CN1226926A - 可凝血酶活化的血纤溶酶原激活物 - Google Patents

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Abstract

血纤溶酶原激活物(t－PA)具有改进的血纤蛋白特异性和降低的副作用,它们按下列方式进行修饰:(a)如此地进行修饰使得血纤溶酶原激活物通过凝血酶可裂解并通过这种裂解转变成双链的形式,(b)如此地进行修饰使得它们的酶原性与人的t－PA相比因子至少大于1.2和(c)这种血纤蛋白的结合力如此地降低,使得高于50%的血纤溶酶原激活物可渗透到血块中。

Description

可凝血酶活化的血纤溶酶原激活物
本发明涉及一种可凝血酶活化的血纤溶酶原激活物，治疗血栓栓塞疾病的药物，含这种血纤溶酶原激活物的药物组合物和它们的用途。
组织血纤溶酶原激活物(t-PA)是一种由多个结构域组成的丝氨酸蛋白酶，它们催化血纤溶酶原向血纤溶酶的转变并用于血纤维蛋白溶解的治疗。
有许多t-PA变体和突变是众所周知的，例如参见T.J.R.Harris(1987)和J.Krause(1988)的综述文章。
此外，为了已知t-PA的作用原理，通过t-PA和血纤溶酶原激活物抑制剂I(PAI-1，一种得自丝氨酸蛋白酶抑制剂族的丝氨酸蛋白酶抑制剂)之间的相互作用来部分调节纤维蛋白的溶解作用。将PAI-1结合到t-PA上主要通过氨基酸296-302进行。这些区域的突变降低了PAI-1对t-PA的抑制影响(E.L.Madison等人(1990))。为了了解PAI-1和t-PA的氨基酸区域296-302间的相互作用机理，人们进行了大规模的试验(也参见E.L.Madison,《自然》339(1989)第721-723页；R.V.Schohet,《血栓形成与止血法)》71(1994)第124-128页；C.J.Refino,《血栓形成与止血法》70(1993)第313-319页；N.F.Paoni,《蛋白质工程》6(1993)第529-534页和《血栓形成与止血法》70(1993)第307-312页；W.F.Bennett,《生物化学》杂志266(1991)第5191-5201页，D.Eastman,《生物化学》31(1992)第419-422页)。
未修饰的人的t-PA(此外，特征在于t-PA)在血浆中存在的形式由527氨基酸组成并可通过血纤溶酶裂解成两个链，该链然后又通过二硫化物桥结合在一起。A链(也称为主(schwere)链)由四个结构域构成。指状结构域(氨基酸l-49)表示与纤连蛋白中指状结构相似。生长-因子-结构域(氨基酸50-86)在某些范围内与鼠和人的表皮生长因子同源。Kringle结构域(氨基酸87-261)在更大的范围内与第四个和第五个血纤溶酶原的Kringle结构域同源。t-PA的指状结构域和Kringle-2-结构域尤其是通过血纤蛋白包含在血纤蛋白结合和蛋白溶解活性的刺激中。t-PA的B-链(氨基酸276-527，蛋白酶结构域)是一种丝氨酸蛋白酶，并主要与尿激酶和血纤溶酶的B-链同源(T.J.R.Harris(1987)和J.Krause(1988))。
t-PA的酶活性(血纤溶酶原对血纤溶酶的催化活性)在无血纤蛋白或血纤蛋白裂解产物的存在下较低，但是，在这种刺激剂的存在下可显著地提高(约大于10个因子)。t-PA在体内的作用机理例如在Kominger和Collen,《血栓形成与止血法》46(1981)第561-565页中已有描述。t-PA使血纤溶酶原活化成血纤溶酶。血纤溶酶使血纤蛋白裂解成可溶的血纤蛋白裂解产物。通过血液中存在的蛋白酶/血纤溶酶，t-PA在氨基酸275(精氨酸)和276(异亮氨酸)之间进行裂解，由此进行活化。因此，通过半胱氨酸桥结合保留的链的两部分。
通过血纤蛋白，血纤蛋白裂解产物的活性的可刺激性是t-PA的一个主要特征，该t-PA与另一个已知的血纤溶酶原激活物例如尿激酶或链激酶的t-PA是有区别。通过修饰t-PA的氨基酸序列可进一步改善可刺激性。可刺激性的程度是在或不在血纤蛋白的存在下催化效率的比例(Kcat/Km)。Kcat是催化反应的速度常数，而Km是米氏(Michael)常数。在修饰氨基酸292和/或305时，t-PA的可刺激性提高达19-81倍(E.L.Madison等人，《科学》262(1993))第419-421页。
由USP5501853已知t-PA衍生物，它们在氨基酸272-280的区域内，尤其在274-277的区域内，另外在糖基位置(117-119和184-186)(Glykosylierungsstellen)的区域内得到修饰。这种t-PA衍生物具有改进的蛋白溶解活性和血纤溶酶原溶解活性，对于抑制具有降低的敏感性，对于血纤蛋白具有改进的亲合力和/或改进的血纤溶酶原溶解活性的血纤蛋白依赖性。
Wen-Pin Yang等人在《生物化学》33(1994)第2306-2312页中描述了可凝血酶活化的血纤溶酶原激活物。这种嵌合血纤溶酶原激活物(59D8-scu PA-t)由抗血纤蛋白抗体(59D8)的Fab片段和可凝血酶活化的低分子量单链尿激酶-血纤溶酶原激活物(scu PA-t)的C末端部分制备，它们通过氨基酸Phe-157和Lys-158的缺失，由低分子量单链尿激酶-血纤溶酶原激活物(scu PA)通过定点诱变而获得。
K.N.Dawson等人在《生物化学》杂志269(1984)第15989-15992页公开了一种血纤溶酶原突变体，它们通过凝血酶可活化。这些血纤溶酶原衍生物通过可凝血酶裂解的序列取代裂解位置的P3-,P2-和P1＇-氨基酸而获得。
N.F.Paoni.等人在《蛋白质工程》5(1992)第259-266页中公开了在氨基酸区域296-299区的t-PA的修饰。借此，获得改进的血纤蛋白特异性。
USP5200340公开了可凝血酶活化的血纤溶酶原激活物，如此地进行修饰使得它们含有用来活化的凝血酶裂解位置。进一步进行修饰使得在这种t-PA衍生物中，尽管生长因子结构域(EGF结构域)可缺失，但是，必须保持血纤蛋白结合结构域(指状结构域)和Kringle结构。
由WO91/09118和WO94/10318已知，血纤溶酶原可通过将凝血酶的凝血酶裂解位置插入到血纤溶酶中进行活化。因为在血块中含有凝血酶，所以这种活化主要在血块上进行。但是，这种方法的缺点在于必须向病人给药大量的经修饰的血纤溶酶原。
