CN1340057A - 干扰细胞内信号发生的合成多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗癌症的组合物和方法。本发明提供的肽,是来自作为SH2和SH3基元的小的标准结构域,这些结构域在蛋白－蛋白互作中起到关键作用,这种互作对于胞内定位、磷酸化前底物的补充、底物对受体复合物的再分配、以及催化活性的失活或活化,是非常重要的。为了胞内易位和癌的靶向,将这些肽与以前用于这些方法的棕榈酸连接。本发明用于抑制癌细胞中的信号途径,比如肝细胞癌、子宫颈癌、结肠腺癌、以及纤维囊瘤。

Description

干扰细胞内信号发生的合成多肽

本发明背景

本发明涉及合成来自与Src家族蛋白激酶结合的基元的多肽，以及含有所述多肽的用于治疗癌症和免疫抑制药物。

细胞的许多生物和生理的活化，是由外部信号控制的，这些信号刺激或抑制细胞内的事件。通过这些事件，外部信号传递到细胞中，引起细胞内的反应，此被称为信号传导。在各种细胞外因子(例如，激素、粘连分子、细胞因子等等)的细胞外连接后细胞内的信号传导包括蛋白激酶的活化。为了活化这些分子，最初需要受体-靶目标的相互作用，这些互作激发与另外的分了互作的级联，包括细胞内多途径传递信号事件。

已知有大约400种不同的蛋白激酶，而几年之后，蛋白激酶的总数有可能增加一倍(Hardie G等，(1995)The protein kinase Facts Book，London：Academic)。许多涉及信号传导的蛋白激酶是由多个结构域组成的，其中一些具有催化活性，有些与其他细胞蛋白结合。对于蛋白激酶，初级序列同源性的主要区域存在于催化结构域中，被称为Src同源性1(SH1)，蛋白激酶的SH1结构域可以进一步划分为11个亚结构域，它们不仅为酶所有，而且为所有的蛋白激酶所具有。被发现的下一个最普遍的功能结构域是Src同源性2(SH2)(Sadowski等(1986)，Mol.Cell.Biol.6：4396-4408)和Src同源性3(SH3)结构域。SH2和SH3结构域在细胞信号级联中介导蛋白-蛋白间的互作，并且在Src家族之外的许多蛋白中也被发现。最近，对SH2和SH3结构域在信号传导中结构与功能的广泛研究进行了全面的叙述，这就是pTy-结合(PTB)结构域(P Blaikie等，(1994) J.Biol.Chem.269：32031；ZhouM等，(1995) Nature 92，7784-7788)。

SH2结构域大约有100个氨基酸，能够高亲和地与含磷酸酪氨酸的多肽序列结合，这种含磷酸酪氨酸的多肽序列促进依赖于蛋白修饰的蛋白-蛋白互作(Pawson T等(1992)Cell.70：694-704)。

随后发现，SH2结构域与特定的磷酸化的酪氨酸残基结合，包括Ras GTP酶活化蛋白(GAP)、磷脂酰肌醇3′-激酶(PIK)、以及磷脂酶C-γ(Cantley等，(1991) Cell 64：281-320)。还有，SH2结构域对将这些蛋白定位到活化的受体上起作用，并且参与调节酶的活性(O′Brien等，(1990) Mol.Cell.Biol.10：2855-2862；Roussel等，(1991)Pro.Natl.Acad.Sci.USA 88：10696-10700；Bucker等，(1992)EMBO.J.11：3469-3479)。

已经发现，根据SH2结构域合成的磷酸肽，阻止磷脂酰肌醇3′-激酶与血小板衍生的生长因子(PDGF)受体的结合(Bscobedo等，(1991)Mol.Cell.Biol，11：1125-1132；Fanll等，(1992)Nature 352：726-730)。另外，突变研究表明，磷脂酰肌醇3′-激酶、Ras GAP和PLC-γ的SH2结构域，识别PDGF受体中不同的磷酸肽序列(Bantl等，(1992)Cell69：413-423；Kazlauskas等，(1990)Science 247：1578-1581；(1992)Mol.Cell.Biol.12：2534-2544)。

蛋白激酶之间另一个共同的特点是Src同源性3(SH3)结构域，SH3结构域长度由大约60个残基组成，与富含脯氨酸的肽序列结合，该结构域具有共有序列PXXP(此处，X为疏水氨基酸，如Ile、Leu、Pro、Met、Phe、Tyr)，它具有左手的多聚脯氨酸II型螺旋结构(Feng等，(1994)Seience 266：1241-1247)。SH3结构域与多聚脯氨酶螺旋的结合还促进蛋白-蛋白互作，在确切的亚细胞位置形成有功能的寡聚复合物，所述位置通常是在与其他标准结构域的连接处(Pawson等，(1995)Nature 373：573)。蛋白可以有多个SH3结构域，有可能使几种不同的配体成簇，而且邻近富含脯氨酸配体的Ser或Thr磷酸化可以影响SH3结构域的互作(Chen等，(1996)J.Biol.Chem 271：6328)。有趣的是，在某些事例中，SH3-配体的互作可以被保守酪氨酸的磷酸化负调控(Park H等，(1996)Immunity4：515-525；Broome MA等，(1996)J.Biol.Chem 271：16，798-806)。

