CN116875520A - 表达核糖体失活蛋白的乳酸菌及其在抗轮状病毒中的应用 - Google Patents

表达核糖体失活蛋白的乳酸菌及其在抗轮状病毒中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供一种表达核糖体失活蛋白的乳酸菌及其在抗轮状病毒中的应用。所述乳酸菌内整合有核糖体失活蛋白基因，其中，所述核糖体失活蛋白基因为核糖体失活蛋白基因PAP或核糖体失活蛋白基因B17。本发明所述乳酸菌能高效表达PAP和B17抗原蛋白，具有良好的免疫原性，能够诱导黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答，可用于防治轮状病毒感染，具有良好的实际应用价值。

Description

表达核糖体失活蛋白的乳酸菌及其在抗轮状病毒中的应用
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，具体涉及表达核糖体失活蛋白的乳酸菌及其在抗轮状病毒中的应用。
背景技术
在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应被视为承认这些现有技术是广为人知的，或构成本领域公知常识的一部分。
轮状病毒感染是由轮状病毒(Rotavirus，RV)引起的传染性疾病。该病具有多种动物共患的特点，是目前婴幼儿及仔猪、犊牛、羔羊、雏鸡等动物发生腹泻的主要病因之一。因其在仔猪中发病率高、存在死亡风险，且目前无针对轮状病毒感染的特效药，故其长期对养猪业造成经济损失。
猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PRV)是一种双链RNA病毒，归类于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)。病毒基因共计11节段RNA，以此编码6种结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和5种非结构蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5/6)。轮状病毒病毒粒子外观呈正二十面体接近球状，无囊膜，直径约65～75nm，具有三层蛋白质衣壳，最外层衣壳由780个VP7蛋白和60个VP4二聚体形成的纤突构成，中间层衣壳由260个VP6蛋白构成，最内层为VP2和少量VP1、VP3三种蛋白分子搭配11个双链RNA片段与其他非结构蛋白分子共同构成。在电镜下可观察到病毒粒子中央呈现致密的六角型，向外存在辐射状结构，最外层显示为光滑薄膜，整体呈现为轮状结构，因此得名轮状病毒。此病毒与呼肠孤病毒属的区别即在于该病毒具有由VP7蛋白形成的光滑外表面。在此表面存在向外突出的VP4蛋白，该蛋白是88KDa的红血球凝集素纤突蛋白，是具有血凝特性的RV表面抗原并影响病毒对细胞的黏附，与病毒毒性相关。VP4蛋白对蛋白水解酶敏感，可利用胰蛋白酶将其水解为VP5和VP8两个片段。经水解的RV获得较水解前更强的感染能力，从而增强RV在细胞中的繁殖能力。在自然感染时，VP4蛋白可作为抗原刺激机体产生少量中和抗体。RV在进入感染细胞后会呈现不完整的病毒粒子状态，该状态是将完整病毒粒子溶解最外层衣壳即VP4、VP7蛋白后获得的两层衣壳结构(DLP)。VP2蛋白是RV内部的结构基础。裸露在不完整病毒粒子外表面的VP6蛋白结合在由VP2蛋白构成的界面上，并影响最内层衣壳蛋白VP1与VP3的转录。内侧的RNA通过与VP1、VP3结合的方式与VP2蛋白界面相连。NSP1、NSP2、NSP3、NSP5/6四种非结构蛋白均可与RNA结合，影响病毒复制，参与转录，组成病毒繁殖需要的酶，介导病毒与细胞的结合，参与病毒形成外衣壳。其中NSP5可影响VP2蛋白界面结构，因此界面两侧均受到影响：向内，影响由VP1、VP2、VP3三种蛋白共同组成的病毒核心结构；向外，影响VP6蛋白于界面的稳定性。与其他非结构蛋白共同存在于病毒中心的NSP4蛋白是一种糖蛋白，影响病毒粒子在内质网出芽，同时NSP4的突变能影响RV的毒力，因此NSP4蛋白在病毒复制与致病方面产生影响。
猪轮状病毒感染的主要传染源包括病猪、隐性感染猪及病毒携带猪。成年猪包括妊娠母猪在感染轮状病毒后仅表现为隐性感染。因妊娠母猪分娩前后依旧排出病毒，并可直接接触新生仔猪，故成为本病的重要传染源。同时，RV具有多种动物共患的特征，环境中同样存在传染源如：鼠、蝙蝠、人类，因此可能造成本病在不同物种之间传播。
