CN1230446C - 识别抗原ior c2的抗体和fv片段 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从由杂交瘤产生的鼠抗体ior C5获得新颖的重组抗体，按照布达佩斯条约，所述杂交瘤以ECCC 97061101被保藏。所述重组抗体利用重组DNA技术获得，其特征在于它们识别抗原ior C2。重组抗体具体是嵌合抗体、人源化抗体和单链Fv片段。嵌合抗体含有鼠免疫球蛋白的可变域和人免疫球蛋白的恒定区。人源化抗体含有人免疫球蛋白的恒定区，而且已经在鼠构架区(FR)中经过修饰，而且在后者中，在可以产生T细胞抗原位点的那些区域中修饰。Fv片段含有鼠免疫球蛋白的可变域。本发明还涉及从鼠抗体ior C5衍生的重组抗体在结肠直肠肿瘤、其转移瘤和复发的诊断和治疗中的用途。

Description

识别抗原IOR C2的抗体和FV片段
发明领域
本发明涉及生物技术领域，确切地涉及运用遗传工程技术获得的新型重组抗体，具体地涉及从鼠IOR C5抗体获得的嵌合抗体、人源化抗体和单链Fv片段，它们识别在ior C2抗原中表达的表位，该抗原已被称为在正常与恶性结肠直肠细胞中表达的糖蛋白复合体。
发明背景
已经试验了不同方式的结肠直肠癌疗法，不过时至今日手术仍然是唯一有疗效的方案。如果能在初期发现肿瘤，手术可以获得较高的存活率，然而不幸的是大多数病案都是在肿瘤已经转移之后才得到确诊的。
当前，在癌尚未扩散到器官的外层部分、仍然可以通过外科手术治愈肿瘤的阶段，提高存活率的方法包括诊断、治疗和流行病学。这样，流行病学方面的知识以及新的治疗方法的发展将有助于提高存活率。
近年来，开始通过免疫γ射线照相法运用由放射性同位素做标记的单克隆抗体(Mab)或者是它们的片段来对癌症进行检测。单克隆抗体已经表现出了作为放射性同位素载体和靶向于相关肿瘤抗原的潜力。
部分做过放射性标记的抗体已经被用来检测与癌胚抗原(CEA)有关的肿瘤。用I-131或I-125做过标记的针对CEA的抗体被用于检测产生CEA或者与此标记有关的肿瘤(美国专利No.3663684、No.3867363和No.3927193)。同样，Mab也可以用Tc-99m做标记以获得进行“体内”诊断所用的分子。
由Khler和Milstein开发的杂交瘤抗体技术给免疫化学学科带来了革命性的变化，同时提供了在疾病的研究和临床诊断上都有广阔应用前景的一组新试剂(Khler G；Milstein C.(1975)《自然》256，495-497)。这些抗体没有表现出很强的治疗效果，而尽管生产鼠单克隆抗体(mAbs)用于基础研究和临床诊断已经成为一种例行程序，使用这些抗体用于“体内”免疫疗法是很困难的。这是因为在人体内这些抗体具有缩短了的半寿期，而且人体的免疫系统很难识别鼠抗体的效应域，还因为外来的免疫球蛋白能够引发一种抗球蛋白应答(HAMA应答)，可能会干扰治疗。
基因工程的发展为遗传法操纵抗体基因、从而产生在用于某些病理治疗或诊断时抗原性低或者无抗原性且所需要的效应器功能也得到了增强的mAb的能力带来了革命性的变化。这些操纵提供了一种备择方案，其中能够把鼠mAb转化为主要为人的形式，同时保持相同的抗原结合特征(Morrison S.L等1984，P.N.A.S.USA，81，6851-6855)。
最近又开发了一些方法，旨在把鼠或大鼠抗体人源化，并使其在人体中应用时降低对外来蛋白质的异种应答。
降低抗原性的初衷之一是为了生产“嵌合”抗体。在这些分子中，可变域被插入到人构架之中，这样不但可以降低免疫原性，还可以改善效应器功能，这是因为它们具有人源化的形式，因而可以被免疫系统识别(Morrison S.L等(1984)P.N.A.S，USA81，6851-6855)。这些嵌合分子保持了对原始抗原的识别，而且尽管它保持了对鼠抗原可变区的免疫原性，其恒定区不是免疫原性的。
其他作者试图通过从一个鼠抗体中仅移植抗原结合位点，而不是整个可变域来在人体抗体中直接建立一个啮齿类动物抗原结合位点(Jones P.T等(1986)《自然》321，522-524，Verhoeyen M等(1988)《科学》239，1534-1536)。Rietchmann已经发展了该方法的一些应用(Rietchmann L.等(1988)《自然》332，323-327；Queen C.等(1989)P.N.A.S.USA86，10029-10033)，不过为了恢复对原始抗原的亲和性，其他作者研究的是重构抗体，其中包括人FR中的某些鼠残基(Tempest，P.R.(1991)《生物技术》9，266-272)。
Mateo等人(美国专利No.US5712120)描述了降低鼠抗体的免疫原性的一种方法。该方法中所作的修饰被限制在可变域中，具体说来被限制在嵌合抗体的鼠构架中。而且，这些修饰只在带有两亲性螺旋结构的FR区中进行，因此是被T细胞所识别的潜在表位。此方法提出用在人免疫球蛋白中处于相同位置的氨基酸取代两亲性区中的鼠残基。当然，在结合位点的三维结构中涉及到的氨基酸，也就是说游标区，CDR的规范结构的氨基酸以及在轻链和重链之间界面的氨基酸要排除在外。
使用Mateo等人描述的这种方法所修饰的抗体保留了识别和与抗原结合的能力，所述抗原识别出原始抗体，并产生较小的免疫原性，因此可以提高疗效。采用这种方法，只需要很少几个突变就可以得到与嵌合抗体相比免疫原性减小的修饰抗体。
IOR C5鼠单克隆抗体(专利申请WO97/33916)是一个IgG1同位型，它是用SW1116细胞(结肠直肠腺癌)对Balb/c进行免疫得到的，识别一种优选在恶性的和正常的结肠直肠细胞的表面和细胞质之中表达的抗原。此抗体既不能识别CEA，Lewis a，Lewis b，无唾液酸化(asialylated)Lewis，正常的单核细胞抗原膜，也不能识别红细胞(Vázquez A.M.等，《杂交瘤》11，p.245-256，1992)。