Shc和胰岛素受体底物1(1RS-1)蛋白的pTyr结合(PTB)结构域识别磷酸肽基元，其中形成β折叠(常常带有共有序列NPXpY)的残基处在pTyr之前(Blaikie等，(1994)J.Biol.Chem.269：32031)。特异性取决于距pTyr氨基末端5到8个残基的疏水氨基酸(Trub等，(1995)J.Biol.Chem.270：18205)。因此以不同方式识别它们的配体，形成SH2结构域(Zhou等，(1995)Nature378：584)。PTB结构域所起的作用与SH2结构域有点不同，因为发现它们主要是停靠蛋白的组分，停靠蛋白将额外的信号发生蛋白补充到已活化受体的附近。X11、FE65和Numb等蛋白的PTB结构域能够结合非磷酸化肽的基元，表明PTB结构域主要是肽识别元件，不像SH2结构域看来专门识别pTyr。

作为治疗靶目标而受到人们注意的蛋白-蛋白互作包括：偶联免疫应答受体所必需的SyK家族激酶的SH2结构域，参与偶联受体和下游效应子的Src家族激酶的SH2和SH3结构域，以及Shc功能所必需的PTB结构域。开发这些结构域的抑制物所面临的挑战，包括需确认出对每一种蛋白有高度特异性的化合物、证实膜的通透性和高亲和力以及具有合适的药物动力学和安全性。

蛋白-蛋白互作涉及细胞内信号传导的每一个步骤，因此，通过补充其他细胞蛋白的受体，原生质膜上的信号在细胞质中起动；在细胞质中，信号散布到不同的细胞位置；而在细胞核中，信号被传导到涉及复合物中控制转录的其他蛋白，调控特定基因的转录。

Src家族成员享有共同的调节机制，但细胞表达和定位却不同。已经确定9个Src家族酪氨酸激酶(Src、Lck、Hck、Fyn、Fgr、Yes、Blk、Lyn及Yrk)(Brown M(1996)Biochem.Biophys.Acta 1287，121-149)。Src家族成员高度保守的调节机构由两种肽结合组件(module)组成：Src同源结构域SH2和SH3。这些组件与分别包含磷酸酪氨酸和多聚脯氨酸II型螺旋的靶目标结合，在信号发生过程中介导蛋白-蛋白复合物的形成。累积的证据表明，在酪氨酸磷酸化位点和多聚脯氨酸丰富位点周围所选择的序列，能够分别被含有SH2结构域和SH3结构域的蛋白所识别。而这种蛋白-蛋白互作通过介导蛋白复合物的功能和/或溶解而传播细胞内的信号。据认为SH2对磷酸蛋白的识别和SH3对多聚脯氨酸的识别的特异性，完全来自于这些结构域的特性以及周围氨基酸序列的存在。

应用与小的调控结构域进行反应的肽，抑制蛋白-蛋白互作，可以调控与细胞增殖生物或生理相关的信号发生现象。例如，引发与细胞增殖和分裂有关的基因表达的细胞内或细胞外信号被阻止，从而不被传递到细胞核中，导致细胞生长终结，并因此细胞死亡。

据此，涉及与受体偶联并传送到下游效应子的蛋白的SH3结构域的潜在抑制物，应该达到对每一种蛋白有高度的特异性和亲和性的要求，并且具有合适的药物动力学和安全性能。

本发明人经过研究，提供新的对SH3结构域具有高亲和力的肽，从而抑制信号发生途径中蛋白-蛋白互作。作物研究的结果，他们发现，包含氨基酸序列(I)的合成肽，对SH3结构域表现出高亲和力，而且，如果将棕榈酸偶联到此肽的N-末端，所产生的肽进入细胞的通透性提高。此肽和N-棕榈酰肽可以有利地用于治疗癌症和与免疫抑制有关的疾病。

本发明概述

由此，本发明提供新的抑制剂肽，它们对SH3结构域显示出高亲和力，能够干扰或阻止由含SH3的蛋白介导的细胞内信号途径，同时具有合适的药物动力学和安全性能。

本发明还提供这些肽作为治疗癌症或与免疫抑制有关疾病的试剂的用途。

本发明还提供治疗癌症和与免疫抑制相关疾病的药物组合物，这些药物组合物含有本发明的肽。

附图的简要描述

图1显示本发明抑制剂肽对SH3-GST融合蛋白的结合亲和力。

图2是显示棕榈酰化抑制剂肽在细胞中易位的荧光显微照片。

图3是显示棕榈酰化抑制剂肽在细胞中分布的聚焦显微照片。

图4是显示棕榈酰化抑制剂肽对酪氨酸磷酸化的效应的电泳。

图5是显示棕榈酰抑制剂肽对信号发生途径中各组分磷酸化的效应的电泳。

图6是显示抑制剂肽对细胞内钙浓度的效应的流式细胞光度术。

图7显示抑制剂肽对癌细胞生长的效应，由MTS分析测定。

图8是显示经本发明抑制剂肽处理后癌细胞数量和形态发生变化的显微照片。

本发明的详细描述

本发明的合成肽，衍生于与某些蛋白结合的基元，例如，Src家族激酶(此后，称为“肽”或“抑制剂肽”)，具有下列式(I)所代表的部分或全部氨基酸序列：

                    KX₁X₂X₃PX₄X₅PX₆PX₇其中，K为赖氨酸；

P为脯氨酸；

X₁为谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸或赖氨酸；

X₂为精氨酸、赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；

X₃、X₄和X₅彼此可以相同或不同，各自独立地为脯氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；

X₆为天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸或赖氨酸；

X₇为天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或赖氨酸；并且这些氨基酸残基中的某一个可以连接1个或4个氨基酸残基，在连接一个氨基酸的情况下，这个氨基酸为酪氨酸，pTyr(磷酸酪氨酸)，而在连接4个残基的情况中，这些氨基酸可以是酪氨酸或磷酸酪氨酸为第一个残基，天冬氨酸或谷氨酸为第二和第三个残基，疏水氨基酸如异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸为第四个残基。

