JPH0448433B2 - - Google Patents
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- JPH0448433B2 JPH0448433B2 JP63138232A JP13823288A JPH0448433B2 JP H0448433 B2 JPH0448433 B2 JP H0448433B2 JP 63138232 A JP63138232 A JP 63138232A JP 13823288 A JP13823288 A JP 13823288A JP H0448433 B2 JPH0448433 B2 JP H0448433B2
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Description
れを含む薬学的化合物に関するものである。さら
に限定的に言うと、これは変性クリングル
(kringle)領域をもつ組織プラスミノーゲン活性
化因子類似体に関するものである。 <従来の技術> 血液凝固は、場合によつてフイブリンネツトワ
ーク又は血餅を発生させる可能性のあるさまざま
な血液成分の複雑な相互作用から成るプロセスで
ある。フイブリンネツトワークの分解は、酵素前
駆体プラスミノーゲンをプラスミンに活性化させ
ることにつて達成することができる。プラスミン
というのは、フイブリンネツトワークを分解させ
るように直接作用しこうして血液凝固プロセスを
調節するようなセリンプラテアーゼである。プラ
スミンへのプラスミノーゲンの変換は通常、プラ
スミノーゲンの生理学的血管活性化因子であると
考えられているフイブリン特異的セリンプロテア
ーゼである組織型プラスミノーゲン活性化因子
(t−PA)によりイン ビボで触媒反応を受け
る。ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性
化因子(u−PA)は、セリンプロテアーゼとし
て特徴づけられるプラスミノーゲン活性化因子の
クラスのもう一つの一員である。 t−PAは通常、アミノ酸275(Arg)と276
(Ile)との間のペプチド結合の開裂により2鎖形
態に変換されるMr72000ダルトンの単一ポリペ
フチド鎖として循環する。t−PAのH鎖
(Mr40000と37000の2つの変異体)は、アミノ末
端から誘導され、一方H鎖(Mr33000)、t−PA
分子のカルボキシ末端から誘導される。この開裂
は、トリプシン又はプラスミンにより触媒作用を
受け、合成基質を用いて測定されるような活性の
増大ならびに線維素溶解活性の増大を伴う。単鎖
t−PAは、恐らくフイブリンに対する結合によ
り誘発された活性化因子内の立体配座の変化のた
め、フイブリンへの結合の時点で活性化する。2
鎖形状への開裂は、血流からのt−PAの急速な
浄化と結びつけられうるものであるが、この点に
ついて相反する報告書が発表されており
(Wallen他、Eur.J.Biochem.132:681−686、
1983)、浄化機構は、ほとんど把握されていない。 潜在的な前駆体t−PAたん白質の2次元モデ
ルが作成された(Ny他、Pro.Natl.Acad.Sci.
USA 81:5355−5359、1984)。このモデルに基
づき、H鎖が「クリングル」として知られている
2つの三重ジスルフイド構造を含んでいることが
確認された。同じようなクリングル構造は、プロ
トロンビン、プラスミノーゲンそしてウロキナー
ゼにも存在しており、フイブリンへの結合によつ
て重要なものであると考えられている(Ny他、
前記)。t−PAの第2のクリングル(K2)は、
第1のクリングル(K1)に比べフイブリンに体
する親和性が高いと考えられている。(一ノ瀬、
瀧尾及び藤川著、I.Clim.invst.78:163−169、
1986;Verheijen他著、EMBO.J.5:3525−
3530、1986)。 さらに、t−PAのH鎖は、表皮細胞増殖因子
及び同様なたん白質C中の領域、第因子、第
因子及び第因子に対する相同性をもつ三重ジス
ルフイド結合構造である「増殖因子」ドメインを
含む。増殖因子ドメイはt−PAの迅速な生体内
浄化に参加すること、そして増殖因子ドメインの
欠失は、結果として得られる分子のフイブリン結
合を妨げたり或いはプラスミノーゲンを活性化す
るというその能力を阻害したりしない、というこ
とがわかつている。 t−PAのH鎖は又は、フイブロネクチンのフ
インガードメイン(finger domains)と相同性
の「フインガー」ドメインを含んでいる。フイブ
ロネクチンは、フイブリン結合を含むさまざまな
生物活性を示す:そのフイブリン結合活性は、そ
の9つのフインガードメインのうちの4つ又は5
つに対し相関関係づけされている。 t−PAの軽鎖には、その他のセリンプロテア
ーゼの活性部位と相同性の高いセリンプロテアー
ゼの活性に対する活性部位が含まれている。 t−PAの前駆体形状はさらに、集合的に「プ
レープロ」領域と呼ばれる、1プロー領域を下流
に従えたプレー領域を含んでいる。プレー領域は
血管内皮細胞によるt−PAの分泌にとつて重要
なシグナルペプチドを含んでいる(Ny他著、前
記)。プレ配列は、細胞外分泌において必要な段
階である小胞体の内腔内へのt−PAの分泌をひ
きおこす原因であると考えられている。プロ配列
は、小胞体からゴルジ体への搬送に続いてt−
PA分子から開裂されるものと考えられている。 動物及びヒトの被験体における線維素溶解のた
めのt−PAの使用は、生来の分子のいつくかの
欠点を目立たせることになつた。イン ビボでの
t−PAの半減期は、人体において3分という短
かいものであることがわかつた。(Nilsson他著、
Scond.J.Haematol.33:49−53、1984)。注入さ
れたt−PAは、急速に肝臓により浄化され、注
入された物質のうちほとんどは30分以内に低分子
量の形に代謝される。この短かい半減期は、高い
投与量を必要とすることにより血栓溶解剤として
のt−PAの効能を制限する可能性がある。標準
的に言つて、生来のt−PAは、患者1名あたり
30〜150mgの用量で投与され、さしてたん白質は
可溶性が低いことから注入には長時間が必要であ
る。Fuchs他(Blood.65;539−544、1985)は、
注入されたt−PAがたん白質分解部位とは無関
係なプロセスで肝臓により浄化されること、そし
て注入されたt−PAが体内で蓄積しない、すな
わち浄化機構が飽和され得ないという結論を出し
た。さらに、冠状動脈血栓を溶解するのに充分な
t−PAの用量は標準的な生理学的レベルに比べ
はるかに大きく、人体全体にあたるプラスミノー
ゲンの活性化をひき起こしてフイブリノーゲンの
全身分解の原因となり(Sherry著、前記)、危険
な出血の発現を結果としてもたらす可能性があ
る。この全身的活性は、明らかに、分子の2鎖形
状の特異性が低いことによるものである。 さまざまな研究者が、臨床的安定性を高めよう
としてt−PAを改良してきた。Rosa and Rosa
(国際特許出願明細書W086/01538号)は、単鎖
形のt−PAを安定化させるため、その位置27
7のLys(リジン)を変更した。大腸菌内で生成
されたIle(イソロイシン)(277)t−PAは生
来ののt−PAに比べ単鎖分子として活性が低い
ことがわかつた。Wallen他(前記)は、このリ
シン残基が単鎖t−PAのたん白質分解活性の原
因でありうるということを仮定した。Heyneker
及びVehar(公示済英国特許出願明細書第2173804
号)は、t−PAの開裂部位のまわりのアミノ酸
置換を開示している。位置275にGlu(グルタ
ミン酸)を含む変異体t−PAは、生来のt−PA
に比べてより大きい比活性を有することがわかつ
