JPH02436A - 新規な線維素溶解酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は線維素溶解作用を有する組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子、それをコードするＤＮＡ配列、それを含
有する薬剤組成物、ならびにそれらの生産方法に関する
。

詳細には、本発明は（ａ）組織型プラスミノーゲン活性
化因子の肝臓による取込みが減少する；および（ｂ）そ
の酵素が血漿阻害剤による不活性化に対して本質的に抵
抗する；ような手段で修飾された組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子（ｔ−ＰＡ　）に関する。その結果、本発
明に包含される修飾ｔ−ＰＡは以前に使用され九（天然
または組換え）　ｔ−ＰＡ裂剤よりも長い生物学的半減
期を有することにより特徴づけられる。

本発明の他の面は真核細胞による天然または修飾ｔ−Ｐ
Ａの発現に関する。より詳細には、本発明はｍＲＮＡプ
ロセッシングシグナルを含み且つ異種細胞内での組換え
タンパク質の高生産を誘導する特定のＤＮＡ配列に関す
る。

〔従来の技術〕

心筋梗塞、肺塞栓症、脳卒中、深静脈血栓症、末梢動脈
血栓症および他の血栓症のような血管の疾患は血塊によ
る血管の部分的または完全閉塞によって引き起こされる
。フィブリン網状構造から成る血塊は線維素溶解酵素に
よって溶解される。

プラスミンはこのような線維素溶解酵素の１つであり、
不活性なグロ酵素のプラスミノーゲンとして血液中に存
在する。プラスミノーゲン活性化因子はプラスミノーゲ
ンをプラスミンへ転化し、続いてプラスミンはフィブリ
ンを可溶性断片に分解する。こうして、プラスミノーゲ
ン活性化因子は血栓溶解を誘導すべく使用することがで
きる。

組織プラスミノーゲン活性化因子は、それがフィブリン
九対して親和性ヲ有する生理学的化合物であり、しかも
フィブリンの存在下でのみ効果的にプラスミノーゲンを
活性化するので、血栓溶解処置に非常に適していると考
えられる〔カミオロ（Ｃａｍ１ｏｌｏ　）ら、Ｐｒｏｃ
、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ　、Ｍｅｄ、　１３Ｌｐ、
２７７−２８０．１９７１およびランビー（Ｒａｎｂｙ
、Ｍ、　）。

Ｂｌｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ＋７０４＊
ｐ、４６１−４６Ｌ１９８２を参照〕。従って、それは
静脈内投与に適し九血塊選択的溶解剤である。細菌タン
パク質のストレプト＝Ｆナーゼまたは尿から分離された
ウロキナーゼのような他のプラスミノーゲン活性化因子
もプラスミノーゲンを活性化するが、血塊選択的ではな
い。その結果、循環性プラスミンが生成され、その循環
性プラスミンはフィブリノーゲン、第■因子および第■
因子のような凝血因子を分解するので、出血を起こす可
能がある。

臨床実験は急性心筋梗塞の治療に対しｔ−ＰＡの血栓溶
解有効性を証明した（　ＴＩＭＩ研究グループ。

Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３１２．ｐ、９３２，１９
８５　；およびバーストレー）　（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔ
ｅ　）ら、ＬａｎｃｅＬＬｐ、８４２−８４７゜１９８
５を参照〕。しかしながら、肝臓によるｔ−ＰＡの急速
なりリアランス（浄化）のために〔コーニンガ−（Ｋｏ
ｒｎｉｎｇｅｒ　）ら、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ
ａｓ、４６゜ｐ、６５８−６６１．１９８１を参照〕、
高用量５０〜９０■を連続輸液として投与して効果的な
血栓溶解を誘導しなければならなかった。ヒトにおける
ｔ−ＰＡの生物学的半減期はほんの数分であシ〔チーフ
エンプルン（Ｔｉｅｆｅｎｂｒｕｎｎ　）ら、Ｃ１ｒｃ
ｕｌａｔｉｏｎ　＋　７１＋９゜１１０−１１６．１９
８５を参照〕、少量の活性化因子が実際に血塊へ到達す
るφにすぎないであろう。血塊溶解に利用しうるｔ−Ｐ
ＡＯ量をさらに減するもう１つの要因は血漿阻害剤との
反応である。ｔ−ＰＡは多種多様の血漿プロテアーゼ阻
害剤（最近発見された内皮型および胎盤型のプラスミノ
ーゲン活性化因子阻害剤を含む）と複合体を形成するこ
とが分かつている〔ライケン（Ｒｌｊｋｅｎ　）ら、Ｊ
、Ｌａｂ。

Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、１０１．ｐ、２８５−２９４．１９
８３　；ライマン（Ｗｉｍａｎ　）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、２５９．ｐ、３６４４−３６４７゜１９８４
　；およびレカンダ−（Ｌｅｃａｎｄａｒ　）ら、Ｂｒ
１ｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈａｅｍａｔｈｏ
ｌｏｇｙ＋５７＋ｐ、４０７−４１２．１９８４　　を
参照〕。

本発明によるｔ−ＰＡの修飾は、肝臓クリアランスゆえ
の短い生物学的半減期および血漿阻害剤による不活性化
に対する感受性の両方の問題を解決する。

ｔ−ＰＡおよびその誘導体の情報を含むＤＮＡ配列は、
真核細胞内での発現のために適当なベクターに博入され
る。−時的にトランスフェクションしたまたは安定に形
質転換した宿主細胞により生産される線維素溶解活性は
、プラスミノーゲン活性化因子の標準検定を用いること
によシ測定しうる。

ここに記載される真核細胞発現ベクターは、天然源から
の又は慣用法により化学合成されたレプリコン、エンハ
ンサ−ブロモ−ターナトノ成分ヲ用いて、当業者によく
知られた技法によシ構築される。

普通の２倍体細胞と同様［、確立された細胞株は宿主と
して適している。大多数の異なる細胞株がｔ−ＰＡ、ま
たはその誘導体の発現のために使用可能である。例えば
、ＣＨＯｄ　−、ＣＨＯＫ　１およびＢ１（Ｋのような
異なるハムスター細胞株、ＣＶ−１およびＣＯ８のよう
なサル細胞株、Ｃ１２７および３Ｔ３のようなマウスＩ
ａ胞株、ならびにヒト細胞株を使用することができる。

また、昆虫細胞のような他の宿主およびトランスゲニッ
ク生物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｏｒｇａｎ−１ｓｍ）
もｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ誘導体の生産のために使用し
うる。

適当な宿主細胞へ導入後、　　ｔ−ＰＡをコードするＤ
ＮＡ配列は宿主細胞ゲノムに安定に組込ま〆れた形で、
あるいは染色体外ＤＮＡの形で含まれ、増幅される。

ｔ−ＰＡ遺伝子を含む配列は多重コピー数で細胞中に優
先的に存在する。ｔ−ＰＡ遺伝子コピー数増幅のための
異なる戦略が開発される。宿主細胞の染色体ＤＮＡへの
ベクターＤＮＡの安定した組込みのために、および組込
まれたベクターＤＮＡのその後の増幅のために、増幅お
よび選択可能な遺伝子がｔ−ＰＡ発現ベクター中に挿入
される。チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）
は、増幅および選択可能なマーカー遺伝子としてのジヒ
ドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子と共に使用するの
が目下のところ好適である〔カウフマン（Ｋａｕｆｍａ
ｎ　）ら、Ｍｏ１．Ｃａ１ｌ、Ｂｌｏｌ、　７　、　ｐ
、１７５０　＋　１７５９　、１９８５ｆ：参照〕。

別の増幅系はパピローマウィルスＤＮＡ、特にウシパピ
ローマウィルス１　（ＢＰＶ　）の使用に基づくもので
ある。ウィルスゲノムの全部または一部が、Ｃ１２７ま
九は３Ｔ３のようなマウス細胞全安定して形質転換する
ために使用される。このウィルスゲノムはベクターＤＮ
Ａ　ｔ−高コピー数で安定した染色体外要素として維持
するための情報を含んでいる〔サンブロック（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ　）ら、ＥＭＢＯＪ、　１　、　ｐ、９１−１
（１３）．１９８５を参照〕。

