CN101080496A

CN101080496A - 抗体工程改造方法

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Publication number: CN101080496A
Application number: CNA2005800432521A
Authority: CN
Inventors: F·J·R·D·库托; K·B·亨德里克斯; S·E·华莱士; 余国良
Original assignee: Epitomics Inc
Current assignee: Epitomics Inc
Priority date: 2004-11-08
Filing date: 2005-11-02
Publication date: 2007-11-28
Also published as: CA2901238A1; CN103980362A; US7462697B2; US8404816B2; CA2901238C; JP2012095654A; WO2006050491A3; DE602005027737D1; US20090155824A1; WO2006050491A2; ES2362792T3; EP1819830A2; JP5096611B2; US20120003671A1; PT1819830E; DK1819830T3; US7960517B2; ATE507302T1; US10613094B2; CA2585742C

Abstract

本发明提供了一种鉴定抗体位置的方法，所述位置可以进行修饰而不会明显减弱抗体的结合活性。在许多实施方案中，该方法包括在亲本抗体中通过比较它的氨基酸序列与多种相关抗体的氨基酸序列来鉴定可取代位置，所述相关抗体每一种都与亲本抗体结合相同的抗原。可以将可取代位置上的氨基酸取代为不同的氨基酸，而不会显著影响抗体的活性。在人源化方法中，或在其它抗体工程改造方法中，本发明的方法可以用于改变CDR的氨基酸序列，而不会显著减弱抗体的亲和力。本发明可以用在许多治疗、诊断和研究应用中。

Description

抗体工程改造方法

发明领域

本发明领域为抗体，特别是工程改造，例如人源化单克隆抗体的方法。

发明背景

因为单克隆抗体能够高度特异性地靶向几乎任何分子，因此其具有成为未来主要治疗剂的潜力。尽管这种潜力在几年前就被认知，但是首次对此验证的尝试令人失望，因为治疗中使用的单克隆抗体引起患者剧烈的免疫反应(Schroff，1985 Cancer.Res.45：879-85，Shawler.J Immunol 1985 135：1530-5)，甚至低剂量也会发生(Dillman，Cancer Biother.1994 9：17-28)。科学家预测人抗体将不会导致如此有害的免疫反应。然而却没有一种合适的产生人单克隆抗体的方法。制造人抗体的备选技术例如使用噬菌体展示和转基因动物近来已得到发展，但没有广泛用于治疗目的。

抗体的免疫原性依赖很多因素，包括给药方法、注射次数、剂量、缀合性质、使用的特异性片段、聚集状态和抗原性质(例如Kuus-Reichel，Clin.Diagn.Lab.Immunol.1994 1：365-72)。这些因素中的许多或大部分能进行操控来降低免疫反应。然而如果最初的抗体序列被认为是“危险的”或是“外源的”，那么剧烈的免疫反应可能迟早会阻止该抗体在治疗中的应用。

为了降低这些反应，人们尽力使用重组DNA技术用人序列替代尽可能多的抗体的非人序列。为了这一目的，使用了嵌合抗体，这种抗体含有人抗体的轻链和重链恒定区，该恒定区与鼠抗体的轻链和重链可变区相连。嵌合抗体在可变区仍含有大量的非人类氨基酸序列，这样的话，针对这类抗体可能会产生显著的免疫反应。CDR稼接是另一种人源化技术，其中单克隆抗体的抗原结合部分或者是“互补决定区”(CDR)通过重组DNA技术移植到人抗体重链和轻链的编码框架的DNA序列(如非CDR区)中。CDR移植抗体的一个技术问题是它们通常显示相当大的亲和力下降。为了重新增加CDR移植抗体的亲和力，某些原始的主要框架残基(如认为与决定CDR构象有关的残基)被重新引入CDR移植抗体。应用另一种人源化方法，Roguska设计了一种针对鼠抗体的“表面重塑”策略，其中只取代与人抗体的暴露残基不同的暴露残基。

然而，尽管通过以上方法人源化的抗体在人类患者中可显示出降低的免疫原性(Moreland，Arthritis Rheum 1993 36：307-18)，但是许多人源化抗体对大部分患者而言仍具有高度免疫原性。人们认为这是因为CDR自身具有免疫原性(Ritter，Cancer Res 2001 61：6851-9；Welt，Clin Cancer Res 2003 9：1338-46)。

以上所述的所有方法都要求非人抗体的CDR区在人源化过程中保持不变以便维持抗体的特异性和亲和力。然而，既然非人CDR区在人体内自身具有免疫原性，就极其需要人源化非人抗体的CDR区又不使抗体的结合活性显著下降的方法。人源化非人抗体的CDR区的合适方法的鉴定对于医学和研究机构来说一直是一项十分艰巨的任务。

因此，一直需要一种制备在人和其他哺乳动物宿主中具有较小免疫原性的非人抗体的改良方法。特别是，需要一种降低人体中非人抗体CDR区的免疫原性的人源化方法。本发明满足这种以及其他的需要。

文献

相关参考文献包括：美国专利6,331,415 B1，5,225,539，6,342,587，4,816,567，5,639,641，6,180,370，5,693,762，4,816,397，5,693,761，5,530,101，5,585,089，6,329,551，和出版物Morea等人，Methods 20：267-279(2000)，Ann.AllergyAsthma Immunol.81：105-119(1998)，Rader等人，J.Biol.Chem.276：13668-13676(2000)，Steinberger等人，J Bio.Chem.275：36073-36078(2000)，Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.91：969-973(1994)，Delagrave等人，Prot.Eng.12：357-362(1999)，Rogusca等人，Prot.Eng.9：895-904(1996)，Knight和Becker，Cell 60：963-970(1990)；Becker和Knight，Cell 63：987-997(1990)Popkov，J MoI Biol 325：325-35(2003)；Rader等人，Proc.Natl.Acad.Sci.95：8910-8915；Mehr等人，J Immunol.172：4790-6(2004)和De Pascalis等人，J Imm.2002，169：3076-3084。

发明概述

本发明提供一种鉴定抗体位置的方法，可对该抗体进行修饰而不会使其结合活性显著下降。在很多实施方案中，该方法涉及亲本抗体可取代位置的鉴定，它将亲本抗体的氨基酸序列与许多相关抗体的氨基酸序列进行比较，这些相关抗体每一个都结合与亲本抗体一样的抗原和表位。位于可取代位置的氨基酸可以被不同的氨基酸取代，且不会显著影响抗体活性。在人源化方法或其他抗体工程方法中，本发明的方法可以用于改变CDR的氨基酸序列且不会显著降低抗体的亲和力。本发明可用在大量的治疗、诊断和研究应用方面。

本发明的这些和其他优点和特征对于阅读了以下本发明更详细的描述的本领域技术人员而言是显而易见的。

附图简述

图1是说明本发明一个实施方案的流程图。

图2是氨基酸序列比对，阐示了可以用于鉴定CDR区内可取代位置的示例方法。从上至下，图2显示的氨基酸序列为SEQ ID NOS：1-11。

图3是显示示例氨基酸序列比对的两个方框，阐示抗体的CDR区可被人源化的一种示例方法的一方面。从上至下，图3显示的氨基酸序列为SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：15。

图4是示例氨基酸序列比对。从上至下，图4显示的氨基酸序列为SEQ ID NOS：16-25。上部显示β链位置。采用的编号系统(见下面的Chothia)在上部附近显示。以下位置表示：c：CDR接触物；i：VK/VH的接触面；b：内部包埋残基(见下面的Padlan)以及C为CDR残基。这些序列按常规标记。

图5显示兔抗体的20个示例VH3区的氨基酸序列。从上至下，图5显示的氨基酸序列为SEQ ID NOS：26-45。

图6是示例氨基酸序列比对，阐示兔抗体可被人源化的一种示例方法的一方面。从上至下，图6显示的氨基酸序列为SEQ ID NOS：46-48。

图7显示示例氨基酸序列比对，阐示如何制备抗体的共有序列。

定义

在对本发明做进一步描述之前，本发明应被理解为不局限于所描述的特定实施方案，因为这些当然会发生变化。还应理解此处使用的术语只是为了描述特定实施方案，并不意味着起限定作用，因为本发明的范围只受所附的权利要求的限制。

除非另外限定，此处使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义一致。尽管与此处描述类似或相同的任何方法和材料都能用于实施或验证本发明，现在对优选的方法和材料进行描述。将本文提到的所有出版物并入本文作为参考文献，以公开和描述与引用该出版物相关的方法和/或材料。

必须注意的是此处和所附的权利要求中使用的单数形式″a″、″and″和″the ″除非有明确指示，都包括复数对象。如，提到“一种抗体”包括多种这类抗体，提到“一个构架区”包括一个或多个构架区和本领域技术人员知晓的其等同物，等等。

本文所讨论的出版物只是用来提供其在本申请的申请日之前的公开内容。本文不应被视为承认由于在先发明根据这些出版物可以预期本发明。此外，提供的出版物的日期可能与实际出版日期不同，这可能需要单独核实。

此处使用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用。这些术语是本领域技术人员所熟知的，并且是指由特异性结合抗原的一个或多个多肽组成的蛋白质。抗体的一种形式构成抗体的基本结构单元。这种形式为四聚物，由两对相同的抗体链组成，每一对有一条轻链和一条重链。每一对的轻链和重链可变区一起负责结合抗原，恒定区负责抗体效应子功能。

鉴定的免疫球蛋白多肽包括κ链和λ轻链以及α，γ(IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄)，δ，ε和μ重链或其他物种中的等同物。全长免疫球蛋白“轻链”(约25kDa或约214个氨基酸)包括NH₂端约110个氨基酸的可变区和COOH端的κ或λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链”(约50kDa或约446个氨基酸)类似地也包含可变区(约116个氨基酸)和上述重链恒定区之一，如γ(约330个氨基酸)。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白；保留抗原结合特异性的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段；嵌合抗体；人源化抗体；单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。这些抗体能可检测地标记，如使用放射性同位素、能产生可检测产物的酶、荧光蛋白等等。这些抗体能进一步与其他部分缀合，如特异结合对的成员，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异结合对的成员)等等。这些抗体也能结合到固体支持物上，包括但不局限于聚苯乙烯板或珠等等。该术语还包括Fab′、Fv、F(ab′)₂和/或其他保留抗原结合特异性的抗体片段和单克隆抗体。

抗体可能以很多其他形式存在，包括，如Fv、Fab和(Fab′)₂，以及双功能(即双特异性)杂合抗体(如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17，105(1987))和单链形式(如Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird等人，Science，242，423-426(1988)，收录于此用作参考)。(一般参见Hood等人，″Immunology″，Benjamin，N.Y.，2nd ed.(1984)和Hunkapiller和Hood，Nature，323，15-16(1986)，)。

免疫球蛋白的轻链或重链可变区由被三个超变区间断的构架区(FR)组成，也称为“互补决定区”或“CDR”。构架区和CDR的范围已被精确界定(参见″Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，″E.Kabat等人，U.S.Department of Health and HumanServices，(1991))。同一物种不同的轻链和重链构架区序列相对保守。抗体的构架区，即轻链和重链组分的结合构架区用于定位和校准CDR。CDR主要负责结合抗原的表位。

