TW450996B - Thrombin-activatable plasminogen activator - Google Patents

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經濟部中央楳準局I工消费合作社印«. A7 B7_五、發明説明（1 ) 發明之背景 本發明係關於一種可由凝血酶活化之血嫌維蛋白溶酶 原活化劑，賅藥劑用於治療血栓性栓塞症，該蕖的成分包 括血織維蛋白溶酶原活化劑及其用法。 組織之血嫌維蛋白溶酶原活化劑（t — P A)是一種 絲胺酸蛋白酶，該酵索由許多結構苗組成，催化血縝維蛋 白溶酶原椁變成血織維蛋白溶酶而在治療上用於溶解血織 維蛋白。 目前己知大1：的t—ΡΑ變種及突變，參閱T. J. R. Harris( 1 9 8 7 )及 J. Krause( 1 9 8 8 )的文 章。 t — PA對血嫌維蛋白溶解作用之作用機制部份被t _PA和血纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑1 (PAI — 1 ，一種來自水蛭之絲胺酸蛋白商抑制劑）間之交互作用調 控。PAI — 1結合至t-PA主要經胺基酸2 9 6 — 3 0 2。此面域突變會降低PAI — 1對t—PA之抑制 劑效果（參聞 E. L. Mad i son et a 1 · ( ί 9 9 0 ))。 深入硏究此t— PA胺基酸區域2 9 6 — 3 0 2和PAI 一 1間之交互作用之文獻有E. L. Madison，Nature 339 (1989) 721-723； R. V. Schohet» Thrombosis and Haemostasis 71 (1994) 124 —1 2 8 ； C . J. Refino» Thrombosis and Haemostasis 70 (1993)313 3 1 9 ； N. F. Paoni * Pr- otein Engineering 6 (1993) 529—534 及 45 09 96 7丨-：-------:,裝------Tr------旎 (請先閎讀背面之注意夺項再c本頁_) ( 本纸浪尺度適用中困國家梯準（CNS ) A4规格（210：<297公釐） 經濟部中央樣準局真工消费合作社印" A7 B7__五、發明説明（2 ) Thrombosis and Haemostasis 70 (1993) 307 —3 1 2 ： W. F. Bennett» J. Biol. Chen. 266( 1991) 5191—5201» D. Eastman * Biochemistry 31 (1992) 419-422» 未修飾之人類t _PA (以下稱爲t -PA)之血漿 型由5 2 7個胺基酸組成能被血織維蛋白溶海切割成由雙 硫橋連接之雙鍵型式。A鏈（又稱爲重鐽）由四個構造上 的結檐區組成。其中指狀結構區（胺基酸1 _ 4 9 )和嫌 維結合素的指狀樽造有相當的類似性。生長因子結構面（ 胺基酸50 -86)和鼠科動物及人類表皮生長因子有 相當的類似性。紋狀（kringle )結構區（胺基酸87 一 2 6 1 )和血嫌維蛋白溶酶原的第四個和第五個紋狀（ ltringle )結構區有相當的類似性。t-PA的指狀及第 2個紋狀（kringle )結構區涉及嫌維蛋白結合及促進 嫌維蛋白之蛋白質水解的活性。t_PA的B鐽（胺基酸 2 7 6 — 5 2 7 ,蛋白酶結構區）是絲胺酸蛋白酶和尿 激酶及血嫌維蛋白溶酶之B鏈有相當的類似'性（參閱T. J. R. Harris (1987) and J. Krause ( 1 9 8 8 ))。 t - PA的酵索活性（將血織維蛋白溶海原活化成血 嫌維蛋白溶酶）在沒有孅維蛋白或纖維蛋白切割產物存在 下很低*但在促進劑存在下則能顯著的提升（大於1 0倍 )。在活體中，有關t-PA之作用機制參閱Korninger and Collen» Thronb. Haenostasis 46 ( 1 9 8 1 ) 450996 (請先《讀背面之注—項再c本頁) 本紙浪尺度適用中國國家標率（CNS ) A4规格（210X297公釐）_ 經濟部t央樣率局貝工消费合作杜印«. 4 5 09 9 6 at _B7_五、發明説明（3 ) 5 6 1 — 5 6 5之描述。t— PA活化血纖維蛋白溶酶原 形成血嫌維蛋白溶酶。血嫌維蛋白溶酶切割織維蛋白後形 成溶解的嫌維蛋白切割產物。t — PA被血液中之蛋白酶 /血織維蛋白溶酶切割後活化，其切點在胺基酸2 7 5 ( 精胺酸）和2 7 6 (異白胺酸）之間。在此過程中此二鍵 仍經半胱胺酸橋連結。 嫌維蛋白及嫌維蛋白切割產物促進活性的能力是t 一 PA的基本特性，以此能证分t —PA和其他的血嫌維蛋 白溶酶原活化劑，例如：尿激酶或鏈激酶。此促進效力經 修飾t - PA之胺基酸序列後能加以改進。測量促進效力 是在嫌維蛋白存在或不存在下其催化效率（Kcat/Km ) 之比率。Kcat是催化反應的速率常數而Kn是米氏（Mic-lia e!is)常數。修飾胺基酸2 9 2及/或3 0 5後，t 一 PA之促進效力能增加19至8 1倍（參閱E. L. Madison et al. * Science 262 (1993) 419— 4 2 1)〇 t — PA衍生物，參閿US patent 5，50 1，853其修飾的®域是胺基酸272 — 2 8 0，尤其是胺基酸2 7 4 — 2 7 7的區域及睡化作用 位點之區域（胺基酸1 1 7 — 1 1 9及1 8 4_1 8 6) 。此t - PA衍生物能改進蛋白質水解的及血嫌維蛋白溶 酶原溶解的活性，降低抑制敏感性，改進對嫌維蛋白之親 和性及/或改進血纖維蛋白溶海原溶解的活性對嫌維蛋白 的依賴性。 I丨~：------------ir------0} (請先《讀背面之注意事項再t本頁》 ί 本紙張尺度逍用中國國家搮準（CNS > A4规格（210X297公釐） 附件C :第861丨0829號專利申請案中文說明書修正頁 民國88年10月呈 經濟部智慧財產局貝工消費合作社印製 ( 4 ) 可由凝血酶活化之血纖維蛋白溶酶原活化劑已描述於 Wen— Pin yang et al. ♦ in Biochemistry 33( 1994)2306-2312.此重組之血纖維蛋白溶 .酶原活化劑（59 D 8 - s c u P A - t ) 由抗纖維 蛋白抗體 （59 D8)之Fab片段和凝血酶活化之低 分子量單鏈的尿激酶血纖維蛋白溶酶原活化劑 （ 3 011卩八一〇的（：-端部分組成*3(：11 PA-t是 將低分子量單鏈的鏈尿激痴血嫌維蛋白溶酶原活化劑（ s cuPA)之胺基酸 Phe-157 及 Lys — 158 用定點突變法移除。 可由凝血酶活化之血嫌維蛋白溶歯原之突變蛋白描述 於 K · N D a w s ο π e t a 1 ，i n J . B i ο 1 . C h e m . 2 6 9 (1984) 15989 — 15992。這些血纖維蛋白 溶酶原衍生物是將凝血酶-切割序列之切點胺基酸P 3、 P 2及P 1 *取代* N. F. Paoni et al.，於 Protein Engineering 5 (1992)259-266描述一種修飾胺基酸區域 296 — 299的t-PA，能增進纖維蛋白的專一性。 一種修飾過可由凝血酶活化之血锇維蛋白溶酶原活化 劑的凝血酶切點之該活化劑，描述於US patent 5 .200，340。該文指出雖然t — PA衍生物生 長因子結構面（EGF結構區）可以移除’但纖維蛋白 結合結構區（指狀結構區）及紋狀（kr ingle )構造® 必須保留β (靖先Mit背面之注条 -h. 項寫本頁)

