CN1487085A

CN1487085A - 芋螺毒素MVII A与Trx的融合蛋白及表达和应用

Info

Publication number: CN1487085A
Application number: CNA031422489A
Authority: CN
Inventors: 詹金彪; 陈小颖
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2003-08-08
Filing date: 2003-08-08
Publication date: 2004-04-07
Anticipated expiration: 2023-08-08
Also published as: CN1228446C

Abstract

本发明提供一种芋螺毒素MVII A与Trx的融合蛋白及表达和应用，是在大肠杆菌中克隆并表达Trx－CTXMVII A融合蛋白，经层析纯化、还原、氧化，得到活性的Trx－CTX MVII A融合蛋白。本发明得到的融合蛋白，可在制备治疗晚期癌症和爱滋病人的顽痛药物及在制备治疗手术后的急性疼痛、烧伤、胆绞痛病人、难治性神经疼痛等镇痛药物中应用；因有神经保护作用，还可在制备用于脑缺血和脑损创的治疗药物中应用。本发明工艺简单、质量稳定、成本较低，得到的融合蛋白分子量较大，体内的半衰期(t_1/2)较长，可直接进行药物开发；也可作为中间体，经酶切，得到活性的ω－芋螺毒素MVIIA，再进行药物开发。

Description

芋螺毒素MVIIA与Trx的融合蛋白及表达和应用

技术领域

本发明属基因工程，涉及化学合成多肽，尤其涉及ω-芋螺毒素MVIIA基因与硫氧还蛋白(Trx)的融合蛋白及表达和在药物中的应用。

背景技术

芋螺毒素(CTX)是海洋软体动物芋螺分泌的一类具特异生物活性的小肽神经毒素。一般含10～30个氨基酸，大多富含二硫键，按其作用靶位及药理学活性，可分为α，ω，μ等家族^[1]。ω-CTX MVIIA是电压敏感性钙通道(Voltagesensitive calcium channel，VSCC)阻滞剂，主要作用于神经组织的N型VSCC。它由25个氨基酸组成，含6个Cys残基，组成三对二硫键。非临床研究证明它具双重效应，一方面阻断痛觉传递而具镇痛效应，另一方面抑制刺激毒性(excitotoxic)神经递质释放，阻止神经元细胞病理性钙内流而有神经保护作用^[2]。因其直接作用于钙通道，无需第二信使或G蛋白，故不成瘾，将成为慢性重症疼痛如晚期恶性肿瘤和AIDS病，用阿片类成瘾的难治性神经疾病的新一代镇痛药物。国外公司开发的MVIIA无瘾镇痛药，已进入III期临床试验。

目前，ω-芋螺毒素MVIIA可以用化学合成的方法获得，但需要20多步反应，得率很低，工艺十分困难，因为分子中有6个半胱氨酸(Cys)需要准确配对形成二硫键，质量不稳定，而且成本较高。因此，寻找一种合适的方法获得ω-芋螺毒素MVIIA成为需要。本研究旨在构建ω-CTX MVIIA基因原核表达质粒，制备高纯度的硫氧还蛋白(Trx)-CTX MVIIA融合蛋白，并可进一步酶切获得CTXMVIIA，研究其生物学活性，作为新药开发。

发明内容

本发明的一个目的是在大肠杆菌中克隆并表达硫氧还蛋白(Trx)与ω-芋螺毒素MVIIA的融合蛋白(Trx-CTX MVIIA融合蛋白)，经超声破菌后采用Cu-IDA树脂金属螯和亲和层析方法纯化，经还原、氧化得到活性的Trx-CTX MVIIA融合蛋白，SEQ ID NO：1为Trx-CTX MVIIA融合蛋白的一种氨基酸序列：

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181 GKC

(融合蛋白质分子中C159与C174、C166与C178、C173与C183分别形成三对二硫键)

该融合蛋白共由183个氨基酸组成，其中：小写部分为硫氧还蛋白(Trx)序列，大写部分为芋螺毒素(CTX MVIIA)的序列，有下划线的氨基酸为连接部分，其中连续的6个组基酸为亲和纯化所用；该融合蛋白序列中，Trx和连接部分的氨基酸序列允许有突变，但芋螺毒素MVIIA的序列不变。

