CN115819575A - 针对人肿瘤坏死因子-α的单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种针对人肿瘤坏死因子‑α的单克隆抗体,该单克隆抗体能够特异性结合人肿瘤坏死因子‑α,因此,可用该单克隆抗体应用于制备检测人肿瘤坏死因子‑α水平的试剂盒。另外,由于该单克隆抗体能够阻断或抑制因高水平的人肿瘤坏死因子‑α对机体的免疫平衡的破坏,从而达到治疗法相关疾病的目的,因此,该单克隆抗体或含有单克隆抗体的组合物可用于制备治疗相关疾病的药物前体。
Description
技术领域
本申请涉及针对人肿瘤坏死因子-α具有特异性的的单克隆抗体,还涉及该抗体的治疗用途及生产该抗体的方法。
背景技术
人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的多功能急性炎症因子。早期研究发现TNF-α通过一系列信号通路分子事件,促进炎症反应,最终导致肿瘤细胞坏死或者凋亡。随着研究深入,TNF-α的复杂生物学效应逐渐显现,在细胞增殖、细胞分化、细胞存活、免疫细胞发育、风湿性疾病和其他自体免疫疾病等中均有着重要作用。TNF-α分子以单次穿膜蛋白(mTNF-α)和可溶胞外区(sTNF-α)两种形式存在,其可溶胞外区约17KD,有糖基化,可以形成同源三聚体。TNF-α结合在同源三聚受体TNFR-1和TNFR-2,可分别激活MAPK、NF-κB、Caspase等下游信号通路,调节基因表达和细胞凋亡。TNF-α信号通路的异常活性与急性感染和慢性炎症密切相关,因而是重要的炎症反应生物标志物,同时也是一个治疗炎症反应的重要药物靶点。通过测定人体液或人激活淋巴细胞培养上清液中的TNF-α水平,可以对炎症反应和炎症治疗预后做出诊断评估。在正常人的血清中,TNF-α蛋白水平较低,其浓度范围在100pg/mL左右,因此,开发一种高灵敏度的TNF-α蛋白检测方法学,具有非常重要的临床意义。
为了提高酶联免疫吸附剂(ELISA)检测方法的特异性和灵敏度,目前业内的共识是采取抗TNF-α的单克隆抗体对来开发相应的酶联免疫吸附剂(ELISA)检测试剂盒。但是,目前市面上面几乎所有的TNF-α酶联免疫吸附剂(ELISA)检测试剂盒,均采用鼠抗人TNF-α单克隆抗体,其亲和力和特异性普遍低于兔单克隆抗体。并且所使用的鼠单克隆抗体依赖于传统的杂交瘤方法开发和生产,制备工艺相较于重组单克隆抗体更为复杂,也存在较大批间差。因此,利用鼠单克隆抗体所开发酶联免疫吸附剂(ELISA)检测试剂盒存在着灵敏度不高、批间差较难控制等挑战。
发明内容
本申请提供一类高特异性的人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)兔单克隆抗体来代替传统的鼠单克隆抗体,以在一定程度上解决上述技术问题之一。所述的TNF-α兔单克隆抗体的免疫原来自哺乳表达系统具有生物活性的高质量重组TNF-α全长胞外区(对应sTNF-α),制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术。所述单克隆抗体能够特异性结合人肿瘤坏死因子-α,因此,可用所述单克隆抗体应用于制备检测人肿瘤坏死因子-α水平的试剂盒。另外,由于所述单克隆抗体能够阻断或抑制因高水平的人肿瘤坏死因子-α对机体的免疫平衡的破坏,从而达到治疗法相关疾病的目的,因此,所述单克隆抗体或含有单克隆抗体的组合物可用于制备相关药物。总之,本申请提供的单克隆抗体对于人肿瘤坏死因子-α以及相关疾病的诊断与治疗都具有重要临床价值。
为此,本申请实施例至少公开了如下技术方案:
一种抗体,所述抗体特异性结合人肿瘤坏死因子-α,所述抗体:
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区,所述轻链可变区具有:VLCDR1,其由SEQ ID NO:1或7所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;VL CDR2,其由SEQ ID NO:2或8所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;以及VL CDR3,其由SEQ ID NO:3或9所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
和/或
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区,所述重链可变区具有:VHCDR1,其由SEQ ID NO:4或10所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;VH CDR2,其由SEQ ID NO:5或11所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;以及VH CDR3,其由SEQ ID NO:6或12所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;优选地,所述置换为保守性置换。
一种抗体,特异性结合人肿瘤坏死因子-α。所述抗体包含轻链可变区和重链可变区。所述轻链可变区由SEQ ID NO:17所示序列组成,所述SEQ ID NO:17序列中的X为空白或由任意氨基酸代替。所述重链可变区由SEQ ID NO:18所示序列组成,所述SEQ ID NO:18中的X为空白或由任意氨基酸代替。
一种抗体,包含具有轻链可变区和重链可变区的Fv段,所述轻链可变区由SEQ IDNO:17所示序列组成,所述SEQ ID NO:17序列中的X为空白或由任意氨基酸代替;所述重链可变区由SEQ ID NO:18所示序列组成,所述SEQ ID NO:18中的X为空白或由任意氨基酸代替。
一种抗体,包含具有轻链可变区和重链可变区的Fab段,所述轻链可变区由SEQ IDNO:17所示序列组成,所述SEQ ID NO:17序列中的X为空白或由任意氨基酸代替;所述重链可变区由SEQ ID NO:18所示序列组成,所述SEQ ID NO:18中的X为空白或由任意氨基酸代替。
一种抗体,包含具有轻链可变区和重链可变区的F(ab’)2,所述轻链可变区由SEQID NO:17所示序列组成,所述SEQ ID NO:17序列中的X为空白或由任意氨基酸代替;所述重链可变区由SEQ ID NO:18所示序列组成,所述SEQ ID NO:18中的X为空白或由任意氨基酸代替。
一种缀合物,包含所述的抗体,及与所述抗体连接的可检测的标记。
一种药物组合物,其含有所述的抗体以及药学上可接受的载体和/或赋形剂;所述药物组合物用于体外或在受试者体内阻断人肿瘤坏死因子-α,和/或阻断或抑制因高水平的人肿瘤坏死因子-α对机体的免疫平衡的破坏。
一种试剂盒,用于检测人肿瘤坏死因子-α,所述试剂盒包括所述的抗体或所述的缀合物。
附图说明
图1为本申请实施例提供的3A6抗体和8C7抗体VL和VH序列对比图。
图2为本申请实施例提供的3A6抗体与人TNF-α蛋白结合曲线。
图3为本申请实施例提供的8C7抗体与人TNF-α蛋白结合曲线。
图4为本申请实施例提供的3A6抗体和8C7抗体EP实验结果。
