KR20040018427A

KR20040018427A - 유전자 재조합 에카린 및 그를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20040018427A
Application number: KR10-2004-7000117A
Authority: KR
Inventors: 요네무라히로시; 이마무라다카유키; 나카타케히로시; 소에지마겐지; 노자키치카테루
Original assignee: 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-07-04
Publication date: 2004-03-03
Also published as: JP4150814B2; CN1551918B; KR101054735B1; US20080153132A1; EP1405912B1; EP1405912A4; CA2452767A1; EP1405912A1; CA2452767C; WO2003004647A1; EP1405912B8; US20050164365A1; JPWO2003004647A1; CN1551918A

Abstract

프토트롬빈을 특이적으로 활성화시키는 재조합 에카린 단백질로서, (1) 에카린을 코딩하는 유전자가 프로모터의 하류에 도입된 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물 또는 동물 세포를 배양하여 배양 상등액중 에카린을 생성하고 축적시키고 생성된 에카린을 회수하고; (2) 회수한 에카린을 포함하는 용액을 정제하여 정제된 에카린을 수득하는 것을 포함하는, 유전자 재조합 에카린을 제조하는 방법에 의해 제조된다. 본 발명은 산업 규모로 재조합 에카린을 생산할 수 있도록 한다.

Description

유전자 재조합 에카린 및 그를 제조하는 방법{Genetically modified ecarin and process for producing the same}

일부 동물은 뱀 독, 거미 독, 전갈 독 및 벌 독과 같은 강력한 독을 갖는다. 상기 독은 신경독, 출혈 독, 혈전 독, 생리학적 활성 펩티드, 세포 성장 인자 등을 포함하는 실질적으로 유용한 물질을 포함하는 것으로 밝혀졌다.

에카린은 특이적으로 프로트롬빈을 활성화시키는 것으로 공지되어 있는 에키스 카리나투스(Echis carinatus)로부터 분리된 뱀 독-유래 프로테아제이다(T.Morita et al., J. Biochem. 83, 559-570, 1978). S. Nishida 등(Biochemistry, 34, 1771-1778, 1995)은 에카린을 코딩하는 cDNA를 코딩하여 그의 구조를 밝혀냈다. 당단백질인 에카린은 메탈로프로테아제이고, 그의 성숙한 형태는 총 426개의 아미노산 잔기를 갖고, Zn⁺²킬레이트, 디스인테그린 영역 및 Cys-풍부 영역을 포함하는 모자이크 구조를 갖고, RVV-X(Russell's viper 뱀독 X 활성자)의 H쇄와 61%의 상동성을 갖는다. 에카린은 그의 효소 활성이 EDTA에 의해 불활성화되지만 DFP 또는 항트롬빈 III에 의해 저해되지 않는다는 점에서 인자 Xa와 뚜렷이 구별되는 효소이다.

에카린에 의해 활성화되는 표적 기질인 프로트롬빈은 다양한 혈액 응고 인자중 하나이 트롬빈의 전구체이다. 활성화 결과 생성된 트롬빈은 생체내에서 다양한 기질과 상호작용하고 응고-항응고 방식으로 작용할 수 있는 다기능 세린 프로테아제이다. 인간 혈액에서, 프로트롬빈은 프로트롬빈의 두개 부위, 즉, Arg-Thr 및 Arg-Ile에서 제한절단을 통해 인자 Xa에 의해 활성화되지만 에카린은 Arg-Ile에서만 프로트롬빈을 가수분해하여 상대적으로 고분자량을 갖는 메이조트롬빈을 생성한다. Arg-Ile 절단을 통한 프리트롬빈-2(프로트롬빈으로부터 gla 영역 및 Kringle 영역을 제거한 후의 생성물)을 활성 트롬빈(α-트롬빈)으로의 전환은 높은 기질 특이성에 기초하여 에카린에 의해 확실하에 수행될 수 있다. Arg-Ile 절단은 또한 트립신에 의해서도 수행될 수 있지만 트립신은 상기 절단 부위외의 추가의 부위에서 절단하기 쉬운 반면 에카린은 절단 부위에 의한 그의 높은 기질 특이성에 기인하여 상기 절단 부위외의 다른 부위에서는 절단하지 않는다. 트립신을 사용하여 프리트롬빈-2을 활성화시키는 경우 프리트롬빈-2 일부가 α-트롬빈으로 활성화되는 것을 관찰할 수 있지만, 생성된 α-트롬빈 대부분은 추가로 분해되어 결과적으로는 프리트롬빈-2의 α-트롬빈으로의 완전한 전환은 불가능하다. 반대로, 에카린을 프리트롬빈-2에 가한 경우, 프리트롬빈-2의 α-트롬빈으로의 전환은 에카린이 프리트롬빈-2중 유일하게 Arg-Ile만을 절단하기 때문에 어느 부산물도 없이 측량적으로 수행될 수 있다.