ている。この変異体t−PAは又、t−PA阻害因
子と共により少ない複合体を形成した。この単鎖
形は、2鎖形に比べてフイブリンに対しより大き
な親和性をもつということもわかつた。
Robinson(W084/10786)は、血漿の半減期を増
大させるためのt−PAから炭水化物側鎖を除去
するのに酵素手段を用いた。Van Zonneveld他
(Proc.Natl.Acad.sci.USA.83:4670−4674、
1986)は、H鎖の部分が欠失させられたt−PA
の変更態様を開示している。Robinson他
(EP207、589Al)は、増殖因子ドメインが欠失又
はその他の形で変更されたt−PAの突然変異体
態様を開示している。しかしながら、t−PAの
これらの変形態様は、生来のたん白質に関する問
題点を充分に克服していない。 <課題を解決するための手段> 従つて、長い血漿半減期とフイブリンに対する
強い親和性とをもつプラスミノーゲン活性化たん
白質に必要性が当該技術分野においてなお存在す
る。本発明は、クリングル1ドメンインが他のた
ん白質から誘導されたクリングルドメインにより
置換されているような組織プラスミノーゲン活性
化因子の新しい誘導体を提供することによりこの
必要性を満たすものである。本明細書に記されて
いるt−PA類似体は、治療薬として用いられた
とき生来のt−PAに比べ著しい利点を提供する。
これらの利点の中には、フイブリンに対する特異
性の増大、すなわち血餅分解に対する特異性の増
大を結果としてもたらすフイブリンに対する親和
性の増大がある。特異性の増大は、生来のt−
PAにみられる全身的出血作用を軽減することが
できる。臨床上の適合性の高い新しい類似体をさ
らに提供するため、クリングル1ドメインの置換
を、t−PA内のその他の変異と組合わせること
も可能である。組換えDNA技術を使用すること
により、これらのたん白質の一貫した相同性ある
供給源を得ることができる。たん白質は、フイブ
リンマトリクスの形成を分解又は抑制する必要性
が治療上望まれるような心臓発作の犠牲者その他
の患者において存在する血餅を分解するのに用い
ることができる。 <作用> 簡単に言うと、本発明は、生来のt−PAのK1
ドメインがもう一つのクリングルドメインにより
置換され、かかるクリングルドメインがフイブリ
ンに対する類似体の結合の媒体となつているよう
な組織プラスミノーゲン活性化因子の類似体を開
示している。このクリングルは6つのシステイン
残基を含み、類似体は生来のt−PAに比べて大
きいフイブリンに対する特異性を呈する。本発明
の主な実施態様において、クリングルドメインは
t−PA K2ドメイン、プラスミノーゲンK1ドメ
イン、プラスミノーゲンK4ドメイン、プラスミ
ノーゲンK5ドメイン、第因子リングルドメ
イン、プロトロンビンK1ドメイン及びプロトロ
ンビンK2ドメインから成るグループの中から選
定されている。本発明のいくつかの態様におい
て、クリングルドメインは78〜82のアミノ酸で構
成されると考えられ、以下のアミノ酸シーケンス
を含む可能性がある:
告されている〔ペニカ(Pennica)等、ネーチヤ
ー(Nature)、第301巻、214〜221(1983)参照〕。
この配列は、32〜35個のプレ・プルペプチドに続
いて527〜530個のアミノ酸の成熟タンパク質をコ
ードしている。 成熟t−PAのためのコード配列を包含してい
るcDNAクローンを、ボウエス(Bowes)黒色
腫細胞系統からのmRNAを出発物質として用い
て造成した〔リジエツケン(Rijken)及びコレ
ン(Collen)ジエイ バイオル ケム(J.Biol.
Chem.)、第256巻、7035〜7041(1981)参照〕。次
に、このcDNAを使用して、プラスミド
pDR1296を造成した。 pDR129で形質転換した大腸菌JM83株を、ア
メリカン タイプ カルチユアー コレクシヨン
(American Type Culture Collection)に受託
番号第53347号として寄託した。 プレ・プロ配列が、cDNAクローンpDR1296
に存在しなかつたので、合成オリゴヌクレオチド
から造成し、次に、cDNAに接合した。合成t−
PAプレ・プロ配列において、Bam HT及びNco
Iのための開裂部位を、プレ・プロ配列の最初の
コドン(ATG)の5′に直接導入し、Bgl(Sau
3A、Xho)部位を、プレ・プロ配列の3′端に
保持した。天然のプレ・プロ配列には、中央付近
に適当な制限部位がないが、配列GGAGCA(ア
ミノ酸−20及び−19、Gly−Alaをコードしてい
る)をGGCGCCに変換して、アミノ酸配列を変
更せずにNar 部位を提供するたとができる。 プレ・プロ配列を造成するために、アプライド
バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製
380−A型DNA合成装置を用いて、次のオリゴヌ
クレオチドを合成した。
アニーリングし、12塩基対の重複部分を製造した
(セクシヨン1)。オリゴマーZC133及びZC134を
同様にアリーリングした(セクシヨン2)。これ
らのオリゴマーをPol 緩衝液〔ベセスダ リ
チーチ ラブズ(Bethesda Research Labs)
製〕中で混合し、65℃で5分間加熱後、4時間か
けてゆつくりと室温まで冷却してアニーリングを
行つた。DNAポリメラーゼの10単位を添加し、
2時間室温で反応を進行させた。反応混合物を、
8%オリアクリルアミド−尿素配列ゲルにより、
1000ボルトで2.5時間電気泳動して、反応生成物
のサイズを分画した。適当な大きさの断片(ポリ
メラーゼ反応が完結したもの)をゲルから切り出
し抽出した。 アニーリング後、セクシヨン1をBam H及
びNar で切断し、Bam H+Nar で切
断したpUC8中でクローニングした〔ビシラ
(Vieira)及びメツシング(Messing)、ジーン
(Gene)、第19巻、259〜268(1982);及びメツシ
ング(Messing)、メスイン エンザイモロジー
(Meth.in Enzymology)、第101巻、20〜77
(1983)参照〕。セクシヨン2を再アニーリング
し、Nar 及びBglで切断後、Bam H+
Nar で切断したpUC8中でクローニングした。
コロニーを、適当な標識を付したオリゴヌクレオ
チドでスクリーニングした。コロニーハイブリダ
イゼーシヨンにより陽性として確認されプラスミ
ドを配列して、適当な配列がクローン化されたこ
とを確認した。 次に、セクシヨン1を適当なpUCクローンの
Bam H+Nar 二重消化物から精製した。
一方、セクシヨン2は、Nar +Xho 消化
物から精製された。この2つの断片をNar 部
位で接合後、Bam H切断pU8中でクローニン
グした。 次に、pDR1296のt−PA配列を下記の方法に
より、合成プレ・プロ配裂に接合した(第2図参
照)。プラスミドpIC19R〔マーシユ(Marsh)等、
ジーン(Gene)、第32巻、481〜486(1984)〕を
Sam 及びHind で消化した。地図の位置
270(Pvu )から位置5171(Hind
)までのSV40のori領域を、線状化した
pIC19Rに連結して、プラスミドZem67を製造し
た。次に、このプラスミドをBglで開裂後、ヒ
ト成長ホルモン遺伝子(デ ノト(De Noto)
等、ヌク・アシツド レス(Nuc.Acids.Res.)、
第9巻3719〜3730(1981)〕からのターミネータ領
域をBgl −Bam HT断片として挿入して、
プラスミドZem86を製造した。合成したt−PA
プレ・プロ配列を、Bam HT及びXho での
消化により、pUC8ベクターから除去した。この
断片を、Bgl で消化したZem86に挿入して、
