CN112424232A - 与ncc-st-439抗原特异性反应的单克隆抗体及其制造方法 - Google Patents

与ncc-st-439抗原特异性反应的单克隆抗体及其制造方法 Download PDF

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Abstract

识别用作肿瘤标记物的糖链抗原的抗体的抗原特异性不充分，因而在使用了这样的抗体检测肿瘤标记物时，存在检测特异性降低、癌症诊断的准确性降低的问题。为了解决上述课题，本发明提供与用作肿瘤标记物的NCC‑ST‑439抗原的糖链进行特异性反应的抗体及其制造方法。

Description

与NCC-ST-439抗原特异性反应的单克隆抗体及其制造方法
技术领域
本发明涉及与NCC-ST-439抗原特异性反应的单克隆抗体及其制造方法。
背景技术
近年来，报告了很多与用作肿瘤标志物的糖链抗原相对应的抗体。
现已知，识别食管癌组织的抗体所识别的NCC-ST-439抗原是包含唾液酸的糖链抗原，并在在胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌等中上升(非专利文献1)。
另外，现已知，以人胰腺癌培养细胞HPAF-1为免疫抗原而制备的单克隆抗体DUPAN-2与由胰腺癌细胞高效产生的粘蛋白样蛋白质反应，并且可认为唾液酸与其抗原决定簇相关(非专利文献2、3)。该抗原被称为DUPAN-2抗原，特别用作胰腺癌、胆道系统癌等消化系统癌症的标记物。
另一方面，识别这些用作肿瘤标记物的糖链抗原的抗体通常是作为以特定癌细胞整体为抗原进行识别的物质而被分离，因而其抗原特异性不充分，可能与多个糖链抗原反应。在使用这些的抗体检测肿瘤标记物时，存在检测特异性降低，癌症诊断的准确性降低的问题。
因此，为了利用肿瘤标记物进行更准确的诊断，需要获得与特定糖链抗原特异性反应的抗体。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：GANN Japanese Journal of Cancer Research,1984年,Vol.75,No.6,pp.485-488
非专利文献2：临床病理，1986年，Vol.34,No.6,pp.705-710
非专利文献3：癌症与化学疗法,1986年,Vol.13,No.11,pp.3207-3214
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于提供与用作肿瘤标记物的NCC-ST-439抗原的糖链特异性反应的抗体及其制造方法。
解决技术问题的技术手段
本发明人等为了解决上述课题潜心研究，结果实现了将NCC-ST-439抗原的糖链自身用作抗原并获得与该抗原特异性识别的抗体。在各种用作肿瘤标记物的粘蛋白抗原中，通过该方法得到的抗体高度特异性地识别NCC-ST-439抗原，而不与DUPAN-2等其它肿瘤标记物抗原反应。
即，在本发明的一种方式中，提供以下物质。
[1]一种抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗原结合片段与具有下述糖链结构的NCC-ST-439抗原反应，
Figure BDA0002703688120000021
并且不与具有下述糖链结构的DUPAN-2抗原反应
Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Gal-。
[2]根据[1]所述的抗体或其抗原结合片段，其中，对于DUPAN-2抗原的反应性低于对于NCC-ST-439抗原的反应性的10％。
[3]根据[1]所述的抗体或其抗原结合片段，其中，对于DUPAN-2抗原的反应性低于对于NCC-ST-439抗原的反应性的1％。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为大鼠抗体。
[5]一种方法，其为所述[1]～[4]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的制造方法，并且
其包含将结合有所述NCC-ST-439抗原的高分子化合物进行动物免疫的工序。
[6]一种方法，其为产生所述[1]～[4]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的细胞的制造方法，并且
其包含将结合有所述NCC-ST-439抗原的高分子化合物进行动物免疫的工序。
[7]根据所述[5]或[6]所述的方法，其中，结合有所述NCC-ST-439抗原的高分子化合物不包含NCC-ST-439抗原结合蛋白的蛋白部分。
[8]一种免疫测定方法，其使用所述[1]～[3]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