消化道是猪轮状病毒感染的主要传播途径。病猪等传染源通过排粪的方式向环境中排出病毒。粪便中包裹的RV可在维持其本身感染性的同时污染饲料、饮水等环境设施，进而将本病传播。
猪轮状病毒感染的易感动物包括各年龄、各性别的猪。成年猪多为隐性感染，表现为本病仅能刺激机体产生特异性免疫应答，不引起或只引起轻微的组织损伤，在临床上不显出任何症状、体征，甚至无生化改变，只能通过免疫学检查才能发现。但在仔猪群体中，本病有明显的发病症状，病伴随较高的感染率和死亡率。猪轮状病毒感染初生仔猪死亡率可达100％，感染5～7日龄仔猪死亡率可降至5％～30％。
猪轮状病毒感染与温度相关，表现为寒冷的深秋、冬季和初春是本病的高发期。在地域上，本病常出现同一地区每年发生的情况，因为隐性感染的成年猪会不断排除病毒。
轮状病毒感染潜伏期约12～24h，病猪体温升高，达40-42℃，精神萎靡，厌食或废绝，严重时发生呕吐。腹泻呈水样或蛋清样。眼、鼻有粘性分泌物流出，腹部膨胀，呈腹泻性腹痛。病程4-10天，死亡率高。病死猪现出不同程度的脱水症状，肌肉颤抖无力，体温升高或下降不明显。病程稍长者皮肤干燥、粗糙。轮状病毒主要感染小肠绒毛表面的成熟上皮细胞，在杯状细胞、上皮内分泌细胞和巨噬细胞中也有发现。细胞被RV感染后，内质网中出现增大池，微绒毛减少缩短。上皮细胞死亡脱落导致肠绒毛无法正常发育，进而减弱吸收功能，发生腹泻。上皮细胞脱落后，腺上皮细胞代偿性增生，使分泌过多，进一步加重腹泻。
发明内容
本发明提供了表达核糖体失活蛋白的乳酸菌及其在抗轮状病毒及其导致的感染中的应用。本发明所述重组植物乳杆菌内整合有核糖体失活蛋白(Ribosome-inactivatingproteins，RIPs)基因，其中，所述核糖体失活蛋白基因为核糖体失活蛋白基因PAP或核糖体失活蛋白基因B17。本发明所述重组植物乳杆菌能高效表达PAP抗原蛋白和B17抗原蛋白，具有良好的免疫原性，能够诱导黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答，可用于防治轮状病毒感染，并保护肠道组织，具有良好的实际应用价值。
具体地，本发明提供了下述的技术方案。
在本发明的第一方面，提供了一种表达核糖体失活蛋白的乳酸菌，其整合有核糖体失活蛋白基因，其中，所述核糖体失活蛋白基因为核糖体失活蛋白基因PAP或核糖体失活蛋白基因B17，所述核糖体失活蛋白基因PAP的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述核糖体失活蛋白基因B17的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明的实施方式中，本发明所述乳酸菌能够表达产生核糖体失活蛋白PAP或核糖体失活蛋白B17，所述蛋白在本发明的实施方式中也被简称为PAP抗原蛋白或B17抗原蛋白，具有良好的免疫原性，所述核糖体失活蛋白PAP或核糖体失活蛋白B17，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述乳酸菌的出发菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NC8，优选为丙氨酸消旋酶基因缺陷型植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NC8ΔaLr。
在本发明的一些实施方式中，所述表达载体为pSIP409-pgsA’(ata)载体。
在本发明的第二方面，提供了一种构建上述第一方面中所述乳酸菌的方法，其包括：将核糖体失活蛋白基因与表达载体连接后转入感受态细胞中获取重组质粒，将重组质粒转化至出发菌株比如植物乳杆菌NC8ΔaLr中。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括将核糖体失活蛋白基因PAP或核糖体失活蛋白基因B17与表达载体pSIP409-pgsA’(ata)连接(比如通过T4连接)后转化至大肠杆菌E.coliχ6212中，获得重组质粒pSIP409-pgsA’(ata)-PAP或pSIP409-pgsA’(ata)-B17，将所得重组质粒转至植物乳杆菌NC8ΔaLr，获得重组植物乳杆菌，分别命名为NC8ΔaLr-PAP或NC8ΔaLr-B17。
