CN1763087A

CN1763087A - 一个丝瓜籽核糖体失活蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1763087A
Application number: CN 200510117732
Authority: CN
Inventors: 孙红琰; 王怡
Original assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2005-11-08
Filing date: 2005-11-08
Publication date: 2006-04-26

Abstract

本发明公开了一个丝瓜籽核糖体失活蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供一个丝瓜籽核糖体失活蛋白及其编码基因与其在制备抗肿瘤及病毒感染等免疫性药物中的应用。该蛋白具有下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有抑制细胞内核糖体蛋白合成活性的蛋白质。本发明具有抑制细胞内核糖体蛋白合成活性的作用，可用于治疗肿瘤和抗病毒感染等免疫性药物。本发明将在医学及生物制药领域发挥重要作用。

Description

一个丝瓜籽核糖体失活蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个丝瓜籽核糖体失活蛋白及其编码基因与其在制备抗肿瘤和/或病毒感染，特别是抗HIV感染的药物中的应用。

背景技术

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)是广泛存在于植物界的一类毒蛋白，是真核生物蛋白合成的抑制剂。它能够作用于哺乳动物核糖体大亚基上的28S rRNA，并产生脱腺嘌呤作用，从而破坏核糖体的结构，抑制蛋白质的翻译；同时RIP还参与细胞凋亡的调节。

根据RIP一级结构的不同，可将其分成两类：I型和II型。I型RIP由一条肽链组成；II型RIP由两条多肽链组成，分别称为A链和B链，两条链通过二硫键相连。A链和I型RIP都具有RNA N-糖苷酶活性，能使核糖体失活。天花粉蛋白、美洲商陆蛋白、苦瓜毒素蛋白和丝瓜籽核糖体失活蛋白是I型RIP的典型代表，II型RIP主要包括蓖麻毒蛋白、相思子蛋白和香樟毒蛋白等。从结构和遗传特点上看，II型RIP可能是由I型RIP进化而来的。

I型RIP特别适合做细胞毒性治疗药物的弹头部分，即可将RIP连接到靶向性试剂(如单克隆抗体或是肿瘤抗原配体等)上，利用这种靶向性试剂可将RIP带到体内某一特定种类的细胞(如肿瘤细胞)内，选择性地杀死这种细胞，因而具有较高的疗效和较低的毒性。例如，利用二硫键将靶向性试剂和毒素相连，在体内二硫键被还原，释放出毒素从而产生细胞内毒性；另一策略是将RIP基因和靶向性模块融合表达，从而产生靶向性毒素蛋白。

目前，获得丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a的方法主要依赖于天然提取，其缺点在于对原材料的依赖性强，得率低，不利于进一步制备免疫毒素，而克隆核糖体失活蛋白的基因不仅可以比较容易地获得活性较高核糖体失活蛋白，而且可以有效地进行多种重组免疫毒素的制备。

发明内容

本发明的目的是提供一个丝瓜籽核糖体失活蛋白及其编码基因。

本发明所提供的丝瓜籽核糖体失活蛋白，名称为luffin a，来源于葫芦科植物丝瓜(Luffa cylindrica)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有抑制细胞内核糖体蛋白合成活性的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：1由262个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第36-261位氨基酸残基为核糖体失活蛋白(ribosome inactivating protein，RIP)的功能域。

编码本发明所提供的丝瓜籽核糖体失活蛋白的基因(luffin a)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为：用6×SSC或(6×SSPE)，0.1％SDS，2×Denhardt溶液在65℃杂交，用0.1×SSC，0.1％SDS的溶液，65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2由842个碱基组成，其编码框为自5’端第1-第789位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第108-783位碱基编码核糖体失活蛋白的功能域。

在本发明中，丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a包括含有或不含有起始甲硫氨酸的luffin a。

本发明还提供了所述丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a的保守性变异多肽、片段、类似物或其衍生物，以及编码这些多肽的多核苷酸。