嵌合抗体是其轻链和重链基因经过构建的抗体，特别是利用基因工程改造属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因。例如，可以将鼠单克隆抗体基因的可变区段连接到人抗体恒定区段如γ1和γ3。一例治疗用嵌合抗体是一种杂合蛋白质，它由来源于兔抗体的可变区或抗原结合区和来源于人抗体的恒定区或效应区构成(如由A.T.C.C保藏编号CRL 9688的细胞制备的抗Tac嵌合抗体)，尽管也可以使用其他的哺乳动物物种。

此处使用的术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”是指非人(如鼠或兔)抗体，它包含被人抗体中相应位置上的氨基酸取代的一个或多个氨基酸(例如在构架区、恒定区或CDR中)。通常人源化抗体与同一种抗体的非人源化形式相比，会在人宿主中产生降低的免疫反应。

可以理解本发明设计和生产的人源化抗体可能具有附加的保守性氨基酸取代，它们对抗原结合或其他抗体功能基本上没有影响。保守性取代意指例如来自以下群组的组合：gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg和phe、tyr。未存在于同一组中的氨基酸是“基本上不同的”氨基酸。

术语“特异性结合”是指抗体优先结合存在于不同分析物的均质混合物中的特定分析物的能力。在某些实施方案中，特异性结合的相互作用将会把样品中需要的和不需要的分析物区分开，在一些实施方案中超过约10-100倍或者更高(例如超过约1000或10,000倍)。

在某些实施方案中，捕获物和分析物之间的亲和力当它们在捕获物/分析物的复合物中特异性结合时由K_D(解离常数)来表征，它低于10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或者约10^-12M或更低。

“紧密接触”、“极为接近”或与另一个氨基酸残基“极为接近”的氨基酸残基是具有与另一个氨基酸的侧链接近，即，在7、6、5或4埃以内的侧链的氨基酸残基。例如接近CDR的氨基酸为非CDR氨基酸，它的侧链接近于CDR中的一个氨基酸的侧链。

抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。所有区域、CDR和残基号以序列比对和结构知识为基础进行指定。构架区和CDR残基的鉴定和编号按Chothia和其他人所述(Chothia Structuraldeterminants in the sequences of immunoglobulin variable domain.J MoI Biol 1998；278：457-79)。

VH是抗体重链的可变区。VL是抗体轻链的可变区，它可能具有κ和λ同种型。K-1抗体具有κ-1同种型而K-2抗体具有κ-2同种型，VL为可变λ轻链。

“包埋残基”是一种氨基酸残基，其侧链的相对溶剂可及性小于50％，这是以相对于位于扩展的GGXGG肽中相同残基X而言溶剂可及性的百分比计算得出。计算溶剂可及性的方法为本领域公知(Connolly1983 J.appl.Crystallogr，16，548-558)。

此处所用的术语“确定，”“测量，”“评估”和“测定”可互换使用，并且包括定量的和定性的确定。

此处术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指任一长度氨基酸的聚合形式，可以包括编码和非编码氨基酸，化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，和肽主链经过修饰的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于，具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列，含有或不含N端蛋氨酸残基的融合；免疫标记蛋白；具有可检测融合配偶体的融合蛋白，如包括荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等作为融合配偶体的融合蛋白；等等。多肽可以具有任何大小，术语“肽”是指长度为8-50个残基(如8-20个残基)的多肽。

此处所用术语“分离的”当应用于分离的抗体的情况中时，是指至少60％、至少75％、至少90％、至少95％、至少98％甚至至少99％在纯化前不含与该抗体结合的其他成分的相关抗体。

此处所用术语“治疗”等等是指对哺乳动物的任何疾病或病症的任何治疗，如特别是人或小鼠，并且包括：a)预防疾病、病症或疾病或病症的症状，使其在可能易罹患该疾病但尚未诊断出患病的受试者中不发生；b)抑制疾病、病症或疾病或病症的症状，如在患者中阻止它的发展和/或延迟它的发作或表现；和/或c)缓解疾病、病症或疾病或病症的症状，如引起病症或疾病和/或其症状的消退。

术语“受试者”，“宿主”，“患者”和“个体”在此可互换使用，是指需要诊断或治疗的任何哺乳动物受试者，特别是人。其他受试者可包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。

“相应的氨基酸”，下面会做更详细的描述，指的是当两个或多个氨基酸序列比对时，位于相同位置(也就是它们位于彼此对面)的氨基酸残基。抗体序列比对和编号的方法在Chothia，见上，Kabat，见上和其他中得到详尽阐述。本领域已知(参见如Kabat 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，DHHS，Washington，DC)有时可以在抗体的一个或两个氨基酸中制造一个、两个或三个缺口和/或插入至多1、2、3或4个残基或者至多约15个残基(特别是在L3和H3 CDR中)，从而完成一次比对。

“天然”抗体是指与由诸如噬菌体展示技术制得的非天然成对抗体不同，抗体免疫球蛋白的重链和轻链已经由多细胞生物体的免疫系统进行了自然选择的抗体。由此，本发明的亲本抗体通常不包含任何病毒(如细菌噬菌体M13)衍生的序列。脾脏、淋巴结和骨髓是产生天然抗体的组织的实例。

“可取代位置”，下面会做更详细的描述，指的是抗体的一个特殊位置，其可以被不同的氨基酸取代而不会使抗体的结合活性显著降低。鉴定可取代位置的方法和它们如何可以被取代在下面进行更加详细的描述。可取代位置也可以称为“变异耐受位置”。

“亲本”抗体，下面会做更详细的描述，是指作为氨基酸取代靶的抗体。在某些实施方案中，“供体”抗体会将氨基酸“捐赠”给亲本抗体以生成改变的抗体。

“相关抗体”，下面会做更详细的描述，是指具有相似序列并且由具有共同B细胞祖先的细胞产生的抗体。这种B细胞祖先含有具有重排轻链VJC区和重排重链VDJC区的基因组，并且产生还未经历亲和力成熟的抗体。存在于脾脏组织中的“原初”或“原始”B细胞是B细胞共同祖先的示例。相关抗体与相同的抗原表位结合并且在序列上通常极为相似，特别是在它们的L3和H3 CDR中。相关抗体的H3和L3 CDR都具有相同的长度和近乎一致的序列(即，有0，1或2个残基不同)。相关抗体通过共同抗体祖先，也就是原初B细胞祖先产生的抗体相关联。术语“相关抗体”并不打算描述不具有B细胞产生的共同抗体祖先的一组抗体。

优选实施方案的详细描述

本发明提供一种鉴定抗体位置的方法，其可以经过修饰，但不会显著降低抗体结合活性。在很多实施方案中，该方法涉及鉴定亲本抗体中的可取代位置，将亲本抗体的氨基酸序列与大量相关抗体的氨基酸序列进行比较，所述相关抗体每一个都结合到与亲本抗体一样的抗原和表位上。可取代位置上的氨基酸能被不同的氨基酸取代，且不会显著影响抗体活性。在人源化方法或其他抗体工程改造方法中，本发明的方法可以用于改变CDR的氨基酸序列且不会显著降低抗体的亲和力。本发明可以用于许多治疗、诊断和研究应用上。

在本发明的进一步描述中，首先讨论鉴定变异耐受位置的方法，其次是对使用该方法的不同方案的描述。

鉴定抗体变异耐受位置的方法

如上所述，本发明提供鉴定抗体变异耐受，即可取代位置的方法。一旦这个位置被鉴定，这个位置上的氨基酸就会被不同的氨基酸取代，且不会显著降低抗体的结合活性。这种方法特别适用于需要鉴定抗体区域中的可取代残基的方法，该抗体被认为是抗原结合所必需的。例如，本发明的方法可以用于鉴定抗体CDR区域中的可取代位置。在特定的实施方案中，该方法可以用于鉴定待人源化的抗体的CDR区域中的可取代位置。一旦被鉴定，该位置上的氨基酸就可以被“人”的氨基酸取代(例如，位于人种系抗体相同位置上的氨基酸，该抗体具有与待人源化的抗体相似的序列)。因此，该方法在人源化方法中特别有用，尽管该方法也能容易地用于大量的抗体工程改造方法中，下面会做更详细的描述。

非常笼统地说并参照附图1，该方法涉及用抗原2免疫产生抗体的动物，并且获得一些结合抗原4的单克隆抗体的氨基酸序列。然后将这些氨基酸序列进行比较(例如进行序列比对)，然后根据它们之间的相似性将抗体分类，从而鉴定抗体6的相关组。每一组相关抗体中的抗体通常共享一个共同的抗体祖先，并且通过体细胞高变、基因转变和其他发生在亲和突变和B细胞发育最后阶段期间的产生细胞突变的机制，从该抗体祖先进化而来。一旦确定了相关抗体组，就能够比较同一组中抗体的氨基酸序列从而鉴定可取代位置8。可通过一组相关抗体的个体抗体之间在该位置上氨基酸发生改变的事实来鉴定个体抗体的可取代位置。一旦个体抗体可取代位置上的氨基酸被鉴定，它就能被不同的氨基酸取代，且不会显著降低抗体10的亲和力。由于首次免疫动物的免疫系统最初产生并有效测试了在这些可取代位置上进行了氨基酸取代的抗体，该抗体应当完全耐受在这些位置上的取代。在特定的实施方案中，氨基酸取代可以是人源化取代(即，使得其氨基酸序列与人抗体的序列更相似的取代)12，定向取代(例如，使得抗体的氨基酸序列与相关抗体的序列更相似的取代)14，随机取代(例如，用20个天然存在的氨基酸的任一个进行的取代)或者保守取代(例如，用与被取代的氨基酸具有相似生化特性的氨基酸进行的取代)。

如上所述，本发明的方法涉及用抗原免疫一种合适的动物以及从这种动物中获得几种抗原反应性抗体的氨基酸序列。抗体氨基酸序列通常通过测定编码那些抗体的重链和轻链的cDNA序列而获得。这些cDNA是从该动物的产生抗体的细胞中获得的。

任何合适的动物都能用本领域已知的适用于产生免疫反应的任何方法以选择得到的抗原进行免疫，例如热血动物，特别是诸如兔、小鼠、大鼠、骆驼、羊、牛或猪之类的哺乳动物或诸如鸡或火鸡之类的禽类。免疫动物的程序为本领域公知，在Harlow(Antibodies：ALaboratory Manual，First Edition(1988)Cold Spring Harbor，N.Y.)和Weir(Handbook of Experimental Immunology VoI 4，Blackwell Scientific Publishers，Oxford，England，1986)中也有描述。在特定的实施方案中，可以使用具有确定或不确定的基因型的兔。

