CN1264862C - 白喉毒素－促性腺激素释放素嵌合蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于杀伤携带促性腺激素释放素受体之肿瘤细胞的嵌合蛋白质。更具体地说，本发明涉及带有接头或间隔臂序列的，由截短的白喉毒素和促性腺激素释放素分子组成的嵌合毒素分子。本发明进一步涉及制备所说的白喉毒素-促性腺激素释放素嵌合毒素蛋白质的方法及其作为抗肿瘤剂的应用。

Description

白喉毒素—促性腺激素释放素嵌合蛋白质

本发明涉及用于杀伤携带促性腺激素释放素受体之肿瘤细胞的嵌合蛋白质。更具体地说，本发明涉及带有接头或间隔臂序列的，由截短的白喉毒素和促性腺激素释放素分子组成的嵌合毒素分子。本发明进一步涉及制备所说的白喉毒素—促性腺激素释放素嵌合毒素蛋白质的方法及其作为抗肿瘤剂的应用。

嵌合细胞毒素是一类能够识别和特异性地破坏过表达特异性受体之靶细胞的导向性分子。在嵌合毒素分子中，两个或多个以其天然状态存在的分子相互连接或融合在一起，形成具有原各基本构成部分的所有功能性的单一分子。其中，导向部分是可与相应的靶分子(例如细胞表面受体或抗原)结合的配体或抗体。例如，当导向部分是抗体时，嵌合分子便可与携带相应抗原决定基的细胞结合。嵌合分子的另一个基本组成部分是能够将嵌合分子运输到其所针对的靶目标的效应物分子。包括细胞毒素、标记物、放射性核素、配体、抗体、药物、脂质体等在内的效应物分子，一般是指可被递送到靶位点(如靶细胞)并在靶位点发挥特异作用或活性的分子。

特别适于临床治疗应用的效应物分子是细菌或植物毒素，例如假单胞菌外毒素、白喉毒素、霍乱毒素、葡萄球菌内毒素，以及蓖麻毒素和相思豆素等。可使用化学偶联或DNA重组技术使这些毒素或细胞毒性剂连接到作为导向分子的生长因子(如EGF、TGF-α、bFGF等)、细胞因子(如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-13等)，或短肽激素(如GnRH、MSH等)上，以产生兼有靶细胞(如肿瘤细胞)导向功能和细胞毒活性的嵌合毒素分子。这些嵌合分子借助其针对靶细胞的导向能力将整个分子带向靶细胞并利用其毒素部分直接杀伤之。

Pasten等人报导了用于特异性杀伤肿瘤细胞的，包括与假单胞菌外毒素(PEA)融合之白介素4(IL-4)或转化生长因子α(TGF-α)的，或与白喉毒素(DT)融合之白介素2(IL-2)的嵌合蛋白质(Pasten et al.，Ann，Rev，Biochem.61：331～354，1992)。Williams等人描述了其中DT的天然受体结合区被多肽细胞因子白介素2取代的白喉毒素相关融合蛋白质DAB₄₈₆-IL-2。DAB₄₈₆-IL-2是一种依次由下列部分组成的约68KDa融合蛋白质：Met、DT残基1-485，以及可与IL-2受体结合并选择性杀伤携带高亲和性IL-2受体之淋巴细胞的成熟人IL-2的氨基酸残基2-133(Williamset al.，Protein Engineering 1：493～498，1987)。另外，Willams等人还描述了由成熟白喉毒素的前386个氨基酸加484-486位三个氨基酸残基，以及与之融合的成熟人IL-2的残基2-133组成的DAB₃₈₉-IL-2(Williams et al.，J.Biol.Chem.265：11885～11889，1990)。

另一方面，国际专利WO93/15751公开了将促性腺激素释放素(GnRH)与假单胞菌外毒素分子偶联所得到的嵌合蛋白质分子。该专利述及，投用这样的分子可破坏脑垂体中携带GnRH受体的细胞，导致性激素分泌降低，因而可用于动物不育化和抑制类固醇激素相关肿瘤的增殖。美国专利5,488,036和5,707,964描述了借助化学连接剂连接而成的GnRH-DT结合物，以及使用这些结合物使动物不育化和/或治疗如前列腺癌或乳腺癌等性相关疾病的方法。美国专利6,303,123和6,132,720也分别公开了通过化学结合剂或肽键连接的，包括修饰的GnRH和DT，并能够在哺乳动物体内产生抗黄体生成细胞之免疫反应的免疫组合物，以及使用所说的组合物(或结合物)调节哺乳动物黄体类固醇激素相应疾病，或导致动物不育的方法。