利用SW1116膜提取物所进行的蛋白质印迹研究表明，此抗体可以识别被命名为ior C2的有两个分子量形式(145和190Kda)的糖蛋白复合体(Vázquez A.M.等，Year Immunol.Basel，Karger，vol，7，p.137-145，1993)。
从运用基因工程技术的技术情况也可以知道从单克隆抗体中可以构建重组片段。有许多报告证实了不同的抗体片段在“活体”诊断和疾病的治疗中的应用。
Ira Pastan等(EP0796334A1)描述了使用可以特异性地识别与Lewis Y抗原相关的糖类的抗体的可变区来构建单链Fv片段的过程。使用这些片段，他开发了一种方法来检测含有这种抗原的细胞。他还证明了这些片段对含有此种抗原的细胞的抑制剂作用。
本发明的公开
本发明涉及运用遗传工程技术得到的重组抗体。具体地涉及从鼠抗体IOR C5抗体获得的嵌合抗体、人源化抗体和单链Fv片段。所述鼠抗体IOR C5抗体是由同名的杂交瘤产生的，该杂交瘤在1997年6月11日按布达佩斯条约的规定保藏在欧洲细胞培养物保藏中心，入藏登记号为ECCC 97061101。此抗体可以识别在ior C2抗原中表达的表位，该抗原是在正常的与恶性的结肠直肠细胞中表达的糖蛋白复合体。
本发明提供了从由杂交瘤产生的鼠单克隆抗体IOR C5衍生的与ior C2抗原复合体相互作用的重组抗体，所述杂交瘤以编号ECCC97061101保藏，其中重链与轻链的互补决定区(CDR)序列如下：
重链
CDR1：SDYNWH
CDR2：YISYNGTTSYNPSLKS
CDR3：NDEKAWFAY
轻链
CDR1：KSSQSLLDSDGKTYLN
CDR2：LVSKLDS
CDR3：WQGTHFPHT。
在该重组抗体的一个优选方案中，它含有抗体IOR C5的CDR和构架区(FR)以及该抗体的轻链与重链的人恒定区，其中所述重链与轻链的构架氨基酸序列如下：
重链
FR1：DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSIT
FR2：WIRQFPGKGLEWMG
FR3：RISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAR
FR4：WGQGTLVTVSA
轻链
FR1：DVVMTQTPLTLSVTLGQPASISC
FR2：WLLQRPGQSPRRLIY
FR3：GVPDRFSGSGSGTDFALKIRRVEAEDLGVYYC
FR4：FGGGTKLEIKRKSTLTG。
在该重组抗体的另一个优选方案中，它在重链与轻链的构架区内具有任意下列点突变以降低免疫原性
重链：
10位ASP被GLY替代
17位SER被THR替代
43位ASN被LYS替代
44位LYS被GLY替代
轻链：
15位ILE被LEU替代
45位LYS被ARG替代
63位THR被SER替代。
本发明还提供了用于治疗直肠与结肠恶性肿瘤、其转移瘤和复发的药物组合物，包含前述任一个重组抗体和适合的赋形剂。
本发明还提供了用于直肠与结肠恶性肿瘤、其转移瘤和复发的体内定位和鉴定的药物组合物，包含前述任一个重组抗体。在该药物组合物的另一个方案中，还包含用于放射性标记锝99、铼186和铼188或类似物的化合物作为放射性标记物。
本发明还提供了从由杂交瘤产生的鼠单克隆抗体IOR C5衍生的重组抗体的单链Fv片段，所述杂交瘤以编号ECCC 97061101保藏，其中所述片断的重链与轻链的CDR和FR序列如下：
重链
CDR1：SDYNWH
CDR2：YISYNGTTSYNPSLKS
CDR3：NDEKAWFAY
FR1：DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSIT
ER2：WIRQFPGKGLEWMG
FR3：RISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAR
FR4：WGQGTLVTVSA
轻链
CDR3：WQGTHFPHT
FR1：DVVMTQTPLTLSVTLGQPASISC
FR2：WLLQRPGQSPRRLIY
FR4：FGGGTKLEIKRKSTLTG。
在该单链Fv片断的一个方案中，它在重链与轻链的构架区内具有任意下列点突变以降低免疫原性
重链：
10位ASP被GLY替代
17位SER被THR替代
43位ASN被LYS替代
44位LYS被GLY替代
轻链：
15位ILE被LEU替代
45位LYS被ARG替代
63位THR被SER替代。
本发明还提供了用于治疗直肠与结肠恶性肿瘤、其转移瘤和复发的药物组合物，包含前述任一个单链Fv片段和适合的赋形剂。
本发明还提供了用于直肠与结肠恶性肿瘤、其转移瘤和复发的体内定位和鉴定的药物组合物，包含前述任一个单链Fv片段。在该药物组合物的一个方案中，还包含用于放射性标记锝99、铼186和铼188或类似物的化合物作为放射性标记物。
本发明的详细描述
鼠C5的可变区的cDNA合成和基因扩增
从单克隆抗体C5的大约106个杂交瘤细胞中提取出胞质RNA(Vázques A.M.等，Year Immunol.Basel，Karger，第7期，137-145页，1993)。Faloro等人描述了提取RNA的方法(Faloro，J.，Treisman，R.，和Kemen，R.(1989)，《酶学方法》65：718-749)。cDNA合成反应包括5ug RNA(利用25皮摩尔在鼠IgG1恒定区开始和轻链鼠恒定к区杂交的指定引物获得)、2.5mM每种脱氧核苷酸(dNTPs)、50mM Tris-HCl pH7.5、75mM KCl、10mM DTT、8mM MgCl2和15u核糖核酸酶抑制剂(RNA guard，Pharmacia)，总体积为50ul。将样本在70℃下加热10分钟，历经30分钟缓慢冷却至37℃。然后加入100单位逆转录酶，在42℃下继续培养1小时。
