优选实施方式
实施例1
全长重组sCTLA-4基因的制备全长重组sCTLA-4基因(sCTLA4-M)的合成
本发明根据哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性,已知sCTLA-4片段的氨基酸序列,设计了一段带有克隆表达操作序列的新的重组sCTLA-4基因(SEQ IDNO:1):
CAT
gctagcATGgctatgcagg tcgcgcaccc agccgtagtt ctcgcgagga ggcgtggaat ggcaagttta 60gtctgagact aagcttcccc tggaaaggca acggacgtgc gagtcactgt cctacgccat 120gcagagaggc acgtcacaga ggtgtgagcc gctacgtaga tgaccggaaa ggacttcacg 180ttgctcgaag agtcgatatg gaccggaaca tcgagaggta agcaagtcaa gctgacaatt 240catggtctca gcgcgatgga gaccggtctg tagatgtgga acgtcgacct gatgtagcct 300ccaccttagt agctcggaat cggaaagggt acgcacatat acgtcataga acctgatccc 360tggcctgaat cagagttgct gctgtgcata ctagctgctg taagatccgg cttcttatta 420taaaggttgc tactgactgc agtatcattc aggaatatgc ttaacaatag taggccacta 480actactggcg tgtaagtcaa tatgcctccg actgaccctg attgagataa ccatttccat 540ccataattaa tcccaatgaa ttga 564
运用GCG软件将上述序列及其互补序列分解成长约85b的片段,共计25个多核苷酸片段,其中正链的的第一个片段为5’-CAGgctagcATGgctatgcaggtcgcgcacccagccgtagttctcgcgaggaggcgtgga -3’(SEQ IDNO:4),其前三位碱基是保护碱基,第4-9个碱基是向表达载体插入时的酶切位点(Nhe I),第一个ATG是加入的起始密码子。该片段也是合成全长融合基因时的上游引物,本研究中记作sCTLA4-M5′。设计原则是互补的相邻品片段之间有18-20个碱基的互补区。参照文献Chrisostomos Prodromou and Laurenee H,Pearl(1992)的方法合成上述片段,然后进行PAGE纯化。
合成好的片段按照2μg/μl的浓度溶于灭菌的三蒸水中,按照以下方法进行PCR:
反应体系的组成:
成分 数量(μl)
10XPCR 应缓冲液 10
25mM Mg2SO4 10
Pfu DNA聚合酶(5U/μl) 2
多核苷酸片段(2μg/μl) 各1μl,共计25μl
灭菌三蒸水 至100μl反应条件:
预变性:94℃,2分钟;
主循环:94℃,1分钟,55℃,1分钟,72℃,3分钟;
循环数:20;
后延伸:72℃,5分钟。
PCR过程在PROGENE GENIUS热循环仪上进行。电泳鉴定与凝胶回收
按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在0.8%琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定,发现产物中有唯一一条分子量580bp左右的带,用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收该片段,操作按照厂家的说明书进行。共得DNA约2.5微克。重组sCTLA-4基因的克隆、筛选与测序
上述DNA片段按照常规方法克隆到pUC18载体上,转化大肠杆菌DH5a细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选,取18个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行扩增,用质粒抽提纯化试剂盒(Promega)抽提质粒DNA并进行酶切鉴定后选出了15个大小正确的克隆并进行DNA序列测定。根据测序结果,确认了1个序列完全正确的克隆,即sCTLA4-M3。
实施例2
天然sCTLA-4基因的制备天然sCTLA-4基因的(sCTLA4-N)的PCR扩增
天然sCTLA-4基因的序列是已知的,可参见例如Genebank登录号L15006。据此设计扩增引物:
上游引物:5’CAG