再者，随着导向性嵌合毒素研究的不断深入，Dominique等人曾首先利用小鼠白介素3(mIL-3)作为导向剂与作为细胞毒性剂的截短的白喉毒素分子连接，并在两个之间加入一个结构上与用于单链抗体(svFc)的多接头基本上相同的“接头”序列(Gly₄Ser)，成功地制备了融合毒素蛋白质DAB₃₈₉-Gl_y4Ser-mIL-3。体外实验和动物模型实验结果显示，与不带接头序列Gly₄Ser的融合蛋白质(DAB₃₈₉-mIL-3)相比，前者对肿瘤细胞的特异性细胞毒性提高了约5～10倍(Dominique，L.et al.，FEBSLetters 406：157～161，1997)。最近，也有人报导了一种基于接头序列的由假单胞菌外毒素(PEA)和GnRH短肽组成的嵌合蛋白质(L-GnRH-PE66或L-GnRH-PE40)。细胞学和动物实验均有力地证明，通过在导向和毒素分子之间加入多接头而改良的嵌合毒素的体外抑瘤活性提高约1.5～5倍，并且体内抑瘤活性提高约5～20倍(AhmiBen-yehudah et al.，Medical Oncology 16：38～45，1999)。然而，现有技术中迄今尚未见有关主要用于治疗包括腺癌和鳞状细胞癌等肿瘤的基于接头序列和白喉毒素的嵌合蛋白质。

本发明的一个目的是提供一种具有肿瘤细胞特异性结合和杀伤活性的嵌合毒素蛋白质，该蛋白质从N末端到C末端依次包括：蛋氨酸(Met)、白喉毒素的氨基酸残基1-386加上氨基酸残基484-486、连接毒素和导向两个部分的接头序列、促性腺激素释放素的氨基酸残基1-10。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的蛋氨酸可以不存在。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的接头序列是(Gly₄Ser)₂。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的促性腺激素释放素的氨基酸残基可以是在第6和第10位被修饰的。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的修饰包括促性腺激素释放素的第6位Lys被D-Lys取代，并且第10位Gly被乙酰胺取代。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的嵌合毒素蛋白质是以常规固相肽合成方法生产的。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的嵌合毒素蛋白质是以DNA融合和重组技术生产的。

本发明的另一个目的是提供如上限定的嵌合毒素蛋白质在生产抗肿瘤药物中的应用。

图1显示用于表达本发明的嵌合毒素蛋白质的重组质粒的构建图。

图2显示本发明嵌合毒素的SDS-PAGE电泳分析结果。其中泳道1是分子量标记物，泳道2是本发明的嵌合毒素。

图3显示部分纯化的DAB₃₈₉-L-GnRH(●)和对照样品DAB₃₈₉-GnRH(○)竞争与人乳腺癌Mcf-7结合之¹²⁵I-GnRH的能力。图中横座标给出的数值为嵌合毒素蛋白质的浓度。纵座标为B/Bo值，其中B是在不同浓度竞争物存在下与Mcf-7细胞膜结合的¹²⁵I-GnRH的量(cpm)；Bo为在没有竞争物存在时与Mcf-7细胞膜结合的¹²⁵I-GnRH的量(cpm)。

图4显示部分纯化的DAB₃₈₉-L-GnRH对某些性激素反应性或非反应性组织来源的肿瘤细胞及某些正常组织来源的原代细胞培养物的蛋白质合成的影响。图中●代表卵巢癌OVCAR细胞；▲代表子宫颈癌HeLa细胞；■代表人结肠癌HCT-8细胞；○代表小牛睾丸细胞；△代表小鼠胸腺细胞；□代表人正常乳腺细胞。

本发明涉及用于杀伤携带GnRH受体之肿瘤细胞的嵌合蛋白质，特别是涉及带有中间接头或间隔臂的，由截短的白喉毒素(DAB₃₈₉)和促性腺激素释放素分子组成的嵌合毒素分子。本发明还涉及制备所说的白喉毒素—促性腺激素释放素嵌合毒素(DAB₃₈₉-L-GnRH)蛋白质的方法及该嵌合蛋白质在生产抗肿瘤药物中的应用。本发明人在多年来长期从事用于治疗肿瘤的嵌合毒素研究的基础上，借鉴有关现有技术，成功地制备了以截短的白喉毒素分子(DAB₃₈₉)作为毒素部分，以哺乳动物(包括人)促性腺激素释放素(GnRH)作为导向部分，并且在两者之间插入了一个寡肽接头序列(Gly₄Ser)₂的嵌合毒素蛋白质。我们的体外细胞学试验和动物体内实验结果表明，本发明的嵌合毒素较不带有接头序列的相应嵌合毒素大大提高了对肿瘤靶细胞的毒性，显著地改善了对特异性受体的亲和性，从而表现为比不带接头序列的相应嵌合毒素有更大程度的靶细胞蛋白质合成抑制作用，而且这种抑制作用的发挥更为迅速(体内实验结果未示出)。推测这些积极效果是由于在毒素分子和导向分子之间加入接头序列后，有效地改善了嵌合分子的内部折迭，更有利于导向部分接近和结合细胞表面受体，进而更有利于毒素部分进入细胞并发挥其细胞毒效应所致。