프로트롬빈이 α-트롬빈으로 전환되는 생체내에서, 프로트롬빈은 상기 기술한 바와 같은 메이조트롬빈으로 명명되는 중간체를 통해 활성화된다. 생체내에서, 프로트롬빈은 인자 Xa에 의해 Arg-Ile 부위에서 1차 절단되어 메이조트롬빈을 생성하고, 이는 인자 Xa에 의해 Arg-Thr 부위에서 절단되어 α-트롬빈을 완전하게 활성화시킨다. 메이조트롬빈은 프로테아제 활성을 갖고 있지만 α-트롬빈으로부터 구별되는 뚜렷한 기질 특이성을 갖고, 단백질 C를 활성화시키는 능력을 갖는 반면 섬유소원에 대하여 극도로 낮은 응고 활성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 상기와 같은 특징적인 기질 특이성을 나타내는 메이조트롬빈은 용이하게 α-트롬빈으로 전환되어 상기 기술된 바와 같은 프로트롬빈의 두개 부위, 즉, Arg-Thr 및 Arg-Ile에서 인자 Xa가 절단하기 때문에 생체내에서는 안정적으로 존재하지 못한다. 그러나, 프로트롬빈의 활성화를 위해 에카린을 사용하는 경우, 에카린은 메이조트롬빈은 Arg-Ile 부위에서만 절단하기 때문에 안정적으로 제조될 수 있다. 또한, 에카린은 비타민 K의 부재하에서 생합성적으로 생성된 이상 프로트롬빈에 대하여 작용하기 때문에 상기 이상 프로트롬빈의 혈액 수준을 측정하는데 유용하다.

발명의 개시

상기 설명한 바와 같이, 에카린은 산업적으로 유용한 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 현재까지의 유일한 원료는 에키스 카리나투스(Echis carinatus)이고 따라서 이용상 양적으로 제한되어 있기 때문에 산업적으로 이용하지 못하였다. 현 상황하에서 시약 제조사에 의해 에카린을 시약으로서 시판되었지만 고가이고 제공이 불충분하여 산업적으로 적용가능한 규모로 프리트롬빈-2을 활성화시키거나 메이조트롬빈을 제조하기 위해 에카린을 사용하는 것이 불가능하였다. 또한, 야생형 에키스 카리나투스(Echis carinatus)을 원료으로서 안정하게 제공할 수 있다고 보장할 수 없고 뱀 독과 관련하여 뱀 번식을 취급하는 작업원의 안전을 돌봐야 한다. 모든 것을 고려할 때, 다량의 에카린을 수득하는 것을 매우 어렵다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 에키스 카리나투스(Echis carinatus)으로부터 에카린을 제조할 때 위험성 및 제한성을 고려하여, 더욱 안전하고 더욱 안정적인 방식으로 에카린을 제공할 수 있는 방법 및 또다른 원료가 요구되고 있다.

이러한 환경하에서, 본 발명에 의해 해결하고자 하는 것은 산업적 규모로 트롬빈을 효율적으로 제조하는 방법을 구축하는 것을 목적으로 하면서 트롬빈 생산을 위한 수단으로서 유전자 재조합 기술에 의해 에카린을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 언급된 문제점을 해결하고자 부단히 노력한 결과 유전자 재조합 기술을 사용하여 에카린을 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서, 본 발명의 목적은 Arg-Ile 부위에서 절단하여 프리트롬빈-2을 α-트롬빈으로, 또는 프로트롬빈을 메이조트롬빈으로 전환시킬 수 있는 유전자 재조합 에카린(이하, "재조합 에카린"으로 언급함)을 제공하는 것이다. 단백질의 분자량이 약 80,000이고 하나 또는 수개의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 부가된 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 부분 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열중 하나의 부분 서열, 또는 상기 아미노산 서열중 어느 하나를 일부로서 포함하는 아미노산 서열을 제공하므로써 달성되었다.

또한 본 발명은 상기 기술한 재조합 에카린을 코딩하고 서열번호 2로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편, 또흔 상기 단백질의 일부 아미노산 서열을 펩티드를 코딩하는 유전자 단편, 및 이들 유전자 단편을 포함하는 플라스미드를 제공한다. 본 발명은 또한 재조합 미생물 및 상기 플라스미드로 형질전환된 동물 세포를 포함한다. 본 발명은 또한 관심의 대상이 되는 재조합 에카린 또는 형질전환된 형질전환 미생물 또는 동물 세포를 사용하여 재조합 에카린의 일부 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 제조하는 방법을 포함한다.

도면의 간단한 설명

도 1은 발현 플라스미드 pCAGG-S1.dhhr.neof를 도시화한 것이다.

도 2는 에카린-생산 SP2/0의 배양 상등액으로부터 에카린 정제의 최종 단계인 겔 여과에서 수득한 분획에 대한 SDS-PAGE 및 단백질 염색 결과를 나타낸다.

도 3은 재조합 에카린을 프로트롬빈에 첨가한 후 S-2238을 절단하는 활성을 나타낸다.

본 발명은 신규한 펩티드에 관한 것이다. 더욱 특히 본 발명은 프로트롬빈을 특이적으로 활성화시키는 유전자 재조합 에카린 및 상기 유전자 재조합 에카린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명을 수행하는 최상의 모드

문헌(S. Nishida et al., Biochemistry, 34, p.1771-1778, 1995)에 보고된 서열 및 프로이머 쌍으로서 서열번호 3 및 서열번호 4로 나타낸 합성 DNAs를 사용하여 에카린 단백질을 코딩하는 유전자를 수득할 수 있다.

