CN1084889A - 天花粉蛋白合成基因 - Google Patents

Abstract

天花粉蛋白合成基因已按大肠杆菌高表达密码 子分配系数重新设计和全合成。这个含有27个单 一的限制性核酸内切酶部位的合成基因已在大肠杆 菌中高表达(20mg/l)，产生了与从栝楼块根中分离 的天花粉蛋白有相同免疫活力和生物活力的蛋白 质。

Description

本发明涉及分子生物学，具体地说涉及采用计算机辅助设计基因DNA顺序、DNA的全合成和重组技术以及基因表达的调控等基因工程学，使大肠杆菌等产生原来只有在中医药用植物-栝楼属（Trichosanthes  Kirilowii  Maxim.）植物块根中才含有的医用蛋白质，天花粉蛋白（缩写TCS）。

栝楼在我国有长期的药用历史，近年来，在发掘祖国医学宝库的研究中，我国科技工作者分离纯化了结晶的天花粉蛋白，并成功地在临床上将TCS用于中期妊娠引产和抗早孕、迄今已有十多年数以千计病例的成功实践。TCS对宫外孕、绒毛膜上皮癌及葡萄胎也有疗效。最近发现TCS能抑制爱滋病病毒（HIV）在感染细胞内的复制，对乙型肝炎等七种病毒也有抑制作用。分子生物学研究指出TCS具有I型核糖体失活蛋白的活力，是一个药用范围潜力广泛的重要医用蛋白[汪猷主编，〈天花粉蛋白〉（1990年），科学出版社，北京.]。

TCS是一个分子量为26，000D，等电点为pI9.4的碱性蛋白质。它由247个氨基酸残基组成的单链多肽，其氨基酸顺序已被测定[Wang，Yu，et  al.，Pure  Appl.Chem.（1986）58，789-798;Collins，E.J.，et  al.，J.Biol.Chem.（1990）265，8665-8669.]。TCS天然基因DNA顺序已被测定[Chow，T.P.，et  al.，J.Biol.Chem.（1990）265，86708674.]，它编码289个氨基酸残基，其中包括N-端23个残基的前导肽，247个残基的成熟肽和C端19个残基的延伸肽。

TCS在应用于临床引产和治疗爱滋病的病例中尚出现过一些不利的副作用，还需要对它的结构与功能加以改造。迄今，对蛋白质的结构改造比较有效的是基因工程方法，已有文献报道关于天花粉蛋白天然基因的基因工程研究[Shaw，P.-Ch.，et  al.，Gene（1991）97，267-272;鲍一明等，中国科学B辑（1992）9：944-950;汪丽琴等，自然科学进展（1992）5：402-406;Zhu，R.-H.，et  al.，Int.Pept.Prot.Res.（1992）39，77-81.]。此外，美国专利（US  5128460，1992年）公布了一个合成的DNA顺序，它不同于天然TCS基因顺序，主要用于编码成熟的TCS顺序，但合成步骤复杂繁琐。上述已有技术报道的基因在大肠杆菌中表达的产率低，仅为1-5mg/l，表达的结果只能用灵敏的放射免疫印迹法（Western  blotting）检出，大多数用天然基因表达的产物是TCS前体，有的带着前导肽或带C端延伸肽，有的甚至不表达。为了克服上述缺点，因此设计和合成一个方法简便且高表达的TCS基因是目前天花粉蛋白基因工程研究的重要课题。

为此，本发明目的是设计合成一个成熟的天花粉蛋白结构基因，直接在大肠杆菌中能高表达出与天然天花粉蛋白有相同免疫活力和生物活力的蛋白质，并且在天花粉蛋白基因中设置至今为最多的限制性内切酶部位，以提供一个便于进行基因突变研究的基因工程体系。

本发明是一种在大肠杆菌中高表达的天花粉蛋白合成基因，是按大肠杆菌高表达体系的密码子分配系数，经计算机辅助设计和全合成的TCS结构基因（简称mTCS  G），能以高产率（20mg/l）表达出单一的成熟TCS，经生物测试证明这个基因产生的蛋白质具有与天然TCS相同的免疫活力和生物活力，并且该基因便于对TCS突变进行系统的结构与功能研究。