本发明的文本中，短语“选择得到的抗原”包括任何能产生抗体的物质，其中包括多肽(包括肽)、碳水化合物、无机或有机分子、类似于酶促过程中的中间体的过渡态类似物、核酸、包括癌细胞在内的细胞、细胞提取物、包括活病毒或减毒病毒在内的病原体、细菌等等。本领域技术人员能理解的是，低免疫原性的抗原能带有佐剂或半抗原以便增强免疫反应(例如，完全或非完全弗式佐剂)或者带有诸如钥孔血蓝素(KLH)的载体。合适的抗原包括Her2、GD2、EGF-R、CEA、CD52、CD20、Lym-1、CD6的胞外暴露片段、补体激活受体(CAR)、EGP40、VEGF、肿瘤相关糖蛋白TAG-72 AFP(甲胎蛋白)、BLyS(TNF和APOL相关配体)、CA125(癌抗原125)、CEA(癌胚抗原)、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR相关的杂多聚体)、CD4、CD11α(整联蛋白α-L)、CD14(单核细胞分化抗原)、CD20、CD22(B细胞受体)、CD23(低亲和力IgE受体)、CD25(IL-2受体α链)、CD30(细胞因子受体)、CD33(骨髓细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、CD44v6(介导白细胞的粘附)、CD52(CAMPATH-I)、CD80(CD28和CTLA-4的辅助刺激因子)、补体成分C5、CTLA、EGFR、嗜酸细胞活化趋化因子(细胞因子A11)、HER2/neu、HLA-DR、HLA-DR10、HLA II类、IgE、GPiib/iiia(整联蛋白)、整联蛋白αVβ3、整联蛋白α4β1和α4β7、整联蛋白β2、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6R(IL6受体)、IL-12、IL-15、KDR(VEGFR-2)、lewisy、间皮蛋白、MUC1、MUC18、NCAM(神经细胞附着分子)、癌胚纤连蛋白、PDGFβR(β血小板衍生生长因子受体)、PMSA、肾癌抗原G250、RSV、E-选择蛋白、TGFβ1、TGFβ2、TNFα、TRAIL-R1、VAP-1(血管附着蛋白1)或VEGF等等。

在很多实施方案中，使用具有对应于上面列出的蛋白质之一的胞外域的一部分的氨基酸序列的肽作为抗原。

一旦免疫了合适的动物并且该该动物建立了针对抗原的免疫反应，就筛选该动物的抗体产生细胞，从而鉴定产生具有所需活性的抗体的细胞。在很多实施方案中，这些方法可以应用杂交瘤技术。而在其他的实施方案中，这些方法可以应用从兔脾脏、骨髓、淋巴结、血浆或其他淋巴器官获得的细胞群的流式细胞计量术(FACS)，例如孵育细胞与标记的抗兔IgG，用FACSVantage SE细胞分选仪(Becton-Dickinson，San Jose，CA)分选标记的细胞。

在很多实施方案中，编码抗体VH和VL区的核酸从产生抗体的杂交瘤细胞中分离。为了制备产生抗体的杂交瘤细胞系，用抗原免疫动物。一旦建立起兔的特异性免疫反应，将免疫动物脾脏的细胞与合适的无限增殖细胞(如NIH 3T3，DT-40或240E细胞等；Spieker-Polet等人，Proc.Natl.Acad.Sci.92：9348-9352，1995)融合产生杂交瘤细胞。通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测这些杂交瘤细胞的上清液中的抗体分泌，分泌抗原特异性的单克隆抗体的阳性克隆能按照标准操作步骤筛选和扩增(Harlow等人，Antibodies：ALaboratory Manual，First Edition(1988)Cold spring Harbor，N.Y.；和Spieker-Polet等人，见上)。合适的单克隆抗体可以根据结合活性进一步筛选，结合活性包括它的结合特异性、结合亲和力、结合亲和性、封闭活性或造成一定影响的任何其他的活性(例如促进或抑制细胞表型，如细胞生长、细胞增殖、细胞迁移、细胞生存力(如细胞凋亡)、细胞分化、细胞粘附、细胞形状改变(如肾小管细胞形成)、补体依赖性细胞毒性反应CDC、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用ADCC、受体活化、基因表达改变、翻译后修饰的改变(如磷酸化)、蛋白靶向的改变(如NFκB定位等)等，或抑制受体多聚化(如二聚化或三聚化)或受体-配体相互作用)。

利用标准分子生物学技术从这些细胞中分离编码抗体的核酸，所述技术如聚合酶链反应(PCR)或反转录PCR(PR-PCR)(Ausubel，等人，Short Protocols in Molecular Biology，3rd ed.，Wiley&Sons，1995；Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。

在特定的实施方案中，利用本领域公知技术，如聚合酶链反应(PCR)从cDNA扩增至少编码重链和轻链可变区的序列。参见Mullis，美国专利US 4,683,195；Mullis等人，美国专利US 4,683,195；Polymerase Chain Reaction：Current Communication in MolecularBiology，Cold Springs Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989。简言之，用DNA聚合酶进行依序反应，对编码抗体可变区的cDNA片段进行指数扩增。该反应用5′和3′引物引发。在一些实施方案中，3′反义引物对应于免疫球蛋白链恒定区(或连接区)的DNA序列，而5′引物(或相关引物组)对应于免疫球蛋白链可变区的DNA序列。这种寡核苷酸引物的组合已用于未知序列的鼠免疫球蛋白cDNA的PCR扩增中(参见Sastry等人，Proc Natl.Acad.Sci.86：5728-5732，1989和Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.86：3833-3837，1989)。可选择地，也可以进行“锚式聚合酶链反应”(参见Loh等人，Science 243：217-220，1989)。在这个过程中，cDNA的第一条链用上述的3′DNA引物引发，然后利用末端脱氧核苷酸转移酶在该链的3′端添加多聚(dG尾部)。然后再使用特异的3′DNA引物和另一种由附加到具有适宜限制性位点序列上的多聚(dC尾部)组成的寡核苷酸，通过PCR扩增产物。然而在很多实施方案中，使用跨越免疫球蛋白cDNA的两条链的起始密码子和终止密码子的引物扩增编码重链或轻链的全长多核苷酸，然而，根据所需的扩增产物，使用合适的引物。在一个代表性的实施方案中，可以使用下述引物扩增编码兔抗体的核酸：重链，5′端(CACCATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTG；SEQ ID NO：49)；重链，3′端(CTCCCGCTCTCCGGGTAAATGAGCGCTGTGCCGGCGA；SEQ ID NO：50)；κ轻链，5′端(CAGGCAGGACCCAGCATGGACACGAGGGCCCCCACT；SEQ ID NO：51)；和κ轻链，3′端(TCAATAGGGGTGACTGTTAGAGCGAGACGCCTGC；SEQ ID NO：52)。可以在扩增寡核苷酸中构建合适的限制性位点和其他尾部以有利于扩增产物的克隆和进一步加工。也可以使用本领域技术人员公知的嵌套引物进行扩增操作。抗体的可变区可以直接从PCR产物或克隆的DNA片段进行测序。

据此用抗原免疫动物，并且获得与抗原结合的多个(如，2个或更多，3个或更多，5个或更多，10个或更多，15个或更多，20个或更多，30个或更多，50个或更多，80个或更多，100个或更多，通常多达500或1000个或更多)单克隆抗体的氨基酸序列。在某些实施方案中，单克隆抗体是从用抗原免疫的单个动物细胞中获得的。

一旦确定了一组抗原结合抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列，就可以比较这些氨基酸从而鉴定出一组具有相似序列的相关抗体。这可通过使用合适的编号系统，例如Chothia或Kabat(同上)提供的系统编号每个抗体的氨基酸位置来完成。CDR和/或框架残基可以应用这些方法进行鉴定。编号的序列可用肉眼或通过使用诸如CLUSTAL程序组(Thompson等人，Nucleic Acids Research，22：4673-4680)之一的比对程序进行比对。相关抗体组中抗体的可变区具有十分相似的氨基酸序列。例如，相关抗体组中抗体的VH或VL区可以具有至少90％同一性(例如，至少95％或至少98％或至少99％同一性)的氨基酸序列，忽略为方便序列比对而制造的任何缺口或插入。相关抗体组中的抗体具有相互类似的VL区和VH区。也就是说，在某些实施方案中两种不同的相关抗体的VH或VL区通常包含多达约五个(即一、二、三、四或五个或更多)氨基酸差异。氨基酸差异可存在于可变区的任何位置上，包括在任何CDR或构架区中。相关兔抗体具有几乎相同的H3 CDR和L3 CDR。在这些实施方案中，任何相关的两种抗体都具有长度相同的L3和H3 CDR和几乎相同的序列(即，含有0，1，或2个氨基酸改变)。也就是说，这两种抗体的L3 CDR在长度上相同，在序列上几乎相同，这两种抗体的H3 CDR在长度上相同，在序列上几乎相同。图4显示了两组示例性相关抗体，也显示了非相关兔抗体的20个示例性VH3区的序列用于对比。

取决于使用的特殊抗原，所用动物的种类和基因型，以及测序的编码抗体的核酸的数量，相对少量的相关抗体组可以被鉴定(如，少于约5或10组可以被鉴定)。在某些实施方案中，只有一组或两组可以被鉴定。每一组中的抗体相互之间显示有超过90％的序列同一性，而横跨抗体可变区的全长，任意两个不同组中的任意两个抗体相互之间一般显示少于90％的同一性。

为了鉴定抗体的可取代位置，将该抗体的氨基酸序列与属于该抗体同一组的其他抗体的序列进行比较。如果一组中的不同相关抗体在任何特定位置上的那个氨基酸发生改变，那么这个位置就是该抗体的可取代位置。也就是说，可取代位置是相关抗体之间的该氨基酸发生改变的位置。包含不变氨基酸的位置不是可取代位置。

本发明的这个方面可以参照图2举例说明。图2显示10个不同的示范性、假定相关抗体的示范性氨基酸序列比对。这些抗体的构架区(FW)的氨基酸序列在图2中被省去，尽管上文和下文讨论的原理易适用于框架序列。从一种抗体到另一种抗体，每一个位置上的氨基酸都可以是不变的(即恒定的)或可变的(可以改变)。在图2显示的例子中，在a，b，d，e，g，h，i，j，k，m，n，o，q，r，s，u，v，w，x，z和α位置的氨基酸是恒定的，而在c，f，l，p，t和y位置的氨基酸是可变的。c，f，l，p，t和y位置是可取代(或变异耐受)位置而a，b，d，e，g，h，i，j，k，m，n，o，q，r，s，u，v，w，x，z和α位置是不可取代位置。

在另一个实施方案中，上述方法可用于提供抗体的共有序列。在这种共有序列中，不可取代位置由存在于该位置上的氨基酸表示，可取代位置以“X”表示。根据这些抗体将要如何使用，X可以是a)任何氨基酸，b)该存在于组中的任何相关抗体或其保守取代变体该位置上的任何氨基酸或者c)存在于该组中的任何相关抗体该位置上的氨基酸。例如，在图2显示的例子中，抗体共有区具有序列：RTXATXCLFQ-FW1-RXWTVXA-FW2-PSXSHTVXIT(SEQ ID NO：54)，这里的X可以是任何氨基酸、存在于相关抗体该位置上的任何氨基酸、或者存在于相关抗体该位置上的保守取代的氨基酸。具有共有区所包括的序列的任何抗体都应该上与任何相关抗体一样结合相同的抗原。图7显示结合TNFα的三组相关抗体的重链和轻链的示范性共有序列。非X氨基酸与图4显示的抗体序列相同位置上所示的氨基酸相同。在某些实施方案中，共有序列可以只包括抗体CDR区的氨基酸序列。