전장의 에카린 구조 영역 부위를 코딩하는 cDNA 단편을 발현 벡터내로 도입하고, 적절한 미생물 또는 동물 세포를 생성된 발현 벡터로 형질전환시키고, 형질전환 미생물 또는 동물 세포를 배양하여 에카린 또는 그의 부분 단백질을 생산하여 에카린 또는 그의 부분 단백질을 제조할 수 있다. 에카린의 부분 단백질 생산을 위해 펩티드 합성기를 또한 사용할 수 있다.

미생물 또는 동물 세포에서 분비를 위한 적절한 시그날 서열을 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA의 상류에 연결시켜 상기 단백질이 발현될 수 있고 배양 배지내로 분비될 수 있도록 한다. 분비 목적을 위해 상기와 같이 변형된 DNA는 배양 배지내로 분비되는 단백질을 용이하게 회수할 수 있다는 점에서 이롭다. 상기 시그날 서열은E.Coli에 대하여 pel B 시그날(S.P.Lei et al., J. Bacteriology Vol.169, 4379-4383, 1987); 효모에 대하여 α-인자 시그날(A.J.Brake, Yeast Genetic Engineering, p269 Butterworth, 1989); 이뮤노글로블린 시그날 SG-1(H-maeda et al., Hum, Antibod. Hybridams Vol.2, 124-134, 1991), 동물 세포등에 대하여 C25 시그날(Patent, International Publication, No. Wo94/20632)을 포함한다.

사용할 수 있는 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 발현 벡터내 포함되는 프로모터는 숙주 세포로서 미생물 또는 동물 세포와 조합될 때 궁극적으로 활성 에카린 단백질을 제공할 수 있는 한 어느 프로모터일 수 있고, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 프로모터 및 닭 β-액틴 프로모터 등을 포함한다. 미생물에 대한 발현 벡터인 경우 마커 유전자는 앰피실린 내성 유전자, 숙주로서E.Coli에 대하여 테트라사이클린 내성 유전자; 숙주로서 효모에 대한 Leu2 유전자 등을 포함한다. 동물 세포에 대한 발현 벡터인 경우, 아미노글리코시드 3' 소프소트랜스퍼라아제(neo) 유전자, 디하이드로폴레이트 리덕타아제(dhfr) 유전자, 글루타민 신타아제(GS) 유전자 등을 사용할 수 있다. 도 1은 선별을 위해 첨가된 물질이 G418, 네오마이신, 메토트렉세이트 등을 포함하는 예증의 발현 벡터로서 pCAGG-S1(Sal).dhhr.neo를 나타낸다.

동물 세포에 대한 발현 벡터인 경우 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 마우스 골수종 세포, 예로서, SP2/0, BHK21 세포, 293 세포 및 COS 세포와 같은 다양한 세포를 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 작제된 에카린 발현 세포를 사용하여, 예를 들면, COS 세포(아프리카 녹색 원숭이로부터 유래)를 사용하여 일시적으로 발혈시킬 수 있거나 숙주 세포로서 SP2/0 또는 CHO 세포를 사용하여 안정적으로 발현시킬 수 있다.

숙주 세포는 예를 들면 인산칼슘 방법, DEAE 덱스트란 방법, 예를 들면 리포펙션과의 침전, 폴리에틸렌 글리콜로의 프토로플라스트의 융합, 일렉트로포레이션 등을 포함하는 공지된 방법에 의해 형질전환시킬 수 있다. 형질전환 방법은 사용하는 숙주 세포에 따라 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명의 재조합 에카린은 하기 기술하는 바와 같이 제조할 수 있다. 에카린을 안정하게 발현시키는 동물 세포를 일반 조건, 예를 들면 네오마이신 내성 세포를 제조하기 위하여 네오마이신 내성 유전자를 마커 유전자로 사용하는 경우 400μg/ml 내지 1mg/ml의 네오마이신 및 10% FCS를 포함하는 MEM 알파 배양 배지에서 안정적으로 에카린을 발현시키는 동물 세포를 배양한 후 배양 상등액중 에카린의 효소 활성을 측정한다. 무혈청 조건하에서 성장할 수 있는 클론을 에카린 생산 형질전환체로부터 수득하고 대량으로 배양한다. 회수한 배양 상등액으로부터 프로트롬빈을 α-트롬빈으로 전환시키는 에카린 활성 지수를 갖는 에카린을 제조하고 정제하였다.

염석(salting out), 한외여과, 등전압초점맞추기, 전기영동, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등으로부터 적절하게 선택되는 단백질 화학 분야에서 통상 사용되는 방법에 의해 프로트롬빈을 α-트롬빈으로 전환시키는 에카린 활성 지수를 갖는 본 발명의 재조합 에카린을 분리하고 정제할 수 있다. 재조합 에카린을 정제하는 바람직한 일면은 실시예 9에 기술된 바와 같은 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피 순서의 것을 포함한다. 이 단계는는 재조합 에카린 단백질을 프로트롬빈을 활성화시키는 능력에 대한 지표로서 약 2,600배 높은 특이적 활성 13% 활성 수율을 갖도록 정제할 수 있다.

정제시킨 후 수득한 분획을 2-머캅토에탄올 존재하에서 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석하여 약 M.W. 80,000의 중 밴드를 검출하였다. (도 2).