利用聚合酶链反应(PCR)扩增轻链可变区(VK)和重链可变区(VH)。简单地说，将5μl VH或VK的cDNA与25皮摩尔特定引物、2.5mM各dNTP、5μl DNA聚合酶缓冲液10X和1单位该酶混合。对样本进行25次热循环，即94℃30秒、50℃30秒、72℃1分钟，最后在72℃下保温5分钟。
扩增后的cDNA的克隆化和测序
将纯化后的VH与VK cDNA克隆至TA载体(TA克隆试剂盒，Promega，USA)中。利用T7 DNA Pol(Pharmacia，Sweden)，按照双脱氧法对克隆体进行测序。
嵌合基因的构建
通过酶的限制从TA载体中得到轻链与重链可变区，克隆至表达载体中(Coloma M.J.等《免疫学方法杂志》152，89-104，1992)。
通过EcoRV和Nhel消化从TA载体中切割VH基因，并克隆在PAH4604表达载体中，其中包含了人恒定IgG1和组氨醇抗性基因。
所得构建体是C5VH-PAH4604。从TA EcoRV和Sall消化作用切割VK基因，并克隆在PAG4622中。这种载体含有对gpt和所用к人恒定区的抗性。所得构建体是C5VK-PAG4622。
嵌合抗体的表达
将NSO细胞用10μg C5VH-PAH4604和10μg C5VK-PAG4622电穿孔，并用Pvul消化使其线性化。将DNA混合在一起，用乙醇沉淀，并溶于25μl水。大约有107个NSO细胞生长至半铺满状态(semiconfluency)，离心收获之，在电穿孔杯内与所消化的DNA一起再悬浮在0.5ml DMEN中。在冰上5分钟后，给细胞一个170伏、960μF的脉冲，再在冰中放置30分钟。随后把细胞放入20ml DMEN加10％牛胚胎血清中，使其恢复48小时。此时将细胞分布在96孔平皿中，施用选择性培养基(DMEN、10％牛胚胎血清、0.8μg/ml霉酚酸、250μg/ml黄嘌呤)。10天之后可以用肉眼看到转染的克隆体。
用ELISA测量含有转染克隆体的小孔的培养基中的人抗体的存在。将微量滴定板的小孔涂以山羊抗人抗体(γ链特异性)。用PBST(含有0.02％Tween 20，pH7.5的磷酸盐缓冲盐水)洗涤之后，将来自含有转染体的小孔的100μl培养基加入到每个微量滴定孔中，在37℃下达1小时。小孔用PBST洗涤，加入轻链特异性缀合山羊抗人к抗体，在室温下保温一小时。小孔然后用PBST洗涤，加入含有二乙醇胺的底物缓冲液。30分钟后测量405nm处的吸收性。
通过T表位人源化构建人源化IOR C5h
T表位的预测
使用AMPHI程序分析IOR C5的可变区序列，此程序预测带有一个两亲性螺旋的长度为7或11个氨基酸的序列的区段，它们与T免疫原性相关。还使用了SOHHA程序，它预测疏水性螺旋(Elliot等，J.Immunol.138：2949-2952，(1987))。这些算法预测了与T表位在IOR C5的轻链和重链可变区中的呈递相关的片段。
对可变区同源性的分析
将IOR C5的可变域与相应的那些人可变域进行了比较，以辨别与鼠分子最为同源的人序列。使用的人序列数据库在Gene Bank和EMBL中报导过，两者都已经上网。比较是用一种自动的计算机化的方法进行的：PC-DOS HIBIO PROSIS 06-00，Hitachi。
对免疫原性降低的分析
这种方法的精髓就在于通过对可能的T细胞表位进行人源化以降低免疫原性，只在FR中进行了几个突变，具体说来就是在两亲性螺旋中进行几个突变，排除了在结合位点的三维结构中涉及到的位置。
在这种方法中，将鼠免疫球蛋白的VH和VK区与最为同源的人免疫球蛋白序列作了比较。这样就可能辨别鼠和人序列之间在FR区中只在两亲性区内部的不同的残基(Kabat E.(1991)Sequences ofproteins of immunological interest，Fifth Edition，NationalInstitute of Health)，只有这些鼠残基才会被那些处于相同位置的人序列所突变。
鼠构架中负责规范结构的那些残基或者在Vernier区的那些残基是不能被突变的，因为它们对于三级结构可能会有明显的影响，并可能影响到结合位点。制作一个可变区的三维分子模型可能会得到更多有关三级结构中替换的信息。
将人源化IOR C5抗体克隆化并在NSO细胞中表达
在进行完PCR重叠以得到突变和人源化的VH和VK之后，通过对T细胞表位进行人源化而得到的与IOR C5相应的遗传构建物被克隆至表达载体中，所采用的方法与表达嵌合抗体的方法相似，由此产生以下的质粒：C5VkhuPAG4622和C5Vhhu-PAH4604。这些基因对NSO细胞的转染是在与我们先前描述的与嵌合抗体完全一致的条件下进行的。
单链Fv片段的获得。scFv的构建和表达。
此方法包括首先使用PCR进行扩增，这可以修饰VH和VL序列，包括在表达载体中克隆的核酸内切酶限制位点。此扩增在精确的序列上使用了设计的寡核苷酸。扩增之后使用对应的限制酶对可变区进行纯化和消化。DNA片段被纯化并与表达载体连接。随后，遵循常规的方法在大肠埃希氏菌中表达这些遗传构建物。
在从生产细胞中提取蛋白质的过程中，进行一个利用超声波的破裂过程，这样就可能结合SDS聚丙烯酰胺电泳凝胶、硝基纤维素迁移和蛋白质印迹而分离可溶性及不溶性级分。
对蛋白质进行部分纯化，该纯化过程包括：(1)使用超声波和离心法分离可溶性和不溶性物质，(2)在低摩尔浓度的尿素中洗涤，在高浓度的尿素中增溶。对于增溶的物质利用对金属离子的亲和层析进行蛋白质纯化。随后将蛋白质针对缓冲剂进行复性。
实施例
例1.嵌合单克隆抗体的获得
VH和VK cDNA是从RNA获得的，该RNA是使用逆转录酶从产生单克隆抗体IOR C5的杂交瘤提取的。使用的特异性引物如下：
