CN1958611A - 血清类粘蛋白抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特异性识别血清类粘蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.1512、CGMCC NO.1513的杂交瘤细胞产生。本发明还涉及包含上述单克隆抗体的用于血清学诊断肿瘤的试剂盒，以及血清类粘蛋白抗体在制备用于血清学检测肿瘤的诊断剂中的用途。

Description

血清类粘蛋白抗体及其用途

技术领域

本发明涉及蛋白质工程、基因工程和生物医药领域，具体涉及血清类粘蛋白抗体及其在诊断肿瘤中的用途。

背景技术

血清类粘蛋白(Orosomucoid，又被称为α1-Acid glycoprotein(AGP))是一种血清糖蛋白，其由183个氨基酸组成，主要合成，分泌于肝细胞。

尽管它作为应急蛋白的多种免疫调节功能已经被提出，并作了广泛深入的研究，但其确切的作用至今未知。各种炎症因子和类固醇激素影响AGP mRNA的表达，并且发现在各种炎症状态、肝病、自身免疫性疾病及癌症病人血清中AGP的浓度上升。

本领域中还需要找出用于血清学诊断的肿瘤标志物及其相关的诊断试剂和方法。

发明内容

为实现上述发明目的，本发明首先提供了一对能特异性识别血清类粘蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.1512、CGMCC NO.1513的杂交瘤细胞产生。

本发明另一方面提供了一种用于血清学诊断肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含一对抗体，由保藏号为CGMCC NO.1512的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第一抗体，以及由保藏号为CGMCC NO.1513的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第二抗体。

本发明另一方面还涉及血清类粘蛋白抗体、尤其是上述单克隆抗体在制备用于血清学检测肿瘤的诊断剂中的用途。

本发明的血清类粘蛋白抗体，尤其是本发明获得的单克隆抗体能够用于血清学检测各种肿瘤。本发明的其它目的和优点可从以下的详细描述中得知。

附图说明

图1显示了载体pGEX-2T的图谱，图中的Thrombin表示凝血酶；Stop Codons表示终止密码子；glutathione S-transferase表示谷胱甘肽S-转移酶的编码序列；Amp^r表示氨苄青霉素抗性基因。

图2显示了重组血清类粘蛋白的SDS-PAGE结果。

图3显示了对富集后的血清类粘蛋白用OroD07和OroD09进行Western检测的结果。

图4显示了Northern印迹证明血清类粘蛋白在癌症组织样品中上调。

具体实施方式

本发明者利用含5612个基因的人的cDNA阵列，检测了多对癌症病人及其癌旁正常组织样品的基因表达谱，找到多个在癌症病人中上调的基因，再对这些基因所编码的蛋白进行一，二级结构分析，试图找到含有分泌肽的蛋白。也就是说所找到的蛋白不仅在癌症病人中上调，而且是可以分泌到血清中的。最终发现血清类粘蛋白在多种癌症病人组织样品中上调，且含有分泌肽。这就提示血清类粘蛋白可以作为肿瘤标志物，应用于肿瘤的血清学诊断和病情跟踪。为了验证上面的假设，本发明者利用单克隆抗体技术和免疫酶联技术(ELISA)制备并寻找了可配对的针对血清类粘蛋白的单克隆抗体，并利用该配对抗体检测了多种癌症病人和正常人血清中血清类粘蛋白的含量，所得的结果显示血清类粘蛋白可以作为癌症病人的血清学肿瘤标志物，从而完成了本发明。

本发明第一方面提供了两个能特异性识别血清类粘蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体分别由保藏号为CGMCC NO.1512、CGMCC NO.1513的杂交瘤细胞产生。

本文所用的术语“抗体”指由至少一个抗体结合位点组成的一个或一组多肽，其具体包括：单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段(例如Fab、F(ab′)2和Fv)，只要它们表现出所需的生物活性(即与血清类粘蛋白特异性结合)。术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常是抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段。木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为Fab片段，每个片段有单个抗原结合部位)，以及一个残余的“Fc”片段(如此称呼是因为它很容易结晶)。用胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段(它具有两个能与抗原交联的抗原结合片段)以及一个残余的其它片段(称为pFc′)。其它片段可包括二抗体、线性抗体、单链抗体分子和抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用的，关于抗体的术语“功能性片段”是指Fv，F(ab)和F(ab′)2片段。

本文所用的术语“单克隆抗体”指从一群基本均一抗体获得的抗体，即该群体中包含的各个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体是高特异性的，针对单个抗原位点。而且，与常规(多克隆)抗体制剂(通常是包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。本文的单克隆抗体还包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)(其中重链和/或轻链的一部分与特定动物种类衍生的、或是属于特定的抗体类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，而链的其余部分则与另一动物衍生的、或是属于另一抗体类或亚类的抗体的对应序列相同或同源)以及这些抗体的片段，只要这些片段具有所需的生物活性即可。

针对血清类粘蛋白的单克隆抗体可用常规方法制得。通常，首先用血清类粘蛋白蛋白来免疫合适的动物，较佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。所述血清类粘蛋白蛋白可从商业途径获得，或是根据常规分子克隆和基因重组表达技术来获得。由于可获得的血清体积多，能获得标记的抗家兔和抗山羊抗体，因此对于制备多克隆抗血清来说，家兔和山羊是较佳的。免疫通常这样进行：将蛋白以盐水(较佳的以佐剂如弗氏完全佐剂)混合或乳化，然后肠胃外(通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂。随后用盐水(较佳的是用弗氏不完全佐剂)配的蛋白质注射一次或多次以强化免疫。另外可以用本领域已知的方法进行体外免疫来产生抗体。