그렇게 수득한 에카린은 프로트롬빈을 활성화시키는 활성을 갖는다. 본 발명의 에카린 단백질은 프로트롬빈을부터 메이조트롬빈의 제조, 트리트롬빈-2을 α-트롬빈으로 활성화시키는데 유용하고, 비정상적인 프로트롬빈에 대한 검출 시약으로서 유용할 수 있다.

또한, 에카린 단백질 또는 그의 일부 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 또한 통상의 방법에 의해 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 제조를 위한 이뮤노겐으로서 유용하다. 에카린 단백질 또는 그의 일부 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 그렇게 제조딘 항체 및 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 웨스턴 블랏 또는 ELISA와 같은 항원에 대한 검출 시스템에서 사용할 수 있고 진단용 시약을 작제하기 위한 재료로서 사용할 수 있다. 다르게는, 항체는 친화성 크로마토그래피에서 사용하는 적절한 캐리어에 결합하여 항원성 단백질을 정제할 수 있다.

본 발명을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하지만 어느 의미로든 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 하기 제조예 및 실시예에서 사용하는 시약은 Pharmacia, BioRad, Wako Pure Chemical Industrial, Ltd, TAKARA SHUZO CO., Ltd., Toyobo, 및 New England Biolabs으로부터 입수하였다.

실시예 1

(발현 플라스미드의 작제)

(1) 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal)의 작제

닭 베타-액틴 프로모터-기초 발현 플라스미드 pCAGG(Japanese Patent Pulication No. 168087/1991)을 제한효소 EcoRI로 분해하고 T4 DNA 폴리머라제로 둔단한 후 인산화 XhoI 링커의 존재하에 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 pCAGG(Xho)를 작제하였다. 수득한 pCAGG(Xho)를 제한효소 SalI로 분해하고 T4 DNA 폴리머라제로 둔단한 후 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 pCAGG-Pv2를 작제하였다. 생성된 pCAGG-Pv2를 제한횻 XhoI로 분해한 후 S1 뉴클레아제로 처리하여 XhoI 인식부위 주위의 수개의 뉴클레오티드를 제거하였다. 뉴클레아제 처리후, 단쇄 영역을 dNTPs의 존재하에 T4DNA 폴리머라제로 변형시킨 후 인산 SalI 링커 존재하에 T4 DNA 폴리머제로 결찰시켜 pCAGG-S1(Sal)를 작제하였다.

(2) 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal).dhfr의 작제

DHFR 유전자를 ㅍ함하는 pSV2-dhfr(S.Subramani et al., Mol. Cell biol., 1, p.854-864, 1981)을 제한효소 BglII로 분해하고 T4 DNA 폴리머라제로 둔단한 후 인산화 XhoI 링커의 존재하에 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 pSV2-dhfr-Bgn을 작제하였다. 수득한 pSV2-dhfr-Bgn을 제한효소 PvuII로 분해하고 인산 BglII 링커의 존재하에 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 pSV2-dhfr-BgB를 작제하였다. 생성된 pSV2-dhfr-BgB를 제한효소 BglII 및 BamHI로 분해한 후 아가로스겔 전기영동시켜 약 1.7kbp의 단편을 수득하였다. 상기에서 수득한 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal)를 제한효소 BamHI로 분해하고 1.7kbp의 단편과 폐환화되도록 결찰시켜 pCAGG-S1(Sal).dhfr를 작제하였다.

(3) 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo의 작제

아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 (neof)- 기초 발현 플라스미드 pMClneo-polyA(K.R. Thomas et al., Cell, 51,p.503-512, 1987)을 제한효소 XhoI로 분해하고 인산화 BamHI 링커의 존재하에 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 pMClneo-2B을 작제하였다. 생성된 pMClneo-2B를 제한효소 BamI로 분해한 후 아가로스겔 전기영동시켜 약 1.1kbp의 단편을 수득하였다. 상기에서 수득한 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal).dhfr를 제한효소 BamHI로 분해하고 1.1kbp의 단편과 폐환화되도록 결찰시켜 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo를 작제하였다.(도 1)

실시예 2

(뱀 독 에카린 cDNA의 제조)

문헌(S. Nishida et al., Biochemistry, 34, p.1771-1778, 1995)에 보고된 에카린 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 주형으로 사용하여 프라이머쌍으로서 서열

을 갖는 합성 DNA 및

서열

을 갖는 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하여 제한효소 XhoI의 인식 부위를 두개의 말단에 도입하였다. 수득한 유전자를 제한효소 XhoI로 분해하고 pUC18내로 서브클로닝하여 pUC.EC를 작제하였다. 생성된 플라스미드의 에카린 cDNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 통상의 방법에 따라 결정하여 개시 코돈으로부터 종결 코돈까지의 뉴클레오티드 서열이 상기 문헌에 보고된 서열에 정확하게 일치하는 에카린 cDNA를 수득하였다(서열번호 2)

본 명세서에서 수득한 에카린 cDNA을 서열번호 1로 나타낸 폴리펩티드를 코딩한다.