gctagcgctatgcaggtcgcgcacc-3’(SEQ ID NO:5)
其中,CAG为保护碱基,下划线部分为向表达载体pMSG(Pharmacia)克隆时的切点(NheI)。该片段也是构建天然sCTLA-4与Fc全长融合基因时的上游引物,记作sCTLA4-N5′。
下游引物:5’-tcaattcattgggattaattatgg-3’(SEQ ID NO:6)。
合成上述引物,PAGE纯化后用于PCR。
用GIBCO公司的Trizol试剂从人MT细胞中抽提总RNA,操作过程按照厂家的说明进行。抽提的总RNA在1%琼脂糖电泳上确认完整性后用INVITROGENE公司的反转录试剂盒按照厂家说明进行反转录,获得cDNA。反应完毕,经Promega公司的反应体系DNA抽提纯化试剂盒纯化后作为PCR的模板。
利用上述引物和模板DNA进行PCR,其反应体系如下:
成分 数量(μl)
10X PCR反应缓冲液 10
25mM Mg2SO4 10
Pfu DNA聚合酶(5U/μl) 2
引物(2μg/μl) 各3μl,共计6μl
模板DNA(1.6μg/μl) 1.2
灭菌三蒸水 至100μl
PCR过程在PROGENE GENIUS热循环仪上进行,循环条件如下:
预变性:94℃,2分钟;
主循环:94℃,1分钟,59℃,1分钟,72℃,2分钟;共20循环。
后延伸:72℃,5分钟。PCR产物的鉴定和凝胶回收
按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在0.8%琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定,发现产物中有一条分子量在580bp左右的单一带,与预期的576bp大小一致。用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收该片段,操作按照厂家的说明书进行。共得DNA约3.2微克。天然sCTLA-4基因的克隆、筛选与测序
上述DNA片段按照常规方法克隆到pUC18载体上,转化大肠杆菌DH5a细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选,取5个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行扩增,用质粒抽提纯化试剂盒(Promega)抽提质粒DNA并进行酶切鉴定后选出了5个大小正确的克隆并进行DNA序列测定。根据测序结果,确认了1个序列完全正确的克隆,即sCTLA4-N3。
实施例3
sCTLA-4/Fc融合基因的获得
人IgG1 Fc片段的序列是已知的(参见例如Genebank登录号acc82527)。据此设计3′端引物:
IgG1Fc-3′:5’-gca
ctcgagttttacccggagacagggagag-3’(SEQ ID NO:7)。
其中,gca为保护碱基,下划线部分为向上述表达载体克隆时的切点(Xho I)。该引物也是获得全长sCTLA-4与Fc融合基因的下游引物。
另外设计跨接sCTLA-4与Fc的引物,用于重组sCTLA-4的为:引物M:5’-
taaccatttccatccataattaatctgaggttgtctggaacccag-3’(SEQ ID NO:8)。
用于天然sCTLA-4的为:引物N:5’-
cttattttattcccatcaattgaacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ ID NO:9)
以上引物按照常规方法合成,并进行PAGE纯化。
以前述的sCTLA4-N3和带有全长IgG1基因的质粒pMG18(DEVELOPMENTOF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9PLASMIDS SEQUENCES.A.Greated,R.Krasowiak,M.Titok,C.M.ThomasSchool of Biological Sciences,University of Birmingham,Edgbaston,BirminghamB152TT,UK and Faculty of Biology,Dept of Microbiology,Belarus State UniversityScorina Ay.4,Minsk 220080 Belarus)为模板,sCTLA4-N5′、IgG1Fc-3’和引物N为引物进行PCR,在琼脂糖凝胶电泳上获得分子大小约为1233bp的单一条带后进行凝胶回收。获得的DNA按照常规方法克隆到pUC18载体上后转化大肠杆菌并进行蓝白斑筛选,通过酶切鉴定和测序确认了一个序列完全正确的克隆,记作sCTLA4-N/Fc。