对于VH：
5′AGGTCTAGAA(CT)CTCCACACACAGG(AG)(AG)CCAGTGGATAGAC3′
对于VK：
5′GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG3′
链VH和VK的ADNc是这样扩增的，使用Taq聚合酶进行聚合酶链反应(PCR)，同时对VH使用特异性引物ECORV/NHEI限制位点，对VK使用ECORV/SALI。使用的特异性引物如下：
对于VH：
寡核苷酸1：
5′GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT3′
寡核苷酸2：
5′TGGGTCGAC(AT)GATGGGG(GC)TGTTGTGCTAGCTGAGGAGAC3′
对于VK：
寡核苷酸1：
5′GGGGATATCCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)(GA)CTCAG(CT)T(CT)3′
寡核苷酸2：
5′AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC3′
将PCR产物克隆在TA载体(TA克隆试剂盒，Invitrogen)中。采用双脱氧法使用T7 DNA Pol(Pharmacia)对12个独立的克隆体进行测序。VH和VK序列与Kabat的亚组-2有非常密切的关系。
随后，VH链用ECORV/NHEI消化，VK链用ECORV/SALI消化，然后将VH和VK分别克隆在PAH4604和PAG4622之中。这些载体是由Sherie Morrison(UCLA，California，USA)赠送的，将它们用于哺乳动物细胞中免疫球蛋白的表达。PAH4604载体已经包括了人恒定区IgG1，PAG4622具有人Ck(利用聚合酶链反应产生的可变区、表达抗体分子的新型载体，M.Josefina Coloma等《免疫学方法杂志》152(1992)，89-104)。克隆IOR C5区之后所得到的构建体为VHC5-PAH4604和VKC5-PAG4622。
将NSO细胞用10ug嵌合载体C5VH-PAH4604和10ugC5VK-PAG4622电穿孔，并用Pvul消化使其线性化。将DNA混合在一起，用乙醇沉淀，并溶于25ul水。大约有107个NSO细胞生长至半铺满状态，离心收获之，在电穿孔杯内与所消化的DNA一起再悬浮在0.5ml DMEN中。在冰上5分钟后，给细胞一个170伏、960uF的脉冲，再在冰中放置30分钟。随后把细胞放入20ml DMEN加10％牛胚胎血清中，使其恢复48小时。此时将细胞分布在96孔平皿中，施用选择性培养基(DMEN、10％牛胚胎血清、10mM组氨醇)。10天之后可以用肉眼看到转染的克隆体。
用ELISA测量含有转染克隆体的小孔的培养基中的嵌合抗体的存在。将微量滴定板的小孔涂以山羊抗人抗体(γ链特异性的，Sara lab)。用PBST(含有0.02％ Tween 20，pH7.5的磷酸盐缓冲盐水)洗涤之后，将来自含有转染体的小孔的20ul培养基加入到每个微量滴定孔中，在37℃下达1小时。小孔用PBST洗涤，加入轻链特异性的、碱性磷酸酶缀合山羊抗人к抗体，在室温下保温一小时。小孔然后用PBST洗涤，加入含有二乙醇胺的底物缓冲液。30分钟后测量405nm处的吸收性。
例2.不同版本人源化抗体的获得。
将VH和VK IOR C5序列与人序列数据库进行了比较，得到与IORC5最为人同源性的序列。
随后确定VH和VK区中两亲性区或可能的T细胞表位。
对于VH，在10和17位引入突变，氨基酸ASP和SER分别被GLY和THR取代。这些突变是用PCR重叠完成的，在第一PCR中使用引物1和2、3和4，这些PCR结果在使用引物2和4的第二PCR中被重叠，其序列如下(Kamman，M.，Laufs，J.，Schell，J.，Gronemborg，B.“聚合酶链反应(PCR)对DNA的快速插入诱变”《核酸研究》17：5404，1989)：
用于重链突变10和17的引物。
引物1：
5′GAGTCAGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGACACTTTCACTCACC 3′
引物2：
5′TGGGTCGAC(AT)GATGGGG(GC)TGTTGTGCTAGCTGAAGAGAC 3′
引物3：
5′GGTGAGTGAAAGTGTCTGAGAAGGTTTCACCAGGCCAGGTCCTGACTC 3′
引物4：
5′GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT 3′
前面的突变通过测序而校验之后，向该突变后的DNA引入新的突变，在43和44位引入的新突变是LYS和GLY，分别取代ASN和LYS。重叠操作的进行与以前的重叠相同。突变通过测序而得到校验，这种新的构建体被称为C5VHhu。
在这些突变中涉及到的引物是：
用于重链中突变43和44的引物。
引物1：
5′CAGTTTCCAGGAAAAGGACTGGAATGGATG 3′
引物2：
5′TGGGTCGAC(AT)GATGGGG(GC)TGTTGTGCTAGCTGAAGAGAC 3′
引物3：
5′CATCCATTCCAGTCCTTTTCCTGGAAACTG 3′
引物4：
5′GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT 3′
对于VK来说，突变在15、45和63位上进行，分别用LEU、ARG和SER取代ILE、LYS和THR。
如前文所述通过重叠PCR引入突变。所用引物的序列如下。新的遗传构建体被命名为C5Vkhu。