图5为本申请实施例提供的3A6抗体和8C7抗体对人TNF-α蛋白ELISA检测结果图。
图6为本申请实施例提供的3A6抗体和8C7抗体交叉反应结果图。
图7为本申请实施例提供的3A6抗体和8C7抗体稳定性实验结果图。
图8为本申请实施例提供的人TNF-α诱导L929细胞凋亡的曲线图。
图9为本申请实施例提供的3A6抗体对人TNF-α的阻断活性曲线图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请,并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂,均可从商业途径获得;未详细特别说明的方法均为常规实验方法,可从现有技术中获知。
术语解释
在本申请中,术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释,具有各种抗体结构,包括但不限于Y型抗体、所谓的全长抗体、Y型抗体的抗原结合部分,以及它们的遗传学或化学修饰。其中,“抗原结合部分”是指Y型抗体的一个或多个部分或片段,可以保留该抗体与人肿瘤坏死因子-α特异性结合的能力。
在本申请中,术语“单克隆抗体”(mAb)包括具有基本相同的抗原决定簇的高度同质的抗体群。即在该抗体群中,单个抗体基本上是相同的,除了可能自然发生的少量突变。单克隆抗体可以对抗原上的特定表位显示出单一的结合特异性和亲和力。与通常包含针对不同表位的多克隆抗体相比,每个单克隆抗体可以针对抗原上相同或基本相同的表位。修饰词“单克隆”表示抗体的特性是从一个基本同质的抗体群体中获得的,并且不能被解释为需要通过任何特定的方法制得的抗体。该抗体可以通过多种方法制备,包括但仅限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库以及类似的方法制得。
在本申请中,术语“兔抗体”或“抗人肿瘤坏死因子-α兔单克隆抗体”或者类似术语中的修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。在一个实施例中,抗人肿瘤坏死因子-α的兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR和骨架区(FR)。在一个实施例中,针对人肿瘤坏死因子-α的兔抗体或兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR。在一个实施例中,针对人肿瘤坏死因子-α的兔单克隆抗体可以为CDR区来源于兔源免疫球蛋白序列、而FR来自于其他哺乳动物的种系免疫球蛋白序列(如小鼠或人类)的一种抗体。术语“抗人肿瘤坏死因子-α的兔单克隆抗体”也可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基的抗体,例如,由体外随机突变或点特异性突变引入的、或体内体细胞突变引入的突变。然而,术语“抗人肿瘤坏死因子-α的兔单克隆抗体”并不包括CD R区来自其他哺乳动物的种系(如老鼠)的抗体。
在本申请中,术语“抗体”是指,由四条异源性多肽链组成的免疫球蛋白分子,其中,分子量较大的两条链称为重链(heavy chain,H),而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain,L)。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大,其他部分氨基酸序列相对恒定。因此,将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region,V),分别占重链和轻链的1/4和1/2;将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域,称为恒定区(constant region,C),分别占重链和轻链的3/4和1/2。
重链的V区和轻链的V区分别称为VL和VH。VL和VH中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域,称为高变区(hypervariable region,HVR)或互补决定区(complementarity determining region,CDR),包括HVRl(CDRl)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3),其中,HVR3(CDR3)变化程度更高。VL和VH的3个CDR共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site),决定抗体的特异性,是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中,CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守,称为骨架区(framework region,FR)。VH或VL各有四个骨架区,分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示。
重链的恒定区称为CH,轻链的恒定区称为CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致,但是不同类Ig的CH长度不同,如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3,而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。
在本申请中,术语“构架区”或“骨架区”的残基是指,抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
在本申请中,术语“嵌合抗体”是指其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类),且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类),但其仍保留对目标抗原的结合活性。
在本申请中,术语“人源化抗体”是指,经基因工程改造的非人源抗体,其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言,人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体),全部或部分的非CDR区(如可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。典型地,人源化抗体的至少一个或两个但通常所有三个(重和/或轻免疫球蛋白链的)受体CDR被供体CDR替换。提供CDR的免疫球蛋白称为“供体”,提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方式中,供体免疫球蛋白是非人源(如兔)抗体,受体框架可以天然存在的人框架,或与其相比具有约85%、90%、95%、99%或更高同一性的序列。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质,包括但不限于,抗原特异性、亲和性、反应性等。供体抗体可以是有预期性质(如,抗原特异性、亲和性、反应性等)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(如,食蟹猴)抗体。
