CN1551918A

CN1551918A - 基因重组伊卡因及其制备方法

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Publication number: CN1551918A
Application number: CNA028175026A
Authority: CN
Inventors: 米村宏; 幸; 今村隆幸; 事; 中武博; 英; 副岛见事; 野崎周英
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-07-04
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2022-07-04
Also published as: CN1551918B; CA2452767A1; CA2452767C; KR20040018427A; WO2003004647A1; KR101054735B1; JPWO2003004647A1; EP1405912A4; JP4150814B2; EP1405912A1; EP1405912B8; EP1405912B1; US20050164365A1; US20080153132A1

Abstract

一种能特异性活化凝血酶原的改良伊卡因蛋白；及利用基因修饰技术产生这种蛋白的方法，该方法包括：1)培养一种转化体，所述转化体通过用表达载体转化微生物或动物细胞来构建，所述表达载体携带整合在启动子下游的编码伊卡因的基因，收集培养基或转化体中产生并积累的伊卡因；2)将收集并回收的含伊卡因溶液纯化得到纯化的伊卡因。依据该方法，可以在实践中在工业规模上生产改良的伊卡因蛋白。

Description

基因重组伊卡因及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型多肽。更具体地说，本发明涉及一种特异性活化凝血酶原的基因重组伊卡因(ecarin)及所述基因重组伊卡因的制备方法。

背景技术

一些动物具有强效毒液，如蛇毒、蜘蛛毒、蝎毒和蜂毒。研究表明，这些毒液实际上包含一些有用的物质，包括神经毒素、出血毒素、血栓毒素、生理活性肽、细胞生长因子等。

伊卡因是一种从锯鳞蝰( Echis carinatus)分离的蛇毒来源蛋白酶(T.Morita等，J.Biochem.83，559-570，1978)，可特异性地活化凝血酶原。S.Nishida等(Biochemistry，34，1771-1778，1995)克隆了编码伊卡因的cDNA以揭示其结构。伊卡因(一种糖蛋白)是一种金属蛋白酶，成熟的伊卡因共有426个氨基酸残基，有一个包含螯合Zn²⁺的镶嵌结构、单链蛇毒多肽域和富含Cys域，和RVV-X(拉塞蝰蛇毒X激活子)的H链具有61％的同源性。伊卡因是一种与Xa因子截然不同的酶，因为它的酶活性可以被EDTA灭活，而不能被DFP或抗凝血酶III灭活。

伊卡因活化的靶底物之一，即凝血酶原是凝血酶的前体，而凝血酶是多种血液凝固因子之一。活化后生成的凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，能与多种底物相互作用，在生物体内以凝固与抗凝固方式发挥作用。在人体血液里，Xa因子通过在凝血酶原的两个位点即Arg-Thr和Arg-Ile限制性裂解凝血酶原而使之活化，而伊卡因只在Arg-Ile位点水解凝血酶原，产生分子量相对较大的间凝血酶(meizothrombin)。基于伊卡因的底物高度专一性，它可通过Arg-Ile位点裂解将前凝血酶(prethrombin)-2(凝血酶原去除Gla域和Kringle域的产物)转化为具活性的凝血酶(α-凝血酶)。尽管同属于丝氨酸蛋白酶的胰蛋白酶同样能使Arg-Ile位点裂解，但其更倾向于裂解别的位点，而伊卡因由于其对于Arg-Ile位点裂解的高度专一性只裂解该位点而不裂解任何其它位点。用胰蛋白酶活化前凝血酶-2，尽管可观察到前凝血酶-2部分活化成α-凝血酶，大部分得到的α-凝血酶会进一步降解，因此将前凝血酶-2完全转化为α-凝血酶是不可能的。相较之下，将伊卡因加入前凝血酶-2中能定量地将前凝血酶-2转化为α-凝血酶而没有任何副产物，因为伊卡因仅裂解凝血酶原-2中唯一的Arg-Ile位点。

如上所述，在凝血酶原转化为α-凝血酶的生物过程中，凝血酶原经过称为间凝血酶的中间体而活化。在生物体内，Xa因子首先对凝血酶原的Arg-Ile位点进行切割，形成间凝血酶。然后Xa因子进而对间凝血酶的Arg-Thr位点进行切割将之完全活化成α-凝血酶。众所周知，间凝血酶虽然有蛋白酶活性，但其底物专一性与α-凝血酶截然不同。在保留其活化蛋白酶C的能力的同时，它凝聚纤维蛋白原的活性极低。尽管间凝血酶显示这样的特征性底物专一性，如上所述因为Xa因子切割凝血酶原的两处位点即Arg-Thr和Arg-Ile，间凝血酶易于转化成α-凝血酶因而不能稳定存在于生物体内。然而用伊卡因活化凝血酶原可制备稳定的间凝血酶，因为伊卡因仅裂解Arg-Ile位点。而且，既然伊卡因可以作用于无维生素K存在条件生物合成的异常凝血酶原，它也用于测定血液中这种异常凝血酶原的水平。