실시예 3

(에카린 발현 플라스미드의 작제)

실시예 1에 기술된 발현 벡터 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo내로 실시예 2에서 수득한 에카린 cDNA를 도입하였다. 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo를 제한효소 SalI로 분해한 후 소 소장-유래 알칼리성 포스포타아제로 탈인산화시켰다. 상기에서 수득한 플라스미드 pUC.EC를 제한효소 XhoI로 분해하고 에카린 cDNA를 코딩하는 약 1.8kbp의 단편을 아가로스겔 전기영동시켜 정제하였다. 이어서 탈인산화된 플라스미드 및 에카린 cDNA를 코딩하는 단편을 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 폐환화하여 pCAGG-S1.EC.dhfr.neo를 작제하였다.

실시예 4

(동물 세포를 사용하여 에카린의 발현)

실시예 3에 기술된 바와 같은 에카린 발현 플라스미드 pCAGG-S1.EC.dhfr.neo를 사용하여 CHO 세포 및 SP2/0 Ag14 세포를 형질전환시켰다. CHO 세포는 변형된 인산칼슘법에 의해 형질전환시킨 반면, SP2/0 Ag14 세포는 일레트로포레이션에 의해 형질전환시켰다.

형질전환에 사용하기 위한 발현 플라스미드는 제한효소 PvuI로 분해하여 미리 선형화시켰다.

(1) CHO 세포를 사용한 에카린을 생산하는 능력 평가

CHO 세포를 사용하여 하기 기술하는 형질전환으로부터 형질전환을 선별하였다.

형질전환하기 전날 세포를 5 x 10⁵세포/디쉬의 세포 밀도로 10cm 디쉬에 10% 우태아 혈청으로 보충된 핵산을 갖는 MEM 알파 배지에 세포를 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 세포를 20μg/ml의 선형화된 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo로 형질전환시켰다. 3% CO₂에서 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 세포를 Dulbecco PBS(-)로 세척하고 배양 배지를 10% 투석된 FCS 및 500μg/ml Geneticin을 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지로 대체하였다. 선별을 위해 매 3 내지 4일마다 이 배양 배지를 대체하면서 5% CO₂인큐베이터에서 37℃에서 배양을 계속한 후, 출현된 형질전환체를 풀링하고 에카린을 생산하는 그의 능력에 대하여 평가하였다.

형질전환된 세포를 2 x 10⁵세포/디쉬의 밀도로 10% 투석된 FCS로 보충된 핵산이 결여된 MEM 알파 배지에 플레이팅하고 밤새도록 배양하였다. 그 다음날, 무혈청 YMM 배지(인슐린, 트랜스페린, 에탄올아민 및 소듐 셀레나이트를 포함하는 아미노산/비타민이 보강된 핵산이 결여된 MEM 알파 배지)로 대체하였다. 5% CO₂인큐베이터에서 35℃에서 약 14일동안 배양한 후 배양 상등액중 에카린 수준을 측정하였다. 결과 배양 상등액중 10U/mL의 에카린이 검출되었다.

(2) SP2/0 세포를 사용한 에카린 생산 능력의 평가

SP2/0 세포를 사용하여 하기 기술하는 형질전환으로부터 형질전환체를 선별하였다.

SP2/0 세포를 냉각된 Dulbecco PBS(-)로 2회 세척하고 0.8ml의 PBS(-)중 현탁된 10⁷개의 세포를 일렉트로포레이션을 위한 큐벳에 놓았다(전극 폭 0.4cm; BIO-RAD 제조). 선형화된 발현 플라스미드(40μg)를 가하고 피펫을 혼합하였다. GenePulserII(BIO-RAD 제조)를 사용하여 975μF에서 0.22kv로 펄스를 적용시켰다. 큐벳을 10분동안 얼음상에서 냉각시킨 후, 세포 현탁액을 10% 우태아 혈청(FCS)를포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지를 사용하여 약 5,000세포/50㎕로 희석하고, 각각 50㎕/웰로 5개의 96-웰 플레이트상에 플레이팅하였다. 그 다음날, 10% 투석된 FCS를 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지 50㎕/웰을 가하고 밤새도록 추가로 배양하였다. 그 다음날, 1mg/mL Geneticin 및 10% 투석된 FCS를 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지 100㎕/웰을 가하였다. 10 내지 14일동안 배양한 후, 각 웰에 출현한 형질전환체를 에카린을 생산하는 능력에 대하여 분석하였다. 세포를 약 3 x 10⁵세포/mL의 밀도로 2% 투석된 FCS 및 500μg/mL Geneticin을 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지로 세포를 플레이팅하였다. 약 14일동안 배양한 후 배양 상등액중 에카린 수준을 측정하였다. 결과 각 형질전환체는 2 내지 10U/mL의 에카린을 생산하는 것으로 나타났다. 이들 형질전환체중 고수준의 에카린 생산 능력을 갖는 것 각 200㎕/웰을 동일 배양 배지를 사용하여 0.5세포/웰의 농도로 96웰 플레이트상에 접종하여 한계 희석에 의해 클로닝을 실시하였다. 수득한 각 클론은 에카린을 생산하는 능력에 대하여 분석하였다. 각 클론을 약 3 x 10⁵세포/mL의 밀도로 2% 투석된 FCS를 포함하는 핵산이 결여된 MEM 알파 배지로 플레이팅하였다. 약 14일동안 5% CO₂인큐베이터에서 35℃에서 배양한 후 배양 상등액중 에카린 수준을 측정하였다. 수득한 클론중 클론 #1H-8은 배양 상등액중 15U/ml의 에카린을 발현시켰다.