プラスミドZem86を製造した。プラスミド
pDR1296を、Bgl及びBam Hlで消化し、t−
PAのcDNA断片を単離後、Bgl D切断した
Zem88に挿入した。得られたプロスミドを、
「Zem94」と命名した。 次に、MT−1プロモーター、完全なt−PA
コード配列及びhGHターミネータを包含するベ
クターZem99を、下記の方法で組み立てた(第2
図参照)。MT−1プロモーターを包含するKpn
l−Bam Hl断片を、MThGH111〔パルミテル
(Palmiter)等、サイエンス(Science)、第222
巻、809〜814(1983)から単離後、pUC18に挿入
してZem93を造成した。プラスミドMThGH112
〔パルミテル(Palmi−ter)等、前記〕を、Bgl
で消化後、再連結してhGHコード配列を除
去した。次に、MT−1プロモーター及はhCHタ
ーミネータをEco R1断片として単離後、pUC13
に挿入してZem4を造成した。その後、Zem93を
Bam H及びSal で消化して線状化した。
Zem4をBg1 及びSal で消化後、hGHタ
ーミネータを精製した。次に、t−PAプレ・プ
ロ配列をBam H−Xho 断片としてpUC8
ベクターから除去した。その後、これらの3つの
DNAの断片を接合後、Zem97(第2図参照)の構
造を有するプラスミドを選択した。Zem97をBg1
で切断し、Zem94から得たXho t−PA
断片を挿入した。このようにして得られたベクタ
ーが、Zem99である。 実施例 2 プラスミノーゲンのK1ドメインをコードする
DNA配列の構成 プラスミドpK1はプラスミノーゲンK1ドメイ
ンについてのコード配列を含み、その配列は第3
図に示されている。それはpK1−1、pK1−2、
pK1−3……pK1−12と称される一連の11個のオ
リゴルヌクレチドから構成それ、その配列は第1
表に示されている。
1〜82についてのコード配列はオリゴヌクレオチ
ドPK−1〜PK−7から次の方法で構成した。オ
リゴヌクレオチドPK1−1、PK1−2、PK1−3
及びPK1−4の各々の100ピコモルをそれらの
5′未満でリン酸化した。そのリン酸化したオリゴ
ヌクレオチドをPK1−5、PK1−6及びPK1−7
の各々の100ピコモルと混合した。その混合物を
エタノールで沈澱させ、そしてその沈澱物を
H2O中に懸濁させて90℃で3分間加熱した。次
いでその溶液を室温で10分間静置したままにして
おき、次いで氷上に置いた。その冷却した混合物
に、6.6mMのMgCl2を含有する600mMのトリス
HCl(PH7.6)10μ、0.1Mのジチオトレイトール
10μ、5mMのATP10ml、及びT4DNAリガーゼ
1000単位を添加した。その混合物を14℃で15時間
培養した。エタノールを添加し、そしてその沈澱
物をTE緩衝液(10mMのトリスHCl、1mMの
EDTA、PH8.0)20μ中に再懸濁させ、次いで等
容量のアルカル緩衝液(20mMのNaCl、2mMの
EDTA、80%のホルムアミド、0.1%のキシレン
シアノール及び0.1%のブロムフエノールブルー)
を添加した。その混合物を90℃で30分間加熱し、
そして8.4Mの尿素を含有する6%のポリアクリ
ルアミドゲル上で300Vで1時間電気泳動した。
そのゲルを臭化エチジウムで染色し、また250bp
バンドをDEAE・セルロースペーパーへの電気泳
動移動によつて回収した(Dretzenほか、Anal.
Bio−chem.112:295〜298、1981)。その回収し
たDNAをTE緩衝液100μ中に溶解し、そのフ
ラグメントを“PK1−n”と称した。そのPK1−
n溶液10μを100mMのカコジル酸ナトリウム・
25mMのHEPES(PH7.6)2μ、1mMの
dCTP6.2μ、ターミナルデオキシヌクレオチジ
ルトランスフエラーゼ10単位及びHzO5μと組み
合わせることによつてPK1−nを3′未満でCテー
ルした。その反応混合物を37℃で10分間培養し、
次いでフエノール:クロロホルム(1:1)で抽
出した。 (Pharmacia社から得た)1μの3′−オリゴ
(dG)テールしたpUC9をSma で切断した。
その線形にされ、テールされたプラスミドを上記
のCテールしたPK1−nに添加した。次いでその
混合物をエタノールで沈澱させ、そしてその
DNAを2MのKCl0.5μ及びTE緩衝液9.5μ中に
再懸濁させて65℃で10分間培養し、次いで室温に
冷却した。その冷却した混合物に、0.1Mの
MgCl2及び0.1Mのジチオトレイトールを含有す
る0.1MのトリスHCl(PH7.5)5μ、2.5mMの
dNTPs20μ、5mMのATP10μ、H2O53μ、
DNAポリメラーゼ(クレノウフラグメント)
5単位及びT4 DNAリガーゼ300単位を添加した
(最終容量は100μ)。その混合物を14℃で12時
間培養し、次いでE.コリ(E.coli)JM83をトラ
ンスフエクシヨンするために用いた。 そのトランスフエクシヨンしたJM83細胞を、
Wallaceなどの方法(Nnc.Acids Res.9:879〜
894、1981)を用いてPK1−6でプローブした。
20種の陽性のクローンを順番に配列し、そして塩
基対1〜170を包含する#1−3、及び塩基対68
〜186を包含する#8−5(第4図参照1)の2種
を選んだ。 第5図に関連して、クローン#1−3をEco
R及びFok で消化し、そしてKpn の部
位を含有する130bpフラグメントを回収した。同
様にして、クローン#8−5をFok 及び
Hind で消化し、そして90bpフラグメント回
収した。その2種のフラグメントを、Eco R、
Hind で消化したpUC12に結合させ、その生
成プラスミドを“pPK−A”と称した。従つて
このプラスミドはプラスミノーゲンK1配列のヌ
クレオチド1〜182に相当するDNA配列を含む。 K1配列の残りの部分を、オリゴヌクレオチド
PK1−9、PK1−10、PK1−11及びPK1−12を用
いて構成した。そのオリゴヌクレオチドの各々の
1pmoleをその5′未満でリン酸化し、そしてその
一緒にしたオリゴを、Bam HI 、Sph で消
化したM13tg130RF(Amersham社から得た)
40ngと混合した。この混合物に、6.6mMの
MgC12を含有する600mMのトリスHCl(PH7.6)
4μ、及びH2O22μを添加した。その溶液を90
℃で3分間加熱し、そして1時間にわたつて室温
に冷却するままにしておいた。0.1Mのジオチト
レイトール4μ、5mMのATP 4μ、及び
T4DNAリガーゼ300単位を添加し、そしてその
混合物を14℃で12時間培養した。“M13PKB
RF”(第6図)と称されるその生成フアージクロ
ーンはK1配列のヌクレオチド183〜250を含んで
いた。 完全なK1コード配列のアツセンブリーは第6
図に例示されている。プラスミドpPKAをM1u
及びSau 3Aで消化し、そして176bpフラグ
メントを回収した。M13PKB RFをSau 3AI及
びEco Rで消化し、そして88bpフラグメント
を回収した。これらのフラグメントを、、Mlu
、Eco Rlで消化したM13um20RF(IBI社から
得た)に結合させ、その生成プラスミドを
“M13um20−PK”と称した。 次いでそのPK1コード配列を、t−PAクリン
グル1配列の代わりとしてt−PA cDNA中に挿
入した(第7図及び8図)。Mlu 部位及び
Eco RV部位を挿入するように最初にt−PA配
列に突然変異を誘発させた。プラスミド
pDR1496をSph 及びXba で消化し、そし
てα因子及びt−PA配列を含む2.1kbフラグメン
トを単離した。(pDR1496で形質転換されたS.セ
レビシアエ(S.cerevi−siae)菌株E8−11cは