上記の真核細胞宿主−ベクター系において、ｔ−ＰＡ分
子またはその変異型の発現は異なる上流および下流の調
節ＤＮＡ因子により影響を受ける。

本発明者らは、ヒ）　ｔ−ＰＡ遺伝子由来のポリアデニ
ル化シグナルのような下流のプロセッシングシグナルを
含むＤＮＡフラグメント（ＫＧＨＩＩ　）　ｆｔヒトゲ
ノムライブラリーから分離して、その性状を決定した。

この適当なりＮＡフラグメントはヒトｔ−ＰＡ遺伝子の
最後のエクソン配列部分を含む。

このセグメントはまたｃ　ＤＮＡに表わされるので、重
複領域の唯一の制限酵素部位を、２つの要素を連結する
九めの融合部位として使用することができるであろう（
第３図参照）。分析した真核細胞発現系において、この
相同構築物からの生産レベルは、　　ｔ−ＦＡ遺伝子の
下流のプロセッシングシグナルが含まれ々いことを除い
てあとは同一の発現ベクター構築物からのレベルよりも
有意に高がつた。

組換えＤＮＡおよび他の生命工学技術は、血管疾患を治
療するためのｔ−ＰＡを効率よく生産するために利用さ
れた。有望な臨床実験はヒト黒色腫細胞から分離したｔ
−ＰＡ　ｋ用いてまず最初に行われた〔コーケン（Ｃｏ
ｋｅｎ　Ｄ、）、Ｃ１ｒａｕｌａｔｉｏｎ＊７２ｓＰ、
１８−２０．１９８５を参照〕。

ヒト黒色Ｊｉｌｔ−ＰＡのアミノ酸配列分析〔ワシン（
Ｗａｌｌｅｎ　）ら、Ｅｌ：ｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｒ
ｎ、１３２＋ｐ、６８１−６８６゜１９８３を参照〕は
％ＤＮＡグローブの合成に必要とされる情報を提供し、
そのグローブを使用して初めに部分的ｃＤＮＡを分離し
〔エドルンド（Ｅｄｌｕ−ｎｄ）ら、　　Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８（Ｌｐ、３４９−
３５２゜１９８３を参照〕、その後全タンパク質をコー
ドする完全ｃＤＮＡ　Ｃ第１図参照〕を分離した。

ｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡ：ａが分離され、異種細
胞内でｔ−ＰＡｔ生産する試みがなされた他の例は欧州
特許出願第９３６１９号および同Ｍ　１７８１０５号に
記載されている。また、ベニ力（Ｐｅｎｎ１ｃａ　）ら
、Ｎａｔｕｒｅ３０１．ｐ、２１４−２２１　、１９８
３　を参照されたい。

いろいろなヒ）ｔ−ＰＡ調製物のアミノ酸配列決定は、
そのＮ末端出発位置の差異を明らかにした。

形成期分子のプロセッシングの差ゆえに、Ｌ、Ｓおよび
Ｕ体のポリペプチドが生産される゛〔ボール（Ｐｏｈｌ
　）ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１６８．ｐ、６５７−６
６３　。

１９８５を参照〕。５体はＮ末端残基としてグリシンを
有し、８体およびＵ体のＮ末端残基はそれぞれセリンお
よびバリンである。ここで使用したｔ−ＰＡのアミノ酸
配列のナンバリングシステムは、Ｎ末端セリンを番号１
とする８体に基づくものである。その結果、５体のＮ末
端グリシンは−３の位置にあり、そしてＵ体のＮ末端バ
リンは４位置にある。本発明に従って修飾される組織プ
ラスミノーゲン活性化因子は、このような変異体をすべ
て包含するものである。

ｔ−ＰＡ分子の異なる部分は他のタンパク質の部分との
相同性を示す。パティ（ＰａｔｔｈｙＬ、　）、Ｃｅ１
ｌ　４１．ｐ、６５７−６６３　　、１９８５に論じら
れるように、天然ｔ−ＰＡ分子は１フインガードメイン
’　（Ｆ）　。

嘗成長因子ドメイン’　（Ｇ）　、　’クリングルドメ
イン１（クリングル１およびクリングル２に対してに１
およびに２〕、および１プロテアーゼドメイン”　（Ｐ
）とそれぞれ名づけられた５つの構造ドメインから構成
されている。従って、天然ｔ−ＰＡは次式： ％式％ によって表すことができる。

ヒトｔ−ＰＡ遺伝子のエクソン／イントロン接合点はす
でに決定されており〔ニー（Ｎｙ）ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１．ｐ、５３
５５−５３５９．１９８４　ｋ参照〕、これらの接合点
の位置はアミノ酸配列の異方るドメイン間の境界を定め
るために使用できる。

こうして、Ｆドメインはアミノ酸残基４−５０から成り
、Ｇドメインは残基５１−８７から成り、Ｋｌドメイン
は残、ｌ　８８−１７６　から成り、そしてに２ドメイ
ンは残ＴＭ１７７−２６１から成る。Ｋ　２ドメインの
あとに残基２６３−２７４から成る短い連結ペプチドが
続く。Ｐドメインは５つのエクソンによりコードされ、
残基２７５−５２７のアミノ酸配列内に含まれる〔ボー
ルＣＰｏｈｌ　）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ）’ｙ２
３＋ｐ。

３７０１−３７０７．１９８４　　を参照〕。ヒトｔ−
ＰＡは一本鎖のポリペプチド〔ボール（Ｐｏｈｌ　）ら
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ７．２３．ｐ、３７０１−３
７０７．１９８４を参照〕として合成されるが、２本の
鎖がジスルフィド結合を介して連結された二本鎖形に変
換しうる。重鎖（残基１−２７４３　ＦｉＦ、Ｇ、Ｋｌ
およびに２ドメインと短い連結ペプチドから成り、軽鎖
（残基２７５−５２７　）はＰドメインから成る。

天然の一末鎖ｔ−ＰＡが合成低分子量基質に対して活性
を示し且つプロテアーゼ阻害剤により阻害される事実〔
ランビー（Ｒａｎｂｙ）ら、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ。

２７、ｐ、１７５−１８３．１９８２を参照〕は、−重
鎖ｔ−ＰＡが有意な酵素活性をもつことを示している。

この点において、ｔ−ＰＡは、合成基質に対して本質的
に全く活性ヲ示さず且つ阻害剤と反応しない他の一本鎖
形のセリンプロテアーゼと相違している。−重鎖ｔ−Ｐ
Ａの酵素活性は一定のりシン残基（ｔ−ＰＡ分子の２７
７位）の存在によって生ずることが示唆された〔ワレｙ
　（Ｗａｌｌ＆ｎ　）ら、Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３２．ｐ、６８１−６８６．１９８
３を参照〕。他のすべてのセリンプロテアーゼでは、対
応する位置（すなわち、活性化切断部位の後の２位置）
が小さい疎水性残基で占められている。

上肥りシン残基をイソロイシンと交換したｔ−ＰＡの突
然変異体を生産するために１組換えＤＮＡ技術を応用す
る試みがなされた（国際特許出願ＰＣＴ／ＴＪＳ８５１
０１６１３を参照）。しかしながら、この修飾は肝臓に
よるｔ−ＰＡの急速な取込みを減することが期待できな
い。なぜならば、急速なりリアランスがその分子の酵素
的に不活性な重鎖中の構造によシ仲介されるからである
〔リジタノ（Ｒｌｊ−ｋｅｎｓＤ、Ｃ，）およびエメイ
ス（＆Ｉｅｉａ、Ｊ、Ｊ、）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、２
３８．ｐ、６４３−６４６．１９８６を参照〕。

〔発明の概要〕

本発明の主な目的は、生体内で比較的長い生物学的半減
期を有する線維累溶解活性組織型プラスミノーゲン活注
化因子を提供することである。本発明の他の目的は、天
然ヒト　ｔ−ＰＡと比較して、血漿阻害剤による阻害に
対してそれほど感受性でない活性化因子を提供すること
である。