在本发明的实施方式中，所述核糖体失活蛋白基因PAP的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述核糖体失活蛋白基因B17的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明的实施方式中，本发明所述乳酸菌能够表达产生核糖体失活蛋白PAP或核糖体失活蛋白B17，其氨基酸序列比如分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中所示。
在本发明的实施方式中，所述转化的方式可按照本领域的常规操作进行，比如采用电转化的方式。
在本发明的第三方面，提供了一种组合物，其包含上述第一方面中所述的乳酸菌。在一些实施方式中，本发明所述组合物可以为菌剂、药物组合物、药物制剂、饲料或饲料添加剂。
在本发明的第四方面，提供了上述第一方面中所述的乳酸菌或包含所述乳酸菌的组合物在制备抗轮状病毒的产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述轮状病毒为猪轮状病毒感染。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为菌剂、药物制剂、饲料或饲料添加剂、微生态制剂等等。
在本发明的第五方面，提供了上述第一方面中所述的乳酸菌或包含所述乳酸菌的组合物在制备防治轮状病毒感染的产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述轮状病毒感染为猪轮状病毒感染。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为菌剂、药物制剂、饲料或饲料添加剂、微生态制剂等等。
在本发明的一些实施方式中，构建了两株整合有核糖体失活蛋白基因的重组乳酸菌NC8ΔaLr-PAP和NC8ΔaLr-B17菌株，并以此进行了动物实验，对出生乳鼠进行了口服灌胃免疫实验，对比PBS组以及原始菌株NC8组，隔天免疫，共免疫7次，再感染猪轮状病毒，通过流式细胞仪检测重组植物乳酸菌免疫后对乳鼠细胞免疫的影响，结果显示两种重组植物乳酸菌均可以诱导乳鼠脾脏产生CD4+IL-4+和CD8+IFN-γ+细胞，表明重组植物乳酸菌表达的核糖体失活蛋白作为诱导机体细胞免疫的抗原，成功诱导了T淋巴细胞的反应，可能两个T细胞亚群均起到保护作用。使用流式细胞术检测了重组植物乳酸菌免疫后乳鼠派尔集合淋巴结B细胞中IgA的含量，结果显示重组植物乳酸菌中B220+IgA+的数量显著高于PBS和NC8组，表明在重组植物乳酸菌的刺激下抗体分泌量显著增加，成功活化了B淋巴细胞的反应。两种重组植物乳酸菌在口服灌胃后均能够刺激派尔集合淋巴结中CD80+和CD86+表面标志的活化，表明两种重组植物乳酸菌均能够使树突状细胞活化，使其进一步发挥其抗原摄取呈递功能。通过灌胃的方式免疫乳鼠，两株重组植物乳酸菌能更好的刺激DC细胞的活化，诱导乳鼠产生细胞因子，促进T细胞增殖，提高B细胞的活化水平，为生发中心的形成提供了条件，并促进了IgA的表达。以及，通过病理学检查可以发现重组植物乳酸菌组的两组乳鼠肠绒毛完整，肌层和浆膜层较厚，较为健康。同时，免疫重组植物乳酸菌的乳鼠血清中的TNF-α、IL-1β含量显著下降，而IFN-α和IL-6显著升高，抑制了炎症因子的升高。以上结果表明，本发明的重组植物乳杆菌能够很好的防治轮状病毒感染，特别是猪源性轮状病毒感染。
相较于现有技术，本发明的优势包括：
本发明提供了一种表达核糖体失活蛋白的新功能型乳酸菌并提供了该菌株在抗轮状病毒及其导致的感染方面的应用。本发明以食品级植物乳杆菌NC8为出发菌株，以三角梅的核糖体失活蛋白基因B17和商陆的核糖体失活蛋白基因PAP序列为基础，根据保护性抗原位点的研究，将相关的保护性抗原位点片段连接至植物乳杆菌NC8上，从而成功构建获得NC8ΔaLr-PAP和NC8ΔaLr-B17菌株。经实验研究证明，本发明的重组植物乳杆菌能高效表达PAP抗原蛋白和B17抗原蛋白，具有良好的免疫原性，同时所述重组菌株能诱导黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答，对轮状病毒感染的肠道具有良好的保护作用，具有良好的实际应用价值。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：
图1：表达核糖体失活蛋白的新功能型乳酸菌构建，其中，A：B17基因的酶切鉴定；B：PAP基因的酶切鉴定。