具有本发明序列1全部或部分的代表性肽可以包括SEQ.ID.NO1到12，它们在序列表中列出。

本发明的这些肽，在细胞中结合靶目标蛋白，利用表达SH3的GST融合蛋白以及某些退化的细胞如表达Src家族激酶的癌细胞，通过离体结合分析进行了确定。

根据本发明，这些肽可以化学制造或通过基因重组技术制造，经修饰如缺失、替换和添加产生它们的变体和衍生物。它们最好有4到20个氨基酸残基。

含有抑制剂肽的药物组合物，可以以溶液、胶粒、脂质体或悬浮在合适的佐剂中的形式来应用。为了增强抑制剂的肽向细胞中转移及靶向癌细胞，可以将其连接到脂质上。在优选的实施方案中，可以将单个或两个棕榈酸连接到肽的N-末端赖氨酸。

根据本发明，药物组合物可以经肠胃外或局部途径给药到人，而优先地，以溶液或悬浮在含水介质中的形式给药到人。

抑制剂肽可以用于抗肿瘤治疗，用于治疗肝细胞癌或其他表达SH3结构域的癌症，以及用来抑制癌症患者临床手术后癌细胞的转移。术语的定义

在本专利说明书和权利要求书中，所用术语的含义如下：

在本说明书中术语“肽”与“寡肽”可互换使用，表示一系列残基，通过α氨基与邻近氨基酸的羧基之间典型的肽键彼此相连。对于本发明，寡肽的长度并不是关键，只要保持正确的序列即可。一般，肽的长度少于约50个残基，但重复连接形式除外(比如，SH2-SH2-SH2……n，SH3-SH3-SH3……n)，而通常由大约4个到20个之间的残基组成，最好是13或16个残基。

“抑制剂肽”是包含SH2和SH3结合结构域的肽，因而此肽与细胞内带有这些结构域的蛋白结合，并且能够阻止或干扰信号途径事件。因此，在癌细胞的变体中，抑制剂肽能够结合到合适的胞内蛋白上，如与蛋白激酶以及与细胞增殖和分裂的信号途径有关的信号过继蛋白结合。

术语“双棕榈酸肽”是指与脂质(棕榈酸)连接的抑制剂肽形式。棕榈酰化作用被设计用来增强抑制剂肽向细胞中转移和在体内靶向癌。

“癌”包括人/动物癌的变体，它们表达含有SH2、SH3和PTB结构域的细胞内蛋白。

此外，根据WIPO标准ST.25(1998)，附录2，表3，用三字母编码表示氨基酸残基。

序列表中的免费文本(<223>)

SEQ.ID.NO.1-SEQ.ID.NO.12：以高亲和力特异性结合到SH3结构域的肽，因此抑制细胞内信号的传送。

SEQ.ID.No.13：对比肽

下面将对本发明进行更详细的描述。

本发明提供能够抑制癌中信号传导途径的肽。抑制剂肽的亚结构域来自蛋白的多个结构域，这些蛋白与特定的蛋白结合如Src家族激酶，且对SH3结构域表现出高亲和力，因而通过抑制由SH3结构域介导的细胞内信号途径，可用来抑制/排斥癌细胞。

本发明的肽可以合成制备或通过重组DNA技术制备。虽然包含本发明肽的结构域优选基本上不含自然存在的宿主细胞和癌细胞，如淋巴细胞和各种癌细胞、其它宿主细胞、蛋白及其片段，但在一些实施方案中，肽可以经合成连接到微粒的天然片段上。肽可以通过重组DNA技术制备，其中应用表达载体，该表达载体中插有具有编码此肽DNA序列的DNA。构建这样的载体，以便将之转到癌诱导位点，转染到合适的宿主中，然后根据Sambrook等(分子克隆(Molecular Cloning)，1989，冷泉港，冷泉港实验室出版社)描述的方法，在适当的条件下表达。另外，可以从包含一个或多个本发明肽片段的融合蛋白中制备这些肽。

由于本文所述长度的肽的编码序列可以通过化学技术合成，例如，Matteueei等的磷酸三酯方法，(J.Am.Chem.Soc.103：3185，1981)，因此通过对那些编码天然肽的序列进行合适的碱基替换，就可以简单地进行修饰，然后给编码序列提供合适的接头，并连接到本领域通常可得到的表达载体中，再将这些载体用于适合的宿主，产生所需的融合蛋白。现在可以得到大量的这些载体和适合的宿主系统。为了表达融合蛋白或多肽，给编码序列提供可操作连接的起始和终止密码子、启动子和终止子区及常用的复制系统，以便提供一个表达载体，用于在理想的细胞宿主中表达。

多肽或肽可以是各种长度，不论是它们的中性(不带电荷)形式还是盐的形式，它们可以没有任何修饰，或者可以受到修饰如糖基化、侧链氧化或磷酸化，只要它们的生物学活性得以保留即可。肽具有的长度为大约50个氨基酸残基或更少，优选为4到20氨基酸残基，而最优选为8到16个氨基酸残基。

本发明的肽包含参与细胞内信号级联的结构域，这些肽在活体中的活性可以通过修饰得以提高，如脂质化、糖基化或连接到其他肽上。比如，与脂质链的共价联接如棕榈酸与肽的联接将提高细胞内的易位，并且通过与脂质的亲和力而靶向癌。另外，用靶向癌或特定组织的载体/病毒载体，编码成这些本发明的形式，也可用于同样的目的。为了通过增强与细胞膜脂质的亲和力，提高肽向细胞中转移，脂质可以连接到肽上，这些脂质可包括C₁₈饱和脂肪酸，或C₁₆或C₁₈不饱和脂肪酸。