在可取代位置上取代氨基酸

上述方法可用于设计和制备亲本抗体的变体的方法中，该变体至少保持(即保持或增加)亲本抗体的抗原结合活性。因为在可取代位置包含取代的抗体已由免疫的动物产生和测试，所以可以在这些位置上进行取代，据了解它们不应显著降低抗体的结合活性。一般而言，亲本抗体的变体具有抗原结合亲和力，其为至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％(如，至少150％，至少200％，至少500％，至少1000％，通常高达至少10,000％)的亲本抗体与特殊抗原的结合亲和力。

如图1所示，亲本抗体的可取代位置可以被下列氨基酸取代a)产生随机取代的20个天然存在的氨基酸中的任何一种，b)产生保守取代的其生化特性与存在于可取代位置的氨基酸类似的氨基酸，c)产生定向取代的存在于相关抗体相同位置的氨基酸，或者d)产生人源化取代的存在于相似人抗体相同位置的氨基酸。取代可以在抗体可变区的任何部分，包括任何构架区或CDR中进行。在某些实施方案中，众多可取代氨基酸(如，多达约5或10个或更多)可以被取代。在特定的实施方案中，可以在每个可取代位置上进行的取代的类型可以由存在于相关抗体该位置的氨基酸的类型表明。例如，如果不相关氨基酸(如ala，gly，cys，glu和thr)存在于一组相关抗体的某一位置上，那么任何氨基酸都能在该位置上进行取代，并且不会显著降低该抗体的结合活性。类似地，如果非极性氨基酸(如val，ile，ala和met)的亚组存在于一组相关抗体的某一位置上，那么其他非极性氨基酸(如leu)能在该位置进行取代，并且不会显著降低该抗体的结合活性。

在这些方法的任一种中，可以测试产生的抗体变体以确认任何结合活性都没有因为取代而显著降低。此外，且以下将做更详细的描述，可以制备含有众多被取代氨基酸的抗体变体库，并且进行筛选从而提供具有改善活性的抗体。例如，抗体的一个或多个可取代位置可通过随机、保守或定向取代的任意组合进行取代，从而产生变体库，单独测试每一个变体库来鉴定具有改善结合活性的抗体。

保守取代

位于抗体可取代位置的氨基酸可被与将要替代的氨基酸具有相似特性的氨基酸替代(基于大小、极性、疏水性等等)。也就是说，位于抗体可取代位置的氨基酸能被同一类的不同氨基酸替代，其中氨基酸可以如下分类：芳香族：phe，tyr，trp；非极性：leu，val，ile，ala，met；脂肪族：ala，val，leu，ile；酸性：asp，glu；碱性：his，lys，arg；极性：gln，asn，ser，thr，tyr。在某些实施方案中，位于抗体可取代位置的氨基酸可按照下表进行替代：

将要被替代的氨基酸	替代氨基酸
将要被替代的氨基酸	替代氨基酸	Ala	Ser
Arg	Lys	Ala	Ser
Arg	Lys	Asn	Gln，His
Asp	Glu	Asn	Gln，His
Asp	Glu	Cys	Ser，Ala
Gln	Asn	Cys	Ser，Ala
Gln	Asn	Glu	Asp
Gly	Pro	Glu	Asp
Gly	Pro	His	Asn，Gln
Ile	Leu，Val	His	Asn，Gln
Ile	Leu，Val	Leu	Ile，Val
Lys	Arg，Gln，Glu	Leu	Ile，Val
Lys	Arg，Gln，Glu	Met	Leu，Ile
Phe	Met，Leu，Tyr	Met	Leu，Ile
Phe	Met，Leu，Tyr	Ser	Thr
Thr	Ser	Ser	Thr
Thr	Ser	Trp	Tyr
Tyr	Trp，Phe	Trp	Tyr
Tyr	Trp，Phe	Val	Ile，Leu

定向取代

位于抗体可取代位置的氨基酸可以被存在于相关抗体相同位置上的不同氨基酸替代。例如且参照图2，位于抗体1中可取代位置c上的ala可以用gly，cys，glu或thr替代，因为这些氨基酸分别位于抗体3、5、7和10中的可取代位置c上；位于抗体1中可取代位置f上的met可以用val或ile替代，因为这些氨基酸分别位于抗体4和8中的可取代位置f上；位于抗体1中可取代位置1上的phe可以用tyr或trp替代，因为这些氨基酸分别位于抗体6和9中的可取代位置l上，对于抗体1的位置p、t和y情况也是如此。

人源化取代

位于亲本抗体可取代位置上的氨基酸可以被存在于人抗体相同位置上的不同氨基酸替代。在这些实施方案中，亲本抗体可变区的氨基酸序列通常与人抗体序列的数据库进行比较，然后筛选具有与亲本抗体相似的氨基酸序列的人抗体。对亲本抗体和人抗体的氨基酸序列进行比较(如序列比对)，亲本抗体的一个或多个可取代氨基酸被人抗体中相应位置上的氨基酸取代。这个实施方案在图3的上图中进行了例证，其中所有的可取代氨基酸都被它们的人对应物取代。人源化序列(hmAb)的带黑体下划线的氨基酸表明了已被取代的氨基酸。带黑体双下划线的氨基酸未被取代，因为“人”氨基酸已存在于亲本抗体中。

在此实施方案的改进形式中，人源化取代可以是一个定向取代，其中在一个可取代位置上的氨基酸被一个同时存在于人类抗体和相关抗体中的氨基酸所取代。在图3的下图中对此实施方案进行了图解。在此图中，在抗体1位置c上的ala被thr所取代，而thr在抗体10(如图2所示)和相似的人类抗体的该位置上都被发现。另外，在抗体1位置y上的gln被tyr所取代，而tyr在抗体9(如图2所示)和相似的人类抗体的该位置上被发现。其它的可取代氨基酸(即，在位置f，l，p和t上的氨基酸)在这个实施方案中没有被取代，因为在这个位置上相关抗体中没有一个具有与人类抗体相同的氨基酸。

在其它实施方案中，取代氨基酸可以选择比其它氨基酸极性低的，因此具有低免疫原性的氨基酸。

通过比较亲本抗体重链和轻链的可变结构域序列(或一组相关抗体的共有序列)与人类抗体序列数据库来鉴定用于这些方法的合适的人类抗体。一般来说，根据氨基酸序列同一性(用同一性百分比或P值表示)最相似的十个序列之一将被用作氨基酸残基供体。在某个实施方案中，就与亲本抗体序列的氨基酸序列同一性(同一性百分比或P值)而言最相似的三个抗体之一可以用作氨基酸残基供体。横跨一条或全部两条被测序的链中的整个可变结构域，所选的人类抗体和亲本抗体一般将具有至少约55％，至少约65％，至少约75％，至少约85％，至少约90％，或者至少约95％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，来自相同人类抗体的轻链和重链都可以用作氨基酸供体。在大多数实施方案中，将亲本抗体与人类种系抗体序列进行比较。

对于一个给出的兔免疫球蛋白序列可以通过搜索各种抗体数据库来鉴定最同源的人类抗体免疫球蛋白。除国家生物技术信息中心(NCBI)数据库以外，下面还列举了几个最常用的数据库：

V BASE-人类抗体基因数据库：这个数据库是由英国剑桥大学医学研究委员会(MRC)维护的，网址是： www.mrc-cpe.cam.ac.uk。这个数据库是综合性的全部人类种系可变区序列的名录，它广泛地收录了超过一千种公开的序列，包括那些在Genbank和EMBL数据库里最新发表的序列。

Kabat免疫学特性蛋白质序列数据库(Johnson，G and Wu，TT(2001)Kabat Database and its applications：future directions.Nucleic Acids Research，29：205-206)，建立在芝加哥西北大学网站上(immuno.bme.nwu.edu)。

免疫遗传学数据库：由欧洲生物信息学研究所维护，其网址为：www.ebi.ac.uk。这个数据库是包括在免疫系统功能中起重要作用的基因的核苷酸序列信息的综合的专门数据库。它收录和注释了与免疫鉴定有关的属于免疫球蛋白超家族的序列。

ABG：小鼠种系基因名录-小鼠VH和VK种系片段的名录，是UNAM(墨西哥国际大学)生物技术研究所抗体组网页的一部分。

内置式搜索引擎可以用于搜索就氨基酸序列同源性而言最相似的氨基酸序列。在本发明的方法中，BLAST(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-10，1990)是使用缺省参数来进行的，包括选择BLOSUM62矩阵，期望阈值为10，低复杂性滤出，允许间隙，字长为3。

在本发明的人源化方法中，进行一个，两个，三个，四个，五个，六个或更多，通常一直到10个或更多人源化氨基酸取代。在这些方法中通常是非连续氨基酸被取代。

以上描述的在抗体中进行人源化取代的方法可以用作已知抗体人源化方法的备选方案，或与已知抗体人源化方法结合使用，或用作已知抗体人源化方法之外的方法，所述的已知抗体人源化方法诸如CDR移植和表面重建方法，已在引言中讨论过。

例如，本发明的人源化方法可以结合任何人源化方法使用，所述任何人源化方法需要在亲本抗体中进行氨基酸取代，以便使之更加相似于已知人类抗体(参见，例如美国专利申请序列号：10/638,210和10/637,317，两者都在2003年8月7日提交，以及在背景部分引用的其它参考文献，将其全部引入本文作为参考)。例如，很多先前的人源化方法涉及鉴别在亲本抗体中的可以被人类氨基酸(即，在人类抗体同一位置发现的氨基酸)所取代的特定氨基酸。作为这些先前方法的改进，本发明方法可以用于鉴别哪些特定氨基酸是可取代的氨基酸并且因此具有变异耐受性。由于在这些可取代位置的氨基酸取代容易被抗体耐受(即，它们没有显著降低结合亲和力)，所以人源化氨基酸取代可以在没有显著降低抗体活性的情况下进行。例如，只有在抗体表面而不是在二级结构的重要区域中的可取代位置，才可以被人类氨基酸所取代。另外，该方法也可以与从抗体中除去辅助性T细胞表位的方法使用，如在公开的美国专利20030153043和其他文献中描述的“去免疫”方法。例如，只能进行发生在可取代位置上的去免疫氨基酸变化。这种变化应该不会消除抗体活性。

在特定的实施方案中，本发明的方法可以用于人源化抗体的CDR。除了例如涉及对抗体的框架区和其它的非CDR区进行人源化的其它人源化方法之外，还可以使用这些实施方案。

上面所描述的人源化方法对抗体人源化的技术起着重要的促进作用，因为没有其它人源化方法可以用来只取代那些已知能够耐受取代的抗体的位置。

再者，由于本发明的方法有效利用通过经免疫动物的免疫系统筛选具有强结合活性的变异抗体的氨基酸序列(通过亲和力成熟)，所以在通过上述方法鉴定的抗体可取代位置上取代氨基酸经常导致结合亲和力的增加。这对如上所述进行了定向取代的抗体尤其适用。因此，大体上讲，本发明的人源化方法可以用来使亲本抗体人源化，从而产生比亲本抗体具有更强的对抗原的结合亲和力的人源化抗体。