本发明Trx-CTX MVIIA融合蛋白的表达，是分段合成目的基因片段，经退火、连接成完整片段，插入原核表达载体pET32a(+)的Kpn I和EcoR I位点之间，构建重组表达质粒pET32a(+)-CTX MVIIA转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达获得Trx-CTX MVIIA融合蛋白，超声破菌后采用Cu-IDA树脂金属螯和亲和层析方法得纯化Trx-CTX MVIIA融合蛋白，经还原、空气氧化得活性的Trx-CTX MVIIA融合蛋白。其中采用含巯基的还原剂，包括β-巯基乙醇、二巯苏糖醇(DTT)、半胱氨酸等。

本发明的另一个目的是得到的Trx-CTX MVIIA融合蛋白，可经肠激酶切生产ω-芋螺毒素MVIIA。

本发明的又一个目的是得到的Trx-CTXMVIIA融合蛋白，在制备治疗晚期癌症和爱滋病人的顽痛药物中的应用。

本发明的还有一个目的是得到的化Trx-CTX MVIIA融合蛋白，在制备治疗手术后的急性疼痛、烧伤、胆绞痛病人、难治性神经疼痛等镇痛药物中的应用。

本发明的还有另一个目的是得到的Trx-CTX MVIIA融合蛋白，在制备治疗脑缺血和脑损创等神经保护药物中的应用。

本发明具有的特点是：采用的表达系统是pET32a(+)，其特点是P_tac启动子受乳糖操纵子的控制。其上游为硫氧还蛋白(Trx)基因，在Trx和多克隆位点之间存在肠激酶的酶切位点。外源基因片段以正确阅读框架克隆到强启动子下游的多克隆位点上，在IPTG的诱导下能表达外源蛋白与Trx形成的融合蛋白，且可显著提高融合蛋白的表达产率。在肠激酶作用下，Trx和下上游蛋白分子分离，便于纯化^[5]。Trx融合蛋白在水溶液中可溶，在不变性的条件下，通过亲和层析得到。由于细菌诱导因不同蛋白而异，为了达到最佳的表达量，本研究首先对诱导时间和诱导时的温度进行了摸索。经摸索发现(实验数据未列出)，在37℃，诱导3小时表达的量最大(可达50～60mg蛋白/L菌液)，且可溶性好。

本发明采用基因工程生产出的Trx-CTX MVIIA融合蛋白，经热板法测定其对小鼠的镇痛活性，结果表明它具有很高的镇痛活性。比文选报道的吗啡(有效剂量7.5mg/kg)的镇痛效果大10～20倍。因融合蛋白具有产量大，易于提取，纯化方便，中间流程少、体内停留的半衰期长等特点，可以为开发新的镇痛药物提供新的途径。本发明为进一步的研究芋螺毒素，开辟了新途径。

本发明的融合蛋白基因工程的生产方法，可以得到工艺简单、质量稳定、成本较低的生产路线。而且得到的与硫氧还蛋白(Trx)的融合蛋白质，分子量较大，体内的半衰期(t_1/2)较长，可以直接作为新药进行开发；也可以作为中间体，经酶切，得到活性的ω-芋螺毒素MVIIA，进行药物开发。

附图说明

图1重组克隆pET-32a(+)-CTX MVIIA的构建。

图2重组质粒pET32a(+)-CTX MVIIA的酶切鉴定。

图3重组质粒pET32a(+)-CTX MVIIA的表达鉴定。

图4Trx-CTX MVIIA融合蛋白的表达与纯化。

图5纯化后Trx-CTXMVIIA融合蛋白的RP-HPLC图谱。

图6不同浓度Trx-CTX MVIIA融合蛋白对小鼠热板痛阈提高百分率的影响。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，而非限定本发明。

实施例Trx-CTX MVIIA融合蛋白的一种表达及应用

1.材料与方法

1.1菌株和质粒

大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21(DE3)，原核表达载体pET-32a(+)均由杭州九源基因工程有限公司研究所提供。

1.2工具酶和试剂

内切酶Kpn I和XbaI，T4多核苷酸激酶，IPTG和蛋白质标准分子量均为MBI公司产品；内切酶EcoR I为Biolab公司产品；T4 DNA连接酶购自Promega公司；CTX DNA片段由上海生工公司合成；纯化用树脂为Pharmacia Biotech公司产品；DNA标准分子量购自上海博亚生物技术公司；常用化学试剂为国产分析纯试剂。

1.3仪器和设备

小型高速制冷离心机为Sigma公司产品，大型离心机为SORVALL，购自美国科峻仪器公司；蛋白电泳仪为Biolab产品；蛋白纯化和凝胶成像仪均为AmershamPharmacia Biotech公司产品。HPLC为PERKIN ELMER公司Series200Autosampler。