通过扩展或减少氨基酸残基可以修饰这些肽，例如通过氨基酸的添加或缺失。通过改变氨基酸顺序或某些残基的组成也可修饰本发明的肽，只要这些修饰影响肽的活性即可。本发明所属领域的技术人员可容易地意识到，对生物学抑制活性必需的氨基酸残基(“必需氨基酸”)，例如关键的接触位置或保守的残基，为了保持它们的抑制活性而不能受到这种改变。自然存在于蛋白中的非必需氨基酸不必受到限制，如L-α-氨基酸，β、γ、δ-氨基酸，以及许多L-α-氨基酸的衍生物。

典型地，应用一系列带有单个氨基酸替换的肽，以确定静电电荷、疏水性等对结合的影响，比如，沿肽的长度方向进行了一系列带正电荷(如赖氨酸或精氨酸)或负电荷(如谷氨酸)氨基酸的替换，揭示出对含有信号发生组件SH2或SH3的细胞内激酶/过继蛋白有不同形式的敏感性，残基替换或添加的数量和类型，取决于必要接触点与某些功能特性之间的间隔需要，所述功能特性是sough(如疏水性对亲水性)，对比本发明完整肽的亲和力，对于参与信号途径的合适的细胞内靶蛋白，通过这种替换，结合亲和力也可以得到提高。在任何情况下，这些替换应该使用氨基酸残基或选择的其他分子片段，以避免出现(例如)可能瓦解结合的空间和电荷干扰。

氨基酸替换一般是单个残基的替换。替换、缺失、插入或其任何组合，可合用来激活最终的肽。替换的变体即是，肽的至少一个残基已经去除，而不同的残基插入到这个位置中。当需要细致地调整肽的特性，一般是根据下面的表1进行这些替换。

                  表1

        氨基酸替换的合适残基

原始残基                   示例替换

Ala                         Ser

Arg                         Lys

Asn                         Gln：His

Asp                         Glu

Cys                         Ser

Gln                         Asn

Glu                         Asp

Gly                         Pro

His                         Asn：Glu

Ile                         Leu：Val

Leu                         Ile：Val

Lys                         Arg：Gln：Glu

Met                         Leu：Ile

Phe                         Met：Leu：Tyr

Ser                         Thr

Thr                         Ser

Trp                         Tyr

Tyr                         Trp：Phe

Val                         Ile：Leu

替换变化引起蛋白功能明显改变，例如对激酶或过继蛋白的亲和力而言。替换对肽主链结构可以产生大的影响，例如对片层或螺旋构象，在靶点分子的电荷或疏水性、或者侧链的庞大造成影响。一般希望肽的特性产生最大变化的替换就是亲水残基如丝氨酸被疏水残基如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸所替换；带正电侧链的残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸被带负电的残基如谷氨酸或天冬氨酸替换；或者带大侧链的残基被不带侧链的残基如甘氨酸替换。

所有的肽，其中的一个或几个氨基酸，用D-氨基酸替换、或用氨基酸的衍生物如羟脯氨酸、羟赖氨酸、胱氨酸、甲状腺素、正亮氨酸或焦谷氨酸替换，或用甲基化的氨基酸替换，都包括在本发明的范围之内。另外，C-末端有酰胺、羧基或酯的肽也落入本发明的范畴，只要它们能够完成本发明的目的即可。

本发明的肽还可以包括1个或多个残基的同型配位体。此处定义的同型配位体是2个或多个残基的序列，由于第一个序列的空间构型而可以为第二个序列所替换。该术语具体包括本领域技术人员熟知的对肽主链的各种修饰，这些修饰包括酰胺氮、α-碳、酰胺羰基、酰胺键的完全取代、扩展、缺失或主链交联。

用各种非天然的氨基酸类似物修饰肽，对于提高肽在活体中的稳定性是非常有用的。可以用很多方法来分析稳定性，例如，肽酶和各种生物介质如人的血浆和血清，一直被用来测定稳定性。

本发明还提供含有一种或多种本发明的肽作为活性成分的药物组合物。

在一些实施方案中，可以期望在本发明的药物组合物中，至少包含一种组分；使用肽脂质化方法该组分有助于促进细胞内易位和靶向癌。脂质已经被确认为能够协助细胞内易位以及部分靶向癌的试剂。例如，棕榈酸残基能够附着到赖氨酸残基的α和ε氨基上，然后比如通过一个或多个连接残基如Gly、Gly-Gly、Ser或Ser-Ser连接。然后将脂质化的肽以胶粒的形式、或掺入到脂质体中，或在佐剂如不完全弗氏佐剂中乳化的形式进行直接注射。在优选的实施方案中，非常有效的易位和靶向包括附着到赖氨酸α和ε氨基上的棕榈酸，本发明的抑制剂肽可以偶联到如Pal₂K(棕榈酰-棕榈酰-Lys)或Pal₃CK(棕榈酰-棕榈酰-棕榈酰-Cys-Lys)，产生的脂肽就可以向待治疗个体给药，以特异性抑制癌生长。

为了靶向癌细胞，肽可以掺入到脂质体中，该脂质体含有对靶标癌细胞上的细胞表面决定簇有特异性的抗体或其片段。

对于固体配方，可以使用可药用常规无毒固体载体，这些载体可以包括甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等，但不仅限于此。对于口服，将根据本发明的一种或多种肽作为活性成分按占配方总重量10-95％，最好是25-75％的量加入到以上所列的载体中，得到口服配方。