本发明的目的是提供使用一种改进的血纤溶酶原激活物，这种激活物具有较高的特异性和有效性，能够在体内溶解血块。
本发明的目的通过来源于人的组织血纤溶酶原激活物的血纤溶酶原激活物的下列修饰来实现：(a)如此地进行修饰使得血纤溶酶原激活物通过凝血酶可裂解并通过这种裂解转变成双链的形式，(b)如此地进行修饰使得它们的酶原性(Zymogenitat)与人的t-PA相比至少大1.2个因子，优选大于2个因子和(c)这种血纤蛋白的结合力要如此地降低，使得高于50％的血纤溶酶原激活物可进入血块中。
这种血纤溶酶原激活物在血块上起特异作用，因此它们的副作用要比已知的血纤溶酶原激活物明显地降低。
本发明的出发点是人的组织血纤溶酶原激活物的序列。因此，根据本发明，“来源于人的组织血纤溶酶原激活物”是指本发明的血纤溶酶原激活物的序列来源于人的血纤溶酶原激活物的序列。这表明在结构上至少部分地保持了t-PA特性的结构特征(结构域)。例如结果表明本发明的血纤溶酶原激活物是可利用的，其中仍然保持了Kringel2和/或蛋白酶结构域的结构，并且另外可按本发明进行修饰。同样可能的是可进一步保持结构域并且通过氨基酸的缺失，突变和/或加入产生本发明的特征。氨基酸序列的改变可通过专业人员已知的方法例如定向诱变或PCR进行。
在一个优选的实施方式中，与人的组织血纤溶酶原激活物相比，如此地修饰本发明的血纤溶酶原激活物，使得本发明血纤溶酶原激活物的可裂解性通过血纤溶酶在氨基酸P1(275)和P1＇(276)之间降低。在本发明的血纤溶酶原激活物中，通过血纤溶酶使可裂解性有效地降低了10％或以上，更优选20％或以上，特别优选地50％或以上。因此无需完全保持可血纤溶酶的裂解性。尤其是，通过本发明血纤溶酶原激活物的可血纤溶酶裂解性，可改进凝血酶的活化。
但是也优选地是，应如此地降低可裂解性，使得在体内不再进行与生理有关的裂解。借此可明显地降低副作用。因此实现了体内凝血参数的分解(Abbau)明显地得到削弱，并且如在已知的血纤溶酶原激活物中不会明显地延长出血时间。
可在一个体外试验中，测定通过血纤溶酶的可裂解性。因此，将具有提高量的血纤溶酶的血纤溶酶原激活物在25℃下温育5分钟，接着在具有12.5-15％丙烯酰胺的丙烯酰胺凝胶中根据血纤溶酶原激活物的量进行SDS电泳(U.Kohnert等人，《蛋白质工程》5(1992)第93-100页)。
血纤溶酶原激活物的修饰可按以下的方式，以对于每个专业人员来说已知的方法进行，使得在P1和P1＇之间(根据Schechter,J.和Berger A.,的命名法，《生物化学与物理研究通讯》27(1967)第157-162页)不再进行裂解或降低通过血纤溶酶的裂解。血纤溶酶裂解序列R275-I276(在单字母密码中的氨基酸符号)。例如，通过修饰一种或两种氨基酸可提高或明显降低通过血纤溶酶的可裂解性。
也可通过P4-P3＇位置(氨基酸272-278)的修饰来降低通过血纤溶酶的可裂解性。在这种情况下，最好将P2转变成优选不疏水的和/或非芳香族的氨基酸例如P。由此，令人惊奇地是除了降低可血纤溶酶的裂解性外，实现了凝血酶的可裂解性。
此外，优选地遵守一个或多个下列的一般条件：(P)P4：任何氨基酸(但是不是P，如果P2是P，优选是L,I,V)(Q)P3：任何氨基酸(F)P2：疏水的氨基酸(F,H,G,V,L,I,T,A或P，特别优选P)(R)P1:R或K,优选R(I)P1＇:V或I，优选I(K)P2＇:V,L,I或K，优选V(G)P3＇:G
特别优选地，将P4转变成V,P2转变成P,P2＇转变成V。由此产生特别好的裂解位置(272-278)VQPRIVG。(序列NO:1)
凝血酶裂解位置的插入也可按现有技术进行。但是，优选地是在氨基酸264-288的区域内插入相应的突变。
向凝血酶引入亲合力的t-PA的修饰也可通过环459-471，自溶环417-425和/或氨基酸Q475,K505和/或E506的修饰进行。
对其底物来说，酶的特异性主要取决于裂解位置的序列(初级序列)。对于丝氨酸蛋白酶例如凝血酶和血纤溶酶来说，P1残余物是主要的特定决定子。可折叠的蛋白底物的特异性也取决于酶(凝血酶或血纤溶酶)和底物(血纤溶酶原激活物)之间的特性接触以及裂解位置的构象和适应性。因为血纤溶酶和凝血酶的初级特异性极为类似(根据精氨酸，在P1位置上两种都裂解)，所以不再有另一种可能，为获得血纤溶酶原激活物，其中通过血纤溶酶(血纤溶酶的可活化性)降低裂解并通过凝血酶(凝血酶的可活化性)保留裂解或基本上要比血纤溶酶的可活化性大(至少小2-10因子)但是，令人惊奇地发现，通过在酶和底物之间的二次结合位置上的修饰以及对活化环的结构和动力特性的修饰，可获得这种特性。
优选在降低可血纤溶酶的裂解性的同时，通过突变改变在活化环中的初级特异性而在氨基酸264和288之间进行插入凝血酶特异的裂解位置。对此，特别优选地是上述突变在区域272-277(P4-P2＇)内进行。
可通过适应性的修饰和/或结合环的可接近性来提高可凝血酶的裂解性。此外，特别优选地是修饰G265(突变引起适应性降低)或R267(突变引起G265和E410之间盐桥的改变或裂解)。同样优选地是在264和267之间的区域内进行插入。特别优选地是在S中修饰R267(D.Lamba等人，《分子生物》杂志258(1996)第117-135页)。
一种可提高适应性的突变是在S处改变R267，优选与F处的P4,G处的P3和V处的P2＇的突变结合。
可通过二次特异结合位置的改变进一步改进可凝血酶的裂解性和特异性。此外，例如环459-471可完整或部分地缺失。这种环由下列氨基酸组成：
GDTRSGGPQANLH.        (序列NO:2)
优选地，在这种环中，区域PQANLH(序列NO:3)完全或至少部分缺失(而且优选保留H)或在它们的氨基酸序列中进行改变。
优选在氨基酸272-277的区域中使用下列序列：
GIPRIV                (序列NO:4)
AQPRIK                (序列NO:5)
同样有利的是在265-277的氨基酸区域(t-PA原始序列GLRQYSQPQFRIK(序列NO:6))中，使用下列序列：
GLSQASQGIPRIV         (序列NO:7)
对于该区域，同样优选地是下列序列：
GLRQYSQAQGIPRIV       (序列NO:8)
在该序列中，将在Q和P(原始序列：Q和F)之间插入氨基酸G和I以使其延长。优选地，这种插入可在264和276之间的区域内在任何位置上进行。