用Kohler和Milstein的标准方法[Nature(1975)256：495-96]或其改进方法可制得单克隆抗体。通常，如上所述对啮齿类动物如小鼠和大鼠进行免疫。当然，也可用家兔、羊或蛙细胞。采用大鼠可能会有某些优点，但是小鼠是较佳的，其中BALB/c小鼠是最佳的，它是最常用的动物，通常能提供较高比例的稳定融合。为了产生单克隆抗体，在免疫接种后，选择具有生产抗体潜力的体细胞，具体是B淋巴细胞(B细胞)，以用于单克隆抗体生产程序。这些细胞可从活检的脾脏、扁桃体或淋巴结、或周围血液样品获得。脾细胞和周围血细胞是较佳的，因为前者是处于分裂的浆母细胞阶段的抗体产生细胞的丰富来源，而后者周围血液很容易获得。通常是对一组动物免疫接种，取出抗体滴度最高的动物的脾脏。用注射器将脾脏匀浆，获得脾淋巴细胞。免疫接种过的小鼠的脾脏通常含有约5×10⁷至2×10⁸的淋巴细胞。

然后，使免疫接种的动物的产生抗体的B细胞与无限增殖骨髓瘤细胞系(通常与免疫接种动物的种类相同)融合。适用于产生杂交瘤融合程序的骨髓瘤细胞系最好不产生抗体，融合效率较高，且有酶缺陷，使得它们不能在某些只支持所需融合细胞(称为杂交瘤)生长的选择性培养基中生长。可采用许多骨髓瘤细胞中的任何一种，它们是本领域技术人员中已知的。例如，当免疫接种的动物是小鼠时，可采用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp2/0、FO、NSO/U、MPC-11、MPC 11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；对于大鼠，可采用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6均可与人细胞融合结合。一种较佳的小鼠骨髓瘤细胞系是NS-1骨髓瘤细胞系(也称为P3-NS-1-Ag4-1)，它可从NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository通过要求细胞系保藏号GM3573获得。可采用的另一种小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟嘌呤抗性的小鼠骨髓瘤SP2/0非生产型细胞系。

产生抗体产生性脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交物的方法通常包括在促进细胞膜融合的一种或数种试剂(化学或电)存在下，以2∶1的比例混合体细胞和骨髓瘤细胞，但是比例也可分别从约20∶1至约1∶1。Kohler & Milstein(1975；1976)已经描述了采用Sendai病毒的融合方法，Gefter等(1977)描述了采用聚乙二醇(PEG)(如37％(v/v)PEG)。采用电诱导的方法也是适用的。

融合步骤产生存活杂交细胞的频率通常较低。然而，这并不成问题，因为通过在选择性培养基中培养可将存活的融合杂交细胞与亲代未融合细胞(特别是会继续正常无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)中区分开来。选择性培养基通常含有阻断组织培养基中核苷酸从头合成的试剂。典型的较佳的试剂是氨基喋呤、氨甲喋呤和重氮丝氨酸。氨基喋呤和氨甲喋呤阻断了嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸仅仅阻断嘌呤的合成。当采用氨甲喋呤或氨甲喋呤时，在培养基中补充入次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸源(HAT培养基)。当采用重氮丝氨酸时，在培养基中补充加入次黄嘌呤。

较佳的选择培养基是HAT。只有能进行核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤在补救途径中缺少关键性酶，如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，它们不能存活。B细胞能进行该途径，但是它们在培养基中的生命期有限，通常会在大约两周内死亡。因此在选择性培养基中存活的细胞只有骨髓瘤和B细胞形成的杂交瘤细胞。

这一培育提供了一群杂交瘤，从中选出具体的杂交瘤。通常，杂交瘤的选择是：在微量滴定板中单克隆稀释，然后测试各个克隆的上清液是否具有所需反应性。该试验应当灵敏、简单而迅速，例如放射性免疫试验、酶免疫试验、细胞毒性试验、空斑试验、斑点免疫结合试验、酶联免疫吸附试验等。然后系列稀释所选杂交瘤，并克隆成单个的抗体产生细胞系，然后就可使克隆无限增殖以提供单克隆抗体。

在本发明的实施方案中，发明人通过数轮筛选获得了两株对血清类粘蛋白有高特异性的单克隆抗体杂交瘤细胞株OroD07和OroD09，并于2005年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为CGMCC No.1512和CGMCC No.1513。

细胞系可利用两种基本的方式来生产单克隆抗体。一种方式是将杂交瘤样品注射入用未提供体细胞和骨髓瘤细胞进行最初融合的组织相容性动物中，通常注射入腹膜腔内。注射过的动物产生的肿瘤分泌出由杂交融合细胞产生的特异性单克隆抗体。然后可抽出动物的体液(如血清或腹水)以提供高浓度的单克隆抗体。任选地，在注射细胞前给予动物一种烃类(具体说是油，如降植烷Pristane(四甲基十五烷)、石蜡等)。

本发明的单克隆抗体也可用本领域熟知的体外方法进行繁殖。体外繁殖可在合适的培养基(如Dulbecco改进的Eagle培养基或RPMI 1640培养基)中进行，还可任意的补加入哺乳动物血清(如胎牛血清)或微量元素以及维持生长的补充物，如饲养细胞(如正常小鼠腹膜渗出液细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞等)。体外生产提供了较纯的抗体制品，并允许放大规模来大量提供所需抗体。在组织培育条件下大规模培育杂交瘤的技术是本领域中已知的，其包括均相悬浮培养，例如在气升式反应器或连续搅拌罐反应器中，或固定或截留细胞培养。如果需要，用任一方法产生的单克隆抗体可用过滤、离心和各种层析方法(如HPLC或亲和层析)进一步纯化。