本発明のこれらの目的および他の目的は以下の記載から
明らかであシ、成長因子（Ｇ）ドメインのほかＫＫＩド
メインも欠失された線維素溶解活性組織型プラスミノー
ゲン活性化因子によシ得られる。さらに、本発明のプラ
スミノーゲン活性化因子は１つまたはそれ以上の次の位
［または領域：すなわちアミノ酸残基１７７．１８４．
２７７および４４８の位置、およびＦドメイン（修飾さ
れる場合には、その一部または全部が欠失される）にお
いて修飾されている。

Ｆドメインは場合により欠失され、かつ１８４位はその
位置でのグリコシル化を防ぐために修飾されるのが好ま
しい。１８４位および４４８位はこれらの位置でのグリ
コシル化を防ぐために両方とも修飾されるのが特に好ま
しい。

本明細書にお込て、グリコシル化位置１８４および４４
８の修飾について述べる場合、その修飾とはグリコシル
化が起こらないようなものである。従って、問題の位置
はＮ−グリコシル化コンセンサス（共通）配列を修飾す
ることにより、Ｎ−グリコシル化を妨げるように修飾さ
れる。

本発明の特釦好適な態様では、Ｆドメインが全部欠失さ
れ、そしてアミノ酸位置１８４および４４８はこれらの
位置でグリコシル化が起こらないように修飾される。

このようなプラスミノーゲン活性化因子において、アミ
ノ酸残基２７７の位置で追加の修飾を行うのが好寸しく
、この種の修飾はその側鎖において陽電荷を示さないア
ミノ酸残基への変更の形であり得る。このような修飾の
例は、２７７位のりシン残基の代わりにバリン残基を使
用することである。

本発明の別の好適な態様では、成長因子ドメインの修飾
のほかにその分子の唯一の修飾として、あるいはアミノ
酸残１２７７位の修飾との組合せで、追加の修飾かに１
ドメインにおいてなされる。

本発明のさらに別の態様では、その分子の修飾がアミノ
酸残基１８４位においてなされ、それにより通常のｔ−
ＰＡでは起こるその位置でのＮ−グリコシル化がもはや
起こらない。１８４位におけるこの種の修飾では、その
アスパラギン残基がグルタミン残基によって置換される
。

アミノ酸位置１８４および２７７での上記修飾のほかに
、Ｋｌドメインを、場合によりＦドメインの修飾との組
合せで、修飾することも好適である。

本発明によれば、異なるドメインのこのような全ての修
飾は、それぞれのドメインの一部または全部の欠失によ
り構成される。

本発明Ｆｉｔた上記のような線維製溶解活性プラスミノ
ーゲン活性化因子をコードするヌクレオチド配列から成
るＤＮＡ配列を包含する。さらに、本発明はこのような
りＮＡ配列を発現しうるａ判可能な発現ベクターを含む
。さらに、本発明はこの種の複夷可能な発現ベクターで
形質転換した宿主細胞を包含する。

本ＥＡ細書で先に示したように、本発明の線維製溶解活
性プラスミノーゲン活性化因子は天然ｔ−ＰＡに比べて
より長込生物学的半減期を示し、それ故に血管の疾病の
ような血栓症を治療するための薬剤組成物および方法に
おいて特に有用である。

本発明の修飾ｔ−ＰＡは薬学的に有用な組成物の既知製
法を用いて処方される。従って、本発明はま念治療上有
効な量の修飾ｔ−ＰＡＷ、薬学的に許容される担体表共
に含有してなる薬剤組成物を包含する。得られる組成物
は血栓症を治療するのに有効な量、例えば血塊を溶解す
るのに有効な量、の修飾ｔ−ＰＡを患者に与えるであろ
う。

燻々の剤形がこのような薬剤組成物の投与を可能にすべ
く製造される。こうして、例えば非経口投与は心臓血管
系の疾患をもつ患者のために用いられる。投与量および
投与回数はその場の状況に応じて選択されるであろう。

本発明の修飾ｔ−ＰＡは天然ｔ−ＰＡよりも長い半減期
を有するために、投与量は従来技術のｔ−ＰＡによる療
法において現在使用されている投与量よりもかなり少な
くなる。

従って、−船釣に、血栓症の治療においては１日あたシ
約１〜／ｋｆ（体重〕までの用量が投与されるであろう
。この種の投与は注射または輸液により行われる。

静脈投与用の組成物は、無菌状態の等張水性溶液に修飾
ｔ−ＰＡを溶解した溶液剤の形をとり得る。

このような溶液はｔ−ＰＡを溶解状態に維持するための
可溶化剤を含むことができる。

本発明の他の面によれば、血栓症をもつ患者に有効量の
本発明プラスミノーゲン活性化因子を投与することから
成る、血栓症の治療方法が提供される。

本発明の別の面では、天然ｔ−ＰＡと比較して増大した
生物学的半減期を有し且つフィブリン親和性全保持する
これらの修飾ｔ−ＰＡ分子が血栓の生体内局在化のため
に使用される。この酵素は好ましくは活性部位のアミノ
酸残基の化学的修＠ＶＣより、あるいはこれらの残基を
コードするＤＮＡ配列の修飾により不活性化される。ジ
イソプロピルフルオロホスフェ−）　（ＤＦＰ　）　、
フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ　）、Ｎ−
ｐ−）シルーＬ−リシルクロロメタン（ＴＬＣＫ　）　
ｔたはペプチドクロロメチルケトン（例えばＨ−Ｄ−Ｐ
ｈｅ　−Ｇｌ）’　−ｋｒｇＣＨｚＣｌ　）のような試
薬によるセゾンプロテアーゼの化学的不活性化のために
、多くの公知方法が存在する。遺伝子修飾による不活性
化は特定部位の突然変異誘発（例えば実施例２）を使用
して行われ、それによシ活性部位の残基のいずれかをコ
ードする）Ａ配列を変化させる。好ましくは、天然の全
長ｔ−ＰＡのＳｅｒ　−４７８に相当するセリン残基が
アラニンに変えられる。

本発明はまた、本発明による修飾プラスミノーゲン活性
化因子をコードするヌクレオチド配列から成るＤＮＡ配
列を包含する。

さらに、本発明は、哺乳動物細胞内でのヒトタンパク質
の発現のために、ヒ）　ｔ−ＰＡ遺伝子に由来する下流
のｍＲＮＡプロセッシングシグナルｔ−含むＤＮＡフラ
グメントの好適な使用を包含する。このＤＮＡフラグメ
ントは第３図に示すヌクレオチド配列および制限酵素切
断部位によシ特徴づけられる。

さらに、本発明は、形質転換宿主細胞内でこの種のＤＮ
Ａ配列を発現しうる複製可能な発現ベクター７５提供す
る。さらに、本発明は、上記の複製可能な発現ベクター
で形質転換された宿主細胞を包含する。

本発明のさらに別の面によれば。

ａ）修飾プラスミノーゲン活性化因子をコードするＤＮ
Ａ配列を発現しうる複製可能な発現ベクターを作製し； ｂ）工程ａ）から得られるベクターを用いて培養宿主細
胞を形質転換して組換え宿主細胞を形成し；Ｃ）上記の
組換え宿主細胞を、プラスミノーゲン活性化因子コード
化ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で培養して、上
記プラスミノーゲン活性化因子を生産させ； ｄ）得られたプラスミノーゲン活性化因子を回収する； ことから成る、本発明の修飾プラスミノーゲン活性化因
子の生産方法が提供される。このような方法においては
真核宿主細胞が用いられる。

例として、１つの本発明化合物は成長因子ドメインおよ
び第１クリングルドメインを欠くことにより天然ヒ）　
ｔ−ＰＡと異なっている◇天然ｔ−ＰＡのＰｒｏ−４７
からＧｌｕ　−１７５までのアミノ酸残基が欠失され、
そしてＶａｌ−４６がｃｘ７−１７６に直接続いている
。この例示化合物と天然ｔ−ＰＡ分子との他の差異は、
第２クリングルドメイン中のＮ−グリコシル化部位（天
然分子ではＡｓｎ　−１８４に存在する）がこのアスパ
ラギン残基のグルタミンへの変換によりグリコシル化に
利用できなくなって因ることである。天然ｔ−ＰＡ分子
のＬｙｓ　−２７７に相当する位置のりシン残基はバリ
ンに変えられる。