白喉毒素(DT)是由535个氨基酸组成的对敏感真核细胞具有强毒性的单链多肽。白喉毒素完整分子包括A和B两个片段。毒素分子首先借助525位上的丝氨酸与细胞表面受体结合，然后经受体介导的内吞作用通过酸性细胞腔隙，向胞液内释放出具有酶促活性的A片段(Moya M.et al.，J.Cell Biol，101：548～559；Sandving，K.etal.，J.Biol Chem.261：11639～11645，1986)。A片段催化延伸因子2(EF-2)的NAD⁺依赖性ADP核糖基化，导致细胞蛋白质合成抑制和细胞死亡。所以，可用各种多肽类激素(如GnRH、MSH)、细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-13)或生长因子(如EGF、TGF-α)取代天然白喉毒素的受体结合区，以产生对携带相应受体分子的真核细胞具有选择性结合能力和细胞毒活性的嵌合毒素。本发明中所使用的即是包括白喉毒素的催化区和跨膜区，而去掉了B片段中受体结合区的前386个氨基酸及第484～486位氨基酸残基的白喉毒素，即通常所说的DAB₃₈₉。

促性腺激素释放素(GnRH)是在调节生殖系统中发挥作用的十肽促激素。GnRH由下丘脑释放后进入血流并被输送到脑垂体，在其中诱导促性腺细胞释放促性腺激素和卵泡刺激素。这两种性腺激素本身又作用于性腺，诱导类固醇生成和配子形成。从腺体释放的类固醇进入血循环进而作用于带有相应受体的各种靶组织。已知乳腺癌、子宫癌和其他一些妇科肿瘤、子宫内膜异位、子宫纤维瘤、前列腺癌和良性前列腺增生等重要疾病均受到促性腺激素和性腺类固醇激素的影响。已有证据表明，卵巢细胞特别是粒层细胞表面具有GnRH受体。而且已证明睾丸细胞表面的受体表达与体内性激素水平有关(Harwood，J.et al.，Endocrinology 107：407～413，1980)。另外，还发现大鼠子宫内膜上具有亲和力很高的GnRH受体(曹咏清等，中国科学B辑1：32～37，1984)。我们以前的研究表明，由GnRH与假单胞菌外毒素融合而成的嵌合蛋白质(GnRH-PE40和GnRH-PE66)对包括HeLa细胞和黑色素瘤细胞(B16细胞系)在内的多种腺癌和上皮细胞癌均表现有明显的细胞毒活性。

用于本发明的GnRH可以是具有天然十肽结构的GnRH，但也可以是第6位Gly被D-Gly取代并且去掉第10位Gly而代之以乙酰胺的GnRH肽类似物。可以使用本领域已知的固相肽合成技术分别合成肽链相对较短(如少于约50个氨基酸)的导向分子和效应物分子。然后，再使一个分子的氨基酸末端缩合到另一个分子的羧基末端上，从而得到两部分融合的分子。例如，可以首先以肽合成方法合成一个由GnRH(十肽)+接头基团[(Gly₄Ser)]₂+间隔臂(Arg-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys)组成的导向分子，然后利用一端含有琥珀酰亚胺酯，并且另一端含有马来酰亚胺的异双功能连接剂，通过还原的末端Cys残基，使该短肽连接到预活化的DT分子上。用于完成连接反应的连接剂可以是N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)、马来酰亚氨基苄甲酰基N-羟琥珀酰亚氨酯(MBS)、N-琥珀酰亚氨基(4-碘乙酰)氨基苯甲酸(SIAB)、琥珀酰亚氨基-4-马来酰亚氨苯基丁酸酯(SMDS)、1-乙基-3-(3-二甲氨基苯基)碳二亚胺(EDC)、双-二氮杂苯肼和戊二醛。