所述丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a，包括具有与luffin a功能相同，且具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)：若干个(通常为1-50个，优选为1-30个，更优选为1-20个，尤其优选为1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，优选为10个以内，更优选为5个以内)氨基酸残基。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸残基进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能；在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸残基通常也不会改变蛋白质的功能；还包括luffin a的活性片段和活性衍生物。

本发明还提供了luffin a的类似物。这些类似物与天然luffin a的差别可以是氨基酸残基序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同与天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在或合成的氨基酸的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性多肽。

所述luffin a的片段、衍生物和类似物，是指保持有本发明天然luffin a蛋白相同生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可定义为：1)由一个或多个保守或非保守氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)所取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是，也可以不是由遗传密码编码的；2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；3)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽；4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如用来纯化此多肽的序列，或是抗体片段或其他抗原配体序列的融合蛋白)，或是将编码另一个多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)融合产生的融合多肽。产生融合多肽的技术可采用本领域内公知的，包括连接编码多肽的编码序列，从而使它们在同一个读码框中，并且融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。

具体来讲，luffin a的保守性变异多肽，是指与序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列相比，有至多10个，优选为至多8个，更优选为至多5个，尤其优选为至多3个氨基酸残基被性质相似或相近的氨基酸残基所替换而形成的多肽。例如，在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷安酰氨和天冬酰氨)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和结页氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)或小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)内进行的取代。通常不会改变特异活性的氨基酸取代是本领域已知的。最常见的替换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly以及反向进行的替换。

所述luffin a还可为经过修饰的，或经修饰提高了抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的luffin a多肽。修饰(通常不改变一级结构)的形式包括：1)体内或体外的多肽的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化；2)糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工过程中进行糖基化修饰而产生的多肽，这种修饰可以通过将多肽暴露于具有糖基化功能的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；3)具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸)的序列。

本发明luffin a的多核苷酸可以是DNA或RNA形式。DNA形式包括cDNA或人工合成DNA，可以是单链的或双链的，可以使编码链或非编码链。本发明还提供了所述luffin a多核苷酸的变异体，其编码与luffin a有相同的氨基酸残基序列的多肽、多肽片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。还可包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体，如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增luffin a中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a的表达方法。

本发明所提供的丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a的表达方法，是将所述丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a基因、该基因变异体或含有丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a基因的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a。

所述丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a基因可插入到重组表达载体中。构建所述重组表达载体的出发载体，可为任意一种指本领域熟知的可进行外源基因表达的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。所述载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg，et al.gene，1987)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(LEEand Nathans，1988，J Bio Chem，263)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

以pET-28 a(+)为出发载体，构建的含有丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a基因的重组表达载体为pET-28 a(+)-luffin。

可采用本领域技术人员熟知的方法构建含丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a的重组表达载体，如体外重组DNA技术，DNA合成技术和体内重组技术等(Sambrook，et alMolecular cloing，a Laboratory Manual.Cold spring harbor laboratory.NewYork，1989)。所述丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a基因的DNA序列可以有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。所述启动子可为：大肠杆菌的lac或trp启动子、噬菌体启动子、反转录病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体还可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型形状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因以及绿色荧光蛋白(GFP)基因或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因等。

所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；低等真核细胞，如酵母细胞；高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真核细胞如酵母、植物细胞；果蝇S2或Sf9等昆虫细胞；CHO、COS、293细胞或Bowes黑色素瘤细胞等动物细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列，将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，长度通常为10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。如在复制起始点晚期一侧的长度约为100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子或腺病毒增强子等。

可用本领域技术人员熟知的常规技术，将重组DNA转化宿主细胞，培养转化子，诱导表达目的蛋白，并对重组蛋白进分离纯化。

培养含有本发明的丝瓜籽核糖体失活蛋白编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

本发明还提供了一种抗肿瘤和/或病毒感染的免疫性药物。

本发明所提供的免疫性药物，它的活性成分为上述丝瓜籽核糖体失活蛋白luffina。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液(请根据本发明促吞噬因子的作用机理，确定该药物的剂型)等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为0.01-0.5mg丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a/kg体重/天，疗程为7-14天。