改善抗体活性的方法

在一个特别关注的实施方案中，本发明的取代方法可用于改善亲本抗体的结合活性。如上所述，用本发明的方法所鉴定的可取代位置是在亲和力成熟期间用来改善祖抗体结合活性的位点。这些位置，及存在于相关抗体组中这些位置的氨基酸，被选择来增加抗体对特定抗原的亲和力。通过结合亲和力成熟期间对抗体进行的各种个别变化，可以产生对抗原亲和力提高的抗体。所以在某些实施方案中，可以在亲本抗体中进行多种定向取代来提高该抗体的亲和力。例如，亲本抗体可能被修饰，从而使之包含一组相关抗体的每个可取代位置上的最常见的取代。

在相关方法中，如果足够多的抗体(例如，20个以上，直到约50个或更多)被测序，则可以将这些抗体的特定抗体活性(例如，抗体结合亲和力，抗体结合亲和度，抗体结合特异性等)与特定的氨基酸变化相关联。这种知识使人们能设计并制备一种抗体，其具有选定的结合活性的组合。

另外，并且正如上面提到的，对抗体可取代位置的鉴定有利于产生待筛选的候选抗体文库，从而鉴定出具有所需结合活性的抗体。在一个实例中，这种方法包括在抗体可取代位置上进行每种可能的氨基酸取代的组合(例如，任何定向、随机和/或保守取代的组合)以产生抗体文库，其可以被筛选以鉴定具有改善性能的抗体。

筛选抗体的合适方法是本领域公知的，包括但不限于下列：

结合测定法

在这些测定法中，对目标文库的每种抗体测试其特异性结合底物的能力。在抗体结合中的术语“特异性地”是指抗体结合特定抗原即肽或表位的高亲和性和/或就亲和力。在许多实施方案中，特异性抗原是指用于免疫动物宿主的抗原(或抗原的片段或亚片断)，产生抗体的细胞是从所述动物宿主分离获得的。抗体特异性结合某一抗原的能力比同一抗体结合其他抗原的能力要强。与一种多肽特异性结合的抗体可能能够在一个微弱但可检测的水平上(例如，对目标多肽所示结合的10％或更少)结合其他多肽。这种微弱的结合，或背景结合，能容易地从与目标多肽的特异性抗体结合中分辨出来，例如，通过利用合适的对照。一般来说，特异性抗体对抗原的结合亲和力KD值为10^-7M或更低，如10^-8M或更低(如，10^-9M或更低，10^-10或更低，10^-11或更低，10^-12或更低，10^-13或更低等)。一般而言，结合亲和力KD值为10^-7M或更高的抗体是不可用的，因为该抗体与抗原的结合水平不能通过目前所用的常规方法进行检测。

一般，在进行筛选测定时，将由产生抗体的宿主细胞文库产生的抗体样品放置在固相载体上，这样每一抗体都能被鉴别，例如，根据平板数和在平板上的位置，或用另一种能鉴定产生抗体的宿主细胞培养物的鉴定试剂。

可以通过本领域已知的任何方法检测本发明的抗体的免疫特异性结合。可用的免疫测定法包括但不限于竞争性及非竞争性测定体系，利用诸如蛋白质印迹，放射性免疫测定法，ELISA(酶联免疫吸附测定法)，“夹心”免疫测定法，免疫沉淀测定法，沉淀素反应，凝胶扩散沉淀素反应，免疫扩散测定法，凝集反应测定法，补体结合测定法，免疫放射测定法，荧光免疫测定法，蛋白A免疫测定法这类技术。这些测定法都是本领域公知的常规方法(见，例如，Ausubel等人，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley& Sons，Inc.，New York，将其全部并入本文作为参考)。示例性的免疫测定法将在下面简要描述(然而不意味着限定)。

免疫沉淀法通常包括在裂解缓冲液如添加了蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(如，EDTA，PMSF，抑肽酶，钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％ SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠pH 7.2，1％ Trasylol)中裂解细胞群，向细胞裂解物中加入目标抗体，于4℃孵育一段时间(例如，1-4小时)，再加入蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠，于4℃孵育大约一小时或更久，于裂解缓冲液中洗涤琼脂糖珠，并在SDS/样品缓冲液中重悬浮琼脂糖珠。目标抗体对特定抗原的免疫沉淀能力可以通过例如蛋白质印迹分析法测定。本领域技术人员将会了解能够改变来增加抗体与抗原的结合并降低背景的参数(例如，用琼脂糖珠预清除细胞裂解物)。

蛋白质印迹分析通常包括蛋白样品制备，然后是经聚丙烯酰胺凝胶(例如，8％-20％ SDS-PAGE，根据抗原分子量而定)电泳蛋白样品，将分离的蛋白样品从聚丙烯酰胺凝胶中转移到膜，如硝酸纤维素膜，PVDF或尼龙膜上。转移后，在封闭溶液(例如，含3％ BSA的PBS或脱脂乳)中封闭膜，在洗涤缓冲液(例如，PBS-Tween 20)中洗涤，与在封闭缓冲液中稀释的一抗(目标抗体)一起孵育。在此孵育后，在洗涤缓冲液中洗涤膜，与二抗(其鉴定一抗，例如，抗人抗体)一起孵育，所述二抗缀合到酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如32P或125I)上，进一步洗涤后，可以检测到抗原的存在。本领域技术人员将会了解能够改变来增强检测信号并减弱背景噪音的参数。

ELISA包括制备抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，向孔中加入缀合到可检测化合物如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)上的目标抗体并孵育一段时间，和检测抗原的存在。在ELISA中，目标抗体不一定要和可检测化合物缀合；取而代之，可以将缀合了可检测化合物的二抗(其鉴定目标抗体)加入到孔中。另外，也可用抗体来包被孔，而不是用抗原包被孔。在这种情况下，在加入目标抗原后可以向包被过的孔中加入缀合了可检测化合物的二抗。本领域技术人员将会了解能够改变来增强检测信号的参数以及本领域已知的其它ELISA变化形式。

抗体对抗原的结合亲和力及抗体-抗原相互反应的分离率可以由竞争性结合测定法来测定。竞争性结合测定法的一个例子是放射性免疫测定法，它包括将标记的抗原(3H或125I)与目标抗体一起在渐增量的未标记抗原存在下孵育，和检测与标记抗原结合的抗体。目标抗体对特定抗原的亲和力及分离率可由通过斯卡查德作图分析得到的数据来确定。与二抗的竞争也可以利用放射性免疫测定法来测定。在这种情况下，抗原与缀合了标记化合物(3H或125I)的目标抗体一起孵育，在孵育时有渐增量的未标记的二抗存在。

本发明的抗体可利用免疫细胞化学方法在转染的细胞(例如，哺乳动物细胞，如CHO细胞)上进行筛选，所述细胞利用本领域公知的技术用能够表达抗原的载体进行转染，或只用载体进行转染。结合抗原转染的细胞，但不结合只用载体转染的细胞的抗体是抗原特异性的。

不过，在某些实施方案中，所述测定法是抗原捕获测定法，抗体的阵列或微阵列可以应用于这种目的。制备和使用多肽微阵列的方法是本领域已知的(见例如美国专利6,372,483，6,352,842，6,346,416及6,242,266)。

抑制剂测定法

在某些实施方案中，该测定法测量抗体对第一化合物与第二化合物(例如两种生物聚合物)之间相互作用的特异性抑制，或对反应(例如酶促反应)的特异性抑制。在相互作用抑制测定中，一种相互作用底物，通常为生物聚合物如蛋白质例如受体可以在反应器中结合到固相支持物上。加入抗体到反应器中，随后，加入可检测的底物结合配偶体，通常是一种生物聚合物，如蛋白质例如放射性标记的受体配体。在洗涤反应器之后，相互作用抑制可通过测定反应器中存在的可检测的结合配偶体数量来测定。与不含抗体的对照试验比较，相互作用抑制发生在结合配偶体的结合下降大于约20％，大于约50％，大于约70％，大于约80％，大于约90％或95％或者更多时。

在反应抑制测定中，酶可以结合到反应器中的固相支持物上。通常在将抗体加入到反应器中之后再加入酶的底物。在许多实施方案中，酶和底物之间的反应产物是可以检测的，经过一段时间后，通常反应会停止。在反应停止之后，通过测定存在于反应器中的可检测反应产物的水平来测量反应抑制。与不含抗体的对照试验比较，反应抑制发生在反应速率降低大于约20％，大于约50％，大于约70％，大于约80％，大于约90％或95％或更多时。

体内测定法

在某些实施方案中，在体内对抗体进行测试。一般来说，该方法包括对动物模型给予针对某一疾病或病症的目标单克隆抗体，并确定所述单克隆抗体对模型动物的疾病或病症的作用。本发明的体内测定包括对照，其中合适的对照包括不存在单克隆抗体的样品。通常多种测定混合物以不同的抗体浓度平行测试，从而得到对不同浓度的差别反应。一般，将这些浓度之一作为阴性对照，即在零浓度下，或在检测水平之下。

取代抗体

本发明提供了按上述方法取代得到的取代抗体。

一般情况下，与亲本抗体相比，取代抗体保留对抗原的特异性，具有对该抗原的实质性亲和力(例如，至少10⁷M^-1，至少10⁸M^-1，或至少10⁹M^-1到10¹⁰M^-1或更高)，并且与亲本抗体相比，如果进行了人源化，通常在人宿主中具有更低的免疫原性。

与亲本兔抗体相比，人源化抗体在人宿主体内的免疫原性水平可以通过多种方式中的任何一种加以确定，包括对单个人宿主给予包含等摩尔量的两种分离的抗体的制剂，和测量人宿主对每一种抗体的免疫反应。或者，把亲本抗体和经修饰的抗体分别给予不同的人宿主，并且测量该宿主的免疫反应。测量宿主对每一种抗体的免疫反应的一种适合的方法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)(在Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，3rd ed.，Wiley&Sons，1995，第11-4单元中进行了描述)，在这种方法中，把适当的等量的每一种抗体滴在微量滴定板上的孔内，然后采用来自人宿主体内的多克隆抗血清进行测定。在大多数实施方案中，与未修饰的亲本抗体相比，本发明的人源化抗体的免疫原性大约低10％、大约低20％、大约低30％、大约低40％、大约低50％、大约低60％、大约低80％、大约低90％或甚至大约低95％。

根据所采用的是恒定区还是其他区，可以制成几种本领域已知的抗体类型。除了全长抗体之外，还可以通过本发明的方法制成抗体的抗原结合片段。这些片段包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)₂、Fd、单链Fv(scFv)，单链免疫球蛋(例如，其中重链或其部分，以及轻链或其部分进行了融合)、二硫键连接的Fv(sdFv)、二价抗体、三价抗体、四价抗体、scFv微型抗体(minibodies)、Fab微型抗体以及二聚scFv和任何其他在构象中包含V_L和V_H结构域、从而形成特异性抗原结合区的片段。包括单链抗体在内的抗体片段，可以只包含可变区，或与完整的或部分的下列区域组合：重链上的重链恒定区或其部分，例如CH1、CH2、CH3、跨膜和/或细胞质结构域，以及轻链上的轻链恒定区，例如C_κ结构域或C_λ结构域，或其部分。此外，本发明还包括可变区与CH1、CH2、CH3、C_κ、C_λ、跨膜及细胞质结构域的任何组合。术语“抗体”意指任何类型的抗体，其中包括上述的那些，其中已经在前面解释过，重链和轻链是天然配对的，即，不包括所谓的“噬菌体展示”抗体。