发明内容

如上所述，人们发现伊卡因具有工业上有用的活性。然而到目前为止，其唯一来源为锯鳞蝰，因而由于其有限的可用量而不能用于工业化生产中。在目前的情况下，伊卡因由试剂制造商作为试剂出售，但由于其价格高并且不能充足供应，在工业上大规模应用中使用伊卡因活化前凝血酶-2或制备间凝血酶是不可能的。另外，不能保证作为来源的野生锯鳞蝰可以稳定地供应。而且从蛇毒角度讲，还必须考虑饲养蛇的工作人员的安全问题。综合这些因素，要获得大量的伊卡因显然是非常困难的。考虑到从锯鳞蝰制备伊卡因的危险和局限性，必须找到以更安全、更稳定的方式制备伊卡因的其他来源和方法。

在这种情况下，本发明需要解决的问题之一是：致力于建立一种在工业规模上有效制备凝血酶的方法，利用基因重组技术提供伊卡因用于凝血酶的生产。

为了解决上述问题，本发明人进行了认真的研究，并成功完成本发明，提供了利用基因重组技术有效制备伊卡因的方法。

因此，本发明的目的之一是提供基因重组伊卡因(以下亦称“重组伊卡因”)，它能通过切割Arg-Ile位点将前凝血酶-2转化为α-凝血酶或将凝血酶原转化为间凝血酶。为达到此目的，提供了一种具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列、分子量约为80,000的蛋白质，或所述氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基发生缺失、替换或添加的一个或一系列肽段，或上述氨基酸序列中任一种氨基酸序列的部分序列，或包含上述氨基酸序列中任一种氨基酸序列作为一部分的氨基酸序列。

本发明也提供了一种编码上述重组伊卡因、具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因片段，或编码具有所述蛋白部分氨基酸序列的多肽的基因片段，和包含这些基因片段的质粒。本发明还包括用所述质粒转化的重组微生物和动物细胞。本发明进一步包括使用这些转化的微生物或动物细胞制备目的重组伊卡因或具有重组伊卡因部分氨基酸序列的多肽的方法。

附图简述

图1.表达载体pCAGG-S1(Sal).dhfr图解。

图2.所示为凝胶过滤所得级分的SDS-PAGE和蛋白染色结果，在对产生伊卡因的SP2/0细胞的培养上清液进行伊卡因纯化中，凝胶过滤是最后一个步骤。

图3.凝血酶原加入重组伊卡因后对S-2238的裂解活性。

实施本发明的最佳方式

以文献(S.Nishida等，Biochemistry，34，p.1771-1778，1995)报道的序列为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4序列为引物，进行PCR，获得编码重组伊卡因蛋白的基因。

伊卡因或其部分蛋白可以通过如下方法获得，将编码全长伊卡因结构区一部分的cDNA片段引入表达载体，用所得表达载体转化合适的微生物或动物细胞，培养转化体微生物或动物细胞以产生伊卡因或其部分蛋白。对于伊卡因的部分蛋白的生产来说，可使用肽合成仪。

将微生物或动物细胞内合适的分泌信号肽连接到编码本发明蛋白质的DNA的上游，以使该蛋白得以表达并分泌到培养基中。对于这种用于分泌目的的改进DNA来说，其优势在于分泌入培养基的蛋白易于回收。这种信号肽序列包括用于大肠杆菌的pel B信号肽序列(S.P Lei等，J.Bacteriology Vol.169，4379-4383，1987)、用于酵母的α因子信号肽(A.J.Brake，Yeast Genetic Engineering，p269，Butterworth，1989)、用于动物细胞的免疫球蛋白信号肽序列SG-1(H.Maeda等，Hum.Hybridomas Vol.2，124-134，1991)和C25信号肽序列(专利，国际公开号NO.WO94/20632)等。

可使用的表达载体包括质粒、病毒载体等。包含在表达载体内的启动子可以是任意启动子，只要它和作为宿主细胞的微生物或动物细胞相联用时能最终提供活性伊卡因蛋白。这些启动子包括SV40早期启动子、SV40晚期启动子、巨细胞病毒启动子、鸡β-肌动蛋白启动子等。对于微生物的表达载体来说，标记基因包括宿主为大肠杆菌情况下的抗氨苄青霉素基因、抗四环素基因；宿主为酵母情况下的Leu2基因等。对于动物的表达载体来说，可使用氨基糖苷3’磷酸转移酶(neo)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因、谷氨酸合成酶(GS)基因等。图1所示为表达载体示例pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo，其中用于筛选的可加入物质包括G418、新霉素、氨甲蝶呤等。

对于动物细胞的表达载体来说，可以使用多种细胞作为宿主细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠骨髓瘤细胞如SP2/0、BHK21细胞、293细胞和COS细胞。利用构建的伊卡因表达细胞来瞬时表达伊卡因，如利用COS7细胞(来源于非洲绿猴)；或稳定表达伊卡因，如利用SP2/0细胞或CHO细胞作为宿主细胞。

宿主细胞的转化可以使用任何已知的方法。举例来说，包括磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、利用脂质转染试剂的沉淀法、利用聚乙二醇的原生质体融合法、电穿孔法及类似方法。依据所用的宿主细胞选择合适的转化方法。