以上のように修飾され走化合物はＦＫ２　（Ｇｉｎ　）
　Ｐ（Ｖａｌ）と表される。その他の例示化合物では、
天然ｔ−ＰＡ分子のＣ７ｓ　−６からＣｙｓ　−１７３
までの残基が欠失され、アミノ酸配列中のＩｌｅ　−５
の後にＳｅｔ　−１７４が続く。天然分子のＡｓｎ　−
１８４およびＬｙｓ−２７７に相当する残基は、最初の
化合物と同じ方法で修飾される。この２番目の化合物は
に２　（Ｇｉｎ　）　Ｐ　（Ｖａｌ　）と表される。

これらの例示化合物は表１に示す。

表　　　ｌ Ａｇｎ−１７７→５ｅｒ ＦＫ２（Ｇｉｎ）Ｐ（Ｖａｌ）　　　４７−１７５　　
　　Ａｓｎ−１８４→ＧｉｎＬＹＢ−２７７→Ｖａｌ Ａｓｎ−１７７−＋５ｅｒ Ｋ２（Ｇｌｎ）Ｐ（Ｖａｌ）　　　　　６−１７３　　
　　Ａｇｎ−１８４→Ｇ１ｎ１’１ｓ−２７７→’Ｖａ
　１ 残基に対して示された番号は天然ヒ）　ｔ−ＰＡ配列か
ら引用したものである（第１図参照）。

本発明によるヒト　ｔ−ＰＡの修飾は好ましくは、成長
因子ドメインの修飾または欠失、少なくとも１つのグリ
コシル化部位の除去、およびプロテアーゼドメイン中の
第２残基（Ｌ”ｌｔｓ　）の他のアミノ酸残基（その側
鎖が陽電荷を示さなｈもの）への修飾の組合せである。

これらの線維素溶解活性修飾ｔ−ＰＡ分子は、血流中で
天然の非修飾ｔ−ＰＡ　（天然または組換え体）よりも
長い生物学的半減期を有し、阻害剤との複合体形成によ
る不活化に対してもそれほど感受注でなＡ０効果的な血
栓溶解は、非修飾ｔ−ＰＡに対して現在使用されている
用量よりも比較的少ない用量のこれらのｔ−ＰＡ変異型
によシ得られる。

理論によって束縛されるのを欲しないが１本発明者らＶ
！、修飾ｔ−ＰＡ：ｓのようなより小さい分子が血塊中
九より速く拡散し、それによって非修飾全長ｔ−ＰＡよ
りも効果的に血栓溶解を誘発すると推測する。我々の結
果はまた。これらのより小さいｔ−ＰＡ分子が真核細胞
によって一層効果的に発現されることを示す。また、−
本領形の修飾分子が血漿阻害剤と反応しないか、又は非
修飾ｔ−ＰＡよりも遅く反応するということは、大規模
生産にとって重要であるだろう。大抵の場合に、プロテ
アーゼ阻害剤を含む血清を培地に補給しなければならな
いので、このことは組織培養物からの線維素溶解活性分
子の生産量を増大させる。分泌された非修飾ｔ−ＰＡの
かなりの部分がウシ胎児血清に由来する阻害剤と複合体
を形成することが報告されている〔シュｅｔイニング（
Ｓｃｈｌｅｕｎｌｎｇ　Ｗ、Ｄ、入線紅素溶解九関する
第■回国際会議の抄録番号８２゜ウィーン、１９８６を
参照〕。

これらの修飾された線維素溶解酵素は組換えＤＮＡ技術
を用いて生産される。修飾分子をコードするＤＮＡ　Ｆ
ｉ、全長ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ　ｋ適当な制限酵素で消化
し、特定部位の突然変異誘発および／またはＤＮＡフラ
グメントの化学合成のような技術を利用することにより
構築される。これらの方法は組換えＤＮＡ技術の分野で
通常の知識を有する者によく知られて層る。

修飾され九線維素溶解分子をコードするＤＮＡは。

真核またＦｉ原核細胞内での発現のための適当なベクタ
ーに導入される。

この分子の精製は、適当な改変を伴う天然ヒトｔ−ＰＡ
のために開発された既知方法にょシ行うことができる。

適切な精製方法は、タンパク質精製の分野で通常の知ａ
ｔ−有する者によって開発されるだろう。

ヒト　ｔ−ＰＡ下流プロセッシングシグナルに融合され
た天然または修飾ヒトｔ−ＰＡコード配列の上流にプロ
モーター因子だけでなくエンハンサ−因子を含む転写単
位を使用することにより、分析し＊全てのＸ核ａ胞ｉ、
例、ｔハＣ１２７、ＮＩＨ３Ｔ３　。

５ｗ１ｓｓ３Ｔ３のようなマウス細胞、ＣＨＯｄ　−、
ＣＨＯＫ　１　。

ＮＡＫ　、　Ｒ３１６１０（７）ようなハムスター細胞
、ＣＶ−１゜Ｃ０８−１，Ｃ０８−７のようなサル細胞
において高レベル発現が得られた。発現レベルは、ヒト
以外の真核生物遺伝子またはウィルス遺伝子からの下流
プロセッシングシグナルを使用したときに比べて、相同
なコーディング／下流プロセッシング単位を使用したと
きの方が実質的に高かった。ｔ−ＰＡ発現配列は最後の
エクソンと更に下流の配列に関してヒトゲノムに見られ
るこの領域の配列と同一である。この領域は第３図に示
すヌクレオチド配列および制限酵素切断部位により特徴
づけられる。

この改良された相同単位は、ｃＤＮＡの老後のエクソン
領域中の対応部位へｓ　ｍＲＮＡプロセッシングシグナ
ルを与える要素を融合することにより得られる。

ウサギによるターンオーバー（回転速度）検定天然およ
び修飾ｔ−ＰＡｔ−１０〜３０４の静脈内ポーラス用量
として注入した。耳動脈中のカニユーレから、血液試料
全頻繁に採取し、１０％クエン酸ナトリウムと混合した
。遠心後、血漿試料はヒト黒色１１ｆｌ−ＰＡに対する
ポリクローナル抗体を利用する酵素結合免疫吸着検定（
ＥＬＩＳＡ　）により組換えｔ−ＰＡについて検定した
。

寄託：微生物、組換えＤＮＡ分子、および本発明の修飾
ｔ−ＰＡＤＮＡコート°配列、ならびにそれらを作農す
るのに有用な出発物質は１９８７年６月１６日にドイツ
国ゲッチンゲンＤ　−３４００、グリスバッハストラー
ゼ８　、　　’　Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ
　ｖａｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　’のカルチ
ャーコレクションに寄託され、そこで以下のように同定
された：Ａ　：　ＪＭ８３　　（ｐＫＧＥ２２）　　　
　寄託番号：　ｍ　４１４２本発明は次の実施例を参照
することによりさらに理解されるであろう。これらの実
施例は細枠に例示的であり、特許請求の範囲に記載の本
発明の真の範囲を制限するものとして解釈されるべきで
はない。

実施例１ ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）をコ
ードする遺伝子のクローニング 細胞培養 高レベルのｔ−ＰＡ　ｔｌ−構成的に生産する形質転換
ヒト細胞株Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞は、１％非必須アミノ
＋ＩＲ（Ｆｌｏｔｖ　）、グルタミン（２ｒｎＭ）−ペ
ニシリン（５０ＩＵ／Ｉｄ）、ストレプトマイシン（関
μＩ／耐）、ヘペス（２０ｍＭ％ｐＨ７，２）およびｌ
Ｏチウシ胎児血清を補給したイーグル最少必須培地中３
７℃でガラス製のローラーボトル中にて培養した。