Amrican Type Culture Collectionに受理番号
20728として寄託されている。)このフラグメント
を、Sph 、Xba で消化したM13tg130
(RF)に結合させ、その生成フアージを
“M13tg130−W”と称した。次いで一重鎖フアー
ジDNAをオリゴヌクレオチド(5′GCA CGT
GGC ACG CGT ATC TAT TTC3′)にアニ
ーリングし、突然変異の誘発を標準の方法に従つ
て実施した。その突然変異の誘発されたフアージ
を“M13tg130−PKA1”と称した。M13tg130−
PKAの一重鎖DNAを単離し、配列5′CTC AGA
GCA TTC CAG GAT ATC GCA、GAA
CTC3′を持つオルゴヌクレオチドで突然変異を誘
発させた。一重鎖DNAを突然変異の誘発された
フアージから調整し、そして配列させた。クリン
グ1コード配列の5′末端にM1u 部位を含み且
つ3′末端にEco RV部位を含むクローンを選び、
“M13tg130−PKA2”と称した(第7図)。 複製型分子DNAをM13tg130−PKA2から調整
し、Bg1 及びAPa で消化した。Mlu
部位及びEco RV部位を含むそのフラグメントを
回収し、そして、第7図に示されているように、
Ba1 、Apa で消化されたZem99に結合さ
せた。その生成プラスミドを“Zem99−2020”と
称した。 次いでそのPK1配列をt−PA cDNA中に挿入
した。M13um20−PK1をMlu 及びEco RV
で消化し、そして336bpフラグメントを回収し
た。このフラグメントを、Mlu 、Eco RVで
消化したZem99−2020に結合させてZem99−8000
を構成した(第8図)。Zem99−8000の突然変異
体t−PAコード配列及びコードしたアミノ酸配
列を第9図に示す。Zem99−8000で形質転換した
E.コリは通商産業省、工業技術院、醗酵研究所
(FRI)に受理番号FERM P−9272として寄託さ
れている。 プラスミドZem99−8000及びpSV2−dhfr
(Subra−maniほか、同書)を用いて、Loyterの
方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79:422、
1982)によつてtk−BHK細胞を共にトランスフ
エクシヨンした。トランスフエクタントを限界希
釈法によつてクローニングした。“#8000”と称
される突然変異体t−PA蛋白質を、抗体含有カ
ラムでアフイニテイー精製して固有のt−PAと
した。 実施例 3 #8100の調整 位置96でAsnをコードする第二のプラスミノ
ーゲンK1配列を構成した(第8図)。Zem99−
8000をBam Hで消化し、そしてBg 部
位を含むフラグメントを回収した。このフラグメ
ントをBam H−カツトM13mp18に結合させ
てM13−8000Rを構成した。オリゴヌクレオチド
プライマー(配列5′TTT TTA CCA TTA
CCG GTC TT3′)を一重鎖M13−8000Rにアニ
ーリングし、そして突然変異の誘発を通常の手順
に従つて実施した。クローンを選別して配列し、
そして“M13−8000RRF”と称される二重鎖
DNAを正のクローンから調整した。このフアー
ジをBg1 及びApa で消化し、そしてt−
PAフリグメントを単離してBag1 、Apa
−カツトZem99に結合させた。その生成プラスミ
ドを“Zem99−8100”と称した。Zem99−8100中
に存在するt−PAコード配列及びそのコードさ
れたアミノ酸配列は第10図に示されている。
Zem99−8100で形質転換されたE.コリRR1はFR
6に受理番号FERMp−9315として寄託されて
いる。 その8100突然変異体蛋白質を発現させるため
に、Zem99−8100及びpSV2−dhfrを用いて、
Loyterの方法(前記)によつてtk−BHK細胞を
共トランスフエクシヨンした。形質転換細胞を限
界希釈法によりクローニングした。その蛋白質を
上記したようにアフイニテイー精製した。 実施例 4 プラスミンによる切断に耐性のt−PA類似体
中のK1ドメインの置換 A: 突然変異誘発 切断部位の部位特異的突然変異誘発のため
に、bp802〜bp1274のp−PA配列を含む472bp
Eco RフラグメントをZem99から単離し、
そしてM13mp18(複製型分子)のEco R部
位中にクローンを発生させた。その組換え体フ
アージをE.コリ(JM101)中にトランスフエク
シヨンし、そしてアンチセンスストランド
DNAを単離した。 次いで部位特異的突然変異誘発を、第2表に
示されている突然変異誘発プライマーの1種及
び第二プライマーとしてZC87(5′TCC CAG
TCA CGA CGT3′)を用いて一重鎖アンチセ
ンス鋳型DNAで実施した。オリゴヌクレオチ
ドZC487、488、489、及び620は位置274におい
てPheをそれぞれGlu、Gly、Arg又はProに変
化させる。オリゴヌクレオチドZC797、874、
1013及び1027は位置275においてArgをそれぞ
れGly、Leu、Pro又はAspに変化させる。オリ
ゴヌクレチド621は位置277においてLeuをLys
の代わりに導入する。オリゴヌクレオチド928
は位置276においてleをProに変化させる。前
もつてLys(277)がLeuに転換されている突然
変異体においてはオリゴヌクレオチド875は
Arg(275)はLeuに変化させ、オルゴヌクレオ
チド927はPhe(274)をProに変化させる。従つ
て、オリゴヌクレオチド875及び927は二重突然
変異を発生させるのに用いることができる。リ
ン酸化した突然変異誘発プライマー20pmole及
び第二プライマー20pmoleを、10μの20mM
のトリス(PH7.5)、10mMのMgCl2、50mMの
NaCl、1mMのDTT中の一重鎖鋳型1pmoleと
一緒にし、そして65℃で10分間、次いで室温で
5分間培養し、そして氷の上に置いた。20mM
のトリス(PH7.5)、10mMのMgCl2、2mMの
ATP、1mMのdNTPsを含有する10mMの
DTTの量10μ、クレノウポリメラーゼ2.5単
位、DNAリガーゼ3.5単位をそのがアニーリン
グしたDNAに添加し、そしてその混合物わ15
℃で3時間培養した。次いでそのDNAをコン
ピテントE.コリJM101中にトランスフエクシヨ
ンし、そしてその細胞をYT寒天培養基上に薄
くかぶせて37℃で培養した。次いでそのDNA
をニトロセルロースに移動させて、そして突然
変異誘発プライマーのTm−4℃で1時間、6
×SSC、10×デンハードツ(Denhard′s)中で
予備ハイブリツド形成し、そして同じ溶液中で
Tm−4℃で32p標識した突然変異誘発プライ
マーにハイブリツド形成した。Tm−4℃で3
回洗浄した後、フイルターを一晩X線フイルム
に露出した。追加の洗浄工程を5℃で実施し
て、突然変異体プラークを同定するのに必要な
ようにより高い増加を得た。その突然変異を起
こした挿入物をジデオキシ法によつて配列決定
した。
クター構成した(第11図)。プラスミド
Zem86(実施例1で記載したもの)をHindで
消化し、そしてその末端を、DNAポリマラー
ゼ(クレノウフラグメント)を用いてふさい
だ。次いでその線形にされたDNA Eco R
で消化し;そしてSV40 ori配列を含む350bpフ
ラグメントをゲル精製し、そしてSma +
Eco Rで消化したpUC13に結合させた。そ
の生成ベクターは“pDR3001”と称した。プ
ラスミドpDR3001をSal 及びEco Rで消
化し;そしてSV40 ori及びポリリンカー配列
を含む-350bpフラグメントをゲル精製した。