— — — — —— · n If — — IV I I 本紙張尺度適用令困國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 7 4 5 09 9 6 A? B7 經濟部中央橾準局—工消费合作社印装 五、發明説明（5 ) 由 W0 91/09118 及 W0 9 4 / 1 0 3 1 8 得知，血嫌維蛋白溶酶原引入凝血酶切黏後可被凝血酶活 化，形成血縝維蛋白溶酶。因爲凝血酶位於血凝塊之內， 所以活化作用主要是發生在血凝塊。但是此方法的缺點是 須要使用大*修飾的血嫌維蛋白溶酶原治療病人。 本發明的目的是提供一種改良的血繅維蛋白溶酶原活 化劑，其能在活《中髙度專一且有效的溶解血凝塊。 達成以一目的是使用以人類組嫌型血嫌維蛋白溶海原 活化劑爲底質的血織維蛋白溶酶原活化劑： a)經修飾後此血嫌維蛋白溶海原活化劑能被凝血酶切割 後轉變成雙鏈形式， b )經修飾後其海原性和人類t - PA相較至少增高 1 . 2倍，較佳者爲2倍而 c )其和嫌維蛋白之結合則作某種程度的下降，此血嫌維 蛋白溶酶原活化劑能增加50 %之穿透進入血凝塊 0 此血縝維蛋白溶薛原活化劑專一的作尾於血凝塊，因 此能顓著的降低血嫌維蛋白溶酶原活化劑己知的的副作用 〇 先從人類組嫌型血嫌維蛋白溶酶原活化劑的序列爲起 點*接著根據本發明所謂的"以人類組織型血嫌維蛋白溶 酶原活化劑爲底質’’是指本發明的血嫌維蛋白溶酶原活化 劑序列是源自人類血嫌維蛋白溶酶原活化劑的序列。此點 意味著在構造上至少保留部份t -PA的構造特色（結構 (請先閲讀背面之注意事項再本3ί'·) 本紙張又度通用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（210X297公釐〉 經涛部中央揉準扃员工消费合作杜印策 4 5 09 9 6 at _B7_五、發明説明（6 ) 區）之特性。例如，本發明除了作了根據本發明之修飾外 仍然保留血《維蛋白溶酶原活化劑之第2個紋狀（kr ingle > 構造及 / 或蛋白海結構® 。根據本發明進行刪除、 突變及/或增加胺基酸之後亦保留上述之結構區。改變胺 基酸之序列能用热於此技藝之專業人士所热悉的方法進行 ，例如：定點突變作用或聚合酶連鎖反應（PCR )。 根據本發明之修飾的血嫌維蛋白溶酶原活化劑的較佳 «系，其被血嫌維蛋白溶海在胺基酸P1 (275)及 P 1 1 ( 2 7 6 ) Μ切割之切割性和人類組織型血纖維蛋 白溶酶原活化削比較下顯得較低。根據本發明較佳之血嫌 維蛋白溶酶原活化劑被血嫌維蛋白溶酶切割之切割性至少 降低1 0%*更佳者爲2 0%而最佳者爲5 0%或更多。 而被血嫌維蛋白溶酶切割之切割性也不必完全破壞。尤其 是根據本發明改進血嫌維蛋白溶_原活化劑被血織維蛋白 溶酶切割之切割性後能改進凝血酶之活化 用。 然而在活髖中最好是將切割性降低至和生理相關的切 割不再發生。這樣才可能大大的降低血嫌Μ蛋白溶酶原活 化劑之副作用。因此才能在活中急遽降解凝結參數而使 出血的時間不至於顯著增加。 血繊維蛋白溶海之切割性能在離體中測定。測定時將 血織維蛋白溶两原活化劑在2 5 X：下和增加含之血嫌維蛋 白溶酶反應5分鐘，接著依據血嫌維蛋白溶酶原活化劑的 大小在含12. 5 - 15 %之丙烯醣胺凝膠中進行 SDS 電泳分析（參閱 U. Kohnert et al. ’Protein I . -- (請先M讀背面之注$項再f本I-〕 訂 線 本紙張尺度適用中圃固家標率（CNS ) A4规格（210X297公釐） 經濟部中央梯準局負工消费合作社印製 4 5 099 6 A7 __B7_五、發明説明（7 ) Engineering 5 (1992) 93—100) 0 修飾之血嫌維蛋白溶海原活化劑不再，或僅只有部份 被血繊維蛋白溶酶在P 1和P 1 ’ （命名是根據Schecht-e r ，J. and Berger » A. » B i ochera. Biophys. Res C o-mmm 27 (1967) 157 -162)間切割，切割 的方法包括所有熟於此技藝之專業人士所知道的方法。血 嫌維蛋白溶酶的切割點位於R2 7 5 — I 2 7 6 (胺基酸 之名稱爲一字碼）序列之間。而修飾這一個或兩個胺基酸 能破壞或降低血織維蛋白溶海的切割性。 血織維蛋白溶海的切割性亦可因修飾P 4 — P 3 * ( 胺基酸2 7 2 — 2 7 8 )而降低。在此例子中P2最好轉 變成小的，疏水性的及/或非芳香族的胺基酸，例如P。 結果除了降低血嫌維蛋白溶酶切割性之外亦可增加凝血痗 之切割性。 於此製程中最好加入一些下列之一般狀況： (P ) P 4 ： 任何胺基酸（除了 P，若P’2是P，則最 好是L、I、V ) (Q) P3:任何胺基酸 (F) P 2 ：疏水性胺基酸（F、H、G、V、L、I 、T、A或P，最好是P ) (R ) 卩1:1^或1^，最好是尺 (I) Ρ1·:ν或I，最好是I { Κ )卩2*:乂、1^、1或1^，最好是乂 ^----；------^------1Τ------線，· ♦ ) I. (請先閱讀背面之注意事項再f本頁) { 本紙張尺度逍用中國國家揉率（CNS>A4規格（ 210X297公釐> _ _ 4 5 09 9 6 A7 B7