1.基因的设计

将247个残基的氨基酸顺序输入计算机后，运转有关程序，按大肠杆菌高表达密码子分配系数[参见文献：Sharp，P.M.，et  al.，Nucl.Acids  Res.（1986）14，5134.]和设置尽可能多的常用的单一的限制性内切酶部位的要求设计了含755b.P.的mTCSG（图1），它含有编码基因741  b.P.，双重终止密码子（保证正确表达的机率很高），以及两端的粘性末端EcoRⅠ和HindⅢ。在mTCSG中，除了二端的EcoRⅠ/HindⅢ外，还设置了27个常用的单一的限制性核酸内切酶部位（图2），相应的TCS天然基因中只有7个这种内切酶。显然mTCSG更有利于进行基因的定位突变和盒式突变，以便系统、全面地对TCS进行结构与功能关系的研究。另外对照TCS天然基因，有141个碱基不一样（图1中mTCSG核苷酸顺序上面标出的部分碱基），这是为了改变126个氨基酸的密码子使mTCSG适合于在大肠杆菌中表达。与美国专利（US  5128460）报道的合成基因比较有131个氨基酸密码子的164个碱基不同。即mTCSG与天然TCS基因及美国专利的合成TCS基因比较，有50%以上的密码子不同。

2.基因的全合成

本发明参照该领域的标准方法和本实验室于1990年发表的单链法[参见文献：Chen，H.-B.，et al.，Nucl.Acids Res.（1990）18，871-878]并加以改进后完成了mTCSG的全合成。采用T₄DNA连接酶催化连接有机合成的寡核苷酸片段，然后用DNA重组技术将连接成的mTCSG大片段单链或双链直接克隆进一种质粒载体，并且在载体中装配成完整的mTCSG，得到含此基因的克隆质粒并且转化一种大肠杆菌。

图3表示mTCSG被划分为EP₁PN和NH三个大片段和它们由A、B.C.D……等等26个寡核苷酸片段组成。图4是mTCSG的合成路线图：EP和PN大片段分别从六个和四个寡核苷酸片段按单链法连接成相应的单链大片段，NH大片段由三个双链连接而成;然后EP，PN和NH三个大片段分别先后按图4所示的路线逐步重组克隆进载体pUC18（参见文献：Yanisch-Perron，C.，et al.，Gene（1985）33，103-119），直至得到含完整mTCSG的克隆质粒pCOTCS（于1993年5月18日提交中国典型培养物保藏中心，地点中国武汉，保藏编号CCTCC  NO：M93029）。

3.全合成mTCSG的表达

为了使全合成的mTCSG能在大肠杆菌中高表达，除上述密码子设计方面的安排外，还采取下述二个设计：a.选择由强启动子控制的表达载体质粒，b.设计和合成与这个表达载体及mTCSG都匹配的核糖体结合部位，SD顺序，及相关的核苷酸顺序。

利用本发明的mTCSG容易改造的优点，如实施例3所述按图6所示的路线构建了高效表达质粒pElTCS（于1993年5月18日提交中国典型培养物保藏中心，地点中国武汉，保藏编号CCTCC  NO：M93030），并转化大肠杆菌C600（pCI857）。转化子经预培养至对数生长的中后期，于41℃热诱导并继续培养4个小时后，离心收集菌体。表达产物经过不同时间取样经过十二烷基磺酸钠变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明（图7）：在与天然TCS泳距相同的部位，出现一条随表达时间延长而产物数量逐渐增加的蛋白质条带，表达产率约为20mg/l。

4.mTCSG表达产物的纯化和活力测定

将上述表达产物20mg/l按图8的程序将菌体细胞用溶菌酶等方法破碎，离心收集上清液。经硫酸铵沉淀及上清液对磷酸钠（pH7）透析，再用羧甲基葡聚糖C-50柱层析分离，经NaCl梯度洗脱后（图9）可得到纯度为95%以上的TCS纯品（图10）15mg/l，经ELISA方法鉴定有天然TCS的免疫活性[表3]，和对中期妊娠小白鼠的止孕效应测定证实用mTCSG表达产生的TCS具有天然TCS的生物活力[表4]。