同样特别优选地是本发明的化合物，其中将裂解位置(序列NO:1)与一个或多个，优选全部的F处的突变P4,G处的突变P3,P处的突变P2和V处的突变P2＇和S处的突变R267相结合。
在本发明的一个优选的实施方式中，血纤溶酶原激活物含有另一个突变，其单链形式的活性，而不是双链形式的活性显著地降低，由此提高酶原性，使其达到约1.2因子，优选为2因子或更高。
术语“酶原性”是指双链形式活性和单链形式活性的商。活性是酰胺分解测定的。使用这种血纤溶酶原激活物在明显降低副作用的同时实现了体内血栓溶解的高选择性和有效性。在E.L.Madison等人《科学》262(1993)第419-421页中描述了合适和优选的单链形式的突变。
为提高酶原性(血纤溶酶原激活物的双链形式的酰胺分解活性与单链形式的酰胺分解活性的比例)，特别优选地是(也对于所有的血纤溶酶原激活物，它们是由人的组织血纤溶酶原激活物产生的)修饰Q处的K429和/或T处的H417和/或阻止或破坏在K429和H417之间的相互作用。
特别优选的本发明的化合物含有裂解位置(272-278)VQPRIVG(SEQ ID NO:1)，它们在Q处具有另外的突变K429和/或在T处的突变H417。
血纤蛋白结合的降低可这样进行，使对血纤蛋白结合呈特异性的t-PA结构域(血纤蛋白结合结构域，指状结构域)缺失或如此进行突变，以使血纤蛋白的结合不是通过指状结构域进行或者仅在小范围内进行(不起作用的指状结构域)。通过这种血纤蛋白结合的降低，实现了可将血纤溶酶原激活物渗透到血块中(优选50％以上)并且分布均匀。在那儿，它们通过凝血酶发生裂解并使它们的活性以活化双链的形式显示。一种按这种方式降低其血纤蛋白结合的血纤溶酶原激活物对于t-PA不再具有典型的高亲合力的血纤蛋白结合。通过这种特异的作用方式，血纤溶酶原激活物的能力增强，并且尤其是明显地降低了副作用。可以一种体外模型来确定本发明血纤溶酶原激活物在血块中的渗透。肉眼观察确定血块渗透的程度和在血块中的分布。为了进行判断，使用USP5223256中公开的渗透到血块中分布均匀的血纤溶酶原激活物作为标准，并由此按定义将该值定为100％(在浓度为3μg/ml时进行测定)。使用EP-B0093619的重组体人的组织血纤溶酶原激活物作为另一个标准，按定义不是渗透到血块中，而是基本上结合到表面上。为了研究血块的渗透，在实施例3c中描述了该过程。与该标准进行对比表明“未渗透到血块中”是指绝大部分(80％或以上)的血纤溶酶原激活物位于血块的四分之一位置上，而“均匀分布”是指至少50％的血纤溶酶原激活物进一步地渗透到血块中，并且因此在剩余的四分之三位置中定位。
当使用本发明的血纤溶酶原激活物时，还可进一步提高溶解凝结物的特异性和有效性，没有或仅有极少量的非特异血纤蛋白的结合。这种分子渗透到凝血的内部，从而使人们担心血纤溶酶原对血块中的血纤溶酶的有效活化。这种血纤溶酶原激活物例如基于t-PA的蛋白酶结构域(WO96/17928)或基于一种物质，这种物质主要含有Kringle2-结构域和蛋白酶结构域作为t-PA结构域，而不含指状结构域作为t-PA结构域(WO90/09437,USP5223256,EP-B0297066,EP-B0196920)。
在一个优选的实施方式中，本发明的血纤溶酶原激活物另外还进行如此地修饰，以使它们不是通过PAI-1来抑制的。一种这样的修饰优选通过突变氨基酸296-302(Madison,E.L.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(1990)第3530-3533页)，特别优选通过由AAAA交换氨基酸296-299(KHRR)(WO96/01312)而进行。
本发明的化合物是溶血栓活化蛋白质，这种蛋白质优选与t-PA(Alteplase)不同，适合于以静脉内大丸剂注射液的形式给药。它们在剂量较少时是有效的并且实际上具有相同的溶血栓作用，例如Alteplase临床常用的输注。
提高特异性和与此有关的降低出血副作用使得可将本发明的化合物变成对用于治疗所有血栓栓塞疾病的极有价值的溶血栓药。与迄今仅在最威胁生命的疾病如心肌梗塞和大面积肺栓塞容许的溶血栓药不同，利用这种变体开辟了在轻度急性威胁生命的疾病例如深度腿静脉血栓形成中也使用本发明的化合物进行溶血栓的可能性。此外，现在可比以往更多地使用基于本发明化合物溶血栓药，因为对于更宽的应用来说，主要的阻碍原因是存在出血并发症的危险。对此无关，本发明的化合物具有优点，也可在急性疾病如心肌梗塞形成或肺栓塞中使用。
可根据专业人员常用的方法，在真核细胞或原核细胞中进行本发明中所使用的血纤溶酶原激活物的制备方法。优选采用基因工艺制备本发明的化合物。例如在WO90/09437,EP-A0297066,EP-A0302456,EP-A0245100和EP-A0400545中已公开了这种方法，这些文件公开的主题是这种制备方法。可通过“寡核苷酸的定点特异诱变”在t-PA或其衍生物的cDNA中插入突变。例如Zoller和Smith(1984)，根据T.A.Kunkel(1985)和Morinaga等人(1984)的修饰，描述了“定点特异诱变”。同样适用的是PCR诱变法，例如Ausubel等人(1991)描述了该方法。
如果在适用于所使用的寄主细胞的表达载体中有核酸存在，那么按该方法获得的核酸起表达本发明中使用的血纤溶酶原激活物的作用。
另外还可修饰本发明蛋白质的核酸序列。这种修饰的实例是：
改变核酸序列，以便插入减少连接、克隆和诱变步骤的限制酶的不同的识别序列，
改变核酸序列，以便构建对于寄主细胞的优选的密码子，
在附加的调节元件和转录元件周围补充核酸序列，以便使在寄主细胞中的表达达到最佳。
所有其它的适于表达载体的制备和表达的方法步骤是现有技术并对专业人员是已知的。例如Sambrook等人在《分子克隆》的“在大肠杆菌中克隆基因的表达”中描述了这种方法：实验手册(1989),Cold Spring Harbor实验出版社，美国纽约。
本发明所使用的糖基化的血纤溶酶原激活物的制备是在真核寄主细胞中进行的。本发明所使用的非糖基化的血纤溶酶原激活物的制备也是在真核寄主细胞中进行的(其中必须将首先获得的糖基化产物通过专业人员常用的方法脱糖基化)或者优选通过在非糖基化的寄主细胞中，特别优选在原核寄主细胞中表达来进行。