經濟部中央梂準扃及工消费合作社印I 五、發明説明（8 ) (G ) P 3，： G P 4最好是轉變成V，P 2最好是轉變成P而P 2 * 最好是轉變成V。由此可以產生較佳的切點（2 7 2 — 2 7 8 ) VQPRIVG 。<序列認証號碼：1 ) 根據先進之技藝亦可引入凝血酶之切點。但是最好在 胺基酸2 6 4 — 2 8 8間之區域引入逋當的突變。 修飾 t-PA之 459 -471 環，417 — 425 自解環及/或胺基酸Q 475、K 505及/或Ε 5 0 6亦可增加凝血酶之親和力。 酵索對其底物之專一性隨切點之序列（一級序列）而 定。在絲胺酸蛋白酶，例如：凝血酶及血嫌維蛋白溶酶， 此Ρ 1殘基是重要的專一性決定面。折叠蛋白質底物之專 一性亦鼸酵素（凝血酶或血織維蛋白溶酶）和底物（血嫌 維蛋白溶酶原活化劑）間接觸的特性和切黏的彈性及構形 而定。因爲血嫌維蛋白溶酶和凝血酶的初級專一性非掌類 似（二者均切割精胺酸後之Ρ1位黏），m以不可能同時 降低血嫌維蛋白溶酶（血嫌維蛋白溶酶活化性）之切割或 增加凝血酶（凝血酶活化性）之切割而輕易得到血嫌維蛋 白溶酶原活化劑或者是顯著的增大血織維蛋白溶酶活化性 (至少增大2—10倍）。因此修飾酵素和底物間的二級 結合位點（修飾活化環構造上的及動力學的性質）後異想 不到的發現了上述性質。 用突變方法改瓣胺基酸2 6 4和2 8 8間之活化環的 (請先《讀背面之注意事項再f本1) 訂 線 本纸浪尺度邊用中困國家標準（CNS)A4规格（2丨0X297公釐）_ ^ _ 450996 經濟部中央樣丰扃貞工消费合作社印«. A7 B7 五、發明説明（9 ) 初級專一性能引入凝血海專一的切點同時自動降低血織維 蛋白溶酶切制性。上述突變在ffi域2 7 2 — 2 7 7 (P4 一 P 2 ')之間尤佳。 修飾結合環之弹性及/或可接近性可以改進凝血海之 切割性。爲了達成此一目的，修飾G 2 6 5 (突變會降 低弹性）或R 2 6 7 (突變會改變G 2 6 5和丑 4 1 0間之鹽檐而影響切割）尤佳。在2 6 4和2 6 7間 之面域插入胺基酸亦很理想。R 2 6 7被修飾成S效果亦 佳（參閱 D. Lamba et al. ，J . Mo 1 · Biol. 258 (1996) 117-135) 〇 其中一種增加彈性的突變是將R 2 6 7變成S，同 時將P4突變成F、P 3突變成G、P2突變成P而 P 2 ’突變成V。 改變二級專一結合的位點能進一步改進凝血海的切割 性及專一性。此4 5 9 — 4 7 1環能完全或部份刪除。此 環之胺基酸組成是： GDTRSGGPQANLH. (序列認証號碼：2 ) 此環上的PQANLH (序列認証躭碼：3 )區域最好完 全或部份刪除（其中Η最好保存）或修飾其胺基酸序列 Ο 以下序列最好用於胺基酸2 7 2 - 2 7 7之班域： (請先閱讀背面之注i項再f本頁) 訂 本纸浪尺度逋用十國國家橾準（CNS)A4規格（210X297公藿> -12 - 經濟部中央揉準局貞工消费合作社印製 5 09 9 6 at ___________B7_ 五、發明説明（10 ) GIPRIV (序列認証號碼：4) AQPRIR (序列K証號碼：5 ) 亦可用以下之序列 GLSQASQGIPRIV (序列豚証號磚：7〉 於胺基酸2 6 5及2 7 7 ( t — PA原始序列GUQYSQP-QFRIK (序列認証號碼：6 ))問之區域。序列 GLRQYSQAQGIPRi V (序列認証號磚：8 ) 亦可用於此區域。於此胺基酸序列中，G及丨插入Q及P ( 原始序列：Q及F)。如此之插入可用於2 6 4及2 7 6 面域問之任何位黏。 根據本發明化合物切酤（序列認証號磚：1 )之突變 是P4變成至F、P3變成G、P2變成P、P2’變成 V及R 2 6 7樊成S中一種或多種最好是圣部之組合。 本發明較佳之《系中，血嫌維蛋白溶酶原活化劑再多 含一種突變能急遽的降低單鍵形式但非《鏈形式之活性因 而改進酶原性1. 2倍，較佳者2倍或更高。 酶原性是代表雙鏈形式之活性及單鍵形式之活性的商 數◊此活性由溶解醯胺的方法測定。此血嫌維蛋白溶酶原 活化劑在活«中達成高選擇性及有效溶解血栓且大大地降 低副作用。適當的單鍵形式之突變描述於E. L. Madison 本纸張尺度速用中國國家揉準（CNS > A4规格（210X297公釐）_ ^ (請先閱讀背面之注意事項再f本頁) 訂 線 經濟部中央揉準局霣工消费合作杜印製 4 5 09 9 6 A7 __B7_五、發明説明（11 ) et al. * Science 262 (1993) 419—421 Ο 爲了增加酶原性（雙鏈形式和單鏈形式之血嫌維蛋 白溶酶原活化劑其醣胺溶解的活性的比例），最好是將（ 所有來自人類組嫌型血織維蛋白溶酶原活化劑之血雄維蛋 白溶酶原活化劑）Κ 4 2 9變成Q及/或Η 4 17變成 Τ及/或抑制或干痠Κ 4 2 9及Η 4 17間之交互作用 。根據本發明較佳之化合物含VQPR I VG (序列認証號碼： 1)之切點（272 278)和Κ 429變成Q及/或 Η4 1 7變成Τ之突變。 用刪除法（無功能上可活化之指狀結構面）只能降低 嫌維蛋白結合能力能使血嫌維蛋白溶酶原活化劑穿過凝塊 (大於5 0%)及均勻的分散。經凝血酶切割後展示活化 之雙鏟形式之活性。因此用此方法降低血嫌維蛋白溶酶原 活化劑之繊維蛋白結合能力後t 一 Ρ Α不再對對嫌維蛋白 有髙的親和力。此專一的作用機制能增加血嫌維蛋白溶酶 原活化劑效力且大大的降低副作用。根據本發明血織維蛋 白溶酶原活化劑穿入凝塊能用離tt的模式測定。穿越凝塊 的程度及在凝塊中之分布可用肉眼測定。評估此血織維蛋 白溶酶原活化劑是用如US patent 5，2 2 3，2 5 6所 描述爲標準的方法，並嫌以定義（測定濃度爲3 # g/ ml)凝塊之穿透、分散之均勻性及其10 0 %之値。 根據EP-B 0 093 619，以不會穿過凝塊及結 合在表面之重組人類組嫌型血嫌維蛋白溶酶原活化劑作爲 -14 - 本紙張尺度通用中阖國家橾準（CNS } A4规格（210X297公釐） ----------— (請先Μ讀背面之注$gf再頁) 訂 線 4 5 09 9 6 經濟部中央搮準局貝工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（12 ) 標準樣品。程序描述於實施例3 c用於決定凝塊之穿透性 。和標準樣品比較後發現”非穿透入凝塊”意指大部分（ 大於等於8 0%)之血嫌維蛋白溶酶原活化劑出現在凝塊 的前四分之一而”均勻分布指至少5 0%之血鼸維蛋白 溶酶原活化劑深入凝塊而出現在其他的四分之三部分。 根據本發明若使用沒有或僅有微置之非專一性嫌維蛋 白結合能力之血嫌維蛋白溶酶原活化劑，其凝塊溶解的專 一性及有效性能更一步的增加。此分子能深入凝塊而能保 証血嫌維蛋白溶海原有效的活化凝塊中之血嫌維蛋白溶酶 。此血纖維蛋白溶酶原活化劑以：例如t -PA (WO 9 6/1 7 9 2 8 )之蛋白酶結構區或含第2紋狀（kri-iigle)結構面及蛋白酶結構區但非t - PA結構區指狀結 構西（WO 9 0/09437、US patent 5，223，256、 EP-B 0 2 9 7 066、 EP - BO 1 9 6 920.)爲主。 根據本發明較佳的賺系之血嫌維蛋白溶酶原活化劑經 修飾後不能被PAI — 1抑制。此修飾是將鯈基酸2 9 6 -3 0 2 突變（參閱 Madison，E. L. et al. ，Proc . Nat i . Acad . Sc i. USA 8 7 (1990)3530- 3533)及將胺基酸 296 -299 ( KHM )用 A A A A ( W 0 96/01312 )取代。 根據本發明此化合物是溶解血栓的活性蛋白質，和t -PA( A!teplase )相反，該化合物逋合作靜脈的大 量快速注射。在較低劑置時其功效就和注射標準臨床上溶 ------------ ** >lr <請先閲讀背面之注意事咬再本頁) 訂 本紙張尺度逍用t國國家榇準（CNS M4规格（210X297公釐） -15 · 經濟部中央棣準局工消費合作社印«. 45 09 9 6 at __B7_五、發明説明（13 ) 解血栓作用的Alteplase相等。 增加專一性及降低相關的出血的副作用使根據本發明 之化合物成爲出色的血栓溶解劑能治療所有的血栓性栓塞 症。和以前批準使用於極端致命的疾病，例如：治療心肌 梗塞及大塊的肺栓塞的血栓溶解劑不同，根據本發明之化 合物可使用於治療更急性的致命疾病，例如：深層靜脈血 栓之血栓溶解作用。此外根據本發明之化合物使用範園更 廣，因爲排除了主要出血的併發症的危除。根據本發明之 化合物亦可用於急性的疾病，例如心肌梗塞或肺栓塞。 根據本發明之血嫌維蛋白溶酶原活化劑可用热於此技 藝之專業人士热知的方法在»核生物的或原核生物的細胞 生產。根據本發明之化合物最好用基因工程方法生產。此 製程描述於，例如：WO 90/09437、EP_ A 0 2 9 7 066、EP-A 0 3 0 2 456、EP- A 0 2 4 5 100 及 EP-A 0 400 545。突 變可用寡核苷酸定點突變作用引入t - P A或其衍生物之 cDNA。定黏突變作用描述於Zol丨er and Smith( 1 9 8 4 )，及T. A. Kunkel ( 1 9 8. 5 ) and Moriuaga et al . (1984)°PCR之突變作用製程亦可使用 ，胲方法描述於Ausube丨et al · (1991)。 根據本發明得到的血嫌維蛋白溶酶原活化劑之核酸用 逋當的表達載《在宿主細胞表遑。 根據本發明蛋白質之核酸序列可進一步的修飾。例 如： 16 - 本紙張尺度遑用tit國家搮準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意Ϋ-項再t本頁) 订 線 4 5 09 9 6 經濟部中央橾準扃貞工消費合作社印裝 A7 B7_五、發明説明（14) 修飾核酸序列後加入各種限制海辨識序列以幫助結合 、選殖及突變作用之處部驟。 修飾核酸序列後加入宿主細胞較佳之密碼。 在核酸序列中加入調控及轉錄元件使宿主細胞表達最 逋化。 生產逋當表連載«及的表達所有的製程步驟的先進之 技藝對熟於此技藝之專業人士而言是相當热悉的。該方法 描述於，例如：Sambrook et al. "Expression of closed genes in E . c o 1 i " in Molecular Cloning __ A 1 a -boratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press » New York* USA 0 根據本發明生產醣化的血钂維蛋白溶海原活化劑是使 用眞(核生物的宿主細胞'、根據本發明生產非醣化的血嫌維 蛋白溶酶原活化劑是使用ft核生物的宿主細胞，先得到醣 化的產物然後用热於此技藝之專業人士知道的方法去酸化 或者在無醣化作用的宿主細胞，較佳者爲原核生物的宿主 細胞表達。 大»桿菌，鏈球菌或枯箪芽孢桿苗是逋當的原核生 物的宿主。爲了生產蛋白質，根據本發明將原核生物的 細胞於常用之方法中發酵而於常用之方法中將蛋白質從溶 解的細菌中分離。若蛋白質以不活化之型式（包含髏）產 生，則根搛熟於此技藝之專業人士热知的方法先將其溶解 及復性。根據熟於此技藝之專業人士熟知的方法，蛋白質 亦可能以活化之蛋白質的形式從微生物分泌。適合的表達 (請先聞讀背面之注意^項^^^本頁) V) 訂 本紙張尺度遑用中國國家揉隼（CNS)A4洗格（ 210X297公釐）-17 - t 45 09 ^0 M濟部中央揉準局負工消费合作社印«. A7 B7_五、發明説明（15 ) 載«內含倌號序列，其能用該核酸序列編两之蛋白質將蛋 白質從宿主細胞向外分泌。在製程此中此載髏表達之蛋白 質能直接分泌至培養液（格蘭氏陽菌）或分泌到細胞質周 園空間（格蘭氏陰菌）。根據本發明，信號序列及t -P A衍生物序列閏最好加入蛋白質切點序列以便在製作過 程或蛋白酶治療中切割。 根據本發明選擇的內含血嫌維蛋白溶酶原活化劑 D NA序列之表達載體之轉形作用是依宿主細胞而定。逋 當的質《之基本須求（例如：複製起點*限制酶切點）對 於熟於此技藝之專業人士而言是熟知的。本發明亦可使用 热於此技藝之專業人士热知的黏接質體、噬菌體（λ， Ml 3 )之複製雙股形或其他戰髅替代。 根據本發明於原核生物生產不分泌之血嫌維蛋白溶酶 原活化劑，最好將包含《從溶解的細菌顆粒中分離出來， 用變性劑在還原狀況下溶解包含《內含之血嫌維蛋白溶酶 原活化劑，然後加入G S Η及變性劑在非變性澳度或L 一 精胺酸之下將其轉變成G S S G而將血織福蛋白溶酶原活 化劑復性。此活化包含《內t - ΡΑ及衍生物的製程描述 於、例如：EP-A 0 219 874及EP-A 0 241 022。然而亦可使用其他的製程方法自包含饞 分離活化之蛋白質。 根據本發明血嫌維蛋白溶酶原活化埘最好在L_精胺 酸（濃度爲1 0 — 1 0 0 Ommo 1/丨）中純化。 外來蛋白質用親和力色層分析分離，最好使用固定 (请先Μ讀背面之注•項本頁)

本纸伕尺度遑用中因國家揉準（CNS)A4规格（ 210X297公釐）-18 - 450996 A7 B7 钂濟部中失揉率局員工消費合作社印製 五、發明説明（16) ET I (地衣胰蛋白海抑制劑）之吸附管柱。以瓊脂糖R 作爲支持物。用ETI吸附管柱純化的優黏是ET I吸附管 柱物質可以直接裝載復性混合物，即使精胺酸的满度大於 0· 8 m ο 1 /丨。根據本發明，血繳維蛋白溶酶原活化 劑是用ETI吸附管柱在濃度0. 6 — 0. 8mol/l 精胺酸之下純化。用於此製程之溶液p Η大於7較佳者介 於7 . 5及8 . 6之間。 根據本發明，不論精胺酸是否存在，是用降低ρ Η的 方法將血嫌維蛋白溶酶原活化劑自ETI管柱洗提。此製 程中較佳的ρ Η値是在酸性範園介於ρ Η 4 . 0和5. 5 之間。 本發明進一步的主題是一種薬的'成分，根據本發明該 藥內含溶解血栓的活化之蛋白質，其中此蛋白質的構造只 含人類組嫌型血嫌維蛋白溶酶原活化劑之蛋白酶結構區及 非必須的第2個紋狀（kr ingle )結構區以具有溶解血 栓的活性。 根據本發明所使用的血嫌維蛋白溶酶雇活化劑，能被 热於此技藝之專業人士用作配方來生產治療劑，其中根據 本發明之化合物通常和蕖理可接受的載體混合。典型的成 分內含有效纛0. 1_7 msr/kg，更佳者含0, 7 ~ 5mg/k g而最佳者含1 _ 3mg/k gft重之劑童 。此治療的成分通常以滅苗水溶液或無菌可溶之乾燥（例 如冷凍乾燥）配方的形式使用。此成分通常含一逋當量之 蕖理可接受的鹽以製備等張溶液β此外緩衝溶液，例如： ：----Γ-----------ΪΤ------_: <請先《讀背面之注$項^^本頁) ί、 本紙浪尺度速用中困國家標準（CNS ) Α4规格（210X297公釐）-19 - 4 5 09 96 雉*部中夬標率局貞工消费合作社印«. 五、發明説明（17) 精胺酸緩衝溶液、磷酸緩衝溶液亦可用於穩定適當的P Η 値（較佳者介於5. 5 — 7. 5之間 > 。根據本發明之化 合物其使用置可爲热於此技藝之專業人士簡單的決定。例 如，依使用之型式（注射或大量快速注射）及治療時間。 因爲其半生期（在活龌中降解時間）長，根據本發明之化 合物適於大量快速注射（單一大量快速注射，多重大量快 速注射）。用於大量快速注射之型式，例如：安瓿，內含 25-1000 mg根據本發明化合物、加强血嫌維蛋 白溶酶原活化劑溶解度之物質（例如精胺酸）及緩衝溶液 。較佳之治療法有靜脈內的注射、皮下的注射、肌肉內的 注射或動脈內的注射。此外根據本發明血嫌維蛋白溶酶原 活化劑亦可局部注射。 根據本發明之化合物能多重大量快速注射（轉佳者爲 二次大量快速注射）。逋當的隔間介於2 0和1 8 0分鏟 之間，介於3 0至9 0分鏟之間尤佳而介於3 0至6 0分 鐘之間最佳。以外注射根據本發明化合物之亦可介於1小 時至2天之間。 — 根據本發明之化合物適於治療所有的血栓性栓塞症， 例如：急性的心肌梗塞、腦部梗塞、肺栓塞、腿部深層靜 脈之血栓形成作用、急性的動腿閉塞等。根據本發明之化 合物尤逋於治療須要進行較長期血栓溶解作用之次慢性的 血栓性栓塞症。 根據本發明之化合物最好和凝結抑制刺（抗凝.血劑） 合用，例如：肝素及〆或血小板凝集抑制劑以增加血管擴 I--：------^-- (锖先Μ讀背面之注意Ϋ·項本莧) 訂 本紙張尺度適用t國®家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-20 - 450996