이 클론 #1H-8을 YMM 배지를 사용하여 무혈청 배지에 순응시켰다. 2% 투석된FCS를 ㅍ함하는 YMM 배지를 배양에 사용하고 세포 성장을 확인하였다. 이후, 첨가하는 혈청 수준을 0.5% 및 추가로 0.1%로 서서히 감소시키면서 배양을 계속하였다. 세포가 잘 증식되었는지 확인한 후, 완전하게 무혈청 YMM 배지와 함께 배양하였다. 세포 성장을 확인하고 에카린을 생산하는 그의 능력을 YMM 배지를 사용하여 상기 기술된 방법에 따라 분석하였다. 무혈청 배양액에 순응시킨 후 클론 #1H-8은 20U/mL의 에카린을 생산하는 능력을 가졌다.

실시예 5

(에카린-생산 세포의 대량 배양)

실시예 4에 기술된 바와 같은 무혈청 배양액에 순응된 에카린-생산 세포 #1H-8을 스피너 플라스크로 현탁배양시켰다. 세포를 확장 시킨 후 250mL의 세포를 2 x105세포/mL 밀도로 250mL 스피너 플라스크(Techne 제조)중 YMM 배지로 배양하였다. 세포를 1 x10⁶세포/mL 이상의 밀도로 1L 스피너 플라스크로 확장시켰다. 세포 성장을 확인한 후, 세포를 추가로 5개의 1L 스피너 플라스크로 확장시켰다. 세포를 약 7일동안 배양한 후 배양 상등액중 에카린 수준을 측정하여 약 18U/mL 에카린의 발현을 검출하였다.

실시예 6

(에카린의 일부 펩티드에 대한 항체 제조)

에카린 cDNA에 의해 코딩된 아미노산 서열을 Hopp and Wood(T.P.Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 78, 3824-3828, 1981)에 따라 그의 친수성 및소수성 영역에 따라 분석하였다. 고도의 친수성 영역으로서 서열번호 5을 기술한 아미노산 서열

을 갖는 펩티드를 펩티드 합성기(Applied)로 합성하였다. 0일째 프로인트 완전 아주반트의 존재하에, 14일 및 28일째 프로인트 불완전 아주반트의 존재하에 이 펩티드(500μg)를 진피내 접종하여 에카린 펩티드에 대항 폴리클로날 항체를 제조하였다. 웨스턴 블랏을 사용하여 수득한 항체가 에카린을 인식하는지 확인하였다. 자연발생된 에카린을 2-머캅토에탄올의 부재하에 SDS-PAGE시켰다. 전기영동시킨 후, 겔을 트랜스퍼 완충액(10mM N-사이클로헥실-3-아미노프로판설폰산, 10% 메탕로, pH 11)에 5분동안 침지시킨 후 100% 메탄올 및 트랜스퍼 완충액에 미리 침지시킨 PVDF 막(Immovilon: Millipore)상에 오버레이시켜 TRANS-BLOTCELL(BIO-RAD)를 사용하여 16시간동안 160mA에서 트랜스퍼를 수행하였다. TBST(50mM Tris-HCl, pH 8.0; 150mM NaCl; 0.05% Tween 20, 5% 스킴 밀크 포함)으로 차폐시킨 후, 실온에서 1시간동안 합성 펩티드를 투여받은 래빗으로부터의 TBST로 500배 희석된 혈청과 함께 막을 인큐베이션시킨 후 TBST로 세척하였다. 실온에서 1시간동안 2000배 희석된 항-래빗 IgG-HRP 표지 항체(Bio-RAD)와 막을 반응시켰다. 세척 후, 막을 Konica Immunostaining HRP 1000(Konica)로 염색하였다. 결과, 합성 펩티들 면역화되어 수득한 혈청이 에카린과 특이적으로 반응한다고 입증되었다.

실시예 7

(에카린의 정제)

(1) 양이온 교환 크로마토그래피

에카린-생산 SP2/0 세포로부터 배양 상등액(2000ml)을 2회 분량의 물로 희석시키고 1M 시트르산으로 pH 5.0으로 조정하고 0.45μm 필터를 통해 여과하여 샘플로서 사용하였다. 20mM 시트레이트(pH 5.0) 완충액으로 평형화된 Macro-Prep High S Support(20ml; Bio-Rad Laboratories) 칼럼에 4ml/분의 유속으로 적용시켰다. 칼럼을 동일한 완충액(150mL)로 세척한 후 0mM 내지 1000mM NaCl/20mM 시트르산(pH 5.0; 210ml) 범위의 염 농도 구배로 4ml/분의 유속으로 용출시켰다. 분획 1분량을 실시예 6에서 수득한 항-에카린 항체(Sigma)아 함께 웨스턴 블랏에 사용하여 용출된 에카린을 갖는 분획을 확인하고, 풀링하고 50mM NaCl을 포함하는 20mM 탄산수소나트튬 완충액(pH 9)에 대하여 투석하였다.