编码取代抗体的核酸

本发明还提供了这样的核酸，其包含编码本发明的修饰抗体及其部分，包括重链或轻链、重链或轻链可变区，或重链或轻链可变区的构架区的核苷酸序列。本发明的核酸是通过本发明的方法产生的。在许多实施方案中，该核酸还包含恒定区，例如任何人抗体的恒定区的编码序列。编码人免疫球蛋白前导肽(例如MEFGLSWVFLVAILKGVQC，SEQID NO：53)的核酸可以通过基因工程技术处理，实现抗体链的分泌。

由于遗传密码和操纵核酸的重组技术是已知的，并且可以使用上述方法获得本发明抗体的氨基酸序列，因此，编码取代抗体的核酸的设计和生产完全在本领域技术人员的能力范围之内。在某些实施方案中，使用标准DNA重组技术(Ausubel等人，Short Protocols inMolecular Biology，3rd ed.，Wiley&Sons，1995；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。例如，利用多种重组方法的任何一种或其组合可以从产生抗体的细胞中分离出抗体编码序列，这些方法就不必在本文中加以赘述了。随后，也可以利用标准DNA重组技术，在编码蛋白质的核酸序列中进行取代、缺失和/或添加核苷酸。

例如，可以采用定点诱变技术和亚克隆技术在编码抗体的多核苷酸中导入/缺失/取代核酸残基。在其它实施方案中，可以采用PCR。还可以通过化学合成完全由寡核苷酸制成编码目的多肽的核酸(例如，Cello等人，Science(2002)297：1016-8)。

在某些实施方案中，在特定物种，特别是哺乳动物，例如人物种的细胞中优化编码目的多肽的核酸密码子。

本发明还提供了包含本发明的核酸的载体(也被称为“构建体”)。在本发明的许多实施方案中，将在已经把序列可操作性连接到表达控制序列，包括例如启动子上之后在宿主内表达本发明的核酸序列。一般情况下，还可把本发明的核酸置于表达载体中，所述表达载体可以在宿主细胞内以游离体的形式或作为宿主染色体DNA的组成部分进行复制。通常，表达载体将包含选择标记，例如四环素或新霉素，从而检测出那些用所需DNA序列进行转化的细胞(见，例如，美国专利US 4,704,362，将其并入本文作为参考)。载体，包括单和双表达盒载体是本领域公知的(Ausubel等人，Short Protocols inMolecular Biology，3rd ed.，Wiley&Sons，1995；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。合适的载体包括病毒载体、质粒、粘粒、人工染色体(人类人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体等等)、微型染色体等等。也可以采用逆转录病毒、腺病毒以及腺伴随病毒载体。

对于在细胞中生产目标多肽来说，本领域技术人员可以利用多种表达载体。一种合适的载体是在某些实施方案中使用的pCMV。按照《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》，这种载体于1998年10月13日存入美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209 USA)。该DNA经过美国典型培养物保藏中心的检验，并确认为具有活力。美国典型培养物保藏中心已经给pCMV指定了如下的保藏号：ATCC #203351。

不过，在某些实施方案中，本发明的核酸通常包含编码目标抗体的单一可读框，因为用于目标多肽表达的宿主细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞，如人细胞，单一可读框可能会被内含子打断。本发明的核酸通常是转录单元的一部分，该转录单元除了本发明的核酸之外还可以包含3′和5′非翻译区(UTR)，该非翻译区可指导RNA的稳定性和翻译的效率等。本发明的核酸还可以是表达盒的一部分，所述表达盒除了本发明的核酸之外还可以包含启动子和转录终止子，该启动子指导目标多肽的转录和表达。

真核启动子可以是任何在真核宿主细胞或任何其它宿主细胞中发挥作用的启动子，包括病毒启动子和源于真核基因或原核基因的启动子。典型的真核启动子包括、但不限于如下启动子：小鼠金属硫蛋白I基因序列的启动子(Hamer等人，J.Mol.Appl.Gen.1：273-288，1982)；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 31：355-365，1982)；SV40早期启动子(Benoist等人，Nature(London)290：304-310，1981)；酵母菌瘿基因序列启动子(Johnston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79：6971-6975，1982)；Silver等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81：5951-59SS，1984)；CMV启动子；EF-1启动子；蜕皮素应答启动子；四环素应答启动子等等。病毒启动子可能具有特殊的意义，因为它们一般是特别强的启动子。在某些实施方案中，所采用的启动子是靶病原体的启动子。选择用于本发明中的启动子的原则是它们能在所导入的细胞类型(和/或动物)内发挥作用。在某些实施方案中，启动子是CMV启动子。

在某些实施方案中，本发明的载体还可以提供可选择标记的表达。合适的载体和可选择标记是本领域公知的，并且在Ausubel等人(ShortProtocols in Molecular Biology，3rd ed.，Wiley&Sons，1995)以及Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Edition，(2001)Cold Spring Harbor，N.Y.)中进行了讨论。已经采用了多种不同基因作为可选择标记，在本发明的载体中采用作为可选择标记的特定基因主要是依据便利性而选择的。已知的可选择标记基因包括：胸苷激酶基因；二氢叶酸还原酶基因；次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因；CAD；腺苷脱氨酶基因；天冬酰胺合成酶基因；抗生素抗性基因，例如tetr、ampr、Cmr或cat、kanr或neor(氨基糖苷磷酸转移酶基因)、潮霉素B磷酸转移酶基因等等。

本发明的核酸还可以包含限制位点、多克隆位点、引物结合位点、可连接末端、重组位点等，通常是为了有利于构建编码人源化兔抗体的核酸。

一般而言，本领域已知几种方法用于生产编码抗体的核酸，包括在美国专利6,180,370、5,693,762、4,816,397、5,693,761和5,530,101中所见的那些方法。一种PCR方法利用“重叠序列延伸PCR”(Hayashi等人，Biotechniques.1994：312，314-5)，产生编码轻链和重链的核酸的表达盒。按照这种方法，采用得自抗体产生细胞的cDNA产物以及其它适当的核酸作为模板进行多次重叠PCR反应生成表达盒。

生产抗体的方法

在许多实施方案中，将编码目标单克隆抗体的核酸直接导入宿主细胞中，将该细胞在足以诱导被编码抗体的表达的条件下进行培养。

任何适用于对表达盒进行表达的细胞都可以用作宿主细胞。例如。酵母、昆虫、植物等的细胞。在许多实施方案中，采用一般不会产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，其实例如下：猴肾细胞(COS细胞)；通过SV40转化的猴肾CVI细胞(COS-7，ATCC CRL 165 1)；人胚肾细胞(HEK-293，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77：4216，(1980)；小鼠塞托利氏细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾脏细胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾脏细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾脏细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；大鼠肝脏细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺癌细胞(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci 383：44-68(1982))；NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)和小鼠L细胞(ATCC CCL-1)。其他细胞系对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。从美国典型培养物保藏中心(ATCC)可以获得多种细胞系，ATCC地址：American Type Culture Collection，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209。

把核酸导入细胞的方法是本领域公知的。适合的方法包括电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等等。方法的选择一般取决于待转化的细胞类型，以及进行转化所处的具体环境(即：在体内，离体或在体内)。有关这些方法的一般性讨论可以参见：Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，3rd ed.，Wiley&Sons，1995。在某些实施方案中，可以采用脂质转染胺试剂和钙介导的基因转移技术。

在把目标核酸导入到细胞中之后，一般对细胞进行培养，正常培养温度为37℃，某些时候温度可以选择，培养时间为大约1到24个小时，以便使抗体得以表达。在大多数实施方案中，抗体一般分泌到细胞生长培养基的上清液中。

在哺乳动物宿主细胞中，许多基于病毒的表达系统可以用来对目标抗体进行表达。在采用腺病毒作为表达载体的情况下，可以将目标抗体编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合体上，例如晚期启动子和三联前导序列。随后可以通过体外或体内重组，将这种嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组非必需区(例如E1或E3区)将导致重组病毒能存活并且能在被感染的宿主内表达抗体分子。(例如，见Logan&Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：355-359(1984))。通过包含合适的转录增强子元件，转录终止子等，可以提高表达的效率(见Bittner等人，Methods in Enzymol.153：51-544(1987))。

对于长期，高产量的重组抗体产生，可以使用稳定的表达。例如，可以对稳定表达抗体分子的细胞系进行工程改造。胜于使用包含病毒复制起点的表达载体，可以用免疫球蛋白表达盒以及选择性标记对宿主细胞进行转化。在导入外源DNA之后，可以使经改造的细胞在富集培养基中生长一到两天，之后，转换成选择性培养基。重组质粒中的选择性标记产生对选择的抗性，使得细胞可以稳定地将质粒整合到染色体中，并生长形成转化灶，它又可以被克隆并增殖为细胞系。这种经工程改造的细胞系尤其适用于对直接或间接与抗体分子相互作用的化合物进行筛选和评估。

一旦制得本发明的抗体分子，就可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的任何方法对它进行纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱，亲和色谱，特别是通过在蛋白A之后对特异性抗原的亲和色谱，和分级柱色谱)、离心、差异溶解度，或通过任何其它纯化蛋白质的标准技术。在许多实施方案中，抗体从细胞分泌到培养基中并从培养基中进行收集。

测定抗体的结合亲和力

一旦产生了经修饰的抗体，可以利用任何已知的方法测试其亲和力，所述方法诸如：1)采用标记的(放射性标记的或荧光标记的)亲本抗体、修饰的抗体以及由亲本抗体鉴定的抗原进行的竞争性结合分析；2)使用例如BIACore仪进行的表面等离振子共振以提供抗体的结合特性。采用这种方法，把抗原固定在固相芯片上，并以实时方式测量抗体在液相中的结合；以及3)流式细胞术，例如，通过采用荧光激活细胞分选术(FACS)分析来研究抗体与细胞表面抗原的结合；4)酶联免疫吸附测定法(ELISA)；5)平衡透析或FACS。在这种FACS方法中，表达抗原的被转染的细胞和自然细胞都可以用于研究抗体结合。测量结合亲和力的方法一般描述于Harlow等人，《抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)》，第一版(1988)Cold springHarbor，N.Y.；Ausubel等人，Short Protocols in MolecularBiology，3rd ed.，Wiley&Sons，1995)。

如果亲和力分析表明修饰的抗体与其亲本抗体相比抗体的结合有所下降的话，可以进行“微调”以增加亲和力。一种进行微调的方法是采用定点诱变技术，系统化地把每一个修饰的残基变回到原来的状态。通过对这些反向突变抗体进行表达和分析，人们可以预测出无法进行修饰的关键残基，不然会降低亲和力。

