CN112969800A - 抗原的处理方法 - Google Patents

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清水知
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Sekisui Medical Co Ltd
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Abstract

需求制备在不预先通过变性剂对生物样品中的糖蛋白进行处理的情况下与糖蛋白的糖链发生特异性反应的抗体等选择性结合物质的方法、通过该方法而制备的选择性结合物质、和使用该选择性结合物质来特异性地检测糖蛋白的方法。为了解决所述问题,本发明通过用糖链特异性的糖链剪切酶对糖蛋白进行处理,来制备与糖蛋白的糖链发生特异性反应的选择性结合物质。

Description

抗原的处理方法
技术领域
本发明涉及:用于制造抗体等选择性结合物质的抗原的处理方法、使用进行了该处理的抗原来制造抗体等选择性结合物质的方法、通过该方法制造的抗体等选择性结合物质、使用了该抗体等选择性结合物质的糖蛋白的检测方法和用于这些方法的试剂盒。
背景技术
糖蛋白具有各种结构的糖链,如果能够利用识别这些单个糖链的抗体,则可得到生物体的状态等有关的各种信息。
另一方面,已知难以取得糖蛋白的糖链特异性的抗体,并认为其原因之一是由于在产生抗体的宿主动物中存在类似的糖链。为了克服该困难已经做了各种努力。例如,专利文献1公开了使用由糖肽的岩藻糖部分和肽部分这两者构成的抗原,制备以这些为表位的抗体的方法。
然而,为了通过由该方法制备的抗体来检测生物样品中的糖蛋白,而需要预先通过SDS等变性剂对生物样品进行处理,来使糖蛋白变性,该方法并不实用。
此外,专利文献2中公开了,通过用蛋白质分解酶对糖蛋白进行处理,来使糖蛋白与糖结合化合物反应得到的反应产物的检测水平增大的方法。
然而,由于在该方法中,蛋白质分解酶的活性是糖链结构非特异性的,因此不能特异性地检测具有特定的糖链的糖蛋白。
因此,需要制备在不预先通过变性剂对生物样品进行处理的情况下与糖蛋白的糖链发生特异性反应的抗体的通用性的方法。
现有技术文献
专利文献
[专利文献1]日本特开2017-214348
[专利文献2]国际公开2017/131022
发明内容
发明所解决的技术问题
本发明提供:制备在不预先通过变性剂对生物样品进行处理的情况下与糖蛋白的糖链发生特异性反应的抗体等选择性结合物质的方法、通过该方法而制备的抗体等选择性结合物质、和使用该抗体等选择性结合物质来特异性地检测糖蛋白的方法。
解决问题的技术手段
本发明人等为了解决所述问题进行了深入研究,结果发现,可通过在温和条件下通过糖链特异性的糖链剪切酶对糖蛋白进行处理,来制备与糖蛋白的糖链发生特异性反应的抗体,从而完成了本发明。
虽然理论上不限于此,但可认为理由如下:由于通过糖链特异性的糖链剪切酶进行了处理的糖链会产生在动物体内极为稀少的糖链结构、例如岩藻糖基化糖肽结构,因此不会妨碍产生抗体的动物体内的抗体产生。
即,本发明在一个方式中提供以下内容。
项目1、一种糖蛋白的处理方法,其是将糖蛋白用作抗原时的糖蛋白的处理方法,其中,所述方法包含:
通过糖链特异性的糖链剪切酶对糖链进行剪切的工序。
项目2、根据项目1所述的糖蛋白的处理方法,其中,
所述对糖链进行剪切的工序是通过该剪切使糖链中内在的表位处于可被选择性结合物质识别的状态的工序。
项目3、根据项目1或2所述的糖蛋白的处理方法,其中,
所述糖链特异性的糖链剪切酶选自Endo-A、Endo-M、Endo-H、Endo-D、Endo-F1、Endo-F2、Endo-F3。
项目4、根据项目1~3中任一项所述的抗原的处理方法,其中,
所述糖蛋白为AFP。
项目5、一种选择性结合物质的制造方法,其使用项目1~4中任一项所述的糖蛋白的处理方法。
项目6、一种检测生物样品中的糖蛋白的方法,其使用项目1~4中任一项所述的糖蛋白的处理方法。
项目7、一种糖蛋白据,其通过项目1~4中任一项所述的糖蛋白的处理方法进行了处理。
项目8、一种选择性结合物质,其与通过项目1~4中任一项所述的抗原的处理方法进行了处理的糖蛋白结合,并且不与未经过该处理的相同糖蛋白结合。
项目9、根据项目8所述的选择性结合物质,其是抗体或抗体的抗原结合片段。
项目10、一种制造方法,其制造项目8或9所述的选择性结合物质,其中,所述制造方法包含:
将通过项目1~4中任一项所述的抗原的处理方法进行了处理的糖蛋白用作抗原。
项目11、一种制造方法,其制造项目8或9所述的选择性结合物质,其中,所述制造方法包含:
将通过化学合成或基因重组技术而得到的糖蛋白用作抗原。
项目12、用作检测糖蛋白的方法,其包含下述工序:
通过糖链剪切酶对可能包含该糖蛋白的样品进行处理的工序;
使项目8所述的选择性结合物质作用于通过所述糖链剪切酶进行了处理的糖蛋白,来得到该糖蛋白与该选择性结合物质的反应产物的工序,和
检测所述反应产物的工序。
项目13、根据项目12所述的方法,其同时进行下述工序:
通过糖链特异性的糖链剪切酶对糖蛋白进行处理的工序;和
得到所述糖蛋白与选择性结合物质的反应产物的工序。
项目14、一种试剂盒,其是用于项目12或13所述的方法的试剂盒,其中,所述试剂盒在同一组合物中含有下述两种试剂:
用于通过糖链特异性的糖链剪切酶对糖蛋白进行处理的试剂;和
用于得到所述糖蛋白与选择性结合物质的反应产物的试剂。
项目15、一种抗体的制造方法,其使用了具有糖链结构的抗原,所述糖链结构在生物体内不存在或即使存在也极为稀少。
项目16、根据项目15所述的方法,其中,
所述抗原是通过糖链特异性的糖链剪切酶进行了处理糖蛋白。
项目17、根据项目15所述的方法,其中,
所述抗原通过化学合成或基因重组技术得到。
发明效果
通过利用本发明的糖蛋白的处理方法,可制备:在不使样品中的糖蛋白变性的情况下,仅通过温和条件的处理而检测糖蛋白的抗体等选择性结合物质。
此外,就使用了通过本发明的方法而制备的抗体等选择性结合物质的检测糖蛋白的方法而言,由于可在不使生物样品变性的情况下应用,因此可与不能在变性条件下利用的其他检查组合使用,可得到关于生物样品的更详细的信息。
附图说明
[图1]图1是表示通过用糖链特异性的糖链剪切酶对糖蛋白进行处理,来产生抗体的方法的概要的图。
[图2]图2是表示通过用糖链特异性的糖链剪切酶对糖蛋白进行处理,来对糖链进行剪切的图。
[图3]图3是表示糖肽的示意图的图。
[图4]图4是表示通过Endo-F2或Endo-F3对AFP(甲胎蛋白)进行了处理的结果的图。两种酶均显示可消化AFP的糖链。
[图5]图5是表示在使用了二糖肽与蛋白质交联而成的免疫原的情况下,使用了免疫动物的抗血清的抗原固相化ELISA法的结果的图。与非免疫动物的血清相比,免疫动物的抗血清显示包含更高浓度的针对二糖肽的抗体。
[图6]图6是表示使用了产生抗AFP抗体的杂交瘤细胞(hybridoma)的培养上清液的抗原固相化ELISA法的结果的图。显示可从对二糖肽免疫的动物中确认多种产生与二糖肽反应而不与单糖肽反应的抗体的菌株。