本发明提供了一个丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a及其编码基因。该蛋白具有糖苷酶活性和抑制核糖体功能(蛋白合成活性)的作用，因而该蛋白与其它核糖体失活蛋白一样具有抗肿瘤以及抗HIV等病毒感染的作用，可用于制备抗肿瘤、癌症、自身免疫性疾病和抗病毒感染等免疫性药物。该蛋白的表达条件简单，易于纯化，可进行大规模工业化生产。本发明将在医学及生物制药领域发挥重要作用。

下面结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。

附图说明

图1为丝瓜籽核糖体失活蛋白基因luffin a编码蛋白的功能域分析结果

图2为丝瓜籽核糖体失活蛋白基因luffin a的原核表达产物、原核表达后的上清和沉淀以及纯化产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

具体实施方式

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如“Sambrook等人，分子克隆：实验室手册”(New York：Cold Spring Laboratory Press，1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、丝瓜籽核糖体失活蛋白基因luffin a的克隆

一、丝瓜籽总RNA的提取

将北京产丝瓜籽置于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，加入TRIzol试剂(Invitrogen公司)，4℃、120,000rpm离心10分钟，取上清，加入200ul氯仿/mL TRIzol，剧烈震摇15-30秒，室温放置3分钟，再4℃、120,000rpm离心15分钟，取上层水相溶液，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10分钟，4℃120,000rpm离心10分钟，弃上清，加入预冷的75％乙醇(用DEPC水配制)洗涤，放置至沉淀透明后，加入适量的无核酸酶的水溶解沉淀，得到丝瓜籽总RNA，-70℃保存备用。

二、反转录PCR扩增luffin a

根据来源于同一种属植物的RIP核酸序列具有保守性，参照已报道的丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a的cDNA序列(Kataoka，J.，1992，Plant Mol.Biol.)设计引物RT-PCR扩增丝瓜籽核糖体失活蛋白基因，引物序列如下：

P1(上游引物)：5’-ATGAAGAGATTTACAGTGCTAATTCTC-3’；

P2(下游引物)：5’-TCAGTGTTTTGCAGGAATATCCTCGTC-3’。

用Superscript II反转录酶(Invitogen公司)并参照说明书，取1ug丝瓜籽总RNA作模板，进行反转录。结束后，取5ul反转录产物作模板，在引物P1和引物P2的引导下，PCR扩增丝瓜籽核糖体失活蛋白基因，PCR扩增体系为：10×PCR缓冲液5ul，25mM MgSO₄ 6ul，引物P1、P2各50pmol，10mM dNTPs 1ul，Taq聚合酶1U，补水至反应体系为50ul。PCR反应条件为：94℃30sec，55℃40sec，72℃1min，共35个循环；72℃延伸10分钟。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果扩增片段大小约为850bp，与预期结果相符。