[9]一种免疫测定试剂，其包含所述[1]～[3]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
发明效果
在用作肿瘤标记物的粘蛋白抗原中，本发明的抗体高度特异性地识别NCC-ST-439抗原，而不与DUPAN-2等其他肿瘤标记物抗原反应。因此，可以特异性检测表达NCC-ST-439抗原的癌细胞，例如胰腺癌细胞等，从而可以更准确地诊断癌症。
另外，通过利用本发明中的制备特异性识别用作肿瘤标记物的粘蛋白抗原的抗体的方法，可以得到与特定肿瘤标记物高度特异性反应的抗体。
附图说明
图1是表示与NCC-ST-439抗原特异性反应的抗体的制备方法的概要的图。
图2是表示抗原固相化ELISA法的试验结果的图。
图3是表示本发明的单克隆抗体的表位分析结果的图。
图4a是表示本发明的单克隆抗体的特异性分析结果的图。
图4b是表示本发明的单克隆抗体的特异性分析结果的图。
图4c是表示本发明的单克隆抗体的特异性分析结果的图。
图4d是表示本发明的单克隆抗体的特异性分析结果的图。
图4e是表示本发明的单克隆抗体的特异性分析结果的图。
图5是表示本发明的单克隆抗体的特异性评价中使用的糖链的示意图。
图6a是表示本发明的单克隆抗体S18201R使用游离纯化糖链进行的特异性分析的结果的图。
图6b是表示本发明的单克隆抗体S18202R使用游离纯化糖链进行的特异性分析的结果的图。
图6c是表示本发明的单克隆抗体S18203R使用游离纯化糖链进行的特异性分析的结果的图。
图6d是表示本发明的单克隆抗体S18201R使用游离纯化糖链进行的特异性分析的结果的图。
图7a是表示本发明的单克隆抗体S18201R对于NCC-ST-439标准品的反应性的图。
图7b是表示本发明的单克隆抗体S18202R对于NCC-ST-439标准品的反应性的图。
图7c是表示本发明的单克隆抗体S18203R对于NCC-ST-439标准品的反应性的图。
图7d是表示本发明的单克隆抗体S18204R对于NCC-ST-439标准品的反应性的图。
图7e是表示使用了癌症患者血清的试验中使用本发明的单克隆抗体S18201R进行测定时的吸光度与使用市售的ELISA试剂盒测定得到的NCC-ST-439的值之间的相关性。
具体实施方式
下面，对本发明的实施方式进行说明。下面的说明仅为示例，本发明的范围不限定于这些说明，并且可以在不损害本发明的主旨的范围内实施适当变更。
(定义)
只要没有特别指示，则本说明书中所使用的全部技术术语及科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。
在本说明书中，在示出多个数值范围的情况下，由这些多个范围的任意下限值及上限值的组合而构成的范围也具有相同含义。
在本说明书中，在采用抗体和某个化合物“反应”、“表现出反应性”、“具有反应性”、“结合”或者抗体“识别”某个化合物这些的表述的情况下，包含本发明的领域中通常使用的含义，且均按照相同的含义使用。抗体是否与某化合物“反应”，除可以通过本领域技术人员公知的抗原固相化ELISA法、竞争ELISA法、夹心ELISA法等来确认以外，还可以通过利用了表面等离子体共振(surface plasmon resonance)原理的方法(SPR法)等来确认。SPR法可以使用以Biacore(注册商标)的名称市售的装置、传感器、试剂类来进行。
在本说明书中，本发明的抗体不与某化合物“反应”是指本发明的抗体实质上不与某化合物反应。“实质上不反应”是指，例如在抗原固相化ELISA法中，抗体和固相化抗原的结合实质上不因添加该化合物而受到影响。也可以通过除上述抗原固相化ELISA法以外的本领域技术人员公知的方法及方式来确认“实质上不反应”。
在本说明书中，抗体“特异性反应”、或抗体的“特异性”是指抗体与存在于抗原上的抗原决定簇可检测地进行反应的能力，而在另一方面与其它抗原的可检测的反应性较小或实质上检测不到反应性。例如，在抗体与特定抗原“特异性反应”的情况下，该抗体与该抗原反应，且不与其它抗原反应。在优选方式中，在抗体与特定抗原“特异性反应”的情况下，例如在抗原固相化ELISA法中固定的该抗原和该抗体的相互作用被游离的该抗原抑制，且不被其它游离抗原抑制。例如，在利用游离抗原的IC50表示上述抗原固相化ELISA法的抑制的情况下，相对于该特异性抗原的IC50，非特异性抗原的IC50可以为10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1000倍、10000倍。另外，在特异性抗原的IC50为其它抗原的1/X的情况下，也可以表现为该特异性抗原的反应性为对于其它抗原的反应性的X倍。优选其它抗原的反应性相对于特异性抗原为20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％以下。在本发明的优选方式中，本发明的抗体与NCC-ST-439抗原反应，而不与DUPAN-2抗原反应。