本发明的药物组合物还可以通过肠胃外或局部途径向病人给药，例如，通过静脉内、皮下、皮内、肌肉内途径等。

对于气雾剂给药，最好是将本发明的肽分成微细的形式，与表面活性剂和抛射剂一起使用。肽的典型用量为配方的总重量的0.01～20％，而最好是1％-10％重量。

本发明药物组合物的给药量并不限定在某个范围内，本领域的技术人员根据病人的病情、症状、年龄和体重，毫不费力就可以确定。但是，一般的范围为大约5-100mg/kg/天，尤其为大约10-50mg/kg/天，最好是大约30mg/kg/天。

本发明的肽或含有该肽的药物组合物在活体中可以表现生理活性，用来自服用了该肽或药物组合物的病人的血样或骨髓样品可以活体测定这种生理活性。

本发明将通过有代表性的实例进行更详细的描述，但应以任何方式认为这是限定本发明的范围。

实施例实施例1：肽的合成

抑制剂肽(SEQ.ID.NO：1)通过固相肽合成方法进行合成，使用Applied Biosystems 430A合成仪、我们自己的Fmoc程序和来自Novabiochem(Laufelfingen，Switzerland)带有侧链保护基团的Fmoc L-氨基酸：Lys(Boc)、Arg(Mtr)、Asp(OtBu)、Tyr(tBu)。

用1克承载了Fmoc-Asp-OH(0.35mmol)或Fmoc-Arg-OH(0.35mmol)的对苄氧苯甲醇树脂启动每次的合成之后，进行下面的合成循环：在N-甲基吡咯烷酮中的55％的六氢吡啶进行N^α-脱保护(1×2分钟，1×5分钟)；在N-甲基吡咯烷酮(6ml)中的二异丙基碳二亚胺(1.5mmol)和1-羟基苯并三唑(1.5mmol)预活化Fmoc-AA-OH(1.5mmol)，随后偶联1.5小时。用N-乙基吗啉(在N-甲基吡咯烷酮中含5％)清洗后，重复预活化和偶联。用在N-甲基吡咯烷酮中的乙酸酐(2.5mmol)和二异丙基乙胺(1.2mmol)对非反应氨基基团带帽。在树脂连接的肽合成完毕后，通过三氟乙酰解切割去除分析肽探针，并且用高效液相色谱、FAB质谱氨基酸分析进行检查。

重复同样的方法合成肽SEQ.ID.NO.2到SEQ.ID.NO.12。实施例2：脂质化

连有肽的树脂SEQ.ID.NO.1与棕榈酸的偶联，在苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-磷鎓六氟磷酸盐/N-羟基苯并三唑/N-甲基吗啉(2∶1∶2)中进行，其用量为超过肽树脂的5倍。3小时之后，用甲醇洗涤脂肽-树脂(3次)，经茚三酮测试完全偶联达99％。偶联较少的肽再次偶联14小时，使用超过5倍量的苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-磷鎓六氟磷酸盐/N-羟基苯并三唑/N-甲基吗啉(2∶1∶2)。在含有茴香硫醚(thioanisol)(250μl)和1，2-乙二硫醇(150μl)的三氟乙酸(4ml)中，4小时之内将脂肽从树脂中分离出来，蒸发干滤液，用乙酸吸取残留物，并倾注到搅拌的冷乙醚中。沉淀出的脂肽用乙醚洗三次，通过含有冷丙酮(20ml)的三氟乙醇/氯仿(1∶3)(3ml)沉淀进一步纯化，随后加几滴水。脂肽从叔丁醇/水(3∶1)中冻干。氨基酸分析和FAB质谱分析证实了脂肽的同一性，每个脂肽在SEQ.ID.NO.1到SEQ.ID.NO.12的肽的N-末端赖氨酸上带有棕榈酰-棕榈基。参考实例：GST融合蛋白的制备

为了评估目前这些肽的抑制活性，对抑制剂肽抑制特定肽基元与SH3结构域之间互作的能力进行了确定。不同的SH2或SH3结构域用pGEX载体系统(Pharmacia)作符合读框的亚克隆，产生的pGEX-E2构建体编码谷胱甘肽-S-转移酶(GST)/SH2和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)/SH3融合蛋白。经转化将pGEX构建体导入E.coli中，转化物在有IPTG的液体培养基(LB)中生长，用标准方法纯化GST/E2融合蛋白(Current Protocols in molecular Bionology，Ausubel等编著，NY：John Wiley ％ Sons，1991)。简言之，将细胞沉淀，用缓冲液A重悬(50mM TRIS(pH7.5)，2mM EDTA，250mM NaCl，5％甘油(V/V)，1％吐温(V/V)，1％ Triton X-100(V/V)，加2mM PMSF和15mM 2-疏基乙醇。用声处理或微型流化器机械破碎细菌，溶菌物的可溶性部分用已在缓冲液A中水合的谷胱甘肽-琼脂糖微珠吸收，4℃下吸收30分钟到14小时，在此期间通过摇动使微珠保持悬浮状态，最后，微珠用冷的缓冲液A洗3次，随后用50mM Tris pH8.0洗5次。实验实例1：肽与SH3结构域结合的测定

为了评估实施例1和2中制备的肽与SH3结构域结合的能力，将肽(“P1”，SEQ.ID.NO.1)及其棕榈酰化产物“LP1”)偶联到氨甲基香豆素乙酸酯(“AMCA”)上。