本申请的嵌合抗体或人源化抗体可以根据免疫动物(如兔子)所产生的单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从来自免疫动物的目标杂交瘤或特异性B细胞中获得,并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含人免疫球蛋白序列。
在本申请中,术语“特异性结合”是指,两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本申请中,术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。
在本申请中,术语“保守性置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换,例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(具有相似大小、形状、电荷、化学性质,包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。
在本申请中,术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂,其是本领域公知的,包括但不限于:pH调节剂,表面活性剂,佐剂,离子强度增强剂,稀释剂,维持渗透压的试剂,延迟吸收的试剂,防腐剂。
在本申请中,术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量,“治疗有效量”是指,足以治愈或至少部分阻止已患有相关疾病的患者的疾病和其并发症的量,“预防有效量”是指,足以预防,阻止,或延迟相关疾病的发生的量。
抗体
为此,本申请实施例公开了一种抗体,该抗体特异性结合人肿瘤坏死因子-α。该抗体包含下述3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区,所述轻链可变区具有:VL CDR1,其由SEQ ID NO:1或7所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;VL CDR2,其由SEQ ID NO:2或8所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;以及VL CDR3,其由SEQ ID NO:3或9所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
和/或
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区,所述重链可变区具有:VHCDR1,其由SEQ ID NO:4或10所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;VH CDR2,其由SEQ ID NO:5或11所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;以及VH CDR3,其由SEQ ID NO:6或12所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;优选地,所述置换为保守性置换。
在某些实施方式中,该抗体包括:包含下述3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VH),所述轻链可变区具有:
VL CDR1,其由SEQ ID NO:1所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;VL CDR2,其由SEQ ID NO:2所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;VL CDR3,其由SEQ ID NO:3所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
和/或
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区,所述重链可变区具有:VHCDR1,其由SEQ ID NO:4所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;VH CDR2,其由SEQ ID NO:5所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;以及VH CDR3,其由SEQ ID NO:6所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
优选地,所述置换为保守性置换。
在某些实施方式中,该抗体包括:包含下述3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VH),所述轻链可变区具有:
VL CDR1,其由SEQ ID NO:7所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;VL CDR2,其由SEQ ID NO:8所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;VL CDR3,其由SEQ ID NO:9所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
和/或
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区,所述重链可变区具有:VHCDR1,其由SEQ ID NO:10所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;VH CDR2,其由SEQ ID NO:11所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;以及VH CDR3,其由SEQ ID NO:12所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
优选地,所述置换为保守性置换。
在某些实施方式中,该抗人肿瘤坏死因子-α的抗体可以具有Y型分子结构。在一个实施例中,抗人肿瘤坏死因子-α的抗体可以包括一对重链和一对轻链。重链可以包括一个重链可变区和一个或多个重链恒定区。在一个实施例中,重链可以包括一个VH和三个CHS。与三个CHS相比,VH更接近重链的N端。与CHS相比,VH在氨基酸序列上表现出更高的多态性。VH可以在不同抗体之间有所不同,并且赋予每种抗体所具有的特异性。CHS的氨基酸序列在同型(类)的所有抗体中可以是相同的,也可在不同型抗体之间有所不同。术语“同型”是指由重链恒定区域基因编码的同类抗体(例如同为IgG)。哺乳动物的抗体一般包括五种类型的重链:γ、δ、α、μ和ε,相对应组成的抗体就称为IgG,IgD,IgA,IgM和IgE五种抗体。轻链可以是一个相对于重链更小的一个多肽亚基。轻链可以包括一个轻链可变区和一个轻链恒定区。VL通常是轻链的N端部分,在氨基酸序列上表现出更高的变异性。不同抗体之间的VL具有特异的氨基酸序列。在一个实施例中,重链可变区VH和轻链可变区VL可均用于识别和结合人肿瘤坏死因子-α。
