＢ６ＴＦ形質転換細胞誘導した。

形質転換細胞は対数増殖器の後半で回収し、標準技法を
用いてスフエコプラストと、周辺質タンパクを含む上清
フラクションに転換した。スフ二ロプラスト内、また、
大腸菌７１−１８／１ＪＬＢ６ＴＦ形質転換体の周辺質
タンパク（ペリプラズムフラクション）を含む上清フラ
ンジョン内の組織因子活性をバッハ他、Ｊ、　　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、２５６：８３２４−８３３１．１９８
１　（実施例１で記述したもの）による２段階クロッテ
ィング検定法を用いて検定した。

スフエコプラスト、周辺質フラクションの両者に低い組
織因子凝固促進活性が検出できた。スフ二口プラストの
活性は、周辺質（ぺ°リプラズム）フラクションの活性
の約１００倍であった。ペリプラズムフラクションの可
溶性組織因子の活性を高めるため、ペリプラズムフラク
ション９０Ｏｍｌに混合脳脂質（１０ｍｇ／ｍｌ）　ｔ
ｏｏ　ｍｌと０．２５％のデオキシコール酸塩１００　
ｍｌを添加し、この混合物を５　ｆｌｍＭのトリス−Ｈ
ＣｌｐＨ７，５、１００ｍＭのＮａＣｌ２５０　ｍｌで
一晩中透析した。２段階のクロッティング検定法を用い
組織因子の活性を調べるため分割量（アリコート）を分
析した。

ペリプラズム・フラクションへのレリピデーション（脂
質強化）の結果、組織因子の活性は、スフェロプラスト
断片（フラクション）のレベルに近いところまで増大し
た。

実施例１に記述した単クローン抗ヒト組織因子抗体を用
いて調製した免疫吸着カラムで免疫親和性クロマトグラ
フィを行うことにより可溶性組織因子を精製することが
できた。０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ、　ｐＨ２，１を
用いカラムから可溶性組織因子を溶離した。

スフエコプラストとペリプラズマ・フラクション中の可
溶性のヒトの組織因子及び抗体精製可溶性組織因子につ
いても、ヒトの組織因子に対する単クローン抗体を用い
、ウェスターン法によるプロット分析によって分析した
。ペリプラズム・フラクションには抗体と結合して分子
量的３０．０００の単タンパクが含まれていたのに対し
、スフエコプラストには、分子量が約３２，５００．３
０．０００ダルトンの２つのタンパクが認められた。こ
れらのサンプルを次のようなゲルに加えた。即ち、レー
ン１はＭＷ標準物、レーン２はスフェロプラズムフラク
ション、レーン３はペリプラズム・ファンクション、レ
ーン４乃至６は、免疫吸着カラムからのブレークスルー
、フラクション、レート８はグリシン−ＨＣｌを用いて
免疫吸着カラムから溶離したヒトの可溶性組織因子。上
記の中、大型のタンパクは、Ｍ１３遺伝子■リーダー配
列を含む前駆体タンパク質と思われるが、これは、結果
として、タンパクが放出されて細胞周辺腔に入ると共に
ヒトの可溶性組織因子から除去される。抗原性の物質は
スフ二口プラストにもペリプラズム・フラクションにも
等しく分布しているように思われた。更に、ヒトの可溶
性組織因子タンパクは免疫吸着カラムで簡単に離脱でき
た。

大腸菌７１−１８／ｐＬＢ６ＴＦ形質転換体精製物の第
２のウェスターン法によるプロットかにじんだ。レーン
１には分子量標準物質を含み、レーン２と３は精製した
可溶性組織因子を含む。生成物の凝固促進活性はタンパ
ク１■につき約１．９Ｘ１０４ユニツトと決定された。

従って可溶性組織因子は、無処理のアポタンパク質に較
べはるかに活性の低い凝固促進剤である。しかしながら
、可溶性タンパクは因子■と結合するのであり、従って
無処理のアポタンパク質と因子■が結合するのを阻害で
きる。