在本说明书中，“抗体”是指包含四个多肽链、并通过二硫键相互连接的含有两个重链(H)和两个轻链(L)的免疫球蛋白分子。各重链包含重链的可变区(“HCVR”或“VH”)及重链的恒定区(包含CH1、CH2及CH3域)。各轻链包含轻链的可变区(“LCVR”或“VL”)及轻链的恒定区(CL)。VH及VL区进一步可分割成命名为互补决定区(CDR)的高变区，并且可分散存在于命名为框架(FR)的保守区。各VH及VL包含三个CDR和四个FR，并且按照下面的顺序从胺末端向羧基末端进行配置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。术语“抗体”还包含抗体全部的基因重组体，例如在原核生物中表达的抗体、非糖基化抗体。
另外，如Padlan(1995FASEB J.9:133-139),Vajdos et al.2002 J Mol Biol320:415-428所示，已知实际上仅CDR残基的一部分与抗原接触，不与抗原接触的CDR残基可以通过分子模型或凭经验地从存在于Chothia的CDR的外侧的Kabat的CDR区来确定。在去除CDR或者其一个或多个残基的情况下，其通常被其它的人类抗体序列或在这样的序列的共有序列中占据相应位置的氨基酸置换。另外，CDR及氨基酸内的置换位置可以凭经验选择。凭经验的置换可以为保守性或非保守性置换。
在本说明书中，抗体的“抗原结合片段”是指具有与抗原(例如，NCC-ST-439)特异性结合能力的抗体的一个或一个以上的片段。抗体的“抗原结合片段”内所含的结合片段的非限制性示例包含下述片段：(i)Fab片段，其为包含VL、VH、CL及CH域的一价片段；(ii)F(ab′)2片段，其为包含通过铰链区中的二硫桥结合的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH及CH域构成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL及VH域构成；(v)由VH域构成的dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546)；(vi)分离后的互补决定区(CDR)；以及(vii)通过合成接头任选结合的两个或两个以上分离后的CDR的组合。另外，正如已知作为单链Fv(scFv)那样，也可以使用基因重组法，通过合成接头将VL及VH区配对作为单条蛋白质链(Bird et al.(1988)Science 242:423-426；and Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。另外，“抗原结合片段”可以为结合域免疫球蛋白融合蛋白质，其包含：(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合域多肽；(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区；及(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。这些抗体片段可以使用本领域技术人员公知的现有技术来获得。
可用于本发明的抗体或其抗原结合片段可以来自包含鸟类、哺乳类在内的所有动物。优选抗体或片段来自人、黑猩猩、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠或兔子)、鸡、火鸡、猪、绵羊、山羊、骆驼、牛、马、驴、猫或狗。本发明的抗体包含由衍生自某一物种的抗体的恒定区与衍生自其它物种的抗原结合位点组合而成的嵌合分子。再者，本发明的抗体包含由衍生自非人物种(例如，来自小鼠)的抗体的抗原结合位点和人源的恒定区及框架区组合得到的人源化分子。
本发明的抗体可以获得于表达该抗体的杂交瘤或通过基因重组而表达该抗体的宿主细胞。作为宿主细胞，例如可使用：CHO细胞、淋巴细胞、大肠杆菌等细菌细胞、及酵母等真菌细胞。
另外，可以在使用了基因重组技术进行转基因的非人动物或植物中制造本发明的抗体。
作为本发明中的抗体，优选例如杂交瘤S18201R、杂交瘤S18202R、杂交瘤S18203R、或者杂交瘤S18204R所产生的单克隆抗体。所述杂交瘤基于布达佩斯条约国际保藏于下述机构。
保藏机构名称：NITE国际专利微生物保藏中心；
保藏机构地址：千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室(邮编292-0818)；
保藏编号：NITE BP-02717(杂交瘤S18201R)
保藏编号：NITE BP-02718(杂交瘤S18202R)
保藏编号：NITE BP-02719(杂交瘤S18203R)
保藏编号：NITE BP-02720(杂交瘤S18204R)
保藏日期：2018年5月17日。