应当理解，本发明的术语“单克隆抗体”还涵盖了该单克隆抗体的功能性片段和偶联物。本发明的单克隆抗体的片段可从上述制得的单克隆抗体获得，方法例如包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜酶)消化和/或用化学还原来断裂二硫键。本发明的单克隆偶联物也可用本领域熟知的方法制得，例如，在偶联剂(如戊二醛或高碘酸盐)存在下使上述制得的单克隆抗体与酶反应。在这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸盐反应，制得带荧光素标记的偶联物。类似地制得带金属螯合剂的偶联物。可与抗体偶联的其它物质包括放射性核素，如³H、¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³⁵S、¹⁴C、⁵¹Cr、³⁶Cl、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、¹⁵²Eu和⁹⁹mTc以及可与抗体偶联的其它有用的标记物。本发明的放射性标记过单克隆抗体可根据本领域熟知的方法制得。例如，通过与碘化钠和碘化钾以及化学氧化剂(如次氯酸钠)或酶氧化剂(如乳过氧化物酶)接触，可使单克隆抗体碘化。本发明的单克隆抗体可通过配体交换方法或直接标记方法来标记锝⁹⁹m。交换方法例如是用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到Sephadex柱上，然后将抗体施加到该柱上；直接标记方法例如是培育高锝酸盐、还原剂(如SNCl₂)、缓冲液(邻苯二甲酸钠-钾溶液)和抗体。

如果需要，抗体可用常规技术来标记。合适的标记包括荧光团、发色团、放射活性原子(尤其是³²P和¹²⁵I)、密电子试剂、酶、以及具有特异性结合配偶的配体。酶通常靠其活性来检测。例如，辣根过氧化物酶通常是检测其将3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)转变成蓝色的能力，可用分光光度计定量测定。其它特异性结合配偶包括生物素和亲和素或链亲和素，IgG和蛋白A，以及本领域已知的许多受体-配体对。应理解，上述内容并非要将各种标记分成不同的类，因为同一标记可在几种不同的模型中起作用。例如，¹²⁵I可作为放射活性标记，或作为密电子试剂。HRP可作为酶或单抗的抗原。另外，一种物质可以和各种标记组合以获得所需的效果。其它替换和可能性对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，所以应认作属于本发明范围内的等价方案。

本发明另一方面涉及用本发明的血清类粘蛋白抗体来检测样品(如血清)中的血清类粘蛋白水平，并将其与正常参考值比较，从而实现检测肿瘤的目的。

在较佳的实施方案中，本发明的抗体可用来检测肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、食管癌、胰腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等肿瘤。在较佳的实施方案中，本发明的抗体可用来检测胃癌和结肠癌。

所述检测可通过标准免疫化学方法，例如ELISA、Western印迹方法、RIA以及其它非酶联抗体结合试验等来实现。

在典型的ELISA中，将本发明的一对单克隆抗体中的一个固定在具有蛋白亲和性的选定表面上，例如聚苯乙烯微滴板的测试孔。然后，在测试孔中加入怀疑含有抗原的待测组合物，例如临床样品如血清。在结合、并洗涤去除非特异性结合的免疫复合物后，就可以检测被结合的抗原。检测通常是通过加入另一种抗体(如本发明的另一单克隆抗体)来完成的，所述抗体对要求检测的抗原具有特异性并连接有可测标记。这类ELISA是一种简单的“夹心ELISA”方法。也可以先加入对所需检测抗原具有特异性的第二抗体，然后加入对第二抗体有结合亲和性的第三抗体来进行测定，所述第三抗体连接有可测标记。另外，也可以使用竞争ELISA，使待测样品与已知量的标记抗原或抗体竞争结合，在与包被测试孔孵育前或孵育过程中，将样品与已知的标记反应物混合来测定未知样品中反应物的量。

不论采用何种方式，各种ELISA有一些共同的特征步骤，例如包被、孵育或结合、洗涤去除非特异性结合物、和检测结合的免疫复合物。下面将对此进行说明。

在用抗原或抗体包被测试板时，通常是将测试板孔与抗原或抗体溶液一起孵育过夜或一定的时间。然后，洗涤测试板孔以去除不完全吸附的物质。然后，在测试孔的剩余表面“包被”以非特异性蛋白，此蛋白对待测抗血清在抗原性上是中性的。这类蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、伴刀豆蛋白和奶粉溶液。此步包被封闭了固相表面上的非特异性吸附位点，由此减弱因抗血清与表面的非特异性结合引起的背景。

在抗原性物质与测试孔结合，用非反应性物质包被以减弱背景和洗涤去除未结合物质后，使固相化表面在一定条件下与待测的抗血清或临床或生物学提取物接触形成(抗原/抗体)免疫复合物。这类条件宜包括用胎牛血清(BSA)、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸盐缓冲液(PBS)/吐温等稀释剂来稀释抗血清。加入的这些试剂还有助于减弱非特异性背景。孵育之后，洗涤接触过抗血清的表面去除非免疫复合的物质。洗涤过程宜包括用例如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液之类溶液进行洗涤。

在待测样品与结合的抗体之间形成了特异性免疫复合物并经洗涤后，可以用对抗原有特异性的第二抗体来测定有无所形成的免疫复合物甚至测定其含量。为了提供检测手段，第二抗体宜含有与之偶联的酶，该酶在与合适的生色底物孵育后会显现出颜色。

在与酶标记第二抗体一起孵育并洗涤去除未结合物质后，通过与显色色底物一起孵育来测定标记的量，所述底物例如脲和溴甲酚紫，如果酶标记是过氧化物酶，则底物为2，2’-偶氮-二-(3-乙基-苯并噻唑林-6-磺酸)(ABTS)和H₂O₂。然后通过测定显色程度来定量，例如使用可见光光谱分光光度计。或者，可以是化学发光标记。