經濟部中央橾準局貝工消费合作杜印装 五、發明説明（18) 赉效甩並減少副作用。根據本發明之化合物於治療時能同 時或不同時和抗凝血劑一起使用。同時亦可加入促進血流 或增進微循環之物質。 以下之實施例、發表之文獻、及序列表及圓示能進一 步的說明本發明申請尊利範園保護的範園。撤述之製程及 實施例修飾後亦屬於本發明之範園。 以下之”r - PA”是指重組之血嫌維蛋白溶酶原活 化劑，內含結構區K2及人類t _PA之P。生產此血嫌 維蛋白溶酶原活化劑已描述於U. S. patent 5，2 2 3 » 2 5 6 ° r — PA(F274P，K277V)是指血纖 維/白溶酶原活化劑內含結構BEK2及P之胺基酸2 7 4 ( / )被胺基酸P取代而胺基酸2 7 7 (K)被胺基酸V ( /指定之胺基酸類似T . Harris ( 1 9 8 7 ))取代。

圖1是血漿凝塊穿透及溶解棋式之圖示。爲了避免血漿因 爲剪力而凝結，壓力由緩衝溶液室（斜線运）產生。混合 緩衝溶液和血漿時（打黏區），爲了避免凝塊而加入氣泡 捕捉裝S。j 1:緩衝溶液貯存區；2:蠕動泵浦：3:氣泡捕捉裝置 :4:血嫌維蛋白溶解劑注射器：5:含凝塊之移液管頂 端（交差斜線: 6 :管夾：7 :壓力元件。 圖2各自顯示被凝血酶切割之r_PA (F 27 4P， Κ 2 7 7 V ) (Α)及r—PA( B丄。j (詳見寅施例8 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）-21 - (請先闥讀背面之注意Ϋ-項再f本頁) 450996 鯉濟部中央樑率局貝工消費合作杜印製 五、發明説明（19 ) )° 自顯示被血嫌維蛋白溶酶切割之r — PA ( S^rTT P » K 2 7 7 V) (Α)及 r-PA(B) 〇 j ( 詳見實施例9 )。 4顯示被凝血酶切割之r 一 PA ( P 2 7 2V， F 2 7 4 P . K 2 7 7 V )J( 詳見實施例1 Ο )。 資施例1 :根據本發明生產重組化合物 a)構建表達質體 起始質髄 p A 2 7 f d 描述於 T a i w a n e s e P a t e n t A p plication N o . 7 9 1 0 0 8 0 7 (Taiwasnese Pate~ ntNo. 52847)內含以下成分：tac啓動子、丨ac 操作子面域內含ATG起始密碼、突變蛋白t 一 PA之第 2個紋狀（kringle )結構區及蛋白海結構B[編碼面域 和fd轉錄終止子。 描述於 Morinaga et al. Biotechnology ( 1 9 8 4 )636之方法用於引入突變。爲了形成M型雙螺旋儺， 分離自ΡΑ2 7 f d之二片段（例如，片段A :大的 BamHI片段：片段B:載髖用Pvul切成線性）。 用於突變作用之寡核苷酸列於表1。 製備之異型雙媒旋«和質髏PUBS 5 2 0 —起轉形至大 腸禅菌 （Bri nkntann et a!. ， Gene 8 5 ( 1 9 8 9 )1 0 9 )。轉形鳗於培養皿中用氨比西林及康徽索（各 爲5 0#g/m!)飾選。 (锖先閲讀背*之注$項再f本頁 订 線· 本紙珉尺度適用中困«家標準（〇邶）六4規格（2丨0乂297公釐）-22· 經*部中央梯準属負工消费合作社印«. A7 B7___五、發明説明（2〇 ) 產生之質體示於表1。 b)大腸样菌之表達 爲了決定含質體（見表1 )及PUBS 5 2 0之大腸 襌菌在氮比西林及康徽索（各爲5 0 p g/m 1 )之LB 培養液中生長至OD55〇nm爲0 . 4 ( Sambrook et al. »1989» Molecular Cloning» Cold Spring Ha-rbor)時之表達產率。加入IPTG開 始表達。培養繼緩進行4小時。接著離心收集大腸桿菌細 胞，再懸浮於緩衝溶液（5 0 m m ο 1 / 1 T r i s H C 1 p Η 8、50 m m ο 1/1 EDTA);此細 胞用超音波振盪打破。不溶之蛋白質離心收集後用超音波 振盪再懸浮於上述之緩衢溶液。此懸浮液用1/4髏稹之 緩衝溶液（250 mmol/lTris-HCI ρ Η 6. 8、10 mmol/I EDTA' 5 % SDS、 5 %乙硫酵、50 %甘油及0. 005 %溴酚藍）混 合。用12. 5% SDS之聚丙烯醯胺凝膠分析。控制組使 用有相同質體之大腸桿菌培養後不用I P TG誘發表達。 在IPTG誘發表達的培養中用孔馬西藍（coomassie blue ) R2 5 0 (溶於3 0%甲醇及1 0%醋酸）染色 後可見到一條分子量約4 0 kD之帶。此帶不在控制組出 現。 更進一步生產活化之化合物詳見E P — A 0 382 174之實施例2及3。 45 0996 (請先Μ讀背面之注意Ϋ-項本頁) 本纸張尺度適用中Η國家搮準（CNS)A4规格（2丨0X297公釐）-23 - 45 09 9 6 a? B7 明説 明發 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 -^ \—/ nl 2 ! Plasmid | < α. E pttPA-2 rn < a τ < < 二 iM < < t • ,：.：·： 1 VW 名 ::¾ pH :3 ：；C S δ η ϋ Η U d ο ο < ο ο tjj y α ί- < α Ό ο G ο ο < 匕 ο ο ο 8' < ϋ :< Γ* Ό F- U G d a < o q b σ ϋ 0 . ul ij o o a d < ϋ % ϋ < Η d < ο ci ο <1 u ϋ α ο ϋ 民 ϋ o a h o 0 s Ό 1 P d a a d < ϋ b O Γ2 -Si c 0 ,£P V *£ ep Ί 1 <S < a. 〇 ε ε «2 C 2 M h d o a b < o q a d 5 〇 o o ϋ < h a T? ,-s i i c §] 0 5 3 o 1 < CL s T3 ε s Q. ε 芑 1 cq _〇 _u c J c •i s <s cu 1 i ε c rt C4 Mutation sites > 个 Cu Φ g ΓΜ > 个 cu pj rs ca b) 267R > S, 272Ρ -» F, 273Q G 274F 今 P, 277K + V σ 个 σ* <N Ό H 个 X 卜 *ΐτ *4? i c- ^4> -o —cs 内 π 2ldNQa3s 1I0Z90-3S ο- 02Θ σωΜ 6oNea3s {請先聞讀背面之注意事項再本頁)

線1 if.. 本紙張尺度逍用中國國家橾率（CNS } A4规格（210X297公釐）-24 450996 經濟部中央楳準局貝工消费合作社印装 五、發明説明（22) 實施例2 :在活«中之特性 使用 D C ο M e n ( J CM i n . I π v e s t · 7 1 ( 1983) 368 — 376)建立之兔子模式的頸靜脈血 栓溶解作用來測定根據本發明之蛋白質溶解血栓的效力及 效率。於此方法中在動物之頚靜脈產生放射性檩記之血栓 。動物經皮下的注射1 0 0 IU/kg抗凝血之肝素。將 Alteplase (重組之野生型血緝維蛋白溶酶原活化劑，”t — PA'_ ，'商品名稱 Actilyse®，製造商爲 Thomae Company， Biberach* Germany) 、 描述於實施例 1 之蛋白質 、鍵激海（商品名稱Streptase®，製造商爲Behring Company，Mar burg，Germany)或溶劑（0. 2 Μ 精胺 酸磷酸緩衝溶液）經靜脈內的注射入兔子。 安慰劑組接受靜脈單一大量快速注射1 m g /k g之 溶劑。Alt ep Use組靜脈內的注射之總劑量爲1 . 4 5 m g / k g ； 0 . 2 mg/kg爲起始的注射董， 0.75 mg/kg爲30分鏟後之注射量，0. 5mg /kg爲6 0鐘後之注射置（總共注射/ 9 0分鐘）。 鐽激酶組接受6 0分鐘6 4，0 0 0 IU/kg之靜脈注 射。根據本發明之蛋白質組接受單一大量快速的靜脈內注 射。於AltepUse及鍵激酶之測試是使用標準規範。 治療後2小時，移去殘餘之血栓，血栓溶解由血栓中 降低的放射活性決定。血液樣品於治療前及治療後2後小 時得自血漿β活化凝血激素所需要的時間由檫準程序測定 。溶解血栓的治療中血液之損失亦同時定量。於使用血栓 <請先Μ讀背面之注I項再本頁) 本紙張尺度適用中國國家揉率（0呢>八4规格（210><297公釐）-25- 45 09 9 6 A7 B7 趣濟部中央樣準局胄工消费合作杜印裝 五、發明説明（23) 溶解劑前，在動物的大腿上用解剖刀作一個4公分長及 0. 3公分深的切口。自然凝結後停止出血。治療開始 後用一塊海綿ff於傷處吸收血栓溶解作用後之出血。出血 置由海綿稱重後決定（扣除海綿原有之重置）而決定出血 副作用的程度。 Alteplase及根據本發明資施例1之蛋白質是高度活 化之溶解血栓的物質而能踱著的溶解凝血。 實施例 3 :比較凝塊溶解之活性 a)凝塊溶解測定之程序 在凝塊溶解測定中測定實施例1之t - P A及重組蛋 白質之活性。 樣品蛋白質之濃度用緩衝溶液 （0. 06M N a 2 Η Ρ Ο 4 » pH 7 . 5， 5 m g / m 1 B S A (牛的血清蛋白），0. 0 1% Tween®8 0)調整。 0. ltnl樣品和lml人類嫌維蛋白原溶液（IMCO )(2 m g / m 1 0. 0 0 6 M Na2H>〇4» pH 7 . 4 > 0 . 5 m g / m 1 BSA，0. 01 % Tween ® 8 0 ) 混合後在下3 7 eC反應5分鐘。然後加入 1 0 0 " 1之血織維蛋白溶酶原溶液（1 0 IU/ml 〇 〇 6 M Na2HP〇4/H3P〇4» pH7. 4， 0 . 5 m g / m 1 BSA，0. 0 1% Tween ® 8 0 ) 及凝血酶溶液 <3 0U/ml 0. 06M Na2HP〇4 ，PH 7. 4*0. 5 m g / m 1 BSA， 0. 〇 1 ---r------裝-- %-s-/ :請先閲讀背面之注—項再本頁) 訂 本紙張尺度通用中國國家梯準（匚阳）八4规格（210父297公釐）-26- ;4 5 09 9 6