5.天花粉蛋白突变体结构基因的构建和表达

为了利用mTCSG进行TCS突变，原则上先找出要突变的氨基酸密码子（一个或几个）在图1中的部位，然后找到待突变氨基酸密码子附近的二端限制性内切酶，决定要置换的限制性内切酶片段，并合成含有新密码子的限制性内切酶片段后，用类似上述方法进行DNA重组构建突变体质粒，并进行突变体质粒的基因表达等。

这里介绍天花粉蛋白N227K突变体：先在质粒pClTCS上进行将第227位天门冬酰胺密码子AAT变换成赖氨酸密码子AAG的限制性内切酶片段置换，即用新合成的限制性内切酶片段，BClI-BstBI，取代pClTCS中原来的BClI-BstBI片段的DNA重组，得到含突变体N227K结构基因的质粒pC1TCS-N227K，然后用实施例3（A）后半部分相同的方法将突变体N227K结构基因从突变体质粒pC1TCS-N227K转入表达载体pPLc2833得到突变体表达质粒pE1TCS-N227K，并转化大肠杆菌C600（pCI857）后基因表达和表达产物的分离纯化、测活等等。用相似的步骤对mTCSG进行基因突变可以构建许多突变体基因，然后基因表达可得到许多天花粉蛋白的突变体。研究它们的结构与功能关系，从中可以发现一些性能优良的天花粉蛋白的衍生物或新品种，实施例5介绍的N227K突变体已显示它对IgE单抗的免疫力有明显降低，是天然天花粉蛋白的24%-44%（表5）。

下面所给出的定义是为了更清楚地说明它们在本发明中使用的含义。

基因

是指生物合成一个蛋白质所需的完整DNA部分，一个基因包括结构基因，结构基因上游的转录启动区，它启动和调节结构基因的表达，和3'端多聚腺苷酸顺序。

结构基因

是基因的一个部分，包括编码蛋白质或多肽的部分，有时包括其中一部分插入的DNA片段。结构基因通常可以在细胞中发现或通常不在其被引入的细胞位置上，在后一种情况下，它被称之为异源基因。异源基因可以全部或部分地来自该领域已知的任何来源。结构基因在编码区或翻译区有一个或多个修饰，它们能影响表达产物的生物活性或化学结构、表达率或表达控制方式。这些修饰包括（但不局限于）突变、插入、缺失和一个或多个核苷酸的置换。

合成基因

是指一个结构基因的DNA顺序中编码区的全部或大部分是化学合成的，如这里所列举的，寡核苷酸片段是采用该领域熟知的过程化学合成，经退火和酶催化连接而形成基因片段，然后用酶催化进一步装配这些基因片段成完整的基因。与这里所描述的合成基因的功能和结构相当的基因可采用该领域中所用的定位突变或其它有关的方法来制备。

克隆

是指一群细胞的每一个衍生自同一个祖先细胞，克隆最重要的用处是将DNA片段，包括整个基因或一部分，通过载体（如质粒，噬菌体和柯斯质粒）在宿主细胞中扩增。本发明合成的mTCSG按此领域的常规方法重组进质粒后转化大肠杆菌而得到扩增。

转化

是指稳定地将携带功能基因的一个DNA片段引入一个以前不含有该基因的生物体内。上述mTCSG通过重组进质粒后转化引入以前不含有该基因的大肠杆菌中。

基因表达

是指结构基因转录和翻译（或转译）而产生所编码的蛋白质。本发明的合成mTCSG在大肠杆菌中比相应的TCS天然基因有更高的表达效率和更正确的表达结果。

功能相当

指功能相同或接近相同。一种基因的表达产物，其免疫活性和生物活力与天然基因表达的产物或天然分离的相同，就被认为与天然基因功能相当。

本发明有下列优点：

1.只设计成熟TCS的编码基因核苷酸顺序，表达时可以采用多种方法：如在实施例3中叙述的，在基因的5'端加一个翻译所需的起始密码子ATG和必要的核糖体结合部位，SD顺序，等有关核苷酸顺序，这样可使本发明的mTCSG有适宜于选择各种大肠杆菌表达体系的灵活性。