将RT-PCR扩增获得的cDNA片段连接到测序载体pGEM-T(Promega公司)中，用CaCl₂法转化E.coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，利用通用引物T7/SP6鉴定获得的阳性克隆。小量培养阳性克隆，取菌液送北京华诺生物技术有限公司测定DNA序列。序列测定结果表明所扩增的DNA序列具有序列表中SEQ ID №：2的多核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：2由842个碱基组成，其编码框为自5’端第1-第789位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。将该DNA序列与GeneBank登录号为：X62371、S38043的序列以及已报道的丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a的DNA序列(Kataoka，J.et al，1992，Plant Mol.Biol.)进行同源性比较，同源性为95％。将该DNA序列编码的氨基酸序列与已报道的丝瓜籽核糖体失活蛋白的的氨基酸序列(GeneBank登录号为：CAA44229、Q00645、S22494；Kataoka，J.et al，1992，Plant Mol.Biol.)进行同源性比较，同源性为92％，与Islam MR等报道的丝瓜籽核糖体失活蛋白的氨基酸序列(Islam MR，Nishida H，Funatsu G etal，1990，Agric Biol Chem.)的同源性可达93％。上述序列比对结果表明所获得的基因是编码丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a的一个新序列。对所克隆的luffin a所编码的氨基酸序列进行结构域分析，分析结果如图1所示，表明编码蛋白具有核糖体失活蛋白(ribosome inactivating protein，RIP)的功能域，序列表中SEQ ID №：2白N端第36-261位氨基酸残基序列。同时参考相关文献，与其RNA N-糖苷酶活性密切相关的氨基酸位点(序列表中SEQ ID №：1中自N端第160位的His¹⁶⁰，第160位的Tyr¹⁸⁵，第250位的Lys²⁵⁰)都没有发生突变，因而具有糖苷酶活性和抑制核糖体功能(蛋白合成活性)的作用，所得蛋白为一种核糖体失活蛋白。

现已有大量研究报道证实了核糖体失活蛋白的功能，如：高闻达等证实luffin a在体外可以杀死黑色素瘤细胞M₂₁(高闻达，曹惠婷，季瑞华，等.丝瓜籽中蛋白质生物合成抑制蛋白的分离、纯化及性质研究[J].生物化学和生物物理学报，1994，26(3)：289-295.)；林峻凯等报道了luffin a在体外可以抑制人白血病细胞系K562的生长(林峻凯，陈明晃，谢捷明，等.八棱丝瓜籽核糖体失活蛋白的分离纯化及其生化性质[J].中国生物化学与分子生物学报，2002，18(5)：609-613)；AU TK等研究报道了luffin a具有抑制HIV整合酶的作用(AU TK，COLLINS R A.The plantribosome inactivating proteins luffin and saporin are potent inhibitors ofHIV 21 integrase[J].FEBS Letters，2000，471(223)：169-172.)；徐小蓉等研究证实体外表达的luffin a蛋白具有生物活性(徐小蓉，詹金彪，夏铮.丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a基因的克隆和表达[J].浙江大学学报，2005，34(3)：207-211)。因此，该蛋白与其它核糖体失活蛋白一样具有抗肿瘤以及抗HIV等病毒感染的作用。

实施例2、丝瓜籽核糖体失活蛋白基因luffin a的表达及其表达产物的纯化

一、含丝瓜籽核糖体失活蛋白基因luffin a的重组表达载体pET-28a(+)-luffin的构建

根据实施例1获得的luffin a的DNA序列，分别设计包含酶切位点的上、下游引物，引物序列如下：

LUFFIN1/NdeI：GGAGATATA CATATGAAGAGATTTACAGTGCTAATT；(带下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点)

LUFFIN1/NotI：TCGAGT GCGGCCGCTCATTACTTGTTTAGAAGCAATTT；(带下划线碱基为限制性内切酶Not I识别位点)

使用高保真聚合酶pyrobest(TaKaRa公司)，PCR扩增luffin a的DNA序列，并在序列两段分别添加上限制性内切酶Nde I和Not I的识别位点，50ul PCR体系为：10×PCR缓冲液5ul，25mM MgSO₄ 6ul，引物LUFFIN1/NdeI、LUFFIN1/Not I各50pmol，10mM dNTPs 1ul，高保真聚合酶pyrobest 1U，补水至反应体系为50ul。PCR反应条件为：先94℃30sec，55℃40sec，72℃1min，共35个循环，再72℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化大小大约为850bp的目的片段后，对其用限制性内切酶Nde I和Not I(均购自NEB公司)进行双酶切后，与经同样酶双酶切的载体pET-28a(+)(Novagen公司)连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，筛选阳性重组子，提质粒，用引物LUFFIN1/NdeI和LUFFIN1/NotI进行PCR鉴定，可扩增出大约为800bp大小片段的初步鉴定为阳性克隆，取样，用测序的方法做进一步的鉴定，最终得到插入序列正确的阳性克隆，将含有丝瓜籽核糖体失活蛋白基因luffin a的重组表达载体命名为pET-28 a(+)-luffin，小量摇菌提取质粒。