本发明的重组伊卡因可按下述方法制备。稳定表达伊卡因的动物细胞在正常条件下培养，例如，在使用抗新霉素基因为标记基因的情况下，使用包含400μg/mL～1mg/mL新霉素和10％FCS的α-MEM培养基来制备新霉素耐受细胞，并测定培养上清液中的伊卡因酶活性。然后从可产生伊卡因的转化体中获得一个可在无血清培养基内生长的克隆，并将之大规模培养。从培养上清液制备并纯化伊卡因，并将之回收，使之具有将凝血酶原转化成α-凝血酶的伊卡因活性指标。

可适当选用蛋白质化学领域中的任一传统方法，对本发明中的具有上述活化凝血酶原能力的指标的重组伊卡因进行分离和纯化。举例来说，这些方法包括盐析法、超滤法、等电聚焦法、电泳法、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、反相层析、亲和层析等。一个纯化重组伊卡因的优选实施方案包括在实施例9所述条件下依次进行阳离子交换层析和凝胶过滤层析。该步骤纯化的重组伊卡因蛋白比活提高约2600倍，活性收率为13％，具有活化凝血酶原的能力指标。

由此纯化后得到的级分在2-巯基乙醇存在的条件下进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，检测分子量约80,000的主带(图2)。

由此获得的伊卡因具有活化凝血酶原的活性。本发明的伊卡因蛋白可应用于由凝血酶原制备间凝血酶和将前凝血酶-2活化成α-凝血酶的过程中，或用作异常凝血酶原的检测试剂。

此外，伊卡因蛋白或含其部分氨基酸序列的多肽也可用作免疫原，通过常规方法制备多克隆或单克隆抗体。所制得的抗体能与伊卡因蛋白或含其部分氨基酸序列的多肽结合，该蛋白或多肽也可用作检测系统，如蛋白质印迹或ELISA的抗原，并可作为构建诊断试剂的原料。作为一种替代选择，该抗体也可以在亲和层析中与合适的载体结合以纯化抗原蛋白。

下文提供的实施例将对本发明作出更详细的阐述。但从任何意义上讲，这些实例都对本发明的范围不构成任何限制。下列制备过程和实施例所使用的试剂从Pharmacia、BioRad、Wako Pure ChemicalIndustries有限公司，TAKARA SHUZO有限公司、Toyobo和NewEngland Biolabs获得。

实施例1

(表达质粒的构建)

(1)表达质粒pCAGG-S1(Sal)的构建

用限制性酶EcoRI消化基于鸡β-肌动蛋白启动子的表达质粒pCAGG(日本专利公开号NO.168087/1991)，T4 DNA聚合酶钝化末端，然后在磷酸化XhoI衔接物存在的条件下用T4 DNA连接酶连接末端，以此构建pCAGG(Xho)。所得pCAGG(Xho)用限制性酶SalI消化，T4 DNA聚合酶钝化末端，然后在磷酸化XhoI衔接物存在的条件下用T4 DNA连接酶连接末端，以此构建pCAGG-Pv2。所得pCAGG-Pv2用限制性酶EcoRI消化，然后用S1核酸酶切去pCAGG-Pv2识别位点旁数个核苷酸。经核酸酶处理后，在dNTPs存在的条件下用T4 DNA聚合酶对单链区进行修饰，然后在磷酸化SalI衔接物存在的条件下用T4 DNA连接酶连接末端，构建pCAGG-S1(Sal)。

(2)表达质粒pCAGG-S1(Sal).dhfr的构建

用限制性酶BglII消化含DHFR基因的表达质粒pSV2-dhfr(S.Subramani等，Mol.Cell.Biol.，1，p.854-864，1981)，T4 DNA聚合酶钝化末端，然后用T4 DNA连接酶连接，以此构建pSV2-dhfr-Bgn。所得pSV2-dhfr-Bgn用限制性酶PvuII消化，然后在磷酸化BglII衔接物存在的条件下用T4 DNA连接酶连接，以此构建pSV2-dhfr-BgB。所得pSV2-dhfr-BgB用限制性酶BglII和BamHI消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳获得一长约1.7kbp的片段。前面所得的pCAGG-S1(Sal)经限制性酶BamHI消化，然后与1.7kbp片段连接成环，构建pCAGG-S1(Sal).dhfr。

(3)表达质粒pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo的构建

用限制性酶XhoI消化基于氨基糖苷磷酸转移酶(neo^r)的表达质粒pMClneo-polyA(K.R.Thomas等，细胞，51，p.503-512，1987)，然后在磷酸化BamHI衔接物存在的条件下用T4 DNA连接酶连接，构建pMCleno-2B。所得pMCleno-2B用限制性酶BamHI消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳获得一长约1.1kbp的片段。前面所得的pCAGG-S1(Sal).dhfr经限制性酶BamHI消化，然后与约1.1kbp的片段连接成环，构建pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo。(图1)。

实施例2

(蛇毒素伊卡因cDNA的制备)

以文献(S.Nishida等，Biochemistry，34，.1771-1778，1995)报道的伊卡因cDAN核苷酸序列为模板进行PCR，利用人工合成的DNA序列：

ATGCACTCGAGATGATCCAGATTCTCTTGGT[SEQ ID NO：3]和人工合成的DNA序列：

TGCATCTCGAGTTAGTAGGCTGTATTCACA[SEQ ID NO：4]