2.按表达的宿主细胞密码子体系设计相应的结构基因，从根本上克服了天然基因（植物细胞真核系统）的局限性。我们在mTCSG的密码子选择上消除了原天然基因中18个在大肠杆菌高表达体系分配系数中极低的密码子[表1]，为在大肠杆菌中实现高表达奠定基础。

3.在mTCSG中通过计算机辅助设计了尽可能多均匀分布的单一的限制性核酸内切酶部位。不包括二端粘性末端，mTCSG中设置27个常用的单一的限制性内切酶部位，二个相邻部位之间平均间隔约40b.p.，这样就可以很方便地利用mTCSG进行基因的定位突变或盒式突变去进行TCS结构与功能关系的研究。

4.本发明天花粉蛋白合成基因的合成方法步骤简单，只经过四次克隆就完成了整分子mTCSG的全合成和克隆。尤其是PN片段的合成方法，不用放射性标记，只用常规方法，简便而节省（节约碱基约33%）地实现了单链法连接，在基因合成领域中应用前途广阔。

以下的实施例可用作本发明的具体方案，它们不限制本发明的范围。

材料与方法：

除下述材料与方法之外的参见文献[Chen，H.-B.，et  al.，Nucl.Acids  Res.（1990）18，871-878.]。

Sep-pak  C18反相柱来自Waters公司;

低熔点琼脂糖凝胶和考马斯亮兰R-250来自GibCO  BRL公司;

限制性核酸内切酶，多核苷酸磷酸化激酶，T₄DNA连接酶来自New England Biolabs;

DNA顺序分析所需的引物由本实验室合成纯化;

[α-³⁵S]ATP来自Amersham公司;

羧甲基葡聚糖C-50和质粒pUC  18来自pharmacia-LKB公司;

表达载体pPLC  2833和大肠杆菌C600（pCI857）系麻省理工学院khorana教授赠送;

大肠杆菌JM110系Messing教授赠送;

其他化学试剂均为市售国产品。

寡核苷酸片段间的连接按单链法进行，双链法按文献：[Karnik，s.s.，Sakmar，T.P.，Chen，H.-B.and  Khorana，H.G.，Proc，Natl.Acad.Sci.，USA.（1988）85，8459-8463]进行。

质粒的构建：

对需要进行重组的质粒先按选择的限制性内切酶进行双酶解，酶解物经低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，按常规方法制备线性质粒大片段，然后与合成的基因片段或从另一个质粒双酶解后分离的基因片段连接，连接产物按常规方法转化大肠杆菌并以特定的抗菌素筛选转化子：以pUC18为载体的质粒转化大肠杆菌JM83用氨苄青霉素37℃培养。以pPLc2833为载体的质粒转化大肠杆菌C600（pCI857）用氨苄青霉素和卡那霉素30℃培养。对长出的菌落，挑选单菌落于LB培养液中按常规方法扩增和制备新构建好的质粒。

质粒中的基因DNA顺序分析按文献[Chen，H.-B.，et  al.，Nucl.Acids  Res.（1990）18，871-878.]的条件用pUC18多接头区两端的通用引物或基因合成中用作配对的短寡核苷酸为引物进行。

基因表达：这里介绍以pPLc2833为载体[参见文献：Remaut，E.，Tsao，H.and  Fiers，W.，Gene（1983）22，103-113.]的基因表达。

过夜培养的含表达质粒的菌液，稀释后30℃培养使A_650nm升高到0.5-0.8转入41℃热诱导，直至A_650nm不再增加为止。

表达产物的分离纯化

菌体自培养液离心分离后悬浮于含溶菌酶的Tris·HCl（三羟甲基甲铵盐酸盐）和EDTA（乙二胺四醋酸钠盐）组成的缓冲液中，保温后，用干冰和温水反复冻融三次，然后用上述不含溶菌酶的缓冲液稀释，高速离心取蛋白质上清液用硫酸铵沉淀离心，取上清液对磷酸钠缓冲液透析，后经羧甲基葡聚糖C-50柱分离，用NaCl盐梯度洗脱。分离纯化得到纯的基因工程产生的天花粉蛋白。