每种肽5mg和AMCA溶解到1ml 50mM的碳酸氢钠缓冲液中(pH8.5)，反应前向其中加入5mg/ml二甲亚砜(DMSO)。将50-100μl AMCA逐渐加到反应混合物中，同时搅拌或振荡，产生的混合物放在4℃下反应一天并不断搅拌。反应之后，通过凝胶过滤将偶联了AMCA的肽从未反应的AMCA中分离出来。

然后，AMCA-肽复合物(0.075-1.4μM)与3.12μM GST/SH3融合蛋白反应，反应混合物在室温下放置1分钟。AMCA-肽复合物的肽与GST/SH3融合蛋白的SH3结构域之间的结合亲和力，通过使用共振能量转移法和双激光分光荧光法(PTL-3965，日本)进行测定。这种方法是根据与AMCA结合的肽在350-450nm处发射荧光的现象。相对转移效率如下进行确定：在280nm处照射含有GST/SH3融合蛋白和肽-AMCA复合物的样品，用280nm处的照射激发GST-SH3融合蛋白中的色氨酸，而AMCA-肽复合物又由被激发的色氨酸放出的350nm光所激发而发出450nm荧光。

结果，当肽结合AMCA，然后结合GST融合蛋白的SH3结构域时，色氨酸经280nm发出的350nm荧光降低，与此同时偶联肽的AMCA的450nm荧光增加(图1)。这可以解释为，复合物的肽结合GST/SH3融合蛋白，吸收GST/SH3融合蛋白中色氨酸产生的波长350nm的荧光，因此使得复合物中的肽有可能放射450nm的荧光。

根据复合物中肽的数量，AMCA放射的450nm荧光成比例增加，而色氨酸放射的350nm荧光减少，而GST/SH3融合蛋白的450nm荧光没有表现出这种依赖性。因而这就意味着实施例1和2中的肽对SH3结构域具有高亲和力。实验实例2：抑制剂肽向细胞中易位的测定

为了检测棕榈酰化肽能否调节细胞内的信号途径，测定了它们对T细胞受体(“TCR”)介导的信号途径的作用。CD3和ζITAM(基于活化基元的免疫受体酪氨酸)经Src激酶如Lck磷酸化，激活TCR介导的信号途径，然后磷酸化的CD3和ζITAM与ZAP-70反应，使ZAP-70的酪氨酸磷酸化。

Jurkat细胞和本发明的肽(棕榈酰化的肽SEQ.ID.NO.1，“LP1”)，棕榈酰化(“LPc”)或非棕榈酰化(“Pc”)的对比肽SEQ.ID.NO.13)的混合物，37℃下温育12小时，细胞溶胞产物用针对磷酸酪氨酸的抗体进行探测。

结果如图4所示，对于LP1处理组，在LP1为100μg/ml或400μg/ml，细胞内酪氨酸的磷酸化作用急剧下降(图4B中泳道b和c)，同时LPc或Pc处理组表现基本的磷酸化水平。LP1的浓度在2μg/ml与200μg/ml之间变化，温育时间为6小时，此时的结果由图4A显示，酪氨酸的磷酸化在50-100μg/ml浓度下降低(图4A中泳道c和d)，在大约200μg/ml浓度下急剧降低(图4A中泳道3)。

这些结果证明，本发明的肽能够有效地抑制由酪氨酸磷酸化启始的信号途径的早期，另外，尽管图中没有显示，但棕榈酰化肽(LP1)比非棕榈酰化的肽对酪氨酸磷酸化表现出更高的抑制效果，这说明棕榈酰化作用能够提高肽进入细胞的易位效率。实验实例5：肽影响信号途径各组分磷酸化的分析

正如实验实例2的结果所能看到的，可以相信，本发明的棕榈酰化肽抑制参与由细胞质磷酸酪氨酸诱导的信号途径早期的各种组分。在各种与T细胞如Jurkat细胞的信号途径有关的早期现象当中，酪氨酸磷酸化受到Src聚族激酶如Lck或Gyn的调节，同时脱磷酸化受蛋白酪氨酸磷酸酶的调节。之后，T细胞中TCR的交联及CD3被Src激酶磷酸化得以发生，而磷酸化的CD3与ZAP-70互补，ZAP-70与CD3链和ζ链中磷酸化的ITAM结合，加速磷酸化ζ链的积累，还阻止由酪氨酸磷酸酶引起的脱磷酸化。据此，要抑制由LP1引起的ζ链磷酸化，通过直接阻止Lck的功能或间接地阻止ZAP-70与磷酸化的ITAM结合就可以实现，因此，通过测定Lck、ZAP-70、CD3或ζ链的磷酸化程度，就能确定LP1或Pc的作用。

Jurkat细胞用50μg/ml或300μg/ml的棕榈酰化肽处理6小时，然后悬浮在缓冲液中，该缓冲液含有亮抑蛋白酶、抑酶肽、磷酸酶抑制剂(2mM正钒酸钠、0.4mM EDTA、10mM氟化钠和10mM焦磷酸钠)，50mM Tris-盐酸(pH8.0)，300mM氯化钠和0.5％Triton X-100。细胞溶胞产物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶(4-20％SDS-PAGE)上进行电泳，然后转移到硝酸纤维素膜上。