A7 B7 經濟邨智慧財產肩貝工消f合作社印製 五、發明說明（24 ) % Tween ®8 0 )後反應混合物繼續在3 7 °C下3 7 °C反 應。兩分鐘後在纖維蛋白凝塊中置入Teflon ®，當球到達 試管底部時終止反應。 b)測定動態的血漿模式之活性 根據本發明之物質於此動態的血漿模式以類似在活體 中的條件作測定•將受測物貿加入血漿凝塊，於類似心跳 的壓力下在蠕動壓力下作用· 將2 0 0 jul檸檬酸處理過之血漿和2 0 # 1之 0. 2 5 m 〇 1/1 CaCl2溶液混合後於下 培養。加入0. 16U凝血酶後混合物置於lml之定量 滴管頭（pipette tip ) (Eppendorff，Hamburg，GER )。此定量滴管頭在2 3 "C下垂直置放2分鐘，於 0 . 0 1 m 〇 1 / 1 T r i s / H C 1 » P H 7 • 4， 0 . 1 5 m 〇 1 / 1 N a C l z 1 0 - 0 2 5 m 0 1/1 C £ 1 C 1 2， 0 0 1 % Tween ® 8 0 中 反 應6 0 分鐘 後置入凝塊溶解裝置。此凝塊溶解活性於內含彈性管之轉 辙系統（圖1 )中測定·由蠕動泵浦推動流入兩條平行側 線•側線A含1 m 1之定量滴管頭其內因含血漿凝塊所以 封閉此側線。側線B是平行側線A的盲管。側線B的壓力 用管夾調整至1 Omb a r 。將血漿（lm I )加入凝塊 β打開泵浦等1 5分鐘檢査各凝塊之穩定性β將血纖維蛋 白溶解劑（實施例1或CHO — t - ΡΑ蛋白質之血漿最 終濃度介於0. 5'1〇及20#g/mi之間）用1 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（210 X 297公* ) q------ (请先Μ讀背面之注f項再填寫本頁>

訂---------線Q 45 09 9 6 年月曰Α7 ia -22- 五、發明說明（25 ) m 1之結核菌素注射器及肌肉內的皮下注射針（Braun， Melsungen，GER)小心的注入血漿。凝塊溶解時間是計算 加入血嫌維蛋白溶解酵素和降壓5後加入血繊維蛋白 .溶解劑的時間差。壓力由水校正之壓力電壓偵測系統及電 腦輔助之說明程式測定。 c)凝塊穿透能力的靜態模式 8 0 0 # 1的人類檸檬酸處理過之血漿（來自健康的 捐贈者）和75j«lCa緩衝溶液 （5〇mmol/l Tr i s/HCl · pH7. 2 - 0 . 25 mol/1

CaCl2) ，20私1明膠溶液（10%w/v之 0 . 9 % NaCI)及100ml凝血酶溶液（8U/ (锖先《讀背面之注意事項$寫本頁) 經濟部暫慧財產局貴工消费合作社印製 m 1 ，0 0 5 m o 1 / 1 sodium citrate/ H C 1 1 p Η 6 . 5 t 0 . 15 mol/1 N a C 1 )混合。小 心的將8 0 0 β 1 的混 合液移入2 m 1 管柱（Pierce' Rockfort τ I L • USA) 。血漿凝塊於3 7 eC下反應3小時 後形成。！ 將 2 m 1 緩衝 溶液（0 · 0 0 8 mol/1 N a ZH P 0 4 » 0 . 0 0 1 mol/1 Κ Η 2 P 0 4， 0.00 3 m ο 1 / 1 K C I ，0 . 13 7 mol/1 N a C 1 t 0 .1 % 牛的血清蛋白， 0.01% Tween ® 8 0 丨） 用 Glu - -Gly — Arg -氣 1 甲酮抑制之血嫌維 蛋白溶酶j 原 活 化劑 調整 至須要的濃度（ 0，0 . 5， 1 ，2與3 β s /ml) 後加入此1 m 1之溶液至凝塊表 面》丟棄剩餘的緩衝溶液。凝塊表面用2 m 1之P B S緩

本紙張尺度適用t國國家標準（CNS>A4規格（210 X 297公爱> -28 _ 450996

A7 B7 ft濟部智慧财產居員工消費合作社印製 五、發明說明（26) 衝溶液（0. 008mol/l N a aH Ρ Ο 4 * 0 . 〇〇lmol/l KH2P04，〇. 〇 〇 3 m ο 1 / 1 K C 1 and 0 137mol/l NaCl)清 .洗而蛋白質加入2m 1之戊二醛的PBS溶液固定•接著 凝塊表面用2ml 50mmo 1/1之Tr i s/ HCl，pH 8. 0清洗後和lml過氧化氫酶檫記之 抗t—PA之多株抗體（250mU/ml)反應。用1 ml PBS清洗凝塊後抗雔結合之蛋白質由3 —胺基一 9 -乙基叶唑被過氧化氫酶轉變成不溶之紅色色素之反應 測定。 根據本發明之血嫌維蛋白溶酶原活化劑不會在凝塊表 面集中而會穿入凝塊而且分散均匀。凝塊免疫染色之密度 隨根據本發明之血嫌維蛋白溶酶原活化劑在血漿中之濃度 增加而增加· 實施例4:比較嫌維蛋白之結合能力 在此實施例中測試實施例1中血栓溶解活性的蛋白質 結合至繅維蛋白之能力及比較Alteplase之此項性質· Alteplase之樣品及本發明之蛋白質製備成1 . 5 // g/m 1之溶液。接著血栓溶解活性的蛋白質樣品（ 100仁1)和770#1之緩衝溶液（0· 05M 丁 ris/HCl ，pH7. 4，0. 15 N a C 1 0. 01 % Tween®80) 、10只1牛的血清蛋白溶 液（100mg/tnl) ，10以1抗蛋白酞酶（ 表紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 一 <請先《讀背面之注$ d裝 項寫Η 寫本頁)

450996 經濟部中央標準局Λ工消费合作社印氧 A7 __B7_五、發明説明（27 ) 3. 75 mg/ml) 、1〇私1牛的凝血酶（澳度爲 1 0 OU/ml )及增量之嫌維蛋白原（1 〇"g/mi 至3 0 0 ^ g/m】）混合。所有的溶液均爲水溶液。而 凝血酶會將嫌維蛋白原轉變成不溶之嫌維蛋白凝塊。 各組成物混合後在3 7 °C下反應1小時。接著將上清 液自嫌維蛋白凝塊離心分離（15分鐘，13，000 r pm於4 eC)而血嫌維蛋白溶酶原活化蛋白在上清液之 含置由樓準EL I SA測定。 .實施例 5:比較血縝維蛋白溶酶原溶解活性及促進性 測定血嫌維蛋白溶酶原溶解活性的促進性之程序己描 述於 V e r h e i j e n e t a I ·之 T h r 〇 m b H a e m 〇 s t · 4 8 ( 1982) 266-269» 促進性之嫌維蛋白原片段由人類的嫌維蛋白原經溴化 氰（lg人類的織維蛋白原，1. 溴化氰於10 0 ml水中）於7 0%ν/ν甲酸在室溫下處理1 7小時接 著對蒸餾水透析。 進行測定時，5ng/n 1之t— PA或等蛋白質澳 度之寅施例1於lml 0 . lmol/1 T r i s / H C 1 (pH 7. 5)，內含 0. 1 % v/v Tween ® 8 0 ' 0 . 1 3 μ mol/lGlu_血嫌維蛋白溶 酶原、0. 3mmol之底物S2251 (發色的底物Η 一 DVal — Leu— Lys—p —硝基苯胺）及 1 2 Ο # g/πι 1 之嫌維蛋白原片段。混合物於2 5 °C下反應2小時而 本紙張尺度遑用令困國家橾準（CNS ) A4规格（210X297公釐）-30 - (請先聞讀背面之注意Ϋ-項再本頁) 訂 線· kfi- 經濟部中央標牟扃貝工消资合作杜印复 4 5 0 9 9 6 a? ._B7_五、發明説明（28 ) 40 5 ti m之吸光率在不干搛反應的情況下扣除控制値後 測得。切割發色的S 2 2 5 1可作爲偵測酵素之血織維蛋 白溶酶原溶解的活性。促進性之計算是織維蛋白原片段之 活性除以無織維蛋白原片段之活性。 於各例中，2 1之樣品預先用0. lmo 1/1 Tris，pH7. 5，0. 15%Tweene80 稀轉後 滴入微量測定盤之孔涧。接著如入2 0 0 // 1之混合試劑 於2小時內測定405 nn之吸光<25aI， 0.1 mol/ 1 T r i s * ρ Η 7 . 5，0. 15% Tween®8 0與2 0 0 ;/ 1之混合試劑）。 A樣品=A樣品 t_Aevt)_(A樣品 〇-Abv〇) A樣品t = 2小時後之樣品値 ABvt = 2小時後之試劑値 A樣品。=t = 0時之樣品値 Abvo =t = 0時之試劑値 混合試劑： 5 m 1 測試緩衝溶液（0. lmol/1 Tris， ρ Η 7 . 5 * 0 . 1 5 % Tieen ® 8 0 ) lml t_PA促進劑（lmg/ml人類繊維蛋 白原之溴化氰片段） lml 底物溶液（3mmol/l S2251，H —D — Val — Leu - Lys — pNA :購自 Chromoge- 本紙張Xjt適用中國國家揉率（CNS>A4规格（ 210X297公釐）-31 - {讀先《讀背面之注意事項本頁) 45 099() A7 B7 經濟部智慧財產局貝工消费合作社印裝 五、發明說明（29 ) nix* Moe1nda1 ， SE) 1 m 1 血織維蛋白溶歯原溶液（7 U/ml血縝維蛋 白溶酶原：購自 B 〇 e h r i n g e r Μ a η n h e i m GmbH ) 促進因子之計算：促進因子是t - PA促進劑存在下之活 性除以無t - P A促進劑下之活性·各例子中各製備稀釋 後吸光大致相等•無t - PA促進劑之反應混合物用lml H2〇取代之1 ml t — P A促進劑。 活性在有及無促進劑存在下以相同的方法測定*促進 因子F計算如下： X 稀釋倍數 jgitsias p = —----------- A無«進品 X 稀釋倍數 無淀遘幫樣岛 比活性是血纖維蛋白溶酶原溶解的活性（K U/m 1 )及蛋白質濃度（mg/ml)之商。 實施例6:大童快速注射實施例1之組織血嫌維蛋白溶酶 原活化劑重組蛋白質於狗模式之冠狀動脈血栓形成作用中 引發有效可靠之血栓溶解作用 於大腸桿菌生產之實施例1的蛋白質，其引發血栓溶 解作用可用電刺激後狗的左冠狀動脈血栓形成作用模式評 本紙張尺度適用中國國家標準<CNS)A4規格<210 X 297公釐） ' -3?- {請先聞讀背面之注1^ -r— II <