实施例1：mTCSG的设计

（A）编码DNA顺序的设计

在计算机VAX/11-780辅助下进行mTCSG的设计，将已知的α-TCS氨基酸顺序输入计算机后，运转美国国家生物医学研究基金会（NBRF）赠送的软件PSQ和NAQ，检查由计算机逆翻译的由兼并密码子组成的RNA顺序中可能出现的限制性内切酶的识别顺序，然后按照：（1）大肠杆菌高表达密码子分配系数（表1），（2）在选定的克隆质粒pUC18中均匀安置单一的限制性内切酶于TCS合成基因中，和（3）合成基因片段分段和消除自身配对第三项要求人工选定每个氨基酸的密码子而确定全基因的DNA顺序如图1。在这个顺序的3'端还加上二个终止密码子TAA和TGA以及两端为分子克隆所需要的EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶识别顺序的粘性末端。

（B）部分表达调控顺序的设计

如前述，我们采用质粒pPLc2833作为TCS合成基因的表达载体。为了使这个载体能实际运作，必须在启动子与合成基因的5'端之间加一个翻译的起始密码子ATG和核糖体结合部位，SD顺序。考虑到基因表达时转录出来mRNA的5'端的200个核苷酸会形成二级结构，以及SD顺序在这个初生态mRNA5'端二级结构中的状况对表达产率会有极大影响，我们设计了下列带SD顺序的区域及结构基因的5'端编码顺序如下：

EcoRI  BstEII  SacI

AATTCTAAGGAGGTAACCGCAATGGATGTTTCTTTCCGTCTGTCTGGTGCAACGAGCT

GATTCCTCCATTGGCGTTACCTACAAAGAAAGGCAGACAGACCACGTTGC

实施例2：mTCSG的全合成

（A）寡聚脱氧核苷酸的制备

mTCSG被分成如图3所示的EP，PN和NH三个大片段。EP（345b.p.）进一步划分为A、B、C、D、E和F六个正股寡核苷酸片段，二个末端负股片段A'b和eF'，以及三个中间连接用的短的桥式负股寡核苷酸bc，cd和de。PN（268b.p.）划分为G.H.I和J四个负股寡核苷酸片段，二个末端正股短片段G'和J'以及三个桥式正股短的连接用寡核苷酸gh，hi和ij。NH（142b.p.）划分为K（+）K（-）、L（+）L（-）和M（+）M（-）三个双链。总计26个寡核苷酸在DNA合成仪上（ABⅠ  381A型）用固相亚磷酰胺三脂法合成。每个寡核苷酸被单独合成后，经浓氨水55℃处理6小时以上，使之从固相柱上脱落并切除保护基团，粗产物浓缩后溶于水，用尿素变性的聚丙烯酰胺电泳（PAGE）分离，含纯产物的凝胶带经碳酸氢三乙铵（1mole/l）溶出，用Sep-pak  C18反相柱按LO等方法（参见文献：Lo，K-M.，Jones，S.S.，Hackett，N.R.&  khorana，H.G.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.（1984）81，2285-2289.]脱盐得到纯的寡核苷酸片段。

纯的寡核苷酸用T₄多核苷酸磷酸化激酶和ATP按常规方法进行5'-磷酸化，必要时用Sephadex G-50纯化。

（B）寡核苷酸间的连接合成基因大片段

首先按图4所示的合成路线，将上述5'-磷酸化的寡核苷酸分别用T₄DNA连接酶连接成EP，PN和NH三个大片段，其中EP和PN片段用单链法连接，NH大片段用双链法合成。

单链法连接合成基因大片段以PN大片段的合成为例。等摩尔的G，H，I和J与正股配对短片段gh和ij按1∶1.2摩尔比分为二组：即G.H和gh;I，J和ij分别置于配对溶液[Tris·HCl（pH8，50m mole/l），氯化镁（10m mole/l）]退火配对，温度降至40℃时，混合这二组配对物，并加入正股短片段hi，待温度进一步降至10℃，加入T₄DNA连接酶等连接反应液组分，在10℃连接反应16小时，结果如图5所示。它显示的是用非放射性的ATP进行寡核苷酸的5'一磷酸化后连接合成了PN大片段，用2%低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物取得满意结果。其中DNA电泳条带在紫外灯下用溴乙锭染色而显示橙色荧光带。表2列出该连接反应中各种可能形成的中间产物片段。