二、丝瓜籽核糖体失活蛋白基因luffin a的原核表达

将步骤一构建的重组表达载体pET-28a(+)-luffin转化E.coli BL21感受态细胞，筛选阳性重组子。挑取阳性重组子，将其接种于100ul LB液体培养基中37℃培养过夜，再将菌悬液接种到2mL含25ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm培养1小时，部分培养管加入IPTG至终浓度为0.1mM，在相同条件下继续培养2小时，以不加IPTG的对照。培养结束后，取500ul菌液，10,000离心2分钟收集菌体，加入50ul上样缓冲液，100℃变性10分钟，12,000g离心1分钟，取20ul上清液进行12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳结束后，考马斯亮蓝染色、脱色，检测结果如图2所示(泳道M：蛋白分子量标准，泳道1：诱导前菌体蛋白，泳道2：诱导后蛋白表达)，表明经IPTG诱导，luffin a在大肠杆菌中获得表达，得到了分子量为28kD的重组蛋白，与预计分子量大小一致，将转化有pET-28a(+)-luffin的E.coliBL21的阳性重组子命名为pET-28a(+)-luffin/BL21。

三、丝瓜籽核糖体失活蛋白基因luffin a的原核表达及其表达产物的纯化

将步骤二中筛选所得重组E.coli BL21表达菌株pET-28a(+)-luffin/BL21(带有重组表达载体pET-28a(+)-luffin)划板培养12-24小时，挑取单克隆，将其接种于3mL LB液体培养基中37℃培养12-24小时，再将菌悬液接种到300mL含25ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm培养至600nm的OD值为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，在相同条件下继续培养4小时。培养结束后，8,500rpm离心15分钟收集菌体，将菌体溶于10mL 10mM Tris·HCl (pH 6.5)中，加入溶菌酶(华美生物工程公司)至终浓度为5mg/mL，加入终浓度为100ug/mL的蛋白酶抑制剂PMSF(Amresco公司)，室温放置30分钟，冰浴，超声破碎10分钟，离心分别收集上清和沉淀，分别取少量的上清和沉淀进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图2所示(泳道3：超声破碎后上清中蛋白，泳道4：超声破碎后沉淀中蛋白)，表明表达的蛋白主要存在沉淀中，即以包含体形式存在。将沉淀溶于Ni-NTA树脂(Qiagen公司)上样缓冲液中。按照Ni-NTA树脂的操作说明纯化蛋白，对所纯化的蛋白进行12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳完成后，考马斯亮蓝染色，脱色，检测结果如图2中的泳道5所示，表明经纯化获得了纯度较高的目的蛋白，将纯化蛋白于-20℃保存备用。

序列表

<160>2

<210>1

<211>262

<212>PRT

<213>葫芦科植物丝瓜(Luffa cylindrica)

<400>1

Met Lys Arg Phe Thr Val Leu Ile Leu Ala Ile Phe Leu Ala Ala Ser

1 5 10 15

Thr Val Glu Ala Asp Val Ser Phe Ser Leu Ser Gly Ser Ser Ser Thr

20 25 30

Ser Tyr Ser Lys Phe Ile Gly Asp Leu Arg Lys Ala Leu Pro Ser Ser

35 40 45

Gly Thr Val Tyr Asn Ile Thr Leu Leu Leu Ser Ser Ala Ser Gly Ala

50 55 60

Ser Arg Tyr Thr Leu Met Lys Leu Ser Asn Tyr Asp Gly Lys Ala Ile

65 70 75 80

Thr Val Ala Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Leu Val

85 90 95

Asn Ser Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ser Asp Ala Lys Leu Ala Ser

100 105 110

Gln Tyr Val Phe Lys Gly Ser Thr Ile Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly

115 120 125

Asn Tyr Glu Lys Leu Gln Thr Ala Glu Gly Lys Ile Arg Glu Lys Ile

130 135 140

Pro Leu Gly Phe Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe His

145 150 155 160

Tyr Asp Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Phe Leu Val Ile Ile Gln Thr

165 170 175

Thr Ala Glu Ala Ser Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Gly Gln Ile Ile Glu

180 185 190

Arg Ile Ser Lys Asn Gly Val Pro Ser Leu Ala Thr Ile Ser Leu Glu

195 200 205

Asn Glu Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Leu Glu Gln Thr Asn

210 215 220

Asn Gly Thr Phe Lys Thr Pro Val Val Ile Thr Asp Asp Lys Gly Gln

225 230 235 240

Arg Val Glu Ile Thr Asn Val Thr Ser Lys Val Val Thr Lys Asn Ile

245 250 255

Lys Leu Leu Leu Asn Lys

260

<210>2

<211>842

<212>DNA

<213>葫芦科植物丝瓜(Luffa cylindrica)

<400>2

atgaagagat ttacagtgct aattctcgcc atcttccttg cagcttcaac tgttgaagcc 60

gatgtgagct tcagtttgtc aggttcttcc tccacatctt atagcaagtt catcggagat 120

ctgaggaagg ctcttccatc tagtgggaca gtctacaaca taactctctt actctcctct 180

gcctcgggcg caagccgcta cactctcatg aaactctcca attacgacgg caaagccatc 240

acggttgcca tagatgtaac caacgtttac atcatgggct atctcgtcaa ttcaacatcc 300

tactttttca acgagtctga tgctaaatta gcttctcaat acgtattcaa aggcagtacc 360

atcgtcacgc ttccatattc tggcaattac gaaaagcttc aaactgctga agggaagata 420

agagagaaga ttccactggg attcccagct ttggacagtg cgattaccac cttgtttcat 480

tacgactcca cggctgctgc tgcggcattc ctcgtaatca ttcagaccac tgctgaggct 540

tccagattca agtatatcga gggacagatt attgagagaa tttcgaaaaa cggggtgccg 600

agtctggcga ctataagttt agaaaacgaa tggtctgctc tctctaaaca aattcagttg 660

gaacagacga ataacggaac gtttaaaact cccgttgtga taacggacga taaaggccaa 720

cgagttgaaa taaccaacgt cacttcgaaa gttgtaacca agaacatcaa attgcttcta 780

aacaagtaaa caataaacaa aatgttgcag cttttgacga ggatattcct gcaaaacact 840

ga 842

Claims

1、一种丝瓜籽核糖体失活蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2、根据权利要求1所述的丝瓜籽核糖体失活蛋白，其特征在于：所述蛋自具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列。

3、权利要求1所述的丝瓜籽核糖体失活蛋白的保守性变异多肽、片段、类似物或其衍生物。

4、编码权利要求1所述丝瓜籽核糖体失活蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

5、根据权利要求4所述的编码丝瓜籽核糖体失活蛋白的基因，其特征在于：所述基因具有序列表中SEQ ID №：2的多核苷酸序列。

6、编码权利要求3所述的丝瓜籽核糖体失活蛋白的保守性变异多肽、片段、类似物或其衍生物的多核苷酸。

7、含有权利要求4所述丝瓜籽核糖体失活蛋白基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

8、一种权利要求1所述丝瓜籽核糖体失活蛋白的表达方法，是将权利要求4所述的丝瓜籽核糖体失活蛋白基因、该基因变异体或含有所述丝瓜籽核糖体失活蛋白基因的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到丝瓜籽核糖体失活蛋白。

9、根据权利要求8所述的丝瓜籽核糖体失活蛋白的表达方法，其特征在于：所述重组表达载体为pET-28 a (+)-luffin。

10、权利要求1所述的丝瓜籽核糖体失活蛋白在制备抗肿瘤和/或抗病毒感染的免疫性药物中的应用。