2方法

2.1重组表达质粒pET32a(+)-CTX的构建

2.1.1人工合成CTX核酸片段

根据ω-CTX MVIIA氨基酸序列，按大肠杆菌偏爱密码子设计其DNA片段，5’端添加Kpn I酶切位点和肠激酶识别序列^[3]，3’端添加TAA终止密码子及EcoR I酶切位点，分四个片段分别合成^[4](见表1)。

表1 人工合成ω-CTX MVIIA基因的寡核苷酸片段设计

Fragment(bp) DNA Sequences(5’→3’)

CTX1(45)： C TGC AAA GGT AAA GGT GCG AAA TGC TCT CG

CTX2(54)： T CAG ACG AGA GCA TTT CGC ACC TTT ACC TTT GCA cct gtc gtc gtc gtc GGT

AC

CTX3(50)： T CTG ATG TAC GAC TGC TGC ACC GGT TCT TGC CGT TCT GGT AAA TGC taa G

CTX4(49)： AA TTC tta GCA TTT ACC AGA ACG GCA AGA ACC GGT GCA GCA GTC GTA CA

注：小写黑体gacgacgacgacaag为肠激酶切割位点(EK Cleavage Site)，taa为终止密码子；斜体下划线序列为内切酶Kpn I，EcoR I识别位点

2.1.2CTX基因与载体pET-32a(+)重组

合成DNA片段CTX(1，2，3，4)溶于水成10μmol/L，T4多核苷酸激酶磷酸化，等量1和2，3和4两两变性退火，等量退火产物用T4 DNA连接酶12.5℃连接过夜，无水乙醇沉淀后将DNA溶于水。质粒pET-32a(+)经Kpn I，EcoR I双酶切，0.7％低熔点琼脂糖凝胶回收后溶于水^[5]。目的基因和载体片段按3∶1比例混合，T4 DNA连接酶连接，转化DH5α感受态菌，筛选阳性克隆鉴定。目的克隆命名为pET32a(+)-CTX MVIIA(参见图1)，其中，C代表多克隆插入位点，黑色长条( )代表芋螺毒素MVIIA基因。重组后的质粒经测序鉴定。SEQ ID NO：1为Trx-CTX MVIIA融合蛋白的一种氨基酸序列：

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181 GKC

该融合蛋白共由183个氨基酸组成，其中：小写部分为硫氧还蛋白(Trx)序列，大写部分为芋螺毒素(CTXMVIIA)的序列，有下划线的氨基酸为连接部分，其中连续的6个氨基酸为亲和纯化所用；该融合蛋白序列中，Trx和连接部分的氨基酸序列允许有突变，但芋螺毒素CTX MVIIA的序列不变。

2.2重组子的鉴定

2.2.1酶切鉴定

Xba I，EcoR I双酶切重组质粒，空白载体为对照，1％琼脂糖凝胶电泳。

2.2.2小量表达筛选

重组质粒转化BL21感受态菌，1mM IPTG诱导表达4小时，15％SDS-PAGE^[6]鉴定。

2.2.3DNA测序

由上海博亚公司测序，确定。

2.3融合蛋白的诱导表达^[7]

挑取新转化含确证重组质粒的BL21菌落于LB(含氨苄青霉素50μg/ml)培养基中，37℃振荡培养过夜。次日按1∶50比例转接到3升相同培养基中，相同条件培养至OD₆₀₀＝0.8，加入IPTG至终浓度1mM，诱导表达4小时。离心收获菌体，超声破菌，进行SDS-PAGE，计算机密度扫描确定表达量。

2.4Trx-CTX MVIIA融合蛋白纯化、变性与复性

菌体悬于Tris缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，0.5M NaCl，10％Glycerol)，超声破菌，加10％Triton X-100至终浓度0.05％，冰浴15分钟，再次超声破菌，离心，15％SDS-PAGE分析融合蛋白的存在形式。取上清加样至Cu-IDA金属螯合层析柱，用4mM、40mM、80mM、100mM、200mM的咪唑溶液分步洗脱，分别收集洗脱峰^[8]。将上述收集液经Sephadex G-25凝胶过滤除盐，洗脱液为20mMTris-HCl pH 8.0。15％SDS-PAGE，RP-HPLC^[9]鉴定纯化结果。蛋白质浓度采用考马斯亮蓝染色法测定^[10]。蛋白样品液中加入β-巯基乙醇(还原)及固体NaCl至终浓度分别为50mM，150mM，摇匀后4℃放置3小时。用20mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl透析，更换透析外液3～4次(空气氧化)。