简单地说，为了还原半胱氨酸，首先将合成无误并干燥的肽溶解于含有过量二巯基乙醇(DTT)的0.1M磷酸钠缓冲液中，并将所得溶液室温搅拌4小时。然后再次加入10毫摩尔过量的DTT并在水饱和的氮气环境下继续搅拌2小时。然后在G10 Sephadex柱上层析分离含有还原的半胱氨酸的肽。将DT(10mg)溶解于1ml0.5M PBS(pH6.5)中，并向DT中逐滴加入溶于二甲基甲酰胺的6.15mg N-羟基琥珀酰亚氨马来酰亚氨乙酯(EMCS)，以活化DT。在暗处室温保持90分钟后，在用含有EDTA(0.1mM)的0.1M柠檬酸钠平衡的G50 Sephadex柱上层析分离混合物。通过PM10超滤膜加压浓缩含有EMCS的DT的部分。然后将肽溶液加到活化的DT中，并在暗处于氮气环境下室温保温过夜。使含有足够量游离-SH的短肽与DT分子(溶于含有0.1mM EDTA的0.1M柠檬酸钠缓冲液中)上适当比例的EMCS活化的氨基基团反应，以将预先还原的肽偶联到活化的DT上。可用0.2M碳酸氢铵平衡的G50 Sephadex柱低压层析分离通过EMCS连接到DT上的肽的结合物，并在冻干后-20℃低温保存。可用氨基酸序列分析方法并根据其重量的增加鉴定结合物的肽含量。

根据本发明的一个优选实施方案，本发明的嵌合蛋白质是使用重组DNA技术生产的。总地说来，该方法包括产生编码融合蛋白质的DNA序列、将该DNA连接到处于特定启动子控制下的表达盒中，然后在适当的宿主中表达并分离所需的蛋白质。完成所有DNA操作的基本方法是本领域普通技术人员熟知的(如参见Sambrooket al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，2th ed.，1989)。

可以首先用化学合成方法(如磷酸二酯法，参见Narang et al.，Meth.Enzymol.68：90～99，1979)定向合成单链寡核苷酸，然后以其作为模板在DNA聚合酶存在下与互补序列杂交得到双链DNA。另外，也可以首先克隆亚序列，用适当的限制酶切割后，再将这些片段连接成所需的编码本发明嵌合蛋白质的序列。在本发明的一个特别优选的实施方案中，为了方便起见，可使用DNA扩增法(如PCR方法)，从已知携带所需DT或GnRH编码序列的来源中克隆编码DT的DNA序列(DAB₃₈₉编码序列)和GnRH基因，然后将它们与接头序列一起连接到一个适当的载体中。特别是可根据DNA操作的需要，在用于PCR反应的正链和负链引物中引入适当的限制性核酸内切酶位点及编码(Gly₄Ser)₂接头和/或Arg-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys间隔臂的序列。例如，可以使用这样的引物从已知携带DAB₃₈₉编码序列的质粒pET-28a-DAB₃₈₉-L-EGF中直接扩增得到带有适当的内切酶位点的DAB₃₈₉-L-GnRH片段。可将所得到的片段连接带有同样酶切位点的适当载体中，得到编码本发明DAB₃₈₉-L-GnRH的重组载体。

应特别指出的是，为了进一步改善重组DNA在大肠杆菌宿主内的表达效率，本发明特别将GnRH编码序列中的个别密码子改换成大肠杆菌偏性密码子。

与现有技术不同的是，本发明的嵌合蛋白质中在毒素分子(DAB₃₈₉)和导向分子(GnRH)之间插入了一个(Gly₄Ser)₂接头序列或(Gly₄Ser)₂-Arg-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys接头/间隔臂序列，从而将两个部分分隔开。一般说来，虽然该序列只是使两部分肽序列保持适当的距离和空间关系，但该序列的加入影响了整个嵌合分子的折迭、净电荷及疏水性质，从而改善了分子的空间柔曲性，以有利于嵌合分子导向部分与相应受体的结合及毒素部分的内在化。

可在细菌如大肠杆菌、酵母和各种高等真核细胞(如COS、CHO和骨髓瘤细胞系)等各种宿主细胞中表达编码本发明嵌合蛋白质的核酸序列。可将重组蛋白质基因可操作地连接到各宿主的适当表达控制序列中。对于大肠杆菌来说，表达控制序列包括启动子(如T7、trp和λ启动子)、核糖体结合位点及转录终止信号。对于真核细胞来说，这些控制序列将包括启动子和衍生于免疫球蛋白基因或SV40等的增强子，以及多聚腺苷酸化序列等。

