CN1260356C - 溶细胞性t细胞相关抗原4可溶性部分的重组基因，及其融合基因与产物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组sCTLA-4基因，其中的密码子符合哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性。本发明还提供一种包含该重组基因的融合基因。当本发明的基因或融基因表达时，其在CHO等哺乳动物细胞中的表达量及其淋巴细胞抑制能力均显著提高。

Description

溶细胞性T细胞相关抗原4可溶性部分的重组基因，及其融合基因与产物

                           发明领域

本发明涉及溶细胞性T细胞相关抗原4(CTLA-4)尤其是其可溶性部分的重组基因，以及含该重组基因的融合基因及其产物。

                           发明背景

溶细胞性T细胞相关抗原4(CTLA-4)是表达在活化T细胞表面的标志性分子之一。研究表明，该成分是维持体内T细胞稳定性的负调控因子，具有抑制活化T-细胞的增值的功能，与CD28构成了一对十分重要的免疫调节因子。目前，它被作为免疫抑制受体进行了广泛的研究，在临床上有可能作为抑制免疫排斥反应的制剂进行应用。

CTLA-4是一种极性跨膜蛋白。将这种蛋白的膜外可溶性部分(sCTLA-4)的基因与抗体分子Fc片段的编码融合在一起构成融合基因，插入适当的载体，导入适当的细胞后可以表达得到一种天然不存在的融合蛋白，它既有细胞表面受体与其原有配体结合的能力，又有抗体分子一样的可溶性，半衰期和抗体分子接近，保持活性时间比较长。利用人源基因获得的蛋白分子在体内不会引起免疫反应。目前已经有多种类似的可溶性融合蛋白质被制备出来并成功地用于临床。

                           发明目的

本发明的目的在于提供一种重组的sCTLA-4基因，它能够提高在哺乳动物细胞内的表达。

本发明的目的还在于提供一种含有该重组基因的融合基因，以及由此得到的融合蛋白，该融合蛋白具有更强的免疫活性。

本发明的目的还在于提供含有本发明重组基因的重组载体，可转染哺乳动物细胞而实现高表达。

本发明的目的还在于提供含有本发明重组载体的哺乳动物细胞。

                           技术方案

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种新的重组sCTLA-4基因，其中的密码子符合哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性，所述重组基因的序列为SEQ IDNO.1：

gctatgcagg tcgcgcaccc agccgtagtt ctcgcgagga ggcgtggaat ggcaagttta   60

gtctgagact aagcttcccc tggaaaggca acggacgtgc gagtcactgt cctacgccat  120

gcagagaggc acgtcacaga ggtgtgagcc gctacgtaga tgaccggaaa ggacttcacg  180

ttgctcgaag agtcgatatg gaccggaaca tcgagaggta agcaagtcaa gctgacaatt  240

catggtctca gcgcgatgga gaccggtctg tagatgtgga acgtcgacct gatgtagcct  300

ccaccttagt agctcggaat cggaaagggt acgcacatat acgtcataga acctgatccc  360

tggcctgaat cagagttgct gctgtgcata ctagctgctg taagatccgg cttcttatta  420

taaaggttgc tactgactgc agtatcattc aggaatatgc ttaacaatag taggccacta  480

actactggcg tgtaagtcaa tatgcctccg actgaccctg attgagataa ccatttccat  540

ccataattaa tcccaatgaa ttga                                         564

为了克隆与表达的目的，本发明在该序列在该结构基因前增加了一段操作序列CAT gctagcATG。其中，前3个大写碱基表示的保护碱基，下划线部分是NheI酶切位点，其后是加入的起始密码子ATG。

本发明还提供了包含该重组基因的融合基因。其中，重组sCTLA-4基因与人Ig抗体Fc片段的融合。

在本发明的一种优选实施方式中，重组sCTLA-4基因通过一段接头序列与人Ig抗体Fc片段融合，其编码的氨基酸序列为(Ala₃Ser₂)₅(SEQ ID NO：2)。该氨基酸序列的DNA序列之一为：5’-ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCTCGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCT CGTCA-3’(SEQ ID NO：3)。

本发明的目的还在于提供含有本发明重组基因的重组载体，可转染哺乳动物细胞而实现高表达。所述的载体可以是本领域熟知的各种适合转染哺乳动物的表达载体。

本发明的目的还在于提供含有本发明重组载体的哺乳动物细胞。所述的哺乳动物细胞可以是例如CHO细胞，Hela细胞，小鼠Ltk-(4)细胞，猴肾VERO细胞等各种常用哺乳动物工程细胞株。