Zem86をEco Rで部分的に消化し、そして
Xho で完全に消化してSV40ori配列を除去
した。次いでそのpDR3001からのSV40フラグ
メントを線形にしたZem86に結合させた。その
生成プラスミドを“pDR3002”と命名した
(第11図)。 Zem94中のt−PA配列のATG出発コドンの
直ぐ上流側の配列を部位特異的突然変異誘発に
よつて変性して、Hind 部位及びBam H
部位をATGに隣接させた。その生成ヌクレ
オチド配列は−3位置にアデニンを含んでい
る。ポリリンカー、pre−pro及び熟成t−PA
配列の一部分を含むZem94からの-800bpHind
−Eco RフラグメントをM13mp19中に
導入することによつて一重鎖M13鋳型DNAを
調製した。部位特異的突然変異誘発を、突然変
異誘発プライマーとしてオリゴヌクレオチド
ZC444(5′CAT CCA TGG TGG ATC CAA
GCT TGG C3′)を用いて、Zollerほかによつ
て説明されたようにして実質的に実施した
(Manual for Advanced Techniques in
Molecular Cloning Course、Cold Spring
Harbor Laboratory 1983)。第二のプライマ
ーとしてオリゴヌクレオチドZC87(5′TCC
CAG TCA CGA CGT3′)を用いた。その突
然変異を起こした挿入物をジデオキシ法よつて
配列決定し、そしてポリリンカー配列が除かれ
ており且つpre−pro配列の5′末端でのBam HI
部位が復位しているクローンを選択した。この
フアージクローンをBam H及びEco Rで
消化し、そして5′t−PA配列を単離した。
Zem99をEco Rで消化し、そしてt−PA配
列の3′部分及びhGHターミネータを含むフラグ
メントを単離した。次いでその2種のフラグメ
ントを、 Bam H+Eco Rで消化したpIC19H
(Marshほか、Gene32:481〜486、1984)に、
3部分連鎖反応で結合させた。適当な配向でt
−PAフラグメントを含むプラスミドを選択し、
“Zem182”と称した。プラスミドZem182を
Eco Rで部分的に消化し、その末端を、
DNAポリメラーゼ1(クレノウフラグメント)
を用いてふさいだ。その線形にしたプラスミド
をゲル精製し、そしてT4DNAリガーゼを用い
て再環状化した。hGHターミネータの3′末端の
EcoR部位が破壊されているプラスミドを選
択し、“Zem182b”と称した(第12図)。 複製型分子(RF)DNAを、実施例4で記載
した突然変異を起こしたフアージから調製し、
その変性されたt−PA配列をEco Rフラグ
メントとして精製した。プラスミドZem182b
をEco Rで消化し、t−PAコード配列の
5′及び3′部分を含むベクター配列を子牛のアル
カリ性腸ホスフアターゼで処理し、そしてその
修飾したt−PA配列を挿入した。その生成プ
ラスミドをBam H及びXba で消化し、
そしてそのt−PAフラグメントをBam H
+Xba −カツトpDR3002中に挿入した。
その生成ベクターを”pMH7”〜”pMH20”
と称する(第3表及び第11図)。
突然変異を、実施例3で開示した8100突然変異
と組み合わせて、クロツトの結合及び溶解の実
質的に増加した特異性を持つt−PA類似体を
製造した。これらの類似体のためのコード配列
を含むベクターを、3つの部分の連鎖反応で、
Ban H、Xba で消化したZem219bから
のベクターフラグメント、Zem99−8100からの
Ban H−APA クリングルフラグムメン
ト、及び適切なpMHベクターからのApa
−Xqa 活性化部位フラグメントを組み合わ
せることによつて構成する。その生成プラスミ
ドを用いて、エレクトロポレーシヨンによつて
tk−BHK細胞をトランスフエクシヨンした。
選択及び拡大の後に、その突然変異体蛋白質を
精製し、特徴づけする。 実施例 5 K1及びフインガードメイン中に置換体を持つ
t−PA類似体。 t−PAフインガードメインを共働フインガー
領域で置き換えると、Arg−27及びLys−49での
潜在的蛋白質分解切断が排除されることになる。
フイブロネクチン及びt−PAのフインガーメイ
ンの分析に基ずいて8個のフインガー置換配列を
構成した。これらの“コンセンサス”フインガー
ドメインのアミノ酸配列は第19図及び第4表に
示されている。 コンセンサスフインガー配列を下記のようにし
てオリゴヌクレオチドから構成し、次いでt−
PAコード配列中に挿入した。この挿入を容易に
するために、Kpn 部位を、野生型フインガー
ドメインをコードする領域の下流側3′に導入し
た。その生成配列をBg1 及びKpn で消化
すると、フインガードメインが除かれることにな
つた。 A フインガードメインと増殖因子ドメインとの
間へのKpn 部位の挿入 t−PA中のフインガードメインの後にKpn
部位を配置するために、オリゴヌクレオチ
ドZC986(5′TTT GAT AGG TAC CGA
GAG GCA3′)を用いて突然変異誘発を実施し
た。生来のt−PAcDNAの5′Bam H−Eco
Rフラグメントを含むフアージM13クローン
をDNAを調製した。DNA溶液100μを用い
て、0.1μg/mlのウリジンで補われているYT
媒体 100μ中のE.コリRZ1032を感染させた。
この培養物を37℃で、激しく振りながら一晩培
養した。RZ1032中でのM13の成長で、ウリジ
ン含有フアージが製造され、それはJM101中で
はなくてRZ1032中で生活力がある。 その細胞を高速回転処理し、そしてフアージ
上澄み液を用いて、E.コリRZ1032を再度感染
させた。この第二の接種は、ウラシルを含有し
ないJM101誘導フアージのいずれかを希釈する
ために実施した。再度、その細胞を高速回転処
理し、そしてフアージをJM101及びRZ1032の
上に薄くかぶせた。RZ1032板では通常の生活
力が観察され(109pfu/mlのフアージを示し
た)が、JM101細胞ではプラークが観察されな
かつた。次いで、突然変異誘発オリゴヌクレオ
チドで感作した相補的ストランドを生体外で作
つた。突然変異を含む新しいスノランドはチミ
ジンを含んでおり、それゆえにJM101中で生活
力があり:野生型鋳型は生活力がなかつた。 フアージ上澄み液のPEG沈澱処理、それに
続くフエノール・クロロホルム抽出処理及びエ
タノール沈澱処理によつて鋳型DNAを調製し
た。この鋳型DNA1μgを、10μgのオルゴヌ
クレチオチドZC986を用いて、簡単に沸騰さ
せ、65℃で5分間培養し、次いでその温度を
徐々に4℃に下げ、その後0.2MのHEPES(PH
7.8)10μ、100mMのDTT2μ、1Mの
MgC12 1μ、2.5mMの各dNTP20μ、
10mMのATP 10μ、2.5U/μのクレノウ
1μ、及び1U/μのT4DNAリガーゼ2μ
を添加し、最終容量をH2Oで100μに調節し
てハイブリツド形成した。37℃で2時間のイク
ステンシヨンの後にDNAをコンピテント
JM101細胞中にトランスフエクシヨンした。汚
染RAN種又はDAN種に感作することによつて
イクステンシヨンによつてもはたらされたバツ
クグランドの量を比較するために、対照イクス
テンシヨン(マイナスのオリゴヌクレオチド)
を実施した。そのトランスフエクシヨンは突然
変異誘発されなかつた鋳型についてゼロのプラ
ークもたらし、対照イクステンシヨン(マイナ
スのオリゴヌクレオチド)では150であり、そ
して突然変異誘発された鋳型については300で
あつた。 32pで標識した突然変異誘発オリゴヌクレオ
チドでプラークリフトをハイブリツド形成し、
そして3MのTMSC1(Woodほか、Proc.Natl.