在本说明书中，“烷基”可以为直链状、支链状、环状或包含它们的组合的脂肪族烃基中的任意一种。烷基的碳原子数没有特别限定，例如碳原子数可以为1～20个(C1～20)、碳原子数1～15个(C1～15)、碳原子数1～10个(C1～10)。
烷基可以具有1个以上任意取代基。例如，C1～8烷基中包含：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基、正辛基等。作为该取代基，例如可列举：烷氧基、卤素原子(可以为氟原子、氯原子、溴原子、或碘原子中的任意一种)、氨基、单或者二取代氨基、取代甲硅烷基、或酰基等，但不限定于这些。在烷基具有2个以上取代基的情况下，该取代基可以相同也可以不同。
在本说明书中，“亚烷基”表示由直链状或支链状饱和烃构成的二价基团。
在本说明书中，在关于某官能团被定义为“可以被取代”的情况下，取代基的种类、取代位置及取代基的个数没有特别限定，并且在具有2个以上取代基的情况下，该取代基可以相同也可以不同。作为取代基，例如可列举：烷基、烷氧基、羟基、羧基、卤素原子、磺基、氨基、烷氧基羰基、氧代基团等，但不限定于这些。这些取代基上可以进一步存在取代基。作为这样的例子，例如可举出卤化烷基等，但不限定于此。
在本说明书中，“NCC-ST-439抗原”是指具有被报道(Kumamoto.K.et.al.Biochem.Biophys.Res.Commun.(1998),247(2):514-17)能被NCC-ST-439抗体识别的下述结构的糖链。
Figure BDA0002703688120000071
在本说明书中，“DUPAN-2抗原”是指，具有被报道(Kawa.S.et.al.Pancreas(1994),9(6):692-697))能被DUPAN-2抗体识别的下述结构的糖链。
Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Gal-
在本说明书中，“NCC-ST-439抗原结合肽”是指在生物体内的肿瘤细胞等中所发现的且被NCC-ST-439抗原所结合的肽。
(与NCC-ST-439抗原特异性反应的抗体的制备方法)
本发明中特异性识别NCC-ST-439抗原的抗体，可通过图1中示出概要的方法来获得。具体而言，现有的肿瘤标记物反应性抗体是以肿瘤细胞自身为抗原进行分离(图1A)得到的，与之相比，在本发明的与NCC-ST-439抗原特异性反应的抗体的制造方法中(图1B)，将构成NCC-ST-439抗原的糖链通过接头负载于高分子化合物上，并将其进行小鼠等哺乳动物免疫。通过Antibod ies,A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1988))等中记载的已知的方法，摘取该动物的脾脏细胞或淋巴细胞，并将其与骨髓瘤细胞进行细胞融合，由此制备杂交瘤。从制得的杂交瘤细胞群中，将能产生与癌细胞特异性反应的抗体的物质进行分离。
在现有方法中，最终获得抗体之后需要分析抗原决定簇，与之相对，在本件发明的方法中免疫原与抗原决定簇一致，因而能高效地制备抗体，并且能获得与特定糖链抗原特异性反应的抗体。但是，在糖链合成中需要先进的技术。
接头的结构没有特别限定，例如，可以使用：C1～C12的任选取代的烷基、亚烷基、乙二醇、聚乙二醇、氨基酸、肽等。
高分子化合物没有特别限定，例如，可以使用：白蛋白、卵清白蛋白、绿脓杆菌外毒素、破伤风毒素、蓖麻毒素、白喉毒素、霍乱毒素、不耐热肠毒素、钥孔血蓝蛋白、上皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、血小板衍生生长因子、聚-L-赖氨酸、聚-L-谷氨酰胺等蛋白质。
本发明的NCC-ST-439抗原所结合的高分子化合物可以包含或不包含NCC-ST-439抗原结合肽的一部分。在优选的方式中，本发明的NCC-ST-439抗原所结合的高分子化合物不包含NCC-ST-439抗原结合肽部分。
杂交瘤可以根据该领域中公知的方法来制备，例如，可以采用聚乙二醇法、使用仙台病毒的方法、利用电流的方法等。可以根据公知的方法使得到的杂交瘤增殖，并可以确认所产生的抗体的性质，同时选择所需的杂交瘤。杂交瘤可以通过例如有限稀释法及软琼脂法等公知的方法进行克隆。
所得到的抗体除了由上述杂交瘤直接产生以外，也可以通过基因重组制备表达该抗体的宿主细胞，并由该宿主细胞获得。作为宿主细胞，例如，可以使用：CHO细胞、淋巴细胞、大肠杆菌等细菌细胞及酵母等真菌细胞。
需要说明的是，上述抗体的制备方法不限定于NCC-ST-439抗原，也可以用于为其它公知的糖链蛋白质的糖链抗原制备特异性抗体。例如，可以通过相同的方法，制备与上述DUPAN-2抗原特异性反应的单克隆抗体。
(本发明的抗体的用途)