[图7]图7是表示在将通过Endo-F3对从HepG2的培养上清液中纯化得到的AFP进行处理并除去酶而得到物质作为免疫原的情况下,使用了免疫动物的抗血清的抗原固相化ELISA法的结果的图。与非免疫动物的血清相比,免疫动物的抗血清显示包含更高浓度的针对二糖肽的抗体。
[图8]图8是表示对于产生抗AFP抗体的杂交瘤细胞的抗原固相化ELISA法的结果的图。显示从对二糖肽免疫的动物中可确认多种产生与二糖肽反应而不与单糖肽反应的抗体的菌株。
[图9]图9是表示单克隆抗体的特异性分析的结果的图。显示S20205R抗体或S20206R抗体仅识别通过酶处理而产生的糖酵解AFP。
[图10]图10是表示通过Endo-F3或PNGaseF进行的AFP的处理结果的图。两种酶均显示消化AFP。
[图11]图11是表示单克隆抗体的特异性分析的结果的图。S20205R抗体、S20206R抗体显示包含通过Endo-F3产生的糖链作为识别部位的一部分。
[图12a]图12a是表示使用了本发明的抗体的与现有抗体的夹心ELISA的结果的图。显示在使用了S20205R抗体的情况下,对于进行了酶处理的AFP,吸光度以浓度依赖性的方式上升。
[图12b]图12b是表示使用了本发明的抗体的与现有抗体的夹心ELISA的结果的图。显示在将S20206R抗体用作标记的检测抗体的情况下,对于进行了酶处理的AFP,吸光度以浓度依赖性的方式上升。
[图13a]图13a是表示对各酶处理物进行反应性分析的结果的图。显示在将现有抗AFP抗体用作ELISA分析中的标记化检测抗体的情况下,吸光度以AFP浓度依赖性的方式增大,与是否进行了酶处理无关。
[图13b]图13b是表示对各酶处理物进行反应性分析的结果的图。显示在使用了S20206R抗体的情况下,仅通过Endo-F2和Endo-F3进行了处理的AFP,吸光度以浓度依赖性的方式增大。
[图14]图14是表示血清中酶处理的结果的图。显示Endo-F3即使在血清中也对AFP发挥作用,可通过本发明的抗体检测到进行了酶处理的AFP。
[图15]图15是表示酶处理的pH条件的探讨结果的图。显示本发明中使用的酶无论pH如何均可进行使用。
[图16]图16是表示板载酶处理的结果的图。显示可同时进行抗原抗体反应与抗原酶反应。
具体实施方式
以下,对本发明的实施方式进行说明。以下的说明仅仅是例举,本发明的范围不限于这些说明,可在不损害本发明的主旨的情况下进行适宜变更并实施。
(定义)
在没有特别说明的情况下,本说明书中使用的所有技术性和科学性术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意义。
在本说明书中,在显示多个数值范围的情况下,包含这些多个范围的任意下限值和上限值的组合范围也同样具有意义。
在本说明书中,“糖蛋白”是指包含一个以上的通过共价键而附着于多肽链的碳水化合物基团的蛋白质。例如,糖蛋白包含1重量%~60重量%的多种组成不定的较短分枝状的寡糖链形态的碳水化合物。
大多数的天然肽和蛋白质含有通过对于氨基酸的特异性的结合而与肽或蛋白质结合的碳水化合物部分,所述氨基酸是沿主要的肽或蛋白质链的长度的特定数目的氨基酸。任意肽或蛋白质上的糖基化模式的变异性,可影响该肽或蛋白质的功能。例如,肽或蛋白质上的N结合型聚糖的结构可影响肽或蛋白质的各种特性,所述特性包含:细胞或生物中的肽或蛋白质的蛋白酶敏感性、细胞内运输、分泌、组织靶向、生物学半衰期和抗原性。
这些特性中的一种或多种变化可影响其自然环境下的肽或蛋白质的有效性。
此外,例如,已知具有包含590氨基酸的肽的糖蛋白AFP以具有不同糖链结构并且被称为AFP-L1和AFP-L3的状态而存在于生物体内。其中,已知仅AFP-L3肝癌特异性地存在。
因此,可通过使用对AFP-L3的糖链进行特异性检测的抗体,来检查生物体内是否有肝癌。
在本说明书中,特定的生物体内分子“在生物体内不存在或即使存在也极为稀少”是指,存在于通常状态的生物体内的该生物分子的分子量或重量不能通过通常的检测手段进行检测,或比类似的生物分子少。通常状态的生物体是指,例如没有特定疾病、病症等并且处于安静状态的生物体,少是指,例如该生物体内分子的分子量或重量是类似的生物分子的1/100、1/1000或1/10000以下。例如,在用于糖蛋白的情况下,“在生物体内不存在或即使存在也极为稀少”是指,例如与结构中包含相同的蛋白质并且具有不同糖链结构的糖蛋白相比,生物体内的存在量较少。例如,六糖、四糖或二糖的糖蛋白(例:二糖的岩藻糖基化糖肽)在生物体内极为稀少。
在本说明书中,“进行检测”或“检测”在广义上进行使用,其包含靶分子的定性和定量两者的测定。检测包含直接和间接的检测,包含进行检测的任意手段。
在一个方式中,本发明的抗体用于检测生物样品中的糖蛋白的存在的方法。在特定的实施方式中,包含:在允许本发明的抗体与糖蛋白结合的条件下,使本发明的抗体与生物样品接触,并检测在该抗体与糖蛋白之间是否形成复合体的工序。这样的方法可以是体外或体内的方法。在一个实施方式中,使用本发明的抗体来检测代表患者状态的生物标志物(Biomarker)。
在本说明书中,在抗体等选择性结合物质与某种化合物“发生反应”、“表现反应性”、“具有反应性”、“结合”或抗体等选择性结合物质表现出“识别”某种化合物的情况下,包含本发明的领域中通常使用的意义,均可进行同义互换来使用。就抗体等选择性结合物质是否与某种化合物“发生反应”的确认而言,可通过本领域技术人员周知的抗原固相化ELISA法、竞争ELISA法、夹心ELISA法等来进行,并且可通过利用了表面等离子共振(surface plasmonresonance)的原理的方法(SPR法)等来进行。SPR法可使用以Biacore(注册商标)的名称而市售的装置、传感器、试剂类来进行。
在本说明书中,本发明的抗体等选择性结合物质与某种化合物“不反应”是指,本发明的抗体等选择性结合物质与某种化合物实际上不发生反应。“实际上不发生反应”是指,例如,在抗原固相化ELISA法中,抗体等选择性结合物质与固相化抗原的结合实际上不因该化合物的添加而受到影响。也可通过所述抗原固相化ELISA法以外的本领域技术人员周知的方法·手段来确认“实际上不反应”。
在本说明书中,抗体等选择性结合物质“发生特异性反应”或抗体等选择性结合物质的“特异性”是抗体等选择性结合物质以可检测的方式与抗原上存在的表位发生反应的能力,另一方面,与其它抗原的可检测的反应性相对较小或实际上未检测到反应性。例如,在抗体等选择性结合物质与特定的抗原“发生特异性反应”的情况下,该抗体等选择性结合物质与该抗原发生反应,另一方面,不与其他抗原发生反应。在优选的方式中,在抗体等选择性结合物质与特定的抗原“发生特异性反应”的情况下、例如在抗原固相化ELISA法中固定化的该抗原与该抗体等选择性结合物质的相互作用被游离的该抗原抑制,另一方面,不被其他游离抗原抑制。
在本说明书中,选择性结合物质与抗原的“反应产物”是指,选择性结合物质与抗原发生特异性反应而产生的物质,并且是指可通过通常的检测方法检测的物质。