在较佳的实施方案中，本发明获得了能够配对用于夹心ELISA法的两株单克隆抗体，这样就能实现通过检测对象血清中血清类粘蛋白的水平来快速诊断对象是否患有肿瘤。

因此，本发明的另一方面还提供了一种用于血清学诊断肿瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含一对抗体，其中由保藏号为CGMCC NO.1512的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第一抗体，由保藏号为CGMCC NO.1513的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第二抗体。在较佳的实施方案中，所述抗体还可与标记物偶联。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1血清类粘蛋白的克隆纯化

1).基因的克隆

采用引物序列：F：5-CGCGGATCCAACCTAGTACCGGTGCCCATCACT(SEQ IDNO：1)；R：5-CGGCGGAATGGATTCCCCCTCCTCCTGTTT(SEQ ID NO：2)，扩增得到目的基因(SEQ ID NO：3)的PCR产物。

将目的基因PCR产物用鼎国DNA回收试剂盒进行回收。PCR产物用BamHI和EcoR I进行酶切，与相同酶切的载体PGEX-2T(图1)进行连接，并转化大肠杆菌DH5α。先双酶切鉴定，再经测序鉴定。测序由上海博亚生物技术有限公司完成。测序结果如下：

核苷酸序列：

GGATCC AACCTAGTACCGGTGCCCATCACTAACGCCACCCTGGACCGGATCAC

TGGCAAGTGGTTTTATATCGCATCGGCCTTTCGAAACGAGGAGTACAATAAGT

CGGTTCAGGAGATCCAAGCAACCTTCTTTTACTTCACCCCCAACAAGACAGAG

GACACGATCTTTCTCAGAGAGTACCAGACCCGACAGGACCAGTGCATCTATAA

CACCACCTACCTGAATGTCCAGCGGGAAAATGGGACCATCTCCAGATACGTGG

GAGGCCAAGAGCATTTCGCTCACTTGCTGATCCTCAGGGACACCAAGACCTAC

ATGCTTGCTTTTGACGTGAACGATGAGAAGAACTGGGGGCTGTCTGTCTATGCT

GACAAGCCAGAGACGACCAAGGAGCAACTGGGAGAGTTCTACGAAGCTCTCG

ACTGCTTGCGCATTCCCAAGTCAGATGTCGTGTACACCGATTGGAAAAAGGAT

AAGTGTGAGCCACTGGAGAAGCAGCACGAGAAGGAGAGGAAACAGGAGGAG

GGGGAATCCTAGCAGGACACACGAATTC

推导的氨基酸序列：

NLVPVPITNATLDRITGKWFYIASAFRNEEYNKSVQEIQATFFYFTPNKTEDTIFLRE

YQTRQDQCIYNTTYLNVQRENGTISRYVGGQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDE

KNWGLSVYADKPETTKEQLGEFYEALDCLRIPKSDVVYTDWKKDKCEPLEKQHE

KERKQEEGES(SEQ ID NO：4)

2).融合蛋白在大肠杆菌中的表达

经测序鉴定的重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌表达，将阳性克隆接种到3mL LB培养基(含Amp，100mg/mL)中，37℃培养过夜。按1∶100的比例接种到另一根LB(含Amp)培养基管，37℃快速振荡培养至细菌生长对数期OD 600到0.5时，加入IPTG，使其终浓度为0.5mmol/L，37℃快速振荡培养3h，分别在加入IPTG前后取出0.5mL细菌培养物，离心进行SDS-PAGE电泳(聚丙稀酰胺分离胶浓度12％，浓缩胶5％)观察表达。PGEX-2T/血清类粘蛋白在BL21(DE3)大肠杆菌为包涵体表达。

3).重组血清类粘蛋白抗原的表达

在超净工作台上取少量上述阳性克隆菌液涂LB固体平板；37℃培养过夜，次日挑单克隆接种于3ml的LB培养基，37℃摇菌培养至OD6000.4～0.6，用15％的甘油保菌，0.2ml/管分装，置-80℃冻存，以后每次表达时取出一管活化，一次性使用。

抗原基因表达纯化所用的试剂和仪器如下：

试剂：

LB培养基(1L：Yeast Extract 5g，Tryptone Peptide 10g，NaCl 10g)

1M IPTG

200mg/mL氨苄青霉素

PBS(3.58g Na₂HPO₄，0.245g KaH₂PO₄，8.18g NaCl，1L H₂O，pH7.5)

2M咪唑：PBS配制

500mM EDTA：水配制(pH8.0)

6M盐酸胍(水配制，pH8.0)

透析液：梯度(缓冲液：20Mm Tris，pH8.5，含150mM NaCl，0.5mM EDTA)7M尿素，6M尿素，5M尿素，4M尿素，3M尿素，2M尿素，1M尿素，0M尿素。

(3)基因在大肠杆菌中的表达

活化：取上述冻存于-80℃的甘油菌接种于20mL LB培养基中，30℃培养过夜；

接种：菌液以1∶100稀释于300mL新鲜LB培养基中，于37℃振荡培养3小时左右，使菌体浓度达到OD600＝0.5；

诱导：加入1MIPTG诱导至终浓度0.5mmol/L诱导，37℃振荡培养3小时；

收菌：离心(6000rpm，4℃，10min)，收集菌体。

6).目的产物的纯化

GSTtag融合蛋白的分离纯化：用40mL PBS(pH7.5，预冷)，重悬离心收集的细菌(仪器1)，冰浴超声破碎(200W，工作时间3秒，间歇时间5秒，工作次数40次)，离心(仪器4)14000rpm 10min(4℃)，分别收集上清和沉淀，分别取样跑12％SDS-PAGE电泳，结果确定目的蛋白以包涵体状态表达，即是存在于沉淀中。