EP大片段的连接合成是采用[γ-³²P]ATP将B.C.D.E和F等五个寡核苷酸[5'-³²P]磷酸化后，按上述相类似的步骤分步配对一次连接装配成EP大片段，PAGE分离纯化，用邻位分析[参见文献：Sgaramelle，V.，and Khorana，H.G.，J.Mol.Biol.（1972）72，427-444.]显示dAp⁺∶dGp⁺∶dTp⁺∶dCp⁺＝1∶1∶3∶0，初步证实已合成了EP大片段。

NH大片段由三个双链K（+）K（-），L（+）L（-）和M（+）M（-）按常规方法等摩尔比一次连接合成。

（C）大片段克隆和mTCSG的全合成

按图4程序，上述连接成的EP，NH和PN三个片段分别先后克隆进质粒pUC18得到含mTCSG整分子的克隆质粒pCOTCS。

首先将EP片段与A'b与eF'二端负股配对片段按单链法配对后与EcoRⅠ/PstⅠ双酶解pUC18而得的线性质粒连接，并且转化大肠杆菌JM83。对转化子扩增后提取制备的质粒进行酶介分析：EcoRⅠ/PstⅠ双酶解及BstEⅡ，EcoRV，BglⅡ，AlwNⅠ，ECoO109Ⅰ和NdeⅠ酶解，初步肯定EP片段已经正确合成并克隆进质粒pUC18得到新质粒pCOTCS-EP。

NH片段则与经NheⅠ/HindⅢ双酶解p3'THF^＊得到的线性质粒连接并转化大肠杆菌JM83，并对转化子所得的质粒经BstBⅠ，DraⅠ酶解及NheⅠ/HindⅢ双酶解证实后，进一步用PstⅠ/HindⅢ双酶解所得的质粒pCOTCS-NH，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化小片段与同样经PstⅠ/HindⅢ双酶解pCOTCS-EP而得的大片段连接重组成pCOTCS-EP/NH质粒，最后，这个质粒经过PstⅠ/NheⅠ双酶解后，和事先已将PN片段与二个末端配对片段G'和J'配对后，以1∶10或1∶20摩尔比进行连接，并转化大肠杆菌JM83，得到含mTCSG的克隆质粒pCOTCS。经DNA顺序分析证明合成的mTCSG与设计的相符。

实施例3合成的天花粉蛋白结构基因在大肠杆菌中的表达

（A）表达质粒的构建

如图6所示含mTCSG的质粒pCOTCS经EcoRⅠ/SacⅠ双酶解后，用1%琼脂糖凝胶电泳分离制备线性质粒大片段。实施例1设计的SD顺序的片段ES（+）和ES（-），在DNA合成仪上合成，纯化后，配对成带SD顺序的双链片段ES与上述线性质粒大片段，按10∶1或20∶1摩尔比连接转化大肠杆菌JM83（参见文献：Vieria，J.，et  al.，Gene（1982）19，259-268），转化子经BstEⅡ酶解分析证明是含有在mTCSG上游带SD顺序的质粒pC1TCS。

^＊此质粒系发明人实验室从质粒pWR13m[参见文献Chen，H.-B.，et al.，“Current Research on Photosynthesis”Vol Ⅲ，347-350（1990），Ed.by Baltscheffsky，M.Kluwer Academic Publishers，Netherland]在多接区的PstⅠ和HindⅢ之间引入NheⅠ识别顺序改建而成。

质粒pC1TCS与pPLc2833分别经EcoRⅠ/HindⅢ双酶解，前者取结构基因的较小片段，后者取线性质粒大片段，连接重组成如图6所示的表达质粒pE1TCS，并转化大肠杆菌C600（pCI857）（参见文献：Simons.G.，et  al.，Gene（1984），28，55-64）。

