CN85104701A

CN85104701A - 生产有用物质的方法

Info

Publication number: CN85104701A
Application number: CN85104701.7A
Authority: CN
Inventors: 前田进; 古泽满
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1984-06-21
Filing date: 1985-06-19
Publication date: 1986-12-17
Also published as: CN1016796B

Abstract

公开了一种通过在培养的细胞或宿主体内增值重组的中国家蚕核多角体病毒(BmNPV)来生产有用物质的方法。经重组而产生的该重组BmNPV DNA为双股DNA，其包含原先存在于多角体蛋白结构基因上游的5′上游BmNPV DNA片段，且还包括所说结构基因的启动子区域、一个翻译起始密码子和一个产生有用物质的基因，带有或没有原先存在于所说多角体蛋白结构基因下游的3′下游BmNPV DNA片段。

Description

生产有用物质的方法

本发明是关于利用遗传工程技术生产可用作药物的物质的方法，特别是关于较之常规方法更为有效地生产这些物质的方法，尤其是涉及利用病毒DNA于体外和体内生产这类物质的方法。另一方面，本发明涉及利用核多角体病毒，于家蚕〔中国桑蚕（Bombyx mori）〕体内有效地生产各种有用物质的方法。本发明也涉及到用于实施上述方法的载体和重组体病毒DNA，以及以其生产同样物质的方法。

以前曾报导过许多借助重组DNA技术的优越性，使用载体等在大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母等微生物体内生产有用物质的方法。

有一篇报导述及试图利用一种其结构基因被替换后的病毒DNA（Autographa californica核多角体病毒DNA），在培养的细胞（一种建立的Spodoptera frugiperda细胞系）内生产β-干扰素和β-半乳糖苷酶〔Molecular and Cellular Biology，3（12），2156-2165（1983）;ibid.，4（3），399-406（1984）〕。但问题在于用来完成该方法的A.Californica病毒是可在外界生存的有害毒株。因此以所说的方法来生产有用物质是不能令人满足的。本发明人进行了一些试图提供一种更好方法的研究，以生产有用物质现已完成了本发明。

本发明提供一种利用中国家蚕核多角体病毒（以下缩写为BmNPV）的DNA，以遗传工程技术生产如蛋白质或糖蛋白等有用物质的方法，特别是提供一种利用所说的BmNPV DNA中启动子区域的功能优点与有用物质之基因重组而得到的重组体DNA、以及用于这种重组的重组载体，以有效地生产有用物质的方法。本发明还提供一种利用与BmNPV重组转移载体结合方式影响转染的方法，该重组的转移载体含有一个原来存在于多面体蛋白质结构基因之上游，且仍包括所说结构基因之启动子区域的5′上游BmNPV DNA片段、一个翻译起始密码子以及一个产生有用物的基因，带有或不带有原先存在于所说的多角体蛋白结构基因下游的3′下游BmNPV DNA片段。本发明进一步提供一种生产有用物质的方法，其包括用重组转移载体和BmNPV DNA的混合物接种培养的细胞或活的家蚕体以便形成重组体BmNPV，从而在所说的细胞或活体内产生所说的重组BmNPV，或者以同样方法用重组BmNPV接种培养的细胞或活的家蚕-该重组BmNPV是通过由BmNPV DNA和大肠杆菌质粒如PBR322制备一个连接的DNA，再用其它的适当方法进一步用生产有用物质的基因取代多面体蛋白结构基因而构建的，并在所说的细胞或活体内增殖所说的重组体BmNPV。本发明的一个特殊方面是，其所提供的制造有用物质的方法包括在培养的细胞或宿主（特别是由中国家蚕得到的细胞系或恬的家蚕体）内增殖重组的中国家蚕核多角体病毒（BmNPV），该重组体是通过重组含有原先存在于多角体蛋白结构基因上游且仍包括所说的结构基因启动子区域、一个翻译起始密码子和产生有用物质的基因的5′上游BmNPV DNA片段而产生的，其带有或没有原先存在于所说的多角体蛋白结构基因下游的3′下游BmNPV DNA片段。另一方面，本发明提供了一种载体，其含有最初存在于所说的多角体蛋白结构基因上游且仍包括所说的结构基因之启动子的5′上游BmNPV DNA片段，以及一个最初存在于所说之结构基因下游的3′下游BmNPV DNA片段，另外，刚刚提到的这种载体中的5′上游DNA片段是跟在翻译起始密码子和产生有用物质的基因之后的。再一个方面，本发明提供一种生产有用物质的方法，其包括由BmNPV DNA上切去多角体蛋白结构基因，连同有自所说的结构基因的且包括所说的结构基因的启动子区域的5′上游部分，以及自所说的结构基因下游的3′下游部分，用产生有用物质的基因去置换所得到的DNA片段的结构基因部分，将置换产物插入载体中，将如此产生的与BmNPV DNA与BmNPV DNA联合转移到细胞或宿主中，以便转染并增殖所得到的重组BmNPV DNA;经与产生有用物质的基因重组而产生的重组BmNPV DNA为异源基因;刚刚提到的这种重组BmNPV DNA，其重组是通过在多角体蛋白基因区域置换，或在某些其它区域插入而实现的;一种以遗传工程技术生产有用物质的方法包括利用BmNPV DNA作载体;而且以遗传工程技术生产有用物质的一种方法包括利用原来存在于多角体蛋白结构基因之上游并仍包括所说的结构基因之启动子区域的5′上游BmNPV DNA部分、以及原来存在于所说的结构基因之下游的3′下游BmNPV DNA部分。