在某些实施方式中,该抗人肿瘤坏死因子-α的抗体可以具有Y型分子结构,该“Y型分子结构”包括两个Fab段(抗原结合片段)、一个Fc段和铰链区。两个Fab段类似于“Y”型结构的两个臂,而Fc段类似于“Y”型结构的底部。铰链区将Fc段与两个Fab段连接起来。每一Fab段可以包含一个重链可变区、来自于重链的重链恒定区、一个轻链可变区和来自于轻链的轻链恒定区。每一Fab段包含一个由轻链可变区和重链可变区形成的可变段(Fv)。Fv段容纳抗原结合位点,即抗原配位。抗原配位可以位于兔单克隆抗体Y型结构的手臂顶端。每个可变区域(VL和VH),可以包括互补性决定区(CDR)和骨架区(FR)。CDR决定了兔单克隆抗体的特异性和亲和力。CDR包含与抗原结合的残基,并具备识别和接触人肿瘤坏死因子-α的功能。Y型兔单克隆抗体可包括6个CDR,其中3个位于VH中,即VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,另外3个位于VL中,即VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一些实施例中,位于VL和VH区域中的CDR,相互之间可被都FR分隔开。FR是序列结构中的保守区域。FR通常可以作为一个支架,以使得CDR形成能够特异性地结合抗原(例如人肿瘤坏死因子-α)的三维结构。FR的三维结构可以在不同的抗体中呈现保守性。Y型兔单克隆抗体的CDR可以被移植到来自其他物种的另一种抗体的FR之间,同时保留其与人肿瘤坏死因子-α结合的能力,形成一种融合抗体。在一个实施例中,将Y型兔单克隆抗体的CDR移植到人抗体的FR之间,形成一个抗人肿瘤坏死因子-α的人源化抗体。在一些实施例中,该抗体包含来源于人免疫球蛋白的FR区,所述FR区任选地包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个从人源残基至相应的兔源残基的回复突变。
抗体制备
另外一方面,本申请公开了上述抗体的制备方法,本申请的单克隆抗体可以采用本领域已知的各种方法来制备,如通过基因工程重组技术来获得;通过化学合成或PCR扩增获得编码本申请抗体的重链和轻链基因的DNA分子,将所得DNA分子插入表达载体内,然后转染宿主细胞,并在特定条件下培养转染后的宿主细胞,并表达本申请的抗体。
在某些实施方式中,制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术。在一些实施例中,所述制备方法包括:以重组人sTNF-α蛋白作为免疫原,免疫新西兰大白兔;从大白免的脾脏细胞中分选B淋巴细胞并进行培养;提取B淋巴细胞中的RNA,反转录成cDNA;cDNA经PCR扩增获得天然配对的的兔单克隆抗体;将然配对的的兔单克隆抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区基因分别装载至表达载体上,并将载体转染宿主细胞,培养宿主细胞,并从宿主细胞的培养液分离,纯化获得所述的单克隆抗体。
一个该兔源单克隆抗体的制备实施过程包括:
(1)分选B淋巴细胞
以重组人sTNF-α蛋白(武汉爱博泰克公司)为免疫原,免疫2只新西兰大白兔;每只大白兔免疫量为200μg,首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂,在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂,在兔腹部及背部皮下多点注射,加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本,用酶联免疫吸附剂(ELISA)方法测定其针对TNF-α的滴度,取血清滴度高的兔子,用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次,三天后从脾脏细胞分选B淋巴细胞,B淋巴细胞筛选方法参见专利“可溶性B淋巴细胞刺激因子原核表达及其单克隆抗体制备[J]生物学杂志,出2021,第3期,ISSN:2095-1736”。
(2)培养B淋巴细胞,用抗原包被的酶联免疫吸附剂(ELISA)检测其阳性克隆。收集阳性克隆的细胞收,裂解后提取RNA并反转录成cDNA。采用PCR方法,天然配对的兔单克隆抗体轻重链可变区(VL和VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来,并经测序确定序列。
3、单克隆抗体的生产和纯化:为了获得多株识别人sTNF-α蛋白的兔单克隆抗体,本申请将兔单克隆抗体重链、轻链基因分别装载在表达载体上,将质粒转染293F细胞;转染72~96小时获得培养上清中含有重组的识别人sTNF-α蛋白且不识别大小sTNF-α的兔单克隆抗体。使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别人TNF-α蛋白的兔单克隆抗体,抗体验证合格后分装,于-20℃低温保存备用。
(3)结果
本申请实施例中筛选出两株高性能重组兔单克隆抗体,分别为3A6抗体和8C7抗体,其抗体序列信息如表1所示:
表1
上述两个抗体均特异性结合TNF-α。如图1所示,通过将上述两个单克隆抗体VL和VH的序列信息进行对比,可以发现3A6抗体和8C7的VL和VH序列同一性非常高,达到70%。因此可知,对TNF-α能够特异性结合的功能源自3A6抗体和8C7的VL和VH序列中相同的氨基酸序列,而其它不同的占比较小(低于30%)的氨基酸序列,不会影响各自抗体与TNF-α的特异性结合,进一步确定将前述占比较小的不同氨基酸序列区域的氨基酸去除或以任意氨基酸代替原有的氨基酸,均不会影响抗体与TNF-α的特异性结合。
基于上述结论,本申请实施例提供一种单克隆抗体,所述抗体包含:重链可变区;所述重链可变区由SEQ ID NO:17所示序列组成,所述SEQ ID NO:17序列中的X为空白或由任意氨基酸代替;及轻链可变区;所述轻链可变区由SEQ ID NO:18所示序列组成,所述SEQID NO:18中的X为空白或由任意氨基酸代替。
免单克隆抗体与TNF-α亲和力检测
本申请实施例利用Gator Prime(购自星童)和探针为Protein A探针检测上述实施例提供的免单克隆抗体与TNF-α亲和力,该检测方法包括:
(1)探针预湿润:使用前将Protein A探针在配套Q Buffer(137mM NaCl,2.7mMKCl,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,0.02%吐温,和0.2%BSA,pH7.4)中震荡润湿,1000rpm,300秒;