作为引物对进行PCR，在伊卡因cDAN的两端引入限制性酶XhoI的识别位点。所得基因用限制性酶XhoI消化，然后亚克隆至pUC18，构建pUC.EC。利用传统方法测定所得质粒伊卡因cDNA区的核苷酸序列，获得起始密码子至终止子间序列(SEQ ID NO：12)与文献报道序列完全相同的伊卡因cDNA。

这里所获得的伊卡因cDAN编码SEQ ID NO：1中的多肽。

实施例3

(伊卡因表达质粒的构建)

将实施例2中所获得的伊卡因cDNA插入实施例1中所述的表达载体pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo。用限制性酶SalI消化质粒pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo，然后用来源于牛小肠碱性磷酸酶将之去磷酸化。用限制性酶XhoI消化前面所得的质粒pUC.EC，然后通过脂糖凝胶电泳提纯一长约1.8kbp、编码伊卡因cDNA的片段。用T4 DNA连接酶将去磷酸化的质粒与编码伊卡因cDNA的片段连接成环，构建pCAGG-S1.EC.dhfr.neo。

实施例4

(利用动物细胞表达伊卡因)

用实施例3中所述伊卡因表达质粒pCAGG-S1.EC.dhfr.neo转化CHO细胞和SP2/0 Ag14细胞。使用改进的磷酸钙法转化CHO细胞，而SP2/0细胞的转化染则使用电穿孔法。

转化中所用到的表达质粒预先用限制性酶PvuI消化成线形。

(1)评估CHO细胞产生伊卡因的能力

如下所述，使用CHO细胞进行转化，并从转化体系中选择转化体。

转化前一天，将细胞铺到加有MEM培养基的10-cm培养皿中，使之密度为5×10⁵细胞/皿。其中MEM培养基含核酸，并添加有10％胎牛血清。37℃培养过夜，使用20μg/mL线形化表达质粒pCAGG-S1.EC.dhfr.neo转化细胞。在3％ CO₂培养箱内于35℃培养过夜，用Dulbecco PBS(-)洗涤细胞，培养基换成不含核酸而含有10％透析FCS和500μg/mL遗传霉素的α-MEM培养基。为了选择转化体，细胞继续于37℃、5％CO₂培养箱内培养，每3至4天换液一次。收集出现的转化体，并分析其产生伊卡因的能力。

转化细胞以2×10⁵细胞/mL密度接种至不含核酸而含有10％透析FCS的α-MEM培养基中，培养过夜。第二天，培养基换成无血清的YMM培养基(不含核酸而富含氨基酸/维生素，并含有胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和亚硒酸钠的α-MEM培养基)。于37℃、5％CO₂培养箱内培养约14天后，测定培养上清液中伊卡因的水平。结果检测到培养上清液中含10U/mL的伊卡因。

(2)评估SP2/0细胞产生伊卡因的能力

如下所述，使用SP2/0细胞进行转化，并从转化体系中选择转化体。

SP2/0细胞用冷Dulbecco PBS(-)洗涤两次，将悬于0.8mLPBS(-)中的10⁷细胞加入到电穿孔样品池(电极宽0.4cm，BIO-RAD生产)中。加入线形化的表达质粒(40μg)，并用吸管吹打混匀。使用GenePulser II(BIO-RAD生产)施加一次0.22kv、975μF脉冲。将样品池置冰上预冷10分钟后，用含核酸和10％胎牛血清(FCS)的α-MEM培养基将细胞悬液稀释至约5000细胞/50μL，以50μL/孔的量铺到5块96孔板中，在3％CO₂培养箱内于35℃培养过夜。第二天，每孔加入不含核酸而含有10％透析FCS的培养基50μL，继续培养过夜。第二天，每孔加入不含核酸而含有10％透析FCS、100nM或200nM MTX的α-MEM培养基100μL。培养10天至14天后，分析各孔转化体产生伊卡因的能力。将细胞以3×10⁵细胞/mL的密度接种至不含核酸而含有2％透析FCS的α-MEM培养基中。培养约14天后，测定培养上清液中伊卡因的水平。结果发现各转化体表达伊卡因的水平为2～10U/mL。通过有限稀释法将悬于同样培养基中的细胞以200μL/孔的量接种到96孔板中，使浓度为0.5细胞/孔，对细胞进行克隆。分析所得各克隆产生伊卡因的能力。将各克隆以3×10⁵细胞/mL的密度接种至不含核酸而含有2％透析FCS的α-MEM培养基中。在3％CO₂培养箱内于35℃培养14天后，测定培养上清液中伊卡因的水平。在所获得的克隆中，克隆#1H-8的培养上清液中表达有15U/mL的伊卡因。

用YMM培养基使克隆#1H-8适应于无血清培养基。用含2％透析FCS的YMM培养基进行培养并确认其可以生长。然后将血清含量逐渐降到0.5％，进一步降到0.1％，继续培养。确认细胞增殖良好后，使用完全不含血清的YMM培养基培养。确认细胞可以生长，然后使用YMM培养基按上述方法测定其产生伊卡因的能力。适应无血清培养基的克隆#1H-8具有产生20U/mL伊卡因的能力。