実施例９ （ａ）プラスミドｐＴＬ８ＴＦＡ−１の構造精製したフ
ァージＤＮＡ　　（実施例２乃至３）を制限酵素Ｋｐｎ
ｌ、　５ｓｔｌと共に切り取り、２．２ｋｂフラグメン
トをプラスミドｐｔｌｃ１９の中にクローン化した［Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ、　１．　（１９８３）　ｒ酵素学的方法
Ｊ　１００２０乃至７８］。これは事前にＫｐｎｌ及び
５ｓｔｌとリニアにしてあったものである。白色集落を
スクリーニングして得たプラスミドｐＬＢＩＴＦ　（第
１０図）を単離、精製し、また酵素５ａｕ３ａと旧ｎｄ
ｌで制御して、ヒトの組織因子のコード領域を含む１２
５２ｐｂフラグメントを得た。このフラグメントは、ゲ
ル電気泳動による単離の後、ＢａｍＨＩと旧ｎｄｌによ
る消化によって多重クローニング部域にオープンしてあ
ったファージｍｐ１９のＲＦ型の中にクローン化した。

これによって得たファージ１３／ＬＢ２ＴＦを青色／白
色コロニー・スクリーニングを用いて単離した（第５図
）　。Ｋｕｎ　Ｋｅｌ、　Ｔ、Ａ、　（１９８５）　Ｐ
ｔｏｃ、　Ｎａｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ８２．　４８８−４９２のクンケル
法により組織因子の構造遺伝子の５′末端にｐｓｔ１部
域をつくるためにオリゴヌクレオチドの突然変異誘起を
用いた。使用したオリゴヌクレオチドの種類は５’ＧＧ
ＴＧＧＣＣＧＧＯＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＣＡＧＧＣＡＣ
ＴＡＣＡ　３’である。

Ｍ１３／ＬＢ３ＴＦのＲＦ型（第５図）はＰｓｔｌと旧
ｎｄｌで消化させ、組織因子の暗号配列を含む１１５０
ｂｐフラグメントは、プラスミドｐＬ８４ＴＦを与える
ためＰｓｔｌと旧ｎｄｌでオープンにしてあったｐＵｃ
ｌ、９のリニア型につないだ（第５図）。

組織因子の構造遺伝子を、組織因子遺伝子生成物が細胞
周辺腔に分泌できるような形に変換するため、Ｐｓｔｌ
と５ｎａＢｌに消化させることにより、Ｍ１３／ＴＬ１
３１Ｐから、バクテリオファージＭ１３遺伝子■のリー
ダー配列と対応するリポソームの結合部位に対する制限
フラグメントの暗号づけ（ニーディング）を得た。この
１００ｂｐ　フラグメントは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いＰｓｉと５ｎａＢｌで切断してあったｐＬＢ４ＴＦに
挿入した（実施例７．第５図）。その結果得たプラスミ
ドｐＴＬ８ＴＦ　（実施例７．第６図）は、Ｕ…プロモ
ータの上流部域に存在する組織因子構造遺伝子に先立ち
、遺伝子■リーダーを含む５ｓｔｌ−Ｈｉｎｄｌフラグ
メントを挿入することにより組織因子の形質発現に有用
なベクターに転換した。

このことは、１ｌＴＬ１３１Ｑ　　（実施例７．第６図
）をＳｓＮと旧ｎｄｌで制限し、かつ、第８図に示すよ
うにｐＴＬ８ＴＦから５つのｐＴＬ８ＦＱ　（実施例７
）まで５ｓｔｌ−Ｈｉｎｄｌ制限フラグメントでつなぐ
ことによって実施した。プラスミドｐＴＬ８ＦＱ　（実
施例７）は、組織の構造遺伝子に種々の欠失をつくる場
合に親としての役割を果す。

ｐＴＬｌｌＦＱは旧ｎｄｌと５ｓｐｌに消化させ、また
Ｘｂａｌリンカ−を消化させたｐＴＬ８ＦＱにつないで
ｐｌ、Ｂ６ＴＦを得た（第１１図）　。ｐＴＬ８ＴＦは
ＡｌｕｌとＰｓｔｌに消化させた。