在本文所附之图1中，画出了重组BmNPV DNA的组建图。

通过以下对本发明之实施模式的描述，将使本发明更为清楚、明显。

BmNPV是一种属于杆状病毒的昆虫病毒。它具有高度宿主特异性并能感染家蚕（Bombyx mori），其可在家蚕细胞内大量聚集多角体蛋白。此种病毒具有双股长度约140千碱基对（kbp）的环状DNA基因组，且该DNA可通过常规方法，如蛋白酶处理、十二烷基磺酸钠（SDS）处理以及萃取等方法由病毒颗粒中得到。这种双股环状DNA（以下简称病毒DNA或BmNPV DNA）是一种相当大的环状DNA。因此最好是选择使用由限制性内切酶处理DNA片段所产生的含多角体蛋白结构基因的较小DNA片段以及所说之基因前面或后面的部分（5′上游和3′下游部分）。各种限制性内切酶都是已知的，并且可从市场上买到，因此很容易为上述目的选择一种或几种适当的酶，并根据所使用的一种或多种酶来选择其适当的使用条件。包括于本发明之技术内容中的合成（化学合成、用一种或多种限制性内切酶裂解）、DNA片段的分离和定、DNA序列分析和大肠杆菌的处理（转化、培养、质粒回收等），均是使用已知的遗传工程技术完成的。

在由BmNPV DNA制得的许多DNA片段中筛选含有结构基因部分的DNA片段时，其中一个有用的方法是使用由常规方法制备的探针进行Southern杂交。因为要求被选择的片段含有结构基因部分，故所说的片段在5′侧另有一段相当长的DNA链是很重要的，当然在有些情况下，这样一个DNA链也可存在于3′侧（下游侧）。每侧链的长度对于有效的产生所要的有用物质是十分重要的。正如在下文中将要提到的，虽然容易操作也是一个重要因素，但究竟一个给定的链长是否足够用尚不能从实验上确定。纵然要花费很多的劳动，但依靠下面的描述，特别是通过各实施例，一个具有本领域内普通技术水平的人员在完成这些实验中不会遇到太大的困难。因为经用EcoRⅠ裂解可得到一个适用于本发明目的的约10.6Kbp的片段，所以也能用其它一些限制性内切酶得到各种适用的片段。

可有效地使用各种技术由连着前或后面DNA链的含有多面体蛋白结构基因的片段中去掉结构基因部分，并取出供使用的有适当长度并且在所说的结构基因上游侧含有启动子区域的DNA链，有时也可能是有适当长度的、且原来存在于所说的结构基因下游的DNA链。

因此，须检定由各种限制性内切酶裂解所得到的片段之DNA序列，以鉴定结构基因部分，从而可使用限制性内切酶裂解（如用Bal31消化）去除所说的部分。可以制备所需要的上游或下游DNA链，如可在Bal31消化之后保留这些部分，或者在测定各自的DNA序列之后用限制性内切酶裂解，或者用化学合成方法得到之。

业已分析并报导了家蚕中多角体蛋白质的氨基酸序列，据Serebryani等〔J.Invertebrate Patholoqy，31，442-443（1977）〕报导其包含有244个氨基酸。从而有可能核对由BmNPV得到的多面体基因部分与该氨基酸序列是否相符，或者通过测定所说之片段的碱基序列，根据密码子-氨基酸相符规律在所说的碱基序列基础上组建一个氨基酸序列，并以该氨基酸序列与Serebryani等人报告的序列比较，看所说的片段是否来自其它部分而不是所说的基团。

本发明人业已确证，为了去掉结构基因部分和利用上游和下游DNA片段，用EcoRⅠ裂解可得到的BmNPV DNA片段（约10.6Kbp）是最为适用的，并用Hind Ⅲ裂解所说的片段得到两个便于利用的片段。然而只用一个所说的片段并不能达到本发明的目的。通过用各种限制性内切酶筛选也可能获得其它一些适当的片段。在后面的描述中，当遇有使用上面提到的适用片段的例子时，将随时列举出来。除特别说明者外，一般DNA序列等均是以惯用方式指明的。5′末端在左侧，3′末端在右侧，由限制性内切酶得到的片段则连同限制性内切酶的名称指明。另外在这种情况下，左边或右边的序列也有如上指出的同样意义。