M · I I ϊ I I n I I n n 寫本I)

I 450996 經濟部中央樑準局貝工消费合作杜印製 五、發明説明（3〇) 估。 實施例7:測定醯胺溶解的活性 爲了測定醯胺溶解的活性，2 0 Om 1之緩衝溶液（ O.lmol/1 Tris/HCl*pH7. 5» 0. 15 %Tween«»8 0)及2 0 0#1之血嫌維蛋白溶 海原活化劑溶液（用緩衝溶液稀釋至1 一 1 2 μ g/m 1 )於3 7°C下反應5分鐘。測定開始時加入2 Ο Ο μ 1 S 2 2 8 8 ( 6mmo 1 /1 »H— D— lie— Pro— Arg-p —硝基苯胺，購自Λ a b i V i t r u ra， S w e d e π )。此 S 2 28 8底物於3 7 °C下預先平衡。醯胺溶解的活性得 自起始2. 5分鏟405nm吸光之增加，p—硝基苯胺 之消光係數是9750丨/mo1/cm。 實施例8 :使用凝血酶切割r_PA (F2 7 4P， K 2 7 7 V ) 1 .程序 將 44eg r-PA(F274P，K277V) 及r— PA (標準搛品）於3 7T下滇匿1 5分鏟，和於 3 7X：下預《1 5分鏟之以下各單位之人類凝血酶（Sig-ma)混合，反應於3 7 °C下進行3 0分鏟。接著樣品以 1 : 1 ( v / v )的比列和SDS樣品緩衝溶液（ 0. 1 2 5 m ο 1 / 1 Tris/HCI，pH8. 8 ，4. 6% (w/v) SDS » 4mo 1/1 尿索，

本紙*尺度適用中國國家梯準（CNS>A4規格（2丨0X297公釐）-33 - 450996 經濟部中央標率局真工消费合作社印氧 五、發明説明（31) 0 . 1%溴酚藍，〇· 3mol/丨硫赤藓糖醇）混合， 反應在9 5 eC下進行3分鏡後用SDS聚丙烯醯胺凝膠電 泳分析。 2 .結果 凝血酶切割r-PA (F274P，K277V)示 於圊2。資料顯示增量之凝血酶將r 一 PA (F2 7 4P ，K2 7 7V) 完全轉變成雙鏈形式。蛋白_及1·— PA(F274P，K277V)之第 2 個紋狀（krin-gle )結構面被凝血酶切割後在電泳中移動的距離和血嫌 維蛋白溶酶水解製備之雙鏈型式之r一ΡΑ(Γ— PA (t c ))的結構ffi大致相等。 和 r-PA(F274P，K277V) (112A) 不同*於標準條件下r一PA(圖2B)無法被凝血酶切 割。 A ： Lane 1 :蛋白質分子纛檩準《Τ lane 2 ： r - P A Lane 3: r — P A ( t c ) '' Lane 4: r-PA(F274P»K277V) Lane 5 ： r-PA (F274P，K277V) + 凝血海緩衝溶液 Lane 6 ： r—PA(F274P，K277V)+ 本紙浪尺度適用中國國家輮车（CNS ) A4規格（210X297公釐） -34 - 4 5 0996 a? B7 五、發明説明（32) 經濟部中央橾率局—工消费合作杜印裝 0 .0 5 5 N I H軍位 之 凝 血 梅 Lane 7 • r -P A ( F 2 7 4 Ρ f K 2 7 7 V ) + 0 .5 5 N I H 單位之 凝 血 m Laji e 8 « r 一 P A ( F 2 7 4 Ρ 9 K 2 7 7 V ) + 2 .7 4 N I H 單位之 凝 血 酶 Lane 9 * 凝 血酶 ( 5 N I Η單位 ) Lane 1 0 • » 蛋白 質 分 子 it 檩準髏 _ B ： Lane 1 蛋 白質 分 子 量 檁準*r Lane 2 Γ - -P A Lane 3 r -P A ( t C )" Lane 4 r -P A + 概 血 酶緩衝溶液 Lane 5 r -P A + 0 0 5 5 N I Η 單 位 之 凝 血海 Lane 6 r -P A + 0 5 5 Ν I Η 單 位 之 凝 血 酶 Lane 7 r -P A + 2 7 4 Ν I Η 單 位 之 凝 血 酶 Lane 8 凝血酶 ( S NIH units ) Lane 9 蛋 白質 分 子 量 揉 準髏_ {请先Μ讀背面之注I項再W本頁) 訂 ·)蛋白質分子Jk檫準體：溶菌海（14，307 Da) ，大豆胰蛋白海抑制劑 （20，100Da)，丙糖磷 酸異構酶（2 6，6 2 6 D a )，醛纊酶（3 9， 212Da)，麩胺酸去氫酶（55，562Da)，果 糖_6 —磷酸一激酶 （85，204Da) ，/? 一半乳 本紙張尺度逍用中國«家揉牟（CNS ) A4规格（2丨OX 297公釐）_ % " 45 09 9 6 A7 B7 珐齊部中央橾率局et工消费合作杜印装 五、發明说明（33) 糖苷酶（1 1 6，353Da) ，“― 2_巨球蛋白（ 170，000Da)〇 j ··) r_PA(tc):雙鍵形式之r 一 PA，得自r_ P A和血織維蛋白溶酶之反應產物。 資施例9:使用血嫌維蛋白溶海切割r_PA(F274 P » K 2 7 7 V ) 1 . 程序 將 25#g r-PA(F274P，K277V)及 r_PA (槺準樣品）於3 7Ό下預置15分鐘，和於 3 7 °C下預置1 5分鐄之以下各單位之人類血嫌維蛋白溶 酶（Sigma)混合，反應於3 7 eC下進行I 0分鐘。接著 樣品以1 : 1 ( v / v )的比列和SDS樣品緩銜溶液（ 0. 1 2 5 m 〇 1 / 1 Tris/HCI*pH8. 8 ，4. 6%(w/v)SDS，4mol/l尿素， 0 . 1%溴酚藍，〇 3mol/l硫赤杳糖酵）混合 »反應在9 5 °C下進行4分鐘後用SDS聚丙烯醯胺凝膠電 泳分析。 2 . 結果 凝血酶將r-PA(F274P，K277V)完 全轉變成雙鍵形式。蛋白酶及r_PA (F2 7 4P， K2 7 7V)之第2個紋狀（kringle)結構區被凝血酶 {请先閎讀背面之注意夺項再W本X )

—裝· -ifr. 本V 線 本紙張尺度適用中國Η家櫺率（CNS)A4規格（ 210X297公釐）-% 45 0996 A7 B7 經砉部t央橾率Λ貝X消费合作社印装 五、發明説明（34) 切割後在m泳中移動的距離和血繊維蛋白溶酶水解製備之 雙鏈型式之r _PA ( r—PA ( t c ))的結構區大致 相等。 和 r-PA (F274P，K277V)(圖 2A) 不同，於標準條件下r—PA(圖2B)無法被凝血酶切 割。 血嫌維蛋白溶酶切割r_PA (F 2 7 4 P， K2 7 7V)及r_PA分別示於圚3A與B。資料顯示 增置之r -PA (圖3 B )在增量之血嫌維蛋白溶海完全 轉變成雙鏈形式。此條件下r _PA完全被2 5mU之血 織維蛋白溶酶轉變成雙鏈形式。 相反的，r-PA(F274P，K277V)(圖 3 A ) 被血嫌維蛋白溶海切割的效果很差。當和 0. 025U及0.1U血纖維蛋白溶酶反應時，r一 PA (F2 7 4P，K2 7 7V)沒有發現被血嫌維蛋白 溶酶明顯的切割。甚至當25eg r - P A ( F 2 7 4 P，K2 7 7V)和2 5tnU之血嫌維蛋i溶酶反應時， 亦無完整之切割發生。 凝血酶切割之蛋白酶及r 一 FA (F 2 7 4 P， K2 7 7V)之第2個紋狀（kringle)結構區被凝血酶 切割後在髦泳中移動的距離和血纖維蛋白溶酶瓊脂糖水解 製備之雙鏈型式之r一PA(r_PA(tc))的結構 面大致相等，因此確定突變之蛋白質如同r 一 PA其切點 介於胺基酸2 7 5和2 7 6 (數字編號是根據Harris， (請先閲讀背面之注意篆項本頁) 裝' 訂 線 本紙張尺度逋用中國國家揉率（CNS)M规格（210X297公釐）-37 _ A74 5 0 9 9 ^_ _ b7 經濟部中央樣準局員工消费合作社印製 五、發明説明（35) Prot. Engineering 1>449-458 (1987)) 之間。 A ： Lane 1 ：蛋白質分子置棋準體_ Lane 2 ： r — P A Lane 3 ： r — P A ( t c) Lane 4 ： r-PA(F274P，K277V) Lane 5: r-PA(F274P，K277V)+ 0. 25mU血嫌維蛋白溶酶 Lane 6 ： r-PA(F274P，K277V)+ 0 . 2 5 m U血嫌維蛋白溶酶 Lane 7 ： r-PA(F274P，K277V)+ 1 2 . 5 m U血嫌維蛋白溶酶 Lane 8 ： r-PA(F274P，K277V)+25 mU血嫌維蛋白溶酶 B ： Lane 1 ： 蛋白質分子置標準體_ Lane 2 : r-PA Lane 3 ： r - P A ( t c ) ' * Lane 4 ： r_PA+0. 2 5mU血嫌維蛋白溶酶 Lane 5 ： r— PA+2. 5mU血嫌維蛋白溶酶 Lane 6 ： r_PA+12. 5mU血嫌維蛋白溶酶 (請先《讀背面之注意参項再 —装I. D本頁 訂