メツセンジャーＲＮＡの調製 黒色腫細胞の全面生長培養物をトリプシン処理して収穫
した。氷冷したリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，２）で洗った
後、細胞を遠心により回収した。細胞沈殿物は４Ｍ　Ｇ
ｕＳＣＮ中で溶解し、その後金ＲＮＡ　ｔ−ＧｕＦ（Ｃ
Ａ！溶液から選択的にエタノール沈殿させた。

メツセンジャーＲＮＡはオリゴ−ｄＴセルロースでのク
ロマトグラフィーにより全ＲＮＡ調製物から精製した。

得られたポ！ｌ　Ａ＋ｍＲＮＡは関ｍＭ　ＬＩ（２１　
、加ｍＭト　リ　ス　−　Ｈ（２１　　、　　　１ｍＭ
　　　ＥＤＴＡ　　−Ｌｉ　、　　１　　％　ＬｉＤＳ
　　中の１０〜３０％ショ糖から成るシヨ塘勾配上でｐ
Ｈ７，８にて大きさにより分画化した。

黒色腫細胞ｍＲＮＡからのｃＤＮＡバンクの作製２３Ｓ
に相当するショ糖分画は、ドツト−プロット・ハイブリ
ダイゼーションによりｔ−ＰＡ　ｍＲＮＡに富むことが
分かった。この濃縮分画からのｍＲＮＡ　５Ｍｇを用い
て、ヘテン（Ｈｅｄｅｎ　）ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　
、　１９４．ｐ、３２７−３３２．１９８６に詳述され
る如く改変した岡山＆バーブ法ＣＯｋａｙａｍａ　＆　
Ｂｅｒｇ＋Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、３．ｐ、２８
０−２８９　）によりｅＤＮＡライブラリーを作製した
。開示された方法に従って作製したｃＤＮＡ含有プラス
ミドｐＴ４は大腸菌５Ｋを形質転換するために使用した
。得られた遺伝子バンクは約５ＸＩＯ’個の独立クロー
ンから成っていた。

分離した部分的ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡクローン〔エドルン
ド（Ｅｄｌｕｎｄ　）ら、Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔ　１　、
Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ　、ＵＳＡ　８０　＊ｐ、３４９
−３５２．１９８３　　を参照〕を用いて、ｔ−ＰＡ配
列含有クローンについて遺伝子ライブラリーをスクリー
ニングした。ｃ　ＤＮＡクローンの４７６　ｂｐＥｃ　
ｏＲＩフラグメントは市販のニック・トランスレーショ
ンキット（ＮＥＮ　）を使って、比活性約５×１０’ｃ
ｐｍ／μ、！ｉｉ’　ヘ”Ｐ　−ｄＣＴＰ　　でニック
・トランスレーションした。細菌コロニーＦｉＰＡＬＬ
フィルターへ製造者の指示する方法により移行させ、５
０％ホルムアミド、５　Ｘ　ＳＳＣ、２５０４／−酵母
皮仏中３７℃チー晩ニック・トランスレーションしりＤ
ＮＡ　７”ローブとハイブリダイズさせた。周囲温度に
おいて２　Ｘ　ＳＳＣで３回洗った後、フィルターを乾
燥させてＸ線フィルムに露出させた。

Ｉ）ＫＧ　１２と名づけた１つのクローンがオートラジ
オグラフィー後に同定された。制限酵素Ｋｐｎ　Ｉおよ
びＰｓｔ　Ｉでの消化は、ｐＫＧ１２が約２．５ｋｂの
挿入物を含むことを明らかにした。この挿入物はＭ１３
ｍｐ１０およびｒｌｐＨ（メツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ
　）、Ｊ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ）’ｍｏｌ、１０１．ｐ、２０
−７８．１９８３’に参照〕にサブクローニングし、そ
してジデオキシ−チエイン・ターミネーション法〔サン
ガー（Ｓａｎｇｅｒ　）ら。

ＰＮＡＳ　、　７４　、Ｔ）、５４６３−５４６７．１
９７７を参照〕を用いてＤＮＡ配列を解析した。クロー
ンｐＫＧ　１２はヒトｔ−ＰＡの全コード領域、並びに
１０２ｂｐ　５’隣接ＤＮＡ７６０　ｂｐ　３’隣接Ｄ
ＮＡおよびポリＡ尾部を含むことが判明した。ｐＫＧ　
１２の完全なりＮＡ配列を第１図に示す。

真核細胞発現のためのｔ−ＰＡのサブクローニング第２
図に示すように、全コード配列、全部の５非コード領域
、および５５９ｂＰの３１非コードＤＮＡは２３５０ｂ
ｌ）の部分ＡｖａＩ／ＸｍｎＩフラグメントに含まれる
。

このフラグメントを得るために、ｐＫＧ１２２５４は３
０単位のＸｒｒＩｎＩ（ｉ−用いて３７℃で一晩完全に
切断した。Ａｖａ　Ｉ　（９単位）を加え、切断ヲ３７
℃でさらに１時間加分続行した。生成した種々の切断産
物は０．６チ低モ アガロース、ＢｉｏＲａｄ社）で分離した。２３５０ｂ
ｐバンドを切り出し、６８℃で融解し、その後フェノー
ル抽出を行ってエタノール沈殿させた。精製したフラグ
メントはｄＮＴＰ　：　ｓの存在下にＤＮＡポリメラー
ゼのフレノウ断片を用いて修復反応により平滑末端とし
た。このフラグメントにＢａｍＨＩリンカ−（５’　−
（Ｇ（ＧＧＡＴＣ（Ｇ（Ｇ−３’　）’ｔ　Ｔ　４　Ｄ
ＮＡリガーセニヨり付加した。ＢａｍＨＩでの切断およ
び０．７　％　ＬＧＴ　−アガロース電気泳動による過
剰のＢａｍＨＩリンカ−フラグメントの除去後に、ｔ−
ＰＡフラグメントをＢａｍ１Ｉで切断したｐＵＣ８に連
結させた。得られたプラスミド（ｐＫＧＥ２２と称す）
はＨｉ　ｎｄｌ［ｌ／　ＢａｍＨＩフラグメント内に大
部分のｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ　’に含む。

推定上のポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡ　’ｅ　
有するＸｍｎ　１部位の下流の配列は除去された。

連結混合物を使用して、コンピテント大腸菌ＪＭ８３細
胞を形質転換し比。５０４／ＩＩＬｔのアンピシリンお
よび２５４／平板のジメチルホルムアミド中２　％　Ｘ
　−９ａｌ　ｋ含む寒天平板上で白色コロニーを選択し
た。

実施例２ に２　（Ｇｉｎ　）　Ｐ　（Ｖａｌ　）の構築Ｆ、Ｇお
よびに１ドメインを欠失したｔ−ＰＡ分子をコードする
遺伝子を構築するために使用した戦略（ｓｔｒａｔｅｇ
）’　）は、初めに１（１３）位のＢｇｌ　１１から７
１６位のＥｃｏＲ１部位にまで及ぶ６１３ｂｐ制限フラ
グメントを除き、次いでオリゴヌクレオチドリンカーを
用いてに２ドメインをシグナルペプチドへ直接融合する
ことであった。

６１３ｂＰの内部Ｂｇｌ　Ｂ　／　ＥｃｏＲＩフラグメ
ントの除去により、　　Ｆ、Ｇおよびに１ドメインをコ
ードする領域が欠失される。リンカ−断片を用いて、プ
ロセッシングされた成熟ｔ−ＰＡの５個のＮ末端アミノ
酸残基を伴うに２ドメインの欠失部分を修復した。さら
に、グリコシル化部位Ａｓｎ　１８４をＧｉｎ　Ｋ変え
、１７７位のアスパラギン残基をセリン残基で竹換した
。

シグナルペプチドとに２ドメインとを融合させるリンカ
−フラグメントは、ホスホルアミダイト法〔エルンプラ
ツド（Ｅｌｍｂｌａｄ　）ら、Ｎｕｃｌ。

Ａｃ　ｉｄＱ　、　ｐ、　３２９１−３３０１　、１９
８２を参照〕を用いて２本の相補的な１１６ｂＰオリゴ
ヌクレオチドを合成することにより作製した。

合成した１１６−　ｍａｒそれぞれ（資）ピコモルは、
マニアチスらの方法ＣＭａｎｉａｔｉｓら、モレキュラ
ー−クローニング：　実ａ室マニュアル、コールド書ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−１９８２’を参照〕
によりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ＋ｓ社）を用いてリン酸化した。