功用

用这种方法生产的抗体具有在诊断学，在抗体成像和在用基于单克隆抗体的疗法可治疗的疾病方面的用途。特别地，用这种方法进行人源化的抗体可以用于被动免疫或者除去不需要的细胞或抗体，如通过补体介导的裂解作用或者抗体介导的细胞毒性(ADCC)，都不会引起实质性的免疫反应(如过敏性休克)，而这些免疫反应是与许多先前的抗体相关联的。例如，本发明的抗体可以用于治疗疾病，在该疾病中有害细胞的表面特异性地表达一种可以被抗体鉴定的蛋白质(例如HER2，或任何其它的癌症特异性标记)，或者所述抗体可用于中和不良毒素，刺激物或病原体。人源化抗体特别可用于治疗很多类型的癌症，例如结肠癌，肺癌，乳腺癌，前列腺癌等等，这些癌都与特定细胞标记的表达相关。由于大多数，如果不是全部，疾病相关的细胞和病原体都具有为抗体潜在靶点的分子标记，所以许多疾病是人源化抗体的潜在指征。这些疾病包括自身免疫疾病，在这些疾病中特定类型的免疫细胞攻击自身抗原，例如胰岛素依赖型糖尿病，系统性红斑狼疮，恶性贫血，过敏症和类风湿性关节炎；移植相关的免疫激活作用，例如移植排斥和移植物抗宿主疾病；其它的免疫系统疾病，例如败血性休克；传染病，例如病毒感染或细菌感染；心血管疾病，例如血栓形成和神经性疾病，例如阿尔茨海默氏病。

当与缺乏抗体时的对照实验相比时，特别关注的抗体是调节，即减轻或加重动物模型疾病或病症的症状至少约10％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，或更多的抗体。一般而言，目标单克隆抗体将使得受试动物与没有遭受疾病或病症的同种动物更相似。已经利用本发明的方法和组合物鉴定过的有治疗价值的单克隆抗体称为“治疗性”抗体。

试剂盒

如上所述，本发明还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。该试剂盒至少包括如下一种或多种：根据以上方法制成的取代的抗体，编码该抗体的核酸，或包含该抗体的细胞。可以对取代的抗体进行人源化。试剂盒的其它任选组分包括：限制性内切酶、对照引物和质粒、缓冲液等。该试剂盒的核酸还可以具有限制位点、多克隆位点、引物位点等等，以利于它们与非兔抗体互补决定区编码核酸的连接。该试剂盒的各组分可以单独存在于分开的容器中，也可以根据需要，把某些相容的组分预先组装到单一的容器中。

除了上述的组分之外，本发明的试剂盒一般还包括使用试剂盒的各组分实施本发明方法的说明书。实施本发明方法的说明书一般记录于适当的记录介质上。例如，可以将说明书印在如纸张或塑料等基片上。这样，这些说明书可以作为药品说明书存在于试剂盒中，包括在试剂盒或其组分的容器上的标签中(即：随附于包装或子包装上)等。在其它实施方案中，这些说明书可以采取电子存储数据文件的形式存储在适当的计算机可读存储介质，如CD-ROM、软磁盘等上。还有一些实施方案中，实际的说明书并不包括在试剂盒中，而是以远程通讯形式获取，例如通过互联网。这种实施方案的一个例子就是包括网址的试剂盒，此时，使用者可以在线阅读这些说明书和/或通过网络下载这些说明书。关于说明书，这种获得说明书的方式被记录在适当的介质上。

本发明还提供至少包括一个计算机可读介质的试剂盒，该介质包括上述的程序设计和使用说明书。所述说明书还可以包括安装说明或设置说明书。说明书可以包括本发明与上述个别方案或各种方案组合一起使用的用法说明。在某些实施方案中，说明书同时包括这两类信息。

提供软件和使用说明书形式的试剂盒可以用于多种目的。该组合形式的产品可以包装和购买，用于制备在非兔宿主中产生的免疫原性低于亲本抗体的兔抗体或其核苷酸序列。

说明书一般记录于适当的记录介质上。例如，可以将说明书印在纸张或塑料等基片上。这样，这些说明书可以作为药品说明书存在于试剂盒中，包括在试剂盒或其组分的容器上的标签中(即：随附于包装或子包装上)。在其他实施方案中，这些说明书可以采取电子存储数据文件的形式存储在适当的计算机可读存储介质上，如CD-ROM、软磁盘等，包括存放程序的相同介质。

实施例

下列实施例的意图是为了给本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并非意欲限制发明人要求其发明的保护范围，也并非意欲表示下面的实验是所进行的全部或仅有的实验。尽管已经尽力确保所用数字的精确度(如用量，温度等等)，但是应该考虑到某些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是指重量份数，分子量是指重均分子量，温度是指摄氏度，而压力为大气压或接近大气压。

实施例1

在抗TNFα兔单克隆抗体中鉴定变异耐受氨基酸

用TNFα免疫兔，将该兔的脾脏用于制备杂交瘤细胞，并分离表达抗TNFα单克隆抗体的杂交瘤细胞。将编码这些单克隆抗体重链和轻链的cDNA从分离的细胞中分离出来，然后进行测序。由cDNA编码的多肽依照它们的结构特征进行比对，这种比对被显示在图4中。图4显示出获得了两组相关的抗TNFα兔单克隆抗体。抗体52，63和115属于同一组。抗体1和204属于不同组。由星号(*)标明的位置是非变异位置，其中由句号(.)和冒号(：)标明的位置是变异耐受位置。许多变异耐受位置都存在于CDR中。

图2是从Kabat数据库中选取的十个兔抗体序列H3区域的多重序列比对用来显示在不相关抗体中的预期变异。

实施例2

抗TNFα兔单克隆抗体的人源化

将兔抗TNFα兔单克隆抗体A52的序列与最相似的人种系抗体L20相比对，兔抗TNFα兔单克隆抗体的变异耐受位置被在L20抗体的相应位置上的氨基酸所取代以产生人源化兔抗体(HZD)。被取代的氨基酸已经用星号标记。根据图4，位置31(在CDR内)是一个变异耐受位置，因为它是N或S。选择N是由于在人类种系抗体的那个位置上发现的是N。根据图4，位置48(恰好在CDR外)是一个变异耐受位置，它是M或I。选择I是由于在人类种系抗体的那个位置上发现的是I。根据图4，位置50(在CDR内)是一个变异耐受位置，因为它是L或V。由于A是在人类种系抗体的那个位置上发现的氨基酸，所以，这个位置被A所取代。根据图4，位置70(在构架区内)是一个变异耐受位置，因为它是E或Q。这个位置被D取代，因为在人类种系抗体的那个位置上发现的是D。根据图4，位置95B(在CDR内)是一个变异耐受位置，因为它是D或N。由于N的极性较小，因而可能免疫原性较低，所以这个位置被N取代。

从上述结果和讨论显而易见，本发明提供了一种对抗体进行抗体氨基酸改变的重要的新方法。由此，本发明的方法和系统可以用于许多不同的应用，包括科研，农业，治疗和其它应用。特别是，本发明提供了一种对非人类抗体的抗原结合区(如CDR区)进行人源化方法。因此，本发明对本领域做出了重大贡献。

尽管本发明已经参照其具体实施方案进行了描述，本领域技术人员应当理解可以进行各种改变并可以替换等同方案，而不背离本发明的真实精神和范围。此外，可以进行许多修改，以使特定的情况、材料、物质组成、方法、方法的一个或多个步骤适应于本发明的目的、精神和范围。所有这样的修改都包括在本文随附的权利要求范围内。

序列表

<110>COUTO，FERNANDO JOSE REBELO DO

HENDRICKS，KRISTIN B.

WALLACE，S.ELLEN

YU，GUO-LIANG

<120>抗体工程改造方法

<130>EPIT-013WO

<140>未指定

<141>2005-11-02

<150>10/984,473

<151>2004-11-08

<160>48

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>1

Arg Thr Ala Ala Thr Met Cys Leu Phe Gln Arg Phe Trp Thr Val Thr

1 5 10 15

Ala Pro Ser Ala Ser His Thr Val Gln Ile Thr

20 25

<210>2

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>2

Arg Thr Ala Ala Thr Met Cys Leu Phe Gln Arg Phe Trp Thr Val Ser

1 5 10 15

Ala Pro Ser Ala Ser His Thr Val Asn Ile Thr

20 25

<210>3

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>3

Arg Thr Gly Ala Thr Met Cys Leu Phe Gln Arg Phe Trp Thr Val Thr

1 5 10 15

Ala Pro Ser His Ser His Thr Val Gln Ile Thr

20 25

<210>4

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>4

Arg Thr Ala Ala Thr Val Cys Leu Phe Gln Arg Phe Trp Thr Val Ser

1 5 10 15

Ala Pro Ser Ala Ser His Thr Val Gln Ile Thr

20 25

<210>5

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>5

Arg Thr Cys Ala Thr Met Cys Leu Phe Gln Arg Phe Trp Thr Val Thr

1 5 10 15

Ala Pro Ser Ala Ser His Thr Val Gln Ile Thr

20 25

<210>6

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>6

Arg Thr Ala Ala Thr Met Cys Leu Phe Gln Arg Tyr Trp Thr Val Thr

1 5 10 15

Ala Pro Ser Gln Ser His Thr Val Gln Ile Thr

20 25

<210>7

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>7

Arg Thr Glu Ala Thr Met Cys Leu Phe Gln Arg Phe Trp Thr Val Thr

1 5 10 15

Ala Pro Ser Ala Ser His Thr Val Gln Ile Thr

20 25

<210>8

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>8

Arg Thr Ala Ala Thr Ile Cys Leu Phe Gln Arg Phe Trp Thr Val Thr

1 5 10 15

Ala Pro Ser Ala Ser His Thr Val Gln Ile Thr

20 25

<210>9

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>9

Arg Thr Ala Ala Thr Val Cys Leu Phe Gln Arg Trp Trp Thr Val Thr

1 5 10 15

Ala Pro Ser Ala Ser His Thr Val Tyr Ile Thr

20 25

<210>10

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>10

Arg Thr Thr Ala Thr Met Cys Leu Phe Gln Arg Phe Trp Thr Val Thr

1 5 10 15

Ala Pro Ser Trp Ser His Thr Val Gln Ile Thr

20 25

<210>11

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<220>

<221>变体

<222>3，6，12，16，20，25

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>11

Arg Thr Xaa Ala Thr Xaa Cys Leu Phe Gln Arg Xaa Trp Thr Val Xaa

1 5 10 15

Ala Pro Ser Xaa Ser His Thr Val Xaa Ile Thr

20 25

<210>12

<211>27

<212>PRT

<213>兔

<400>12

Arg Thr Ala Ala Thr Met Cys Leu Phe Gln Arg Phe Trp Thr Val Thr

1 5 10 15

Ala Pro Ser Ala Ser His Thr Val Gln Ile Thr

20 25

<210>13

<211>27

<212>PRT

<213>人

<400>13

Arg Thr Thr Ala Ser Gly Ala Leu Ala Gln Arg Phe Trp Ala Cys Phe

1 5 10 15

Ala Pro Ala Ala His Gln Thr Val Tyr Thr Thr

20 25

<210>14

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>14

Arg Thr Thr Ala Thr Gly Cys Leu Phe Gln Arg Phe Trp Thr Val Phe

1 5 10 15

Ala Pro Ser Ala Ser His Thr Val Tyr Ile Thr

20 25

<210>15

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>15

Arg Thr Thr Ala Thr Met Cys Leu Phe Gln Arg Phe Trp Thr Val Thr

1 5 10 15

Ala Pro Ser Ala Ser His Thr Val Tyr Ile Thr

20 25

<210>16

<211>115

<212>PRT

<213>兔

<400>16

Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Ser Gly Asn Ile Trp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ile