組織因子の細胞外ドメインのすべてに対する。また細胞
膜に及ぶ領域のうち残り６ケ所に対するコード領域を含
む７００ｔＵフラグメントをアガロースゲル電気泳動に
よって単離し、Ｐｓｌｌ−Ｘｂａｌ　フラグメントをあ
らかじめ除去してあったｐＬ８６ＴＦのリニア型とつな
いだ。このことは、まず初めに、ＸｂａｌにｐＬＢ６Ｔ
Ｆを消化させ、５′の突出部に大腸菌ｐｏｌ　ＩＫｌｅ
ｎｏｗのフラグメントを用いてｄｌＪＴＰを充填して平
滑末端を得、次いで、この型をＰｓｔｌで消化させた後
、大フラグメントを電気泳動で単離することによって行
った。上述した７００ｂｐフラグメントをｐＬＢ６ＴＦ
の大フラグメントと連結させることにより、第１２図に
示すようなｐＴＬ８７Ｆ−ＡＩが生成し、これにともな
い、切り取ったヒトの組織因子と称されるヒトの組織因
子のＣ０ＯＨ末端から３７−残基の欠失を見た。

（ｂ）切り取ったヒトの組織因子の形質発現ｐＴＬ８Ｔ
Ｆ−ＡＩを大腸菌株７１−１８に転換し、細胞が対数増
殖期の半ばに達するまで（Ｄ５７０　”０．５　）ルリ
ア培養液の中で３７°で増殖させた。ｐｔａｃプロモー
タからの転写誘導はイソプロピルチオガラクトシド（Ｉ
ＰＴＧ）　（培養ｍｌにつき２マイクロリツトル）を添
加して行い、また細胞は４時間２５°に保った。

次いで遠心分離によって細胞を回収し、０．１Ｍのトリ
ス緩衝液ｐＨ７，５で１回洗浄した後、この緩衝液に再
度懸濁させて希釈スラリーを得た（緩衝液１０ｍ１につ
き細胞５グラム）　。ＣＩ（ＣＩ３　１　ｍｌを加え、
混合物を２分間烈しく震盪させ、７０００ＲＰＭで遠心
分離にかけてから水層をデカントし、次の段階の精製に
そなえた。上記の手順を繰返し、水層と水層を混ぜた。

抽出物３０ｍ１を３時間冷室内において１ｍＭのベンズ
アミジン−〇ＣＩを含む２リツトルの１０ｍＭ　）リス
−ＣＩｐＨ７，５で透析した。透析後の混濁した状態の
懸濁液をベックマン冷凍遠心分離機で１５分間１５００
０ＲＰＭで遠心分離した。沈殿物を捨て、上澄液（３０
ｍｌ）を用いて切り取ったヒト組織因子を精製した。

３０ｍ１の上澄液はＦＰＬＣシステム（ファルマシア）
（サイズ：ＩＸ２０ｃｍ）のモノＱカラムにスーパール
ープを用いて注入した。勾配は１０ｍ１リス−ＣＩｐＨ
７，５（トリス−ＣＩｐＨ７，５１０ｍＭ中にＮａＣｌ
　０．３Ｍ）。流量は毎分２ｍｌ、２ｍｌ／管の画分を
３５％で捕集した（ＮａＣ１約０．１０５　Ｍ）　。１
ｓｏｃｒａｔｉｃ　５ｔｅｐ　（１４ｍｌ）を用いた。

ｌ５ｏｃｒａｆｉｃ　５ｔｅｐの最終段階において切り
取ったヒト組織因子を溶出した。切り取ったヒト組織因
子は、ドツトプロット、ウェスタン−ブロッティング及
び５Ｏ９−ポリアクリルアミド電気泳動を用いて特定し
た。切り取ったヒト組織因子を含むプールピーク（＃１
２乃至１４．約１０ｍ１）を３時間、５００ｍ１の１０
ｍＭ　トリス−ＣＩｐＨ７，５で透析した。

透析を終えたサンプルをモノＱカラムに供し、最終のが
ラムと同じ条件でクロマトグラフィー処理した。

切り取ったヒト組織因子タンパクは４０％（約０．１２
Ｍ　　ＮａＣＩ）で溶離した。プールピーク（＃２６乃
至３０．約１０ｍ１）をセントリコン１０を用いて濃縮
、約０．５ｍｌとした。