（B）在大肠杆菌中的基因表达

取上述合格的转化子单菌落置于少许LB培养液中30℃摇荡过夜，然后此培养液稀释50倍至A_650nm＝0.05-0.06，30℃培养约2小时至A_650nm＝0.5-0.8时，转入41℃热诱导表达，分别于15'，30'，60'，2小时和4小时各取样1ml，离心后沉淀部分加入100μl菌体裂解液溶解均匀后，各取15μl上样，经15%十二烷基磺酸钠变性的PAGE分离，然后用考马斯亮兰显色显示在电泳迁移速度与天然天花粉蛋白泳速相同的部位出现一条随表达时间延长而蛋白量不断增加的色带（图7），但热诱导四小时后不再增加，后经1-2公升培养液规模表达多次重复，表达产率约20mg/l。表达产物纯化后显示与天然天花粉蛋白有相同的免疫活力和生物活力已如前述。

实施例4mTCSG表达产物的纯化

如图8所示，1克湿重菌体悬浮在3ml缓冲液pH8.0含Tris·HCl（10m  mole/l），EDTA（1m  mole/l），0.6mg溶菌酶，在37℃水浴上保温20分钟，经冻融法反复处理三次，用上述不含溶菌酶的缓冲液稀释至30ml，30，000g离心20分钟，取上清液和少许沉淀，经15%SDS-PAGE分离分析表明，基因表达产物主要存在於上清液中，上清液用25%饱和度的硫酸铵沉淀和6，000g离心20分钟，取上清液对磷酸钠（pH7.0，10m  mole/l）透析，经图9所示的阳离子交换层析柱（CM-Sephadex  C-50）层析，NaCl梯度洗脱（0.1mole/l-0.8mole/l，由各300ml以磷酸钠为基液的溶液组成），每3ml搜集1管，实验条件下产物峰在0.44mole/l  NaCl洗脱（即图9中98-105管），经过15%  SDS-PAGE分析，此产物的纯度大于95%（图10），每立升培养液纯化后得15mg天花粉蛋白纯品。

实施例5：天花粉蛋白N227K突变体结构基因的构建和表达。

（A）天花粉蛋白N227K基因突变体限制性片段的选择和设计

为了实现N227K突变，我们从mTCSG结构图中（图1）找到N227，由该基因的第679-681位碱基即AAT编码，只需将第681位碱基从T变为G则AAT变为AAG，后者编码赖氨酸（K）。另外在这个密码子的上游最近的酶切位点是BclI，其下游是BstBI（图2），这样我们就设计合成下述双链限制性内切酶片段：

BclI  StyI  BstBI

用来取代原来的BclI/BstBI片段，由于新合成的限制性内切酶片段通过第681位碱基的变换新引入了一个StyI限制性内切酶位点，便于对突变体N227K的基因分析鉴定。

（B）含N227K突变体基因克隆质粒的构建

质粒pClTCS（图6）转化大肠杆菌JM110（参见文献：Yanisch-Perron，C.，et  al.，Gene（1985）33，103-119），转化后的菌落在LB培养液中扩增后制备无甲基化腺嘌呤（或胞嘧啶）的质粒pClTCS。这样从JM110制备的质粒pClTCS经BclI/BstBI双酶解后，分离制备线性质粒大片段，并以1∶10和1∶20与上述新合成的BclI/BstBI限制性DNA片段连接，连接产物转化大肠杆菌JM110，转化子经StyI酶解证实已得到含天花粉蛋白N227K突变体基因的质粒pClTCS-N227K。

（C）含天花粉蛋白N227K突变体基因的表达和产物性能测定

按实施例3（A）相同的方法将质粒pClTCS-N227K与pPLc2833重组后得到pElTCS-N227K表达质粒并转化大肠杆菌C600（pCI857）。然后按实施例3（B）相同的方法进行基因表达。表达产物纯化后，用ELISA方法测免疫活力和用小白鼠受孕后测中期妊娠引产活力。表5的数据表明天花粉蛋白N227K对天花粉蛋白IgE单克隆抗体的免疫活力有明显降低，为天然天花粉蛋白的24%-44%，而中期妊娠引产活力基本不变（表6）。

此外，类似于实施例5可以逐步突变本发明的合成基因，直到其中123个密码子被改变，即使这样得到的突变体基因，其密码子与本发明的天花粉蛋白合成基因相对应的密码子还有50%以上相同。