                           发明效果

本发明在构建人CTLA-4可溶部分(sCTLA-4)与人Ig抗体Fc片段的融合基因时，通过人工重新设计sCTLA4基因及其与Fc片段之间的接头序列，使该融合蛋白的免疫活性及其在CHO等哺乳动物细胞中的表达量得到了显著提高。

                            优选实施方式

                              实施例1

                     全长重组sCTLA-4基因的制备

全长重组sCTLA-4基因(sCTLA4-M)的合成

本发明根据哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性，已知sCTLA-4片段的氨基酸序列，设计了一段带有克隆表达操作序列的新的重组sCTLA-4基因(SEQ IDNO：1)：

                                                     CAT gctagcATG

gctatgcagg tcgcgcaccc agccgtagtt ctcgcgagga ggcgtggaat ggcaagttta   60

gtctgagact aagcttcccc tggaaaggca acggacgtgc gagtcactgt cctacgccat  120

gcagagaggc acgtcacaga ggtgtgagcc gctacgtaga tgaccggaaa ggacttcacg  180

ttgctcgaag agtcgatatg gaccggaaca tcgagaggta agcaagtcaa gctgacaatt  240

catggtctca gcgcgatgga gaccggtctg tagatgtgga acgtcgacct gatgtagcct  300

ccaccttagt agctcggaat cggaaagggt acgcacatat acgtcataga acctgatccc  360

tggcctgaat cagagttgct gctgtgcata ctagctgctg taagatccgg cttcttatta  420

taaaggttgc tactgactgc agtatcattc aggaatatgc ttaacaatag taggccacta  480

actactggcg tgtaagtcaa tatgcctccg actgaccctg attgagataa ccatttccat  540

ccataattaa tcccaatgaa ttga                                         564

运用GCG软件将上述序列及其互补序列分解成长约85b的片段，共计25个多核苷酸片段，其中正链的的第一个片段为5’-CAGgctagcATGgctatgcaggtcgcgcacccagccgtagttctcgcgaggaggcgtgga-3’(SEQ IDNO：4)，其前三位碱基是保护碱基，第4-9个碱基是向表达载体插入时的酶切位点(Nhe I)，第一个ATG是加入的起始密码子。该片段也是合成全长融合基因时的上游引物，本研究中记作sCTLA4-M5′。设计原则是互补的相邻品片段之间有18-20个碱基的互补区。参照文献Chrisostomos Prodromou and Laurence H，Pearl(1992)的方法合成上述片段，然后进行PAGE纯化。

合成好的片段按照2μg/μl的浓度溶于灭菌的三蒸水中，按照以下方法进行PCR：

反应体系的组成：

成分	数量(μl)
		10X PCR反应缓冲液25mM Mg2SO4Pfu DNA聚合酶(5U/μl)多核苷酸片段(2μg/μl)灭菌三蒸水	10102各1μl，共计25μl至100μl

反应条件：

预变性：94℃，2分钟；

主循环：94℃，1分钟，55℃，1分钟，72℃，3分钟；

循环数：20；

后延伸：72℃，5分钟。

PCR过程在PROGENE GENIUS热循环仪上进行。

电泳鉴定与凝胶回收

按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，发现产物中有唯一一条分子量580bp左右的带，用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行。共得DNA约2.5微克。

重组sCTLA-4基因的克隆、筛选与测序

上述DNA片段按照常规方法克隆到pUC18载体上，转化大肠杆菌DH5a细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选，取18个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行扩增，用质粒抽提纯化试剂盒(Promega)抽提质粒DNA并进行酶切鉴定后选出了15个大小正确的克隆并进行DNA序列测定。根据测序结果，确认了1个序列完全正确的克隆，即sCTLA4-M3。

                            实施例2

                      天然sCTLA-4基因的制备

天然sCTLA-4基因的(sCTLA4-N)的PCR扩增

天然sCTLA-4基因的序列是已知的，可参见例如Genebank登录号L15006。据此设计扩增引物：

上游引物：5’CAG gctagcgctatgcaggtcgcgcacc-3’(SEQ ID NO：5)