上述的EcoRⅠ-EcoRⅠ片段概括如下。

也可通过进一步将上述片段裂解为较小片段，之后用Southern杂交等方法对其进行筛选，来确定多角体蛋白的基因部分。因此在上述情况下，可确定所研究的结构基因是存在于HapⅠ-HindⅢ片段（约1.8Kb）中。为了参考，在最后一页中给出了所说的HpaⅠ-Hind Ⅲ片段之一个部分的碱基序列〔由HpaⅠ裂解位点上游的+201碱基到Hind Ⅲ裂解位点（从-382到1185的1567bp）〕。为了利用结构基因的上游和下游部分，比较方便的是使用由Hind Ⅲ处理制备的两个Hind Ⅲ-Hind Ⅲ（约3.9Kb）和Hind Ⅲ-Hind Ⅲ（约3.1Kb）片段。而这两个片段则可用常用的琼脂糖电泳法加以分离。

如此分离的两个片段可以方便地分离插入含有人工连接子（lin-Kers）的质粒中。适用于这一目的的质粒如有商品质粒PUC9和PUC8（均为Pharmacia P-L Biochemicals公司生产）。

将取自下游侧的Hind Ⅲ-Hind Ⅲ片段（约3.1Kb）在其Hind Ⅲ位点插入PUC8而使其得以利用。而含有多面体蛋白基因的上游侧HindⅢ-HindⅢ片段，则在其Hind Ⅲ位点插入PUC9，用限制性内切酶（如EcoRⅠ）在一个位点切断插入产物，并将如此得到的DNA片段经Bal31消化，因为Bal31是由切断位点两侧一个接一个地消化碱基，因而可很便利地校准DNA链的长度。通过改变处理时间，而产生几个不同长度的片段，并对其进行碱基序列分析，便可能找出现已没有多面体基因的片段。

以上述方法除去多面体基因后，即可得到一个含有起自所说基因上游的病毒源启动子区域的DNA片段。这个片段用于产生载体质粒，可通过向质粒插入所说的片段连同一个也可在上述去除多角体基因中得到的多角体基因之下游DNA片段，并进一步通过插入一个产生有用物质的基因到两个片段之间的位点（其为多角体基因出现之前的位点）插入质粒，以产生重组质粒。

例如，将用Hind Ⅲ处理后得到的上游部分插入PUC9得到一种质粒;而以Hind Ⅲ-Hind Ⅲ片段（约3.1Kb）形式将下游部分在Hind Ⅲ位点插入PUC8，则得到另一种质粒。之后利用两种质粒上所有的限制性内切酶位点之特征，可将上游和下游部分插入同一个质粒，而进一步构建含有上游和下游部分的另一种质粒。这种情况中，在这个部分之间设计二个人工连接子，有时很便于插入产生有用物质的基因。

当发现在多面体基因的翻译起始密码子处或其周围，以及在翻译终止密码子处或其周围有缺失时，可通过补加合成的DNA或以某些其它的适当方法来填充。这种修补是使用一般常用的重组DNA技术完成的。

为了生产有用物质，除了已报导的许多不同的基因外，尚期望在将来出现更多分离的天然基因并合成这些和其它一些基因。应很容易了解到的是，所有这些基因都能用于本发明的实践中。所说的有用物质包括肽、蛋白质和糖蛋白，如干扰素（α干扰素、β干扰素、γ干扰素）、胰岛素、人类生长激素、生长调节素、白细胞间素和各种淋巴细胞活素等。一般在进行继后的程序步骤之前，宜于将翻译起始密码子ATG与产生有用物质的这些基因相联接。

之后将产生有用物质的基因两端接上连接子，经插入载体中或用某种其它适当的惯用方法而制成重组质粒。结果，如此得到的重组质粒便含有来自病毒的片段，即含启动动子区的DNA片段和由翻译起始密码子开始的下游DNA片段，其分别来自产生有用物质之基因的上游和下游。在上述的程序步骤中，在DNA片段插入时可能会发生碱基序列倒转。因此在进行下一个步骤之前，必须进一步证实其插接准确无误，即必须证实碱基序列保有正确的方向性。

用上述方法得到的重组质粒本身可用于转化大肠杆菌并在其中增殖。

并不一定要求含有启动子区域的5′上游片段保有原先出现于BmNPV DNA中的碱基序列。既使所说的片段有或多或少的改变时，也可望得到相似的表达率。

存在于启动子区域中的典型的TATA序列框（TATAoox）一般不能以有限的方法鉴定，BmNPV DNA的那个部分是起自多面角蛋白结构基因上ATG之上游的。但如在实施例C-2和继后的例子及表1中所显示的，如在ATG的上游部分中有某些缺失，即缺失-7至-1bp，-18至-1和-19至-1bp，并不会真正影响到如没有这些缺失时可得到的极好结果。当缺失-29至-1bp时，也可产生满足的结果。但另一方面，如缺失-82至-1bp，则会造成明显降低效果的趋向。由此可见似乎在-80碱基附近包含了一个重要的启动子区域。5′上游DNA包括所说的启动子区域和一个用于病毒DNA重组的上游DNA，其长度可有较大的差异，例如，ATG前面可有长达几千碱基对。更特殊的是，正如本文后面将要提到的，使用取自ATG上游约1.8Kb的HpaⅠ-HindⅢ片段的那个部分，或使用取自ATG上游约3.9Kb的HindⅢ-HindⅢ片段的那个部分或其一部分，可获得满意的结果。5′上游DNA含有由所说的约3.9Kb片段向上游的更多部分，大概不是一个可少的条件。如前面已提到的，所说的启动子区域对于取得BmNPV DNA的极好蛋白产率是十分重要的。