０．５ｍのＮａＣｌを含む１ｈ＋Ａ　トリス−ＣＩｐＨ
７，５の緩衝液中にスーパーローズ１２カラム（ＩＸ３
０ａｎ）により切り取ったヒト濃縮組織因子を注入した
（流速０．２５ｍ１／分）。０．５ｍｌ／管の画分を逮
集した。

単一シンメトリカルピークの画分＃２９乃至３０（全量
：１ｍ１）に切り取ったヒト組織因子を溶離した。また
＃３７には低モル成分のマイナーピークを溶出した。

ゲル分析で予測した通り約５５乃至７０％の収率で約４
乃至６■の切り取ったヒト組織因子を得た。

切り取ったヒト組織因子の因子■に対する応答は自然の
ままの組織因子とは際立って異なる。第１３図に示した
ように、自然の組織因子の場合には、１ｍＭ程度の小さ
い因子■でも凝固時間は最小限であるが、切り取った因
子の場合には因子■１（１０ｈＭまで漸次短くなってい
る。ここから明らかなように、切り取ったヒト組織因子
は、血漿中の因子■の活性レベルの増減を検出する血液
凝固試験において有用となろう。

［発明の効果コ 本発明によれば、ヒトの組織因子のアポ蛋白全体、組織
因子のアポ蛋白またはクローン化されたｃ　ＤＮＡによ
ってコード化されるその機能部分につきコード化を行う
配列をもった完全単一クローン化ｃＤＮＡ、並びに、ヒ
トの組織因子のアポ蛋白全体、可溶性のヒトの組織因子
のタンパク端を切り取ったヒトの組織因子タンパク及び
適当な宿主における機能的部分をコード化し、且つ、こ
れらを発現すべく誘発できるクローン化されたｃＤＮＡ
を含む組換え（体）ベクトルを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

図１に示すのは成熟したヒトの組織因子アポ蛋白のアミ
ノ酸配列とそのヒトロバシープロットである。 第２図はクローン化された胎盤のｃＯＮＡライブラリー
のスクリーニングに用いるヒト、の組織因子に特異的な
オリゴヌクレオチドΦプローブのヌクレオチド配列を示
す。 図３は、ヒトの組織因子アポ蛋白についてのコード化（
暗号）を行う２１４７ｂｐｃＤＮＡの略図解とそのヌク
レオチド配列を得るのに用いられる方法を示す。 第４図は、組換えプラスミドｐＫｓ−２Ｂと組換えラア
ージｍ１３／ＬＢ２７Ｆを示す。 第５Ａ図は、組換えプラスミドｐＬＢ４ＴＦの構造を示
す。 第５Ｂ図はＪ３／ＴＬ１３１Ｐの構造を示す。 第５Ｃ図は座位特異的突然変異誘発に用いられるオリゴ
ヌクレオチドＴＦＡＤとＧ８ＰＳＴの配列を示したもの
である。 第６図はヒトの組織因子形質発現プラスミド２丁Ｌ８Ｆ
Ｑの構造を示す。 第７図は哺乳動物の細胞中にあるヒトの組織因子を発現
させるためのｐＭＡＭ／ＴＦシャトルベクターを表した
ものである。 第８図はプラスミドｐＬＢ５７Ｆの構造の略図解である
。 第９図は可溶性組織因子表現ベクターｐＬＢ６ＴＦの構
造を略図で示したものである。 第１０図はＭ１３／ＬＢ２ＴＦの構造を示す。 第１１図はｐＬＢ６ＴＦの構造を示す。 第１２図はｐＴＬ８ＴＦＡ−１ノ構造を示すもノテ、Ｓ
は遺伝子■（Ｍ１３）のシグナルペプチド、Ｅは細胞外
ドメイン、Ｍは膜ドメインである。 第１３図は切り取ったヒトの組織因子の因子■に対する
活性を示した図である。