图2：B17基因和PAP基因的测序结果比对，其中，A：B17基因的测序鉴定；B：PAP基因的测序鉴定。
图3：B17基因和PAP基因在植物乳杆菌中的PCR结果。
图4：新功能型乳酸菌植物乳杆菌NC8ΔaLr-PAP、NC8ΔaLr-B17的测序结果比对，其中，A：NC8ΔaLr-B17的测序鉴定；B：NC8ΔaLr-PAP的测序鉴定。
图5：新功能型乳酸菌植物乳杆菌NC8ΔaLr-PAP、NC8ΔaLr-B17的Western Blot验证，其中，A：B17基因的测序鉴定；B：PAP基因的测序鉴定。
图6：间接免疫荧光验证新功能型乳酸菌植物乳杆菌NC8ΔaLr-PAP、NC8ΔaLr-B17蛋白表达，其中，A：新功能型乳酸菌植物乳杆菌NC8ΔaLr-PAP；B：新功能型乳酸菌植物乳杆菌NC8ΔaLr-B17。
图7：乳鼠攻毒实验结果，其中，A：健康组；B：PAP组；C：B17组；D：PBS攻毒组；E：空载体组。
图8：乳鼠T细胞流式结果，其中，(1)：CD4T细胞中IFN-γ的数量变化；其中，F：针对A至E各实验组中CD4T细胞中IFN-γ的数量变化的对比；(2)：CD8T细胞中IFN-γ的数量变化，其中，F：针对A至E各实验组中CD8T细胞中IFN-γ的数量变化的对比；(3)CD4T细胞中IL-4的数量变化，其中，F：针对A至E各实验组中CD8T细胞中CD4T细胞中IL-4的数量变化的对比；(1)至(3)中的A至E分别表示，A：PBS攻毒组；B：空载体组；C：B17组；D：PAP组；E：健康组；(1)至(3)中F自左至右的柱形均分别对应PBS攻毒组、空载体组、B17组、PAP组和健康组。
图9：乳鼠树突状细胞流式结果，其中，A：乳鼠树突状细胞CD80的百分比；B：乳鼠树突状细胞CD86的百分比；C：各实验组乳鼠树突状细胞CD80的百分比的对比；D：各实验组乳鼠树突状细胞CD86的百分比的对比。
图10：乳鼠B细胞流式结果，其中，A：PBS攻毒组；B：空载体组；C：B17组；D：PAP组；E：健康组；F：各实验组乳鼠B细胞流式结果对比，其中，自左至右的柱形分别对应PBS攻毒组、空载体组、B17组、PAP组和健康组。
图11：乳鼠小肠HE病理切片结果，其中，A：PBS攻毒组；B：空载体组；C：B17组；D：PAP组；E：健康组。
图12：ELISA检测乳鼠血清中细胞因子结果，其中，A：乳鼠血清中TNF-α的变化；B：乳鼠血清中IL-1β的变化；C：乳鼠血清中IFN-α的变化；D：乳鼠血清中IL-6的变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
表达核糖体失活蛋白的重组植物乳杆菌的构建及验证
1.1材料与方法：本实验中使用的菌株和质粒见表1。
表1菌株与质粒
1.1.1酶及主要试剂
限制性核酸内切酶、PCR高保真酶、T4连接酶、无缝克隆试剂等均购自于大连宝生物工程有限公司。质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒购买于全式金生物有限公司。蛋白凝胶、蛋白marker、蛋白SDS-buffer均购买于碧云天生物科技有限公司，10×M buffer、10×T4buffer、D-丙氨酸和2％GLy，由吉林农业大学实验室配制并保存。
1.1.2主要的仪器
4℃冷冻离心机(Centrifμge 5810R)、梯度PCR仪(Eppendorf AG)购自德国Eppendorf公司；流式细胞仪(LSRFortessaTM)购自美国BD公司；超声波细胞粉碎机(SCIENTZ-IID)购自宁波新芝生物科技股份有限公司；电穿孔仪(Gene PμLser XceLLTMSystem)、凝胶成像分析系统(UniversaL HoodⅡ)、紫外可见分光光度计(L5S)和垂直电泳仪(041BR 02682)、转膜仪、Western bLot相关仪器均自于美国BIO-RAD公司；酶标仪购于Thermo Fisher公司；CO2培养箱(HERACELL 240i)和恒温培养箱(Heratherm IGS180)均购自美国Therm Scientific公司；超灵敏多功能成像仪(Amersham Imager 600RGB)购自美国GE公司；全自动高压灭菌锅(GR85DA)购自德国Sigma公司；微孔板分光光度计(Epoch2)购自美国BioTek公司，AI600(Amersham Imager 600RGB)化学发光成像系统购自GE公司。
1.1.3大肠杆菌χ6212感受态的制备