用于轻链的突变15的引物。
引物1：
5′TTGTCGGTTACCCTTGGACAACCAGCC 3′
引物2：
5′AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3′
引物3：
5′GGCTGGTTGTCCAAGGGTAACCGACAA 3′
引物4：
5′GGGGATATCCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)(GA)CTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GT
用于轻链的突变45的引物。
引物1：
5′GGCCAGTCTCCAAGGCGCCTAATCTAT 3′
引物2：
5′AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3′
引物3：
5′ATAGATTAGGCGCCTTGGAGACTGGCC 3′
引物4：
5′GGGGATATCCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)(GA)CTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GT
用于轻链的突变63的引物。
引物1：
5′CCTGACAGATTCAGTGGCAGTGGATCA 3′
引物2：
5′AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3′
引物3：
5′TGATCCACTGCCACTGAATCTGTCAGG 3′
引物4：
5′GGGGATATCCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)(GA)CTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GT
所有突变都通过序列加以校验。
将人源化VK和VH克隆至载体PAG4622和PAH4604载体中，得到下列构建体：C5Vkhu-PAG4622和C5VHhu-PAH4604。
将NSO细胞用10μg人源化C5VHhu-PAH4604和10μgC5VKhu-PAG4622电穿孔。这些载体用PVUI消化而线性化。
表达人源化抗体IOR C5h的克隆体的电穿孔和检测与前述嵌合抗体相同。
例3：单链Fv片段的构建
从IORC5mAb的可变域(VH和VL)构建scFv片段(VH-连接体-VL)。克隆至表达载体中以在大肠埃希氏菌中表达。
步骤(a)scFv.-的构建
该方案具有第一轮的PCR扩增，修饰测序后的VH和VL区，包括限制核酸内切酶位点以便克隆至表达载体pPACIB.7plus和pPACIB.9plus中。在扩增过程中使用在精确序列下设计的寡核苷酸。
重链：
4066：EcoRV-FR1-VH
5′.GG GATATCTGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGA..3′
4255：EcoRV-FR4-VH
5′..CA GGATATCGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC..3′
轻链：
2938：Sall-FR1-VL
5′.C GTCGACGATATCCAGATGAC(AC)CA(GA)ACT(AC)C..3′
2935：Apal-FR4-VL
5′.AT GGGCCCTTT(TC)A(TG)(TC)TCCAGCTTGGT..3′
扩增各区后，纯化并消化VH(EcoRV)和VL(Sall-Apal)。纯化和用pPACIB.9plus和pPACIB.7plus载体连接DNA片段，所述载体以前用限制酶消化过。
修饰质粒pPACIB.7plus，以输出到周质异源蛋白中，这些蛋白质的基因是在大肠埃希氏菌中表达的。该质粒含有调节序列，以获得下列功能：启动子序列(色氨酸)、信号肽序列(OMPA)、接头肽序列(Chaudhary等，1990)以及一个由在成熟蛋白质C端编成的6个组氨酸组成的域，有助于这种蛋白质的纯化(Gavilondo，J.V.等，第四界抗体工程年会论文集。IBC Conference Inc.Coronado，CA.1993年12月8-10日)。
修饰质粒pPACIB.9plus(图1)，以在胞质异源蛋白中表达，这些蛋白质的基因是在大肠埃希氏菌中表达的。该质粒含有调节序列，以获得下列功能：启动子序列(色氨酸)、为获得有效蛋白质表达而从IL-2h衍生的27aa片段以及一个由在成熟蛋白质C端编成的6个组氨酸组成的域，有助于这种蛋白质的随后纯化(Gavilondo，J.V.等，第四界抗体工程年会论文集。IBC Conference Inc.Coronado，CA.1993年12月8-10日)。
将PCR反应产物用于转化感受态大肠埃希氏菌细胞(MC1061株)，这些细胞平板接种在固体选择性培养基中，在37℃下生长。为了选择重组载体，将菌落接种在液体培养基中，从该培养物中提取质粒DNA(分子克隆实验室手册，第二版，1989，Sambrook，Fritsch andManiatis)。质粒DNA按照克隆步骤用EcoRV、Sall/Apal、Xhol/Apal消化，涂上琼脂糖凝胶并在UV光下观察，在具有两个带的消化模式的克隆体之间选择重组克隆体，二者之一相当于pPACIB.7和9plus(约2.9kb)，另一个相当于预期的域(约320pb VH或VL和对于scFv的720pb)。对于VH域来说，通过DNA测序检查插入取向。
步骤(b)从IOR C5 Mab的可变域基因得到的scFv在大肠埃希氏菌中的表达