表1.天花粉蛋白合成基因和天然基因的密码子分配情况表

A.氨基酸符号  C.密码子  N.天然基因  S.合成基因

E-H.在大肠杆菌高表达体系中密码子的分配系数

表2.装配PN段连接反应混合物中各种片段的预期长度（计算值）

条带编号  产物或中间体  链长(碱基)  连接的片段数

1  pGpHplpJ  268  4

2  pGpHpl  205  3

pHplpJ  197  3

3  pGpH  139  2

pHpl  134  2

plpJ  129  2

4  寡核苷酸原料  ～67  1

表3.ELISA法测定基因工程产生的天花粉蛋白（GE-TCS）

的免疫特异性数据

Exp.1：表面抗原  20μg/孔

Exp.2：表面抗原  2μg/孔

TCS-1：中科院上海细胞生物学研究所纯化的天然天花粉蛋白

TCS-2：武汉生物制品研究所出品的天然天花粉蛋白

表4.基因工程产生的天花粉蛋白（GE-TCS）

对中期妊娠小白鼠的止孕效应

GE-TGS剂量  母鼠数  总胎仔数  死胎仔数+吸收点数  有效率

(μg)  (只)  (只)  (只)  (%)

300  3  23  22  95.7

200  13  109  109  100

100  10  95  95  100

50  13  131  127  96.9

表5.ELISA法测天花粉蛋白突变体N227K（TCS-N227K）抗天 花粉蛋白1gE单克隆抗体（TE1）和抗血清（1∶5000）的免疫活性

	OD450nm(SD)
					TE 1        培液        抗血清        正常血清（1:5000)      (1:5000)
	Exp.1.TCS-N227KTCS-1TCS-2	0.133(.005)     0.067(.001)    1.334(0.41)    0.131(.005)0.545(.064)      0.223(.021)     0.892(.020)    0.071(.007)1.726(.020)     0.285(.075)    1.737(.022)    0.181(.018)
Exp.2.TCS-N227KTCS-1TCS-2						0.557(.008)   0.091(.005)    1.476(.018)     0.175(.002)1.255(.240)    0.374(.040)    1.760(.066)    0.125(.006)1.749(.141)    0.265(.042)    1.524(.012)    0.341(.048)

Exp.1：表面抗原  2μg/孔

Exp.2：表面抗原  20μg/孔

TCS-1：中科院上海细胞生物学研究所纯化的天然天花粉蛋白

TCS-2：武汉生物制品研究所出品的天然天花粉蛋白

表6.天花粉蛋白突变体N227K（TCS-N227K）

对中期妊娠小白鼠的止孕效应

剂量  孕鼠数  胎仔总数  死胎仔数+吸收点数  有效率

(μg/0.2ml)  (只)  (只)  (只)  (%)

300  5  43  42  97.7

100  10  95  95  100

50  16  164  156  95.1

30  9  96  18  18.8

Claims (8)

1、一种在大肠杆菌中高表达的天花粉蛋白合成基因，其特征在于该基因的DNA顺序是图1中所显示的-5～750的核苷酸，它编码一个与天然的天花粉蛋白功能相当的医用蛋白质。

2、如权利要求1所述的天花粉蛋白合成基因，其特征在于由这个合成基因衍生的突变体基因，与权利要求1所述的合成基因相对应的密码子有50%以上相同。

3、如权利要求1或2所述的天花粉蛋白合成基因，其特征在于该基因及其衍生的突变体基因可插入一种质粒载体。

4、如权利要求3所述的天花粉蛋白合成基因，其特征在于所述质粒载体是pUC18或pPLc2833。

5、如权利要求1或2所述的天花粉蛋白合成基因，其特征在于该基因及其衍生的突变体基因可通过质粒载体转化一种大肠杆菌宿主细胞。

6、如权利要求5所述的天花粉蛋白合成基因，其特征在于所述的大肠杆菌宿主细胞是JM83，C600（pCI857）或JM110。

7、如权利要求1所述的天花粉蛋白合成基因的合成方法，其特征在于如图3和图4所示的全合成步骤。

8、如权利要求1所述的天花粉蛋白合成基因，其特征在于可应用于产生天花粉蛋白及其突变体，包括如图4和图6所示将合成基因插入大肠杆菌质粒载体和转化大肠杆菌宿主细胞，以及在大肠杆菌中高产率的基因表达和表达产物的纯化。

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