同理,以sCTLA4-M3替换sCTLA4-N3,sCTLA4-M5′替换sCTLA4-N5′,以引物M替换引物N,制得sCTLA4-M/Fc。
实施例4
全长sCTLA-4/接头/Fc融合基因的制备
本发明设计的接头序列其氨基酸序列为:
(Ala3Ser2)5(SEQ ID NO:2);
其DNA序列之一为:5’-ACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCA-3’(SEQ ID NO:3)。
为了通过PCR将sCTLA-4编码区与Fc片段拼接,在该片段的首尾各加上一个分别与sCTLA-4编码区3′端和Fc编码区5′端互补的序列,各约20个碱基长度。用于连接sCTLA4-M的记作“接头-M”,其序列为:5’-cataattaatcccaatgaattgaACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ IDNO:10)
用于连接sCTLA4-N的记作“接头-N”,其序列为:5’-cttattttattcccatcaattgaACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ IDNO:11)
合成上述两种接头,并进行Page纯化。
以IgG1Fc-3′引物与“接头-M”构成引物对,以含有人IgG1全序列的质粒pMG18为模板进行PCR,获得带有接头-M的人IgG1 Fc片段,其大小均为764bp(669bp+95bp)。PCR,电泳,鉴定和凝胶回收的方法参照实施例1所述。获得的DNA记作“接头-M/Fc”。
同理,以“接头-N”替换“接头-M”,制得“接头-N/Fc”。
以前述“接头-N/Fc”和sCTLA4-N3的DNA为模板,sCTLA4-N5′和IgG1Fc-3’为引物进行PCR。反应体系为:
成分 数量(μl)
10XPCR反应缓冲液 10
25mM Mg2SO4 10
Pfu DNA聚合酶(5U/μl) 2
引物(2μg/μl) 各1.5μl,共计2μl
接头-M/Fc DNA(1.8μg/μl) 1
sCTLA4-N3(1.5μg/μl) 1.2
灭菌三蒸水 至100μl
PCR过程在PROGENE GENIUS热循环仪上进行,循环条件如下:
预变性:94℃,2分钟;
主循环:94℃,1分钟,60℃,1分钟,72℃,3分钟;共20循环。
后延伸:72℃,5分钟。PCR产物的鉴定和凝胶回收
将以上所得的PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定,发现产物中有一条分子量在1300bp左右的单一带,与预期的1340bp大小一致。用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收该片段,操作按照厂家的说明书进行。共得DNA约3微克。sCTLA-4融合基因的克隆、筛选与测序
上述DNA片段按照常规方法克隆到pUC18载体上,转化大肠杆菌DH5a细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选,取7个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行扩增,用质粒抽提纯化试剂盒(Promega)抽提质粒DNA并进行酶切鉴定后选出了3个大小正确的克隆并进行DNA序列测定。根据测序结果,确认了1个序列完全正确的克隆,记作“sCTLA4-N/接头/Fc”。
同理,以“接头-M/Fc”替换“接头-N/Fc”,以sCTLA4-M3替换sCTLA4-N3,以sCTLA4-M5′替换sCTLA4-N5′,得到“sCTLA4-M/接头/Fc”。
实施例5
sCTLA-4基因的表达融合基因表达载体的构建
将实施例3和4构建的pUC18[sCTLA-4/Fc]和pUC18[sCTLA-4/接头/Fc]正确克隆接种于含有氨苄青霉素的20ml液体LB培养基,37℃培养过夜,用Promega公司的Midi质粒DNA抽提纯化试剂盒抽提质粒DNA,各得质粒DNA约30微克。
分别用Nhe I和Xho I(Phamarcia)(10U/μl)消化pUC18[sCTLA-4/Fc],pUC18[sCTLA-4/接头/Fc]和表达质粒pMSG(Phamarcia)。酶切反应37℃反应过夜。酶切产物在0.8%琼脂糖电泳上进行分离鉴定,用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收大小约为1500bp的片段。