硝酸纤维素膜在PBS缓冲液中用4％脱脂奶处理，用下面提到的抗体进行免疫印迹，估测蛋白水平上的表达。所用的抗体有，克隆4G10抗磷酸酪氨酸抗体(Upatate)、抗ZAP-70抗体(TransductionLaboratories)、抗Lck抗体(Santa Cruz)或抗ζ链抗体(Santa Cruz)，分别按1∶1000、1∶1000、1∶1000或1∶1500稀释，以及偶联HRPO的二抗(Amersharm)，按1∶2000稀释。

结果，Lck激酶活性被LP1显著降低，但不被LPc或Pc降低(图5)。在图5中，标注的“LP1”、“LPc”和“Pc”与上面图4中确定的含义完全相同，而“c”是指对照组。CD3ζ链的磷酸化也被LP1显著降低，这表明CD3ζ链的磷酸化受Lck激酶活性下降的负向影响。

LP1对ZAP-70的抑制作用甚至更强，ZAP-70磷酸化的抑制造成磷酸化的动力学发生变化，特别是，当LP1的浓度在200μg/ml或以上时，对Lck诱导的ZAP-70磷酸化的抑制作用最强。因此，能够发现LP1通过抑制Src激酶阻断Jurkat细胞中早期的信号途径，并且当使用的浓度在每1×10⁶个细胞200μg/ml或以上时，LP1表现出最强的抑制作用。实验实例6：影响细胞中Ca⁺⁺运输的分析

正如从实验实例3中所能看到的，本发明的肽抑制Lck及其他相关蛋白的磷酸化，最后它们影响信号途径的后期现象如细胞中钙离子的运输。

为了确定本发明的肽是否抑制信号途径的后期，将Jurkat细胞用LP1(100μg/ml)37℃下处理1个小时(图6B)，用其他肽(图6C)或只用缓冲液(图6A)处理。处理的细胞用补加3mM Fluo-3AM的PRMI1640培养基重新悬浮，至浓度5×10⁶个细胞/ml然后37℃下温育30分钟。细胞用冰冷的LOCKS缓冲液清洗(150mM氯化钠，1mM硫酸镁，5mM氯化钾，10mM甘氨酸，15mM HEPES，pH7.4)，然后用同样的缓冲液重悬到终浓度1×10⁶个细胞/ml。使用前，这样处理的细胞于黑暗中保存在冰上。为进行低细胞计数分析，将细胞加热到37℃持续5分钟，用FACScalibur(Becton-Dickinson，San Jose.CA)测定抗CD3抗体(OKT3)加入前后的钙水平(图6)。

结果，对于用LP1处理的这一组，没有发生因OKT3刺激TCR而引起的钙离子流出，同时LP1处理并不影响由离子霉素诱导的钙离子流入。这一事实表明本发明的肽影响信号途径的下游，如TCR介导的信号途径中细胞内钙离子水平。实验实例7：抗癌活性；用MTS分析测定细胞生长

为了测定体外抗癌效果，从韩国细胞株库(Korea)获取人的肝细胞癌(SNU-398)(Park J G等(1995)Int.J.Cancer62：276-282)。用RPMI-1640(Sigma)培养基(Gibco BRL)和5×10^-5M 2-巯基乙醇(Sigma)培养保存肝癌细胞(HCC)。

将SNU-398细胞(5×10^-5细胞/孔)铺板到96孔板中，分析培养基由RPMI-1640(Sigma)组成，其中含10％FBS(Gibco BRL)、4mML-谷氨酰胺(Sigma)、庆大霉素(Gibco BRL)和5×10^-5M 2-巯基乙醇(Sigma)。用变化的浓度处理棕榈酰化-抑制剂肽(LP1和LP2)，然后在CO₂培养箱中于37℃培养24小时，然后加入20μl/孔 CellTiter96^AQ_ueous溶液试剂(Promega)，在37℃ 5％CO₂的培养箱中温育1-2小时后，用ELISA平板读数器(Bio-Rad)记录490nm处的吸光值。每点代表3次重复的平均数±SD。零细胞/孔显示的背景吸收没有从这些数据中减去。

为了比较，用对比肽(“Pc”；SEQ.ID.No：13)和棕榈酰化Pc(“LPc”)进行了同样的实验。

用LP1处理的癌细胞的生长明显下降，尤其是在30μg剂量时开始表现下降，160μg剂量时下降达到最大，此时细胞减少到原始数量的1/4(图7)。图8是用肽处理后细胞生长变化的显微成像，显示出LP1处理(8D)引起癌细胞密度明显降低和癌细胞的形态变化，同时对照(8A)、Pc处理(8B)和LPc处理(8C)显示没有变化或仅有不明显的变化。LP1处理的癌细胞尺寸变小，并且失去对板的吸附。

以上结果说明，本发明抑制剂肽对具有SH3结构域的蛋白表现出强的抑制作用，所述SH3结构域参与与有丝分裂有关的信号传导，以及与Lck有关的信号发生等。据此，本发明的肽可以有效地用作抗癌剂。

                     其他参考文献

Volpina.O.M.等，疫苗(Vaccine)14：1375-1380(1996年10月)，针对口蹄疫的基于VP1蛋白的棕榈酰衍生物的合成疫苗(Synthetic vaccineagainst foot-and-mouth disease based on palmitoyl derivative of the VP1protein)

Frankenburg.S.等，疫苗(Vaccine)14：923-929(1996年6月)，利用固有佐药功能的合成脂肽疫苗对小鼠的皮肤利什曼原虫感染进行有效的免疫(Effective immunication of mice against cutaneous leishmaniasisusing an intrinsically adjuvanted synthetic lipopeptide vaccine)