AcadSci.USA 82:1585〜1588)中でTm−5
℃で30分間洗浄することによつて、そしてまた
ランダムに取り出したプラークを順番に配列す
ることによつてプレートを選別した。1種の陽
性のクローンを得た。 B フインガー置換ドメインの製造 第4表及び第19表に示されているコンセンサ
スフインガー領域の置換体を構成した。
リゴスクレオチドから生成した。オリゴヌクレ
オチド(第5表)は、Applie Biosystemsの
Model 380A DNA合成機を用いて製造した。
まず、12個のオリゴヌクレオチドをキナーゼ処
理し、そして同時に、37℃で30分間ポリツクレ
オチドキナーゼと共にそれぞれをインキユベー
トすることによつて、γ−32P ATPにより低
比活性にラベルした。次に、指摘されている8
種の組合せ(ABC、DEF、ABF、AEC、
AFF、DEC及びDBC)を、適切なオリゴヌク
レオチドを混合し、DNAリガーゼを添加し、
そして37℃で1時間インキユベートすることに
よつて生成した。この反応の生成物を、6%ポ
リアクリルアミド−8M尿素配列決定ゲル上で
分類した。完全な長さのフインガードメインを
コードするDNAに対応するバンドを切断し、
そしてそのDNAを2.5Mの酢酸アンモニウム中
に溶出した。そのDNAをエタノール沈澱せし
め、そして水に再懸濁し、1ピコモル/μの
濃度にした。 RF DNAを、実施例5Aに記載された陽性ク
ローンから調製し、そしてBam H〜Eco R
のt−PAフラグメントを精製した。プラス
ミドZem219の(下記の実施例5Dに記載されて
いる)をXba により消化し、そして次に
Eco Rにより一部消化した。3′側のt−PA
コード領域を含む1010bpフラグメントを精製
した。プラスミドZem219b(下記の実施例5Dに
記載されている)を、Bam H及びXba
により消化し、そして5′側のt−PAフラグメ
ント(Bam H〜Eco R)及び1010bpの
Eco R〜Xba フラグメントに連結した。 “Zem238”と称するその得られたベクター
は、フインカードメインの後にkpn 部位を
含む。Zem238をBa 及びKpn により
消化し、野生型フインガードメインを除くため
にゲル精製し、そして8種のコンセンサス配列
のそれぞれに連結し、発現ベクター238−
Fcon1〜238−Fcon8を形成した。 C コンセンサスフインガードメインと共に置換
されたK1ドメインを有するt−PA類似体 一本鎖 M13−8100DNAを、オリゴヌクレ
オチドZC986(実施例5A)による突然変異誘発
のための鋳型として使用し、上記のようにし
て、フインガー領域の3′末端でKpn 部位を
挿入する。正しいクローン(M13−8100−K)
を、配列決定することによつて同定し、そして
RF DNAをKpn 及びXba により消化
し、突然変異体K1フラグメントを単離する。
次に、その突然変異体K1フラグメントを、
Kpn 及びXba により消化されたプラス
ミド238−Fcon1〜238−Fcon8中に挿入する。
得られたプラスミド8100−F1〜8100−F8を、
エレクトロポレーシヨンによりtk−BHK細胞
中にトランスフエクトする。その突然変異体タ
ンパク質を精製し、そして特徴づける。 D Zem2196bの構成 プラスミドpSV2−DHFR(Subramaniなど、
前記)をCfo により消化し、そしてDHFR
のcDNA及び3′側に結合されたSV40配列を含
むフラグメントを単離し、修復し、そこで
Bam Hリンカーに連結した。Bam Hに
よる消化の後、完全なcDNA及びSV40のター
ミネータ領域を含む約800bpのフラグメントを
精製し、そしてBam Hにより消化された
pUC8に連結した。Zem67(例1)をBg1 に
より消化し、そしてBam H DHFR−
SV40フラグメントを連結し、プラスミド
Zem176を得た。プラスミドZcm93をSst 1に
より消化し、再連結し、プラスミドZem106を
得、ここでMT−1プロモーターの5′側の約
600bpの配列が除去された。プラスミド
Zem106をEco Rにより消化し、そしてプラ
スミドZem176からのDHFR遺伝子を含むEco
Rフラグメントに連結した。その得られたプ
ラスミドを“Zts13”と命名した。プラスミド
Zts13をBam Hにより消化、そして完全な
t−PAコード領域及びhGHターミネーター配
列を含むプラスミドZem99からのBam Hフ
ラグメントに連結した。その得られたプラスミ
ドを“Zts15”と命名した。Zts15をBamHに
より一部消化し、修復し、再連結し、そして形
質転換し、プラスミドZem219を得、ここで
3′側のBam H部位は破壊された。プラスミ
ドZem219をxba により一部消化、修復し、
再連結し、そして形質転換し、プラスミド
Zem219a得、ここで3′側のXba 部位は破壊
された。プラスミドZem219aをBam H及び
Xbaにより消化し、そのベクター配列をt−
PAのcDNA配列から精製し、そしてオリゴマ
ーBam H−Xba アダプターに連結し、
発現ベクターZem219b(第13)を得、この中に
突然変異体Bam H−Xba t−PA配
列を挿入した。 実施例 6 置換されたK1ドメインを有し、そして増殖因
子ドメインを欠くt−PA相同体 増殖因子ドメインをコードする配列を欠く突然
変異配列を、オリゴヌクレオチドZC820(5′GTA
GCA CGT GGC CCT GGT TTT AGG CAC
TGA GTG3′)及び一本鎖フアージの鋳型M13−
8100を用いて欠失突然変異誘発により構成する。
正しいクローンを配列決定することにより同定
し、そして“M13−8100−820”と命名する。
M13−8100−820のRFDNAをBam H及び
Xba により消化し、そして二重に突然変異誘
発されたDNAフラグメントを単離する。
Zem219bを、Bam H及びXba により消化
し、そして大(ベクター)フラグメントを単離
し、そしてT4DNAリガーゼにより突然変異フラ
グメントに連結する。形質転換の後、正しいクロ
ーンを同定し(8100−820)、そしてエレクトロポ
レーシヨンによりtk−BHK細胞中にトランスフ
エクトする。その突然変異タンパク質を精製し、
そして特徴づける。 実施例 7 置換されたK1ドメイン及び変性された増殖因
子ドメインを有するt−PA相同体 A Cys(83)の置換 Zem99中のt−PAコード配列を突然変異誘
発し、位置83(アミノ酸の数字は第1図に示さ
れている配列を言及する)でセリンをコードせ
しめた。Zem99をBam Hにより消化し、そ
してt−PAコード配列及びhGHターミネータ
ーを含む2.4Kbのフラグメントを単離した。こ
のフラグメントを、Bam Hにより消化され
たM13mp18(Pharmacia Japan Cob.から得ら
れた)に連結し、そしてその得られた組換えフ
アージを用いて、E.コリJM103をトランスフエ
クトせしめた。所望の挿入体を有するフアージ
クローンを“M13mp18/Bam−Zem99”と命