使用(a)中选择的两种重组质粒转化四种大肠埃希氏菌菌株(TG1，coliB，W3110和MM294)，以研究克隆化基因表达。主要地，重组细菌在37℃下、在含有氨苄青霉素的液体培养基(LB)中生长过夜。将这些培养物接种在含有氨苄青霉素的新鲜培养物上，在37℃下培养3小时。然后向培养物中加入β-吲哚丙烯酸(色氨酸启动子诱导剂)，诱发蛋白质的表达。在SDS聚丙烯酰胺凝胶中的12％下样本分析表明，在这些条件下、在用于构建pPACIB.7plus的周质部分中表达了约28kDa蛋白质，在pPACIB.9plus中有30kDa带用于重组克隆，它是在TG1中表达的，占总细菌蛋白的6-11％。利用从抗IOR C5 Mab的Fab片段的兔中获得并经过免疫纯化的抗血清进行蛋白质印迹测定(分子克隆实验室手册第二版，1989，Sambrook，Fritsch and Maniatis)，证明这种蛋白质相当于IOR C5的scFv。
例4.从细菌培养物获取scFv，抗原复性化和识别测定。
步骤(a).从pPACIB.9plus.-中的重组克隆体提取IOR C5的scFv和复性化。
在从生产细胞提取蛋白质的过程中使用破裂超声波法，可以分离可溶性和不溶性级分，并结合SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶，转移至硝基纤维素和蛋白质印迹法，证明蛋白质残余在不溶性细菌级分中。
在这些环境下，在一个过程中部分纯化蛋白质，该过程包括以下步骤：
(1)使用超声波和离心法分离可溶性和不溶性物质，
(2)在低摩尔浓度尿素(2M)中洗涤，和
(3)增溶至高摩尔浓度尿素(6M)。
用金属离子亲合色谱法从增溶的物质中纯化蛋白质，并针对缓冲溶液使其复性化。
步骤(b).scFv-IORC5片段对肿瘤细胞的结合测定。
细胞系：
细胞是从Centor de Inmunologia Molecular获得的。在37℃下、在6％CO2中，使SW948腺癌细胞系在补充有10％牛胚胎血清的L-15培养基中生长。使用Raji细胞系(Burkitt人淋巴瘤)和Hut 78(T人细胞系)作为阴性对照。
在37℃下，使这些细胞系在补充有10％牛胚胎血清的RPMI 1629中生长。
将细胞悬液固定在含有1％牛血清白蛋白的PBS中，浓度为106个细胞/ml。向每孔中加入10ul细胞悬液。将玻片在无灰尘的空气中干燥3小时，固定在丙酮-甲醇(1∶1)溶液中5分钟，在TBS中水合10分钟。最后，利用免疫细胞化学测定法加工细胞。
通过免疫过氧化物酶工艺，利用免疫细胞化学测定法测定scFv IORC5片段的活性。将细胞与单链Fv IOR C5在37℃下培养2小时，然后与抗Fab血清和与缀合抗鼠过氧化物酶(HRPO)培养，各在室温下培养30分钟。利用含有5mg 3-3二氨基联苯胺，5ml TBS和5μl H2O2，30％的溶液，使过氧化物酶的定位位点变得可见。在两次培养之间，玻片用冷TBS洗涤。
在水中引入后，将玻片与Mayer的Hematoxilline相对照，加入Canadian Balsam。每次实验包括阳性和阴性对照。
免疫细胞化学研究揭示，该片段仅对SW948细胞系显示阳性，说明与完全Mab相比，它是适度标记的，证明了scFv IOR c5对这种细胞系的特异性识别。标记与恶性结肠细胞中的膜和胞质区室有关。
附图的简要说明。
图1：显示质粒pPACIB.9plus的遗传构建，该质粒是经过修饰以在大肠埃希氏菌胞质中表达融合蛋白的质粒。该质粒含有调节序列，以获得下列功能：启动子序列(色氨酸)、为获得有效蛋白质表达而从IL-2h衍生的27aa片段以及一个在成熟蛋白质C端中编成的6个组氨酸的域(将在这种蛋白质的纯化过程中使用)。
                   序列表
<110>CENTRO DE INMUNOLOGIA MOLECULAR
     MATEO DE ACOSTA DEL RIO，Maria Cristina
(仅对美国的申请人)
ROQUE NAVARRO，Lourdes Tatiana
(仅对美国的申请人)
MORALES MORALES，Alejo
(仅对美国的申请人)
PEREZ RODRIGUEZ，Rolando
(仅对美国的申请人)
AYALAAVILA，Marta
(仅对美国的申请人)
GAVILONDO COWLEY，Jorge Victor
(仅对美国的申请人)
DUENAS PORTO，Marta
(仅对美国的申请人)
BELL GARCIA，Hanssel
(仅对美国的申请人)
RENGIFO CALZADO，Enrique
(仅对美国的申请人)
IZNAGA ESCOBAR，Normando
(仅对美国的申请人)
RAMOS ZUZARTE，Mayra
(仅对美国的申请人)
<120>识别抗原IOR C2的抗体和FV片段
<130>CIM
<140>PCT/CU00/00004
<141>2000-11-16
<160>14
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>6
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(6)
<223>重链重组抗体和scFv片断的CDR1
<400>1
Ser Ala Tyr Asn Trp His
  1               5
<210>2
<211>16
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(16)
<223>重链重组抗体和scFv片断的CDR2
<400>2
Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
  1               5                  10                  15