正如后面将要述及的，位于所说启动子区域上游的DNA序列和多角体蛋白结构基因下游的3′下游DNA序列，其作为关键部分对于向BmNPV DNA中插入一个产生有用物质的基因（带有翻译起始密码子）来制备重组病毒是攸关重要的。这样，用BmNPV DNA和一个用于转移的、含产生有用物质基因的DNA片段和所说基因之上游和下游的、其DNA序列同源于BmNPV DNA中各自付本的重组DNA（如质粒）进行混合感染，由于所说关键部分对于产生重组BmNPV DNA的同系性而导致产生有用物质之基因与BmNPV DNA的交换和转移。

参照上文和下文以及实施例中所述的方法进行多角体蛋白结构基因之上游和下游部分如DNA序列的测定、修变和利用，对于本领域内熟练技术人员来说，是不会有什么困难的。一个本领域内的技术人员可以弄懂和实践相关的技术，但如果没有任何技术角度的发明步骤，就可能难于办到。应注意到的是，任何以其方法可实践的具体化模式均落入本发明之范畴内。

使用上述的重组质粒，可有各种方法得到含有有用物质之基因的重组BmNPV DNA，例如一是在体外进行，另外则是在家蚕体内进行。在一个深一步的实践模式中，其不是使用这样一个重组质粒，而是使用在BmNPV DNA和PBR322或其它质粒间产生的重组体，并且在所说的重组体中多角体基因被一种有用物质的基因取代，以得到一个重组病毒DNA。

在体外用BmNPV DNA和带有产生有用物质之基因的重组质粒混合感染培养的细胞，例如由中国家蚕细胞建立的细胞系（Bm细胞），可导致所需要之基因（产生有用物质的基因）与病毒DNA的交换和转移，而得到重组病毒DNA（重组BmNPV DNA）。

在有的实施例中，这种重组是以用所需要的基因置换多角体蛋白结构基因区域的方式实现的，而在其它的实施例中，则是在某个或某些区域向病毒DNA另外插入一个或多个用于产生有用物质之基因的方式实现的。在体外实施的这种混合感染导致重组病毒DNA的增殖，并继而导致所要的有用物质积聚。培养基中可能含有未重组的和重组的病毒，但可用一般方法将重组病毒分离出来，例如用稀释法或噬菌斑法。

上述混合感染也可在家蚕体内完成。

通过以生长在Bm细胞中的病毒（重组或非重组病毒的混合物或由其中分离出的重组体）于体外感染Bm细胞，或将病毒经皮注射于家蚕体内或其体腔中，即可有效地产生所需要的有用物质。之后可用一种适当的已知方法分离和纯化该有用物质。

依据于本发明，从而有可能安全、经济且大量地生产出有用的肽、蛋白质和糖蛋白。

依据于本发明，一种肽或蛋白质是在真核细胞中产生的。因此当使用由真核细胞得到的基因时，所产生的肽或蛋白质即可受到如其在真核细胞体内或经受的修变。如信号肽删除和糖链接加，以期望这些产品较之以通常遗传工程技术中使用细菌获得的产品有更大的效用。另外，因为这些产品是被分泌到细胞外的，所以也很容易纯化。

再者，人类有着许多年的养蚕经验并积累了大量的研究成果，因而很容易实现大量养殖。如今也已可能靠人工饲料养蚕。所以，使用病毒载体在恬生物体水平上生产有用物质大概更为适于工业化生产目的，而且比在细胞水平上生产这些物质更为经济。

下列实施例是述及生产一种作为药物的蛋白质-α干扰素（α-IFN）的，例中使用了α-IFN基因作为产生有用物质的基因，旨在进一步详细阐述本发明的实施模式。但应注意到，这些实施例绝不构成对本发明之范围的限制。

实施例1

A.用噬菌斑技术克隆并增殖BmNPV

用BmNPV经口感染处在第三令期的家蚕（中国家蚕Bombyxmori）。几天后收集体液，用TC-10培养基〔J.Invertebrate Pathology，25，363-370（1975）〕稀释之并用于感染以单层形式培养的Bm细胞（一种公认的中国家蚕细胞系：Appl.Environ.Microbiol.，44，227-233（1982）〕。用感染的细胞在含有0.75%琼脂糖的TC-10培养基上辅层，培养基凝固后，于27℃培养几天。用巴斯德吸管分离平板上形成的噬菌斑。将此噬菌斑技术程序重复两次，得到遗传上均一的病毒隔离群。将这些病毒隔离群的典型毒株BmNPV T₃用于继后的实验。

在Bm细胞中增殖毒株T₃，之后用于经皮接种以感染第五令期的家蚕。6天后形成了含有多角体的感染组织液，向其中加水稀释之，离心，将沉淀物悬液于蒸馏水中并研磨之。经分级离心（3，000rpm，30分钟）和不连续密度梯度离心（45%和55%（W/W）蔗糖溶液2，000rpm，30分钟）纯化多角体。分级离心多角体悬液（3，000rpm，10分钟），以除去蔗糖溶液，将纯化的多角体悬浮于0.1M碳酸钠（pH11）-0.05M氯化钠中，并于25℃处理30分钟，致使病毒颗粒释放。该病毒悬液经10-40%（W/W）蔗糖密度梯度离心（18，000rpm，30分钟）以纯化。经透析或分级离心（40，000rpm，30分钟）除去蔗糖，得到纯化的病毒颗粒。