２本のＤＮＡ鎖は７０℃で５分間加熱することによりア
ニーリングし、その後ω分間かけて温度を２０℃へ低下
させた。５ピコモルの二本鎖リンカ−は標準連結条件〔
マニアチスらの上記文献を参照〕を用いて、ＥｃｏＲｌ
およびＨｉｎｄＩ［Ｉで消化した。　０．１ピコモルの
Ｍ１３ｒｒ１１８へ連結させた。その後、連結混合物を
使用して、コンピテント大腸菌ＪＭ　１（１３）　ｆ形
質転換した。組換え体はＸ−ｇａｌ平板上で白色プラー
クとして選別された。−本領ファージＤＮＡ　を分Ｍ　
Ｌ　ｓ　１７−ｍｅｒ　Ｍ１３ユニバーサル番シークエ
ンシング・ブライマー３　’　−ＧＴＡＡＡＡ（ＧＡ（
ＧＧＣＣＡＴ−５’を用いてジデオキシ法により塩基配
列を決定した。

正確な配列をもつ１つのクローンから二本鎖複製型（Ｒ
Ｆ　）をつくり、その後の構築作業のために使用した。

上記のＭ１３クローンからの二本鎖ＤＮＡ　＃ｉＢｇｌ
　ＩＩおよびＥｃｏＲＩで完全に消化した。生成した１
ｉｏｂｐ７ラグメントを１，２　［ＬＧＴ−アガロース
ゲル（米国ＢｉｏＲａｄ社）から回収した。プラスミド
ｐＫＧＥ２２をＢｇｌ　ＩｔおよびＥｃｏＲＩで部分消
化し、踵々の切断産物を０．６チＩｆｌＴ−アガロース
ゲルで分離した。

１（１３）位のＢｇｌ　ｎから７１６位のＥｃｏＲＩま
でのｔ−ＰＡの内部領域を欠失しｆｃ４３８１ｂｐフラ
グメントが単離されたｏ　１１０　ｂｐ　Ｂｇｌ　ＩＩ
　／　ＥｃｏＲｌオリゴヌクレオチドリンカーは、　Ｔ
　４　ＤＮＡリガーゼを用いて１）ＫＧＦ：Ｊ２２の４
３８１ｂｐ部分Ｂｇｌ口／　ＥｃｏＲＩ消化物へ連結さ
せて、プラスミドｐＫＧＥＰ　７５　”を得た。この連
結混合物を用いて、コンピテント大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞
を形質転換した。Ａｍｐ　（５０４７Ｎ　）　’に含む
選択平板上に現れるクローンからプラスミドＤＮＡ　ｆ
：調製した。

次に、非修飾ｔ−ＰＡ配列の２７７位のアミノ酸に相当
するりシン残基は、特定オリゴヌクレオチドの突然変異
誘発によりバリン残基に変更した。

プラスミドｐＫＧＥＰ　７５はＳａｌ　ｌ　／　Ｓａｃ
　ｌで消化し、そして０．９％ＬＧＴ−アガロースゲル
から０゜９Ｋｂフラグメントを回収した。このフラグメ
ント（アミノ酸２７７をコードするＤＮＡ配列を含む〕
はＭ１３ｍｐ１９　　にクローニングした。　Ｏ，９Ｋ
ｂ　Ｓａｔ　ｌ／Ｓａｃ　Ｉ挿入物を保有するＭ１３ク
ローンの一末鎖ＤＮＡ’を調製し念。この−重鎖ＤＮＡ
は合成オリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＣＣＴＣＣＣＡ
（ＧＡＴＧ（ＧＡＡＡ−３’　　）と７１イプリダイズ
させた。アニーリングは１ｘＴＭ緩ｇｒＩ液（１０ｍＭ
）リス−Ｈ（Ｊ、１０ｍＭ　ＭｇＣ１＊　−ｐＩ（８，
０）中７０℃で５分行った。１時間後、温度が２０°Ｃ
に下がったとき、１μ１１０ＸＴＭ緩衝液、ｌ　ｆｉｌ
　１０ｍＭ　ＡＴＰ　、　１μｌ’Ｘ）ｍΔ（ｄＮＴＰ
　。

１μｌ　１００　ｍＭＤＴＴ　、　５単位クレノウ断片
および１２単位Ｔ　４　ＤＮＡ　９ガーゼを添加した。

伸長／連結反応は１５℃で４時間実施した。

得られ九二発錆ＤＮＡ　を直接使用してコンピテント大
腸菌ＪＭ　１（１３）細胞を形質転換し、２００個のブ
ラーりは５１末端を３２ｐ　　で標識したミスマツチ（
誤対合）ブライマーとハイブリダイズさせたｏ５００Ｃ
で洗浄後に強いノ・イブリダイゼーション信号を与える
１つのプラークを精製し、二本鎖複１！！型をつくった
。Ｌｙｓ　Ｖａｌ修飾を含む９００　ｂｐのＳａｌ　Ｉ
　／　５ａｃＩフラグメントは、　　Ｓａｌ　ｌおよび
Ｓａｃ　ｌでの切断。

それに続＜０．９チＬＧＴ−アガロースゲル電気泳動に
より回収された。このフラグメントは５ａｉｌ／Ｓａｃ
　ｌで消化したｐＫＧＥＰ　７５にクローニングし、こ
れによりプラスミドｐＫＧＥ１１４’ｅ得た。

プラスミドｐＫＧＥ１１４はに２　（Ｇｉｎ）Ｐ（Ｖａ
ｌ）で表される例示化合物をコードしている。

実施例３ ＦＫ２　（Ｇｌｎ）Ｐ（Ｖａｌ）　　の構築プラスミド
ｐＫＧｇＰ　１１４では、に２ドメインがＢａｒｎＨ１
部位により先行される。この部位を利用して、に２ドメ
インのすぐ前にＦドメイン全コードする領域を導入した
＠ 特定部位の突然変異誘発により、ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ配
列のＦドメインとＧドメインとの接合点にＢａｍＨ１部
位を作った。プラスミドｐＫＧＥ　２２はＳａｔ　１お
よびＥｃｏＲＩで完全に消化した。シグナル配列および
Ｆ、Ｇ、Ｋｌドメインに及び８００　ｂｐフラグメント
をＬＧＴアガロースゲル電気泳動後に回収し、Ｍ１３ｍ
ｐ　ｉ９にサブクローニングした。−重鎖型のＭ１３ク
ローンはｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発のための鋳型と
して役立った。合成２４ｂｐオリゴヌクレオチドミスマ
ツチプライマー（５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＴＧＧＡＴＣ
ＣＣＡＣＴＧＡＧＴＧ−３Ｉ）を用いてアミノ酸残基４
７および４８をＰｒｏ　−ＶａｌからＧｔｙ　−Ｓｅｒ
へ変換し、それによってＧドメインとに１ドメインとの
接合点Ｋ　Ｂａｍ）口部位を作った。３２ｐ標識２４　
ｂｐミスマツチプライマーにより強いハイブリダイゼー
ション信号を与える１つのプラークを精製し、二本鎖Ｄ
ＮＡを作製した。

その二本鎖ＤＮＡはＳａｌ　ＩおよびＢａｍＨＩで消化
し、シグナル配列およびＦドメインだけでなく５′非翻
訳領域を含むフラグメントヲ０．８％ＬＧＴアガロース
から回収した。

例示化合物ＦＫ２　（Ｇｌ　ｎ　）Ｐ　（Ｖａ　１　）
をコードするプラスミドＰＫＧＥＰ　１１５　　を得る
ために、プラスミドｐＫＧＥＰ１１４　ｆ　Ｓａｌ　ｌ
で完全に消化し、その後Ｂａｎｆ口で部分切断した。５
１非翻訳領域およびシグナル配列を欠いたｔ−ＰＡ遺伝
子を伴うｐＵＣ８ベクターに相当するフラグメントを切
り出し、そしてシグナル配列およびＦドメインを含むＳ
ａｌ　Ｉ　／　Ｂａｍ）ロフラグメントに連結した。