其中，CAG为保护碱基，下划线部分为向表达载体pMSG(Pharmacia)克隆时的切点(Nhe I)。该片段也是构建天然sCTLA-4与Fc全长融合基因时的上游引物，记作sCTLA4-N5′。

下游引物：5’-tcaattcattgggattaattatgg-3’(SEQ ID NO：6)。

合成上述引物，PAGE纯化后用于PCR。

用GIBCO公司的Trizol试剂从人MT细胞中抽提总RNA，操作过程按照厂家的说明进行。抽提的总RNA在1％琼脂糖电泳上确认完整性后用INVITROGENE公司的反转录试剂盒按照厂家说明进行反转录，获得cDNA。反应完毕，经Promega公司的反应体系DNA抽提纯化试剂盒纯化后作为PCR的模板。

利用上述引物和模板DNA进行PCR，其反应体系如下：

成分	数量(μl)
		10X PCR反应缓冲液25mM Mg2SO4Pfu DNA聚合酶(5U/μl)引物(2μg/μl)模板DNA(1.6μg/μl)灭菌三蒸水	10102各3μl，共计6μl1.2至100μl

PCR过程在PROGENE GENIUS热循环仪上进行，循环条件如下：

预变性：94℃，2分钟；

主循环：94℃，1分钟，59℃，1分钟，72℃，2分钟；共20循环。

后延伸：72℃，5分钟。

PCR产物的鉴定和凝胶回收

按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，发现产物中有一条分子量在580bp左右的单一带，与预期的576bp大小一致。用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行。共得DNA约3.2微克。

天然sCTLA-4基因的克隆、筛选与测序

上述DNA片段按照常规方法克隆到pUC18载体上，转化大肠杆菌DH5a细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选，取5个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行扩增，用质粒抽提纯化试剂盒(Promega)抽提质粒DNA并进行酶切鉴定后选出了5个大小正确的克隆并进行DNA序列测定。根据测序结果，确认了1个序列完全正确的克隆，即sCTLA4-N3。

                          实施例3

                  sCTLA-4/Fc融合基因的获得

人IgG1 Fc片段的序列是已知的(参见例如Genebank登录号acc82527)。据此设计3′端引物：

IgG1 Fc-3′：5’-gcactcgagttttacccggagacagggagag-3’(SEQ ID NO：7)。

其中，gca为保护碱基，下划线部分为向上述表达载体克隆时的切点(Xho I)。该引物也是获得全长sCTLA-4与Fc融合基因的下游引物。

另外设计跨接sCTLA-4与Fc的引物，用于重组sCTLA-4的为：

引物M：5’- taaccatttccatccataattaatctgaggttgtctggaacccag-3’(SEQ ID NO：8)。

用于天然sCTLA-4的为：

引物N：5’- cttattttattcccatcaattgaacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ ID NO：9)

以上引物按照常规方法合成，并进行PAGE纯化。

以前述的sCTLA4-N3和带有全长IgG1基因的质粒pMG18(DEVELOPMENTOF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9PLASMIDS SEQUENCES.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.ThomasSchool of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，BirminghamB15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State UniversityScorina Av.4，Minsk 220080 Belarus)为模板，sCTLA4-N5′、IgG1Fc-3’和引物N为引物进行PCR，在琼脂糖凝胶电泳上获得分子大小约为1233bp的单一条带后进行凝胶回收。获得的DNA按照常规方法克隆到pUC18载体上后转化大肠杆菌并进行蓝白斑筛选，通过酶切鉴定和测序确认了一个序列完全正确的克隆，记作sCTLA4-N/Fc。

同理，以sCTLA4-M3替换sCTLA4-N3，sCTLA4-M5′替换sCTLA4-N5′，以引物M替换引物N，制得sCTLA4-M/Fc。

                            实施例4

                全长sCTLA-4/接头/Fc融合基因的制备

本发明设计的接头序列其氨基酸序列为：

(Ala₃Ser₂)₅(SEQ ID NO：2)；

其DNA序列之一为：

5’-ACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCA-3’(SEQ ID NO：3)。

为了通过PCR将sCTLA-4编码区与Fc片段拼接，在该片段的首尾各加上一个分别与sCTLA-4编码区3′端和Fc编码区5’端互补的序列，各约20个碱基长度。用于连接sCTLA4-M的记作“接头-M”，其序列为：

5’-cataattaatcccaatgaattgaACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCG

TCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ IDNO：10)

用于连接sCTLA4-N的记作“接头-N”，其序列为：

5，-cttattttattcccatcaattgaACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGT

CAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ IDNO：11)

合成上述两种接头，并进行Page纯化。

以IgG1Fc-3′引物与“接头-M”构成引物对，以含有人IgG1全序列的质粒pMG18为模板进行PCR，获得带有接头-M的人IgG1Fc片段，其大小均为764bp(669bp+95bp)。PCR，电泳，鉴定和凝胶回收的方法参照实施例1所述。获得的DNA记作“接头-M/Fc”。

同理，以“接头-N”替换“接头-M”，制得“接头-N/Fc”。

以前述“接头-N/Fc”和sCTLA4-N3的DNA为模板，sCTLA4-N5′和IgG1Fc-3’为引物进行PCR。反应体系为：

成分	数量(μl)
		10X PCR反应缓冲液25mM Mg2SO4Pfu DNA聚合酶(5U/μl)引物(2μg/μl)接头-M/Fc DNA(1.8μg/μl)sCTLA4-N3(1.5μg/μl)灭菌三蒸水	10102各1.5μl，共计2μl11.2至100μl

PCR过程在PROGENE GENIUS热循环仪上进行，循环条件如下：

预变性：94℃，2分钟；

主循环：94℃，1分钟，60℃，1分钟，72℃，3分钟；共20循环。

后延伸：72℃，5分钟。

PCR产物的鉴定和凝胶回收

将以上所得的PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，发现产物中有一条分子量在1300bp左右的单一带，与预期的1340bp大小一致。用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行。共得DNA约3微克。

sCTLA-4融合基因的克隆、筛选与测序

上述DNA片段按照常规方法克隆到pUC18载体上，转化大肠杆菌DH5a细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选，取7个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行扩增，用质粒抽提纯化试剂盒(Promega)抽提质粒DNA并进行酶切鉴定后选出了3个大小正确的克隆并进行DNA序列测定。根据测序结果，确认了1个序列完全正确的克隆，记作“sCTLA4-N/接头/Fc”。

同理，以“接头-M/Fc”替换“接头-N/Fc”，以sCTLA4-M3替换sCTLA4-N3，以sCTLA4-M5′替换sCTLA4-N5′，得到“sCTLA4-M/接头/Fc”。

                             实施例5

                         sCTLA-4基因的表达

融合基因表达载体的构建

将实施例3和4构建的pUC18[sCTLA-4/Fc]和pUC18[sCTLA-4/接头/Fc]正确克隆接种于含有氨苄青霉素的20ml液体LB培养基，37℃培养过夜，用Promega公司的Midi质粒DNA抽提纯化试剂盒抽提质粒DNA，各得质粒DNA约30微克。

分别用Nhe I和Xho I(Phamarcia)(10U/μl)消化pUC 18[sCTLA-4/Fc]，pUC18[sCTLA-4/接头/Fc]和表达质粒pMSG(Phamarcia)。酶切反应37℃反应过夜。酶切产物在0.8％琼脂糖电泳上进行分离鉴定，用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收大小约为1500bp的片段。

分别用T4DNA连接酶(10U/μl)将sCTLA-4/Fe或sCTLA-4/接头/Fc连接到pMSG载体的Nhe I和Xho I位点。

按照常规方法(见Sambrook等，1989)用连接所得重组pMSG转化大肠杆菌DH5a菌株，并在IPTG/X-Gal平板培养基上进行蓝白斑筛选。各取白斑12个接种于LB液体培养基37℃培养后抽取质粒如前所述进行酶切鉴定，每种融合基因至少获得4个具有正确大小的插入片段的克隆，作为候选克隆。

将上述候选克隆中的两个进行DNA测序。根据测序结果，分别确认插入片段的序列与设计的完全一致。将所得的正确克隆分别记作：pMSG[sCTLA4-M/Fc]、pMSG[sCTLA4-N/Fc]、pMSG[sCTLA4-M/接头/Fc]和pMSG[sCTLA4-N/接头/Fc]、CHO细胞的转化与表达

取带有上述四种重组pMSG的大肠杆菌菌株，分别接种于500ml加入了氨苄青霉素的2xYT液体培养基，37℃，260rpm震荡培养16小时。用Qiagen公司的“Ultrapure Plasmid Purification Kit”抽提质粒DNA，抽提过程按照厂家提供的说明书进行。