实施例5

(产生伊卡因的细胞的大规模培养)

按实施例4所述方法，使可产生伊卡因的细胞#1H-8适应于无血清培养基后，用旋转瓶进行悬浮培养。细胞增殖后，将250mL细胞以2×10⁵细胞/mL的密度于250-mL旋转瓶(Techne生产)内用YMM培养基培养。将细胞以大于1×10⁶细胞/mL的密度扩容至1-L旋转瓶。确认细胞可以生长后，将细胞扩容至5个1-L旋转瓶中。培养约7天，然后测定培养上清液中伊卡因的水平，其值约为18U/mL。

实施例6

(抗伊卡因部分肽的抗体的制备)

依据Hopp和Wood所述方法(T.P.Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci，Vol.78，3824-3628，1981)分析伊卡因cDNA所编码的氨基酸序列的亲水区和疏水区。用肽合成仪(Applied)合成序列为Lys-Asn-Asp-Tyr-Ser-Tyr-Ala-Asp-Glu-Asn-Lys-Gly-Ile-Val-Glu-Pro-Gly-Thr-Lys-Cys的肽作为高度亲水区，该序列定为SEQ ID NO：5。在弗氏完全佐剂存在的条件下将该肽(500μg)于第0天接种入兔皮内，在弗氏不完全佐剂存在的条件下于第14天和第28天进行接种，制备抗伊卡因肽的多克隆抗体。利用western印迹法确认所得抗体是否识别伊卡因肽。在无2-巯基乙醇存在的条件下，对天然伊卡因进行SDS-PAGE电泳。电泳后，将凝胶置于转膜缓冲液(10mM N-环己基-3-氨基丙磺酸，10％甲醇，pH11)中浸泡5分钟，然后覆盖到已先后以100％甲醇和转膜缓冲液中浸泡的PVDF膜上，利用TRANS-BLOT细胞(BIO-RAD)在160mA的电流下转膜16小时。用TBST(50mMTris-HCl，pH8.0，150mM NaCl；0.05％吐温20，含5％脱脂奶)将膜封闭。室温下，将该膜与从接种合成肽的兔获得的、经TBST稀释500倍的血清温孵1小时，并用TBST洗涤。然后于室温下，使该膜与2000倍稀释的、抗兔IgG-HRP标记的抗体(BIO-RAD)反应1小时。洗涤该膜，用柯尼卡免疫染色HRP 1000试剂盒(Konica)染色。结果表明用合成肽接种所获得的血清能够和伊卡因发生特异性反应。

实施例7

(伊卡因的纯化)

(1)阳离子交换层析

产生伊卡因的SP2/0细胞培养上清(2000mL)用2倍量的水稀释，用1M柠檬酸调到pH5.0，经0.45μm滤膜过滤后作为样品。将样品加到用20mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)以4mL/min流速所平衡的Macro-Prep High S Support层析柱(20mL：Bio-Rad Laboratories)上。用同样的缓冲液(150mL)洗涤层析柱，然后用盐浓度为0mM～1000mM的NaCl/20mM柠檬酸(pH5.0；210mL)以4mL/min流速进行梯度洗脱。取各级分的一部分用实施例6中所得抗伊卡因抗体进行Western印迹试验，以鉴别洗脱有伊卡因的级分。收集该级分，用含50mM NaCl的20mM碳酸氢钠缓冲液(pH9.0)透析。

(2)阳离子交换层析

上述阳离子交换层析(1)过程中获得的透析产物，加到用含50mMNaCl的20mM碳酸氢钠缓冲液(pH9.0)以0.5mL/min流速所平衡的硫酸Cellulofine层析柱(2mL：SEIKAGAKU CORPORATION)上。用如上所述缓冲液(140mL)洗涤层析柱，然后用盐浓度为50mM～600mM的NaCl/20mM的碳酸氢钠缓冲液(pH9.0；20mL)以0.5ml/min流速进行梯度洗脱。取各级分的一部分用实施例6中所得抗伊卡因抗体进行Wester印迹试验，以鉴别洗脱有伊卡因的级分。

(3)凝胶过滤

以0.5mL/min流速，将层析过程(2)含重组伊卡因的级分加到用含100mM NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)所平衡的HiLoad16/60凝胶过滤层析柱(Pharmacia)上。然后以0.5mL/min的流速进行分级分离。使用凝胶过滤标记物(Bio Rad)作为分子量标准品。测定各级分活化凝血酶的能力，在分子量约80,000的级分中检测到了峰活性。在2-巯基乙醇存在的条件下，对所获得的纯化伊卡因级分进行SDS-PAGE电泳，并用考马斯亮蓝染色。所得结果如图2所示。

经过上述的三步纯化，获得最终活性收率为13％的重组伊卡因，其比活比培养上清液高2,600倍。

实施例8

(重组伊卡因对凝血酶原的活化)

往凝血酶原(20mM Tris-HCL，100mM氯化钠；1mg/mL；40mL)中加入苯甲脒至终浓度为50mM。往该混合物中加入重组伊卡因至终浓度为2U/mL。反应混合物于37℃孵育16小时，然后按下述方法测定凝血酶的酶活性。结果如图3所示，加入重组伊卡因时检测到了凝血酶原切割S-2238的活性。