可使用氯化钙转化法(大肠杆菌)和磷酸钙处理或电穿孔(哺乳动物细胞)等已知方法将本发明的重组质粒转化到适当的宿主中。可根据质粒含有的基因所赋予的抗生素抗性来选择被转化的细胞。培养转化体细胞并表达后，可按照本领域已知的方法纯化所需的嵌合蛋白质，这些方法包括硫酸铵沉淀法、超滤、凝胶电泳、凝胶过滤以及离子交换层析和高效液相层析等(参见Guide to Protein Purificafion，Academic Press，NY，1990)。纯化过程中，可使用多克隆抗DT抗体和Vectastain试剂盒(Vector Labs.Buvlingame，Calif.)以免疫印迹法监测纯化产物。经纯化后，嵌合蛋白质的纯度应在95％以上。众所周知，按上述方法生产并纯化的GnRH受体导向性嵌合蛋白质可能具有与天然多肽不同的构象。在这种情况下，可按本领域已知的方法对所得到的纯化产物进行变性和还原处理，然后再使这些多肽重新折迭(如参见Dekinski et al.J.Biol.Chem.268：14065～14070，1993；Bachuner，et al.，Anal.Biochem.205：263～270，1992)。例如，可使用盐酸胍对包涵体蛋白质进行变性并还原处理，然后再用含有氧化态谷胱苷肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液处理，以使蛋白质重折迭。

可使用文献中已公开的各种检测方法鉴定本发明的DAB₃₈₉-L-GnRH嵌合蛋白质的性质和生物学活性。这些方法包括：(1)ADP核糖基化试验：该方法是根据DAB₃₈₉-L-GnRH或DAB₃₈₉-GnRH催化延伸因子的ADP核糖基化能力检测嵌合毒素对哺乳动物细胞蛋白质合成的抑制作用；(2)MTT细胞存活率试验：该方法是根据活细胞将MTT转化成兰紫色甲瓒结晶体的能力检测DAB₃₈₉-L-GnRH或DAB₃₈₉-GnRH对肿瘤靶细胞存活性的影响；(3)[³H]亮氨酸掺入试验：该方法是根据活的靶细胞摄入[³H]亮氨酸的能力检测DAB₃₈₉-L-GnRH或对照样品DAB₃₈₉-GnRH对靶细胞蛋白质合成的影响；(4)受体结合试验：该方法是根据DAB₃₈₉-L-GnRH或DAB₃₈₉-GnRH竞争性置换与靶细胞浆膜结合之¹²⁵I-GnRH的能力检测其特异性受体结合活性；(5)裸鼠移植瘤生长抑制试验：该方法是根据DAB₃₈₉-L-GnRH或DAB₃₈₉-GnRH对裸鼠移植瘤生长的抑制能力检测其对肿瘤靶细胞的细胞毒活性。

可用本发明的DAB₃₈₉-L-GnRH嵌合蛋白质作为基本活性成分，并加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂，制成适于临床抗肿瘤治疗应用的药物组合物。所说的载体或赋形剂包括但不只限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水、葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根据待治疗的疾病的不同，可在本发明的药物组合物中加入一种或多种与本发明的嵌合蛋白质有相似活性，并可发挥辅助作用的其他来源的活性化合物。另外，可在本发明的药物组合物中加入选自人血清白蛋白、低分子量肽、甘氨酸或赖氨酸及金属阳离子(如Mn²⁺和Zn²⁺)的蛋白质保护剂，以及选自聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸及谷胱甘肽等的稳定剂。

可通过胃肠道外、口服和局部给药途径投用本发明的药物组合物，但优选的是胃肠道外途径，如静脉内、肌肉内、皮内、皮下、体腔内及器官腔内给药。本发明药物组合物的有效剂量范围可从几微克到几十毫克/天，但针对每个特定病人的具体用药剂量，应基于个体化原则并根据待治疗疾病或病理状态的性质和严重程度、病人的年龄、体重和其对所用药物的敏感性，以及所采用的给药途径等因素由临床医生确定。

可使用本发明的嵌合毒素或其药物组合物作为治疗剂，用于治疗可依赖该蛋白质的毒性作用得以缓解或消除的特定类型人体细胞的各种疾病。本发明嵌合蛋白质的一种特别优选的用途是用于治疗表面上过度表达GnRH受体之细胞的恶性增生性疾病，特别是各种组织来源的腺癌和鳞状细胞癌，如卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌、结肠癌、乳腺癌及黑色素瘤等。我们的体外和体内试验证明，与不带有接头和/或间隔臂的亲代嵌合分子相比，毒素部分和导向部分之间插入接头序列和/或间隔臂序列的嵌合毒素分子，显著地改善了对各种肿瘤靶细胞的细胞毒活性。虽然有关机理目前尚不完全清楚，但推测这可能与加入接头和/或间隔臂后改善了所得到的嵌合分子的分子构象、带电性及疏水性，从而更有利于分子导向部分与相应细胞表面受体的结合及毒素部分的细胞内在化有关。另外，我们的研究还发现，本发明的DAB₃₈₉-L-GnRH嵌合蛋白质不仅对受所谓下丘脑-垂体-性腺轴控制的类固醇激素反应性肿瘤有明显的体外杀伤活性，而且对某些非性腺器官来源的腺癌细胞如黑色素瘤B16细胞、S-180肉瘤细胞及结肠癌Hct-8细胞系也具有差不多相同的特异性细胞内在化及细胞毒活性。