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(9)                <223>
重链重组抗体和scFv片断的CDR3
<400>3
Asn Asp Glu Arg Ala Trp Phe Ala Tyr
  1               5
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(16)
<223>轻链重组抗体和scFv片断的CDR1
<400>4
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
  1               5                  10                  15
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(7)
<223>轻链重组抗体和scFv片断的CDR2
<400>5
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
  1               5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(9)
<223>轻链重组抗体和scFv片断的CDR3
<400>6
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro His Thr
  1               5
<210>7
<211>30
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(30)
<223>重链嵌合抗体和scFv片断的FR1
<400>7
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
             20                  25                  30
<210>8
<211>14
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(14)
<223>重链嵌合抗体和scFv片断的FR2
<400>8
Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
  1               5                  10
<210>9
<211>32
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(32)
<223>重链嵌合抗体和scFv片断的FR3
<400>9
Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln
  1               5                 10                  15
Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(11)
<223>重链嵌合抗体和scFv片断的FR4
<400>10
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
  1               5                 10
<210>11
<211>23
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(23)
<223>轻链嵌合抗体和scFv片断的FR1
<400>11
AsP Trp Trp Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Leu Gly
  1               5                 10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys
            20
<210>12
<211>15
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(15)
<223>轻链嵌合抗体和scFv片断的FR2
<400>12
Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu lle Tyr
  1               5                 10                  15
<210>13
<211>32
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(32)
<223>轻链嵌合抗体和scFv片断的FR3
<400>13
Gly Val pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ala
  1               5                 10              15
Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
             20                  25                  30
<210>14
<211>17
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>域
<222>(1)..(17)