(2)基线校准1:将Protein A探针放置于Q Buffer中进行起始点校准,保证探针初始于稳定状态,1000rpm,60秒;
(3)抗体上样:将待测抗体3A6和8C7结合到Protein A探针上,抗体上样浓度为3μg/mL,1000rpm,100秒;
(4)基线校准2:将固化抗体后的探针放置于1×PBS,pH7.4(137mM NaCl,2.7mMKCl,10mM Na2HPO4,and 1.8mM KH2PO4)中进行震荡洗涤,1000rpm,60秒;
(5)抗体-抗原结合:固化抗体后的探针分别放置于75nM和150nM人TNF-α蛋白(购自R&D SYSTEMS)溶液中,测试抗体在不同的摩尔浓度条件下结合抗原的亲和力情况,1000rpm,300秒;
(6)抗原解离:当抗原抗体结合达到饱和状态后,将探针转至Q Buffer中完成解离过程,1000rpm,1080秒。
结果:3A6抗体和8C7抗体对人TNF-α蛋白的亲和力检测结果如表2所示:
表2
从表中可以看出,3A6和8C7抗体对人TNF-α蛋白具有较高的亲和力,如图2~3所示,3A6和8C7抗体,在5min时,两抗体对TNF-α蛋白结合达到稳定值,结合速率也较快。以上结果表现出筛选出的3A6和8C7抗体对人TNF-α蛋白特异性结合能力。
兔单抗3A6抗体和8C7抗体的抗原表位检测实验
本申请实施例利用Gator Prime和Anti-His探针检测上述实施例提供的兔单抗3A6抗体和8C7抗体的抗原表位,该检测方法包括:
(1)探针预湿润:使用前将Anti-His探针在配套Q Buffer中震荡润湿,1000rpm,300秒;
(2)基线校准1:将Anti-His探针放置于Q Buffer中进行起始点校准,保证探针初始于稳定状态,1000rpm,60秒;
(3)捕获抗体上样:将人TNF-α蛋白固化在Anti-His探针上,固化浓度为5μg/mL,1000rpm,1660秒;
(4)基线校准2:将固化蛋白后的探针放置于Q Buffer中进行震荡洗涤,1000rpm,60秒;
(5)捕获抗体-抗原结合:固化蛋白后的探针首先放置于3μg/mL的1×PBS,pH7.4中,使捕获抗体3A6和目的蛋白结合至饱和,1000rpm,1980秒;
(6)捕获抗体-抗原-检测抗体结合:将固化人TNF-α蛋白和捕获抗体3A6的探针放置于1×PBS,pH7.4中,使检测抗体8C7结合人TNF-α蛋白在不同于第一抗体(捕获抗体)的其他表位上,1000rpm,600秒。
结果:如图4所示,3A6抗体作为捕获抗体,8C7作为检测抗体分别稳定的结合在人TNF-α蛋白的不同表位上,因此,3A6抗体和8C7可用于人TNF-α蛋白的检测。
3A6抗体和8C7抗体的双抗夹心ELISA实验
在本申请实施例中,将3A6抗体作为捕获抗体、将8C7抗体作为检测抗体进行双抗夹心ELISA实验,具体实验步骤包括:
(1)将兔抗体3A6用pH7.4 PBS稀释成1μg/mL,涡旋仪温柔混匀后,以100μL/孔加入到96孔微孔板中,盖上封板膜,置于4℃冰箱孵育16~20h后,弃去孔内液体,用1×PBST,pH7.4(1×PBS+0.05%Tween-20)洗板一次,加样350μL,静置40秒后弃去孔内液体,在平板纸上拍干孔内液体;将ELISA封闭液(购自ThermoFisher)以200μL/孔加入到板孔内,盖上盖板膜,37℃封闭2小时,封闭完成后弃去封闭液,将酶标板拍干后,置于37℃烘箱烘干0.5~2h,取出备用;将人TNF-α蛋白用抗原稀释液(购自SurModics)进行稀释,稀释后的梯度浓度分别为250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.62pg/mL、7.81pg/mL、3.91pg/mL、0pg/mL,然后以100μL/孔依次加入酶标板中,盖上盖板膜,37℃孵育2h;孵育完成后,弃去孔内液体,用1×PBST,pH7.4洗板三次,加样300μL,静置40秒后弃去孔内液体,在平板纸上拍干孔内液体;
(2)将8C7-biotin用抗原稀释液(购自SurModics)稀释成0.0125μg/mL后,以100μL/孔依次加入酶标板中,盖上盖板膜,37℃孵育1小时;孵育完成后,弃去孔内液体,用1×PBST,pH7.4洗板三次,加样300μL,静置40秒后弃去孔内液体,在平板纸上拍干孔内液体;将100SA-HRP浓缩液用抗原稀释液(购自SurModics)100倍稀释后,以100μL/孔依次加入酶标板中,盖上盖板膜,37℃孵育0.5小时;孵育完成后,弃去孔内液体,用1×PBST,pH7.4洗板三次,加样300μL,静置40秒后弃去孔内液体,在平板纸上拍干孔内液体;将TMB显色液以100μL/孔依次加入酶标板中,盖上盖板膜,37℃避光孵育15分钟;孵育完成后,取出酶标板,每孔加入50μL终止液(2M HCl),立即用酶标仪在450nm下进行读数,并在630nm下获取背景读数,用于校正450nm读数。
结果如图5所示,3A6抗体作为捕获抗体,8C7抗体作为检测抗体,对人TNF-α进行ELISA检测,体现出良好的线性,使检测具备良好的灵敏度和准确性。
3A6抗体与8C7抗体交叉反应分析
在本申请实施例中,通过ELISA试验检测3A6抗体和8C7的交叉反应性,具体包括:
(1)将兔抗体3A6用pH7.4 PBS稀释成1μg/mL,涡旋仪温柔混匀后,以100μL/孔加入到96孔微孔板中,盖上封板膜,置于4℃冰箱孵育16~20小时;孵育完成后,弃去孔内液体,用1×PBST,pH7.4洗板一次,加样350μL,静置40秒后弃去孔内液体,在平板纸上拍干孔内液体;将ELISA封闭液(购自ThermoFisher)以200μL/孔加入到板孔内,盖上盖板膜,37℃封闭2小时,封闭完成后弃去封闭液,将酶标板拍干后,置于37℃烘箱烘干0.5~2小时,取出备用;将人TNF-α蛋白、鼠TNF-α蛋白、兔TNF-α蛋白和人NF-κB1(均购自R&D)用抗原稀释液(购自SurModics)进行稀释,人TNF-α蛋白用稀释液稀释成2500pg/mL,其他需要测交叉反应的蛋白稀释成5ng/mL,然后以100μL/孔依次加入酶标板中,盖上盖板膜,37℃孵育2小时;孵育完成后,弃去孔内液体,用1×PBST,pH7.4洗板三次,加样300μL,静置40秒后弃去孔内液体,在平板纸上拍干孔内液体;
(2)将8C7-biotin用抗原稀释液(购自SurModics)稀释成0.0125μg/mL后,以100μL/孔依次加入酶标板中,盖上盖板膜,37℃孵育1小时;孵育完成后,弃去孔内液体,用1×PBST,pH7.4洗板三次,加样300μL,静置40秒后弃去孔内液体,在平板纸上拍干孔内液体;将100×SA-HRP浓缩液用抗原稀释液(购自SurModics)100倍稀释后,以100μL/孔依次加入酶标板中,盖上盖板膜,37℃孵育0.5小时;孵育完成后,弃去孔内液体,用1×PBST,pH7.4洗板三次,加样300μL,静置40秒后弃去孔内液体,在平板纸上拍干孔内液体;加TMB显色液:将TMB显色液以100μL/孔依次加入酶标板中,盖上盖板膜,37℃避光孵育15分钟;孵育完成后,取出酶标板,每孔加入50μL终止液(2M HCl),立即用酶标仪在450nm下进行读数,并在630nm下获取背景读数,用于校正450nm读数。