1、现有大肠杆菌x6212感受态细胞在LB固体培养基中加入DAP(终浓度50μg/mL)的平板上划线，37℃过夜培养。
2、隔天挑单菌落在大体积LB液体培养基+DAP(终浓度50μg/mL)中培养，测OD值在0.8-1.0之间。
3、冰上预冷菌液10min，4000rpm/min，离心10min收集菌体。
4、将收集到的菌体用预冷的去离子水洗1次，在用预冷的10％甘油洗2次，同样的转速和时间。
5、最后用预冷的10％甘油重悬(50mL菌液用1-2mL的10％甘油重悬)，分管，每管100μL，-80℃保存。
6、DAP配制5mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，使用时1:100稀释。10％甘油：90mL水+10mL甘油。
1.1.4植物乳杆菌感受态的获得及鉴定
(1)取-80℃冻存的植物乳杆菌NC8ΔaLr接种于5mL含D-丙氨(0.2mg/mL)的MRS培养液中，30℃厌氧条件下培养过夜；
(2)含D-丙氨酸(0.2mg/mL)的MRS固体培养基上接种适量菌液，30℃厌氧条件下培养至长出状态良好的单个菌落，约36-48h
(3)取5mL含D-丙氨酸(0.2mg/mL)的MRS液体培养基(含2％GLy)接种培养生长良好的单个菌落，30℃厌氧条件下培养直至菌液OD600值为0.6；
(4)取20mL含D-丙氨酸(0.2mg/mL)的MRS液体培养基(含2％GLy)接种培养30μL上述菌液，30℃厌氧条件下继续培养直至菌液OD600值为0.4；
(5)冰浴上述OD600值为0.4的菌液20min，4℃条件下5000rpm离心10min，收集菌体沉淀；
(6)将菌体沉淀以冰冷的2mL清洗缓冲液重悬，4℃条件下5000rpm离心10min，并重复清洗两次，收集菌体沉淀；
(7)将菌体沉淀以冰冷的400μL电击缓冲液重悬，冰浴10min后以每管100μL进行分装备用。
1.2方法
1.2.1基因的选择和合成
选用了具有广谱治疗作用的核糖体失活蛋白，通过NCBI数据库查询到美洲商陆抗病毒蛋白PAP(即Pokeweed Antiviral Protein)和三角梅(Bougainvillea)的核糖体失活蛋白B17(Bougainvillea-B17)的基因序列，分别在南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并对其密码子进行了优化，并得到了pUC-PAP、pUC-B17两种质粒。
1.2.2目的基因回收及酶切鉴定
使用限制性核酸内切酶Xba I和Hind III对两种质粒进行酶切，通过胶回收试剂盒将目的基因进行回收，得到PAP、B17基因片段，对其片段进行PCR验证。
表2酶切体系
将酶切产物进行回收，回收方法按照DNA凝胶纯化试剂盒说明书。
表3引物列表
表4反应体系
反应条件：98℃预变性20s，98℃变性10s，50℃退火5s，72℃延伸30s，共30个循环。反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳，点样2μL PCR产物。
1.2.3目的基因与pSIP409-pgsA’(ata)载体片段连接
将pSIP409-pgsA’(ata)载体与PAP片段和B17片段使用T4连接酶进行连接，16℃连接过夜，连接体系如表5所示，连接产物准备转化。
表5连接体系
1.2.4连接产物电转至大肠杆菌6212感受态中
将上述连接产物电转至大肠杆菌6212感受态中，并涂布于LB培养板上，次日提取阳性菌落，并进行测序验证，鉴定成功的阳性质粒命名为pSIP409-pgsA’(ata)-PAP、pSIP409-pgsA’(ata)-B17。
1.2.5重组质粒转化至植物乳杆菌NC8ΔaLr中
将上述质粒通过电转化方法转至NC8ΔaLr中，并涂布于MRS固体培养基上，厌氧培养至长出单菌落后，挑取单菌落，进行验证。
1.2.6新功能型乳酸菌的基因验证
将新功能型乳酸菌植物乳杆菌NC8ΔaLr-PAP、NC8ΔaLr-B17通过PCR方法进行验证，并将PCR产物送至生工测序，经BLAST比对后，确认其连接成功。
1.2.7新功能型乳酸菌蛋白表达验证
将鉴定阳性的两株新功能型植物乳杆菌甘油管保存液0.5mL分别接种于100mL的MRS培养基中，30℃恒温厌氧培养过夜后，2％接种量转接新鲜灭菌的MRS培养基，继续培养3h后(OD600≈0.3)加入诱导剂SppIP(50ng/mL，1：2.5)，同时，以未添加抗原基因的空载体植物乳杆菌NC8Δalr在相同条件下诱导培养作为对照。诱导8h后，分别取20mL菌液在液氮中反复冻融5次，然后再进行超声波破碎等处理。