65 70 75 80

Ser Pro Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly

85 90 95

Val Tyr Asn Ile Gly Leu Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210>17

<211>115

<212>PRT

<213>兔

<400>17

Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Ser Gly Asn Ile Trp Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr

65 70 75 80

Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly

85 90 95

Leu Tyr Asn Ser Gly Leu Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210>18

<211>115

<212>PRT

<213>兔

<400>18

Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Ser Gly Asn Ile Trp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr

65 70 75 80

Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly

85 90 95

Val Tyr Asn Ser Gly Leu Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210>19

<211>119

<212>PRT

<213>兔

<400>19

Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp Thr

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Ser Leu Ser Ser Asn Glu

20 25 30

Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Val Gly Asn Gly Gly Met Thr His Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser

50 55 60

Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Ser Leu Lys Thr Val Thr Leu Lys

65 70 75 80

Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Ser

85 90 95

Ser Val Ala Tyr Thr Gly Ile Tyr Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>20

<211>119

<212>PRT

<213>兔

<400>20

Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp Thr

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Asn Glu

20 25 30

Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Gly Asn Gly Gly Met Thr His Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asp Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu Lys

65 70 75 80

Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser

85 90 95

Ser Val Glu Tyr Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Asn Ile Trp Gly Pro Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>21

<211>112

<212>PRT

<213>兔

<400>21

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Ala Ser Glu Pro Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Thr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Met

35 40 45

Ser Leu Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn His Gly Ser Asn Ser

85 90 95

Asp Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210>22

<211>112

<212>PRT

<213>兔

<400>22

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser A1a Ser Glu Pro Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Thr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Val Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn His Gly Ser Asn Ser

85 90 95

Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210>23

<211>112

<212>PRT

<213>兔

<400>23

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Ala Ser Glu Pro Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Thr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn His Gly Ser Asn Ser

85 90 95

Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210>24

<211>110

<212>PRT

<213>兔

<400>24

Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Glu Pro Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Asp Asn Ile Tyr Ser Gly Leu

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Ala

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Val Tyr Ala Tyr Ser Ser Asp

85 90 95

Asp Gly Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210>25

<211>110

<212>PRT

<213>兔

<400>25

Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Glu Pro Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Asp Asn Ile Tyr Arg Gly Leu

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Val Tyr Gly Tyr Ser Ser Asp

85 90 95

Asp Gly Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210>26

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>26

Cys Ala Arg Asp Ile Asn Ser Tyr Gly Tyr Ala Tyr Ala Thr Asp Ile

1 5 10 15

Trp

<210>27

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>27

Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Ala Gly Ser Ser Tyr Tyr Asn Leu Trp

1 5 10 15

<210>28

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>28

Cys Ala Arg Ser Asp Tyr Ser Tyr Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Trp

1 5 10 15

<210>29

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>29

Cys Ala Arg Arg Val Asp Ser Thr Gly Thr Asp Ile Trp

1 5 10

<210>30

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>30

Cys Gly Ser Gly Tyr Tyr Ile Asn Tle Trp

1 5 10

<210>31

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>31

Cys Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ile Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Asn Ile

1 5 10 15

Trp

<210>32

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>32

Cys Ala Arg Gly Cys Pro Gly Tyr Gly Asp Asn Asp Ile Trp

1 5 10

<210>33

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>33

Cys Ala Arg Gly Tyr Trp Ser Leu Asp Ile Trp

1 5 10

<210>34

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>34

Cys Val Arg Asp Ser Thr Gly Ile Ser Ala Leu Phe Asn Val Trp

1 5 10 15

<210>35

<211>16

<212>PRT

<213>人

<400>35

Cys Ala Arg Arg Gly Ala Thr Ala Ser His Arg Trp Phe Thr Ile Trp

1 5 10 15

<210>36

<211>16

<212>PRT

<213>人

<400>36

Cys Gly Ser Gly Ala Asn Ile Glu Asn Glu Phe Phe Asn Ala Ile Trp

1 5 10 15

<210>37

<211>16

<212>PRT

<213>人

<400>37

Cys Ala Arg Gly Asp Arg Ser His Asp Tyr Asp Tyr Phe Lys Ile Trp

1 5 10 15

<210>38

<211>18

<212>PRT

<213>人

<400>38

Cys Ala Arg Ser Gln Asp Ser Gly Ser His Asp Asp Phe Pro Phe Asn

1 5 10 15

Ile Trp

<210>39

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>39

Cys Ala Arg Ser Pro Gly Gly Ile Gly Asp Ala Phe Asp Pro Trp

1 5 10 15

<210>40

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>40

Cys Ala Arg Gly Trp Val Gly Leu Asn Ile Trp

1 5 10

<210>41

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>41

Cys Ala Arg Arg Ala Asp Ser Tyr Gly Tyr Ala Tyr Asp Ile Trp

1 5 10 15

<210>42

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>42

Cys Ala Arg Tyr Gly Ala Ser Val Thr Tyr Phe Asn Ile Trp

1 5 10

<210>43

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>43

Cys Ala Arg Phe Arg Ile Leu Val Ile Val Leu Val Pro Leu Asp Leu

1 5 10 15

Trp

<210>44

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>44

Cys Ala Arg Gly Ala Thr Met Thr Met Val Arg Gly Trp Leu Asp Leu

1 5 10 15

Trp

<210>45

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>45

Cys Ala Arg Leu Gly Leu Val Val Val Ile Asn Ile Trp

1 5 10

<210>46

<211>112

<212>PRT

<213>兔

<400>46

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Ala Ser Glu Pro Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Thr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Met

35 40 45

Ser Leu Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Val Tyr Cys Gln Ser Asn His Gly Ser Asn Ser

85 90 95

Asp Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210>47

<211>101

<212>PRT

<213>人

<400>47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Val Tyr Cys Gln Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr

85 90 95

Lys Val Glu Ile Lys

100

<210>48

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>48

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Ala Ser Glu Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Thr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Met

35 40 45

Ser Leu Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn His Gly Ser Asn Ser

85 90 95

Asp Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Val Lys

100 105 110

Claims

1.一种设计抗体的方法，其包括：

在亲本抗体内通过比较它的氨基酸序列与多种相关抗体的氨基酸序列来鉴定变异耐受位置，所述相关抗体每一种都与所述亲本抗体结合相同的抗原，和

取代存在于所述变异耐受位置上的氨基酸以产生结合所述抗原并且其氨基酸序列不同于所述相关单克隆抗体的氨基酸序列的抗体。

2.权利要求1的方法，其中所述方法包括：

比较所述亲本抗体的CDR的氨基酸序列与所述相关亲本抗体的CDR和

取代在所述CDR中的氨基酸。

3.权利要求1的方法，其中所述方法包括：

比较所述亲本抗体的构架区的氨基酸序列与所述相关亲本抗体的相同构架区和

取代在所述构架区中的氨基酸。

4.权利要求1的方法，其中所述相关亲本抗体和所述亲本抗体是利用来自通过所述抗原免疫的单一动物的细胞制备的。

5.权利要求1的方法，其中所述单一动物是单一的兔，小鼠或鸡。

6.权利要求1的方法，其中变异耐受位置的氨基酸被存在于所述相关抗体之一中的相应位置上的氨基酸取代。

7.权利要求1的方法，其中氨基酸变异耐受位置的氨基酸被存在于相似人类抗体中的相应位置上的氨基酸取代。

8.权利要求7的方法，其中所述相似人类抗体是由人类种系抗体序列构成的。

9.权利要求1的方法，其中所述比较包括排列所述抗体氨基酸序列以进行序列比对。

10.权利要求1的方法，其中所述多种相关抗体是至少3种相关抗体。

11.权利要求1的方法，其中所述亲本抗体的至少两个非连续氨基酸被取代。

12.权利要求1的方法，其中所述亲本抗体的框架中的氨基酸被取代。

13.编码通过权利要求1的方法设计的抗体的核酸。

14.一种包含权利要求13的编码核酸的载体。

15.一种包含权利要求14的载体的宿主细胞。

16.一种制备抗体的方法，包括：

在适于在所述细胞中生产所述抗体的条件下培养权利要求15的宿主细胞。

17.通过权利要求1的方法设计的抗体。

18.一种使单克隆抗体人源化的方法，包括：

通过比较它的氨基酸序列与多种相关单克隆抗体的氨基酸序列来鉴定单克隆抗体的变异耐受位置，所述相关单克隆抗体每一种都与所述单克隆抗体结合相同的抗原，和

在所述变异氨基酸上的氨基酸用存在于相似人类抗体的相应位置上的不同氨基酸来取代。

19.权利要求18的方法，其中在CDR区域内的氨基酸被取代。

20.权利要求18的方法，其中在构架区域内的氨基酸被取代。

21.权利要求18的方法，其中所述单克隆抗体是兔，小鼠或鸡单克隆抗体。

22.权利要求18的方法，其中所述相似人类抗体是由人类种系抗体序列构成的。

23.筛选具有改善活性的单克隆抗体的方法，包括：

通过比较它的氨基酸序列和多种与所述单克隆抗体一样各自结合相同抗原的相关单克隆抗体的氨基酸序列来鉴定单克隆抗体的变异耐受位置，

在所述的变异耐受位置上的氨基酸用不同的氨基酸来取代从而产生试验抗体；和

针对改善的活性筛选所述试验抗体。

24.权利要求23的方法，其中所述单克隆抗体的CDR的氨基酸被不同的氨基酸所取代。

25.权利要求23的方法，其中所述单克隆抗体构架区的氨基酸被不同的氨基酸所取代。

26.权利要求23的方法，其中所述试验抗体针对增加的亲和力或特异性而被筛选。

27.权利要求23的方法，其中所述筛选通过ELISA进行。

28.权利要求23的方法，其中变异耐受位置的氨基酸被在所述相关单克隆抗体之一中的相应位置上的不同氨基酸所取代。

29.改善单克隆抗体活性的方法，包括：

通过比较所述单克隆抗体的氨基酸序列和多种与所述单克隆抗体一样各自结合相同抗原的相关单克隆抗体的氨基酸序列来鉴定单克隆抗体的变异耐受位置，和

在所述的变异耐受位置上的氨基酸用存在于所述相关单克隆抗体之一中的相应位置上的不同氨基酸来取代。

30.权利要求29的方法，其中所述单克隆抗体CDR的氨基酸被不同的氨基酸所取代。

31.权利要求29的方法，其中所述单克隆抗体构架区的氨基酸被不同的氨基酸所取代。

32.权利要求29的方法，其中所述氨基酸取代提供具有改善的亲和力，亲和性或特异性的抗体。

33.制备结合特定抗原的抗体的共有序列的方法，包括：

比较多种各自结合相同抗原的相关单克隆抗体的氨基酸序列来鉴定结合所述抗原的抗体的氨基酸共有序列。

34.权利要求33的方法，进一步包括产生一种抗体，该抗体具有被所述氨基酸共有序列所包括的氨基酸序列。

35.权利要求34的方法，其中所述抗体与任何一种所述相关单克隆抗体相比包含单个变化。

36.权利要求34的方法，其中所述抗体与任何一种所述相关单克隆抗体相比包含多个变化。