2.5生物学活性测定

经典热板镇痛实验测其生物学活性^[11、12]。健康雌性小白鼠，体重18～22g，调节恒温水浴55±0.5℃，将小鼠置烧杯内，挑选25秒内有舔后肢动作(痛觉反应)的动物为合格动物，该反应时间为给药前正常痛阈值。挑选合格动物40只，随机分成4组，采用侧脑室给药途径。对照组给予等量生理盐水，实验组1、2、3，分别给予原浓度、蒸馏水1∶1和1∶4稀释的Trx-CTX MVIIA融合蛋白。给药后0.5h、1h、1.5h、2h、3h重复上述测定，记录痛觉反应时间。

3结果

3.1重组质粒pET32a(+)-CTX MVHA的构建与鉴定

pET-32a(+)经Kpn I，EcoR I双酶切，与含相同酶切位点的目的DNA片段连接成重组子pET32a(+)-CTX MVIIA(参见图1)。

重组子经XbaI，EcoRI双酶切，小片段约600bp；空白pET-32a(+)作对照，小片段约540bp，两者大片段大小一致。电泳结果与预计值相符，参见图2，其中：1：DNA分子量标准；2：载体pET32a(+)/XbaI+EcoR I；3：重组子pET32a(+)-CTX MVHA/Xba I+EcoR I。

重组子的小量表达筛选，应产生大小约19.7kD的Trx-CTX MVII A融合蛋白；未经IPTG诱导的相应转化菌可能有弱的本底表达；空白pET-32a(+)转化菌应产生大小约20.4kD的蛋白。15％SDS-PAGE结果符合预计值(参见图3)，图3中：1：蛋白质分子量标准；2：诱导BL21(DE3)/pET32a(+)；3：诱导BL21(DE3)/pET32a(+)-CTX MVIIA；4：未诱导BL21(DE3)/pET32a(+)-CTXMVIIA；重组质粒经DNA测序结果与实验设计方案完全一致。

3.2Trx-CTX MVIIA融合蛋白的表达、纯化与鉴定

重组克隆经IPTG大量诱导表达，破菌后SDS-PAGE分析发现，融合蛋白存在于上清中。利用金属螯和亲和层析纯化蛋白，除盐后SDS-PAGE，RP-HPLC分析(参见图4、图5)，图4中：1：蛋白质分子量标准；2：表达菌培养液；3：超声破碎后沉淀物；4：超声破碎后上清液；5：4mM咪唑洗脱液；6：40mM咪唑洗脱液；7：80mM咪唑洗脱液；8：100mM咪唑洗脱液；9：200mM咪唑洗脱液。

参见图4，经计算机灰度扫描，Trx-CTX MVIIA融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的25％左右。分析超声破菌后上清及沉淀，可见蛋白以可溶性形式存在。参见图5，纯化后融合蛋白纯度达95％以上。蛋白浓度经含量测定约0.6-0.8mg/ml，产量达到50-60mg/L。

3.3Trx-CTX MVIIA融合蛋白的生物学活性测定

纯化后蛋白经β-巯基乙醇还原，充分透析使其空气氧化，使二硫键正确配对。小鼠热板镇痛实验证实其具镇痛效应(参见表2、图6)。图6中：痛阈提高百分率％＝(用药后痛阈反应时间-用药前痛阈反应时间)/用药前痛阈反应时间

表2 Trx-CTXMVIIA融合蛋白对小鼠痛阈反应时间的影响

组别痛(s， x±s)

剂量给药前药后0.5h 药后1.0h 药后1.5h 药后2.0h 药后3.0h

(μl)

对照组 15 18.7±3.6 21.3±3.9 20.6±3.7 19.9±3.9 19.6±3.8 20.3±3.3

实验组 15 18.5±3.6 39.4±7.0^* 35.5±6.9^* 30.7±6.1^* 24.7±5.3^* 21.0±4.8^*

1

实验组 15 18.0±3.4 29.0±4.8^* 25.3±4.4^* 22.2±3.7^* 19.8±3.0^* 18.8±3.6

2

实验组 15 18.0±3.5 22.5±3.9^* 20.2±3.7^* 19.0±3.5^* 18.0±3.4 18.0±3.5

3

注：*代表给药前后比较P＜0.01

4讨论

ω-CTX MVIIA作用于神经组织N-型VSCC，具“低分子量，高活性，高专一性”特点，通过调节钙浓度影响许多细胞过程，如神经传递，激素分泌，离子通道与酶活性等。其无瘾镇痛和神经保护的双重效应使之在新一代镇痛药及神经保护药领域具广阔应用前景。