在本说明书中,“选择性结合物质”或“抗原结合性物质”是指与特定的物质特异性地结合的天然或非天然的物质,它们可用于与抗体同样的用途。例如,“选择性结合物质”包含:肽适体、DNA适体、RNA适体等适体、凝集素、受体、这些的变体和这些的组合。
在本说明书中,“抗原”是指,可被抗体等选择性结合物质结合的分子或分子的一部分。抗原可具有一个以上的表位,可分别与不同的选择性结合物质、例如抗体产生相互作用。“抗原”可用于抗体等选择性结合物质的制造,并且可在测定糖蛋白时用作标准品。
在本说明书中,“表位”是抗原的一个区域,是以该抗原为靶标的选择性结合物质与该抗原发生结合的区域。
在本说明书中,“抗体”是包含4个多肽链即通过二硫键相互连接的两个重链(H)和两个轻链(L)的免疫球蛋白分子。各重链包含重链的可变区(“HCVR”或“VH”)和重链的恒定区(包含CH1、CH2和CH3结构域(domain))。各轻链包含轻链的可变区(“LCVR”或“VL”)和轻链的恒定区(CL)。VH和VL区域可进一步分割为被命名为互补性决定区域(CDR)的高变区,可散布于大量被命名为骨架区(FR)的保守区域。各VH和VL包含3个CDR和4个FR,从胺末端至羧基末端按以下顺序配置:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原产生相互作用的结合结构域(domain)。术语“抗体”还包含抗体的所有基因重组体,例如在原核生物中表达的抗体、未糖基化的抗体。
在本说明书中,“抗体”是指包含四个多肽链、并通过二硫键相互连接的含有两个重链(H)和两个轻链(L)的免疫球蛋白分子。各重链包含重链的可变区(“HCVR”或“VH”)及重链的恒定区(包含CH1、CH2及CH3域)。各轻链包含轻链的可变区(“LCVR”或“VL”)及轻链的恒定区(CL)。VH及VL区进一步可分割成命名为互补决定区(CDR)的高变区,并且可分散存在于命名为框架(FR)的保守区。各VH及VL包含三个CDR和四个FR,并且按照下面的顺序从胺末端向羧基末端进行配置:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。术语“抗体”还包含抗体全部的基因重组体,例如在原核生物中表达的抗体、非糖基化抗体。
此外,如Padlan(1995FASEB J.9:133-139),Vajdos et al.2002J Mol Biol 320:415-428所示,已知实际上仅CDR残基的一部分与抗原接触,不与抗原接触的CDR残基可以通过分子模型或凭经验地从存在于Chothia的CDR的外侧的Kabat的CDR区来确定。在去除CDR或者其一个或多个残基的情况下,其通常被其它的人类抗体序列或在这样的序列的共有序列中占据相应位置的氨基酸置换。此外,CDR及氨基酸内的置换位置可以凭经验选择。凭经验的置换可以为保守性或非保守性置换。
在本说明书中,抗体的“抗原结合片段”是指具有与抗原特异性结合能力的抗体的一个或一个以上的片段。抗体的“抗原结合片段”内所含的结合片段的非限制性示例包含下述片段:(i)Fab片段,其为包含VL、VH、CL及CH域的一价片段;(ii)F(ab′)2片段,其为包含通过铰链区中的二硫桥结合的两个Fab片段的二价片段;(iii)Fd片段,其由VH及CH域构成;(iv)Fv片段,其由抗体单臂的VL及VH域构成;(v)由VH域构成的dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546);(vi)分离后的互补决定区(CDR);以及(vii)通过合成接头任选结合的两个或两个以上分离后的CDR的组合。此外,正如已知作为单链Fv(scFv)那样,也可以使用基因重组法,通过合成接头将VL及VH区配对作为单条蛋白质链(Bird et al.(1988)Science 242:423-426;and Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此外,“抗原结合片段”可以为结合域免疫球蛋白融合蛋白质,其包含:(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合域多肽;(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区;及(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。这些抗体片段可以使用本领域技术人员公知的现有技术来获得。
可用于本发明的抗体或其抗原结合片段可以来自包含鸟类、哺乳类在内的所有动物。优选抗体或片段来自人、黑猩猩、啮齿动物(例如,小鼠、大鼠、豚鼠或兔子)、鸡、火鸡、猪、绵羊、山羊、骆驼、牛、马、驴、猫或狗。本发明的抗体包含由衍生自某一物种的抗体的恒定区与衍生自其它物种的抗原结合位点组合而成的嵌合分子。再者,本发明的抗体包含由衍生自非人物种(例如,来自小鼠)的抗体的抗原结合位点和人源的恒定区及框架区组合得到的人源化分子。
本发明的抗体可以获得于表达该抗体的杂交瘤或通过基因重组而表达该抗体的宿主细胞。作为宿主细胞,例如可使用:CHO细胞、淋巴细胞、大肠杆菌等细菌细胞、及酵母等真菌细胞。
此外,可以在使用了基因重组技术进行转基因的非人动物或植物中制造本发明的抗体。在一个方式中,对产生期望的抗体的杂交瘤细胞的基因进行解析,从而能够使用基因重组技术来使具有与该抗体相同的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列的抗体由其他宿主细胞表达。
作为本发明中的抗体,优选例如杂交瘤细胞S20205R或S20206R所产生的单克隆抗体。所述杂交瘤细胞如下所述基于布达佩斯条约进行国际保藏。
保藏机构的名称:NITE国际专利微生物保藏中心,保藏机构的地址:千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室(邮编292-0818),保藏日:2019年3月22日。
保藏编号:NITE BP-02926(杂交瘤细胞S20205R)
保藏编号:NITE BP-02927(杂交瘤细胞S20206R)
本发明中使用的糖链特异性的糖链剪切酶没有特别限定,可使用对生物体内的糖蛋白的糖链进行剪切的各种公知的酶,可组合使用多个酶。在一个方式中,就本发明的糖链特异性的糖链剪切酶或其组合而言,优选处理的结果生成2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的长度的糖链。
在一方式中,作为这样的糖链特异性的糖链剪切酶,优选使用:选择性地对包含构成N-结合型糖链的基本骨架的N,N’-二乙酰基壳二糖结构(GlcNA cβ1,4GlcNAc)的结构进行识别、在蛋白质侧残留1个N-乙酰基葡萄糖胺残基(可附加有岩藻糖)对糖链进行剪切并使其游离的糖链剪切酶,特别优选使用:对糖蛋白的糖链的核心岩藻糖进行识别,选择性地在蛋白质侧残留具有包含核心岩藻糖的二糖的糖链来对糖链进行剪切的酶。