例如，将大肠杆菌，链酶菌素或枯草芽胞杆菌用作原核宿主生物体。为了制备本发明的蛋白质，按常规方法发酵原核细胞，在细菌分解后，按常规方法分离蛋白质。如果蛋白质以失活的形式(包含体)沉淀的话，那么按照专业人员已知的方法进行溶解和天然化(naturiert)。同样可按专业人员已知的方法，从微生物中分泌出作为活化蛋白质的蛋白质。对此适用的表达载体优选含有在使用的宿主细胞中适合于蛋白质分泌的信号序列和编码蛋白质的核酸序列。在这种情况下，用这种载体表达的蛋白质在培养基(在革兰氏阳性菌时)中或者在胞质间隙(在革兰氏阴性菌时)中分泌。在信号序列和用于编码本发明t-PA衍生物的序列之间含有适当的用于编码裂解位置的序列，它们在加工时或通过用蛋白酶处理允许蛋白质裂解。
插入到用来编码本发明血纤溶酶原激活物的DNA序列中的基础载体的选择取决于以后表达所使用的宿主细胞。合适质粒以及对这种质粒提出的最低要求(例如复制源，限制片段位置)是专业人员已知的。在本发明的范围内，也可将一种质粒调整成噬菌体(λ,M13)的复制双股形式的粘粒或使用其它专业人员已知的载体。
在原核生物中制备本发明的血纤溶酶原激活物时，优选不进行分泌，由溶解细胞颗粒分离形成的包含体，在还原条件下通过用变性剂进行处理，溶解含血纤溶酶原激活物的包含体，接着用GSSG进行衍生，通过添加GSH和非变性浓缩物形式的变性剂或L精氨酸来复性血纤溶酶原激活物。EP-A0219874和EP-A0241022公开了活化t-PA和由包含体衍生的这类方法。但是，也可使用从包含体获得活化蛋白质的其它方法。
纯化本发明血纤溶酶原激活物的过程优选在L精氨酸的存在下进行，精氨酸的浓度优选为10-1000mmol/l。
异种蛋白的分离优选通过亲和色谱，特别优选通过一种固定在ETI(刺酮属胰蛋白酶抑制剂)上的吸附柱进行。例如使用Sepharose作为载体材料。通过ETI吸附柱进行纯化的优点是甚至在有如此高的精氨酸浓度例如0.8mol/l的存在下可装填直接由浓缩复性添加剂而获得的ETI吸附柱材料。优选地，在0.6-0.8mol/l精氨酸的存在下，通过ETI吸附柱纯化本发明的血纤溶酶原激活物。在这种情况下，所使用的溶液具有的pH优选大于7，特别优选在7.5-8.6的范围内。
既可以在精氨酸的存在下，也可以不在精氨酸的存在下，通过降低pH从ETI柱中洗脱本发明的血纤溶酶原激活物。优选地，使pH值落在酸性范围内，特别优选地pH为4.0-5.5。
本发明的另一个目的是提供一种含本发明溶血栓活化蛋白质的药物组合物，其中优选起唯一溶血栓活性作用结构的蛋白质含有蛋白酶结构域和必要时含有人的组织血纤溶酶原激活物的Kringel2-结构域。
为了进行治疗，按专业人员已知的方法配制本发明使用的血纤溶酶原激活物，其中通常将本发明的化合物与一种可药用载体相结合进行使用。这种组合物含有通常的有效量的按体重计0.1-7mg/kg，优选0.7-5mg/kg，特别优选1-3mg/kg的剂量。这种治疗用的组合物通常以无菌水溶液或无菌可溶解的干制剂例如冻干物的形式存在。组合物通常含有适量的可药用盐，用等渗溶液制得。此外，可使用缓冲剂例如精氨酸缓冲剂，磷酸盐缓冲剂以稳定合适的pH值(优选5.5-7.5)。本发明化合物剂量的增加通过每个专业人员无需进一步的测定即可确定。例如，它们取决于施用的种类(灌注或大丸剂)和治疗的周期。根据它们延长的半衰期(有关的体内分解)，本发明的化合物特别适用于大丸剂施用(一倍大丸剂，多倍大丸剂)。一种大丸剂施用的合适形式的实例是安瓿，含有25-1000mg本发明的化合物，一种改进血纤溶酶原激活物溶解性的物质(例如精氨酸)和缓冲剂。优选静脉内施用，但是也可皮下，肌内或动脉内施用。同样可以注入本发明的血纤溶酶原激活物或局部施用。
可将本发明的化合物作为多倍大丸剂(优选作为双倍大丸剂)施用。合适的时间间隔为20-180分钟，优选的时间间隔为30-90分钟，特别优选的时间间隔为30-60分钟。此外，作为灌注时，一次剂量的时间间隔为1小时到2天。
本发明的化合物特别适合于治疗所有血栓栓塞疾病例如急性心肌梗塞，脑梗塞，肺栓塞，深度腿静脉血栓形成和急性动脉阻塞等。特别优选地是施用本发明的化合物治疗亚慢性血栓栓塞疾病，其中必须进行较长时间的血栓溶解。
优选地将本发明的化合物与一种凝块抑制剂(抗凝血剂)例如肝素和/或血小板聚集作用的抑制剂结合施用，由此在减小副作用的同时增强血管的扩展作用。抗凝血剂的一次给药剂量可与本发明化合物的一次给药剂量同时进行或者不同时进行。同样优选地是添加使血液流通的物质或改善微循环的物质。
下面的实施例，公开物，序列记录和附图用于说明本发明，其保护范围由权利要求书确定。可借助于实施例来理解所述方法，对实施例的一些改变也落入本发明的范围。
此外，术语“r-PA”是指重组体的血纤溶酶原激活物，它们由人的t-PA的结构域K2和P组成。例如，USP5223256公开了这种血纤溶酶原激活物的制备方法。
术语“r-PA(F274P,K277V)”是指在由结构域K2和P组成的血纤溶酶原激活物中，用氨基酸P代替氨基酸274(F)，用氨基酸V代替氨基酸277(K)(类似于T.J.Harris(1987)的氨基酸符号)。
图1是血浆-血块渗透模型和裂解模型的附图。为了避免满足碎片(Scherbe anspruchung)所引起的血浆凝固，通过缓冲剂室(画影线的区域)产生压力。可通过引入一种Blasenfalle来避免通过血块而使缓冲剂与血浆的混合(加点区域)。1：缓冲储器；2：蠕动泵；3:Blasenfalle；4：用于纤维蛋白溶解药的注射器；5：带血块的吸管尖(交叉阴影线区域)；6：软管夹头；7：压力构件。
图2示出了r-PA(F274P,K277V)(A)或r-PA(B)通过凝血酶的裂解。(详文参见实施例8)
图3示出了r-PA(F274P,K277V)(A)或r-PA(B)通过血纤溶酶的裂解。(详文参见实施例9)
图4示出了r-PA(P272V,F274P,K277V)(A)通过凝血酶的裂解。(详文参见实施例10)实施例1本发明化合物重组体的制备a)表达质粒的结构
EP0382174中公开的原始质粒pA27fd含有下列组分：tac启动子，具有ATG起始密码子的lac操纵基因区域，由Kringle2结构域和蛋白酶结构域和fd转录终止子组成的用于t-PA-突变蛋白的编码区域。原始载体是质粒pkk223-3。