名した。 部位特異突然変異誘発のために、オリゴヌク
レオチド(配列5′CT GGT ATC GAT TTC
ACA GCT CTT CCC AGC A3′)を合成し、
そして突然変異誘発プライマーとして使用し
た。そのオリゴヌクレオチドをアニールし、
M13mp18/Bam−Zem99を一本鎖にした。突
然変異誘発を、標準方法に従つて行ない、そし
て一本鎖のDNAを配列決することにより単離
した。“M13−9100RF”と命名された、突然変
異誘発されたフアージの複製型分子を、Bgl
及びHind により消化した。t−PA配列
を含む2.3Kbのフラグメントを回収し、そして
Bgl 及び Hind により消化された
Zem99に連結し(第14図)、そしてそのDNA
を用いてE.コリTB1を形質転換せしめた。所
望する配列変化を有するプラスミドを回収し、
そして“Zem99−9100”と命名した(第14
図)。Zem99−9100の突然変異化されたt−PA
配列及びコードされたアミノ酸配列は、第15
図に示される。 プラスミドZem99−9100及びpsV2−dhfrを
用いて、Loyterなど(前記)の方法によりtk
−BHK細胞をトランスフエクトせしめた。形
質転換体を、限界希釈法によりクローニングに
ゆだねた。“9100”と命名された突然変異体タ
ンパク質を、アフイニテイー精製により細胞培
養培地から精製した。 プラスミドDem99−9100を含むE.コリTB1
形質転換体は、Fermentation Research
Institute、Agency of Industrial Science
and Technology、Ministry of International
Trade and Industry、Japan(FRI)により寄
託され、、そして取得番号FERM−9269が得ら
れた。B Cys(84)の置換 t−PAのDNAの配列が、オリゴヌクレオチ
ド5′CCT GGT ATC GAT TTC ACT GCA
CTT CCC3′を用いて部位特異的突然変異誘発
によりアミノ酸84でセリンをコードせしめるた
めに突然変異誘発された。そのオリゴヌクレオ
チドをM13mp18/Bam−Zem99にアニール
し、そして突然変異誘発を標準方法を用いて行
なつた。一本鎖の突然変異誘発されたフアージ
を配列決定し、そして所望する配列変化を有す
るクローンを選択した。複製型分子のDNAを
調製し(“M13−9200RF”と命名された)、そ
してBgl 及びHindにより消化した。
2.3Kbのt−PAフラグメントを単離し、そし
てBag +Hindにより切断されたZem99
に連結した。その得られたベクターを“Zem99
−9200”(第14図)と命名した。Zem99−
9200の変性されたt−PAコード配列及びコー
ドされたアミノ酸配列は、第16図に示され
る。 Zem99−9200及びpSV2−dhfrを用いて、
Loyter(前記)の方法によりtk−BHKを同時
トランスフエクトせしめた。形質転換体を限界
希釈法によりクローニングにゆだねた。突然変
異体タンパク質(9200)をアフイニテイー精製
により精製した。 プラスミドZem99−9200を含むE.コリRR1形
質転換体は、取得番号FERM P−9274として
FR1に寄託されている。 C Cys置換及びK1置換の組合せ 一本鎖DNAをM13−9200から単離し、そし
てオリゴヌクレオチド5′GCA CGT GGT
ACG CGT ATC TAT TTC3′を用いてMlu
部位に導入するために突然変異を誘発せし
めた。その突然変異誘発されたフアージを
“M13−92・05PKA1”と命名した。RF DNA
を突然変異体フアージから調製し、そしてBg1
及びMlu により消化し、そして264bp
のフラグメントを回収した。Zem99−8000を
Mlu 及びApa により消化し、そして
1126bpのフラグメントを回収した。これらの
2種のフラグメントを、Bg1 及びApa
により消化されたZem99に連結し、そしてその
得られたプラスミドを“Zem99−9280”と命名
した。このプラスミドは、アミノ酸84でSerを
有する突然変異体t−PA及び位置96でAspを
有するプラスミノーゲンのK1ドメンインをコ
ードする。 アミノ酸84でSerを有するt−PA相同体及
び位置96でAsnを有するプラスミノーゲンの
K1ドメインをコードする突然変異体t−P配
列を含む第二ベクターを構成した。M13−92・
05PKA1からのRF DNAをBg1 及びMlu
により消化し、そして264bpのフラグメント
を回収した。Zem99−8100をMlu 及びAPa
により消化し、そして1126bpのフラグメ
ントを回収した。これらの2種のフラグメント
を、Bgl 及びApa により消化された
Zem99に連結し、そしてその得られたプラスミ
ド“Zem99−9281”と命名した。 実施例 8 t−PA相同体における炭水化物結合部位の変
性 オリゴヌクレオチドプライマー(5′ACG GTA
GGC TGT CCC ATT GCT AAA GTA
GCA3′)が、Gly(183)及びSer(186)をSer及び
Thrによりそれぞれ置換するために調製した。部
位特異的突然変異誘発を、標準方法に従つて鋳型
M13mp18/Bam−Zem99(例7)に対して行な
つた。一本鎖の突然変異化されたフアージDNA
を調製し、そして配列決定した。所望する配列変
化を有するクローンを、“M13−6000”と命名し
た。 M13−6000のRF DNAを単離し、BgI 及
びApa により消化し、そして約1.4Kbのフラ
グメントを単離した。このフラグメントを、Bgl
及びApa により消化されたZem99に連結
し、ベクターZem99−6000を生成した。Zem99−
6000により形質転換されたE.コリRR1を、取得番
号FERM P−9126としてFermentation
Reserch Instituteに寄託した。 一本鎖M13−6000のDNAを突然変異誘発し、
突然変異体t−PA配列中にEco RV部位を挿入
した。突然変異誘発を、オリゴヌクレオチド
5′CTC AGA CCA TTC CAG GAT ATC
GCA GAA CTC3′を用いてワン−プライマー
(one−primer)法により行なつた。突然変異誘
発されたフアージを“M13−6000 PKA2”と命
名した。M13−6000PKA2のRF DNAをEco
RV及びApa により消化し、そして890bpの
フラグメントを回収した。Zem99−8000をBg1
及びEco RVにより消化し、そして500bpのフラ
グメントを回収した。これらの2種類のフラグメ
ントを、Ba1 及びApa により消化された
Zem99に連結し、そしてその得られたプラスミド
を“Zem99−8060”と命名した。 実施例 9 タンパク質の特徴比 突然変異タンパク質#8000を、血漿の半減期
について試験し、そしてその結果は、生来のt
−PA(組換えBHK細胞中に産生された)の対
照サンプルと比較した。試験されるべくタンパ