在一方式中,作为这样的糖链特异性的糖链剪切酶,例如可使用糖苷内切酶(Endo-glycosidase)。特别是,优选使用选自属于β-N-乙酰氨基葡糖苷内切酶(EC3.2.1.96)的酶。就酶的选择而言,可通过本领域技术人员通常进行的范围的酶反应条件的探讨来进行。就是否通过酶反应进行了期望的糖链剪切而言,可通过通用的分析方法进行确认,例如可通过使用质量分析计等对通过酶反应而产生的物质进行分析来进行确认。
作为具体的糖链特异性的糖链剪切酶的非限定性的实例,可使用源自Streptomyces plicatus的Endo-A、Endo-M、Endo-H、源自肺炎链球菌(Streptococ cuspneumoniae)的Endo-D、源自Flavobacterium meningosepticum的Endo-F1、Endo-F2、Endo-F3这样的β-N-乙酰氨基葡糖苷内切酶。在一个方式中,优选使用源自Flavobacteriummeningosepticum的Endo-F1、Endo-F2、Endo-F3,更优选使用Endo-F3。
通过糖链特异性的糖链剪切酶对样品中的糖蛋白进行处理的条件,可根据使用的酶进行适宜变更,例如通过下述方式进行处理:在5~8或6~7的pH下,在25~40℃、28~39℃、30~37℃、32℃~36℃、33℃~35℃或34℃下,在5~60分钟、7~50分钟、10~40分钟、15~30分钟的条件下,将糖蛋白与糖链特异性的糖链剪切酶进行混合。
具有本发明的糖链结构的糖蛋白可在抗体等选择性结合物质的制造中用抗原,并且可在测定糖蛋白时用作标准品。
(制备与本发明的糖蛋白的糖链结构发生特异性反应的抗体的方法)
可将通过所述方法而得到的具有在生物体内不存在或即使存在也极为稀少的糖链结构的本发明的糖蛋白用作抗原,来制备与该糖链结构发生特异性反应的抗体。将制备与本发明的糖蛋白的糖链发生特异性反应的抗体的方法的概要示于图1。
具体而言,通过用糖链特异性的糖链剪切酶对糖蛋白进行处理,来产生在生物体内不存在或即使存在也极为稀少的糖链结构,通过将该结构用作抗原,而容易地进行抗体的制备。该抗原通过记载于Antibodies,A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press,(1988))等中的已知方法,使小鼠等哺乳动物免疫。通过摘除该动物的脾细胞或淋巴结细胞,并与骨髓瘤细胞进行细胞融合来制备杂交瘤细胞。可从制备的杂交瘤细胞群中分离与所述抗原进行反应的物质,并得到单克隆抗体。
在将具有本发明的糖链结构的抗原用作免疫原的情况下,可以原样使用通过所述糖链剪切酶进行的处理而得到的抗原,也可以将该抗原与通用的载体进行结合而使用。这样的载体和抗原与载体的结合方法是本领域技术人员所周知,例如可使用Sulfo-SMCC(Thermo公司22322)等接头使作为载体的KLH(Thermo公司77600)等蛋白质与抗原结合。
作为具有本发明的糖链结构的抗原,可使用通过如上所述通过糖链特异性的糖链剪切酶对糖蛋白进行处理的方法而得到的抗原,并且可将通过化学合成、基因重组技术等公知的方法而得到的具有与通过本发明而得到的抗原相同结构的化合物用作抗原。此外,也可将对表位以外的部分进行了修饰的用作抗原。例如可将通过用糖链特异性的糖链剪切酶对糖蛋白进行处理的方法而得到的糖蛋白中存在的、具有与和选择性结合物质发生结合的部位相同的氨基酸和糖链序列的糖肽用作抗原。这些可用作抗原的糖肽或通过化学合成、基因重组而得到的化合物,不仅可用于抗体等选择性结合物质的制造,还可在测定糖蛋白时用作标准品。
杂交瘤细胞的制备可根据本领域中公知的方法来进行,例如可采用:聚乙二醇法、使用了仙台病毒的方法、利用电流的方法等。得到的杂交瘤细胞可根据公知的方法进行增殖,可在确认产生的抗体的性质的同时,选择期望的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的克隆可通过例如有限稀释法(limiting dilution method)、软琼脂法等的公知的方法来进行。
得到的抗体除了直接由所述杂交瘤细胞产生之外,还可制备通过基因重组而表达该抗体的宿主细胞,并由该宿主细胞得到。作为宿主细胞,例如可使用:CHO细胞、淋巴细胞、大肠杆菌等细菌细胞和酵母等真菌细胞。
(其它选择性结合物质的制造方法)
通过本发明的糖蛋白的处理方法而得到的糖蛋白可用于制造抗体,并且可用于制造特异性地选择该糖蛋白的其他选择性结合物质,例如,肽适体、DNA适体、RNA适体等适体、凝集素、受体、这些的变体和这些的组合。同样为该目的,作为糖蛋白,可使用通过用糖链特异性的糖链剪切酶进行处理的方法而得到的糖蛋白,并且可使用通过化学合成、基因重组技术等公知的方法而得到的具有相同结构的化合物或这些的变体。
对于DNA适体和RNA适体这样的核酸适体,可通过使用本领域技术人员公知的方法、例如体外选择或指数富集的配体的系统性展开(Systematic Evolution of Ligandsby Exponential Enrichment)(SELEX)法(Archemix,Cambridge,MA,USA)(Sampson,2003)的重复回合等,来得到与通过本发明的糖蛋白的处理方法而得到的糖蛋白特异性地结合的适体,但不限于此。
对于肽适体,可通过公知的方法,例如Lu et al.,Chem Rev 2009:109(5):1948-1998中公开的方法等,来得到与通过本发明的糖蛋白的处理方法而得到的糖蛋白特异性地结合的适体,但不限于此。
在将凝集素用作选择性结合物质的情况下,使用的凝集素可由包含植物、动物、酵母菌、细菌、原生动物等的任意生物得到。凝集素可从这些天然存在的来源中分离或通过本领域技术人员周知的方法进行重组表达和纯化。此外,可以使用纯化的市售凝集素。作为与具有岩藻糖的糖链特异性地结合的选择性结合物质,例如可以使用岩藻糖特异性凝集素(参照Mansour MH et al.(2005)Immunobiology.210:335-48等)。为了得到与通过本发明的糖蛋白的处理方法而得到的糖蛋白特异性地结合的凝集素,可以从目前可得到的凝集素中筛选出与本发明的糖蛋白特异性地结合的凝集素,也可以利用基因重组技术,筛选出与本发明的糖蛋白特异性地结合的修饰凝集素。还能够以与凝集素同样的目的,分离并使用具有凝集素样结构域(domain)的蛋白质(参照Drickamer K(1999)Curr.Opin.Struct.Biol.9:585-90等)。
在将受体用作选择性结合物质的情况下,可以从已知的糖蛋白结合受体中筛选出与本发明的糖蛋白特异性地结合的受体,也可以利用基因重组技术,筛选出与本发明的糖蛋白特异性地结合的修饰受体。还能够以与受体同样的目的,分离并使用修饰受体,所述修饰受体通过使受体的一部分与抗体的Fc区域等其他蛋白质结合而得到。
(本发明的选择性结合物质的用途)
通过本发明的方法而得到的抗体等选择性结合物质,可用于在生物样品中对作为生物标志物等发挥功能的糖蛋白进行检测。
(特异性地检测样品中的糖蛋白的方法)
在进行本发明的特异性地检测样品中的糖蛋白的方法时,可能包含糖蛋白的样品可通过糖链特异性的糖链剪切酶进行处理。该糖链特异性的糖链剪切酶可以与制备抗体等选择性结合物质时使用的糖链特异性的糖链剪切酶相同,也可以不同。在一个方式中,优选使用相同的酶或酶的组合。