(1)包涵体洗涤：

a 1％Triton X-100 20Ml(PBS配)充分悬浮，4℃搅拌30min，离心(14000rpm，20min，4℃)收集沉淀；

b 2M Urea 20mL(PBS配)洗涤，重复a操作；

c 4M Urea 20mL(PBS配)洗涤，重复a操作；

(2)包涵体变性：6M盐酸胍20mL搅拌溶解过夜。

(3)电泳：12％SDS-PAGE，以确定纯化变性蛋白的纯度和浓度

(4)梯度复性：取初步纯化样品进行梯度透析，7M Urea-6M Urea-5M Urea-4MUrea-3M Urea-2M Urea-1M Urea-0M Urea(buffer 20mMTris.Hcl，50mM NaCl，pH8.5)透析复性，每个梯度透析时间大于4h，4M Urea以下置4℃环境中透析。

(5)初步纯化样品在CBS(50mM，PH9.6)透析过夜，OD280＝1.08，分装100ul/管，-70℃储存。

重组血清类粘蛋白的SDS-PAGE结果如图2所示。

本实施例获得的血清类粘蛋白基因克隆菌株(大肠埃希氏菌)于2005年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.1508。

实施例2血清类粘蛋白单克隆抗体的制备：

1.免疫小鼠：

动物选择：雌性BALB/c 6-8周龄

免疫方案：长期：第一次    第一天         50ug抗原/只+CFA       sc

                第二次    第十五天       50ug抗原/只+IFA       sc

                第三次    第二十九天     50ug抗原/只+生理盐水  ip

                          第三十二天融合

备注：CFA：福氏完全佐剂；IFA：福氏不完全佐剂；Ip：腹腔注射；Iv：静脉注射；Sc：皮下注射

2.融合前测血清效价(表1)。

                                                               表1

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	2.893	2.828	2.849	2.746	2.537	1.893	1.182	0.759	0.388	0.229	0.164	0.146
B	3.007	2.825	2.836	2.625	2.443	1.844	1.104	0.651	0.363	0.221	0.143	0.109
													C	2.803	2.720	2.712	2.112	1.523	0.984	0.642	0.486	0.242	00.164	0.103	0.107
D	2.913	2.829	2.741	2.103	1.673	1.209	0.759	0.465	0.228	0.159	0.112	0.103
													E	0.577	0.216	0.120	0.238	0.086	0.085	0.074	0.074	0.068	0.071	0.075	0.092
F	0.584	0.191	0.153	0.111	0.090	0.088	0.077	0.082	0.083	0.101	0.084	0.090
													G	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
H	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000

1：血清稀释50倍  2：血清稀释250倍  3：血清稀释1250倍  4：血清稀释6250倍  5：血清稀释12500倍  6：血清稀释25000倍  7：血清稀释50000倍  8：血清稀释100000倍  9：血清稀释200000倍  10：血清稀释400000倍  11：血清稀释800000倍  12：血清稀释1600000倍

AB为复孔：一号小鼠  CD为复孔：二号小鼠  EF为复孔：空白小鼠

一号小鼠免疫的效果较好，选择它做融合

3.融合当天收集骨髓瘤细胞SP2/0，直接从细胞培养瓶收集

4.取免疫小鼠脾脏，收集脾细胞，计数，与SP2/0细胞按10∶1的比例混合。

5.细胞融合

A：准备：1)一支15ml的离心管装10ml1640不完全培养基(终止液)放置37℃水浴

2)PEG一份(0.7ml)放置37℃水浴

3)配制HAT培养基

1640不完全培养基

50*HAT

FBS 20％

100*双抗

100*HEPES

B：融合：

1)脾细胞与SP2/0混合液离心960rpm*8min

2)去上清(尽量吸干)，将细胞弹松。

3)1分钟内加入PEG，逐滴加，边加边轻轻混合均匀。

4)37℃水浴1.5分钟。

5)5分钟内加入终止液(沿管壁滑入，勿吹打细胞)轻轻搅匀。

6)取一滴于载玻片观察融合效果，余者960rpm离心8min。

7)弃上清后加入上述HAT培养基。

8)接种与96孔培养板(200ul/孔)置37℃5％CO²培养

6.融合后10天左右，待融合细胞克隆长成，用ELISA检测融合细胞是否分泌抗体。

                                                                       表2

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	1.356	0.989	0.138	0.155	0.165	0.284	0.197	0.159	0.213	0.122	0.173	0.280
B	0.671	0.237	0.245	0.115	0.246	0.224	0.279	0.235	0.194	0.335	0.142	2.588
													C	0.195	00153	0.231	0.395	2.438	0.218	0.257	0.195	0.214	0.243	0.155	0.160
D	0.084	0.065	0.068	0.069	0.062	0.075	0.066	0.067	0.074	0.066	0.083	0.187
													E	1.568	0.965	0.159	0.118	0.290	0.208	0.146	2.171	0.147	0.338	0.165	0.192
F	0.715	0.180	0.164	0.248	0.179	0.184	0.442	0.194	0.147	0.144	0.135	0.186
													G	0.574	0.192	0.814	1.639	0.341	0.144	0.170	0.149	0.212	0.165	0.169	0.271
H	0.572	0.268	1.304	0.181	0.152	0.190	0.405	0.261	0.185	0.272	0.628	0.224