为了进行突变，主要采用Morinaga等人《生物工艺学》(1984)第636页的方法进行。为了形成异源双链，从pA27fd中分离出两种合适的片段(例如片段A：大的BamHI片段，片段B：带有PvuI的线性化载体)。
表1列出了所使用的寡核苷酸和由此产生的突变。
将异源双链添加物与质粒pUBS520一起转化成大肠杆菌(Brinkmann等人，《基因》85(1989)第109页)。通过向培养基中添加氨苄青霉素和卡那霉素(分别50μg/ml)来选择转化。
分别由添加物产生的质粒同样示于表1中。b)在大肠杆菌中的表达
为了测试表达效率，在氨苄青霉素和卡那霉素(分别50μg/ml)的存在下，在LB介质(Sambrook等人，1989,《分子克隆》Cold Spring Harbor)中用各种质粒(参见表1)和pUBS520培养大肠杆菌直到在550nm处的OD为0.4。通过添加5mmol/l IPTG开始表达。进一步温育培养物4小时。在这之后，通过离心收集大肠杆菌细胞，并再次悬浮到缓冲液(50mmol/lTris-HCl pH8,50mmol/l EDTA)中；通过超声波作用引起细胞裂解。通过再次离心，收集未溶解的蛋白质部分，并通过超声波作用再次悬浮到上述缓冲液中。向悬浮液中加入1/4体积的培养缓冲液(Auftragspuffer)(250mmol/lTris-HCl pH6.8,10mmol/l EDTA,5％SDS,5％巯基乙醇，50％甘油和0.005％溴酚兰)，并用12.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶进行分析。用一种具有大肠杆菌(含有未用IPTG诱导的各种质粒)培养物的相同制剂作为对照物，并在凝胶中进行分离。在IPTG诱导的培养物的制剂中，在用考马斯篮R250(溶解在30％甲醇和10％乙酸中)染色凝胶后，识别分子量约为40kD的明显条带；在对照物制剂中没有这种带存在。
EP-A0382174的实施例2和3中公开了制备相应活化化合物的其它步骤。
表1
突变位点 使用的寡核苷 质粒
a)272P→V,274F→P,277K→V G.TAC.AGC.CAG.GTT.CAG.CCT.CGC.ATC.GTT.GGA.GGG.CTC.T1) pttPA-1
b)267R→S,272P→F,273Q→G274F→P,277K→V C.TGC.GGC.CTG.AGC.CAG.TAC.AGC.CAG.TTT.GGC.CCT.CGC.ATC.GTT.GGA.GGG.CTC.T pttPA-2
c)429K→Q G.GAG.CGG.CTG.CAG.GAG.GCT.CAT.G3) pttPA-3
d)b)和c) 来源于质粒pttPA-2和使用寡核苷c)的条件下 pttPA-4
e)417H→T C.TAC.GGC.AAG.ACC.GAG.GCC.TTG.T4) pttPA-5
f)a)和e) 来源于质粒pttPA-1和使用寡核苷e)的条件下 pttPA-6
g)b)和e) 来源于质粒pttPA-2和使用寡核苷e)的条件下 pttPA-7
1)序列NO:9
2)序列NO:10
3)序列NO:11
4)序列NO:12实施例2体内表征
为了检测本发明蛋白质的溶血栓的能力和有效性，使用由D.Coolen(《临床检查》杂志71(1983)第368-376页)建立的颈静脉血栓溶解的家兔模型。在这种情况下，在动物的颈静脉中产生放射性标记的血栓。对动物皮下给药100IU/kg肝素，进行抗凝固试验。向家兔静脉内给药Alteplase(重组体的野生型组织血纤溶酶原激活物，“t-PA”为德国，比贝腊赫，Thomae公司的市售产品，商标为Actilyse)，实施例1中公开的蛋白质，链激酶(德国，马尔堡，Behring公司市售的产品，商标为Streptase)或溶剂(0.2M精氨酸磷酸盐缓冲液)。
静脉内一次给药1mg/kg溶剂的大丸剂注射液，得到空白对照剂组。静脉内给药总剂量为1.45mg/kg，得到Alteplase组，其中开始时的大丸剂注射量为0.2mg/kg,30分钟时的灌注量为0.75mg/kg,60分钟时直接进行的持续灌注量为0.5mg/kg(总灌注时间：90分钟)。静脉灌注给药64000IU/kg达60分钟得到链激酶组。静脉一次给药大丸剂注射液得到本发明的蛋白质组。对于Alteplase和链激酶来说，这些是众所周知的标准规则。
在开始治疗后2小时，除去剩余的血栓，借助于血栓中放射活性的降低测定的血栓溶解的程度。为了获得血浆，采集治疗前和治疗开始后2小时的血样。采用标准方法确定活化凝血致活酶的时间。此外，根据溶血栓治疗来定量血液损失。对此，在向动物给药溶血栓药前，用模板和解剖刀在动物的股上切出长4cm，深0.3cm的皮肤切口。因此产生的血通过自然凝固至停止。在开始治疗后，在伤口上放置海绵，用它来抽吸由血栓溶解新产生血的血。通过称重海绵(扣除本身重量后)，测定产生的血量并由此说明出血的副作用。
Alteplase和实施例1的本发明的蛋白质都是溶血栓的高活化物质，与溶剂对照物相比，它们显著地溶解了血栓。实施例3血块溶解活性的对比a)进行血块溶解测定
在血块溶解测定中，测定t-PA和实施例1重组的蛋白质的活性。
通过添加缓冲剂(0.06M Na2HPO4,pH7.4,5mg/ml BSA(牛血清白蛋白),0.01％Tween80)，将试样调节到各种所需的蛋白质浓度。将1ml人的血纤蛋白原溶液(IMCO)(2mg/ml 0.006M Na2HPO4,pH7.4,0.5mg/mlBSA,0.01％Tween80)加入到0.1ml试样中，在37℃下保温5分钟。接着，分别加入100μl血纤溶酶原溶液(10IU/ml 0.06M Na2HPO4/H3PO4,pH7.4,0.5mg/ml BSA,0.01％Tween80)和凝血酶溶液(30U/ml 0.06M Na2HPO4,pH7.4,0.5mg/ml BSA,0.01％Tween80)，重新在37℃下保温试验添加物。在2分钟后，在血纤蛋白血块上放置Telflon球，直到该球已经到达试验小管的底部停止时间。b)测定动态血浆模型中的活性
在该动态血浆模型中，在极接近体内条件的条件下，试验本发明的物质。将该物质通过血块，在通过心搏动引起的类似实际压力的压力作用下加入到血浆中。