在使用糖链剪切酶的情况下,可以通过在所述可能包含糖蛋白的样品中添加糖链特异性的糖链剪切酶来进行酶处理,或可以从所述样品中将糖蛋白纯化至一定程度后,进行使用糖链剪切酶的酶处理。此外,可以在对糖蛋白进行使用糖链剪切酶的酶处理的工序后,应用得到选择性结合物质与糖蛋白的反应产物的工序,此外,可以同时进行对糖蛋白进行使用糖链剪切酶的酶处理的工序和得到所述糖蛋白与选择性结合物质的反应产物的工序。在一个方式中,优选同时进行对糖蛋白进行使用糖链剪切酶的酶处理的工序和得到所述糖蛋白与选择性结合物质的反应产物的工序。在同时进行对糖蛋白进行使用糖链剪切酶的酶处理的工序和得到所述糖蛋白与选择性结合物质的反应产物的工序的情况下,作为选择性结合物质,优选选择不受糖链剪切酶影响的物质。
作为检测反应产物的方法,可利用公知的方法,所述反应产物为选择性结合物质与抗原发生特异性反应而得到的。例如可使用:酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫荧光测定法、免疫沉淀法、平衡透析法、免疫扩散法、免疫凝聚测定法、免疫比浊法、粒子免疫测定法和其它方法,但不限于此(例如参照Harlow and Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988;Weir,D.M.,Handbook ofExperiment al Immunology,1986,Blackwell Scientific,Boston)。在一个方式中,本发明的抗体等选择性结合物质可用作:固定于不溶性载体上的固定(固相)化物质、用标记物质标记了的标记化物质(例如,检测抗体)。这样的固定化选择性结合物质、标记化选择性结合物质均包含在本发明的范围内。例如,可通过使本发明的选择性结合物质物理性地吸附于不溶性载体、或与不溶性载体进行化学性结合(可介由适当的间隔物),来制造固定化选择性结合物质。作为不溶性载体,可使用包含聚苯乙烯树脂等高分子基材、玻璃等无机基材、纤维素、琼脂糖等多糖类基材等的不溶性载体。其形状没有特别限定,可选择板状(例如,微板、膜)、珠或微粒状(例如,乳胶粒子、磁性粒子)、筒状(例如,试验管)等任意形状。
作为用于制造标记化选择性结合物质的标记物质,例如可举出:酶、荧光物质、化学发光物质、生物素、抗生物素蛋白或放射性同位素、金胶体粒子、着色乳胶等。作为标记物质与选择性结合物质的结合方法,可使用:本领域技术人员可利用的戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶基二硫化物法或过碘酸法等方法。固定化选择性结合物质、标记化选择性结合物质的种类和它们的制造方法没有特别限定,例如可将过氧化物酶、碱性磷酸酶(以下,有时称为ALP)等酶用作标记物质。在这种情况下,可使用该酶的特异性基质(在酶为辣根过氧化物酶(Horse Radish Peroxidase)(以下,有时称为HRP)的情况下,例如为1,2-苯二胺(以下,有时称为OPD)或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺,在为ALP的情况下,为对硝基苯基磷酸酯等)对酶活性进行测定。在将生物素用作标记物质的情况下,通常与抗生物素蛋白或酶修饰抗生物素蛋白反应。
使用了本发明的选择性结合物质的检测中使用的样品没有特别限定,可使用各种样品。在一个方式中,可使用血液、血浆、血清、尿、唾液等液体生物样品、皮肤、粪便、活检组织等固体生物样品等生物样品。
可提供本发明的选择性结合物质作为用于所述检测糖蛋白的方法的测定试剂。除了本发明的选择性结合物质之外,该试剂还可以包含实施该检测方法所需要的其他构成要素、例如缓冲液、防腐剂等。
在一个方式中,例如在本发明的选择性结合物质包含酶作为标记物质的情况下,可以以试剂盒的方式与包含其特异性基质的试剂一起提供。
在提供使用了本发明的选择性结合物质的检测糖蛋白的方法中使用的试剂盒的情况下,可将用于进行使用糖链剪切酶的酶处理的试剂和用于得到糖蛋白与选择性结合物质的反应产物的工序中的试剂分别作为不同的组合物进行提供,此外,可以将用于进行使用糖链剪切酶的酶处理的试剂和用于得到糖蛋白与选择性结合物质的反应产物的工序中的试剂作为同一组合物进行提供。在一个方式中,优选将用于进行使用糖链剪切酶的酶处理的试剂和用于得到糖蛋白与选择性结合物质的反应产物的工序中的试剂作为同一组合物进行提供。
实施例
以下,通过实施例对本发明进一步详细地说明,但是本发明不限于这些。
[实施例1]
1.糖蛋白AFP-L3通过Endo-F3进行的处理
在下述条件下通过糖链剪切酶:Endo-F3(38.8kDa,New England BioLabs公司制)对从肝癌细胞株HepG2细胞的培养上清液中亲和纯化得到的糖蛋白AFP进行处理。所述纯化AFP包含AFP-L3。
[材料和条件]
对于(1)AFP:8μg,
混合(2)Endo-F3:16U(0.1M MES缓冲液(pH5.5)20μL),
在处理(酶反应)时间:10分钟或30分钟
处理(酶反应)温度:37℃
的条件下进行酶处理,得到进行了酶处理的AFP液。
添加等量的所述进行了酶处理的AFP液和Tris SDS样品处理液(COSMO BIO公司制,423420),煮沸10分钟。通过MULTIGEL(注册商标)II Mini 4/20(13W)(COSMO BIO公司制,414879),在30mA下对该经过煮沸的样品进行70分钟电泳后,通过常规CBB染色将凝胶染色。
图2显示对未进行处理、处理时间10分钟、处理时间30分钟的样品进行电泳(SDS-PAGE)的结果。未进行处理的泳道中52kDa至76kDa之间检测到的谱带是源自AFP的谱带,在泳道1和泳道2中38kDa附近检测到的谱带是源自Endo-F3的谱带。确认了对于所述源自AFP的谱带,与未进行处理的谱带检测位置相比,处理时间10分钟和30分钟的谱带检测位置向分子量降低的方向移动。由以上的结果可知,通过所述处理,对与AFP―L3结合的含有岩藻糖的糖链进行了剪切。
[实施例2]
2.单克隆抗体的制备
将具有所述进行了剪切的糖链的AFP作为抗原(免疫原),通过公知的方法使小鼠或大鼠免疫,由B细胞制备杂交瘤细胞,所述B细胞从该小鼠或大鼠的脾得到。
使用具有所述进行了剪切的糖链的AFP来筛选杂交瘤细胞,得到单克隆抗体,该单克隆抗体特异性地检测出具有进行了剪切的糖链的AFP。
更详细地,进行如下试验。
[材料]
(1)弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant):和光纯药工业株式会社制,014-09541
(2)骨髓瘤细胞(SP2/O)
(3)RPMI1640,GlutaMAX:GIBCO公司制,61870-036
(4)胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS):BIOLOGICAL INDUSTRIES公司制,04-001-1A
(5)HAT培养基:COSMO BIO公司制,16213004
(6)96孔板:NUNC,167008