以下借助实施例进一步举例描述本发明。本领域技术人员可以理解到，这些实施例并不以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。

实施例1：DAB₃₈₉-L-GnRH嵌合蛋白质的制备

本实施例旨在举例简要描述以DNA重组技术制备本发明的DAB₃₈₉-L-GnRH嵌合蛋白质的方法。本实施例中，用于DNA切接、重组质粒构建、细胞培养及表达产物分离与纯化的所有步骤和操作，均按照Sambrook等人的上述文献中所述的方法完成。

1.重组表达质粒的构建：

首先，使用按已知方法人工合成的寡核苷酸引物1：5’-CATGCCATGGCGCTGATGATGTTGTT-3’(SEQ ID NO：1)和2：5’-CGGGATCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCGCATGCGTTTTATGCCCCGGAGA-3’(SEQ ID NO：2)，以携带白喉毒素DT全基因的重组质粒pGEM-T(可购自Novagen公司)为模板，用PCR方法从中扩增得到编码DAB₃₈₉-(Gly₄Ser)₂的DNA片段。用核酸内切酶NcoI和BamHI消化后回收所需的DNA片段，并在T4 DNA连接酶存在下将其连接到已用同样内切酶消化的pET-28a质粒(Novagen)中，得到重组质粒pET-28a/DAB₃₈₉-L。用所得到的连接反应混合物转化感受态大肠杆菌JM105细胞，以大量制备质粒DNA。

然后使用上述合成的寡核苷酸引物1(SEQ ID NO：1)和3：5’-TCAGGCGGAGGTGGATCCCAGCACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTTAAGAATTCCG-3’(SEQ ID NO：3)，并以上述重组质粒pET-28a/DAB₃₈₉-L作为模版进行PCR扩增，得到编码DAB₃₈₉-(Gly₄Ser)₂-GnRH的DNA序列。用核酸内切酶NcoI和EcoRI消化后分离并回收得到用于本发明的DAB₃₈₉-(Gly₄Ser)₂-GnRH片段。然后，在T4 DNA连接酶存在下将其连接到已用同样限制酶消化的质粒pET-28a上，得到本发明的携带白喉毒素DAB₃₈₉(SEQ ID NO：5)、接头序列(SEQ ID NO：6)和促性腺激素释放素(SEQ ID NO：7)之DNA编码序列的重组质粒pET-28a-DLG。

同时，基本上按照上述方法，并使用合成的寡核苷酸引物1和4：5’-TACGGTCTGCGTCCGGGTTAAGAATTCCG-3’(SEQ ID NO：4)，制备携带不带接头序列的DAB₃₈₉-GnRH嵌合蛋白质之DNA编码序列的重组质粒pET-28a-DG。

应特别指出的是，为了进一步改善重组DNA在大肠杆菌宿主内的表达效率，本发明特别将GnRH编码序列中的个别密码子改换成大肠杆菌偏性密码子。

2.嵌合蛋白质的表达及产物的纯化

用此重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(λDE3)菌株，并按常规方法在含有卡那霉素(30μg/ml)的LB培养基中37℃培养被转化的宿主细胞。当OD₆₀₀值达到0.8～1.2时向培养物中加入1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，37℃继续培养3小时，以诱导目的产物的表达。离心收集并于TE(20mM Tris-HCl，pH7.5，1mMEDTA)溶液中破碎细胞后，再次离心(25,000g，20分钟)收集上清，利用饱合硫酸铵分步沉淀法分离并收集目的蛋白质。然后将蛋白质溶液用10mM PBS(pH7.4)彻底透析(换液4次)。离心后，上清即为DAB₃₈₉-L-GnRH粗提物。

将所得的上清液加到已用上述PBS平衡过的DEAE-Sephadex Fast Flow柱(Pharmacia)上，用含有0.05～0.5M NaCl的PB缓冲液(10mM PB pH7.4，1mMEDTA)阶段洗脱，并收集蛋白质活性峰值部分。使用Amicon超滤装置(YM-30)浓缩后，使浓缩物通过上述PB缓冲液平衡过的2.6×100cm Sephacryl S-200柱(Pharmacia)，并用含有0.15M NaCl的PB缓冲液洗脱。收集活性峰值部分并再次过Mono Q-Sepharose柱(Pharmacia)。用NaCl梯度洗脱后收集蛋白峰值部分，并用20mM PBS pH7.4彻底透析，如此得到纯度96％的本发明的DAB₃₈₉-L-GnRH嵌合蛋白质。