将200μl柠檬酸盐血浆与20μl 0.25mol/l CaCl2溶液混合，在37℃下保温。加入0.16U凝血酶并将混合物加入到1ml吸管尖(Eppendorff，汉堡，BRD)中。将吸管尖在23℃下垂直贮存2分钟，在0.01mol/l Tris/HCl,pH7.4,0.15mol/l NaCl2,0.025mol/l CaCl2,0.01％Tween80中保温60分钟，并将它们加入到血块溶解装置中。在一个由弹性软管组装的分段系统(图1)中测定血块溶解活性。通过一个蠕动泵形成流量，并分成两个平行的支路。支路A包括有用来密封支路并装有血浆血块的1ml吸管尖。支路B是与支路A平行隐性导管。借助于软管夹头将支路B中的压力调节到10毫巴。向血块上添加血浆(1ml)。关闭泵，测定各种血块的稳定性达15分钟。借助于1ml结核菌素注射器，用肌内注射的皮下针(Braun,Melsungen,BRD)小心地向血浆中注射纤维蛋白溶解药(实施例1蛋白质或CHO-t-PA的血浆最终浓度在0.5-10-20μg/ml之间)。血块溶解时间按添加纤维蛋白溶解酶和添加纤维蛋白溶解药前压降达50％之间的时间差来计算。借助于水校正的压电压力识别系统测定压力，并借助于依赖计算机的软件程序表示。c)在静态模型中血块的渗透
将800μl人的柠檬酸盐血浆(健康的供体)与75μl的Ca缓冲剂(50mmol/l Tris/HCl,pH7.2,0.25mol/l CaCl2),20μl在0.9％NaCl的明胶溶液(10％w/v)和100ml凝血酶溶液(8U/ml,0.05mol/l柠檬酸钠/HCl,pH6.5,0.15mol/lNaCl)混合。将800μl的这种混合物小心地转移到2ml柱(Pierce,Rockfort,IL,USA)中。通过在37℃下保温3小时形成血浆块。用首先用Glu-Gly-Arg-氯甲基酮抑制血纤溶酶原激活物，并将2ml缓冲剂(0.008mol/lNa2HPO4,0.001mol/l KH2PO4,0.003mol/l KCl,0.137mol/l NaCl,0.1％牛血清白蛋白，0.01％Tween80)与之混合以调节到所需浓度(0,0.5,1.2和3μl/ml)，将1ml这种溶液涂在血块的表面上。丢弃剩余的缓冲剂。用2mlPBS缓冲剂(0.008mol/l Na2HPO4,0.001mol/l KH2PO4,0.003mol/l KCl和0.137mol/l NaCl)洗涤血块的表面，通过添加2ml PBS的戊二醛溶液固定蛋白质。接着用2ml 50mmol/l Tris/HCl,pH8.0洗涤血块表面，用1ml过氧化物酶标记的多克隆抗体对t-PA(250mU/ml)进行温育。在用1ml PBS洗涤血块后，通过用3-氨基-9-乙基咔唑温育，测定抗体结合的蛋白质，通过过氧化物酶将它们转变成难溶的红色。
本发明的血纤溶酶原激活物不是集中在血块的表面上，而是渗透到血块中，并且均匀分布。血块的免疫染色部分的强度随着血浆中本发明血纤溶酶原激活物浓度的增加而增加。实施例4血纤蛋白结合的对比
在该实施例中，对实施例1溶血栓活化蛋白质的功能进行测试，以便将其结合到血纤蛋白上，还将有关的这种特性与Alteplase进行对比。
以1.5μg蛋白质/ml溶液的形式制备Alteplase和本发明蛋白质的试样。接着将溶血栓活化蛋白质的试样(100μl)分别与770μl缓冲剂(0.05MTris/HCl,pH7.4,0.15NaCl,0.01％Tween80),10μl牛血清白蛋白溶液(100mg/ml),10μl抑肽酶(3.75mg/ml),10μl牛凝血酶(浓度100U/ml)和提高量的血纤蛋白原(10μg/ml-300μg/ml)混合。所有溶液都是水性的。众所周知，凝血酶将血纤蛋白原转变成难溶的血纤蛋白血块。
将这些组分混合，在37℃下保温1小时。接着通过离心分离(15分钟，13000UPM,4℃下)从血纤蛋白血块中分离出上清液，通过标准的ELISA测定上清液中存在的血纤溶酶原激活物蛋白质的量。实施例5血纤溶酶原溶解活性和可刺激性的对比
Verheijen等人在《血栓形成与止血法》48(1982)第266-269页中公开了测定血纤溶酶原溶解活性的可刺激性的一种已知方法。
在室温下，用70％v/v氨基酸中的氰基溴化物(1g人的血纤蛋白原，100ml的1.3gCNBr水溶液)处理人的血纤蛋白原17小时，接着用蒸馏水进行透析而制备起刺激剂作用的血纤蛋白原片段。
在进行测定时，在含0.1％v/v Tween80,0.13μmol/l Glu-血纤溶酶原，0.3mmol底物S2251(显色底物H-D-Val-Leu-Lys-对硝基N-酰苯胺HCl)和120μg/ml血纤蛋白原片段的1ml 0.1mol/1 Tris/HCl(pH7.5)中温育5ng/nlt-PA或当量浓度的实施例1的蛋白质。将混合物在25℃下保温2小时，与作为对照物的空白试验值相比较而测定没有反应间歇时405nm处的吸收率。测定显色底物S2251的裂解作为衡量酶的血纤溶酶原溶解的活性。可刺激性按血纤蛋白原片段的活性除以没有血纤蛋白原片段的活性来计算。
将相应地用0.1mol/lTris,pH7.5,0.15％Tween80稀释的各25μl试样移液到微量滴定板的“孔”中。接着加入200μl试剂混合物，测定与空白试验值相比在2小时间隔中的405nm处的消光(25μl,0.1mol/lTris,pH7.5，0.15％Tween80,200μl试剂混合物)。
Figure A9719693300201
Figure A9719693300202
EBVt=2小时后的试剂空白试验值
Figure A9719693300203
EBV0=时间点t=0时的试剂空白试验值试剂混合物：5ml试验缓冲剂(0.1mol/l Tris,pH7.5,0.15％Tween80)1ml t-PA刺激剂(1mg/ml人血纤蛋白原的溴氰基片段)1ml底物溶液(3mmol/l S2251,H-D-Val-Leu-Lys-pNA；显色剂，Moelndal,SE)1ml血纤溶酶原溶液(7U/ml血纤溶酶原，Boehringer Mannheim GmbH)刺激因子的计算：
为计算刺激因子，用有t-PA刺激剂的存在下的活性除以无t-PA刺激剂的活性。应分别进行稀释使得在两种制剂中，达到基本上相同的消光。没有t-PA刺激剂的反应混合物中加入1mlH2O以代替1mlt-PA刺激剂，
以相同的方式，不仅测定无刺激剂时的活性，而且也测定有刺激剂存在时的活性。按下式计算刺激因子F：