(7)HRP标记山羊抗小鼠IgG(H&L)和HRP标记山羊抗大鼠IgG(H&L)抗体:SouthernBiotech公司制,1031-05和3050-05
(8)MULTIGEL(注册商标)II Mini 4/20(13W):COSMO BIO公司制,414879
(9)Tris SDS样品处理液:COSMO BIO公司制,423420
(10)糖肽:合成得到的二糖8a.a.和单糖8a.a.(序列如图3)
[试验例1]酶处理的确认
1.试验方法
将2μL(16U)的Endo-F2(39.8kD,New England BioLabs公司制)或2μL(2μg)的Endo-F3添加至2μL(5~7μg)的从HepG2的培养上清液中亲和纯化得到的AFP中,进一步添加16μL的0.1M MES缓冲液(pH5.5)。在使这些样品在37℃下进行10分钟酶反应后,添加等量的Tris SDS样品处理液,煮沸10分钟。将这些样品以1泳道10μL的量添加至MULTIGEL(注册商标)II Mini4/20(13W),在30mA下进行70分钟电泳。然后,通过常规CBB染色将凝胶染色。
2.试验结果
将结果示于图4。在未添加糖链剪切酶的AFP和添加了作为糖链剪切酶的Endo-F2和Endo-F3的AFP的情况下,检测的谱带的图案不同,在通过酶进行了处理的AFP的情况下,特别是低分子量侧的谱带的浓度较高(图4)。这表明,AFP中经过修饰的一部分糖链被糖链剪切酶所消化剪切,使分子量变小。该结果表明,不管糖链剪切酶的种类如何,都可消化AFP的糖链。
[试验例2]单克隆抗体的制造方法-1
1.免疫原的制备
使用市售的接头试剂,使二糖肽与KLH(Thermo公司77600)等各种蛋白质交联,制备免疫原溶液,所述二糖肽模仿对AFP进行糖链剪切酶处理时产生的氨基酸和糖链序列。
2.产生针对糖链剪切酶处理AFP的单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备
(1)对动物的免疫
使用将所述免疫原溶液(0.2~2mg/mL)与弗氏完全佐剂以等容量进行混合而制备的乳剂,将10~40μg的乳剂作为免疫原注射至每只Balb/cAJcl小鼠或F344大鼠中。此外,以每周为间隔,重复该乳剂的注射3~8次。通过后述的抗原固相化ELISA法来测定从尾部静脉采血得到的抗血清中的抗体效价(antibo dy titer)。
(2)初次筛选(抗原固相化ELISA法)
通过ELISA法来确认所述免疫动物的抗血清中针对糖链肽的抗体的存在,所述ELISA法是使以与免疫原同样的方法制备的二糖肽缀合物固相化的ELISA法(抗原固相化ELISA法)。抗原固相化ELISA法的详细如下。
(2-1)抗原固相化ELISA用板的制备
将二糖肽和与用于制备免疫原的蛋白质不同的蛋白质形成的缀合物液溶解于包含150mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.2;下文中称为PBS)中,并使得缀合物液为1μg/mL,将该溶解液50μL分配至96孔微板的各孔中,在室温下静置2小时。
用包含0.05%Tween(注册商标)20的PBS(下文中称为PBST)400μL将所述各孔清洗3次后,添加包含1%牛血清白蛋白的PBST(下文中称为BSA-PBST)100μL,在室温下封闭1小时。将其作为ELISA用板。
(2-2)抗原固相化ELISA法
将所述ELISA用板的各孔用PBST 400μL清洗3次后,将用BSA-PBST逐步稀释了的免疫动物的抗血清和非免疫动物的血清50μL添加至所述各孔中,在室温下静置1小时。将所述各孔用PBST 400μL清洗3次后,将用BSA-PBST稀释了10000倍的HRP标记抗小鼠IgG(H&L)或稀释了5000倍的HRP标记大鼠IgG(H&L)50μL分配至所述各孔中,在室温下静置1小时。将所述各孔用PBST 400μL清洗3次后,添加包含0.2%邻苯二胺和0.02%过氧化氢的柠檬酸缓冲液(pH5.0)50μL,在室温下放置10分钟后,添加1.5N硫酸50μL来停止酶反应,对波长492nm处的吸光度进行测定。测定的结果,从抗体效价较高的小鼠或大鼠中摘除脾和淋巴结,制备源自脾和淋巴结的细胞,用于细胞融合。
(2-3)试验结果
作为结果的一个实例,将对小鼠进行了免疫的情况示于图5。与非免疫动物的血清相比,免疫动物的抗血清在使用了固相化的二糖的糖肽的情况下,稀释倍数越低,显示出越高的吸光度。在该测定体系中,测定的吸光度取决于采血的动物的血清中包含的针对二糖肽的抗体浓度(图5)。因此,所述结果显示,与非免疫动物的血清相比,免疫动物的抗血清包含更高浓度的针对二糖肽的抗体,因此抗体效价更高。
(3)细胞融合
将所述源自脾的细胞或者源自淋巴结的细胞均与骨髓瘤细胞以细胞数1:1的比例进行混合,通过电脉冲法进行细胞融合。将该融合得到的细胞悬浮于HAT培养基中,在CO2孵化器(incubator)内在37℃、5%CO2的条件下培养8日,得到融合细胞(杂交瘤细胞)。
(4)杂交瘤细胞的挑选(抗原固相化ELISA法)
(4-1)方法
在所述抗原固相化ELISA法中,使用融合细胞的培养上清液代替免疫动物的抗血清,并且作为固相化抗原,除了二糖肽缀合物之外,还使用单糖肽、未进行酶处理的AFP和经过Endo-F3处理的AFP、各自的缀合物,除此之外,进行同样的方法。测定的结果,将对二糖肽的吸光度比单糖肽高的孔或对经过Endo-F3处理的AFP的吸光度比未进行酶处理的AFP高的孔,选作存在产生抗二糖肽或抗酶处理AFP抗体的杂交瘤细胞的孔(阳性孔)。
(4-2)试验结果
作为结果的一个实例,将二糖肽或单糖肽进行了固相化的试验的情况示于图6。可从用二糖肽进行了免疫的动物中确认多种产生与二糖肽反应并且不与单糖肽反应的抗体的菌株(图6)。该结果表明,可通过将二糖肽作为免疫原,来得到在酶处理AFP的二糖的糖链修饰部位附近区域产生抗体的杂交瘤细胞。
[试验例3]单克隆抗体的制造方法-2
1.试验方法
将与试验例1同样地通过Endo-F3对从HepG2的培养上清液中纯化得到的AFP进行处理,并除去酶而得到的物质作为免疫原并以与[试验例2]同样的方法实施。其中,在抗原固相化ELISA法中,使用通过Endo-F3进行了处理的AFP作为抗原。
2.试验结果
作为结果的一个实例,将对大鼠进行了免疫的情况示于图7、8。与非免疫动物的血清相比,免疫动物的抗血清的稀释倍数越低,对固相化的酶处理AFP显示出越高的吸光度(图7)。在该测定体系中,测定的吸光度取决于采血的动物的血清中包含的针对酶处理AFP的抗体浓度。即,所述结果表明,与非免疫动物的血清相比,免疫动物的抗血清包含更高浓度的针对酶处理AFP的抗体,抗体效价更高。
如图8所示,可从用酶处理AFP进行了免疫的动物中确认多种产生与酶处理AFP反应并且不与未进行酶处理AFP反应的抗体的菌株。即显示,可将酶处理AFP作为免疫原,来得到产生对酶处理AFP具有特异性的抗体的杂交瘤细胞。
[试验例4]克隆