本发明的抗体可以用于检测生物体样本中的NCC-ST-439抗原的免疫测定方法，以检测肿瘤标记物。具体而言，可以利用用于使用抗体检测生物体样本中的粘蛋白肿瘤标记物的各种公知的方法，例如，可以使用：酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、免疫荧光测定法、免疫沉淀法、平衡透析、免疫扩散法及其它技术，但不限定于此(例如，参照Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,1988；Weir,D.M.,Handbook of Experimental Immunology,1986,BlackwellScientific,Boston)。在一种方式中，本发明的抗体可以用作固定在不溶性载体上的固定(固相)化抗体及通过标记物质标记后的标记抗体。这样的固定化抗体及标记抗体均包括在本发明的范围内。例如，可以通过使本发明的抗体物理吸附在不溶性载体上或者与不溶性载体化学结合(可以介由适当的间隔物)来制造固定化抗体。作为不溶性载体，可以使用由聚苯乙烯树脂等高分子基材、玻璃等无机基材、纤维素或琼脂糖等多糖类基材等构成的不溶性载体。其形状没有特别限定，可以选择板状(例如微板或薄膜)、珠状或者微粒状(例如乳胶粒子或磁性粒子)、筒状(例如试管)等任意形状。
作为用于制造标记抗体的标记物质，例如可列举：酶、荧光物质、化学发光物质、生物素、亲和素、或放射性同位素、胶体金粒子、彩色乳胶等。作为标记物质和抗体的结合方法，可以使用本领域技术人员可以利用的戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶基二硫化物法或高碘酸法等方法。固定化抗体及标记抗体的种类及它们的制造方法没有特别限定，例如，可以使用过氧化物酶及碱性磷酸酶(下面，有时称为ALP)等酶作为标记物质。在该情况下，可以使用该酶的特异性底物(酶为辣根过氧化物酶(下面，有时称为HRP)的情况下，使用例如1,2-苯二胺(下面，有时称为OPD)或者3,3’,5,5’-四甲基联苯胺；酶为ALP的情况下，使用对硝基苯基磷酸酯等)测定酶活性。在将生物素用作标记物质的情况下，通常使亲和素或者酶修饰亲和素进行反应。
本发明的抗体可以被用于提供上述免疫测定方法中所用的免疫测定试剂。该试剂除本发明的抗体以外，还可以包含实施该免疫测定方法所需的其它构成要素，例如缓冲液、保存剂等。
在一种方式中，例如在本发明的抗体包含酶作为标记物质的情况下，可以与包含其特异性底物的试剂一同以试剂盒的形式提供。
实施例
下面，通过实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明不受这些实施例的限定。
〔试验例1〕NCC-ST-439抗原特异性单克隆抗体的制造
1.材料
(1)NCC-ST-439修饰马来酰亚胺、NCC-ST-439糖肽、各种糖链相关化合物
(2)弗氏完全佐剂：和光纯药工业公司制造、014-09541
(3)骨髓瘤细胞(SP2/O)
(4)RPMI1640,GlutaMAX：GIBCO公司制造，61870-036
(5)Fetal Bovine Serum(FBS)：BIOLOGICAL INDUSTRIES公司制造，04-001-1A
(6)HAT培养基：Cosmo Bio公司制造，16213004
(7)96孔板：NUNC，167008
(8)HRP标记山羊抗大鼠IgG(H&L)抗体：Southern Biotech公司制造，3050-05
(9)“RANAZYME(注册商标)ST-439板”：KAINOS/NIPPON KAYAKU；包含HRP标记NCC-ST-439抗体(现有抗体)和标准液(NCC-ST-439标准品)作为组成试剂
2.免疫原用NCC-ST-439修饰马来酰亚胺或NCC-ST-439糖链加成肽交联蛋白质的 制备
对糖链修饰马来酰亚胺进行交联时，还原人转铁蛋白，再以4:1的重量比将还原后的人转铁蛋白和糖链马来酰亚胺在PBS中混合，室温下反应2小时，4℃下放置一晚。然后，通过透析将缓冲液置换为PBS，制得免疫用共轭溶液。
对糖肽进行交联时，以4:1的重量比将马来酰亚胺活化OVA和糖肽在PBS中混合，并在室温下反应2小时，通过透析将缓冲液取代为PBS，制得免疫用共轭溶液
3.抗NCC-ST-439单克隆抗体产生杂交瘤的制备
(3-1)对动物的免疫
使用等量混合所述免疫用共轭溶液(0.2～2mg/ml)和弗氏完全佐剂而制得的乳液，向每只F344大鼠注射10～40μg。而且，在一周的间隔内反复注射该乳液7～8次。通过后述的抗原固相化ELISA法，测定从尾静脉抽血得到的抗血清中的抗体滴度。
(3-2)初步筛选(抗原固相化ELISA法)
通过ELISA法(抗原固相化ELISA法)确认所述免疫动物抗血清中是否存在抗NCC-ST-439抗体，其中，该ELISA法将通过与免疫用共轭溶液相同的方法制备的NCC-ST-439和BSA的共轭溶液固相化。抗原固相化ELISA法如下方式进行。
(3-2-1)抗原固相化ELISA用平板的制备
将NCC-ST-439糖肽和BSA的共轭溶液溶解在包含150mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.2；下面称为PBS)中，以使共轭溶液为1μg/mL，并将该溶解液50μL分别注入96孔微孔板的各孔中，在室温下静置2小时或4℃下静置一晚。