B.制备病毒DNA，鉴定多角体基因，并克隆化

B-1 病毒DNA的提取

向如此得到的含病毒溶液中加入SDS（十二烷基磺酸钠，1W/W%）和蛋白酶K°（Merck，1mg/ml）。37℃温育2小时后，将等体积苯酚溶液〔含10mM Tris-HCl缓冲液（pH7.6）-1mM EDTA的饱和溶液〕加入上述溶液，将该混合物轻轻摇动约5分钟后，以12，000rpm离心5分钟。收集水层，并重复苯酚处理两次。向该含DNA的水层中加等体积氯仿，之后轻轻摇动约5分钟，并以12，000rpm离心2分钟。收集水层，重复氯仿处理两次，并将水层对10mM Tris-HCl缓冲液-1mM EDTA透析约2天。如此得到的病毒DNA用于继后的基因克隆化和Bm细胞转染。

B-2 多角体基因的克隆化

探针制备：第五令期家蚕经皮注射毒株Bm NPV T₃，几天后用盐酸胍法由脂肪体组织提取总RNA并用Oligo（dT）纤维素柱纯化，得到含Poly（A）的mRNA。于体外用兔网织红细胞翻译系统检验该mRNA，发现编码多角体的mRNA占总RNA的90%或以上。用所说的mRNA作模板，以Oligo（dT）作引物，用反向转录酶合成CDNA。此时是以含³²P的dCTP为底物，如此标记的CDNA用作筛选多角体基因的探针。

含多角体基因Eco RⅠ片段的克隆化：用Eco RⅠ消化BmNPV T₃的纯化DNA。在0.7%琼脂糖凝胶上电泳分离消化片段并转移到硝酸纤维素滤纸上，之后与上述探针杂交。将特异性杂交之约10.6Kb的DNA片段插PBR322的Eco RⅠ裂解位点。至此，用Eco RⅠ消化病毒DNA，之后再按上面B-1中所述方法作同样的苯酚处理和氯仿处理。分离水层，向其中加入1/20体积的4M氯化钠和2体积的冷乙醇，将沉淀的DNA溶解在小量Tris缓冲液〔10mM Tris-HCl（pH7.6）-1mM EDTA〕中。另外，用Eco RⅠ消化PBR322，之后以上述同样方法处理，进一步用BAP〔细菌碱性磷酸酶（Bethesda Research Laboratories）〕处理，再作苯酚处理和氯仿处理，并加乙醇沉淀之。将沉淀物溶于小量Tris缓冲液内。

用T₄连接酶于5℃处理由病毒DNA和pBR322得到的Eco RⅠ消化产物，处理10小时以使之连接。将连接产物引入大肠杆菌K12JM83，用上述标记的cDNA作探针，通过菌落杂交方法筛选形成的四环素抗性转化菌。从而即得到携带一个含有约10.6Kb Eco RⅠ片段（其中含多面体基因）的质粒的大肠杆菌菌株。培养该菌株并用氯化铯方法纯化该质粒DNA，定名为pBmK36。附图中给出了pBmK36之Eco RⅠ-Eco RⅠ插入部分的酶切图。进一步以上述cDNA作探针用Southern杂交法检定插入的DNA部分。所说的cDNA只与HpaⅠ-HindⅢ片段（约1.8Kb）杂交。

C.去掉多角体结构基因部分

C-1 含多角体基因及其下游部分的克隆化

将包含上述HpaⅠ-HindⅢ片段的HindⅢ-HindⅢ片段（约3.9Kb）和包含多角体基因下游部分的HindⅢ-HindⅢ片段（约3.1Kb）分别在HindⅢ位点插入商品化克隆载体pUC9和pUC8中，得到p9H18和p8H225。

C-2去掉多角体基因部分

用Eco RⅠ裂解质粒p9H18，之后用Bal 31处理，将裂解位点的任一侧切掉。根据Bal31处理的时间长短不同，所产生之片段的长度不同。将这些片段用HindⅢ处理并经0.7%琼脂糖凝胶电泳分离，之后提取，得到来自病毒的不同长度的DNA片段。

用SmdⅠ和HindⅢ处理pUC9，之后与前已得到的DNA片段（有一个钝性末端和一个HindⅢ末端）连接。用所产生的质粒转化大肠杆菌K12 JM83并培养之，回收质粒，使用一个引物（用于M13的15碱基序列的引物）依二脱氧方法（dideoxy method）测定插入之各病毒源DNA片段3′侧碱基序列，从而鉴定病毒多角体基因部分。在该病毒源DNA片段的碱基序列中找到了Serebryani等人论文中所述的相应于多角体蛋白之氨基酸序列的碱基序列，而且翻译起始密码子ATG也是完全相同的。在依据Bal 31处理的不同长度片段所得的不同质粒中，一个在多角体基因翻译起始密码子ATG之上游缺失29个碱基对，并且缺失多角体蛋白结构基因（包括ATG）的质粒定名为p9B241。