使用通过所述初次筛选和二次筛选而挑选的产生抗体的菌株杂交瘤细胞,进行杂交瘤细胞的单克隆化和单克隆抗体的纯化。克隆化通过常规方法(有限稀释法,例如参照“实验医学分册蛋白质实验手册”ISBN4-89706-369-8)进行,以与所述抗原固相化ELISA法同样的方法挑选阳性孔,最终得到2种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞(S20205R和S20206R)。
[试验例5]本发明的单克隆抗体的特异性分析1
首先,通过免疫沉淀和蛋白质印迹法来确认:S20205R所产生的抗体和S20206R所产生的抗体以怎样的特异性与酶处理AFP发生反应。
1.试验方法
将0.1M MES缓冲液400μL添加至HepG2细胞的培养上清液400μL中,进一步添加7.5μg的Endo-F3,在37℃下进行30分钟反应后,添加800μL的BSA-PBST,来制备样品。接着,分别将400μL的所述样品添加至分别通过常规方法而固定了4种抗体的琼脂糖凝胶100μL(GEHEALTHCARE公司:CNBr activated Sepharose 4 Fast Flow(17098101))中,并在室温下搅拌2小时,所述4种抗体分别为S20205R抗体、S20206R抗体、现有的抗AFP抗体(本公司制02211)和不与AFP反应的抗体。将它们以10000g进行2分钟离心,除去上清液,使用PBST 1mL进行充分悬浮,再次以10000g进行2分钟离心。重复该操作2次后,除去上清液,添加TrisSDS样品处理液60μL,煮沸10分钟。然后,以10000g进行2分钟离心,1泳道添加15μL的量,以与[试验例1]同样的方式进行SDS-PAGE。将到此为止的操作设为免疫沉淀。通过常规方法使该电泳后的凝胶转印至PVDF膜,在1%BSA-PBST内将所述PVDF膜在室温下振摇1小时。然后,在将生物素标记的现有抗AFP抗体或不与AFP反应的抗体作为检测抗体稀释至1μg/mL的1%BSA-PBST内,将所述PVDF膜在室温下振摇1小时。接着,在PBST内将所述PVDF膜在室温下振摇5分钟,除去上清液。重复该操作3次后,在将HRP标记链霉亲和素稀释至0.33μg/mL的1%BSA-PBST内,将所述PVDF膜在室温下振摇30分钟。接着,在PBST内将所述PVDF膜在室温下振摇5分钟,除去上清液。重复该操作3次后,浸入包含0.2mg/mL的二氨基联苯胺和0.0012%的过氧化氢的50mM Tris盐酸缓冲液(pH7.4)中,在可通过肉眼观察来充分确认谱带后,用RO水对PVDF膜进行清洗。
2.试验结果
将结果示于图9。在通过现有的抗AFP抗体进行免疫沉淀,通过抗AFP抗体进行检测的情况(左泳道)下,无论是否进行了酶处理,都检测到谱带(左泳道中的-和+泳道)。并且确认了,在进行了酶处理的情况下,谱带在高分子量侧和低分子量侧变为双重的(左泳道中的+泳道)。另一方面,在通过S20205R抗体(中央左泳道)或S20206R抗体(中央右泳道)进行免疫沉淀,通过抗AFP抗体进行检测的情况下,在进行了酶处理的情况(中央左、中央右泳道中各个+泳道)下,仅在更低分子量侧检测到谱带(图9)。在该测定体系中,检测到免疫沉淀中使用的抗体所结合的AFP的谱带。即,如[试验例1]所示,除了通过酶处理而使低分子量侧的谱带增大之外,还显示了S20205R抗体或S20206R抗体识别通过酶处理而产生的糖酵解AFP。需要说明的是,在不与AFP反应的抗体(右泳道)的情况下,实际上未检测到谱带。
[试验例6]本发明的单克隆抗体的特异性分析2
1.试验方法
以与所述抗原固相化ELISA法同样的方法来确认S20205R抗体、S20206R抗体的特异性。需要说明的是,固定于板上的抗原为AFP、通过Endo-F3进行了处理的AFP、通过酶PNGaseF(在图3的序列中,对氨基与GlcNAcβ1间的键进行剪切的酶)进行了处理的AFP。同时,也以与[试验例1]同样的方式进行各AFP的SDS-PAGE。
2.试验结果
将结果示于图10、图11。在SDS-PAGE中,未进行酶处理的AFP、经过Endo-F3处理的AFP、经过PNGaseF处理的AFP均显示出不同的谱带图案,经过Endo-F3处理的AFP在高分子量侧和低分子量侧具有双重谱带,而在经过PNGaseF处理的AFP的情况下,在低分子量侧确认了谱带(图10)。显示Endo-F3将AFP的一部分的糖链剪切成二糖,而PNGaseF消化剪切所有N型糖链,产生没有糖链的AFP。另一方面,如图11所示,无论是否进行了酶处理,现有的AFP抗体的吸光度都增大,而在S20205R抗体、S20206R抗体的情况下,仅通过Endo-F3进行了处理的AFP的吸光度增大。在该测定体系中,针对固定于板上的AFP的抗体的反应性越强,吸光度越高。即,显示S20205R抗体、S20206R抗体包含通过Endo-F3产生的糖链作为识别部位的一部分。
[试验例7]现有抗体的夹心ELISA
到目前为止,对针对固定于板上的抗原的反应性进行了评价,还针对存在于液相中的抗原的反应性进行了评价。试验方法如下。
1.试验方法
(1)夹心ELISA用板的制备
制备纯化AFP作为免疫原,将无论是否进行了酶处理都发生反应的现有的抗AFP单克隆抗体(公司内部产品)含有液溶解于包含150mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.2;下文中称为PBS)中,并使所述现有的抗AFP单克隆抗体含有液为5μg/mL,将该溶解液50μL分别分配至96孔微板的各孔中,在室温下静置2小时。
用包含0.05%Tween(注册商标)20的PBS(下文中称为PBST)400μL将所述各孔清洗3次后,添加包含1%牛血清白蛋白的PBST(下文中称为BSA-PBST)100μL,在室温下封闭1小时。将其作为夹心ELISA用板。
(2)夹心ELISA法
以与[试验例1]同样的方式用BSA-PBST来逐步稀释经过Endo-F3处理的AFP。将其作为抗原含有液。从所述夹心ELISA用板的各孔中除去液体后,向所述各孔添加50μL的抗原含有液,在室温下静置15分钟。将所述各孔用PBST 400μL清洗3次后,将用BSA-PBST稀释了1500倍的HRP标记S20205R抗体或HRP标记S20206R抗体50μL分配至所述板的各孔中,在室温下静置15分钟。将所述各孔用PBST 400μL清洗3次后,添加包含0.2%邻苯二胺和0.02%过氧化氢的柠檬酸缓冲液(pH5.0)50μL,在室温下放置10分钟后,添加1.5N硫酸50μL来停止酶反应,对波长492nm处的吸光度进行测定。
2.试验结果
将结果示于图12a、b。对于进行了酶处理的AFP,吸光度以浓度依赖性的方式上升(图12a、b)。在该测定体系中,通过使HRP标记S20205R抗体和HRP标记S20206R抗体与和固定于板上的现有抗AFP抗体发生了结合的液相中的酶处理AFP进行反应而使吸光度增大。即,表示这些抗体与液相中的酶处理AFP发生特异性反应。
根据到目前为止的结果,由于S20205R抗体和S20206R抗体的特性大致相同,因此后续的评价仅使用S20206R抗体。
[试验例8]通过夹心ELISA进行的针对各酶处理物的反应性分析
1.试验方法