実施例４ 真核細胞による線維素浴解活性ｔ−ＰＡおよびｔ−ＰＡ
誘導体の発現 エンハンサ−およびプロモーター配列を含むＤＮＡフラ
グメントおよびヒト　ｔ−ＰＡ遺伝子の下流領域からの
ゲノムフラグメントに連結された実施例２および３で作
製したような修飾ｃＤＮＡ：ｓおよび適当な極ａｔ−有
する実施例１のような全長ｃＤＮＡを制御する発現単位
は、碌々な細胞系内での発現のために数種のベクターに
導入した。

真核細胞発現ベクターは慣用のトランスフェクション法
により細胞内に導入した。所定の宿主細胞クローンでの
一時的発現または安定した発現は酵素結合免疫吸着検定
（ｇＬＩｓＡ　）　’！？用いて検定し、そしてａｍ素
溶解活活性プラスミノーゲン含有フィブリン平板で検定
した。

Ａ）ＣＯ８−７サル細胞による一時的発現ＳＶ　４０後
期プロモーター　ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０由
来の小さいｔイントロン、細菌レプリコンおよび選択マ
ーカーを含む発現ベクター（ｐＭＬ　２ｄ　）を構築し
た。Ｃｏｓ発現ベクターの基本的特徴は、ｃＤＮＡ配列
がＳａｌ　Ｊ　／　Ｂｇｌ　ＩＩ適合性付着末端を用い
てＳＶ４０後期プロモーターと３１ポリアデニル化シグ
ナル配列の間に挿入されるということである。全長ｔ−
ＰＡ　ｃＤＮＡ　、　Ｋ２（Ｇｌｎ）Ｐ（Ｖａｌ）およ
びＦＫ２　（ＧＩ　ｎ　ＪＰ（Ｖａ　１　）のコード配
列はそれぞれベクターｐＫＧＥ　２２　、　ｐＫＧＥＰ
　１１４およびｐＫＧＥＰ　１工５由来のＳａｌ　Ｉ　
／　Ｂａｍ）■フラグメント上に得られた。

これらのフラグメントはＳａｌ　Ｉ　／　Ｂｇｌ　Ｕ消
化ＣＯ８発現ベクターに連結して、ベクターｐＫＧＥ　
７４、ｐＫＧＥ　１１４およびｐＫＧＥ　１１５を得た
。

これらの発現プラスミドはＤＥＡＥ−デキストラントラ
ンスフェクションプロトコール〔サンベイラック＆ダナ
（Ｓｏｍｐａｙｒａｃ　＆　Ｄａｎｎａ　）、Ｊ、Ｖｉ
ｒｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　５．３３５−３４１．１９８２　’に
参照〕を用いてＣＯ３−７細胞へ導入した。培地をトラ
ンスフェクションの槌時間後と７２時間後に収穫し、抗
原および線維素溶解活性について検定した。さらに、Ｓ
ＤＳ　／ポリアクリルアミドゲル電気泳動、それに続く
フィブリンオートグラフィーによって同定した（第４図
を参照）。

Ｂ）Ｃ１２７マウス細胞での安定した発現安定的に形質
転換されたマウス細胞による修飾または天然ｔ−ＰＡの
生産のために、高コピー数の染色体外複製が可能なベク
ターが使用された。ベクターｐＫＧＥ　８３　が構築さ
れ、このベクターではｔ−ＰＡ遺伝子がマウスメタロチ
オネインプロモーター（ｍＭＴ−１）の支配下にあり、
そしてポリアデニル化シグナルおよびｔ−ＦＡ遺伝子の
エクソン１４を包含するヒトゲノムフラグメント由来の
その他の下流シグナルが含まれる。真核細胞複製起点、
プラスミド維持配列および宿主細胞の形質転換はウシパ
ピローマウィルス（ＢＰＶ　）によりもたらされる。

出発プラスミドはｐＵＣ８のＨｉｎｄ［［とＢａｍＨ１
部位間のｔ−ＰＡ遺伝子、ｍＭＴ　−１プロモーター因
子およびＳＶ４０の小さいｔイントロンならびにポリア
デニル化シグナルを含むｐＭＴ　ｔＰＡ　、おヨヒｐＭ
Ｌ２ｄ　−ＢＰＶ変異体ＯｐＫＧＥ５０　テロ　ル。

プラスミドｐＭＴｔＰＡおよびＩ）ＫＧＥ５０￥ｉＢ紅
…■およびＳａｔ　ｌで消化した。ｐＭＩ’　ｔＰＡか
らｔ−ＰＡとｘｉ因子を含む３，９Ｋｂフラグメントを
分離し、全ＢＰＶゲノムおよびｐＭＬ２ｄ配列を含むＢ
ａｍＨＩ　／　Ｓａｌ　ｌフラグメントに連結し、それ
によりｐＫＧＥ　６１　　ｋ得た。

次の工程で、プラスミドｐＫＧＥ　２７　　（ヒトｔ−
ＰＡ遺伝子のエクソン１４以上の領域を包含するゲノム
フラグメントを含む）ｔＡＰａｌおよびＳａｌ　１で消
化した。ポリアデニル化シグナル配列のようなプロセッ
シングシグナルを含むこのフラグメントは、Ａｐａ　Ｉ
およびＳａｌ　ｌで消化したｐＫＧＥ６１へ挿入した。

得られたプラスミドｔ　ｐＫＧＥ　８３　　と名づけた
。

ｐＫＧＥ　８３　　と類似しているが、実施例２のよう
にして修飾したｃＤＮＡ’？含むプラスミドｐＫＧＥ　
１１３は、ｐＫＧＥ８３　由来の１０，２Ｋｂ　Ａｐａ
　Ｉ　／　ＢａｍＨｌフラグメントの連結により構築さ
れた。このプラスミドは全ＢＰ’Ｖ　−１ゲ７　ム、ｐ
ＭＬ２ｄ配列、ｔ−ＰＡ遺伝子の遠位部分、＆−１プロ
モーター因子を含む０，７Ｋｂ　ＢａｍＨＩ　／　Ｓａ
ｌ　ｌフラグメント、およびｃＤＮＡ修飾を含むＳａｌ
　Ｉ　／　ＡＰａ　ｌフラグメントを含んでいる。

これらの宿主ベクター系は完全なまたは修飾されたｔ−
ＰＡＯ高レベし発現が可能である。表２Ｆｉ異なるプラ
スミドを用いてトランスフェクションした後のＣ１２７
細胞に訃ける発現レベルを示す。

線維素溶解活性およびＥＬＪＳＡ検出可能タンパク質の
量は、修飾ｔ−ＰＡ産生クローンの方が全長分子をコー
ドする対応ベクターでトランスフェクションしたものよ
りも多量であった。また、発現レベルはヒトｔ−ＰＡ下
流プロセッシングシグナルを含むゲノムフラグメントを
使用したときに増大すると結論づけることができる。

表 ｐＫＧＥ６１　　　　　　　　０，５　　　　　　　　
　　　４１）ＫＧＥ　８３　　　　　　　　３．１　　
　　　　　　　　　９上記ベクターはリン酸カルシウム
法〔ウィグラー　（Ｗｉｅｇｌｅｒ　）ら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ７６　ｅｌ）、１
３７３−１３７６　、１９７８　を参照〕を用いてマウ
スＣ１２７細胞にトランスフェクションされた。細胞は
ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ　）肉腫ウィルス５’ＬＴＲ（
０７グ・ターミナル・リピート）の制御下にあるネオマ
イシン耐性をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＧ
Ｅ　５３　　と共に同時トランスフェクションした。

ネオマイシン類似体Ｇ４１８を培地に加え（１ｒｎ９／
ｍｌ　）、Ｇ４１８含有培地中で約２週間培養した後初
〜１００クローンを分離した。これらのクローンは別個
に増殖させ、ＥＬＩＳＡ検定でｔ−ＰＡ抗原の発現につ
いて検定した。