具体条件为：超声功率300W，超声2s，间歇5s，每个样品超声20min，超声完成后加入终浓度为0.35g/mL的硫酸铵，4℃静置过夜，次日4℃条件下12000g离心10min，弃掉上清，沉淀用300μL PBS重悬，4℃条件下12000g离心10min，取上清与4×蛋白上样缓冲液混匀后，煮沸10min，迅速冰浴5min，12000g离心3min，取上清20μL上样，以180KD蛋白质标准分子量为参考，用于转印的PAGE胶，按仪器说明安装转印系统，在Biorad 1645050转印仪上进行转印操作，恒流300mA转印60min，取出转印后的膜。转印后的PVDF膜转移至封闭液中于37℃封闭1h；然后利用抗鼠的HIS标签抗体按照1:1000进行稀释作为一抗，于4℃反应过夜；用PBST洗膜3次，每次10min；二抗HRP标记的羊抗鼠IgG按1:5000稀释，于室温摇床震荡1h；用PBST洗膜3次，每次10min；使用超敏ECL化学发光试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)及天能化学发光成像系统进行观察，分析蛋白表达情况。
1.2.10新功能型乳酸菌的免疫荧光实验
1、活化两株新功能型乳酸菌与5mLMRS中过夜厌氧培养。
2、取出500μL的菌液转接到新的5mLMRS中，厌氧培养3h左右，测其OD在0.3左右。
3、向其加入12.5μL的诱导剂SppIP，进行诱导，诱导8h后，取出500μL，12000r离心1min收集菌体，用1mL PBS重悬，将新功能型乳酸菌组及乳酸菌空载体组的OD值进行统一。
4、向其中加入1mL/1％BSA的PBS，4℃封闭1h，在用1mL PBS洗3次。
5、加入抗HIS标签的单克隆抗体1mL，4℃过夜。
6、用1mL 0.2％ Tween-20的PBS洗3次后收集菌体。
7、向菌体中加入1mL荧光二抗(FITC标记，1:1000)重悬，室温避光孵育2h。
8、收集菌体再用0.2％ Tween-20的PBS洗3次，在次收集菌体。
9、在加入50μL的PBS重悬，然后取出10μL的菌液烤片，盖盖玻片前，加入2μL的抗荧光衰减剂，上机镜检。
1.3结果
1.3.11.3.1表达核糖体失活蛋白的新功能型乳酸菌构建结果
通过NCBI数据库检索到具有抗病毒效果的核糖体失活蛋白商陆源的基因PAP以及三角梅的基因B17的序列，对其序列进行优化后，在南京金斯瑞生物科技有限公司合成。在序列两端加入酶切位点XbaI和Hind III。将公司合成的基因序列进行酶切验证，可以发现在822、942bp有明显的条带，结果见图1所示。
1.3.2目的基因与pSIP409-pgsA’(ata)载体连接结果
将目的片段进行回收，同时回收pSIP409-pgsA’(ata)载体的片段，通过T4连接后，将目的基因与pSIP409-pgsA’(ata)载体连接起来，转化至大肠杆菌6212感受态中，提取质粒对其PCR验证，PCR产物送测序，测序结果完全正确，结果见图2所示。其中，核糖体失活蛋白基因PAP的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，核糖体失活蛋白基因B17的核苷酸序列如SEQID NO:2所示，
1.3.3重组质粒转化至植物乳杆菌NC8ΔaLr-
将验证成功的重组质粒pSIP409-pgsA’(ata)-PAP、pSIP409-pgsA’(ata)-B17通过电转化的方式，转化至植物乳杆菌NC8ΔaLr-中，命名为NC8ΔaLr-PAP、NC8ΔaLr-B17，并对其进行PCR验证以及测序，结果见图3和图4所示。
1.3.5新功能型乳酸菌表达核糖体失活蛋白的验证
将新功能型乳酸菌植物乳杆菌NC8ΔaLr-PAP、NC8ΔaLr-B17先通过反复冻融5次，然后在超声10min，离心后，取上清也进行Western Blot验证，可以发现在30.5和35.3kDa的位置出现目的条带，表明蛋白表达成功。结果见图5所示。
1.3.6间接免疫荧光验证目的蛋白的表达