C5：OroD07  E8：OroD09

7.有限稀释法筛选阳性克隆

根据ELISA结果(表2)，选取阳性孔(倾斜粗体)，用移液枪将孔中细胞吹下，计数后取100个细胞溶于20ml1640完全培养基(含20％FBS)，接种于96孔培养板，余细胞置培养瓶中培养。

8.10天左右再复筛。

                                       表3

	OroD07	OroD07	OroD09	OroD09	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	2.666	2.609	2.712	2.722
B	2.214	2.556	2.626	2.618
													C	2.487	2.313	2.627	2.679
D	2.548	2.456	2.567	2.657
													E	2.442	2.371	2.751	2.807
F	2.615	2.689	2.797	2.797
													G	2.558	2.635	2.510	2.599
H	2.115	2.107	2.402	0.402

OroD07和OroD09随机挑16个克隆测ELISA，根据结果(表3)，选取阳性孔(倾斜粗体)，用移液枪将孔中细胞吹下，计数后取100个细胞溶于20ml1640完全培养基(含20％FBS)，接种于96孔培养板，余细胞置培养瓶中培养。

9.10天左右再复筛。

                                                                                  表4

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	2.785	2.150	2.108	0.192	2.169	2.125	2.001	2.127	2.112	2.365	2.079	2.112
B	2.628	2.561	2.080	2.644	2.575	2.636	2.568	2.130	2.124	2.131	2.159	2.150
													C
D
													E
F
													G
H

OroD07(A行)和OroD09(B行)随机挑12个单克隆测ELISA，根据结果(表4)，选取阳性孔(倾斜粗体)，用移液枪将孔中细胞吹下，计数后取100个细胞溶于20ml1640完全培养基(含20％FBS)，接种于96孔培养板，余细胞置培养瓶中培养。

10.10天左右再复筛。

                                                                       表5

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	2.203	2.472	2.199	1.869	1.126	1.657	2.593	1.111	2.238	1.697	1.713	1.891
B	2.758	2.692	2.670	2.628	2.684	2.642	2.591	1.910	2.444	2.494	2.130	2.534
													C
D
													E
F
													G
H

OroD07(A行)和OroD09(B行)随机挑12个单克隆测ELISA，根据结果(表5)，选取阳性孔(倾斜粗体)，用移液枪将孔中细胞吹下，计数后取100个细胞溶于20ml1640完全培养基(含20％FBS)，接种于96孔培养板，余细胞置培养瓶中培养。

11.10天左右再复筛。

                                                                                  表6

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	2.590	2.693	2.702	2.598	2.684	2.605	2.684	2.770	2.720	2.720	2.667	2.781
B	2.340	2.239	1.835	2.147	1.261	1.777	2.325	1.343	1.810	1.075	1.255	2.224
													C
D
													E
F
													G
H

OroD07(A行)和OroD09(B行)随机挑12个单克隆测ELISA，根据结果(表6)，选取阳性孔(倾斜粗体)，由于呈100％阳性两次，用移液枪将孔中细胞吹下，置培养瓶中培养，保存细胞株。所得的两个细胞株OroD07和OroD09已经于2005年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号分别为CGMCC No.1512和CGMCC No.1513。

ELISA的方法如下：

1.包被：把抗原稀释成所需浓度，通常为10ug/10ml，用包被液稀释，100ul/孔加至酶标板，4℃过夜。

1.封闭：洗去包被液，用10％胎牛血清或1％的BSA封闭，每孔200ul，37℃放置1.5小时，或室温放置2小时。

2.用洗板机洗涤三次，200ul/次，拍干。

3.加样品：第一孔抗体稀释为10*^-7mol/l，以后每孔对倍稀释。100ul/孔，37℃放置1小时。

4.重复步骤3。

5.加酶标二抗：为酶标羊抗小鼠IgG，用40％小牛血清60％去离子水1∶1000稀释，100ul/孔，37℃放置1小时。

6.重复步骤3。

7.加底物TMB：A液+B液(1∶1)，即用即配，100ul/孔，37℃放半小时。

8.终止：加2M的硫酸，50ul/孔。

9.酶标仪读数：450nm波长测定。

实施例3小鼠腹水制备和抗体的提取

1.注射0.5ml石蜡至经产孕鼠。

2.两周后，收集OroD07和OroD09的单克隆抗体细胞各10⁶个注射至上述小鼠。

3. 10天左右，当小鼠腹部股出并有一点发黑，体毛有一些竖起时，拉颈处死，打开腹腔取出腹水。

4.3000rpm，15min。

5.取上清，分装，-20℃保存。

6.购买Amersham Biosciences公司的HITRAP PROTEIN G HP来提纯，请按说明书操作。

实施例4抗体标酶

a)称0.004gHRP溶于0.4mlddH₂O(溶液1)，称0.006gNaIO₄溶于0.469ml ddH₂O(溶液2)。

b)取(溶液2)0.4ml逐滴加入溶液1，混匀放于4℃，避光30min至溶液呈墨绿色

c)取0.4ml1％乙二醇逐滴加入上述液体，混匀放于4℃，避光30min至溶液呈深棕色

d)取OroD09抗体0.5mg加入150ul反应液，放入CBS中4℃透析过夜。

e)取出透析的溶液，计算体积。

f)现配5mg/ml的NaBH₄

g)加入20ul NaBH₄，放于4℃，避光2hr。

h)加入等体积饱和(NH4)SO4，混匀放于4℃，避光3hr。

i)5000rmp离心30min

j)取沉淀，用0.5mlPBS溶解，放入PBS中4℃透析过夜。

k)取出标记好的抗体做配对。

实施例5抗体配对

1.包被：把OroD07稀释成10ug/10ml，用包被液稀释，100ul/孔加至酶标板，4℃过夜。

2.封闭：洗去包被液，用10％胎牛血清，每孔200ul，37℃放置1.5小时，或室温放置2小时。

3.用洗板机洗涤三次，200ul/次，拍干。

4.加血清类粘蛋白抗原，100ul/孔，37℃放置1小时。

5.重复步骤3。

6.加OroD09酶标二抗10ug/10ml，100ul/孔，37℃放置1小时。

7.重复步骤3。

8.加底物TMB：A液+B液(1∶1)，即用即配，100ul/孔，37℃放半小时。

9.终止：加2M的硫酸，50ul/孔。

酶标仪读数：450nm波长测定。

抗原浓度(ng/ml)	0	1.5	3	15	30	100
							A	0.095	0.297	0.479	1.222	2.078	2.465
B	0.087	0.311	0.501	1.346	2.109	2.237