按照生产商推荐的方法，使用Vectastain ABC试剂盒(Vector Labs Inc.)和多克隆DT抗血清对纯化的DAB₃₈₉-L-GnRH和DAB₃₈₉-GnRH进行免疫学鉴定。并使用SDS-PAGE方法鉴定本发明DAB₃₈₉-L-GnRH的蛋白质的纯度(参见图2)。

实施例2：DAB₃₈₉-L-GnRH嵌合蛋白质的靶特异性和细胞毒活性试验

本实施例借助蛋白质合成抑制试验检测本发明的嵌合毒素蛋白质对肿瘤的细胞毒活性，并借助细胞膜受体结合试验检测本发明的嵌合毒素蛋白质的特异性细胞受体结合能力。

1.靶细胞膜特异性结合试验

基本上按照Qaycum，A.等人(Br.J.Cancer 62：96～99，1990)所述的方法，检测本发明的DAB₃₈₉-L-GnRH竞争并取代与人乳腺癌细胞浆膜结合的¹²⁵I-GnRH的能力。

将培养的人乳腺癌Mcf-7细胞单层分离到含有10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mMDTT和1mg/ml牛血清白蛋白的缓冲液中以制备细胞匀浆。低速离心去掉大的细胞碎片后，再以25,000g将上清部分4℃离心30分钟，得到细胞浆膜部分。将浆膜悬液按每孔100μl的终体积加于24孔培养板孔中，然后再向各孔中加入5μM ¹²⁵I-GnRH并于37℃温浴1小时。温浴后再向每孔内加入未标记的GnRH或本发明的DAB₃₈₉-L-GnRH或DAB₃₈₉-GnRH对照样品(0.1～100μM)，并继续保温24小时。保温后用上述缓冲液洗样品并用γ计数仪检测结合的配体。结果如图3所示。

从图3所示的数据可以看出，加入渐增浓度的DAB₃₈₉-L-GnRH嵌合毒素后，可随着DAB₃₈₉-L-GnRH浓度的增加而逐渐取代与Mcf-7细胞膜结合的¹²⁵I-GnRH。而且，与不带接头序列的对照样品相比，可见本发明的DAB₃₈₉-L-GnRH嵌合毒素蛋白质具有更强的靶细胞受体结合活性。

2.蛋白质合成抑制试验：

按照Prior等人(Cell 64：1017～1023，1991)所述的方法检测本发明的DAB₃₈₉-L-GnRH融合蛋白质对选择的肿瘤细胞或正常细胞系的蛋白质合成的抑制作用。实验中所使用的靶细胞包括卵巢癌OVCAR细胞、子宫颈癌HeLa细胞和结肠癌HCT-8细胞等肿瘤细胞，以及制备的小牛睾丸细胞、小鼠胸腺细胞和人乳腺细胞等原代正常细胞培养物。

按每孔2×10⁴个细胞将各种被试细胞接种在96孔微量培养板中，在5％ CO₂环境下37℃保温24小时后，向各孔中加入不同浓度的DAB₃₈₉-L-GnRH和作为阳性对照样品的DAB₃₈₉-GnRH，以及作为阴性对照样品的含牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液(BSA-PBS)。所有被试样品均稀释到0.2％牛血清白蛋白-磷酸盐缓冲盐(BSA-PBS)中。37℃保温24小时后，加入[³H]-亮氨酸(Amersham，Corp)(2μCi/孔)继续保温12小时。低温冷冻并快速融解后将细胞收获到玻璃纤维滤膜上，然后用β计数器检测掺入到细胞内的放射活性。以占没有接触毒素蛋白质而只加BSA-PBS的对照细胞的百分掺入量表示的结果如图4中所示。

从图4所示的结果可以看出，本发明的DAB₃₈₉-L-GnRH嵌合蛋白质能够以剂量依赖方式抑制类固醇反应性器官如卵巢和子宫颈来源的肿瘤细胞的蛋白质合成。而且，嵌合毒素对结肠癌细胞也表现有明显的细胞毒活性。另外，从中还可以看出，本发明的DAB₃₈₉-L-GnRH对得自健康供体的正常性腺相关组织(小牛睾丸细胞和人乳腺细胞)、淋巴细胞(小鼠胸腺细胞)来源的原代细胞培养物则未表现有可检测的细胞毒活性。