在PAP和B17基因合成时，在其末端加入了6*His标签。通过间接免疫荧光方法，一抗使用了抗His的单克隆抗体，对新功能型乳酸菌进行标记，然后使用了FITC的荧光二抗，对其进行荧光标记，结果可见，新功能型乳酸菌植物乳杆菌NC8ΔaLr-PAP、NC8ΔaLr-B17都能显现出绿色荧光，表明新功能型乳酸菌植物乳杆菌NC8ΔaLr-PAP、NC8ΔaLr-B17的蛋白表达成功。结果见图6所示。其中，其中，表达的PAP抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，B17抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例2
实施例1构建的重组植物乳酸菌的免疫效果：
植物乳酸菌疫苗有着成本低廉，便于规模化生产的优势，且能够在机体肠道内长期定植，持续发挥作用，并且植物乳酸菌自身就是益生菌，能够提高机体免疫力、促进黏膜免疫。口服的免疫方式，又使之更为方便。因此，重组植物乳酸菌疫苗有着广阔的发展前景。本试验构建的重组植物乳酸菌为非抗生素植物乳酸菌，对环境而言更为友好，对动物而言避免了抗生素耐受。
2.1材料与方法
2.1.1试验菌株与毒株
本实验中使用的菌株为新功能型乳酸菌植物乳杆菌NC8ΔaLr-PAP、NC8ΔaLr-B17，使用的毒株为猪源轮状病毒，均保存于吉林农业大学动物微生态制剂工程研究中心。
2.1.2实验动物
本实验中所使用的是同时出生的SPF级Babi/c乳鼠，每组10只以上。小鼠购买于北京华阜康动物生物公司。
2.1.2试剂与耗材
流式抗体CD3、CD4、CD8、CD11、CD80、CD86、B220、IgA、IFN-γ、均购自BD公司；小鼠耳标器、剪刀、镊子、1.5mL EP管、灌胃针小号、次性尼龙筛网和铜网购自Solarbio公司；4％多聚甲醛通用型组织固定液购自Biosharp公司；酒精、石蜡、甲醛、包埋盒、HE染料等。
2.1.3主要仪器：同1.1.2主要仪器。
2.1.4主要试剂配制
完全培养基：50mL的1640细胞培养基中加入5mL胎牛血清和500μL的双抗。
不完全培养基：50mL的1640细胞培养基中加入1mL胎牛血清和500μL的双抗。
2.2方法
2.2.1动物实验免疫分组及程序
随机将乳鼠分为5组，分别为健康组、PBS攻毒组、PAP组、B17组、空载体组，每组10只乳鼠。除PBS组外，每只小鼠喂饲的活菌数为1.0×109CFU，经过处理的各组新功能型乳酸菌菌液给小鼠灌胃。乳鼠隔天免疫，共免疫7次，14天免疫结束后，经灌胃方式感染100TCID50的猪源轮状病毒。
2.2.2乳鼠免疫指标检测
2.2.2.1细胞悬液制备
无菌环境下摘取小鼠的脾脏、肠系膜淋巴结、派氏淋巴结于PBS中，置于冰上。然后使用300目的铜网将其研磨，用1640培养基重悬成细胞悬液，通过细胞计数板，对其中的细胞进行计数。
2.2.2.2检测乳鼠脾脏中T淋巴细胞的变化情况
利用流式细胞术检测小鼠脾脏中T的数量变化情况，使用表面抗体CD3+、CD4+、CD8+对其染色，完成后再使用固定破膜试剂，打开细胞膜，使用胞内抗体IFN-γ、IL-4染色。流式细胞仪上机检测。
2.2.2.3检测乳鼠MLN中树突细胞的分化情况
利用流式细胞术检测小鼠MLN中DCs的数量变化情况，使用抗体CD80+、CD86+、CD11c对其染色，然后用PBS重悬，流式细胞仪上机检测。
2.2.2.4检测乳鼠脾脏中B细胞数量变化情况
利用流式细胞术检测小鼠脾脏中B细胞的数量变化情况，使用表面抗体B220对其染色，完成后再使用固定破膜试剂，打开细胞膜，使用胞内抗体IgA染色。流式细胞仪上机检测。
2.2.5病理学检查新功能型乳酸菌对感染轮状病毒的乳鼠小肠保护情况
将小鼠处死后，取小鼠小肠肠段，置于4％的多聚甲醛中固定7d。固定好后，将小鼠肠段剪切合适的大小，置于包埋盒中，梯度脱水，在进行浸蜡包埋。包埋成功的样品切片，厚度为3um。烤片，然后进行HE染色。选择合适的染色，显微镜观察组织病理变化。
2.2.6 ELISA方法检测乳鼠血清中细胞因子的变化情况
在攻毒后，采集各组乳鼠血清，使用酶免公司检测小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ试剂盒，试验方法按照试剂盒的说明书执行。
2.2.7数据处理与分析
流式细胞图采用Flowjo 6.2.1软件分析。应用GraphPad Prism 9.0.0作图和统计数据，组间差异使用One-way ANOVA统计(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。
2.3结果
2.3.1各组乳鼠攻毒后的临床症状
乳鼠在感染病毒后3天左右，PBS攻毒组开始出现腹泻，在小鼠肛门附近出现水样粪便，在持续1天后，其肛门出现水肿现象。而PAP组、B17组和空载体组均出现黑色、固体粪便。实验结果见图7所示。