ELISA是酶联免疫吸附分析的缩写，其原理是根据抗原、抗体的特异性相互作用，以及通过酶联扩大反应信号而设计的。为了利用ELISA技术寻找配对抗体并检测抗原，本发明者首先需要对抗体进行酶联标记。即将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。本发明者采用的标记方法是简易过碘酸钠法。本法是以NaIO₄先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与抗体上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近99％的抗体与酶结合，酶与抗体的活性无重大损失，是目前最常用的方法。标记方法如下：

假定要标1mg的抗体，

1.配1L CBS(50Mm，pH9.6)，4度预冷；

2.称取1mg的HRP，用ddH₂O溶解(棕色溶液)，浓度为10mg/ml，体积为0.1ml；

3.称取多于2mg的NaIO₄，用ddH₂O溶解，浓度为12.8mg/ml；

4.取0.1ml NaIO4溶液(与酶液等体积)，逐滴加入到酶液中，混匀，置于4度，避光反应约30min，至反应液成墨绿色

5.配1ml 1％(V/V)乙二醇，取0.1ml(与酶液等体积)，逐滴加入到反应液中，混匀，置于4度，避光反应约30min，至反应液成棕色；

6.将抗体和活化酶液加入到透析袋内，混匀，置于CBS中透析，4度过夜；

7.(第二天)配PBS，10mM，pH7.2，4度预冷；

8.取出透析的混合组分；

9.现配NaBH₄溶液，5mg/ml；在混合组分中加入40ul NaBH₄/mgAb，置于4度，避光静置2h；

10.加入等体积的饱和(NH4)₂SO₄溶液，混匀，置于4度，避光静置3h；(若标酶体积过大，可先分装，直接离心，避免损失)

11.离心，5000rpm，4度，30min；

12.取沉淀，用适量PBS(大约1ml PBS/mgAb)溶解，置于透析袋内，于PBS中透析，4度过夜；

13.(第三天)取出透析袋内酶标抗体，记下此时酶结合物体积，计算酶标抗体的大概浓度，测OD403/OD280，一般此值在0.7左右(相当于70％的标记率)，4度放置；

14.标抗体的质检：包括酶标抗体活性ELISA检测以及酶活力测定(参见质检)；

15.加入等体积的甘油，混匀，置于-20度保存；或者加稳定剂至终浓度为0.2mg/ml，4度保存(这一步骤可视情况而定)。

然后进行配对实验，者利用双抗体夹心法检测抗原，操作步骤如下：

1)将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

2)加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。

3)加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。

为了进一步验证OroD07，OroD09这两个抗体确实是能和血清类粘蛋白结合，本发明者做了免疫沉淀实验。利用购买的血清类粘蛋白抗体在癌症病人腹水中进行免疫沉淀，使抗原得到富积，然后用这两个抗体对富积后的抗原进行western检测，发现该抗原确实可以被OroD07，OroD09这两个抗体识别(结果如图3)。

实施例6血清类粘蛋白在癌症样品中上调

本发明者利用含5612个基因的人的cDNA阵列，检测了多对癌症病人及其癌旁正常组织样品的基因表达谱，结果证实血清类粘蛋白基因在癌症组织样品中上调(表7)。Northern印迹实验证明血清类粘蛋白基因在癌症组织样品中上调(图4)。

                        表7

样品	肿瘤	正常	比率(肿瘤/正常)
				No.18	481.03	144.92	3.32
No.20	0	0	*
				No.21	233.10	172.66	1.34
No.22	238.29	60.97	3.91
				No.23	11.50	0	*
No.24	36.53	16.91	2.16
				No.25	18.11	4.94	3.67
No.26	250.42	50.81	4.93
				No.27	0	0	*

实施例7临床检测

1.本发明者首先对400份正常人血清中血清类粘蛋白的含量进行了检测(表8)。健康人均为参与健康体检的人群，没有已诊断明确的疾病，女性同时排除怀孕的情况。健康男性共234人，22-84岁，平均年龄58岁，健康女性共166人，23-85岁，平均53岁。从检测结果中得到其95％的可信区间，从而确定正常人血清中血清类粘蛋白的参考值为8.07ng/ml。

                                表8

血清类粘蛋白	0-3ng/ml	3-6ng/ml	6-9ng/ml	＞9ng/ml
					男性	23	45	150	16
女性	18	32	88	28
					总计	41	77	238	44

2.对100份胃癌，100份结肠癌及其他若干恶性肿瘤，总计400份血清；下表9是对恶性肿瘤病人情况的统计。

                            表9

恶性肿瘤		男性		女性
						类别	例数	例数	平均年龄	例数	平均年龄
肝癌肺癌胃癌结肠癌食管癌胰腺癌子宫内膜癌乳腺癌前列腺癌卵巢癌	58291009910264392418	49246170814--24-	50.3763.9660.917258.6363.07--73.5-	953929212439-18	46.7858.2536334.559.0857.552.51-53.05