用脂质体法转染CHO细胞，转染试剂盒购自Invitrogene公司。转染时分别取上述纯化的pMSG[sCTLA4-N/接头/Fc]、pMSG[sCTLA4-M/接头/Fc]、pMSG[sCTLA4-M/Fc]、pMSG[sCTLA4-N/Fc]质粒100微克作为DNA样品对CHO细胞进行转染，转染操作程序按照厂家的说明书进行。

转染后的CHO细胞经连续3个月的氨甲喋呤(MTX)筛选，其浓度从0.05μM到10μM，每两周增加一次浓度，每次MTX的用量约为前一次的2倍，具体视细胞生长情况而定。细胞培养按照常规进行，培养基为：15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37℃，5％CO₂培养箱中培养。然后按照常规极度稀释法进行单克隆化。应用ELISA方法分别检测其融合蛋白的表达量，总共得到pMSG[sCTLA4-N/接头/Fc]克隆110个、pMSG[sCTLA4-M/接头/Fc]克隆87个、pMSG[sCTLA4-M/Fc]克隆93个、pMSG[sCTLA4-N/Fc]克隆112个。

在DEME培养基中常规培养，用ELISA对上述部分克隆sCTLA-4的表达强度进行了研究，具体数据如下：

基因类型	pMSG[sCTLA4-N/接头/Fc]	pMSG[sCTLA4-M/接头/Fc]	pMSG[sCTLA4-N/Fc]	pMSG[sCTLA4-M/Fc]
					被测克隆数量平均表达水平(mg/L上清)	740.37±0.21	442.68±0.28	380.39±0.34	482.89±0.52

以上数据说明，本发明的重组sCTLA-4基因显著提高了其表达水平，提高的幅度高达14.6倍。对该蛋白质的规模生产具有重要的经济价值。

                             实施例6

             sCTLA-4融合蛋白抑制淋巴细胞增殖能力的研究

将上述pMSG[sCTLA4-N/接头/Fc]、pMSG[sCTLA4-M/接头/Fc]、pMSG[sCTLA4-M/Fc]、pMSG[sCTLA4-N/Fc]的表达细胞株培养后用A蛋白-Sepharose进行亲和层析，获得纯度达90％以上的融合蛋白。

1.常规分离人外周血单核细胞(PBMC)，调整细胞密度为2×10⁶ cells/ml，PBMC等体积混合后以2×10⁵cells/孔接种“U”型96孔培养板，加入不同量的纯化融合蛋白，设置等体积相应空载体转染上清或培养基作对照，每组3复孔，37℃，5％CO₂培养5d，终止培养前16h加入³H-TdR(终浓度5μCi/ml)，收集细胞于0.45μm微孔滤膜上，烘干，液体闪烁计数仪测DPM(每分钟衰变数)值。

2.结果以 x±s表示，Microsoft Excel统计程序进行均数差异显著性分析。

3.在MLR反应(Linsley P S，Brady W，Urnes M，et al.CTLA-4 is a second receptorfor the B cell activation antigen B7[J].J Exp Med，1991，174(3)：561-569.)体系中，分别加入1微克、5微克和10微克Protein A纯化纯化的sCTLA4-N/接头/Fc、sCTLA4-M/接头/Fc、sCTLA4-M/Fc、sCTLA4-N/Fc或空载体转染CHO细胞上清，结果表明，即使加入1微克A蛋白纯化的融合蛋白，也能显著抑制人外周血MLR，抑制率为60％～70％；而加入同样体积的空载体转染CHO细胞上清，则无此作用，经单因素方差分析，结果有统计学意义，见下表。同样，我们也曾用未纯化的转染细胞的上清直接进行MLR实验，未能观察到显著的抑制作用，这可能与未纯化细胞转染上清中异源蛋白的刺激作用与微量融合蛋白的抑制作用相互抵消有关。

纯化sCTLA-4融合基因对人MLR中淋巴细胞增殖的影响(DPM，n＝3)

^*：与对照相比的P＜0.01；Δ：与0浓度相比的P＜0.01

从以上数据可以看出，加入接头的融合蛋白比没有接头的融合蛋白对人外周血MLR的抑制作用提高了大约1.5倍。这说明，接头的加入可以明显提高融合蛋白对淋巴细胞的抑制能力。