V 本紙張尺度逋用中困國家揉準（CNS)A4規格（210X297公釐）-38 _ 450996 A7 B7 «濟部中央揲率局員X消费合作社印装 五、發明说明（36) Lane 7 ： r— PA+25mU血織維蛋白溶酶 ， ·)蛋白質分子董標準懷：溶苗酶 （14，307Da )、大豆胰蛋白海抑制劑（20，100Da)、丙糖磷 酸異構梅（26，6 2 6Da) '醛綰海（39，212 Da)、麩胺酸去氩海（55，562Da)、果糖一 6 一磷酸一激酶（85，204Da) 一半乳糖苷酶（ 116，353Da) 、α — 2 —巨球蛋白（ 170，000Da)。 ")r - P A ( t c )：雙鏈形式之r— PA得自r 一 P A和血嫌維蛋白溶酶瓊脂糖之反應產物。 實施例1 0 :使用凝血海切割r 一 PA (P2 7 2V， F274P，K277V) 1 . 程序 將 40 p g r-PA(P272V，. F274P， K2 7 7V)預®於3 7*0下1 5分鏟，和牛的凝血酶（ Sigma)混合後在3 7 °C下開始反應3 0分鐘。接著樣品 以1 : 1 ( v / v ) 和SDS樣品緩衝溶液< 0 . 1 2 5 m ο 1 / 1 Tris/HCI，pH 8 . 8，4. 6 % (w，v)SDS，4mol/l 尿素，0, 1% 溴酚 藍，0. 3mo 1/1硫赤藓糖醉）混合，在9 5 °C下反 應3分鐘於S D S聚丙烯蘧胺凝膠電泳分析。 本纸張尺度逋用中國阃家揉丰（CNS ) A4规格（2I0X 297公釐）.39 _ (請先《讀背面之注意务項再本頁)

—^Ί 本 V 订 線 45 09 9 6 A7 B7 五、發明説明（37) 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印袋 凝血 酶 切 割 r —— P A ( P 2 7 2 V ， F 2 7 4 Ρ * K 2 7 7 V ) 之 結 果 示 於 m 4 Q 資 料 顯 示 增 加 凝 血酶之ft 能 將 r - P A ( Ρ 2 7 2 V ， F 2 7 4 P 9 Κ 2 7 7 V ) 完 全 轉變 成 雙鍵 型 式 〇 蛋 白 酶 及 被 凝 血 酶 切 割 之 r - Ρ A ( P 2 7 2 V f F 2 7 4 P K 2 7 7 V ) 第 2 紋狀（ kr in g 1 e ) 結構區和經血嫌維蛋白溶酶水解之1 r - -Ρ A之 雙 鍵 形式 ( r — Ρ A ( t C ) ) 之 結構 區 9 在 電 泳之移動 非 常 類似 Q La ne 1 ： 蛋 白 質 分 子 置 標準 髏 - La n e 2 ： r — Ρ A La ne 3 ： r 一 Ρ A ( tc ) m Φ La n e 4 ： r — Ρ A ( P 2 7 2 V 9 F 2 7 4 Ρ K 2 7 7 V ) La ne 5 ： r — Ρ A ( P 2 7 2 V y F 2 7 4 Ρ 9 Κ 2 7 7 V ) + 凝 血 酶 «a 衝溶 被 La ne 6 ： r — Ρ A ( P 2 7 2 V ϊ F 2 7 4 Ρ ， Κ 2 7 7 V ) + 0 0 5 5 N I Η 單 位之凝血 酶 La n e 7 ： Γ — Ρ A ( P 2 7 2 V > F 2 7 4 Ρ Κ 2 7 7 V ) + 0 5 5 N t Η 單 位 之凝血酶

Lane 8: r-PA (P272V，F274P， K277V)+2. 74NIH單位之凝血酶 (請先Μ讀背面之注I項再f本頁) 訂 線- 本紙張尺度適用中囲國家標準（CNS)A4規格（2丨0><297公釐）-40 - 4 5 09 9 6 A7 B7 紱濟部中央揉窣局貝工消费合作杜印«. 五、發明説明（38) Lane 9:蛋白質分子量檩準«Τ •) 蛋白質分子4檫準《:溶苗海（14，307Da )，大豆胰蛋白酶抑制劑（20，100Da)，丙糖磷 酸異構酶（26，62 6Da)，醛縮酶 （ 3 9，2 1 2 D a )，麩胺酸去氫酶（5 5，5 6 2 D a )，果糖一6-磷酸一激海（85，204Da) ， β —半乳糖苷酶（116，353Da) — 2_巨球蛋 白（170，000Da). '* ) 1*一？八（1(：):雙鏈形式之1：一？八，得自1· 一 P A和血織維蛋白溶酶反應之產物。 參考文獻 Ausubel et al. » Current Protocols In Molecular Biology* Vo 1. 2 » Chapter 1 5 ( Greene Pub 1. Asso ciates & Wiley Interscience 1 9 9 1 ) Bennett* W. F. ，J. Biol . Chem. 266 (1991) 5191 —5 2 0 1 Brinkmatin et al. > Gene 8 5 {19 8 9 )10 9 Dawson » R. N. et al. * J. Biol. Chem. 269(1984) 15989 - 15992 Eastm an » D. » Biochemistry 31 (1992) 4X9— 4 2 2 EP-A 0 219 874 (請先閎讀背面之注意Ϋ'項本X )

訂 庳， 本纸張尺度適用中國國家揉準（CNS)A4洗格（ 210x297公釐）-41- 45 0996 A7 B7 經濟部中央橾準局員工消费合作社印製 五、發明説明（39) EP-A 0 241 022 EP — A 0 245 1 0 0 EP-A 0 302 456 ΕΡ — A Ο 382 174 EP-Λ Ο 400 545 EP — B Ο 1 9 6 9 2 0 E P - B 0 297 0 6 6 Harris» T. J. R. » Protein Engineering 1 ( 1987) 449-459 Rohnert * ϋ. e t a 1. * Protein Engineering 5 ( 1992)93 — 100 Korninger and Co 1 1 en * Thromb. Haemostasis 4 6 ( 1 9 8 1 ) 561 - 565 Krause * J. ♦ Fibrinolysis 2 (1988) 133— 14 2 Kunke 1 > T. A. » P r o c . Natl. Acad . Sci. USA 8 2 ( 1985) 488-492 ' Laraba » D. et al. » J. Mol. Biol. 258 ( 1 9 9 6 )117-135 Had i son * E. L. et a 1. » Science 2 6 2 ( 1 9 9 3 ) 4 19-421 Had i so η * E. L. et. a 1 . ，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 3530-3533 Madison»E. L. * Nature 339 (1989) 721— (請先加讀背面之注意事項 I 項本頁) 訂- 本纸張尺度適用中國困家標準（CNS )A4规格（ 210X297公釐）-42 - 經濟部中央棵率局Λ工消*合作杜印*. 4 5 09 96 A7 _B7_____ 五、發明説明（4ί)) 7 2 3

Morinaga et al. * Biotechnology 21 ( 1 9 8 4 ) 6 3 4

Paoni ' N. F. et al. » Protein Engineering 5 ( 1992) 259-266

Paoni » N. F. * Protein Engineering 6 ( 1 9 9 3 ) 5 2 9 - 5 3 4

Pa ο n i » N. F. » Thrombosis and Haemostasis 7 0 ( 1993) 307-312 R e f i ώ o » C . J. ^Thrombosis and Haemostasis 7 0 ( 1993) 313-319

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Schohet* R. V. » Thrombosis and Haemostasis 7 1 (1 9 9 4 ) 1 2 4 - 1 2 8 US- Patent 5 » 2 0 0 » 3 4 0 US— Patent 5 * 2 2 3 » 2 5 6 US — Patent 5 » 5 0 1 » 8 5 3

Wen— Pin Yang et al. » B i o c h e m i s 11 y 3 3 ( 1 9 9 4 ) 2306 - 2312 本紙張尺度遑用中國國家標率（CNS)A4规格（210X297公釐）-43 - ~ ΊΊ-----4丨| {請先闐讀背面之注•項本I ) '訂 -線 \450996 經*部中央標準局負工消费合作社印製 A7 B7_五、發明説明（41) W 0 90/09437 W 0 9 1 / 0 9 1 1 8 WO 94/10318 W Ο 9 6/01312 W 0 9 6 / 1 7 9 2 8 Zo 1 1 er and Smith* DNA 3 ( 1 9 8 4 ) 4 7 9 - 4 8 8 序列表 (1 ) 一般資料： (i )申請人： (Ο 姓名：BOEHRINGER MANNHEIM GMBH (B)街道：Sandhofer Str· 1 1 6. (C )城市：M a rt n h e i m (E) 國家：Germany (F) 郵遞 K 號（ZIP) :D — 68305 (G) 電話號碼：08856/60-3446 (H) 傅眞猇碼：08856/60 - 3451 (i i )發明之名稱：可由凝血酶活化之血嫌維蛋白溶 酶原活化劑 (i i i )序列數目：12 (iv>電腦讀自： (A) 媒《型式：软碟 (B) 電腦：IBH PC及相容電腦 (请先聞讀背面之注意箏項本頁) ΐτ 線 本紙佚尺度適用中國8家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）· 44 - 45 09 9 6 A7 __B7__ 五、發明説明（42 )