相似地，各缺失ATG上游82个碱对、19个碱基对、18个碱基对和7个碱基对，并缺失ATG及随后之碱基对的质粒分别定名为p9B587、p9B310、p9B276和p9B585。所涉及的这个区域的碱基序列如下：

D.缺失多角体结构基因部分之质粒的构建

用Eco RⅠ和AatⅡ处理质粒p9B241，再用EcoRⅠ、AatⅡ和ScaⅠ处理按C-1所述方法构建的p8H225（用ScaⅠ将非必需的pUC8得到的片段转化为小片段）。两反应混合物先用苯酚处理，再用氯仿处理，之后用乙醇沉淀。连接两份沉淀物DNA，用所得到的质粒转化大肠杆菌K12 JM83。筛选病毒源之上游和下游DNA片段以正确方向插入的质粒。用各种限制性内切酶裂解，显示该重组质粒有一个氨苄青霉素抗性标志，且包含一个病毒DNA的上游部分，该部分起自多角体基因起始密码子ATG上游第30碱基对，并由所说的第30碱基对向上游延伸。约3Kb（所说的部分是一个包括启动子的非翻译区域）;该重组质粒还包含一个由所说的基因之终止密码子向下游约3.1Kb的下游部分（但缺失终止密码子下游约300碱基对），上述的上游与下游各与原始病毒呈同样方向。这个质粒能在大肠杆菌系统中增殖，并定名为p89B241。相似地，分别用p9B587、p9B310、p9B276和p9B585构建p89B587、p89B310、p89B276和p89B585。

E.α-IFN基因的插入

ⅰ）由人类基因组λ噬菌体Charon 4A重组体文库中查找出白细胞IFN基因（Lawn et al.，cell，15，1157（1978）〕，用HindⅢ和Eco RⅠ处理如此得到的含α-IFN-J基因的DNA，以琼脂糖凝胶电泳法分离含α-IFN-J基因的片段，并与用HindⅢ和Eco RⅠ处理的PUC9相连接。用所得到的质粒转化大肠杆菌K12 JM83。由转化菌中回收该质粒并用MstⅡ和PvuⅡ处理之，分离含α-IFN-J基因的DNA片段并将一个SmaⅠ连接子（Takara Shuzo）连接到所说片段的两端。用SmaⅠ处理该连接产物，并与在D步骤中得到的质粒p89B241的SmaⅠ片段连接，以得到一个重组质粒。在进一步证实α-IFN确以正确方向插入该质粒后，即用该质粒转化大肠杆菌K12JM83并培养之，从而产生出大量的质粒。将该质粒定名为pIFN-1-B241。在这个质粒中，跟在多角体基因上游部分（从大约-3Kb碱基对到-30碱基对）之后的是一个在构建质粒p89B241中所用之连接子的13bp残基，再后是一个得自染色体的α-IFN-J基因的32bp5′未翻译区，在这个区域之后则是以ATG开始且具有正确插入方向的α-IFN-J基因。另外与所说的α-IFN-J基因相连的还有一个多角体基因的下游部分（由终止密码子下游约300bp的碱基对到所说碱基对下游约3.1Kbp碱基对）。

ⅱ）用上述质粒，即上述含α-IFN-J基因的HindⅢ-Eco RⅠ片段与pUC9相连接的产物转化大肠杆菌K12 JM83。由转化菌中回收该质粒并用HpaⅡ处理，分离含α-IFN-J基因的DNA片段并与用³²P-ATP和T₄多核苷酸激酶（Takara Shuzo）磷酸化的化学合成之寡聚物（CGGGCCATC）同另一个合成的寡聚物（CCGGGATGGCC）退火的产物相连接。用琼脂糖凝胶电泳法分离该连接产物之后提取之，再用³²P-ATP和T₄多核苷酸激酶使之磷酸化并与步骤D中得到的质粒p89B241的XmaⅠ片段相连接，以得到一个重组质粒。在证实α-IFN-J基因确系以正确方向插入该质粒后，即以所说的质粒转化大肠杆菌K12JM83，从而大量产生这种质粒。该质粒被定名为pIFN-2-B-241。

这个质粒中，接在多角体基因的上游部分（从约3Kb上游碱基对到-30碱基对）之后的是构建质粒p89B241所用连接子的13bp残基，其后是以ATG开始并以正确方向插入的α-IFN-J基因，再接下来是一个多角体基因的下游部分（从终止密码子下游约300bp碱基对到所说碱基对下游约3.1Kb的某个碱基对）。

依同样方法分别用p89B587、p89B310、p89276和p89B585作起始材料，构造pIFN-2-B587、pIFN-2-B310、pIFN-2-B276和pIFN-2-B585。