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトの組織因子またはその一部についての暗号と
   なるような配列順序を有するＤＮＡインサートを含む宿
   主中で複製できる組換えクローニングベクター。
2. （２）複製可能な組換えクローニングベクターを含む宿
   主生物であって、当該ベクターがヒトの組織因子または
   その一部の暗号となるような配列順序のＤＮＡインサー
   トを含むもの。
3. （３）請求項１による組換えクローニングベクターであ
   って、プラスミド、コスミッド、バクテリオファージか
   らなるグループ、その他細菌内で複製できる複数ベクタ
   ー、及び真核生物中で複製できる複数ベクターから選択
   可能なベクター。
4. （４）請求項３による組換えクローニングベクターであ
   って、真核生物宿主内で複製できるベクターをワクチニ
   アウィルス、ウシの乳頭腫ウィルス、シミアンウィルス
   ＾４＾０、酵母ベクター及びバキュロウィルスのグルー
   プから選択できるもの。
5. （５）請求項２による宿主生物であって、細菌、酵母、
   昆虫細胞、及びヒトの細胞のグループから選択されるも
   の。
6. （６）請求項１による組換えクローニングベクターであ
   って、ファージλ１０，３、ファージλ３，４及びプラ
   スミドｐＫＳ−２Ｂのグループから選択されるもの。
7. （７）請求項１による組換えクローニングベクターでフ
   ァージλ１０，３であるもの。
8. （８）請求項１による組換えクローニングベクターでプ
   ラスミドｐＫＳ−２Ｂであるもの。
9. （９）請求項２による宿主生物で大腸菌株ｋ１０８８で
   あるもの。
10. （１０）請求項２による宿主生物で大腸菌株７１−１８
    であるもの。
11. （１１）請求項９による宿主生物で組換えクローニング
    ベクターがファージλ１０．３あるもの。
12. （１２）請求項９による宿主生物でファージλ３，４を
    組換えクローニングベクターとするもの。
13. （１３）プラスミドｐＫＳ−２Ｂを組換えクローニング
    ベクターとするような請求項１０による宿主生物。
14. （１４）ヒトの組織因子用の２１４７塩基対ｃＤＮＡ断
    片暗号であって、 I 式のようなヌクレオチド配列を含
    み、ヌクレオチド１１２乃至１１４でのＡＴＧ開始コド
    ンからヌクレオチド９９７乃至９９９でのＴＡＡ停止コ
    ドンまでのびる読取り枠を有し、当該読取り枠がポリペ
    プチド単鎖であり、且つ２９５アミノ酸配列をもつヒト
    の組織因子の前駆体タンパク質の暗号となり、且つ当該
    前駆体タンパクが I 式のような２６３アミノのアミノ
    酸配列をもつポリペプチド単鎖である実質的に純粋な成
    熟組織に翻訳後切断されるもの。
15. （１５） I 式のようなアミノ酸配列を有する実質的に
    純粋なヒトの組織因子のアポタンパク質またはその機能
    的部分。
16. （１６）ヒトの組織因子用ＤＮＡ暗号を同定するための
    オリゴヌクレオチド・プローブであって、そのヌクレオ
    チド配列が、 I 式ようなアミノ酸配列をもつ実質的に
    純粋なヒトの組織因子のアミノ酸２４から２９までのＤ
    ＮＡ暗号の配列に対応するもの。
17. （１７）ヒトの組織因子用ＤＮＡ暗号を同定するための
    オリゴヌクレオチド・プローブであって、そのヌクレオ
    チド配列が I 式のようなアミノ酸配列をもつ実質的に
    純粋なヒトの組織因子のアミノ酸１４５から１５９迄の
    ＤＮＡ暗号の配列に対応するもの。
18. （１８）ヒトの組織因子使用ＤＮＡ暗号を同定するため
    のオリゴヌクレオチド・プローブであって、そのヌクレ
    オチド配列が I 式のようなアミノ酸配列をもつ実質的
    に純粋なヒトの組織因子のアミノ酸２１０から２１５ま
    でのＤＮＡ暗号の配列に対応するもの。
19. （１９）適当な宿主の中で、ヒトの組織因子またはその
    機能的部分の遺伝子暗号を発現するような組換えクロー
    ニング・ベクター。
20. （２０）ヒトの組織因子アポタンパク質またはその機能