结果如图6所示,3A6抗体与8C7抗体用于检测人TNF-α蛋白,具有良好的特异性。
兔单抗3A6和8C7稳定性实验
在本申请实施例中,通过ELISA试验检测3A6抗体和8C7的稳定性,将捕获抗体3A6和检测抗体8C7-biotin浓度在1×PBS,pH7.4(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,and1.8mM KH2PO4)中调整到1mg/mL,置于37℃恒温箱中热破坏7天。7天后,捕获抗体3A6和检测抗体8C7-biotin用ELISA来检测其配对性能,未被热破坏的抗体对被用做对照。具体步骤如下:
分别将未被热破坏和热破坏7天后的兔抗体3A6用1×PBS稀释成1μg/mL,涡旋仪温柔混匀后,以100μL/孔加入到96孔微孔板中,盖上封板膜,置于4℃冰箱孵育16~20小时;孵育完成后,弃去孔内液体,用1×PBST(1×PBS+0.05%Tween-20)洗板一次,加样350μL,静置40秒后弃去孔内液体,在平板纸上拍干孔内液体;将ELISA封闭液(购自ThermoFisher)以200μL/孔加入到板孔内,盖上盖板膜,37℃封闭2小时,封闭完成后弃去封闭液,将酶标板拍干后,置于37℃烘箱烘干0.5~2小时,取出备用;将人TNF-α蛋白用抗原稀释液(购自SurModics)进行稀释,稀释后的梯度浓度包括250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.62pg/mL、7.81pg/mL、3.91pg/mL和0pg/mL,然后以100μL/孔依次加入酶标板中,盖上盖板膜,37℃孵育2小时;孵育完成后,弃去孔内液体,用1×PBST,pH7.4洗板三次,加样300μL,静置40秒后弃去孔内液体,在平板纸上拍干孔内液体;将未被热破坏和热破坏7天后的8C7-biotin用抗原稀释液(购自SurModics)稀释成0.0125μg/mL后,以100μL/孔依次加入酶标板中,盖上盖板膜,37℃孵育1小时;孵育完成后,弃去孔内液体,用1×PBST,pH7.4洗板三次,加样300μL,静置40秒后弃去孔内液体,在平板纸上拍干孔内液体;将100×SA-HRP浓缩液用抗原稀释液(购自SurModics)100倍稀释后,以100μL/孔依次加入酶标板中,盖上盖板膜,37℃孵育0.5小时;孵育完成后,弃去孔内液体,用1×PBST,pH7.4洗板三次,加样300μL,静置40秒后弃去孔内液体,在平板纸上拍干孔内液体;将TMB显色液以100μL/孔依次加入酶标板中,盖上盖板膜,37℃避光孵育15分钟;孵育完成后,取出酶标板,每孔加入50μL终止液(2M HCl),立即用酶标仪在450nm下进行读数,并在630nm下获取背景读数,用于校正450nm读数。
结果:如图7所示,经过7天热破坏处理过的抗体用于检测TNF-α蛋白时,仍能保持优势性能,进一步说明本申请所提供的兔单抗3A6和8C7,具有良好的稳定性。
兔单抗3A6和8C7阻断活性测定
TNF-α通过与TNF受体结合可促进L929细胞凋亡,在放线菌素D存在的条件,这种促凋亡作用更加明显,在一定浓度范围内,在培养的L929细胞中添加TNF-α,细胞的凋亡率与TNF-α的加入量成正相关。可采用CCK-8法,通过测定TNF-α对L929细胞的毒性作用间接反应TNF-α的活性。Anti-TNF-α阻断活性测可在TNF-α促L929细胞凋亡的同时,加入不同浓度的抗体封闭TNF-α上与TNF受体的结合位点,从而阻断上述通路,抑制了TNF-α对L929细胞的促凋亡作用。通过检测抗体对TNF-α促细胞凋亡的阻断率来衡量抗体对TNF-α的阻断活性。
在某些实施例中,具体的实验步骤包括:
(1)L929细胞培养:L929小鼠成纤维细胞生长至80%融合度时传代,活率为95%,将细胞悬液稀释至2×105Cells/mL,按100μL/孔接种至96孔细胞培养板。37℃5%CO2培养箱培养至细胞贴壁。
(2)TNF-α活性测定:
a.用完全培养基配制1μg/mL的放线菌素D,用含1μg/mL放线菌素D的培养基梯度稀释TNF-α,最大浓度10ng/mL,10倍梯度稀释,共7个梯度,一个无TNF-α的对照,每个处理设置3个复孔;
b.96孔板弃培养基,将配制好的放线菌素D+TNF-α混合液加入96孔板,处理24h。
(3)抗体阻断TNF-α活性测定:将终浓度为1μg/mL放线菌菌素D、20pg/mL TNF-α加入至完全培养基内。同时加入Anti-TNF-αantibodies(抗TNF-α抗体,包括3A6和8C7抗体),其抗体终浓度为1310ng/mL、131ng/mL、13.1ng/mL、1.31ng/mL、0.131ng/mL、0.0131ng/mL、0ng/mL孵育半小时后,稀弃96孔板上清,将孵育液加入到96孔板内培养24小时。
(4)CCK-8检测:每孔加入10μL CCK-8试剂,37℃孵育2h,使用酶标仪测每孔OD值(波长450nm、630nm),并分别计算TNF-α活性及抗体阻断TNF-α活性。阻断效率=[1-(Ac-As)/(Ac-Ab)]*100%;As:实验孔)含有细胞的培养基、CCK-8、TNF-α);Ac:对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8);Ab:空白孔(不含细胞和TNF-α的培养基,CCK-8)。
结论:从图8可知,人TNF-α具有凋亡L929细胞的生物活性。图9显示的是抗人TNF-α抗体,即兔抗体3A6针对人TNF-α的阻断活性曲线图,从图中可以看出,兔抗体3A6具有良好的阻断活性,可抑制TNF-α对L929细胞的促凋亡作用。
抗体作为治疗药物的应用
基于此,本申请实施例公开了一种缀合物,所述缀合物包含第一方面所述抗体,及与所述抗体连接的可检测的标记。抗体可进行衍生化(如标记),如被连接至另一个分子(如另一个多肽或蛋白)。通常,抗体的衍生化不会对与抗原(人肿瘤坏死因子-α)结合产生不利影响。因此,本申请的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。
在某些实施方式中,所述的抗体衍生化包括:将本本申请第一方面所述抗体功能性连接(如化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团,如另一个抗体(形成双特异性抗体),检测试剂,药用试剂,和/或能够介导抗体与另一个分子结合的蛋白或多肽(如抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。
在某些实施方式中,本申请提供的抗体还可以用化学基团进行衍生,如聚乙二醇(PEG),甲基或乙基,或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性,如增加血清半衰期。