ク質を、食塩溶液中に溶解した。その溶液を、
Kg体重当り0.4mgの投与量で雄のSprague−
Dawleyラツト(それぞれ230g〜270g)の大
腿部静脈中に注身した。血液サンプル(0.5ml)
を頚静脈から採取し、3.8%クエン酸により調
節し、遠心分離にかけ、そして血漿を除去し
た。t−PAタンパク質の血漿レベルを、サン
ドイツチタイプの酸素イムノアツセイにより決
定した。第17図は、生来のt−PA及びタン
パク質#8000のための血液レベル曲線のグラフ
を示す。 血液レベル中の変化を、二室モデル(two−
compartment model(Shargel、L、及びYu、
A.B.C.、eds.、Applied Biopharmaceutics
and Pharmackinetics、Appleton−Century−
Crofts、N.Y.、1980、38〜48ページ)により
分析した。半減期を、α及びβ相のクリアラン
スのために決定し、そして縦座標(B)及び曲
線(AUC)下の領域とβ相との外挿されるバ
ツク片片(back intercept)をまた決定した。
種々のタンパク質のために得られた値は、第6
表に示れる。
換えt−PAを用いて血餅溶解活性のために試験
された。長さ3cmの絹糸を、Atom製静脈カテー
テル(4Fr3.5cm)中に導入し、そしてそのカテー
テルを注射器に連結した。クエン酸化されたヒト
血液を血液と3.8%クエン酸塩溶液とを9:1の
比で混合することによつて調製した。そのクエン
酸化された血液(0.5ml)を、125−フイブリノー
ゲン(生理食塩水50ml中、25μCi)、0.25Mの
CaCl2溶液50μ及びトロンビン(溶液1μ当り
5U)と共に混合した。その得られた溶液16μ
を、カテーテル中に注入し、そしてそのカテーテ
ル室温で60分間放置した。次に、絹糸をそのカテ
ーテルから取り出し、そして生理食塩水により洗
浄した。その糸に結合された放射能(初期フイブ
リン血栓値)を決定した。次に、この糸を、200
〜300gの体重の雌Sprague−Dawleyラツトの頚
動脈の動静脈シヤント中に導入した。ml当り50単
位のヘパリンを含む生理的食塩水中、タンパク質
のサンプル1mlを、前記動物の大腿部静脈に注射
した。2時間後、絹糸をシヤントから取り出し、
そしてその放射能(残留するフイブリン血栓値)
を決定した。その残留する血栓の比率は、次の式
により決定される: 残留血栓の比率=残留フイブリン血栓値/初期フイブリ
ン血栓値×100 第18図は、生来のt−PA及び相同体#8000
の種々の投与量を用いて得られた結果のグラフで
ある。そのデータは、突然変異体タンパク質が、
イン、ビボで血餅を溶解する能力において生来の
t−PAよりも卓越することを指摘する。 前述の発明は、明確に溶解するために例示的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請
求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができ
る。
ら作られたプレ−プロt−PAコード配列、なら
びにコードされたたん白質のアミノ酸配列を示し
ている。ラインの上の番号はヌクレオチドの位置
を表わし、ラインの下の番号はアミノ酸の位置を
表わしている。第2図は、ベクトルZem99の構造
を図示している。第3図は、プラスミノーゲンの
K1ドメインのDNA配列及びアミノ酸配列を示
す。第4図は、プラスミノーゲンK1ドメインの
部分をコードするクローン#1−3及び#8−5
の部分的制限地図を示している。第5図は、プラ
スミドpPKAの構造を示す。第6図は、プラスミ
ノーゲンK1コード配列を含むベクトルの構成を
示す。第7図は、プラスミドZem99−2020の構造
を示す。第8図は、プラスミドZem99−8000及び
Zem99−8100の構造を示す。第9図及び第10図
は、代表的なt−P4類似体のアミノ酸配列及び
cDNA配列を示す。第11図は、変えられた開裂
部位でt−PA類似体をコードする突然変異体
DNA配列を含むpMRシリーズのプラスミドの構
造を示す。第12図は、プラスミドZem1826の構
造を示す。第13図は、プラスミド219bの構造
を示す。第14図は、プラスミドZem99−9100及
びZem99−9200の構造を示す。第15図は、コー
ドされたt−PA類似体のアミノ酸配列と共に、
プラスミドZem99−9100内の変異されたT−PA
配列を示している。番号はアミノ酸の位置を表わ
す。第16図は、コードされたt−PA類似体の
アミノ酸配列と共に、Zem99−9200内の突然変異
体DNA配列のヌクレオチド配列を示す。番号は、
アミノ酸の位置を表わす。第17図は、ラツトに
投与された生来のt−PAと代表的t−PA類似体
についての血漿レベルと時間の関係を示してい
る。(‐‐‐)は生来のt−PAを(‐‐‐)は類似体
8000を示す。第18図は、生来のt−PAと本発
明に従つた代表的なt−PA類似体の血餅溶解分
析の結果を示している。(‐‐‐)は生来のt−PA
を(‐‐‐)は類似体#8000を表わす。第19図−
Iは、コンセンサスフインガードメインと生来の
t−PAのフインガードメインのアミノ酸配列を
示す。第20図は、ウロキナーゼ(U)、生来の
t−PA(tPA)、プラスミノーゲン(PL)、第X
因子(FX)及びプロトロンビン(PT)のク
リングルドメイン中の相同体を示している。(−)
は配列アラインメントを最大限にするため挿入さ
れる間隙を表わす。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 生来の組織プラスミノーゲン活性化因子(t
−PA)のK1ドメインがプラスミノーゲンのK1
ドメインにより置換されているt−PA類似体。 2 前記プラスミノーゲンK1ドメインが下記の
アミノ酸配列: 【表】 【表】 [式中、XはAsp又はAsnである〕を含んで成る
請求項1記載のt−PA体。 3 XがAspである請求項2記載のt−PA類似
体。 4 XがAsnである請求項2記載のt−PA類似
体。 5 請求項1〜4のいずれか1項で定義されたt
−PA類似体をコードするDNA。 6 請求項5に定義されているDNAを含有する
発現ベクター。 7 Zem99−8000またはZem99−8100である請求
項6記載の発現ベクター。 8 請求項6〜7のいずれか1項により定義され
た発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。 9 請求項1〜4のいずれか1項で定義されたt
−PA類似体をコードするDNAを含有する発現ベ
クターによつてトランスフエクトまたは形質転換
された宿主細胞を培地に培養し、生じたt−PA
類似体を培養物から採取することを特徴とする請
求項1〜4のいずれか1項で定義されたt−PA
類似体の製造方法。 10 請求項1〜4のいずれか1項で定義された
t−PA類似体を有効成分とする血栓溶解剤。
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