使用400μL包含0.05％Tween(注册商标)20的PBS(下面，称为PBST)清洗所述各孔三次之后，加入100μL包含1％牛血清白蛋白的PBST(下面，称为BSA-PBST)，并在室温下密闭1小时或4℃下密闭一晚。将其作为ELISA用平板。
(3-2-2)抗原固相化ELISA法
使用400μL PBST将所述ELISA用平板的各孔清洗三次之后，向所述各孔中添加50μL由BSA-PBST稀释了1500倍至13500倍的免疫动物抗血清及非免疫动物血清，并在室温下静置1小时。使用400μL PBST将所述各孔清洗三次之后，向所述各孔中分别注入50μL由BSA-PBST稀释5000倍的HRP标记大鼠IgG(H&L)，并在室温下静置1小时。使用400μL PBST将所述各孔清洗三次之后，加入包含0.2％邻苯二胺及0.02％过氧化氢的柠檬酸缓冲液(pH5.0)50μL，并在室温下放置10分钟之后，加入50μL 1.5N硫酸停止酶反应，测定波长492nm处的吸光度。摘取抗体滴度测定结果高的大鼠的脾脏或淋巴结，以制备脾脏或淋巴结来源的细胞，用于细胞融合。
(3-2)试验结果
结果示于图2。与非免疫动物血清相比，免疫动物抗血清均表现为稀释倍率越低，吸光度越高。在该测定系统中，吸光度依赖于与动物血清中所含的NCC-ST-439相对应的抗体浓度。即，前述结果表示，与非免疫动物的血清相比，免疫动物抗血清中包含的与NCC-ST-439相对应的抗体的浓度更高，具有较高的抗体滴度。摘取抗体滴度测定结果高的大鼠的脾脏或淋巴结，以制备脾脏或淋巴结来源的细胞，用于细胞融合。
(4)细胞融合
以细胞数为1比1的比例，将所述脾脏或淋巴结来源的细胞中的任意一种和骨髓瘤细胞混合，并进行电融合。将该融合后的细胞悬浮在HAT培养基中，并在CO2培养箱内，37℃、5％CO2下培养8天，获得融合细胞(杂交瘤)。
(5)杂交瘤的分选(抗原固相化ELISA法)
在上述抗原固相化ELISA法中，使用融合细胞的培养上清液代替免疫动物抗血清，除此之外，以相同的方法进行。选择吸光度测定结果高的孔作为存在抗NCC-ST-439抗体产生杂交瘤的孔(阳性孔)。
(6)克隆
使用通过上述初步筛选及二次筛选所选择的抗NCC-ST-439抗体产生株杂交瘤，进行杂交瘤的单克隆和单克隆抗体的纯化。
单克隆通过常规方法(有限稀释法)进行，利用与上述抗原固相化ELISA法相同的方法分选阳性孔，并最终获得4种抗NCC-ST-439单克隆抗体产生杂交瘤。将这四种杂交瘤S18201R、S18202R、S18203R、S18204R所产生的单克隆抗体分别称为S18201R抗体、S18202R抗体、S18203R抗体、S18204R抗体。
〔试验例2〕本发明的单克隆抗体的抗原决定簇分析
1.试验方法
通过下述竞争ELISA来确认，与S18201R抗体、S18202R抗体、S18203R抗体、S18204R抗体反应的NCC-ST-439的抗原决定簇是否和现有抗体近似。首先，通过与上述抗原固相化ELISA法相同的方法制备ELISA用平板。另外，将BSA-PBST作为溶剂，将稀释了2倍的现有抗体与稀释了2-8倍的S18201R抗体、S18202R抗体、S18203R抗体、S18204R抗体产生杂交瘤培养上清液以及产生不与NCC-ST-439反应的对照抗体的杂交瘤培养上清液混合。将其作为混合液。使用400μL PBST将ELISA用平板的各孔清洗三次之后，按照50μL/well分别注入上述混合液，并在室温下静置1小时。
接着，使用400μL PBST将所述各孔清洗三次之后，加入50μL包含0.2％邻苯二胺及0.02％过氧化氢的柠檬酸缓冲液(pH5.0)，并在室温下静置10分钟之后，加入50μL 1.5N硫酸停止酶反应，测定波长492nm处的吸光度。
2.试验结果
结果示于图3。在将不与NCC-ST-439反应的对照抗体和现有抗体进行混合的情况下，未观察到吸光度减少。另一方面，在将S18201R抗体、S18202R抗体、S18203R抗体、S18204R抗体和现有抗体进行混合的情况下，观察到吸光度减少。在该测定系统中，吸光度依赖于与固定在平板上的NCC-ST-439和BSA的共轭物结合的现有抗体的量。即，吸光度因添加S18201R抗体、S18202R抗体、S18203R抗体、S18204R抗体而减少表示：溶液中的S18201R抗体、S18202R抗体、S18203R抗体、S18204R抗体结合在现有抗体和共轭物的结合部位附近，从而抑制现有抗体和共轭物的结合。由此可知，S18201R抗体、S18202R抗体、S18203R抗体、S18204R抗体识别与现有抗体近似的抗原决定簇。
〔试验例3〕本发明的单克隆抗体的特异性分析
1.试验方法