ω-CTX MVIIA是由25个氨基酸组成的小肽，含三对二硫键，人工合成成本高、毒性大，使三对二硫键正确配对的方法繁琐；若采用基因工程方法直接原核表达则因其分子量过小而不易检测纯化。本实验将ω-CTX MVIIA基因与载体pET-32a(+)重组，表达纯化了Trx-CTX MVIIA融合蛋白，实验设计的优点如下：(1)外源蛋白与Trx硫氧还蛋白融合表达有利于提高表达产物的稳定性，融合蛋白大部分为水溶性，不易形成包涵体，避免了包涵体裂解，蛋白复性的繁琐及其对蛋白生物学活性的破坏；(2)设计该融合蛋白中含His-Tag，表达后经金属螯合层析可方便地从细菌总蛋白中一步分离纯化，该层析方法温和，有利于保持蛋白活性；(3)采用大肠杆菌自身Trx蛋白作融合蛋白，可提高mRNA翻译效率，并避免宿主菌蛋白酶的攻击；(4)设计目的蛋白N端插入到肠激酶切割位点处，该酶对底物具高度专一性，酶切条件宽泛，有助于进一步研究获得CTX MVIIA。综上所述，我们成功构建了ω-CTX MVIIA基因的原核表达质粒，表达纯化后，得到高纯度具生物学活性的Trx-CTX MVIIA融合蛋白，为进一步研究该融合蛋白以及CTX MVIIA用于药物开发奠定了物质基础。

本发明涉及的部分参考文献：

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在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.芋螺毒素MVIIA与Trx的融合蛋白及表达和应用，其特征是：在大肠杆菌中克隆并表达硫氧还蛋白(Trx)与ω-芋螺毒素MVIIA的融合蛋白(Trx-CTXMVIIA融合蛋白)，经超声破菌后采用Cu-IDA树脂金属螯和亲和层析方法纯化，经还原、氧化得到活性的Trx-CTX MVIIA融合蛋白，SEQ ID NO：1为Trx-CTX MVIIA融合蛋白的一种氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的Trx-CTX MVIIA融合蛋白的序列，其特征是：该融合蛋白序列中，Trx和连接部分的氨基酸序列允许有多种突变，但芋螺毒素MVIIA的序列不变。

3.如权利要求1所述的Trx-CTX MVIIA融合蛋白的表达，其特征是：Trx-CTX MVIIA融合蛋白的表达，是分段合成目的基因片段，经退火、连接成完整片段，插入原核表达载体pET-32a(+)的Kpn I和EcoR I位点之间，构建重组表达质粒pET32a(+)-CTX MVIIA转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达获得Trx-CTX MVIIA融合蛋白，超声破菌后采用Cu-IDA树脂金属螯和亲和层析方法获得纯化Trx-CTX MVIIA融合蛋白，经还原、空气氧化得活性的Trx-CTX MVIIA融合蛋白。

4.如权利要求1和3所述的Trx-CTXMVIIA融合蛋白的表达，其特征是：采用含巯基的还原剂，包括β-巯基乙醇、二巯苏糖醇(DTT)、半胱氨酸等。

5.如权利要求1所述的Trx-CTX MVIIA融合蛋白的应用，其特征是可经肠激酶切生产ω-芋螺毒素MVIIA。

6.如权利要求1所述的Trx-CTX MVIIA融合蛋白的应用，其特征是：得到的纯化Trx-CTX MVIIA融合蛋白，在制备治疗晚期癌症和爱滋病人的顽痛药物中的应用。

7.如权利要求1所述的Trx-CTX MVIIA融合蛋白的应用，其特征是：得到的纯化Trx-CTX MVIIA融合蛋白，在制备治疗手术后的急性疼痛、烧伤、胆绞痛病人、难治性神经疼痛等镇痛药物中的应用。

8.如权利要求1所述的Trx-CTX MVIIA融合蛋白的应用，其特征是：得到的纯化Trx-CTX MVIIA融合蛋白，在制备治疗脑缺血和脑损创等神经保护药物中的应用。