ⅲ）连接子的合成

寡脱氧核糖核苷酸的化学合成：

根据H.Ito等人报导〔Nucleic Acids Research，10，1755（1982）〕的方法，使用聚苯乙烯树脂以固相方法合成寡聚物。经在叔丁胺-吡啶（1∶9V/V）溶液中处理，使完全被保护的双功能二聚体（Ⅰ）（约100mg）转化为相应的3′-磷酸二酯（Ⅱ），使用均三甲苯磺酰-硝基三吡咯胺（MSNT，100mg）为缩合剂，使3′磷酸二酯（Ⅱ）与5′游离核苷树脂（Ⅲ）缩合。用醋酸酐-吡啶（1∶9V/V）溶液使未反应的5′羟基酰化。继后在2%三氯醋酸（TCA）-二氯甲烷中处理，得到一种脱三苯甲基产物（Ⅳ）。重复上述反应系列，直至合成特殊需要的序列。向结合了如此得到的寡聚物的离子交换树脂（约20mg）中加入0.5ml 0.5M四甲基胍-吡啶-2-乙醛肟〔溶于吡啶-水（15∶4）〕。于37℃反应8小时后，于55℃用浓氨水将该反应混合物处理8小时。用葡聚糖凝胶G-50精细柱（2.5×60cm）过滤该溶液，得到一种DMTr-寡聚物。之后再用高压液相层析法（HPLC）进一步纯化该寡聚物，层析中使用一个反相柱（SSC-ODS-272，0.6×20cm）和溶液A（0.2M三乙基醋酸铵（TEAA），pH7.0）及溶液B（溶于0.02M TEAA的50%乙腈，pH7.0），以产生一个线性浓度梯度。将如此纯化的DMTr-寡聚物于室温下用80%醋酸处理20分钟，以使脱三苯甲基化作用更完全，之后按如上所述方法再次HPLC。洗脱液对10mM Tris-HCl（pH7.5）-1mM EDTA（pH8.0）透析，得到需要的寡聚物。将如此得到的完全去保护的寡脱氧核糖核苷酸作反相柱层析只出现一个峰，另外在用〔r-³²P〕-ATP和T₄多核苷酸激酶标记5′末端后，以15%聚丙烯酰胺凝胶-7M尿素系统电泳，只出现一条带，从而证实该合成产物的均一性。

F.Bm细胞的转染

BmNPV T₃毒株病毒DNA和pIFN-1-B241，其比例为1：100与分别具有下列组份的溶液Ⅰ和Ⅱ混合：

Ⅰ、双蒸水 2.1ml

载体DNA（鲑鱼精巢，1mg/ml） 50μl

BmNPV DNA 10μl

PIFN-1-B241 DNA 50μg

2M 氯化钙 300μg

Ⅱ、含0.28M氯化钠的50mM HEPES缓冲液（pH7.1）

2.5ml

磷酸盐缓冲液（35mMNaHPO₄-35mMNaH₂PO₄）

50μl

将1ml混悬液加到4ml培养Bm细胞的培养基中，以将上述DNA引入中国家蚕细胞内。20小时后改换新鲜培养基。继续培养5天，之后回收培养基并离心。取澄清之上清液进行α-IFN活性分析。以1，000rpm离心5分钟，回收由培养基得到的上清液，稀释并作噬菌斑分析四天后于显微镜下检查空斑，收集无多角体噬菌斑。将此程序重复3次，得到单一毒株。用该毒株感柴Bm细胞，并于培养5天后回收培养基。

G.α-IFN在中国家蚕体内的表达

第5令期第一天的家蚕经皮注射上面F中所述培养5天后回收的培养基;或者给予注射用单一病毒株以0.5ml/只（10⁷pfu）的剂量感染后培养5天回收的培养基，之后于25℃以桑叶饲养5天。将收集针刺入腹腔附件并将其体液收集到冰冷却的Eppendorff氏管内。向体液中加等体积的TC-10培养基，离心（10，000rpm，5分钟）并分析上清液的α-IFN活性。

H、活性测定

依据C.Philip等人报导的方法〔Method in Enzymoloqy，78，387-394（1981）〕使用得自人类羊膜的FL细胞和水疱性口炎病毒（VSV），在96孔微滴定板上用细胞病理作用抑制（50%CPE抑制）分析法进行α-IFN活性测定，同时与α-IFN标准样品进行比较。表1和表2显示分析结果（各用不同的单一病毒毒株）。