通过下述竞争ELISA确认了S18201R抗体、S18202R抗体、S18203R抗体、S18204R抗体的特异性。首先，通过与上述抗原固相化ELISA法相同的方法制备ELISA用平板。另外，以BSA-PBST作为溶剂，将稀释了80-125倍的S18201R抗体、S18202R抗体、S18203R抗体、S18204R抗体产生杂交瘤培养上清液及稀释了30倍的HRP标记现有现有抗体，与制备为0.1-10μg/mL的NCC-ST-439的糖肽和BSA的共轭物、DUPAN-2的糖马来酰亚胺和BSA的共轭物及纯化糖链Sialyl Lewis X(sLex)混合。将其作为混合液。使用400μL PBST将ELISA用平板的各孔清洗三次之后，按照50μL/well分别注入S18201R抗体、S18202R抗体、S18203R抗体、S18204R抗体产生杂交瘤培养上清液和各糖链相关化合物的混合液，并在室温下静置1小时。按照50μL/well分别向其它孔中注入BSA-PBST，并在室温下静置1小时。在所述各孔中，使用400μL PBST将分别注入了S18201R抗体、S18202R抗体、S18203R抗体、S18204R抗体产生杂交瘤培养上清液和各糖链相关化合物的混合液的孔清洗三次之后，按照50μL/well分别注入使用BSA-PBST稀释了5000倍的HRP标记大鼠IgG(H&L)，并在室温下静置1小时。在所述各孔中，向按照50μL/well分别注入了BSA-PBST的孔中，按照50μL/well分别注入现有抗体和各糖链相关化合物的混合液，并在室温下静置1小时。
接着，使用400μL PBST将所述各孔清洗三次之后，加入50μL包含0.2％邻苯二胺及0.02％过氧化氢的柠檬酸缓冲液(pH5.0)，并在室温下静置10分钟之后，加入50μL 1.5N硫酸停止酶反应，测定波长492nm处的吸光度。
2.试验结果
结果示于图4a、b、c、d、e。在使用现有抗体的情况下，当混合了NCC-ST-439和共轭物时，观察到吸光度减少。此外，在以高浓度混合DUPAN-2的共轭物时，观察到吸光度下降幅度与NCC-ST-439的情况相比较小(图4a)。另一方面，在使用S18201R抗体、S18202R抗体、S18203R抗体、S18204R抗体的情况下，仅NCC-ST-439观察到吸光度减少(图4b、c、d、e)。在该测定系统中，吸光度依赖于与固定在平板上的NCC-ST-439和BSA的共轭物结合的抗体的量。即，吸光度因添加各糖链相关化合物而减少表示：溶液中游离的糖链相关化合物与溶液中的抗体反应，从而抑制抗体和固相化后的共轭物结合。因此，表明S18201R、S18202R、S18203R和S18204R抗体不与DUPAN-2反应，而特异性地与NCC-ST-439反应。
〔试验例4〕用针对纯化糖链的竞争ELISA进行的特异性评价
1.材料
各种糖链
2.测试方法
S18201R、S18202R、S18203R、S18204R抗体的特异性，通过以下描述的竞争ELISA得到确认。首先，通过与上述抗原固定化ELISA法相同的方法制备ELISA用平板。此外，以BSA-PBST为溶剂，将稀释为225～500ng/mL的S18201R、S18202R、S18203R和S18204R抗体与用BSA-PBST连续稀释了的糖链混合(图5)。将它们设为混合液。用400μL的PBST洗涤ELISA用平板的各孔3次后，将上述S18201R、S18202R、S18203R、S18204R抗体产生杂交瘤细胞培养上清液和各糖链的混合液分别以50μL/孔进行分配，并在室温下静置1小时。用400μL的PBST洗涤3次后，将由BBS-PBST稀释了5000倍的HRP标记大鼠IgG(H&L)以50μL/孔进行分配，在室温下静置1小时。
然后，用400μL的PBST洗涤各孔3次后，添加50μL的含有0.2％邻苯二胺和0.02％过氧化氢的柠檬酸缓冲液(pH5.0)，在室温下静置10分钟后，添加50μL的1.5N硫酸以终止酶促反应，测定波长492nm下的吸光度，将未添加糖链的情况的吸光度设为100％来计算反应率。
3.试验结果
结果示于图6a、b、c、d中。当使用S18201R、S18202R、S18203R和S18204R抗体时，仅在NCC-ST-439的情况下观察到吸光度降低(图6a、b、c、d)。在该测定体系中，吸光度取决于与固定在板上的NCC-ST-439和BSA的共轭物结合的抗体量。换句话说，由于各糖链的添加而降低吸光度，意味着溶液中的游离糖链与溶液中的抗体反应并抑制抗体与固定的共轭物之间的结合。即，表明S18201R、S18202R、S18203R和S18204R抗体与NCC-ST-439特异性反应。
〔试验例5〕对检测材料和NCC-ST-439标准品的反应性
1.材料
1.HRP标记链霉亲和素(Thermo Fisher公司制，21126)
2.试验方法
试验了能否通过使用了各抗体的夹心ELISA对血清样品中所含的NCC-ST-439进行测定。夹心ELISA的详细内容如下所述。
(2-1)夹心ELISA用平板的制作