实施例9

(重组伊卡因对凝血酶原B链N-末端氨基酸序列的活化)

众所周知，伊卡因专一地切割凝血酶原中的Arg-Ile位点，生成来源于凝血酶原的A链与B链。测定实施例8活化后所得的凝血酶B链的N-末端氨基酸序列。

2-巯基乙醇处理的样品在含15％聚丙烯酰胺的凝胶上进行SDS-PAGE电泳。将凝胶置转膜缓冲液(10mM N-环己基-3-氨基丙磺酸，10％甲醇，pH11)中浸泡5分钟，然后覆盖至预先以100％甲醇浸泡的PVDF膜上，然后用转膜缓冲液浸泡，利用TRANS-BLOT细胞(BIO-RAD)在160电流下转膜16小时。转膜后的PVDF膜用水洗涤，0.1％氨基黑(含40％甲醇、1％柠檬酸)染色1分钟，然后以流动水脱色。将对应于B链分子量的染色条带切下来，用477A蛋白测序仪(Applied Biosystems)进行序列分析。测定其N-端含十氨基酸残基的序列：Ile-Val-Glu-Gly-Ser-Asp-Ala-Glu-Ile-Gly。该序列与人血来源a-凝血酶B链的N-端氨基酸残基相同，说明依据本发明获得的重组伊卡因和蛇毒来源的伊卡因同等专一地切割凝血酶原中的Arg-Ile位肽键。

上述实施例中的凝血酶活性和伊卡因活性按下述方法测定：

(1)凝血酶活性测定

如下所述测定凝血酶活性。

将样品(20μL)、pH为8.5的50mM Tris-HCl和50mM NaCl配成的缓冲液(60μL)及0.1％PLURONIC F-68(20μL)加到2008管(Falcon)中，于37℃孵育3分钟。使用人血浆来源的纯化□-凝血酶(购自Hematologic Institute：HCT-0020)作为标准品，用相同缓冲液稀释至5、2.5、1.25、0.625和0.3125μg/mL。搅拌加入100μLTestTeam显色底物S-2238(1mM：DATIC PURE CHEMICALS CO.，LTD.)。37℃反应5分钟，用800μL的0.1M柠檬酸终止反应。将反应溶液(200μL)转移到96孔板中，测定OD405/650值。

(2)伊卡因活性测定

如下所述测定伊卡因活性。

将样品(20μL)、pH为8.5的50mM Tris-HCl、50mM NaCl和0.1％PLURONIC F-68配成的缓冲液(“缓冲液1”；60μL)加到2008管(Falcon)中。此后，加入0.01％胰蛋白酶(2μL)，对混合物加以搅拌，于37℃孵育10分钟。根据浓度需要用缓冲液1对样品加以稀释。加入10μL凝血酶原(0.4mg/mL，购自HematologicThecnology)，于37℃反应5分钟。然后，搅拌加入10mM EDTA(10ul)和TestTeam显色底物S-2238(1mM；100μL)。37℃反应5分钟，用800μL的0.1M柠檬酸终止反应。反应溶液(200μL)转移到96孔板中，测定OD405/650值。为了对伊卡因活性加以定量，将蛇毒素来源的伊卡因(可从Sigma获得)用缓冲液1稀释至25、12.5、6.25和3.125mU/mL。用20μL标准溶液替换样品，不加胰蛋白酶，重复上述步骤中加胰蛋白酶后的步骤。

依据本发明，提供了特异性活化凝血酶的重组伊卡因。本发明人制备的重组伊卡因是一种以前未见报道的新型蛋白质。就这样，本发明解决了实际应用重组伊卡因的技术问题，如表达活性伊卡因蛋白的表达载体的构建、稳定表达重组伊卡因的细胞的制备和重组伊卡因的纯化，从而实现了所述蛋白质在工业规模上的制备。

序列表

<110>财团法人化学及血清疗法研究所

<120>基因重组伊卡因及其制备方法

<130>663289

<150>JP 2001-206918

<151>2001-07-06

<160>5

<210>1

<211>616

<212>PRT

<213>锯鳞蝰

<400>1

Met Ile Gln Ile Leu Leu Val Ile Ile Cys Leu Ala Val Phe Pro Tyr

20 25 30 35

Gln Gly Cys Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Asn Val Asn Asp Tyr Glu