(2) 양이온 교환 크로마토그래피

상기 양이온 교환 크로마토그래피 (1)에서 과정에서 수득한 수득한 산물을 50mM NaCl를 포함하는 20mM 탄산수소나트튬 완충액(pH 9)으로 평형화된 Sulfate Cellulofine(2ml; SEIKAGAKU CORPORATION) 칼럼에 0.5ml/분의 유속으로 적용시켰다. 칼럼을 상기 기술된 완충액(14ml)으로 세척학 50mM 내지 600mM NaCl/20mM 탄산수소나트튬 완충액(pH 9; 20ml)의 범위의 염농도 구배로 유속 0.5ml/분으로 용출시켰다. 분획 1분량을 실시예 6에서 수득한 항-에카린 항체와 함께 웨스턴 블랏에 사용하여 용출된 에카린을 갖는 분획을 확인하고, 용출된 에카린과 함께 분획을 풀링하였다.

(3) 겔 여과

상기 크로마토그래피 (2) 과정에서 수득한 재조합 에카린을 포함하는 분획을 100mM NaCl을 포함하는 10mM 포스페이트(pH 7.0) 완충액으로 평형화된 겔 여가 칼럼 HiLoad 16/60(Pharmacia)에 유속 0.5ml/분을 적용시켰다. 겔 여과 마커(Bio-Rad)를 분자량 기준으로서 사용하였다. 각 분획을 프로트롬빈을 활성화시키는 능력에 대하여 측정하여 약 M.W. 80,000 분획에서 피크 활성을 검출하였다. 정제된 에카린의 수득한 분획을 Coomassie Brilliant Blue로 연속처리하고 2-머캅토에탄올 존재하에서 SDS-PAGE 시켰다. 수득한 패턴을 도 2에 나타낸다. 상기 3단계의 정제를 통해 최종 활성 수율이 13%이고 배양 상등액과 비교하여 26000배 높은 특이적 활성을 갖는 재조합 에카린을 수득하였다.

실시예 8

(재조합 에카린에 의한 프로트롬빈의 활성화)

프로트롬빈(20mM Tris-HCl, 100mM NaCl, pH 8.5; 1mg/mL;40mL)에 최종농도 50mM로 벤즈아미딘을 가하였다. 재조합 에카린을 최종농도 2U/mL로 혼합물에 가하였다. 반응 혼합물을 16시간동안 37℃에서 인큐베이션시키고 하기 기술하는 방법에 따라 트롬빈의 효소 활성에 대하여 결정하였다. 결과 도 3에 나타낸 바와 같이 재조합 에카린가 함께 첨가하였을 때 S-2238을 절단하는 활성이 프로트롬빈에서 검출되었다.

실시예 9

(재조합 에카린에 의해 활성화된 프로트롬빈 B 쇄의 N-말단 아미노산 서열)

에카린은 프로트롬빈중 Arg-Ile 부위에서 펩티드 결합을 특이적으로 절단하여 프로트롬빈으로부터 A 쇄 및 B 쇄를 생산하는 것으로 공지되어 있다. 실시예 8에서 활성화시킨 후 수득한 프로트롬빈 B 쇄의 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 2-머캅토에탄올 처리하고 15% 폴리아크릴아미드를 포함하는 SDS-PAGE상에 샘플을 흘렸다. 전기영동시킨 후, 겔을 트랜스퍼 완충액(10mM N-사이클로헥실-3-아미노프로판설폰산, 10% 메탄올, pH 11)에 5분동안 침지시킨 후 100% 메탄올 및 트랜스퍼 완충액에 미리 침지시킨 PVDF 막(Immovilon: Millipore)상에 오버레이시켜 TRANS-BLOTCELL(BIO-RAD)를 사용하여 16시간동안 160mA에서 트랜스퍼를 수행하였다. 트랜스퍼한 후 PVDF 막을 물로 세척한 후 0.1% Amide Black(40% 메탄올, 1% 시트르산 포함)으로 1분동안 염색한 후 증류수로 탈색시켰다. B쇄 분자량에 상응하는 염색된 밴드를 커팅하고 막 단편을 477A Protein Sequencer(Applied Biosystem)으로 분석하였다. N-말단 아미노산 잔기의 서열을 결정하였다;

이 서열은 인간 혈액으로부터 유래된 α-트롬빈의 B 쇄의 N-말단 아미노산 서열가 일치하였고, 이는 본 발명에 따라 수득된 재조합 에카린이 뱀독 유래 에카린과 같이 프로트롬빈중 Arg-Ile 부위에서 펩티드 결합을 특이적으로 절단한다는 것을 증명한다.

상기 기술된 실시예에서 트롬빈 및 에카린의 활성 측정을 하기와 같이 수행하였다:

(1) 트롬빈 활성 측정

하기 기술하는 바와 같이 트롬빈 활성을 측정하였다.

샘플(20㎕), 50mM Tris-HCl, pH 8.5 + 50mM NaCl 완충액(60㎕), 및 0.1% PLURONIC F-68(20㎕)을 2008 튜브(Falcon)에 가하오 3분동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 인간 혈장으로부터 유래된 정제된 α-트롬빈(Hematologic Technology: HCT-0020으로부터 구입)을 기준으로서 동일한 완충액을 사용한 5, 2.5, 1.25, 0.625, 및 0.3125mU/ml로의 희석액과 함께 사용하였다. 교반하면서 반응 혼합물에 100㎕의 TestTeam 전개 기질 S-2238(1mM; DAIICH PURE CHEMICALS CO., LTD.)을 가하였다. 5분동안 37℃에서 반응시킨 후, 반응을 800㎕의 0.1M 시트르산을 퀸칭하였다. 반응 용액(200㎕)을 96-웰 플레이트에 이동시키고 OD 450/650을 측정하였다.