序列表

(1)一般信息

  (I)申请人：中国人民解放军军需大学

  (II)发明名称：白喉毒素-促性腺激素释放素嵌合蛋白质

  (III)序列数：7

  (IV)通讯地址：

     (A)联系人：朱平

     (B)街道：西安大路175号

     (C)城市：长春

     (D)国家：中华人民共和国

     (E)邮编：130062

  (V)计算机可读形式：

     (A)介体类型：3.5英寸软盘

     (B)计算机：IBMPC

     (C)操作系统：WINDOW98

     (D)软件：WORD98

  (VI)电讯信息：

     (A)电话：86-0431-7962109

     (B)传真：86-0431-7965274

(2)SEQ ID NO：1的信息

  (I)序列特征：

     (A)长度：27bp

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列描述：SEQ ID NO：1

 CATGCCATGG GCGCTGATGA TGTTGTT

(2)SEQ ID NO：2的信息

  (I)序列特征：

     (A)长度：56bp

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列描述：SEQ ID NO：2

CGGGATCCAC  CTCCGCCTGA  ACCGCCTCCA  CCCGCATGCG TTTTATGCCCCGGAGA

(2)SEQ ID NO：3的信息

  (I)序列特征：

     (A)长度：59bp

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列描述：SEQ ID NO：3

TCAGGCGGAG  GTGGATCCCA  GCACTGGTCC TACGGTCTGC  GTCCGGGTTAAGAATTCCG

(2)SEQ ID NO：4的信息

  (I)序列特征：

     (A)长度：29bp

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列描述：SEQ ID NO：4

TACGGTCTGC GTCCGGGTTA AGAATTCCG

(2)SEQ ID NO：5的信息

  (I)序列特征：

     (A)长度：1167bp

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列描述：SEQ ID NO：5

ATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTAC

CACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTG

GTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGAC

GCTGCGGAATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCA

AAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTAT

TAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGA

GTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGG

GGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACT

TGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGATTATATGGCTC

AAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTCATGCATAAATCTT

GATTGGGATGACATAAGGGATAAAACTAAGACAAAGATAGAGTCTTTGAAAGACCATGGCC

CTATCAAAAATAAAATCAGCGAAAGTCCCAATAAAACAGTATCTGAGGAAAAAGCTAAACA

ATACCTAGAAGAATTTCATCAAACGGCATTAGAGCATCCTGAATTGTCAGAACTTAAAACCG

TTACTGGGACCAATCCTGTATTCGCTGGGGCTAACTATGCGGCGTGGTCAGTAAACGTTGCG

CAAGTTATCGATAGCGAAACAGCTGATAATTTGGAAAAGACAACTGCTGCTGTTTCGATACT

TCCTGGTCTAGTTAGCGTAATGGGCATTGCAGACGGTGCCGTTCACCACAATACAGAAGAG

ATAGTGGCACAATCAATAGCTTTATCGTCTTTAATGGTTGCTCAAGCTATTCCATTGGTAGGA

GAGCTAGTTGATATTGGTTTCGCTGCATATAATTTTGTAGAGAGTATTATCAATTTATTTCAAG

TAGTTCATAATTCGTATAATCGTCCCGCGTATTCTCCGGGGCATAAAACGCATGCG

(2)SEQ ID NO：6的信息

  (I)序列特征：

     (A)长度：30bp

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列描述：SEQ ID NO：6

GGTGGAGGCG GTTCAGGCGG AGGTGGATCC

(2)SEQ ID NO：7的信息

  (I)序列特征：

     (A)长度：30bp

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列描述：SEQ ID NO：7

CAGCACTGGT CCTACGGTCT GCGTCCGGGT

Claims (6)

1.一种具有肿瘤细胞特异性结合和杀伤活性的嵌合毒素蛋白质，该蛋白质从N末端到C末端依次包括：蛋氨酸(Met)、白喉毒素的氨基酸残基1-386加上氨基酸残基484-486、连接毒素和导向两个部分的接头序列、促性腺激素释放素的氨基酸残基1-10。

2.根据权利要求1的嵌合毒素蛋白质，其中所说的蛋氨酸不存在。

3.根据权利要求1的嵌合毒素蛋白质，其中所说的接头序列是(Gly₄Ser)₂。

4.根据权利要求1的嵌合毒素蛋白质，其中所说的促性腺激素释放素的氨基酸残基是在第6和第10位被修饰的。

5.根据权利要求4的嵌合毒素蛋白质，其中所说的修饰包括促性腺激素释放素的第6位Lys被D-Lys取代，并且第10位Gly被乙酰胺取代。

6.根据权利要求1的嵌合毒素蛋白质在生产抗肿瘤药物中的应用。

Images