表1

表2

HpaⅠ-HindⅢ片段的碱基序列

5′^-382CAGGAAGAGGTTTATACTAAAC

TGTTACATTGCAACGTGGTTTCGTCTACCAAATGTGAAA

ACCGATGTTTGATCAAGGCTCTGACACATTTTTACGAATTA

CGACTCCAAGTGTGTGGGTGAAGTCATGCATCTTTTAATC

AAATCCCAAGATGTGTATAAACCACCAAACTGCCAAAAAA

TGAAAACTGTCGACAAGCTCTGTCCGTTTGCTGGCAACTG

CAAGGGCCTCAATCCTATTTGTAATTATTGAACAATAAAA

CAATTATAAATGTCAAATTTGTTTTTTATTAACGATACAA

ATGGAAATAATAACCATCTGGCAAATAAATAAGTATTTTA

CTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAACCTATAAAT

123

ATGCCGAATTATTCATACACCCCCACCATCGGGCGTACTT

ACGTGTACGACAATAAATATTACAAAAACTTGGGCTGTCT

TATCAAAAACGCCAAGCGCAAGAAGCACCTAGTCGAACAT

GAACAAGAGGAGAAGCAATGGGATCTTCTAGACAACTACA

TGGTTGCGCAAGATCCCTTTTTAGGACCGGGCAAAAACCA

AAAACTTACCCTTTTTAAAGAAATTCGCAGTGTGAAACCC

GATTCCATGAAGTTAATCGTCAACTGGAGCGGCAAAGAGT

TTTTGCGTGAAACTTGGACCCGTTTTGTTGAGGACAGCTT

CCCCATTGTAAACGACCAAGAGGTGATGGACGTGTACCTC

GTCGCCAACCTCAAACCCACACGCCCCAACAGGTGCTACA

AGTTCCTCGCTCAACACGCTCTTAGGTGGGAAGAAGACTA

CGTGCCCCACGAAGTAATCAGAATTATGGAGCCATCCTAC

GTGGGCATGAACAACGAATACAGAATTAGTCTGGCTAAAA

AGGGCGGCGGCTGCCCAATCATCATGAACATCCACAGCGAGTA

CACCAACTCGTTCGAGTCGTTTGTGAACCGCGTCATATGG

GAGAACTTCTACAAACCCATCGTTTACATCGGCACAGACT

CTGCCGAAGAAGAGGAAATCCTAATTGAGGTTTCTCTCGT

TTTCAAAATAAAGGAGTTTGCACCAGACGCGCCTCTGTTC

ACTGGTCCGGCGTATTAAAACACTATACATTGTTATTAGT

ACATTTATTAAGCGTTAGATTCTGTGCGTTGTTGATTTAC

AGACAATTGTTGTACGTATTTTAATAATTCATTAAATTTG

TAATCTTTAGGGTGGTATGTTAGAGCGAAAATCAAATGAT

TTTCACGTAGTCTTTGTATCTGAATTTAAATATTAAATCC

TCAATAGATTTGTAAAATAGGTTTCGATTGGTTTCAAACA

AGGGTTGTTTTTGCAAACCGATGGCTGGACTATCTAATGG

ATTTTCGCTCAACACCACACGACTTGCCAAATCTTGTAGC

AGCAATCTAGCTTTGTCGATATTCGTTTGTGTTTTGTTTT

GTAATAAAGATTCGACGTCGTTCAAAATATTATGCGCTTT

TGTATTTTTTTCATCACTGTCGTTGGTGTACAATTGACTC

GACGTAAACACGTTAAATAAAGCTT 3′

1185

勘误表

Claims

1、一种生产有用物质的方法，其包括在培养的细胞或宿主体内增殖重组的中国家蚕核多角体病毒(BmNPV)DNA，经重组而产生的该重组Bm NPV DNA为双股DNA，其包含原先存在于多角体蛋白结构基因上游的5′上游BmNPV DNA片段，且还包含所说结构基因的启动子区域、一个翻译起始密码子和一个产生有用物质的基因、有或没有原先存在于所说的多角体蛋白结构基因之下游的3′下游Bm NPV DNA片段。

2、根据权利要求1的生产有用物质的方法，其中重组Bm NPV DNA是在中国家蚕细胞的细胞系中或在活的家蚕体内进行增殖。

3、一种经重组而产生的重组Bm NPV DNA，其为包含原先存在于多角体蛋白结构基因上游的5′上游Bm NPV DNA片段，且还包括所说之结构基因的启动子区域、一个翻译起始密码子和一个产生有用物质的基因，带有或没有原来存在于所说的多角体蛋白结构基因下游的3′下游Bm NPV DNA片段的两股DNA。

4、一种载体，其中包含一个原先存在于多角体蛋白结构基因上游的5′上游Bm NPV DNA片段且还包括所说结构基因的启动子区域和原先存在于所说结构基因下游的3′下游Bm NPV DNA片段。

5、根据权利要求4的载体，其中5′上游DNA片段之后跟着一个翻译起始密码子和一个产生有用物质的基因。

6、一种产生有用物质的方法，其包括由Bm NPV DNA切掉多角体蛋白结构基因，连同所说结构基因上游的5′上游部分，并包括所说结构基因的启动子区域和所说结构基因下游的3′下游部分，以一个产生有用物质的基因置换所得到的DNA片段的结构基因部分，将置换产物插入载体中，将如此产生的用于同BmNPV DNA结合转移的重组DNA引入细胞或宿主以转化，并增殖所得到的重组Bm NPV DNA。

7、一种用产生有用物质的基因进行重组而制得的重组Bm NPV DNA其为异源基因。

8、根据权利要求7的重组Bm NPV DNA，其中重组包括在多角体蛋白基因区域置换或在某个其它区域插入。

9、一种以遗传工程技术生产有用物质的方法，其包括利用Bm NPV DNA作为载体。

10、一种以遗传工程技术生产有用物质的方法，其包括利用原先存在于多角体蛋白结构基因上游的5′上游Bm NPV DNA部分且还包括所说结构基因的启动子区域，以及原先存在于所说结构基因之下游的3′下游Bm NPV DNA部分。