    的部分を産生する宿主生物であって、ヒトの組織因子ま
    たはその機能的部分の暗号となるＤＮＡインサートを含
    む組換えクローニング・ベクターによって形質転換され
    るもの。
21. （２１）請求項１９による組換えベクターであって、プ
    ラスミド、コスミッド、バクテリオファージ、細菌内で
    複製できる他のベクター及び真核生物内で複製できるベ
    クターの中から選択されるもの。
22. （２２）請求項２２（ママ）による組換えベクターであ
    って、真核生物宿主内で複製できるベクターがワクチニ
    アウィルス、ウシの乳頭腫ウィルス、シミアンウィルス
    ＾４＾０、酵母ベクター及びバキュロウィルスのグルー
    プから選択されるもの。
23. （２３）請求項２０による宿主生物であって、細菌、酵
    母、昆虫細胞、動物細胞及びヒトの細胞のグループから
    選択されるもの。
24. （２４）請求項１９による組換えベクタ−をｐＴＬ８Ｆ
    Ｑとするもの。
25. （２５）請求項１９による組換えベクターをｐＭＡＭ／
    ＴＦとするもの。
26. （２６）請求項２０による宿主生物を大腸菌株７１−１
    ８とするもの。
27. （２７）請求項２０による宿主生物を大腸菌ＸＬ−１ブ
    ルーとするもの。
28. （２８）請求項２０による宿主生物をＣＨＯ細胞とする
    もの。
29. （２９）ヒトの可溶性組織因子またはその機能的部分の
    形質を発現させるための請求項１９による組換えクロー
    ニング・ベクター。
30. （３０）請求項２９による組換えクローニング・ベクタ
    ーであって、ヒトの可溶性組織因子にヒトの成熟組織因
    子アポタンパク質のアミノ端末細胞外ドメインが含まれ
    るもの。
31. （３１）ヒトノ可溶性組織因子の中に、 I 式のような
    配列順序をもつヒトの成熟組織因子のＮ端末アミノ酸１
    乃至２１９／２２０を含むような請求項２９による組換
    えクローニング・ベター。
32. （３２）組換えベクターをｐＬＢ６ＴＦとするような請
    求項３１による組換えクローニングベクター。
33. （３３）切り取ったヒトの組織因子又はその機能的部分
    の形質発現のための、請求項１９による組換体クローニ
    ング・ベクター。
34. （３４）請求項３３による組換体クローニングベクター
    において、切り取ったヒト組織因子が成熟した組織因子
    のＮ末端アミノ酸１−２２７を含み、式 I に示すよう
    な配列をしたベクター。
35. （３５）請求項３３による組換体クローニングベクター
    であって、組換体ベクターがｐＴＬ８ＴＦ−ＡＩである
    もの。
36. （３６）請求項２０による宿主生物体であって可溶性の
    ヒト組織因子及び切り取ったヒト組織因子から成るグル
    ープから選んだヒトの組織因子を生成するもの。
37. （３７）ヒトの成熟組織因子アポタンパク質またはその
    機能的部分の細胞外ドメインが可溶性の組織因子に含ま
    れるような請求項３６による宿主生物。
38. （３８）可溶性組織因子の中に I 式のようなヒトの成
    熟組織因子のＮ端末アミノ酸１乃至２１０／２２０を含
    むような請求項３６による宿主生物。
39. （３９）請求項３６による宿主生物において、切り取っ
    たヒト組織因子の中に式 I に規定するような成熟した
    ヒトの組織因子のＮ末端アミノ酸１−２２７が含まれる
    もの。
40. （４０）大腸菌株７１−１８が宿主であるような請求項
    ３８による宿主生物。
41. （４１）実質的に純粋なヒトの可溶性組織因子であって
    、 I 式のような配列順序をもつヒトの成熟組織因子ま
    たはその機能的部分の細胞外ドメインを含むもの。
42. （４２）請求項３７によるヒトの可溶性組織因子であっ
    て、 I 式のような配列順序の、ヒトの成熟組織因子の
    Ｎ端末アミノ酸１−２１９／２２０を含むもの。
43. （４３）切り取ったヒト組織因子の中に成熟したヒトの
    組織因子のＮ末端アミノ酸１−２２７を含み、式 I に
    規定するような配列をもつ、実質的に純粋なヒトの切り
    取った組織因子。