特异活性是血纤溶酶原溶解活性(KU/ml)和蛋白质浓度(mg/ml)的商。实施例6组织血纤溶酶原激活物的实施例1的重组体蛋白质的大丸剂注射液在冠状动脉血栓形成的狗模型中诱导起作用和安全的血栓溶解
在左心脏冠状动脉的由电刺激诱导的血栓形成的狗模型中评价在大肠杆菌中产生的实施例1蛋白质的血栓溶解。实施例7酰胺分解活性的测定
为了测定酰胺分解活性，将200ml缓冲剂(0.1mol/l Tris/HCl,pH7.5,0.15％Tween80)和200μl血纤溶酶原激活物溶液(用缓冲剂稀释至浓度为1-12μg/ml)的混合物在37℃下保温5分钟。添加200μlS2288(6mmol/l，H-D-Ile-Pro-Arg-P-硝基苯胺二盐酸化物，Kabi Vitrum，瑞典)开始进行测定。在37℃时预平衡S2288底物。在对-硝基苯胺的消光系数为9750l/mol/cm时，由第一个2.5分钟内在405nm处的消光的增加计算酰胺分解的活性。实施例8r-PA(F274P,K277V)通过凝血酶的裂解1．实施
分别将44μgr-PA(F274P,K277V)和p-PA(参照物)在37℃下预保温15分钟，并且与同样在37℃下预保温15分钟下述单位人的凝血酶(Sigma)混合并在37℃保温30分钟。接着以1∶1(v/v)的比例，将试样与SDS试样缓冲剂(0.125mol/l Tris/HCl,pH8.8,4.6％(w/v)SDS,4mol/l尿素，0.1％溴酚兰，0.3mol/l二硫赤藓醇)混合，在95℃下保温3分钟，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。2．结果
图2示出了r-PA(F274P,K277V)通过凝血酶的裂解。数据表明通过提高凝血酶的量可完全将r-PA(F274P,K277V)裂解成双链形式。通过凝血酶裂解的r-PA(F274P,K277V)蛋白酶结构域和Kringle2-结构域和通过血纤溶酶-消化产生的r-PA(r-PA(tc))双链形式的相应结构域有相同高度上。
与r-PA(F274P,K277V)(A)不同，在下列所述条件下作为参照物的一起进行的r-PA(B)不通过凝血酶来裂解。A：刺激物1：分子量标准*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA(F274P,K277V)刺激物5: r-PA(F274P,K277V)+凝血酶缓冲剂刺激物6: r-PA(F274P,K277V)+0.055NIH单位凝血酶刺激物7: r-PA(F274P,K277V)+0.55NIH单位凝血酶刺激物8: r-PA(F274P,K277V)+2.74NIH单位凝血酶刺激物9：凝血酶(5NIH单位)刺激物10：分子量标准*B：刺激物1：分子量标准*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA+凝血酶缓冲剂刺激物5: r-PA+0.055NIH单位凝血酶刺激物6: r-PA+0.55NIH单位凝血酶刺激物7: r-PA+2.74NIH单位凝血酶刺激物8：凝血酶(5NIH单位)刺激物9：分子量标准**)分子量标准：溶菌酶(14.307Da)，大豆-胰蛋白酶抑制剂(20.100Da)，磷酸丙糖异构酶(26.626Da)，醛缩酶(39.212Da)，谷氨酸脱氢酶(55.562Da)，果糖-6-磷酸盐-激酶(85.204Da),β-半乳糖苷酶(116.353Da),α-2-巨球蛋白(170.000Da)。**)r-PA(tc)：通过用血纤溶酶温育r-PA获得的r-PA的双链形式。实施例9r-PA(F274P,K277V)通过血纤溶酶的裂解1．实施
分别将25μgr-PA(F274P,K277V)和r-PA(参照物)在37℃下预保温15分钟，并且与同样在37℃下预保温15分钟下述单位人的凝血酶(人)混合并在37℃下保温10分钟。接着以1∶1(v/v)的比例，将试样与SDS试样缓冲剂(0.125mol/l Tris/HCl,pH8.8,4.6％(w/v)SDS,4mol/l尿素，0.1％溴酚兰，0.3mol/l二硫赤藓醇)混合，在95℃下保温4分钟，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。2．结果
图3示出了r-PA(F274P,K277V)(A)和作为参照物一起进行的r-PA(B)通过凝血酶的裂解。
数据表明通过用提高量的凝血酶进行温育可将r-PA(B)转变成双链形式。在应用条件下，通过25mU血纤溶酶可将使用量的r-PA完全转变成双链形式。
与此相反，r-PA(F274P,K277V)(A)通过血纤溶酶的裂解明显差。在用0.025U和0.1U血纤溶酶进行温育时，没有明显地观察到r-PA(F274P,K277V)通过血纤溶酶的裂解。在用25mU血纤溶酶温育25μgr-PA(F274P,K277V)时，未进行完全的裂解。
通过凝血酶裂解的r-PA(F274P,K277V)的蛋白酶结构域和Kringle2-结构域和通过用血纤溶酶琼脂糖凝胶消化产生的r-PA(r-PA(tc))双链形式的相应结构域有相同高度，以致得出变体的裂解如同在氨基酸275和276之间的r-PA时所进行的(根据Harris，《蛋白质工程》1,449-458(1987))。A：刺激物1：分子量标准*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA(F274P,K277V)刺激物5: r-PA(F274P,K277V)+0.25mU血纤溶酶刺激物6: r-PA(F274P,K277V)+2.5mU血纤溶酶刺激物7: r-PA(F274P,K277V)+12.5mU血纤溶酶刺激物8: r-PA(F274P,K277V)+25mU血纤溶酶B：刺激物1：分子量标准*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA+0.25mU血纤溶酶刺激物5: r-PA+2.5mU血纤溶酶刺激物6: r-PA+12.5mU血纤溶酶刺激物7: r-PA+25mU血纤溶酶*)分子量标准：溶菌酶(14.307Da)，大豆-胰蛋白酶抑制剂(20.100Da)，磷酸丙糖异构酶(26.626Da)，醛缩酶(39.212Da)，谷氨酸脱氢酶(55.562Da)，果糖-6-磷酸盐-激酶(85.204Da),β-半乳糖苷酶(116.353Da),α-2-巨球蛋白(170.000Da)。**)r-PA(tc)：通过用血纤溶酶-琼脂糖温育r-PA获得的r-PA的双链形式。实施例10r-PA(P272V,F274P,K277V)通过凝血酶的裂解1．实施