(C) 作業系統：PC-DOS/MS-DOS (D) 软 0 : Patentln Release 井 1 . 0 ，

Version #1 . 3 OB (EPO) (vi ) 先前申請日期： (A)申繪號碼：EP 96112487.2 (B )申請日期：02 - AUG — 1996 (2) 序列認証號碣：1之資料： (i ) 序列特性： (A)長度：7胺基酸 (B )型式：胺基酸 (C) 股性：單股 (D) 拓撲型態：線性 (i i )分子型式：胜酞 (xi ) 序列之描述：序列認証號碼：1 ：

Val Gin Pro Arg lie Val Gly 1 5 (2) 序列認証號碼：2之資料： (i ) 序列特性： -------—)A-- (請先閱讀背面之注意事項本頁) .'訂 線 經濟部中央樣率局Λ工«费合作杜印装 (A) 長度：13 胺基酸 (B ) 型式：胺基酸 (C) 股性：單股

本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS)A4«l格（ 210X297公釐）-45 - 5 4 0996 A7 B7 五、發明説明（43 ) (D) 拓挨型態：線性 (i i ) 分子型式：胜酞 { xi ) 序列之描述：序列認証號磚

Gly Asp Thr i\rg Ser Gly Gly Pro Gin Ala 1 5 10

Leu His (2) 序列認証號碼：3之資料： (i ) 序列特性： (A ) 長度 (B )型式 (C) 股性 (D) 拓撲型態：線性 (i i ) 分子型式：胜酞 (xi) 序列之描述：序列認証號碼 6 胺基酸 胺基酸 單股 IM.J-J------裝丨 (請先閱讀背面之注意*項再頁 訂 線_ Μ濟部中央橾準局貝工消费合作社印装

Pro Gin Ala Asn Leu Hi 1 5 (2 ) 序列認証號碼： (i ) 序列特性： (A ) 長度 (B ) 型式 (C ) 股性 4之資料： 6 胺基酸 胺基酸 單股 本紙張尺度逋用中®國家橾率（CNS ) Α4规格（210X297公釐）_ 46 4 5 0 9 9 6 A7 _B7_ 五、發明説明（44 ) (D) 拓撲型態：線性 (i i ) 分子型式：胜酞 (xi ) 序列之描述：序列認証號碼 G1y I1e Pr〇 Arg I Ie Va1 1 5 ) 序列認証號磚 i ) 序列特性： (A)長度 (B ) 型式 { C ) 股性 5之資料： 6胺基酸 胺基酸 單股 (D) 拓撲型態：線性 (i i ) 分子型式：胜酞 (xi) 序列之描述：序列認証號碼 Ala Gin Pro Arg lie Lys 1 5 (請先S讀背*之注意事項本頁) 裝 訂 線 經濟部令央橾半扃工消资合作社印裝 ) 序列認証號碼 i )序列特性： (A) 長度 (B) 型式 (C) 股性 6之資料： 1 3 胺基酸 胺基酸 單股 本纸張尺度逍用家標準（CNS)A4规格（ 210X297公釐）-47

V 450996 A7 B7 五、發明説明（45) (D) 拓撲型態：線性 i) 分子 型式： 胜酞 i) 序列 之描述 :序列K証號碼：6 : Gly 1 Leu Arg Gin Tyr 5 Ser Gin Pro Gin Phe Arg lie Lys 10 序列認証號碼： 7之賫料： ) 序列 特性： (A ) 長度 1 3 胺基酸 (B) 型式 胺基酸 (C) 股性 單股 (D) 拓撲型態：線性 i) 分子 型式： 胜酞 i) 序列 之描述 ：序列認証猇碼：7 : t/ (請先鬩讀背面之注i項再本頁) 裝· 訂 線i • irlr- ^/tuv 經濟部中央揉準局貞工消f合作社印*.

Gly Leu Ser 1 Gin Ala 5 Ser Gin Gly lie Pro Arg lie Val 10 序列認証號碼： 8之資料： ) 序列特性： (A) 長度： 1 5 胺基酸 (B) 型式： 胺基酸 (C) 股性： 單股 本紙張尺度逍用中國國家揉準（CNS)A4规格（ 210X297公釐）-48 - 4 0996 w A7 __B7 五、發明説明（46 ) (D) 拓撲型態：線性 (i i) 分子 型式：胜酞 (xi ) 序列 之描述：序列認証號磚：8: Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Ala Gin Gly lie Pro Arg lie Val 1 5 10 15 (請先閲讀背面之注意事項本頁) (2) 序列認証號碼：9之資料： (1 ) 序列特性： (A ) 長度：38個鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股性：單股 (D) 拓撲型態：線性 (i i ) 分子型式：其他核酸 (A )描述：/desc =u01igonukleotid·' (xi ) 序列之描述：序列認証號碼：9: 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印裝 GTACAGCCAG GTTCAGCCTC GCATCGTTGG AGGGCTCT 38 (2) 序列認証號碼：10之資料： (i ) 序列特性： (A ) 長度：5 3個鹼基對 (B ) 型式：核酸 (C) 股性：單股 本紙張尺度適用中Η國家梯準（CNS ) Α4规格（210X297公釐）-49 - 450996 A7 B7 M濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（47 ) (D) 拓播型態：線性 (i i ) 分子型式：其他核酸 (A)描述：/desc="01igonukie〇tid (κΐ ) 序列之描述：序列認証猇碼：10: CTGCGGCCTG AGCCAGTACA GCCAGTTTGG CCCTCGCATC GTTGGAGGGC TCT (2) 序列認証號碼：11之賫料： (i ) 序列特性： (A ) 長度：2 3個籲基對 (B ) 型式：核酸 (C) 股性：單股 (D) 拓撲型態：線性 (i i ) 分子型式：其他核酸 (A)描述：/desc = U0ligonukleotid (xi ) 序列之描述：序列認証號碼：11: GGAGCGGCTG CAGGAGGCTC ATG (2) 序列認証號碼：12之資料： (i 1序列 特性： (A) 長度： 2 3個鹼基對 (B) 型式： 核酸 (C ) 股性： 單股 本纸張尺度適用肀國國家標丰（匸灿>八4规格（2丨0父297公釐）-5〇- ——.I—— (請先《讀背面之注$項^:<^4買) 訂 線 4 5 0 9 9 6 a7 _B7_ 五、發明説明（48 ) (D) 拓揆型態：線性 (i i ) 分子型式：其他核酸 (A )描述：/desc ^’'Oligonukleotid (xi ) 序列之描述：序列認証號碼：12: 23

CTACGGCAAG ACCGAGGCCT TGT (請先閱讀背面之注意事靖再^^4頁) .裝- 訂 線 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印製 本紙張尺度遍用中國國家標率（CNS ) 规格{ 210X297公嫠）

Claims (1)

1. 9〇U修正 年，1 a 4女 補充 公告1 4六5、0ΙΜ利範圍 附件~ :第86 1 1 0829號專利申請案 中文申請專利範園修正本 民國9 0年6月修正 1 . 一種血嫌維蛋白溶酶原活化劑，該活化劑以人類 組織型血纖維蛋白溶酶原活化劑爲底質’其特徵爲 a) 經修飾後此血織維蛋白溶酶原活化劑能被凝血酶 切割後轉變成雙鏈形式’其中胺基酸R2 6 7被修飾爲S * b) 經修飾後其酶原性和人類血織維蛋白溶酶原活化 劑比較下至少提高1. 2倍，其中胺基酸序列任意由 K4 2 9被修飾爲Q及/或由H4 1 7被修飾爲T : c) 經修飾後其胺基酸Pl(275)及Pl’（276)間被血嫌維 蛋白溶酶切割之能力降低1 0%以上，其中胺基酸位置 2 7 2至2 7 8選自下列血纖維蛋白溶酶切割性降低之狀 況： P 4 (胺基酸272)爲任何胺基酸，但若P2 是P，則不爲P， P3 (胺基酸2 7 3 ) 爲任何胺基酸， P2 (胺基酸274) 爲疏水性胺基酸，選自F、 H、G、V、L、I、Τ、Α 或 P， ρ 1 (胺基酸275)爲R或κ， Pl，（胺基酸276)爲V或I ， Ρ2’（胺基酸27 7)爲V、L、I或Κ， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）-1 - .r*l·!*-------- C c請先閱讀背面之注#^項再填寫本頁) 訂---------^0- 經濟部智慧財產局貝工消費合作社印製 Α8· 4 5 0;9 9 6 I 六、申請專利範圍 ?3’（胺基酸278)爲〇， C: (請先Μ讀背面之注意事項再填寓本頁 d) 其繊維蛋白之結合能力降低至能使血嫌維蛋白溶 酶原活化劑之穿透性在血凝塊中增加5 0 %以上，其中胺 基酸2 9 6至2 9 9任意被胺基酸序列AAAA所置換》 2. 如申請專利範圍第1項之血繊維蛋白溶酶原活 化劑，其中P4爲L，I或V。 3. 如申請專利範圍第1項之血纖維蛋白溶酶原活 化劑，其中經修飾後其胺基酸P1 (275)及Pl’（ 2 7 6 )間被血纖維蛋白溶酶切割之能力降低2 0%以 上。 4. 如申請專利範圔第1或第2項之血纖維蛋白溶 酶原活化劑，其中該活化劑均勻的穿透血凝塊。 5. 如申請專利範画第1或第2項之血纖維蛋白溶 酶原活化劑，其中指狀結構區己刪除。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6. 如申請專利範画第5項之血嫌維蛋白溶酶原活 化劑，其中該血纖維蛋白溶酶原活化劑只含蛋白酶結構區 或第2個紋狀（kringle)結構區及人類組織型血纖維蛋 白溶酶原活化劑蛋白酶之結構區。 7. 如申請專利範圍第1或第2項之血纖維蛋白溶酶 原活化劑，用於生產治療血栓性栓塞疾病的藥學組成物。 8. 如申請專利範圍第1項之血纖維蛋白溶酶原活化 劑，其具有下述胺基酸序列之一：272 — 278區域之 序列VQPRIVG (序列認證號碼1) ，272 — 277區域 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）-2 - 450996 | D8 六、申請專利範圍 之序列GIPRIV (序列認證號碼4)，AQPRIK (序列認證號 碼 5) ' GLSQASQGIPRIV (序列認證號碼 7)，2 6 5 -2 7 7區域之序列GLRQVSQAQGIPRIV (序列認證號碼8)。 9.如申請專利範圍第8項之血織維蛋白溶酶原活化 劑，其具有如下示2 7 2 — 2 7 8區域之胺基酸序列： VQPRIVG (序列認證號碼1 )。 (請先Η讀背面之注意事項再填寫本頁) ,ίμ--------訂— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 Χ 297公釐） -3 -