将测定值超过正常参考值确定为指标阳性，统计各种疾病中的指标阳性率(表10)。

             表10

癌症种类	阳性人数	百分比
			肝癌	10	17.2％
肺癌	5	17.2％
			胃癌	30	30％
结肠癌	32	32.3％
			食管癌	2	20％
胰腺癌	5	19.2％
			子宫内膜癌	0	0
乳腺癌	4	10.3％
			前列腺癌	4	16.7％
卵巢癌	3	16.7％
			总计	95	23.3％

3.良性疾病病人检测结果统计：

良性病人为到医院就诊的其他非恶性肿瘤病人。共50例。包括肝硬化9例，慢性乙肝病人(大三阳)7例，慢性支气管炎7例，胃溃疡23例，胃粘膜息肉4例。在良性肿瘤和炎性病人的样品中血清类粘蛋白有不同程度的升高，尤其是在肝炎和肝硬化的情况下，但是在癌症病人中血清类粘蛋白的水平要明显高于良性病人及正常人血清水平(mean±SD：8.88ng/mL±5.58ng/mL vs.5.69ng/mL±2.38ng/mL；P＜0.001)

4.正常人血清的参考值8.07ng/ml做为域值，高于该值的认为是阳性，则在胃癌及结肠病人中检出率分别达到30.0％和32.3％，特异性分别为93.5％和94.2％。

讨论：本发明者运用单克隆抗体技术得到了血清类粘蛋白的一系列单克隆抗体细胞株，并从中找到了一对可配对抗体，又用ELISA和免疫沉淀的方法验证了本发明获得的抗体确实识别血清类粘蛋白。在临床检测中，通过对400份癌症病人，50份良性病人，400份正常人血清的检测，发现血清类粘蛋白的血清学水平在癌症病人中要明显高于正常人的，从而可以得出结论：本发明所制备的OroDO7，oroD09这两个单抗细胞株能很好地检测血清中血清类粘蛋白水平；血清类粘蛋白可以作为肿瘤，尤其是胃癌、结肠癌血清学诊断的肿瘤标志物。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。

                             序列表

<110>中资汉脉(北京)生物技术有限公司

<120>血清类粘蛋白抗体及其用途

<130>058406

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

cgcggatcca acctagtacc ggtgcccatc act                                 33

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

cggcggaatg gattccccct cctcctgttt                                     30

<210>3

<211>531

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

aacctagtac cggtgcccat cactaacgcc accctggacc ggatcactgg caagtggttt     60

tatatcgcat cggcctttcg aaacgaggag tacaataagt cggttcagga gatccaagca    120

accttctttt acttcacccc caacaagaca gaggacacga tctttctcag agagtaccag    180

acccgacagg accagtgcat ctataacacc acctacctga atgtccagcg ggaaaatggg    240

accatctcca gatacgtggg aggccaagag catttcgctc acttgctgat cctcagggac    300

accaagacct acatgcttgc ttttgacgtg aacgatgaga agaactgggg gctgtctgtc    360

tatgctgaca agccagagac gaccaaggag caactgggag agttctacga agctctcgac    420

tgcttgcgca ttcccaagtc agatgtcgtg tacaccgatt ggaaaaagga taagtgtgag    480

ccactggaga agcagcacga gaaggagagg aaacaggagg agggggaatc c             531

<210>4

<211>177

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Asn Leu Val Pro Val Pro Ile Thr Asn Ala Thr Leu Asp Arg Ile Thr

1               5                   10                  15

Gly Lys Trp Phe Tyr Ile Ala Ser Ala Phe Arg Asn Glu Glu Tyr Asn

            20                  25                  30

Lys Ser Val Gln Glu Ile Gln Ala Thr Phe Phe Tyr Phe Thr Pro Asn

        35                  40                  45

Lys Thr Glu Asp Thr Ile Phe Leu Arg Glu Tyr Gln Thr Arg Gln Asp

    50                  55                  60

Gln Cys Ile Tyr Asn Thr Thr Tyr Leu Asn Val Gln Arg Glu Asn Gly

65                  70                  75                  80

Thr Ile Ser Arg Tyr Val Gly Gly Gln Glu His Phe Ala His Leu Leu

                85                  90                  95

Ile Leu Arg Asp Thr Lys Thr Tyr Met Leu Ala Phe Asp Val Asn Asp

            100                 105                 110

Glu Lys Asn Trp Gly Leu Ser Val Tyr Ala Asp Lys Pro Glu Thr Thr

        115                 120                 125

Lys Glu Gln Leu Gly Glu Phe Tyr Glu Ala Leu Asp Cys Leu Arg Ile

    130                 135                 140

Pro Lys Ser Asp Val Val Tyr Thr Asp Trp Lys Lys Asp Lys Cys Glu

145                 150                 155                 160

Pro Leu Glu Lys Gln His Glu Lys Glu Arg Lys Gln Glu Glu Gly Glu

                165                 170                 175

Ser

Claims (9)

1.特异性识别血清类粘蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.1512、CGMCC NO.1513的杂交瘤细胞产生。

2.一种用于血清学诊断肿瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含一对抗体，由保藏号为CGMCC NO.1512的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第一抗体，以及由保藏号为CGMCC NO.1513的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第二抗体。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其中所述肿瘤选自肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、食管癌、胰腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其中所述第一抗体和第二抗体中的任一抗体与标记物偶联。

5.血清类粘蛋白抗体在制备用于血清学检测肿瘤的诊断剂中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、食管癌、胰腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自胃癌和结肠癌。

8.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体为由保藏号为CGMCCNO.1512、CGMCC NO.1513的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。

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