Ｃ）　　ＣＨＯ細胞での安定した発現 発現ベクターｐＫＧＥ　２５はＳＶ　４０プロセツシン
グシグナルおよびＳＶ４０初期プロモーターの支配下に
ある全長ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ　、マウス乳癌ウィルスＭ
ＭＴＶ５’　ＬＴＲによシ支配されるＤＨＦ’Ｒ１７）
転写単位、ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０由来のそ
の他の下流プロセッシングシグナル、およびｐＢＲ３２
２由来の原核細胞複製シグナル２含むＤＮＡフラグメン
トを包含する。このベクターをＤＴ（ＦＲ欠損ＣＨＯ細
胞〔ウーラウブ＆チェイシン（Ｕｒｌａｕｂ　＆　Ｃｈ
ａｓｉｎ　）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ７７　、１）、４２１６−４２２０．１９８０を
参照〕にトランスフェクションし、形質転換体を分離し
、そして次第に増加する濃度のジヒドロ葉酸還元酵素阻
害剤メトトレキセート（■■）中で生育させた。

１個の代表的形質転換体（ｐＫＧＥ２５７：９　　）に
おいて得られた発現レベルを■■の増幅に相関させて表
３に示す。

表　　　３ ０．００ ０．０５ ０．０２ ０．１５ ０．５０ ４．７ （２１（Ｏｄ−細胞はヌクレオシドを含む培地Ｆ−１２
中で培養した。トランスフェクション後この培地ヲヌク
レオシド不含イーグルα−■瓦に変えた。生存クローン
は次第に増加する濃度のメトトレキセート中で培養する
ことにより増殖させた。ｔ−ＰＡ抗原の生産はＥＬＩＳ
Ａ検定で分析した。

【図面の簡単な説明】

第１図は全長ヒ）　ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列および推定上のアミノ酸配列を示す。 第２図はベクターｐＫＧ１２中の全長ｔ−ＰＡ　ｃＤＮ
Ａと、英施例１に記載されるような真核細胞発現（ｐＫ
ＧＥ　２２　）のために修飾されたｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ
との間の関係を示す模式図であり、異なるドメインをも
つｔ−ＰＡタンパク質が下段に示される。 第３図はｐＫＧ　１２におけるヌクレオチドナンバリン
グと関連させた。クローンＫＧＨ１１に含まれるヒトゲ
ノムＤＮＡフラグメントの模式図である。そこ圧紀載の
ヌクレオチド配列は３′隣接ゲノムＤＮＡおよびポリＡ
シグナルを保有する最後のエクソン部分を表す。 第４図はＣＯ８細胞により生産された全長ヒトｔ−ＰＡ
および修飾型ｔ−ＰＡのＳＤＳ　／ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動後のフィブリンオートグラフィーである。 第５図はウサギ血漿からの天然全長ヒト　ｔ−ＰＡ（ｐ
ＫＧＥ　７４　）および修飾型ｔ−ＰＡ　（ｐＫＧＥ　
１１４　、１１５　）の排出を示すグラフである。 代理人　弁理士　　秋　沢　政　光 他１名 第 図 シこ ウサギ血漿からの天然ｊ−ＰＡおよび修復Ｌ−Ｐ　Ａの
υト出（り１）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）成長因子（Ｇ）ドメインが欠失され、Ｋ１ドメイ
   ンも欠失され、さらに一つまたはそれ以上の次の位置も
   しくは領域：すなわち、アミノ酸残基１７７、１８４、
   ２７７および４４８の位置ならびにＦドメインにおいて
   修飾されており、Ｆドメインの修飾が存在する場合、そ
   の修飾はＦドメインの一部または全部の欠失から成るこ
   とを特徴とする、線維素溶解作用を有する組織型プラス
   ミノーゲン活性化因子。 （２）Ｆドメインが場合により欠失され、そして１８４
   位がその位置でのグリコシル化を防ぐべく修飾されてい
   る、請求項１記載のプラスミノーゲン活性化因子。 （３）Ｆドメインが場合により欠失され、そして４４８
   位がその位置でのグリコシル化を防ぐべく修飾されてい
   る、請求項１記載のプラスミノーゲン活性化因子。 （４）Ｆドメインが場合により欠失され、そして１８４
   位および４４８位がそれらの位置でのグリコシル化を防
   ぐべく修飾されている、請求項１記載のプラスミノーゲ
   ン活性化因子。 （５）追加の修飾がアミノ酸残基２７７の位置で行われ
   る、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプラスミノー
   ゲン活性化因子。 （６）追加の修飾が側鎖において陽電荷を示さないアミ
   ノ酸残基への変更によつて構成される、請求項５記載の
   プラスミノーゲン活性化因子。 （７）追加の修飾がリシン残基をバリン残基で置き換え
   ることにより構成される、請求項６記載のプラスミノー
   ゲン活性化因子。 （８）組み合わされた請求項４および６記載のプラスミ
   ノーゲン活性化因子。 （９）該修飾がアスパラギン残基をグルタミン残基で置
   き換えることにより構成される、請求項２、３または４
   記載のプラスミノーゲン活性化因子。 （１０）Ｆドメインが欠失されており、且つ１８４位お
   よび４４８位がそれらの位置でのグリコシル化を防ぐべ
   く修飾されている、請求項１記載のプラスミノーゲン活
   性化因子。（１１）請求項１〜１０のいずれかに記載の
   線維素溶解作用を有するプラスミノーゲン活性化因子を
   コードするヌクレオチド配列から成るＤＮＡ配列。 （１２）形質転換宿主細胞内で、請求項１１記載のＤＮ
   Ａ配列を発現しうる複製可能な発現ベクター。 （１３）請求項１２記載のベクターで形質転換された宿
   主細胞。 （１４）治療上有効な量の、請求項１〜１０のいずれか
   に記載の線維素溶解作用を有するプラスミノーゲン活性
   化因子を、薬学的に許容される担体と共に含有してなる
   薬剤組成物。 （１５）非経口投与に適した剤形である、請求項１４記
   載の組成物。 （１６）血栓症の治療に使用するための、請求項１〜１
   ０のいずれかに記載の線維素溶解作用を有するプラスミ
   ノーゲン活性化因子。 （１７）請求項１〜１０のいずれかに記載の線維素溶解
   作用を有するプラスミノーゲン活性化因子の生産方法で
   あって、 ａ）上記プラスミノーゲン活性化因子をコードするＤＮ
   Ａ配列を発現しうる複製可能な発現ベクターを作製し； ｂ）工程ａ）から得られるベクターを用いて宿主細胞培
   養物を形質転換し、それにより組換え宿主細胞を形成し
   ； ｃ）該組換え宿主細胞をプラスミノーゲン活性化因子コ
   ード化ＤＮＡ配列を発現させる条件下で培養して、上記
   プラスミノーゲン活性化因子を生産させ；そして ｄ）生産されたプラスミノーゲン活性化因子を回収する ことから成る上記方法。 （１８）真核宿主細胞を使用する、請求項１７記載の方
   法。 （１９）血栓症患者に有効量の請求項１〜１０のいずれ
   かに記載のプラスミノーゲン活性化因子を投与すること
   から成る、血栓症の治療方法。 （２０）請求項１〜１０のいずれかに記載のプラスミノ
   ーゲン活性化因子を用いることによる血栓の生体内局在
   化方法であつて、 ａ）それ自体知られた方法で上記活性化因子を不活性化
   し； ｂ）工程ａ）から得られる活性化因子のみを標識し； ｃ）工程ｂ）で標識した活性化因子を、血栓につけて診
   断すべき動物の生体に投与し；そしてｄ）標識活性化因
   子の蓄積が起こる部位を決定する 各工程から成る上記方法。 （２１）哺乳動物細胞内でヒトタンパク質を発現させる
   ための、ヒトｔ−ＰＡ遺伝子に由来する下流ｍＲＮＡプ
   ロセッシングシグナルをさらに含む、請求項１１記載の
   ＤＮＡ配列。