2.3.2免疫指标结果
2.3.2.1小鼠脾脏中T淋巴细胞的变化情况
通过流式细胞术方法检测了小鼠脾脏中T淋巴细胞数量的变化，其中对T淋巴细胞CD4 T细胞和CD8 T细胞进行了统计分析。与PBS攻毒组相比，B17组、PAP组以及健康组的CD4T细胞中IFN-γ显著高于PBS攻毒组(P＜0.001)。B17组、PAP组的CD8 T细胞中IFN-γ显著高于PBS攻毒组(P＜0.001)。与PBS攻毒组相比，B17组、PAP组以及健康组的CD4 T细胞中IL-4显著高于PBS攻毒组(P＜0.001)。实验结果见图8所示。
2.3.2.2乳鼠MLN中树突细胞的分化情况
对乳鼠MLN中树突状细胞中CD80、CD86进行流式细胞术检测，结果可见，与PBS攻毒组相比，B17组、PAP组以及健康组的树突状细胞中CD80和CD86显著高于PBS攻毒组(P＜0.001)。实验结果见图9所示。
2.3.2.3乳鼠脾脏中B细胞数量变化情况
流式细胞术检测了小鼠脾脏中B细胞的数量变化情况，通过统计发现，与PBS攻毒组相比，PAP组脾脏B细胞中IgA的数量显著高于PBS攻毒组(P＜0.001)。健康组脾脏B细胞中IgA的数量高于PBS攻毒组(P＜0.05)。实验结果见图10所示。
2.3.3各组乳鼠病理学检查结果
通过对各组乳鼠的小肠进行病理学检查，实验结果可见,在20倍物镜下，PBS攻毒组的乳鼠肠道肠绒毛脱落，黏膜下层中结缔组织增多，十二指肠腺减少，杯状细胞增多，同时，肌层壁变薄。而B17组和PAP组肠绒毛完整，肌层和浆膜层较厚，较为健康。实验结果见图11所示。
2.3.4 ELISA检测各组乳鼠血清中细胞因子的结果
通过ELISA方法检测了乳鼠血清中的细胞因子，在检测TNF-α中，结果可见，与PBS攻毒组相比，PAP组和B17组均显著降低(P＜0.001)。在检测IL-1β中，结果发现，与PBS攻毒组相比，PAP组明显降低(P＜0.05)。在检测IFN-α中，结果发现，与PBS攻毒组相比，PAP组和B17组显著升高(P＜0.001)。在检测IL-6中，结果发现，与PBS攻毒组相比，PAP组明显降低(P＜0.05)。结果见图12所示。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种表达核糖体失活蛋白的乳酸菌，其特征在于，其整合有核糖体失活蛋白基因，其中，所述核糖体失活蛋白基因为核糖体失活蛋白基因PAP或核糖体失活蛋白基因B17，所述核糖体失活蛋白基因PAP的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述核糖体失活蛋白基因B17的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌，其特征在于，所述乳酸菌表达核糖体失活蛋白PAP或核糖体失活蛋白B17，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1或2所述的乳酸菌，其特征在于，所述乳酸菌的出发菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，优选为丙氨酸消旋酶基因缺陷型植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NC8ΔaLr。
4.根据权利要求1或2所述的乳酸菌，其特征在于，所述表达载体为pSIP409-pgsA’(ata)载体。
5.权利要求1至4中任一项所述的乳酸菌的构建方法，其包括：将核糖体失活蛋白基因与表达载体连接后转入感受态细胞中获取重组质粒，将重组质粒转化至出发菌株中。
6.一种组合物，其包含权利要求1至4中任一项所述的乳酸菌，所述组合物为菌剂、药物组合物、药物制剂或饲料。
7.权利要求1至4中任一项所述的乳酸菌或包含所述乳酸菌的组合物在制备抗轮状病毒的产品中的应用。
8.权利要求1至4中任一项所述的乳酸菌或包含所述乳酸菌的组合物在制备防治轮状病毒感染的产品中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述轮状病毒为猪轮状病毒。
10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述产品为菌剂、药物制剂或饲料。
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