试验方法与[试验例7]同样。其中,抗原使用以与[试验例1]同样的方式制备并且通过Endo-F2或Endo-F3进行了处理的AFP。此外,在[试验例7]中添加HRP标记抗体的工序中,还同时将用BSA-PBST稀释了6000倍的HRP标记的现有抗AFP多克隆抗体用于试验。
2.试验结果
将结果示于图13a、b。在通过现有的AFP抗体进行测定的情况下,无论是否进行了酶处理,吸光度都以AFP浓度依赖性的方式增大(图13a)。另一方面,在使用了S20206R抗体的情况下,仅通过Endo-F2和Endo-F3进行了处理的AFP,吸光度以浓度依赖性的方式增大(图13b)。即,显示在使用Endo-F2的情况下也产生与使用Endo-F3产生的糖酵解AFP同样的糖酵解AFP,即使在使用Endo-F3以外的酶的情况下,也可进行与到目前为止的试验例同样的测定。
[试验例9]血清中的酶处理的探讨
到目前为止,将酶、缓冲液添加至纯化了的AFP中,进行酶处理。然而,实际上临床检查中假定的测定用样品是血清,除了AFP之外,血清中还预计混合有非常高浓度的N型糖链蛋白质。因此,对在血清中酶是否作用于AFP进行试验。
1.试验方法
试验方法与[试验例7]同样。但是,就使用的抗原而言,将3份健康受试者血清25μL添加至源自HepG2的AFP 200ng,并且添加0.1M MES缓冲液(pH5.5)25μL和2μg的Endo-F3。使这些在37℃下进行10分钟反应后,添加BSA-PBST 1mL,将AFP浓度设为200ng/mL的溶液作为抗原含有液。
2.试验结果
将结果示于图14。在将AFP添加至健康受试者血清的情况下,与添加至缓冲液的情况同样,在根据本发明进行的夹心ELISA中,酶处理AFP特异性地使吸光度增大(图14)。即,表示即使在血清中Endo-F3也作用于AFP。
[试验例10]酶处理的pH条件的探讨
1.试验方法
到目前为止,主要使用0.1M MES缓冲液(pH5.5)作为缓冲液,对是否可使用其他缓冲液(pH)进行探讨。试验方法与[试验例7]同样。其中,将酶处理时使用的缓冲液示于表1。
[表1]
Figure BDA0002709232930000241
酶处理后,用BSA-PBST进行稀释以使得AFP浓度为100ng/mL,用于夹心ELISA。
2.试验结果
将结果示于图15。在约pH0.5~约pH12.5的区域中,吸光度变为0.1以上,可以说发生了反应(图15)。这表明,充分满足分子生物学中使用的通常的缓冲液的pH区域,本发明中使用的酶可在不考虑pH的情况下使用。
[试验例11]板载酶处理的探讨
到目前为止,在酶处理后,将AFP用BSA-PBST进行稀释,然后通过夹心ELISA进行测定。因此,探讨是否可在夹心ELISA中的抗原抗体反应的同时进行AFP的酶处理。
1.试验方法
在板的制备之前,与[试验例7]同样。
(1)板载酶处理
用0.1M MES缓冲液(pH5.5)将Endo-F3稀释至0.33mg/mL,将其作为酶含有液。此外,用0.1M MES缓冲液(pH5.5)逐步稀释包含AFP的HepG2培养上清液,将其作为抗原含有液。
从所述ELISA用板的各孔中除去液体后,将酶含有液以30μL添加至所述各孔中。接着,向所述各孔中添加抗原含有液30μL,在37℃下进行20分钟反应。将所述各孔用PBST 400μL清洗3次后,将用BSA-PBST稀释了1500倍的HRP标记S20206R抗体50μL分配至所述板的各孔中,在室温下静置15分钟。将所述各孔用PBST 400μL清洗3次后,添加包含0.2%邻苯二胺和0.02%过氧化氢的柠檬酸缓冲液(pH5.0)50μL,在室温下放置10分钟后,添加1.5N硫酸50μL来停止酶反应,对波长492nm处的吸光度进行测定。
2.试验结果
将结果示于图16。与到目前为止的结果同样,在添加了酶的情况下,吸光度以浓度依赖性的方式增大(图16)。在本测定体系中,固相化的抗体与抗原发生反应,同时抗原与酶发生反应。即,表明抗原抗体反应与抗原的酶处理反应可同时进行。
尽管使用了以上具体示例对本发明进行说明,但是本发明的范围不限于所述具体示例。可理解本领域技术人员在不脱离本发明的主旨的情况下,可采用其它各种构成。
PCT/RO/134表
Figure QDA0002709235050000011

Claims (17)

1.一种糖蛋白的处理方法,其是将糖蛋白用作抗原时的糖蛋白的处理方法,其中,所述方法包含:
通过糖链特异性的糖链剪切酶对糖链进行剪切的工序。
2.根据权利要求1所述的糖蛋白的处理方法,其中,
所述对糖链进行剪切的工序是通过该剪切使糖链中内在的表位处于可被选择性结合物质识别的状态的工序。
3.根据权利要求1或2所述的糖蛋白的处理方法,其中,
所述糖链特异性的糖链剪切酶选自Endo-A、Endo-M、Endo-H、Endo-D、Endo-F1、Endo-F2、Endo-F3。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的抗原的处理方法,其中,
所述糖蛋白为AFP。
5.一种选择性结合物质的制造方法,其使用权利要求1~4中任一项所述的糖蛋白的处理方法。
6.一种检测生物样品中的糖蛋白的方法,其使用权利要求1~4中任一项所述的糖蛋白的处理方法。
7.一种糖蛋白,其通过权利要求1~4中任一项所述的糖蛋白的处理方法进行了处理。
8.一种选择性结合物质,其与通过权利要求1~4中任一项所述的抗原的处理方法进行了处理的糖蛋白结合,并且不与未经过该处理的相同糖蛋白结合。
9.根据权利要求8所述的选择性结合物质,其是抗体或抗体的抗原结合片段。
10.一种制造方法,其制造权利要求8或9所述的选择性结合物质,其中,所述制造方法包含:
将通过权利要求1~4中任一项所述的抗原的处理方法进行了处理的糖蛋白用作抗原。
11.一种制造方法,其制造权利要求8或9所述的选择性结合物质,其中,所述制造方法包含:
将通过化学合成或基因重组技术而得到的糖蛋白用作抗原。
12.一种检测糖蛋白的方法,其包含下述工序:
通过糖链剪切酶对可能包含该糖蛋白的样品进行处理的工序;
使权利要求8所述的选择性结合物质作用于通过所述糖链剪切酶进行了处理的糖蛋白,来得到该糖蛋白与该选择性结合物质的反应产物的工序;和
检测所述反应产物的工序。
13.根据权利要求12所述的方法,其同时进行下述工序:
通过糖链特异性的糖链剪切酶对糖蛋白进行处理的工序;和
得到所述糖蛋白与选择性结合物质的反应产物的工序。
14.一种试剂盒,其是用于权利要求12或13所述的方法的试剂盒,其中,所述试剂盒在同一组合物中含有下述两种试剂:
用于通过糖链特异性的糖链剪切酶对糖蛋白进行处理的试剂;和
用于得到所述糖蛋白与选择性结合物质的反应产物的试剂。
15.一种抗体的制造方法,其使用了具有糖链结构的抗原,所述糖链结构在生物体内不存在或即使存在也极为稀少。
16.根据权利要求15所述的方法,其中,
所述抗原是通过糖链特异性的糖链剪切酶进行了处理的糖蛋白。
17.根据权利要求15所述的方法,其中,
所述抗原通过化学合成或基因重组技术而得到。
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