<223>轻链嵌合抗体和scFv片断的FR4
<400>14
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lle Lys Arg Lys Ser Thr Leu Thr
  1               5                  10                  15
Gly

Claims (17)

1.从由杂交瘤产生的鼠单克隆抗体IOR C5衍生的与ior C2抗原复合体相互作用的重组抗体，所述杂交瘤以编号ECCC 97061101保藏，其中重链与轻链的互补决定区(CDR)序列如下：
重链
CDR1：S D Y N W H
CDR2：Y I S Y N G T T S Y N P S L K S
CDR3：N D E K A W F A Y
轻链
CDR1：K S S Q S L L D S D G K T Y L N
CDR2：L V S K L D S
CDR3：W Q G T H F P H T。
2.根据权利要求1的重组抗体，它含有抗体IOR C5的CDR和构架区(FR)以及该抗体的轻链与重链的人恒定区，其中所述重链与轻链的构架氨基酸序列如下：
重链
FR1：D V Q L Q E S G P G L V K P S Q T L S L T C T V T G Y S I T
FR2：W I R Q F P G K G L E W M G
FR3：R I S I T R D T S K N Q F F L Q L N S V T T E D T A T Y Y C A R
FR4：W G Q G T L V T V S A
轻链
FR1：D V V M T Q T P L T L S V T L G Q P A S I S C
FR2：W L L Q R P G Q S P R R L I Y
FR3：G V P D R F S G S G S G T D F A L K I R R V E A E D L G V Y Y C
FR4：F G G G T K L E I K R K S T L T G。
3.根据权利要求1的重组抗体，它在重链与轻链的构架区内具有任意下列点突变以降低免疫原性
重链：
10位ASP被GLY替代
17位SER被THR替代
43位ASN被LYS替代
44位LYS被GLY替代
轻链：
15位ILE被LEU替代
45位LYS被ARG替代
63位THR被SER替代。
4.表达权利要求1至3任一项的重组抗体的细胞系。
5.用于治疗直肠与结肠恶性肿瘤、其转移瘤和复发的药物组合物，包含权利要求1至3任一项的重组抗体和适合的赋形剂。
6.用于直肠与结肠恶性肿瘤、其转移瘤和复发的体内定位和鉴定的药物组合物，包含权利要求1至3任一项的重组抗体。
7.根据权利要求6的药物组合物，还包含用于放射性标记锝99、铼186和铼188或类似物的化合物作为放射性标记物。
8.权利要求1至3任一项的重组抗体在制备用于治疗直肠与结肠恶性肿瘤、其转移瘤和复发的药物中的用途。
9.权利要求1至3任一项的重组抗体在制备用于诊断直肠与结肠恶性肿瘤、其转移瘤和复发的药物中的用途。
10.从由杂交瘤产生的鼠单克隆抗体IOR C5衍生的重组抗体的单链Fv片段，所述杂交瘤以编号ECCC 97061101保藏，其中所述片断的重链与轻链的CDR和FR序列如下：
重链
CDR1：S D Y N W H
CDR2：Y I S Y N G T T S Y N P S L K S
CDR3：N D E K A W F A Y
FR1：D V Q L Q E S G P G L V K P S Q T L S L T C T V T G Y S I T
FR2：W I R Q F P G K G L E W M G
FR3：R I S I T R D T S K N Q F F L Q L N S V T T E D T A T Y Y C A R
FR4：W G Q G T L V T V S A
轻链
CDR1：K S S Q S L L D S D G K T Y L N
CDR2：L V S K L D S
CDR3：W Q G T H F P H T
FR1：D V V M T Q T P L T L S V T L G Q P A S I S C
FR2：W L L Q R P G Q S P R R L I Y
FR3：G V P D R F S G S G S G T D F A L K I R R V E A E D L G V Y Y C
FR4；F G G G T K L E I K R K S T L T G。
11.根据权利要求10的单链Fv片断，它在重链与轻链的构架区内具有任意下列点突变以降低免疫原性
重链：
10位ASP被GLY替代
17位SER被THR替代
43位ASN被LYS替代
44位LYS被GLY替代
轻链：
15位ILE被LEU替代
45位LYS被ARG替代
63位THR被SER替代。
12.表达权利要求10或11的单链Fv片段的细胞系。
13.用于治疗直肠与结肠恶性肿瘤、其转移瘤和复发的药物组合物，包含权利要求10或11的单链Fv片段和适合的赋形剂。
14.用于直肠与结肠恶性肿瘤、其转移瘤和复发的体内定位和鉴定的药物组合物，包含权利要求10或11的单链Fv片段。
15.根据权利要求14的药物组合物，还包含用于放射性标记锝99、铼186和铼188或类似物的化合物作为放射性标记物。
16.权利要求10或11的单链Fv片断在制备用于治疗直肠与结肠恶性肿瘤、其转移瘤和复发的药物中的用途。
17.权利要求10或11的单链Fv片断在制备用于诊断直肠与结肠恶性肿瘤、其转移瘤和复发的药物中的用途。
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