分别用T4 DNA连接酶(10U/μl)将sCTLA-4/Fc或sCTLA-4/接头/Fc连接到pMSG载体的Nhe I和Xho I位点。
按照常规方法(见Sambrook等,1989)用连接所得重组pMSG转化大肠杆菌DH5a菌株,并在IPTG/X-Gal平板培养基上进行蓝白斑筛选。各取白斑12个接种于LB液体培养基37℃培养后抽取质粒如前所述进行酶切鉴定,每种融合基因至少获得4个具有正确大小的插入片段的克隆,作为候选克隆。
将上述候选克隆中的两个进行DNA测序。根据测序结果,分别确认插入片段的序列与设计的完全一致。将所得的正确克隆分别记作:pMSG[sCTLA4-M/Fc]、pMSG[sCTLA4-N/Fc]、pMSG[sCTLA4-M/接头/Fc]和pMSG[sCTLA4-N/接头/Fc]、CHO细胞的转化与表达
取带有上述四种重组pMSG的大肠杆菌菌株,分别接种于500ml加入了氨苄青霉素的2xYT液体培养基,37℃,260rpm震荡培养16小时。用Qiagen公司的“Ultrapure Plasmid Purification Kit”抽提质粒DNA,抽提过程按照厂家提供的说明书进行。
用脂质体法转染CHO细胞,转染试剂盒购自Invitrogene公司。转染时分别取上述纯化的pMSG[sCTLA4-N/接头/Fc]、pMSG[sCTLA4-M/接头/Fc]、pMSG[sCTLA4-M/Fc]、pMSG[sCTLA4-N/Fc]质粒100微克作为DNA样品对CHO细胞进行转染,转染操作程序按照厂家的说明书进行。
转染后的CHO细胞经连续3个月的氨甲喋呤(MTX)筛选,其浓度从0.05μM到10μM,每两周增加一次浓度,每次MTX的用量约为前一次的2倍,具体视细胞生长情况而定。细胞培养按照常规进行,培养基为:15%胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37℃,5%CO2培养箱中培养。然后按照常规极度稀释法进行单克隆化。应用ELISA方法分别检测其融合蛋白的表达量,总共得到pMSG[sCTLA4-N/接头/Fc]克隆110个、pMSG[sCTLA4-M/接头/Fc]克隆87个、pMSG[sCTLA4-M/Fc]克隆93个、pMSG[sCTLA4-N/Fc]克隆112个。
在DEME培养基中常规培养,用ELISA对上述部分克隆sCTLA-4的表达强度进行了研究,具体数据如下:基因类型 pMSG[sCTLA4- pMSG[sCTLA4- pMSG[sCTLA4- pMSG[sCTLA4-
N/接头/Fc] M/接头/Fc] N/Fc] M/Fc]被测克隆数量 74 44 38 48平均表达水平 0.37±0.21 2.68±0.28 0.39±0.34 2.89±0.52(mg/L上清)
以上数据说明,本发明的重组sCTLA-4基因显著提高了其表达水平,提高的幅度高达14.6倍。对该蛋白质的规模生产具有重要的经济价值。
实施例6
sCTLA-4融合蛋白抑制淋巴细胞增殖能力的研究
将上述pMSG[sCTLA4-N/接头/Fc]、pMSG[sCTLA4-M/接头/Fc]、pMSG[sCTLA4-M/Fc]、pMSG[sCTLA4-N/Fc]的表达细胞株培养后用A蛋白-Sepharose进行亲和层析,获得纯度达90%以上的融合蛋白。1.常规分离人外周血单核细胞(PBMC),调整细胞密度为2×106cells/ml,PBMC等体积混合后以2×105cells/孔接种“U”型96孔培养板,加入不同量的纯化融合蛋白,设置等体积相应空载体转染上清或培养基作对照,每组3复孔,37℃,5%CO2培养5d,终止培养前16h加入3H-TdR(终浓度5μCi/ml),收集细胞于0.45μm微孔滤膜上,烘干,液体闪烁计数仪测DPM(每分钟衰变数)值。结果以
x±s表示,Microsoft Excel统计程序进行均数差异显著性分析。在MLR反应(Linsley P S,Brady W,Urnes M,et al.CTLA-4 is a second receptorfor the B cell activation antigen B7[J].J Exp Med,1991,174(3):561-569.)体系中,分别加入1微克、5微克和10微克Protein A纯化纯化的sCTLA4-N/接头/Fc、sCTLA4-M/接头/Fc、sCTLA4-M/Fc、sCTLA4-N/Fc或空载体转染CHO细胞上清,结果表明,即使加入1微克A蛋白纯化的融合蛋白,也能显著抑制人外周血MLR,抑制率为60%~70%;而加入同样体积的空载体转染CHO细胞上清,则无此作用,经单因素方差分析,结果有统计学意义,见下表。同样,我们也曾用未纯化的转染细胞的上清直接进行MLR实验,未能观察到显著的抑制作用,这可能与未纯化细胞转染上清中异源蛋白的刺激作用与微量融合蛋白的抑制作用相互抵消有关。