                                   序列表

<110>上海兰生国健药业有限公司

<120>溶细胞性T细胞相关抗原4可溶性部分的重组基因，及其融合基因与产物

<130>015486

<160>11

<170>PaterntIn Version 3.0

<210>1

<211>564

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

GCTATGCAGG TCGCGCACCC AGCCGTAGTT CTCGCGAGGA GGCGTGGAAT GGCAAGTTTA     60

GTCTGAGACT AAGCTTCCCC TGGAAAGGCA ACGGACGTGC GAGTCACTGT CCTACGCCAT    120

GCAGAGAGGC ACGTCACAGA GGTGTGAGCC GCTACGTAGA TGACCGGAAA GGACTTCACG    180

TTGCTCGAAG AGTCGATATG GACCGGAACA TCGAGAGGTA AGCAAGTCAA GCTGACAATT    240

CATGGTCTCA GCGCGATGGA GACCGGTCTG TAGATGTGGA ACGTCGACCT GATGTAGCCT    300

CCACCTTAGT AGCTCGGAAT CGGAAAGGGT ACGCACATAT ACGTCATAGA ACCTGATCCC    360

TGGCCTGAAT CAGAGTTGCT GCTGTGCATA CTAGCTGCTG TAAGATCCGG CTTCTTATTA    420

TAAAGGTTGC TACTGACTGC AGTATCATTC AGGAATATGC TTAACAATAG TAGGCCACTA    480

ACTACTGGCG TGTAAGTCAA TATGCCTCCG ACTGACCCTG ATTGAGATAA CCATTTCCAT    540

CCATAATTAA TCCCAATGAA TTGA                                           564

<210>2

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ala

                5                   10                  15

Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser

         20                      25

<210>3

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA  60

ACCACAACCT CGTCA                                                   75

<210>4

<211>60

<212>DNA

<213>引物

<400>4

CAGGCTAGCA TGGCTATGCA GGTCGCGCAC CCAGCCGTAG TTCTCGCGAG GAGGCGTGGA  60

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>5

CAGGCTAGCG CTATGCAGGT CGCGCACC              28

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>6

TCAATTCATT GGGATTAATT ATGG                  24

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>引物

<400>7

GCACTCGAGT TTTACCCGGA GACAGGGAGA G       31

<210>8

<211>45

<212>DNA

<213>引物

<400>8

TAACCATTTC CATCCATAAT TAATCTGAGG TTGTCTGGAA CCCAG        45

<210>9

<211>45

<212>DNA

<213>引物

<400>9

CTTATTTTAT TCCCATCAAT TGAACATGCC CACCGTGCCC AGCAC        45

<210>10

<211>120

<212>DNA

<213>引物

<400>10

CATAATTAAT CCCAATGAAT TGAACCACAA CCTCGTCAAC CACAACCTCG TCAACCACAA    60

CCTCGTCAAC CACAACCTCG TCAACCACAA CCTCGTCAAC ATGCCCACCG TGCCCAGCAC   120

<210>11

<211>120

<212>DNA

<213>引物

<400>11

CTTATTTTAT TCCCATCAAT TGAACCACAA CCTCGTCAAC CACAACCTCG TCAACCACAA    60

CCTCGTCAAC CACAACCTCG TCAACCACAA CCTCGTCAAC ATGCCCACCG TGCCCAGCAC   120

Claims (8)

1.一种重组sCTLA-4基因，具有SEQ ID NO.1所述的序列。

2.一种融合基因，含有权利要求1所述重组sCTLA-4基因和与之融合的人Ig抗体Fc片段基因。

3.根据权利要求2所述的融合基因，其中还包含一段位于重组sCTLA-4基因与人Ig抗体Fc片段之间的一段接头序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求3所述的融合基因，所述接头的DNA序列为SEQ ID NO：3。

5.权利要求3所述融合基因的蛋白质产物，包含sCTLA-4，如SEQ ID NO：2所示的接头和人Ig抗体Fc片段。

6.一种重组载体，其中含有权利要求1或2所述的基因。

7.一种哺乳动物细胞，其中含有权利要求6所述的重组载体。

8.根据权利要求7所述的细胞，它选自CHO细胞，Hela细胞，小鼠Ltk-(4)细胞，猴肾VERO细胞。