40 45 50

Val Val Tyr Pro Gln Lys Val Thr Ala Leu Pro Lys Gly Ala Val Gln

55 60 65

Gln Pro Glu Gln Lys Tyr Glu Asp Ala Met Gln Tyr Glu Phe Glu Val

70 75 80

Lys Gly Glu Pro Val Val Leu His Leu Glu Lys Asn Lys Glu Leu Phe

85 90 95

Ser Glu Asp Tyr Ser Glu Thr His Tyr Ser Ser Asp Asp Arg Glu Ile

100 105 110 115

Thr Thr Asn Pro Ser Val Glu Asp His Cys Tyr Tyr His Gly Arg Ile

120 125 130

Gln Asn Asp Ala Glu Ser Thr Ala Ser Ile Ser Ala Cys Asn Gly Leu

135 140 145

Lys Gly His Phe Lys Leu Arg Gly Glu Thr Tyr Phe Ile Glu Pro Leu

150 155 160

Lys Ile Pro Asp Ser Glu Ala His Ala Val Tyr Lys Tyr Glu Asn Ile

165 170 175

Glu Asn Glu Asp Glu Ala Pro Lys Met Cys Gly Val Thr Gln Asp Asn

180 185 190 195

Trp Glu Ser Asp Glu Pro Ile Lys Lys Thr Leu Gly Leu Ile Val Pro

200 205 210

Pro His Glu Arg Lys Phe Glu Lys Lys Phe Ile Glu Leu Val Val Val

215 220 225

Val Asp His Ser Met Val Thr Lys Tyr Asn Asn Asp Ser Thr Ala Ile

230 235 240

Arg Thr Trp Ile Tyr Glu Met Leu Asn Thr Val Asn Glu Ile Tyr Leu

245 250 255

Pro Phe Asn Ile Arg Val Ala Leu Val Gly Leu Glu Phe Trp Cys Asn

260 265 270 275

Gly Asp Leu Ile Asn Val Thr Ser Thr Ala Asp Asp Thr Leu His Ser

280 285 290

Phe Gly Glu Trp Arg Ala Ser Asp Leu Leu Asn Arg Lys Arg His Asp

295 300 305

His Ala Gln Leu Leu Thr Asn Val Thr Leu Asp His Ser Thr Leu Gly

310 315 320

Ile Thr Phe Val Tyr Gly Met Cys Lys Ser Asp Arg Ser Val Glu Leu

325 330 335

Ile Leu Asp Tyr Ser Asn Ile Thr Phe Asn Met Ala Tyr Ile Ile Ala

340 345 350 355

His Glu Met Gly His Ser Leu Gly Met Leu His Asp Thr Lys Phe Cys

360 365 370

Thr Cys Gly Ala Lys Pro Cys Ile Met Phe Gly Lys Glu Ser Ile Pro

375 380 385

Pro Pro Lys Glu Phe Ser Ser Cys Ser Tyr Asp Gln Tyr Asn Lys Tyr

390 395 400

Leu Leu Lys Tyr Asn Pro Lys Cys Ile Leu Asp Pro Pro Leu Arg Lys

405 410 415

Asp Ile Ala Ser Pro Ala Val Cys Gly Asn Glu Ile Trp Glu Glu Gly

420 425 430 435

Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ala Asp Cys Arg Asn Pro Cys Cys

440 445 450

Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Lys Pro Gly Ala Glu Cys Gly Asn Gly

455 460 465

Glu Cys Cys Asp Lys Cys Lys Ile Arg Lys Ala Gly Thr Glu Cys Arg

470 475 480

Pro Ala Arg Asp Asp Cys Asp Val Ala Glu His Cys Thr Gly Gln Ser

485 490 495

Ala Glu Cys Pro Arg Asn Glu Phe Gln Arg Asn Gly Gln Pro Cys Leu

500 505 510 515

Asn Asn Ser Gly Tyr Cys Tyr Asn Gly Asp Cys Pro Ile Met Leu Asn

520 525 530

Gln Cys Ile Ala Leu Phe Ser Pro Ser Ala Thr Val Ala Gln Asp Ser

535 540 545

Cys Phe Gln Arg Asn Leu Gln Gly Ser Tyr Tyr Gly Tyr Cys Thr Lys

550 555 560

Glu Ile Gly Tyr Tyr Gly Lys Arg Phe Pro Cys Ala Pro Gln Asp Val

565 570 575

Lys Cys Gly Arg Leu Tyr Cys Leu Asp Asn Ser Phe Lys Lys Asn Met

580 585 590 595

Arg Cys Lys Asn Asp Tyr Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Lys Gly Ile Val