Deprez.B.等，疫苗(Vaccine)14：375-382(1996年4月)，简单脂肽构建体在体内诱导病毒特异性CTL的可比效率(Comparativeefficiency of simple lipopeptide constructs for in vivo induction of virus-specific CTL)

Babu.J.S.等，疫苗(Vaccine)13：1669-1676(1995年12月)，用合成脂肽引发病毒特异性CD8+但不引发CD4+细胞毒T淋巴细胞受乙酰化亚基和脂肽包封作用的影响(Priming for virus-specific CD8+but notCD4+cytotoxic T lymphocytes with synthetic lipopeptide is influenced byacylation units and liposome encapsulation)

Sauzet.J.P.等，疫苗(Vaccine)13：1339-1345(1995年10月)，用嵌合多限制脂肽在体内长期诱导抗病毒细胞毒T淋巴细胞(Long-lastinganti-viral cytotoxic T lymphocytes induced in vivo with chimeric-multirestricted lipopeptides)

Rouaix.F.等，疫苗(Vaccine)12：1209-1214(1994年10月)，脂肽制剂对巨细胞活化和肽呈递到T细胞的影响(Effect of a lipopeptidicformulation on macrophage activation and peptide presentation to T cells)

Celis.E.等，P.N.A.S.(USA)91：2105-2109(1994年3月)，使用初级培养物和合成肽表位在正常人中诱导抗肿瘤细胞毒T淋巴细胞(Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in normal humans usingprimary culture and synthetic peptide epitopes)

Pawson.T.等，细胞(Cell)70：694-704(1992)，SH2和SH3结构域：从结构到功能(SH2 and SH3 domains：from structure to function)

Feng.S.等，Science 266：1241-47(1994)，肽结合到Src SH3结构域的两个方向：与SH3配体相互作用的通用模型的开发(Two bindingorientations for peptides to the Src SH3 domain：development of a generalmodel for SH3 ligand interactions)

Burke.T.R.等，未来药物(Drugs of the Future)17：119-31(1992)，蛋白酪氨酸激酶抑制剂(Protein-tyrosine kinase inhibitors)

Tsuruga.T.等，化学药物公报(Chem.Parm.Bull)(东京)39：3276-8(1991)Melaleuca leucadendron的生物活性组分：从大鼠肥大细胞中受诱导histamine释放的抑制剂(Biologically active constitiuents foMelaleuca leucadendron：inhibitors of induced histamine release from ratmast cells)

Hanke.J.K.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271：697-701(1996)新的强的Src家族选择性酪氨酸激酶抑制剂的发现(Discovery of a novel，potent，and Src family selective tyrosine kinase inhibitor)

Zhu.Q.等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)180：461-70(1994)，Bruton酪氨酸激酶的Src同源性结构域3内的缺矢导致X连锁丙种球蛋白缺乏症(XLA)(Deletion within the Src homology domain 3 of Bruton’styrosine kinase resulting in X-linked agammaglobulinemia(XLA))

Rickles.R.J.等，P.N.A.S.(USA)92：10，909-13(1995)，对Src同源性结构域3结合特异性重要的配体残基的噬菌体展示选择(Phage displayselection of ligand residues important for Src homology 3 domain bindingspecificty)

Feng.S.等，P.N.A.S.(USA)92：12.408-15(1995)，两类Src同源性配体的富含脯氨酸核心以外的特异性相互作用(Specific interactionsoutside the proline-rich core of two classes of Src homology 3 ligands)

Claims (11)

1.具有下列式(I)代表的氨基酸序列的一部分或全部的肽：

               KX₁X₂X₃PX₄X₅PX₆PX₇(I)其中，K为赖氨酸；

P为脯氨酸；

X₁为谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸或赖氨酸；

X₂为精氨酸、赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；

X₃、X₄和X₅彼此相同或不同，各自独立地为脯氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；

X₆为天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸或赖氨酸；及

X₇为天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或赖氨酸。

2.根据权利要求1的肽，其中某个氨基酸残基可以连接1个或4个氨基酸残基，其中在连接一个氨基酸的情况中，该氨基酸为Tyr、pTyr(磷酸酪氨酸)，而在连接4个残基的情况中，这些氨基酸可以是Tyr或pTyr作为第一个残基，Asp或Glu作为第二和第三个残基，而疏水氨基酸如Ile、Leu、Val或Met作为第四个残基。

3.根据权利要求1或权利要求2的肽，其为SEQ ID NO：1到SEQID NO：12中的一个。

4.根据权利要求1到权利要求3中的任何一项的肽，它的N-末端带单脂质或双脂质。

5.根据权利要求4的肽，其中所说的脂质为棕榈酰基团。

6.根据权利要求1到权利要求5中的任何一项的肽，其中所述氨基酸残基为L-氨基酸。

7.根据权利要求6的肽，其中一个或多个氨基酸残基用D-氨基酸替换。

8.根据权利要求1到权利要求7中的任何一项的肽，基中一个或多个氨基酸残基用羟脯氨酸、羟赖氨酸、胱氨酸、甲状腺素、正亮氨酸、焦谷氨酸或甲基化的氨基酸所替换。

9.根据权利要求1到权利要求8中的任何一项的肽，其中该肽的C-末端是酰胺、羧基或酯的形式。

10.根据权利要求1到权利要求9中的任何一项的肽，其中该肽偶联到棕榈酰-棕榈酰-赖氨酸或棕榈酰-棕榈酰-棕榈酰-赖氨酸。

11.用于预防或治疗癌症或免疫抑制相关疾病的药物组合物，它包括权利要求1到权利要求10中的任何一项所述的一种或多种肽作为活性成分和可药用的载体。

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