(2) 에카린 활성 측정

샘플(20㎕), 및 50mM Tris-HCl, pH 8.5 + 50mM NaCl 완충액(60㎕), 및 0.1% PLURONIC F-68("완충액 1"; 60㎕)을 2008 튜브(Falcon)에 가하였다. 그에 0.01% 트립신(2㎕)을 가하고 혼합물을 교반하고 10분동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 그의 농도에 의존하여 필요에 따라 완충액 1로 희석하였다. 반응 용액에 10㎕의 프로트롬빈(0.4mg/ml; Hematologic Tecnology로부터 구입)에 가하고 혼합물을 5분동안 37℃에서 반응시켰다. 이어서 교반하면서 10mM EDTA(10㎕) 및 TestTeam 전개 기질 S-2238(1mM; 100㎕)을 반응 혼합물에 가하였다. 5분동안 37℃에서 반응시킨 후, 반응을 800㎕의 0.1M 시트르산을 퀸칭하였다. 반응 용액(200㎕)을 96-웰 플레이트에 이동시키고 DOD 450/650을 측정하였다. 에카린 활성 측량을 위해, 뱀 독으로부터 유래딘 에카린(Sigma로부터 상업적으로 이용가능)을 완충액 1로 25U/ml, 12.5, 6.25, 및 3.125U/ml로 희석하였다. 각 20㎕의 이들 표준 용액을 트립신 용액을 가하지 않는 샘플을 대신하여 사용하고 프로트롬빈을 가한 후 상기 기술된 단계를 반복하였다.

본 발명에 따라 프로트롬빈을 특이적으로 활성화시키는 재조합 에카린 단백질을 제공한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 본 발명자에 의해 제조된 재조합 에카린은 앞서 보고된 바 없는 신규한 단백질이다. 따라서 재조합 에카린 단백질을 실질적으로 사용하기 위한 기술상 문제, 예를 들면 활성 에카린 단백질을 발현시키는 발현 벡터의 작제, 재조합 에카린을 안정적으로 발현시키는 세포의 제조, 및 재조합 에카린의 정제는 본 발명에 의해 해소되었고, 이로써 산업 규모로 상기 단백질을 제조할 수 있게 되었다.

Claims

Arg-Ile 부위에서 절단하여 프리트롬빈-2로부터 α-트롬빈으로, 또는 프로트롬빈으로부터 메이조트롬빈으로 전환시킬 수 있는 유전자 재조합 에카린.
제 1항에 있어서, 에카린이 하나 또는 수개의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 부가된 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 부분 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열중 하나의 부분 서열, 또는 상기 아미노산 서열중 어느 하나를 일부로서 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 단편 또는 일련의 펩티드 단편인 유전자 재조합 에카린.
(1) 에카린을 코딩하는 유전자가 프로모터의 하류에 도입된 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물 또는 동물 세포를 배양하여 배양 상등액중 에카린을 생성하고 축적시키고 생성된 에카린을 회수하고;

(2) 회수한 에카린을 포함하는 용액을 정제하여 정제된 에카린을 수득하는 것을 포함하는, 유전자 재조합 에카린을 제조하는 방법.
제 3항에 있어서, 프로모터가 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 프로모터 및 닭 β-액틴 프로모터로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 유전자 재조합 에카린을 제조하는 방법.
제 4항에 있어서, 프로모터가 닭 β-액틴 프로모터인 유전자 재조합 에카린을 제조하는 방법.
제 3항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 발현 벡터가 에카린을을 코딩하는 유전자의 상류에 시그날 서열을 포함하는, 유전자 재조합 에카린을 제조하는 방법.
제 6에 있어서, 시그날 서열이 pel B 시그날, α인자 시그날, 이뮤노글로블린 시그날 SG-1 또는 C25 시그날로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 재조합 에카린을 제조하는 방법.
제 3항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 발현 벡터가 추가로 유전자 증폭 유전자를 포함하고 형질전환체가 유전자 증폭에 적절한 조건하에서 배양되는, 유전자 재조합 에카린을 제조하는 방법.
제 8항에 있어서, 유전자 증폭 유전자가 디하이드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하는 유전자인, 유전자 재조합 에카린을 제조하는 방법.
제 3항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 에카린을 코딩하는 유전자가 서열번호 2로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편 또는 상기 에카린 단백질의 아미노산 서열중 일부를 포함하는 펩티드를 코딩하는 유전자 단편인 유전자 재조합 에카린을 제조하는 방법.
제 3항 내지 제 10항중 어느 한 항에 있어서, 형질전환체가 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 마우스 골수종 세포, BHK21 세포, 293 세포 및 COS 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 동물 세포인, 유전자 재조합 에카린을 제조하는 방법.
제 3항에 있어서, 에카린 정제 방법이 양이온 교환크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피 순서로 수행되는 유전자 재조합 에카린을 제조하는 방법.