600 605 610

Glu Pro Gly Thr Lys Cys Glu Asp Gly Lys Val Cys Ile Asn Arg Lys

615 620 625

Cys Val Asp Val Asn Thr Ala Tyr

630 635

<210>2

<211>1863

<212>DNA

<213>锯鳞蝰

<400>2

ctcgagatga tccagattct cttggtaatt atatgcttag cagtttttcc atatcaaggt 60

tgctctataa tcctgggatc tgggaatgtt aatgattatg aagtagtgta tccacaaaaa 120

gtcactgcat tgcccaaagg agcagttcag cagcctgagc aaaagtatga agatgccatg 180

caatatgaat ttgaagtgaa gggagagcca gtggtccttc acctagaaaa aaataaagaa 240

cttttttcag aagattacag tgagactcat tattcgtctg atgacagaga aattacaaca 300

aacccttcag ttgaggatca ctgctattat catggacgga tccagaatga tgctgagtca 360

actgcaagca tcagtgcatg caatggtttg aaaggacatt tcaagcttcg aggggagacg 420

tactttattg aacccttgaa gattcccgac agtgaagccc atgcagtcta caaatatgaa 480

aacatagaaa atgaggatga agcccccaaa atgtgtgggg taacccagga taattgggaa 540

tcagatgaac ccatcaaaaa gactttgggg ttaattgttc ctcctcatga acgaaaattt 600

gagaaaaaat tcattgagct tgtcgtagtt gtggaccaca gtatggtcac aaaatacaac 660

aatgattcaa ctgctataag aacatggata tatgaaatgc tcaacactgt aaatgagata 720

tacttacctt tcaatattcg tgtagcactg gttggcctag aattttggtg caatggagac 780

ttgattaacg tgacatccac agcagatgat actttgcact catttggaga atggagagca 840

tcagatttgc tgaatcgaaa aagacatgat catgctcagt tactcacgaa cgtgacactg 900

gatcattcca ctcttggaat cacgttcgta tatggcatgt gcaaatcaga tcgttctgta 960

gaacttattc tggattacag caacataact tttaatatgg catatataat agcccatgag 1020

atgggtcata gtctgggcat gttacatgac acaaaattct gtacttgtgg ggctaaacca 1080

tgcattatgt ttggcaaaga aagcattcca ccgcccaaag aattcagcag ttgtagttat 1140

gaccagtata acaagtatct tcttaaatat aacccaaaat gcattcttga tccacctttg 1200

agaaaagata ttgcttcacc tgcagtttgt ggaaatgaaa tttgggagga aggagaagaa 1260

tgtgattgtg gttctcctgc agattgtcga aatccatgct gtgatgctgc aacatgtaaa 1320

ctgaaaccag gggcagaatg tggaaatgga gagtgttgtg acaagtgcaa gattaggaaa 1380

gcaggaacag aatgccggcc agcaagggat gactgtgatg tcgctgaaca ctgcactggc 1440

caatctgctg agtgtcccag aaatgagttc caaaggaatg gacaaccatg ccttaacaac 1500

tcgggttatt gctacaatgg ggattgcccc atcatgttaa accaatgtat tgctctcttt 1560

agtccaagtg caactgtggc tcaagattca tgttttcaga ggaacttgca aggcagttac 1620

tatggctact gcacaaagga aattggttac tatggtaaaa ggtttccatg tgcaccacaa 1680

gatgtaaaat gtggcagatt atactgctta gataattcat tcaaaaaaaa tatgcgttgc 1740

aagaacgact attcatacgc ggatgaaaat aagggaatag ttgaacctgg aacaaaatgt 1800

gaagatggaa aggtctgcat caacaggaag tgtgttgatg tgaatacagc ctactaactc 1860

gag 1863

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

atgcactcga gatgatccag attctcttgg t 31

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

tgcatctcga gttagtaggc tgtattcaca 30

<210>5

<211>20

<212>PRT

<213>锯鳞蝰

<400>5

Lys Asn Asp Tyr Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Lys Gly Ile Val Glu Pro

5 10 15

Gly Thr Lys Cys

20

Claims

1.一种基因重组伊卡因，它可通过切割Arg-Ile位点将前凝血酶-2转化为α-凝血酶或将凝血酶原转化为间凝血酶。

2.权利要求1的基因重组伊卡因，其中所述伊卡因是具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的一个肽段或一系列肽段，或上述肽段的部分氨基酸序列，其中一个或几个氨基酸残基发生缺失、替换或添加，或是上述氨基酸序列中任一种氨基酸序列的部分序列，或包含上述氨基酸序列中任一种氨基酸序列作为一部分的氨基酸序列。

3.基因重组伊卡因的制备方法，该方法包括下列步骤：

1)培养转化体微生物或动物细胞，所述细胞用启动子下游整合有编码伊卡因的基因的表达载体转化，使在培养上清液或所述转化体中产生和积累伊卡因，并回收产生的伊卡因；和

2)纯化含有回收的伊卡因的溶液，获得纯化的伊卡因。

4.权利要求3的基因重组伊卡因的制备方法，其中所述启动子选自SV40早期启动子、SV40晚期启动子、巨细胞病毒启动子和鸡β-肌动蛋白启动子。

5.权利要求4的基因重组伊卡因的制备方法，其中所述启动子为鸡β-肌动蛋白启动子。

6.权利要求3至5中任一项的基因重组伊卡因的制备方法，其中所述表达载体在编码伊卡因的基因的上游含有信号序列。

7.权利要求6的基因重组伊卡因的制备方法，其中所述信号序列选自pel B信号、α因子信号、免疫球蛋白SG-1和C25信号。

8.权利要求3至7中任一项的基因重组伊卡因的制备方法，其中所述表达载体还包含基因扩增基因，并且转化体在适于基因扩增的条件下培养。

9.权利要求8的基因重组伊卡因的制备方法，其中所述基因扩增基因是编码二氢叶酸还原酶的基因。

10.权利要求3至9中任一项的基因重组伊卡因的制备方法，其中所述编码伊卡因的基因是具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因片段，或编码包含所述伊卡因蛋白部分氨基酸序列的肽的基因片段。

11.权利要求3至10中任一项的基因重组伊卡因的制备方法，其中所述转化体是选自中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠骨髓瘤细胞、BHK21细胞、293细胞和COS细胞的动物细胞。

12.权利要求3的基因重组伊卡因的制备方法，其中伊卡因的纯化方法包括依次进行阳离子交换层析和凝胶过滤层析。