将40μgr-PA(P272V,F274P,K277V)在37℃下预保温15分钟，并且与同样在37℃下预保温15分钟下述单位的牛凝血酶(Sigma)混合并在37℃下保温10分钟。接着以1∶1(v/v)的比例，将试样与SDS试样缓冲剂(0.125mol/l Tris/HCl,pH8.8,4.6％(w/v)SDS,4mol/l尿素，0.1％溴酚兰，0.3mol/l二硫赤藓醇)混合，在95℃下保温3分钟，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。2．结果
图4示出了r-PA(P272V,F274P,K277V)通过凝血酶的裂解。数据表明通过提高凝血酶的量可完全将r-PA(P272V,F274P,K277V)裂解成双链形式。通过凝血酶裂解的r-PA(P272V,F274P,K277V)的蛋白酶结构域和Kringle2-结构域和通过血纤溶酶-消化产生的r-PA(r-PA(tc))双链形式的相应结构域有相同高度上。刺激物1：分子量标准*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA(P272V,F274P,K277V)刺激物5: r-PA(P272V,F274P,K277V)+凝血酶缓冲剂刺激物6: r-PA(P272V,F274P,K277V)+0.055NIH单位凝血酶刺激物7: r-PA(P272V,F274P,K277V)+0.55NIH单位凝血酶刺激物8: r-PA(P272V,F274P,K277V)+2.74NIH单位凝血酶刺激物9：分子量标准**)分子量标准：溶菌酶(14.307Da)，大豆-胰蛋白酶抑制剂(20.100Da)，磷酸丙糖异构酶(26.626Da)，醛缩酶(39.212Da)，谷氨酸脱氢酶(55.562Da)，果糖-6-磷酸盐-激酶(85.204Da),β-半乳糖苷酶(116.353Da),α-2-巨球蛋白(170.000Da)。**)r-PA(tc)：通过用血纤溶酶温育r-PA获得的r-PA的双链形式。参考文献：
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             序列记录(1)一般数据：
(ⅰ)申请人：
    (A)姓名：Boehringer Mannheim GMBH
    (B)街：Sandhofer街116
    (C)地区：曼海姆
    (E)国家：德国
    (F)邮编：D-68305
    (G)电话：08856/60-3446
    (H)电传：08856/60-3451
(ⅱ)发明名称：
可凝血酶活化的血纤溶酶原激活物
(ⅲ)序列数目：12
(ⅳ)计算机可读的内含
    (A)数据载体：软盘
    (B)计算机：可兼容的IBM PC
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    (D)软件：Patentin Release#1.0,Version#1.30B(EPA)
(ⅵ)原申请的数据：
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    (B)申请日：02.08.1996(2)序列NO:1的数据：
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    (A)长度：7氨基酸
    (B)种类：氨基酸
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(ⅰ)序列特征：
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    (A)长度：6氨基酸
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    (A)描述：/desc=“寡核苷酸”
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Claims (11)

1．来源于人的组织血纤溶酶原激活物的血纤溶酶原激活物，它按下列方式进行修饰：(a)如此进行修饰，使得血纤溶酶原激活物通过凝血酶可裂解并通过这种裂解转变成双链的形式，(b)如此进行修饰，使得其酶原性与人的血纤溶酶原激活物相比至少大1.2因子和(c)该血纤蛋白结合力如此地降低，以使高于50％的血纤溶酶原激活物可渗透到血块中。
2．根据权利要求1的血纤溶酶原激活物，其特征在于，它是如此进行修饰以使得通过血纤溶酶的可裂解性在氨基酸P1(275)和P1＇(276)之间降低10％以上，优选降低20％以上。
3．根据权利要求1或2的血纤溶酶原激活物，其特征在于，它们均匀地渗透到血块中。
4．根据权利要求1-3的血纤溶酶原激活物，其特征在于，它在G264和A288之间的氨基酸区域如此修饰，以使得血纤溶酶原激活物通过凝血酶可裂解。
5．根据权利要求1-4的血纤溶酶原激活物，其特征在于，修饰氨基酸区域459-471,417-425和/或氨基酸Q475,K505和/或E506。
6．根据权利要求1-5的血纤溶酶原激活物，其特征在于，修饰氨基酸G265和/或R267和/或在264和267之间的区域内插入至少一种氨基酸。
7．根据权利要求1-6的血纤溶酶原激活物，其特征在于，缺失指状结构域。
8．根据权利要求7的血纤溶酶原激活物，其特征在于，所述血纤溶酶原激活物仅含有蛋白酶结构域或Kringle2-结构域和人的组织血纤溶酶原激活物的蛋白酶结构域。
9．权利要求1-8的血纤溶酶原激活物的用途，用来制备用于治疗血栓栓塞疾病的药物组合物。
10．重组体制备权利要求1-8血纤溶酶原激活物的方法，其特征在于，用能够表达所述组织血纤溶酶原激活物的载体转化真核或原核寄主细胞，培育该细胞并分离所述血纤溶酶原激活物。
11．含治疗有效量的权利要求1-8血纤溶酶原激活物和必要时的药物助剂，填料或添加剂的药物组合物。
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