将含有S18201R、S18202R、S18203R、S18204R抗体的溶液溶解于含有150mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.2；以下称为PBS)中，并使所述各溶液的浓度分别为5μg/mL，将50μL所述溶解液分配至96孔微孔板的各孔，在室温下静置2小时。
将各孔用400μL的含有0.05％Tween(注册商标)20的PBS(以下称为PBST)洗涤3次，然后加入100μL的含有1％牛血清白蛋白的PBST(以下称为BSA-PBST)。在室温下封闭1小时。将其用作ELISA用平板。
(2-2)夹心ELISA法
将所述ELISA用平板的各孔用400μL的PBST洗涤3次，然后将50μL由BSA-PBST连续稀释了的10位癌症患者的血清和由BSA-PBST连续稀释了的NCC-ST-439标准品加入所述各孔中，在室温下静置1小时。
所述各孔用400μL的PBST洗涤3次后，将50μL由BSA-PBST稀释至2μg/mL的生物素标记了的S18201R、S18202R、S18203R、S18204R分配至固定有相同抗体的所述平板的各孔中，在室温下静置1小时。用400μL的PBST洗涤所述各孔三次后，将50μL由BSA-PBST稀释至0.2μg/mL的HRP标记链霉亲和素分配至各孔中，在室温下静置1小时。用400μL的PBST洗涤所述各孔三次后，添加50μL含0.2％邻苯二胺和0.02％过氧化氢的柠檬酸缓冲液(pH5.0)，在室温下放置10分钟，然后添加50μL的1.5N硫酸来终止酶促反应，并且测定波长492nm下的吸光度。当使用了癌症患者血清时，以使用NCC-ST-439标准品测得的吸光度作为校正曲线来测定NCC-ST-439的浓度。
3.试验结果
结果示于图7a、b、c、d、e中。NCC-ST-439标准品的吸光度呈浓度依赖性增加(图7a、b、c、d)。即，这表明抗体与标准品中包含的NCC-ST-439抗原反应。此外，使用本试验的癌症患者血清时的吸光度与使用市售的ELISA试剂盒测定的NCC-ST-439的值之间表现出近似直线的相关系数为0.99以上的比例关系(图7e)。即，表明本发明的抗体可以与现有的NCC-ST-439抗体同样地测定癌症患者血清中的NCC-ST-439。
以上，使用具体例对本发明进行了说明，但本发明的范围不限定于上述具体例。可以认为：本领域技术人员在不脱离本发明的主旨的前体下，可以采用其他各种构成。
PCT/RO/134表
Figure QDA0002909093310000011

Claims (9)

1.一种抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗原结合片段与具有下述糖链结构的NCC-ST-439抗原反应，
Figure FDA0002703688110000011
并且不与具有下述糖链结构的DUPAN-2抗原反应
Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Gal-。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，对于DUPAN-2抗原的反应性低于对于NCC-ST-439抗原的反应性的10％。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，对于DUPAN-2抗原的反应性低于对于NCC-ST-439抗原的反应性的1％。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为大鼠抗体。
5.一种方法，其为权利要求1～4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的制造方法，该方法包括：
将结合有所述NCC-ST-439抗原的高分子化合物进行动物免疫的工序。
6.一种方法，其为产生权利要求1～4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的细胞的制造方法，该方法包括：
将结合有所述NCC-ST-439抗原的高分子化合物进行动物免疫的工序。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，结合有所述NCC-ST-439抗原的高分子化合物不包含NCC-ST-439抗原结合肽的肽部分。
8.一种免疫测定方法，其使用权利要求1～3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
9.一种免疫测定试剂，其包含权利要求1～3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
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