纯化sCTLA-4融合基因对人MLR中淋巴细胞增殖的影响(DPM,n=3)
*:与对照相比的P<0.01;Δ:与0浓度相比的P<0.01
从以上数据可以看出,加入接头的融合蛋白比没有接头的融合蛋白对人外周血MLR的抑制作用提高了大约1.5倍。这说明,接头的加入可以明显提高融合蛋白对淋巴细胞的抑制能力。
序列表<110>上海兰生国健药业有限公司<120>溶细胞性T细胞相关抗原4可溶性部分的重组基因,及其融合基因与产物<160>11<210>1<211>564<212>DNA<213>聚核苷酸<400>1GCTATGCAGG TCGCGCACCC AGCCGTAGTT CTCGCGAGGA GGCGTGGAAT GGCAAGTTTA 60GTCTGAGACT AAGCTTCCCC TGGAAAGGCA ACGGACGTGC GAGTCACTGT CCTACGCCAT 120GCAGAGAGGC ACGTCACAGA GGTGTGAGCC GCTACGTAGA TGACCGGAAA GGACTTCACG 180TTGCTCGAAG AGTCGATATG GACCGGAACA TCGAGAGGTA AGCAAGTCAA GCTGACAATT 240CATGGTCTCA GCGCGATGGA GACCGGTCTG TAGATGTGGA ACGTCGACCT GATGTAGCCT 300CCACCTTAGT AGCTCGGAAT CGGAAAGGGT ACGCACATAT ACGTCATAGA ACCTGATCCC 360TGGCCTGAAT CAGAGTTGCT GCTGTGCATA CTAGCTGCTG TAAGATCCGG CTTCTTATTA 420TAAAGGTTGC TACTGACTGC AGTATCATTC AGGAATATGC TTAACAATAG TAGGCCACTA 480ACTACTGGCG TGTAAGTCAA TATGCCTCCG ACTGACCCTG ATTGAGATAA CCATTTCCAT 540CCATAATTAA TCCCAATGAA TTGA 564<210>2<211>25<212>PRT<213>接头肽<400>2Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ala
5 10 15Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser
20 25<210>3<211>75<212>DNA<213>接头<400>3ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA 60ACCACAACCT CGTCA 75<210>4<211>60<212>DNA<213>引物<400>4CAGGCTAGCA TGGCTATGCA GGTCGCGCAC CCAGCCGTAG TTCTCGCGAG GAGGCGTGGA 60<210>5<211>28<212>DNA<213>引物<400>5CAGGCTAGCG CTATGCAGGT CGCGCACC 28<210>6<211>24<212>DNA<213>引物<400>6TCAATTCATT GGGATTAATT ATGG 24<210>7<211>31<212>DNA<213>引物<400>7GCACTCGAGT TTTACCCGGA GACAGGGAGA G 31<210>8<211>45<212>DNA<213>引物<400>8TAACCATTTC CATCCATAAT TAATCTGAGG TTGTCTGGAA CCCAG 45<210>9<211>45<212>DNA<213>引物<400>9CTTATTTTAT TCCCATCAAT TGAACATGCC CACCGTGCCC AGCAC 45<210>10<211>120<212>DNA<213>引物<400>10CATAATTAAT CCCAATGAAT TGAACCACAA CCTCGTCAAC CACAACCTCG TCAACCACAA 60CCTCGTCAAC CACAACCTCG TCAACCACAA CCTCGTCAAC ATGCCCACCG TGCCCAGCAC 120<210>11<211>120<212>DNA<213>引物<400>11CTTATTTTAT TCCCATCAAT TGAACCACAA CCTCGTCAAC CACAACCTCG TCAACCACAA 60CCTCGTCAAC CACAACCTCG TCAACCACAA CCTCGTCAAC ATGCCCACCG TGCCCAGCAC 120