在某些实施方式中,本申请提供的抗体带有可检测标记,所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的,其实例包括但不限于,酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等)、放射性核素(如3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(如异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(如Cy7、Alexa 750))、发光物质(如化学发光物质,如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物如三联吡啶钌)、磁珠、测热标记物如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(如链霉亲和素)的生物素。
在某些实施方式中,所述可检测的标记能够适用于免疫学检测(如酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法)。
在某些实施方式中,所述可检测的标记可以选自酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶)、化学发光试剂(如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(如荧光素或荧光蛋白,如FITC、TRITC或PE)、放射性核素或生物素。
在某些实施方式中,可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本申请第一方面所述的抗体,以降低潜在的位阻。
另外,本申请还公开了上述抗体在制备药物的应用,本申请的单克隆抗体前体可用于体外或在受试者体内阻断人肿瘤坏死因子-α,阻断或抑制因高水平的人肿瘤坏死因子-α对机体的免疫平衡的破坏,从而治疗相关疾病,如类风湿性关节炎(RA),多发性硬化症(MS),炎症性肠病(IBD),移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊乱综合征(MDS)等。因此,本申请提供了一种药物前体组合物,其含有本申请所述的单克隆抗体以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
另外,本申请还公开了一种试剂盒,用于检测人肿瘤坏死因子-α,所述试剂盒包括:所述的抗体或所述的缀合物。
在某些实施方式中,本申请的单克隆抗体能够特异性结合人肿瘤坏死因子-α,从而可用于检测人肿瘤坏死因子-α的水平。
在某些实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段不包含可检测的标记。
在某些实施方式中,所述试剂盒包含特异性识别本申请所述单克隆抗体的第二抗体;其中,所述第二抗体包括可检测的标记,如酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
在某些实施方式中,所述第二抗体对本申请所述的单克隆抗体所包含的恒定区所来自的物种(如兔或人)的抗体是特异的。
在某些实施方式中,所述第二抗体是抗-免疫球蛋白(如人或兔的免疫球蛋白)抗体,如抗IgG抗体。
在某些实施方式中,所述第二抗体是抗兔IgG抗体或抗人IgG抗体。
在某些实施方式中,本申请的试剂盒包含用于使相应可检测的标记被检测到的试剂。如,当所述可检测的标记为酶时,所述试剂盒还可以包含相应酶的显色底物,如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS或鲁米诺类化合物,或用于碱性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)或AMPPD。如当所述可检测的标记为化学发光试剂(如吖啶酯类化合物)时,所述试剂盒还可以包含用于化学发光的预激发液和/或激发液。
以上所述,仅为本申请较佳的具体实施方式,但本申请的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (16)
1.一种抗体,所述抗体特异性结合人肿瘤坏死因子-α,所述抗体包含下述3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区,所述轻链可变区具有:
VL CDR1,其由SEQ ID NO:1或7所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
VL CDR2,其由SEQ ID NO:2或8所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;以及
VL CDR3,其由SEQ ID NO:3或9所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
和/或
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区,所述重链可变区具有:
VH CDR1,其由SEQ ID NO:4或10所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
VH CDR2,其由SEQ ID NO:5或11所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;以及
VH CDR3,其由SEQ ID NO:6或12所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
优选地,所述置换为保守性置换。
2.根据权利要求1所述的抗体,其中,所述抗体包含:
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区,所述轻链可变区具有:
VL CDR1,其由SEQ ID NO:1所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
VL CDR2,其由SEQ ID NO:2所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;以及
VL CDR3,其由SEQ ID NO:3所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
和/或
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区,所述重链可变区具有:
VH CDR1,其由SEQ ID NO:4所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
VH CDR2,其由SEQ ID NO:5所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;以及
VH CDR3,其由SEQ ID NO:6所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
优选地,所述置换为保守性置换。
3.根据权利要求2所述的抗体,其中,所述抗体:
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区,所述轻链可变区具有如SEQ IDNO:1所示序列的VL CDR1、如SEQ ID NO:2所示序列的VL CDR2和如SEQ ID NO:3所示序列的VL CDR3;
和/或
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区,所述重链可变区具有如SEQ IDNO:4所示序列的VL CDR1、如SEQ ID NO:5所示序列的VL CDR2和如SEQ ID NO:6所示序列的VL CDR3。
4.根据权利要求1所述的抗体,其中,所述抗体包含:
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区,所述轻链可变区具有:
VL CDR1,其由SEQ ID NO:7所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
VL CDR2,其由SEQ ID NO:8所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;以及
VL CDR3,其由SEQ ID NO:9所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
和/或
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区,所述重链可变区具有:
VH CDR1,其由SEQ ID NO:10所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
VH CDR2,其由SEQ ID NO:11所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;以及
VH CDR3,其由SEQ ID NO:12所示序列组成,或与其相比具有1~3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
优选地,所述置换为保守性置换。
5.根据权利要求4所述的抗体,其中,所述抗体:
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区,所述轻链可变区具有如SEQ IDNO:7所示序列的VL CDR1、如SEQ ID NO:8所示序列的VL CDR2和如SEQ ID NO:9所示序列的VL CDR3;
和/或
包含下述3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区,所述重链可变区具有如SEQ IDNO:10所示序列的VL CDR1、如SEQ ID NO:11所示序列的VL CDR2和如SEQ ID NO:12所示序列的VL CDR3。
6.一种抗体,特异性结合人肿瘤坏死因子-α,所述抗体包含:
轻链可变区;所轻链可变区由SEQ ID NO:17所示序列组成,所述SEQ ID NO:17序列中的X为空白或由任意氨基酸代替;及
重链可变区;所述重链可变区由SEQ ID NO:18所示序列组成,所述SEQ ID NO:18中的X为空白或由任意氨基酸代替。
7.根据权利要求6所述的抗体,其中,所述抗体包含:
包含如SEQ ID NO:13所示序列的轻链可变区;及
包含如SEQ ID NO:14所示序列的重链可变区。
8.根据权利要求6所述的抗体,其中,所述抗体包含:
包含如SEQ ID NO:15所示序列的轻链可变区;及
包含如SEQ ID NO:16所示序列的重链可变区。
9.根据权利要求1~8任一所述的抗体,其中,所述抗体是其嵌合抗体、或其人源化抗体,或它们的变体,所述变体基本保留了其源自前述单克隆抗体的生物学功能。
10.一种抗体,包含具有轻链可变区和重链可变区的Fv段;所述轻链可变区由SEQ IDNO:17所示序列组成,所述SEQ ID NO:17序列中的X为空白或由任意氨基酸代替;所述重链可变区由SEQ ID NO:18所示序列组成,所述SEQ ID NO:18中的X为空白或由任意氨基酸代替。
11.一种抗体,包含具有轻链可变区和重链可变区的Fab段;所述轻链可变区由SEQ IDNO:17所示序列组成,所述SEQ ID NO:17序列中的X为空白或由任意氨基酸代替;所述重链可变区由SEQ ID NO:18所示序列组成,所述SEQ ID NO:18中的X为空白或由任意氨基酸代替。
12.一种抗体,包含具有轻链可变区和重链可变区的F(ab’)2,所述轻链可变区由SEQID NO:17所示序列组成,所述SEQ ID NO:17序列中的X为空白或由任意氨基酸代替;所述重链可变区由SEQ ID NO:18所示序列组成,所述SEQ ID NO:18中的X为空白或由任意氨基酸代替。
13.一种缀合物,所述缀合物包含如权利要求1~12任一所述的抗体,及与所述抗体连接的可检测的标记。
14.一种药物前体组合物,其含有权利要求1~12任一所述的抗体以及药学上可接受的载体和/或赋形剂;所述药物前体组合物用于体外或在受试者体内阻断人肿瘤坏死因子-α,和/或阻断或抑制因高水平的人肿瘤坏死因子-α对机体的免疫平衡的破坏。
15.一种试剂盒,用于检测人肿瘤坏死因子-α,所述试剂盒包括:如权利要求1~12任一所述的抗体或如权利要求13所述的缀合物。
16.如权利要求15所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包含特异性识别所述单克隆抗体的第二抗体;其中,所述第二抗体包括可检测的标记,所述第二抗体对如权利要求1~12任一所述的抗体或如权利要求13所述的缀合物所包含的恒定区所来自的物种(如兔或人)的抗体是特异的。
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- 2022-08-24 CN CN202211021059.XA patent/CN115819575B/zh active Active
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CN101080496A (zh) * | 2004-11-08 | 2007-11-28 | 宜康公司 | 抗体工程改造方法 |
US20120100132A1 (en) * | 2010-10-20 | 2012-04-26 | Wei-Chun Chiu | Humanized anti-human tumor necrosis factor alpha monoclonal antibody and sequence thereof |
CN102675460A (zh) * | 2011-02-28 | 2012-09-19 | 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 | 抗肿瘤坏死因子α的人源化抗体 |
WO2021023274A1 (zh) * | 2019-08-08 | 2021-02-11 | 神州细胞工程有限公司 | 人源化抗TNFα抗体及其用途 |
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